The Protective Effect of Mangiferin against Liver Damage-Induced Doxorubicin Fauzul Husna1, Wawaimuli Arozal2, Rianto Setiabudy2, Frans D. Suyatna2 1 Program Magister Ilmu Biomedik Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia, Jakarta 2 Departemen Farmakologi dan Terapeutik, Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia, Jakarta ABSTRACT Liver is an organ that plays an important role in the metabolism of xenobiotics. However, since it is actively involved in drug metabolism, it is also subject to damage caused by toxic drugs or metabolites. One of the drugs that caused liver damage is doxorubicin. The liver damaging effect of doxorubicin is determined to its chemical structure and toxic metabolites which can produce free radical molecules. The free radicals produced by doxorubicin cause depletion of antioxidant in the body, disrupt the balance of intracellular iron and lead to oxidative stress. Based on this consideration, the oxidative stress induced by doxorubicin should be diminished by means of exogenous antioxidant administration. One of the bioactive ingredient that has been shown to have antioxidant effects is mangiferin; its antioxidant properties relate to free radical scavenging and iron chelating effect. This compound is expected to protect against or prevent oxidative damage caused by doxorubicin to cells. This study aims to investigate the protective effect of mangiferin against liver damage-induced doxorubicin. There were five groups of rats, consisting five each group. The animals in the study groups were treated with intraperitoneal doxorubicin (cumulative dose 15 mg/kgBW for two weeks) and control group was given oral corn oil. Mangiferin (dose 50 mg/kgBW and 100 mg/kgBW) and silymarin were given daily by oral administration for five weeks. After sacrifice, blood and liver tissue samples were collected for histopathological analysis and determination of SGOT, SGPT, MDA, SOD, and GSH. The results showed that administration of cumulative doses of doxorubicin to 15 mg/kgBW for two weeks caused liver cell damage, increased MDA level and decreased activities of SOD and GSH level in liver. The supplementation of mangiferin 50 and 100 mg/kgBW for five weeks reduced liver cell damage as shown by decreased activities of SGPT and SGOT, decreased MDA level, and increased activities of liver SOD and GSH levels. (p <0.05). These results showed that mangiferin has a protective effect against liver damage induced by doxorubicin in the rat.
Keywords: Antioxidant, doxorubicin, hepatotoxicity, mangiferin, oxidative stress Introduction Doxorubicin (DOX) is a potent and broadspectrum antineoplastic agent that is prescribed for the treatment of a variety of cancers including leukemias and solis tumors, both in childhood and adulthood. Unfortunately, its use is limited by the chronic and acute toxic side effects it produces in many organ like heart, kidney, liver and brain. One of mechanism of DOXinduced toxicity is generally accepted as reactive oxygen species (ROS) formation.1-4 Structure of DOX tend to form free radicals in some pathway. One-electron quinine moiety in ring C of DOX has been known to result in formation of semiquinone that quickly
regenerates its parent quinine by reducing oxygen to ROS like superoxide anion (O2) and hydrogen peroxide (H2O2). Then, DOX metabolism produce reactive agycone and alcohol metabolite (doxorubicinol) that disturb intracellular iron metabolism.this effect increased ROS formation and disturb antioxidant protective system and induced oxidative damaged.4-6 Telah banyak penelitian yang membuktikan toksisitas DOK terhadap organ terutama jantung dan ginjal.10-15 Hati sebagai organ yang berperan dalam metabolisme adalah salah satu organ yang berpotensi mengalami kerusakan oleh karena pemberian DOK. Beberapa penelitian menunjukkan bahwa kerusakan hati yang diinduksi DOK dapat disebabkan oleh proses inflamasi, radikal bebas, stres oksidatif dan peroksidasi lemak secara bersamaan.16,24 Pengaturan mediator-mediator yang berperan dalam proses tersebut dapat mencegah toksisitas DOK terhadap beberapa jaringan. Berdasarkan hal tersebut, antioksidan dapat digunakan untuk mencegah bahaya dan kerja patologis radikal bebas termasuk yang disebabkan karena pemberian DOK. Sejumlah bahan aktif dari tumbuhan telah terbukti memiliki efek antioksidan dan digunakan di beberapa negara untuk mengatasi kerusakan yang disebabkan oleh radikal bebas. Beberapa penelitian membuktikan efek protektif silymarin terhadap kerusakan sel yang disebabkan oleh DOK. Silymarin adalah suatu antioksidan flavonoid, diisolasi dari