0
Terahertz spektroszkópiai mérések Orvos és gyógyszerész hallgatóknak szerző: Dr. Orbán József oktatási intézmény: Pécsi Tudományegyetem Általános Orvosi Kar Biofizikai Intézet kutatóhely: MTA TKI Nagy Intenzitású Terahertzes Kutatócsoport Pécs, 2013. november 25.
Terahertz spektroszkópiai mérések
1
Orvos és gyógyszerész hallgatóknak
Spektroszkópiai háttér Az ultraibolya (UV), a látható (VIS) és az infravörös (IR) spektroszkópiához hasonlóan a terahertzes (THz: 1012 Hz) frekvenciatartományba eső elektromágneses sugárzás abszorpciós spektruma is hasznos információt hordoz a molekulákról, illetve azok rezgésés energiaállapotairól. A terahertzes frekvenciatartomány a távoli infravörös sugárzás nagy hullámhosszúságú (távoli infravörös) tartományába esik és a mikrohullámú tartomány rövid hullámhosszúságú végén található. Ahogy az UV/VIS/IR spektroszkópia legegyszerűbb alkalmazása, úgy a terahertzes spektroszkópiának is az alapvető vizsgálati módszere a mintára bocsátott sugárzás elnyelésének, azaz az abszorpciónak a mérése. A sugárzás relatív csökkenésének meghatározásához a THz-es abszorpciós spektroszkópiában is szükség van úgynevezett kontroll-, vagy referenciamérésre. A mintával mért jelet a kontrolléhoz hasonlítjuk, azaz a mérés két lépésben történik, mint az összes egy fényutas spektroszkópnál. Az abszorpció mértékét az 1. egyenlet alapján számíthatjuk ki, ahol I és I0 a mintán áthaladó, illetve a kontroll mérés során mért terahertzes sugárzás intenzitása, minden hullámhosszra (λ).
1. ábra: A terahertzes sugárzás az infravörös tartományban, annak is az úgynevezett távoli infravörös (far infrared; FIR) részében található.
A mintát a terahertzes sugárzást kibocsátó forrás (emitter) és a detektor közé (középre) helyezzük. A kontrollmérést vagy minta nélkül, vagy oldatok esetén a tiszta oldószerrel (pufferrel), azaz a vizsgálandó molekula nélkül végezzük.
A terahertz spektrométer
2
A nagyon rövid (körülbelül 100 femtoszekundumos, továbbiakban fs: 10-15 s) időbeli szélességű impulzusokat kibocsátó lézer (hullámhossz: 780 nm) létrehozza és egyben az energiát adja a szintén 100 fs-os szélességű terahertzes impulzusoknak (3. ábra). Ezek az impulzusok nem egy hullámhosszon hanem szélesebb (0-5 THz) frekvenciatartományon hordoznak energiát. Az impulzusba csomagolt energia tipikus intenzitás-idő eloszlását a 2. ábra mutatja. Az abszorbancia spektrumot a rendelkezésre álló műszerrel 0,2-3 THz tartományon tudjuk nagy pontossággal kiszámítani, az ezen kívül eső tartomány adatainak pontossága gyorsan csökken a szélső értékek felé haladva. Az ezen a tartományon kívül eső abszorbancia értékek alacsony megbízhatóságúak, spektroszkópiailag nem használhatók. B
amplitúdó
amplitúdó
A
idő
idő
2. ábra: A terahertzes impulzus elektromos térerősségének időbeli lefutása. A valós jel alakja (A) és a diszkrét időpontokban mért amplitúdó értékek (B). A mérési pontok sűrűségével befolyásolhatjuk a jelből kinyerhető információ pontosságát.