Silybum marianum yang memiliki efek kuat untuk scavenging radikal bebas. Selain itu silymarin juga mengatur kadar glutation reduktase (GSH) intrasel dan mengkelasi ion logam (besi dan tembaga). penggunaan silymarin (SIL) terbukti dapat mencegah dan mengatasi toksisitas DOK terhadap berbagai organ melalui efek inhibisi peroksidasi lipid dan mencegah berkurangnya GSH. 25,26 Bahan bioaktif yang berasal dari mangga, mangiferin (MGN), juga terbukti memiliki efek antioksidan. Indonesia memiliki berbagai varietas mangga, salah satunya adalah Mangifera foetida, juga memiliki kandungan MGN yang tinggi. MGN ditemukan di batang, buah, akar maupun daun mangga.27 Beberapa penelitian membuktikan MGN memiliki efek antitumor28, antiviral29, antioksidan30,31, antidiabetik32, antiinflamasi33, antiatherogenik dan antihiperlipidemik34 serta agen kelator besi.35,36 Penelitian lain juga membuktikan bahwa senyawa xanton ini memiliki aktivitas antioksidan yang sangat kuat melalui scavenger radikal bebas dan melalui sifat kelator besinya.35,36,38-40 Tujuan penelitian ini adalah untuk membuktikan efek protektif MGN terhadap kerusakan hati tikus yang diinduksi oleh DOK melalui pengukuran kadar serum glutamik oksaloasetik transaminase (SGOT) dan serum glutamat piruvat transaminase (SGPT), pertanda peroksidasi lemak (MDA) di plasma dan hati serta aktivitas enzim antioksidan (SOD dan GSH) di hati. Materials and methods Chemicals DOX was purchased from Combiphar, MAN 99% dan SIL 90% were bought from Plamed Science Technology Company (Xian, China), Bradford, BSA, dl-efinefrin, asam tiobarbiturat, MDA standart (TMEP), GSH standart, dan DTNB standart were purchased from Sigma, enzymatic kit to determine ALT and ALP activity were purchased from Diasys and other reagens were bought from Merck. MAN and SIL was dissolved in corn oil. Each 20 mg MAN was dissolved in 1 mL corn oil and SIL was dissolved in 1 mL corn oil. DOX was administrated intraperitoneally injection. MAN and SIL were orally. In Vivo experimental set up
These research used 25 plasma and liver tissue Spraque-Dawley male rats of 12-16 weeks weighing approximately 150-200 g were purchased from Bogor Agriculture Institut, Bogor,indonesia and induced by DOX. All the experiments with animal were carried out according to the guidelines of the institutional animal ethical committee and was approved by Health Research Ethics Committee Faculty of Medicine Universitas Indonesia Cipto Mangunkusumo Hospital, Jakarta, Indonesia (the permit number is: 475/PT02.FK/Etik/2012). The animals were divided into five groups, consisted of five rats in each and they were treated for five weeks. Group 1: normal control: animals received only NaCl 0.9% and corn oil as vehicle (According to DOX administrated) Group 2 : toxin control (DOX) : rats received DOX 2.5 mg/kg body weight/48 hours for two weeks (Commulative dose 15 mg/Kg body weight) and concomittant with no treatment for five weeks Group 3 : MAN treated group (DOX + MAN 50) : rats received DOX concomittant with 50 mg/kg body weight MAN for five weeks Group 4 : MAN treated group (DOX + MAN 100) : rats received DOX concomittant with 100 mg/kg body weight MAN for five weeks Group 5 : SIL treated group (DOX + SIL) : rats received DOX concomittant with 50 mg/kg body weight SIL for five weeks. Rats in toxin control and normal control groups received the same amount of NaCl 0.9% and corn oil. The animals were euthanized at the end five weeks under light ether anesthesia. serum and liver collected. Preparation liver homogenate The liver tissues were first washed with deionized water to separate blood and then homogenized with PBS 7,4 1:10 at 1000U for about 1 min. after centrifugation at 3000xg for 10 min, the supernatant was taken. These homogenate was used to measure total protein, SOD activity, MDA and GSH levels. Biochemical analysis Assessment of serum specific markers (ALT, ALP) related to hepatic dysfunction, blood samples were collected, kept overnight for clotting and then centrifuged at 3000 g for 10 min. ALT and ALP activity were measured by using standard kits. The protein content of experimental samples was measured by the method of Bradford using crystalline BSA as standard. SOD activity was measured following the method of Misra and Fridovich, GSH level according to Ellman’s methods and the lipid peroxidation in term MDA formation was measured according to TBA-Wills method. Histopathological analysis A part of Livers from the normal and experimental rats were fixed in 10% buffered formalin and were processed for paraffin sectioning. Sections of about 5 µm thickness were stained with hematoxylin and eosin to evaluate under light microscope and were analysis descriptively. Statistical analysis All the values are expressed as mean±S.D. (n=6). Significant differences between the groups were determined with SPSS 16.0 software for Windows using one-way analysis of variance
(ANOVA) and followed by Least Significant difference methods for post hoc analysis. A difference was considered significant at the P < 0.05 level. Results Berdasarkan penelitian ini, didapatkan hasil seprti yang terlampir di tabel 1. Pemberian DOK meningkatkan aktivitas enzim SGOT, SGOT, SGPT dan SOD hati. Selain itu juga meningkatkan kadar MDA di plasma dan hati serta GSH hati. Tabel 1. Effect of DOX, MAN and SIL on the level of serum marker related to hepatic dysfunction, lipid peroxidation and endogen antioxidant system Group
ALT
ALP
Plasma MDA
Liver MDA
Liver SOD
Liver GSH
Control
U/L 28 ± 3
U/L 75 ± 10
nmol/mg protein 0.19 ± 0.02
nmol/mg protein 0.96 ± 0.16
nmol/mg protein 6.67 ± 1.72
DOX
67 ± 25a
93 ± 20a
0.28 ± 0.04a
1.48 ± 0.22a
DOX+MAN 50 DOX+MAN 100 DOX+SIL
29 ± 4b
68 ± 12b
0.21 ± 0.02b
0.96 ± 0.1b
33 ± 2b
72 ± 8b
0.22 ± 0.02b
0.7 ± 0.12b,c
33 ± 6b
72 ± 9b
0.25 ± 0.04
0.9 ± 0.2b
U/mg protein 150.25 ± 7.61 130.45 ± 14.3a 154.17 ± 7.44b 157.82 ± 7.59b 157.17 ± 4.81b
2.70 ± 0.63a 5.8 ± 0.8b 5.71 ± 0.98b 4.93 ± 1.61b
Values are expressed as mean ± SD, for 5 animals in each group. “a” values differ significantly from control (P < 0.05); “b” values differ significantly from DOX (P < 0.05). Dari penelitian ini ditemukan beberapa kerusakan pada struktur sel hati yang variatif. Kerusakan berupa nekrosis, degenerasi, dilatasi sinusoid, infiltrasi polimorfonuklear dan mononuklear, proliferasi sel kupffer. Kerusakan ditemukan tidak merata pada semua hewan pada tiap kelompok. A
B
C
D
Gambar 1. Pengaruh DOK dan MGN terhadap terhadap Gambaran Histopatologi Hati. A. Nekrosis, B. Degenerasi midzonal, C. Vakuolisasi sitoplasma, D. Normal Discussion Pada penelitian ini dilakukan pemeriksaan terhadap kerusakan sel hati yang disebabkan oleh pemberian DOK dan pengaruh pemberian MGN dalam melindungi kerusakan sel tersebut. Salah satu mekanisme kerja DOK adalah dengan memproduksi ROS. Mekanisme ini mendasari efek antikanker dan efek samping DOK. Selain itu pemberian DOK juga dapat mengurangi aktivitas pertahanan antioksidan antioksidan endogen sehingga dapat mencetuskan stres oksidatif. SIL merupakan flavonoid yang memiliki efek antioksidan dan terbukti mengurangi toksisitas DOK terhadap beberapa organ. Hal inilah yang mendasari penggunaan SIL sebagai kontrol positif pada penelitian ini. i Hasil Penelitian ini menunjukkan bahwa pemberian DOK meningkatkan SGPT dan SGOT. Kerusakan sel hati yang disebabkan oleh penyebab apapun dapat menyebabkan enzim-enzim enzim yang berada di sitoplasma dan atau mitokondria keluar dari sel menuju aliran darah. Enzim GPT terutama terdapat di sitosol sel hati, sedangkan enzim GOT selain terdapat di sel hati juga terdapat di sel organ lain seperti jantung, ginjal, dan pankreas. Peningkatan aktivitas enzim-enzim enzim ini di plasma dapat digunakan sebagai pertanda bahwa terjadi t kerusakan sel hati. Pada kerusakan hati yang akut, SGPT jauh meningkat dibanding SGOT.41,42 Hasil ini menunjukkan bahwa pemberian DOK merusak sel hati. Hasil ini seirama dengan hasil penelitian lainnya nya.20,21,23,24 Pemberian DOK sebagai antikanker bertujuan bertujuan untuk menekan pertumbuhan abnormal sel kanker. Mekanisme kerja DOK dalam menginduksi kerusakan sel adalah dengan menyebabkan kerusakan DNA sehingga menginduksi apoptosis sel. DNA termasuk t target selular dari ROS. ROS menyebabkan oksidasi o DNA sehingga memicu terbentuknya DNA yang dapat mengandung basa teroksidasi atau situs tanpa basa (apurinik atau apirimidinik). Produk DNA teroksidasi ini bersifat promutagenik karena dapat berinkorporasi secara tidak tepat. Makin tinggi kadar kerusakan DNA akan menyebabkan menyebabkan peningkatan kapasitas perbaikan selular, mutasi dan memicu apoptosis. Pengaturan respon selular terhadap kerusakan DNA yang diinduksi oleh ROS diperantarai oleh tumor supresor p53. p53 diaktifkan sebagai faktor transkripsi dan menginduksi gen target target yang terlibat dalam penghentian siklus sel, perbaikan DNA dan apoptosis. Pada keadaan ROS yang sangat tinggi,
kerusakan DNA yang sangat banyak menyebabkan akumulasi menetap atau aktivasi p53 sehingga menginduksi apoptosis dari sel yang rusak.5,9 Pemberian MGN 50 dan 100 mg/kgBB menurunkan aktivitas SGPT dan SGOT sehingga mendekati aktivitas enzim ini pada kelompok N. Hasil ini seirama dengan hasil penelitian Das dkk38 dan Pal dkk39. Das dkk (2012) menunjukkan bahwa MGN memiliki efek hepatopretektif karena MGN meningkatkan pertahanan antioksidan endogen melalui jalur nuclear erythroid-2 related factor-2 (Nrf2) dan mengurangi inflamasi melalui inhibisi NFκB. Faktor transkripsi Nrf2 mengontrol gen yang mengkode protein antioksidan seperti GSH dan enzim metabolisme fase II seperti NQ01 dan GST. Stres oksidatif akan menyebabkan Nrf2 yang berada di sitosol bertranslokasi ke nukleus, di nukleus Nrf2 akan berikatan dengan antioxidant response element (ARE) menyebabkan peningkatan transkripsi enzim antioksidan dan menurunkan sensitivitas terhadap kerusakan oksidatif sehingga memberikan efek sitoprotektif. Mereka membuktikan bahwa MGN meningkatkan ekspresi protein Nrf2, GSTα dan NQ01 dan meningkatkan translokasi Nrf2 ke nukleus pada hewan coba yang diinduksi stres oksidatif. Hampir semua gen yang overekspresi pada keadaan inflamasi dikontrol oleh NF-κB. Pada penelitian ini juga dibuktikan bahwa MGN menginhibisi NF-κB sehingga menekan ekspresi sitokin proinflamasi. Hasil-hasil ini mengindikasikan bahwa MGN memiliki efek hepatoprotektif.38,39 Beberapa penelitian melaporkan kerusakan hati akibat pemberian DOK melalui pemeriksaan histopatologi. Saad dkk (2000) menunjukkan gambaran histopatologi hati berupa nekrosis, atipia, dan gambaran inflamasi pada sel hati. Yagmurca dkk (2007) juga melaporkan kerusakan sel hati karena pemberian DOK. Mereka menemukan adanya degenerasi dan pleomorfisme hepatosit, proliferasi duktus, eosinofilia sitoplasmik, nekrosis parenkim, dan sel inflamasi di sekitar area portal.17,20 Pada penelitian ini juga dilakukan pemeriksaan histopatologi untuk memeriksa kerusakan sel hati akibat pemberian DOK dan MGN. Pemberian DOK menyebabkan kerusakan sel hati pada beberapa hewan pada kelompok DOK berupa pembengkakan sel kupffer, infiltrasi polimorfonuklear dan mononuklear, dilatasi sinusoid, granulasi sitoplasma, degenerasi, dan nekrosis. Tapi kerusakan tersebut tidak konsisten dijumpai pada semua hewan pada kelompok DOK. Pada Kelompok DOK+MGN juga ditemukan kerusakan seperti yang ditemukan pada kelompok DOK dan tidak semua hewan pada kelompok DOK+MGN menunjukkan kerusakan sel. Pada kelompok kontrol (N dan SIL) juga ditemukan kerusakan. Sehingga sulit ditarik kesimpulan mengenai efek MGN DOK dan MGN terhadap kerusakan sel hati karena variasi hasil pemeriksaan ini. Beberapa penelitian menunjukkan bahwa pemberian antioksidan tidak memproteksi kerusakan sel hati yang disebabkan pemberian DOK pada tingkat histopatologi. Kalender dkk (2005) memeriksa kerusakan struktural hati dengan menggunakan mikroskop elektron dan menemukan gambaran vakuolisasi dan pembengkakan mitokondria, nukleus piknotik, dan dilatasi celah antarsel dan pemberian catechin tetap menunjukkan gambaran pembengkakan mitokondria yang ringan dan dilatasi retikulum endoplasma. Injac dkk (2008) membuktikan bahwa pemberian DOK pada tikus kanker payudara menunjukkan hasil histopatologi berupa inflamasi leukosit, nekrosis sentrilobular dan vakuolisasi dan co-treatment dengan fullerenol juga tidak menyebabkan perbaikan signifikan terhadap inflamasi dan nekrosis sehingga mereka menyimpulkan bahwa efek protektif fullerenol tidak terbukti pada tingkat histopatologi.18,23 Ibrahim dkk (2010) melaporkan bahwa pemberian DOK dapat menyebabkan proliferasi sel kupffer, kongesti vena sentralis, serta degenerasi lemak pada sel hati dan pemberian selenium tetap memperlihatkan kerusakan sel hati berupa proliferasi sel kupffer. serta degenerasi lemak pada sel hati tapi dengan derajat yang lebih ringan.28
Walaupun gambaran histopalogis jaringan hati yang didapatkan pada penelitian ini memiliki kemiripan dengan beberapa hasil penelitian lain, Tetapi sulit diambil kesimpulan mengenai efek DOK dan MGN terhadap kerusakan sel hati pada tingkat histopatologis. Karena pada kelompok N juga ditemukan gambaran kerusakan sel hati dan pemberian MGN menunjukkan perbaikan gambaran histologi sel hati tetapi ada juga yang memperparah kerusakan sel hati. Pemeriksaan peroksidasi lipid dilakukan dengan mengukur kadar MDA di plasma dan jaringan hati. Dari penelitian ini dapat disimpulkan bahwa pemberian DOK meningkatkan tingkat peroksidasi lipid baik di plasma maupun di jaringan hati. Peroksidasi lipid adalah penanda yang penting terhadap kerusakan jaringan oleh karena stres oksidatif. Peroksidasi lipid didefinisikan sebagai proses oksidasi asam lemak tidak jenuh rantai majemuk (PUFA) yang terdapat di membran biologis. Proses ini diawali oleh radikal hidroksil yang mengabstraksi satu atom hidrogen dari gugus metilen yang terdapat di PUFA membran fosfolipid sehingga akhirnya membentuk hidroperoksida lipid polar, produk teroksidasi seperti epoksida dan aldehida (MDA dan HNE). Pemeriksaan peroksidasi lipid in vivo secara tidak langsung dapat dilakukan dengan mengukur kadar MDA. Pemeriksaan kadar MDA dilakukan dengan uji asam tiobarbiturat (TBA). Sejalan dengan penelitian lainnya,9,17,18,20,22,23 pada penelitian ini ditemukan peningkatan yang signifikan kadar MDA baik di plasma maupun di hati. Peningkatan kadar MDA ini membuktikan bahwa pemberian DOK dapat menyebabkan stres oksidatif. Hal ini disebabkan karena struktur kimia DOK yang memiliki cincin tetrasiklik yang mengandung gugus kuinon hidrokuinon. Gugus kuinon termasuk gugus yang dapat menerima elektron. Penambahan satu elektron pada gugus kuinon yang terdapat pada cincin C tetrasiklik DOK dapat membentuk semikuinon. Semikuinon ini dengan cepat mereduksi oksigen sehingga membentuk kuinon dan O2•-. Siklus ini diperantarai oleh sejumlah NAD(P)H oksidoreduktase seperti sitokrom P450, b5 reduktase, NADH dehidrogenase mitokondria, xantin dehidrogenase, nitrit oksida sintetase endothelial. Semakin meningkat kadar DOK maka makin meningkat pula O2•-.5 Radikal O2•- dapat berpenetrasi ke kanal transprotein ferritin dan memiliki potensial redoks yang lebih rendah dibanding ion ferric yang terdapat di inti ferritin. Kombinasi kedua faktor ini memicu pelepasan besi dari inti ferritin sehingga terjadi pelepasan besi dalam bentuk Fe2+. Semikuinon DOK juga mampu melepaskan besi yang terikat dari ferritin dengan mekanisme yang masih belum jelas. 5 Doksorubisinol juga bersifat reaktif terhadap akonitase sitoplasmik. Akonitase sitoplasmik adalah bagian enzim mitokondria yang memiliki kluster [4Fe-4S] yang mengkatalisis reaksi isomerasi sitrat menjadi asam sitrat. Klusternya merupakan salah satu tempat delokalisasi besi. Reaktivitas doksorubisinol menyebabkan peningkatan kadar besi bebas.5,43 Pada siklus redoks DOK, semikuinon juga dapat mengoksidasi ikatan antara cincin A dengan daunosamin sehingga membentuk 7-deoksiglikon. Aglikon ini memiliki solubilitas dalam lemak yang lebih tinggi sehingga dapat berinterkelasi ke membran biologis.4,5,44 MGN dosis 50 dan 100 mg/KgBB menurunkan kadar MDA di hati dan plasma secara signifikan dibanding kelompok DOK. Peningkatan dosis MGN menurunkan kadar MDA di hati sampai lebih baik dari kelompok N. Kemampuan MGN dalam menurunkan peroksidasi lipid dapat disebabkan oleh aktivitas antioksidannya. Menurut Leiro dkk (2003), MGN memiliki aktivitas scavenging terhadap radikal bebas yang sangat kuat. Berbagai penelitian in vitro juga telah membuktikan bahwa MGN memiliki aktivitas yang tinggi dalam menscavenging radikal bebas, baik terhadap radikal DPPH, O2•-,NO, •OH- dan galvinoksil.40 Menurut Pardo-Andreu dkk, efek antioksidan MGN terutama melalui sifatnya sebagai kelator Fe3+ dan kemampuannya menginduksi oksidasi Fe2+ dan bukan hanya sifat scavengernya saja. MGN menyebabkan Fe2+ cepat dioksidasi dan mencegah reduksi Fe3+
oleh askorbat sehingga membatasi ketersediaan ion besi untuk terlibat dalam reaksi Fenton dan Haber-Weiss sehingga lipid peroksidasi dapat terbatasi.35,36 Secara teoritis, induksi kerusakan jaringan dengan menggunakan DOK dapat menyebabkan peningkatan kadar besi bebas sehingga mungkin peran sifat antioksidan MGN sebagai kelator besi sangat berperan. Tapi penelitian ini belum bisa memastikan mekanisme kerja utama MGN sebagai antioksidan adalah melalui sifat kelator besinya karena pemeriksaan kadar besi di serum dan kapasitas pengikatan besi di plasma tidak dilakukan. Pertahanan antioksidan lini terdepan di dalam tubuh diperankan oleh pertahanan enzimatik dan SOD adalah salah satu enzim yang berperan dalam hal ini. SOD mengkatalisis reaksi dismutasi O2•- sehingga membentuk H2O2 yang selanjutnya akan diubah menjadi air dan O2 melalui reaksi enzimatis lainnya.7,8 Pemberian DOK pada penelitian ini menurunkan aktivitas SOD di hati secara bermakna. Hasil ini sejalan dengan penelitian Yagmurca dkk (2007).17 Akumulasi ROS disertai dengan berkurangnya aktivitas pertahanan antioksidan akan mencetuskan stres oksidatif. Pemberian DOK dapat menurunkan kadar protein dan aktivitas enzim SOD sitosol dan produk peroksidasi lipid (MDA) mengurangi aktivitas enzim dengan cara mengoksidasi situs aktif atau membentuk protein cross-link. Pada penelitian ini dibuktikan bahwa pemberian DOK dapat menurunkan kadar GSH di hati. Penurunan kadar GSH dapat menyebabkan gangguan aktivitas enzim yang berperan dalam eliminasi H2O2 sehingga terjadi akumulasi H2O2. Akumulasi H2O2 juga menginaktivasi CuZnSOD sehingga mengurangi aktivitas SOD.4,5,45 Normalnya, jika terjadi peningkatan jumlah radikal superoksida maka enzim SOD akan mengkatalisis reaksi dismutasi O2•- sehingga keseimbangan tetap terjaga. Beberapa penelitian lain menunjukkan bahwa pemberian DOK dapat menyebabkan peningkatan aktivitas SOD.9,18,23 Penurunan aktivitas SOD menunjukkan bahwa pemberian DOK akan mengganggu keseimbangan pertahanan antioksidan endogen. Tetapi pada penelitian ini belum dapat memastikan mengenai penurunan aktivitas SOD pada penelitian ini diakibatkan karena DOK menurunkan aktivitas antioksidan endogen atau diakibatkan akumulasi ROS yang menyebabkan aktifitas SOD mencapai ambang kejenuhan sehingga aktivitas SOD menjadi menurun. Untuk mengetahui hal tersebut perlu dilakukan pemeriksaan aktivitas SOD secara serial. Pada penelitian ini juga didapatkan bahwa pemberian DOK menurunkan kadar GSH di hati secara signifikan dibanding kelompok N. Penurunan kadar GSH menunjukkan bahwa pemberian zat ini mengganggu keseimbangan sistem pertahanan antioksidan endogen. Ibrahim dkk (2010) juga membuktikan bahwa pemberian DOK dapat menurunkan kadar GSH intrasel.12 Berkurangnya GSH merupakan marker stres oksidatif seluler karena aktivitas gugus hidrosulfida glutation berperan dalam reaksi antioksidan dan detoksifikasi.7 GSH merupakan gabungan tiga asam amino (glutamat-sistein-glisin) yang memiliki gugus thiol bebas dan dijumpai di sel mamalia dalam konsentrasi yang tinggi. GSH merupakan antioksidan intraseluler lini kedua yang mencegah pembentukan ROS intraseluler dan peroksidasi lipid.7,8 Peran antioksidan GSH dapat secara langsung yaitu GSH bertanggungjawab untuk menjaga keseimbangan thiol-disulfida dan berhubungan dengan potensial redoks sel. Berkurangnya GSH mengganggu status redoks thiol dan menggeser keseimbangan fisiologis seluler antara prooksidan dan antioksidan.7,8 Selain itu, GSH merupakan kofaktor enzim glutation peroksidase (GPx) yang merupakan salah satu enzim yang mengeliminasi H2O2 yaitu dengan menggunakan H2O2 untuk mengoksidasi GSH menjadi GSSG sehingga mengeliminasi H2O2. Berkurangnya kadar GSH akan mengurangi kemampuan dalam mengeliminasi H2O2 sehingga H2O2 dapat bereaksi dengan besi bebas untuk membentuk OH• dan menginisiasi peroksidasi komponen seluler.7,8
Penurunan kadar GSH juga dapat memperburuk stres oksidatif. Berkurangnya kadar GSH karena stres oksidatif selain mengurangi aktivitas enzim GPx juga mengurangi aktivitas enzim glutation-S-transferase (GST) dan diikuti oleh berkurang aktivitas enzim glutation reduktase (GR). Pemberian DOK akan menyebabkan terjadinya siklus redoks yang melibatkan gugus kuinon yang terdapat pada struktur kimia DOK. Siklus ini akan meningkatkan kadar O2•- dan H2O2. Detoksifikasi ROS oleh GSH menyebabkan simpanan selulernya berkurang sehingga menyebabkan penurunan sistem pertahanan antioksidan. Pada penelitian ini pemberian MGN dapat meningkatkan aktivitas SOD dan meningkatkan kadar GSH di hati sehingga setara dengan kelompok N. Peningkatan aktivitas SOD yang terjadi pada kelompok MGN membuktikan bahwa MGN dapat meningkatkan pertahanan enzimatis terhadap radikal bebas yang disebabkan oleh pemberian DOK sehingga hal ini dapat menunjukkan bahwa MGN dapat mencegah kerusakan oksidatif. Peningkatan aktivitas SOD dengan pemberian MGN juga telah dibuktikan oleh Pal dkk.39 Peningkatan kadar GSH pada penelitian ini mengindikasikan bahwa MGN berpotensi melindungi hepatosit terhadap kerusakan oksidatif yang diinduksi oleh DOK. Perbaikan antara MGN dosis rendah dan tinggi tidak berbeda bermakna. Das dkk menunjukkan bahwa pemberian MGN dapat meningkatkan aktivasi dari Nrf-2 yang berperan dalam mengontrol ekspresi gen yang mengkode antioksidan GSH, GST dan NQ01. Nrf2 akan berikatan dengan ARE di nukleus sehingga meningkatkan transkripsi gen yang dikontrolnya.9 Sarkar dkk (2004) melaporkan bahwa MGN dapat meningkatkan kadar GSH hampir dua kali lipat dibanding antioksidan lainnya dan pada saat yang bersamanan MGN juga menurunkan kadar GSSG. Sehingga MGN dapat berkonstribusi terhadap kerusakan oksidatif yang disebabkan oleh DOK karena peningkatan kadar GSH merupakan salah satu syarat bagi enzim GPx untuk mengeliminasi H2O2.46 Efek antioksidan mangiferin sebagai scavenger ROS juga akan menyebabkan ROS yang terbentuk akan ditangkap oleh MGN sehingga mengurangi ROS yang dapat mengganggu sistem pertahan Conclusion Berdasar penelitian ini dapat ditarik kesimpulan bahwa pemberian DOK dapat menyebabkan kerusakan oksidatif pada sel hati dan pemberian mangiferin dosis 50 mg/KgBB dan 100 mg/KgBB dapat memproteksi sel hati terhadap kerusakan oksidatif tersebut. References 1. 2.
3. 4.
5.
MM, Ritter JM, Flower RJ, Henderson G. Anticancer drugs. In : Rang and Dale’s Pharmacoloy. 7th ed. UK: Elsevier Inc; 2012. p.681-2. Chabner BA, Bertino J, Cleary J, et al. Cytotoxic agent. In : Brunton LL, Chabner BA, Knollmann BC, editors. Goodman & Gilman’s The Pharmacological Basic of Therapeutics. 12th ed. United Stated: McGraw-Hill; 2011. p.1712-5. Chu E, Sartorelli AC. Cancer Chemotheraphy. In : Katzung BG, Masters SB, Trevor AJ. Basic and Clinical Pharmacology. 11th Ed. New York: McGraw-Hill; 2009. p. 951-3. Granados-Principal S, Quiles JL, Ramirez-Tortosa CL, Sanchez-Rovira P, RamirezTortosa MC. New advance in molecular mechanism and the prevention of adriamycin toxicity by antioxidant nutrient. Food Chem Toxicol. 2010;48:1425-38. Minotti G, Menna P, Salvatorelli E, Cairo G, Gianni L. Anthracyclines: molecular advances and pharmacologic development in antitumor activity and cardiotoxicity. Pharmacol Rev. 2004;56:185-229.
6. 7. 8. 9. 10. 11.
12.
13. 14. 15.
16.
17. 18.
19.
20.
21.
22.
23. 24.
Quiles JL, Huertas JR, Battino M, Mataix J, Ramirez-Tortosa MC. Antioxidant nutrient and adriamicin toxicity. Toxicol. 2002;180:79-95. Halliwell B, Gutteridge JMC. Free Radicals in Biology and Medicine. 3rd ed. New York: Oxford Univ Press; 2007. Mark DB, Mark AD, Smih CM. Biokimia Kedokteran Dasar: sebuah Pendekatan Klinis. Jakarta: EGC;1996.h. 321-33. Deavall DG, Martin EA, Horner JM, Roberts R. Drug-induced oxidative stress and toxicity. J Toxicol. 2012; Article ID 645460. Danessi R, Foqli S, Gennari, Conte P, Del Tacca M. Pharmakokinetic-pharmacodynamic relationships of the anthracycline anti cancer drugs. Clin Pharmacokin. 2002; 41: 431-44. Gilleron M, Marechal X, Montaigne D, Franczak J, Neviere R, Lansel S.NADPH oxidases participate to doxorubicin induced cardiac myocyte apoptosis. Biochem Biophys Res Commun. 2009;388:727-31. Ibrahim MA, Ashour OM, Ibrahim YF, El-Bitar H, Gomaa W, Abdel-Rahim SR. Angiotensin-converting enzyme inhibition and angiotensin AT1-receptor antagonism equally improve doxorubicin-induced cardiotoxicity and nephrotoxicity. Pharmacol Res. 2009;60:373-81. Herman EH, Ferrans VJ. Animal models of anthracycline cardiotoxicity: Basic mechanisms and cardioprotective activity. Prog Pediatr Cardiol. 1998;8:49-58. Rajasekaran M, Kalaimagal C. cardioprotective effect of a medicinal mushroom, Ganoderma lucidum agains adriamycin induced toxicity. I J Pharmacol. 2012;8(4):252-8. Arozal w, Sari FR, Watanabe K, et al. Carvedilol-afforded protection against daunorubisin-induced cardiomyopathic rats in vivo: effect on cardiac fibrosis dan hypertrophy. International Scholarly Research Network. ISRN Pharmacol.2012; Article ID 430549. Crawford JM, Liu C. Liver and Biliary Tract. In : Kumar V, Abbas AK, Fausto N, Aster, editors. Robbins and Cotran Pathologic basis of Disease. 8th ed. Philadhelpia: W.B. Saunders company; 2010. Yagmurca M, Bas O, Mollaoglu H, et al. Protective effect of erdostein on Doxorubicininduced Hepatotoxicity in Rats. Arch Med Res. 2007; 38: 380-5. Injac R, Perse M, Obermajer N, et al. Potential Hepatoprotective effect of fullerenol C60(OH)24 in doxorubisin-induced hepatotoxicity in rats with mammary carcinoma. Biomaterials. 2008; 29: 3451-60. Henninger C, Huelsenbeck J, Huelsenbeck S, et al. The lipid lowering drug lovastatin protect against doxorubicin-induced hepatotoxicity. Toxicol appl Pharmacol. 2012; 261: 66-73. Saad SY, Najjar TA, Al-Rikabi AC. The preventive role of deferoxamine against acute doxorubicin-induced cardiac, renal and hepatic toxicity in rats. Pharmacol Res. 2001; 43(3): 211-8. Firat O, Kirdok O, Makay O, et al. Can hyperbaric oxygenation decrease doxorubicin hepatotoxicity and improve regeneration in the injured liver?. J Hepatobiliary Pancreat Surg. 2009; 16: 346-52. Bulucu F, Ocal R, Karadurmus N, et al. Effect of N-acetylcystein, deferoxamine and selenium on doxorubicin-induced hepatotoxicity. Biol Trace Elem Res. 2009; 132: 18496. Kalender Y, Yel M, Kalender S. Doxorubicin hepatotoxicity and hepatic free radical metabolisme in rats the effect of vitamin E and catechin. Toxicol. 2005; 209: 39-45. Ibrahim SS, Barakat MA, Helmy HM. Role of selenium in attenuating cardiac and hepatic damages by the antitumor agent, doxorubicin. Life Science J. 2010;7(4):162-71.
25. El-Shitany NA, El-Haggar S, El-desoky K. Silymarin prevent adriamycin-induced cardiotoxicity and nephrotoxicity in rats. Food and Chem Toxicol. 2008; 46: 2422-8. 26. Cecen E, Dost T, Culhaci N, Karul A, Ergur B, Birincioglu M. Protective effect of silymarin against doxorubicin-induced toxicity. Asian Pacific J cancer Prev.2011; 12: 2697-704. 27. Shah KA, Patel MB, Patel RJ, Parmar PK. Mangifera indica (mango). Pharmacog Rev. 2010;4(7):42-8. 28. Guha S, Ghosal S, Chattopadhyay U. Antitumor, immunomodulatory and anti-HIV effect of mangiferin, a naturally occurring glucosylxanthone. Chemotherapy.1996; 42: 443–51. 29. Yoosook C, Bunyapraphatsara N, Boonyakiat Y, Kantasuk C. Anti-herpes simplex virus activities of crude water extracts of Thai medicinal plants. Phytomedicine. 2000; 6: 411– 9. 30. Sanchez GM, Re L, Giuliani A, Nunez-Selles AJ, Davison GP, Leon-Fernandez OS. Protective effects of Mangifera indica L. extract, mangiferin and selected antioxidants against TPA-induced biomolecules oxidation and peritoneal macrophage activation in mice. Pharmacol Res.2000; 42: 565–73. 31. Muruganandan S, Gupta S, Kataria M, Lal J, Gupta PK. Mangiferin protect the streptozotocin-induced oxidative damage to cardiac and renal tissue in rats. Toxicol. 2002;176:165-73. 32. Aderibigbe AO, Emudianughe TS, Lawal BA. Evaluation of antidiabetic action of Mangifera indica in mice. Phytother Res. 2000; 15: 456–8. 33. Gorrido G, Gonzales D, Lemus Y, et al. In vivo and in vitro anti-inflamatory activity of mangifera indica L. extract (Vimang). Pharmacol Res. 2004;50:143-9. 34. Hossain MS, Ahmed M, Islam A. Hypolipidemic and hepatoprotective effect of different fraction of ethanolic extract of immature leave of Mangifera indica (Linn) in alloxan induced diabetic rats. IJPSR.2010;1(11):132-8. 35. Pardo-Andreu G, Delgado R, Velho JA, Curti C, Vercesi AE. Iron complexing activity of mangiferin, a naturally occurring glucosylxanthone, inhibits mitochondrial lipid peroxidation induced by Fe2+-citrate. Eur J Pharmacol. 2005;513:47-55. 36. Pardo-Andreu G, Delgado R, Nunez AJ, Vercesi AE. Dual mechanism of mangiferin protection against iron-induced damage to 2-deoxyribose and ascorbat oxidation. Pharmacol Res. 2006;53:253-60. 37. Purwaningsih EH, Hanani E, Amalia P, Krisnamurti DG. The chelating effect of Mangifera foetida water extract on serum thalassemic patients. J Indon Med Assoc. 2011;61(8);321-5. 38. Das J, Ghosh J, Roy A, Sil PC. Mangiferin exerts hepatoprotective activity against Dgalactosamine induced acute toxicity and oxidative/nitrosative stress via Nrf2-NFκB pathways. Toxicol Appl Pharmacol. 2012;260:35-47. 39. Pal PB, Sinha K, Sil PC. Mangiferin, a natural xanthone, protects murine liver in Pb(II) induced hepatic damage and cell death via MAP Kinase, NF-B and mitochondria dependent pathway. Plos one. 2013;8(2):1-17. 40. Leiro JM, Alvarez E, Arranz JA, Siso IG, Orallo F. In vitro effects of mangiferin on superoxide concentrations and expression of the inducible nitric oxide synthase, tumor necrosis factor-α and transforming growth factor-β genes. Biochem Pharmacol.2003;65:1361-71. 41. Ramachandran R, kakar S. Histological pattern in drug-induced liver disease. J Clin pathol.2009;62:481-492. 42. Ozer J, Ratner M, Shaw M, Bailey W, Schomaker S. The current state of serum biomarkers of hepatotoxicity. Toxicol. 2008;245:194-205.
43. Kalyanaraman B, Joseph J, Kalivendi S, Wang S, Konorey E, Kotamraju S. Doxorubicin-induced apoptosis: implications in cardiotoxicity. Mol Cell Biochem. 2002;234:119-24. 44. Chen Y, Jungsuwadee P, Vore M, Butterfield DA, St Clair DK. Collateral damage in cancer chemotherapy: oxidative stress in nontargeted tissue. Mol Interv. 2007;7:147-156. 45. Li T, Danelisen I, Singal PK. Early changes in myocardial antioxidant enzyme in rats treated with adriamycin. Mol Cell Biochem. 2002;232:19-26. 46. Sarkar A, Sreenivasan Y, Ramesh GT, Manna SK. β-D-Glucoside suppresses tumor necrosis factor-induced activation of nuclear transcription factor κB but potentiates apoptosis. J Biol Chem. 2004;279(32): 33768-81.