Az emitterből kibocsátott terahertzes impulzus-nyaláb megfelelő lencsékkel a mintára fókuszált és a mintán áthaladó – már széttartó – nyalábot egy a fókuszáló lencsével azonos típusú lencse gyűjti össze és irányítja a detektorra (3. ábra). Mind az emitter, mind a detektor egyaránt optikailag vezérelt kétpólusú antenna. Az előbbi a beérkező lézerfény hatására THz-es frekvenciájú elektromágneses sugárzást bocsát ki, míg az utóbbi a THzes impulzusokat elektromos jellé alakítja át. A detektorban kialakult elektromos jel nagysága arányos a beérkező THz impulzus energiájával. Az impulzus amplitúdójával arányos elektromos jeleket az úgynevezett lock-in erősítő – egy elektronikai egység – gyűjt össze és dolgoz fel (ismertetés később). A rendszer az emittert egy nagyfrekvenciájú elektromos (négyszög)jellel kapcsolja ki/be, hogy össze tudja hasonlítani a bekapcsolt állapotban kapott elektromos jelet a kikapcsolt állapothoz tartozóéval. Az utóbbit kivonva a bekapcsolt állapotban mért valós jelből történik a korrekció a spektrométer háttérzajára, ezáltal nagymértékben javul a jel/zaj viszony. A kivonási műveletet sokszor elvégezve a háttérzajtól megtisztított jeleket összegzi az úgynevezett lock-in erősítő és ezzel még pontosabbá teszi a mérést, hiszen így a random mérési hibák is eltűnnek. A lézerimpulzusokat egy nyalábosztóval 50-50% arányban kettéosztva létrehozunk két mérési nyalábot; az emitter és a detektor nyalábot (3. ábra). Az előbbi értelemszerűen az emitterhez jut és a THz-es impulzusok létrehozásáért felel, az utóbbi pedig a detektor
antennát kapcsolja ki és be. A detektor antennára érkező egy-egy impulzus az időbeli hosszának megfelelő, ~100 fs-nyi időre érzékennyé teszi a detektort.
50-50% fs-os impulzus lézer
detektor
minta
emitter
késleltető egység
elektromos impulzus generátor
lock-in erősítő
3. ábra: A terahertzes spektrométer sematikus ábrája. Az elektronikai egységeket kék, az optikai egységeket vörös szín jelöli. A szaggatott piros vonalak a lézer, illetve a THz-es impulzusok útvonalát jelölik. Az 50-50%-os nyalábosztó a lézer fényét két nyalábra osztja: emitter és detektor nyalábra. A detektor ágban haladó impulzusok a késleltető egység mozgatásával késleltethetők az emitter ágban haladókhoz képest, így biztosítható az időbeli felbontás optikai háttere.
A fény alapú vezérlés teszi lehetővé, hogy a detektorral a mintán áthaladó impulzust akár 100 fs-os időbeli pontossággal letapogassuk. Ez egyben azt is jelenti, hogy a mintán áthaladó THz impulzus időbeli lefutását nem egyetlen impulzus segítségével mérjük meg, hanem – általunk megválasztott számú – sok lépésben, pontról pontra állítjuk össze (2. ábra). Ehhez az összeállításhoz van szükség a késleltető egységre (KE), ami akár 1 mikrométer pontossággal pozícionálható. Ne feledjük, hogy a fény 10 fs alatt „csak” 3 mikrométernyi utat tesz meg, a fény vákuumbeli terjedési sebességéből (~ 3 · 108 m/s) számítva. Fontos tény, hogy a késleltető egységre beérkező és onnan visszaverődő impulzus a késleltető egység 15 μm-es eltolás hatására dupla annyit; 30 μm-nyit késik. Az úthosszak különbsége az emitter és detektor nyalábok között – ennek megfelelően – 30 μm, ami ~100 fs-nyi időbeli késésre számolható át. Végeredményben a detektort kapcsolgató lézerimpulzust 15 mikronos lépésekkel késleltetve az emitter jeléhez képest letapogathatjuk a mintán áthaladó impulzus időbeli lefutását.
3
Idő domén – frekvencia domén adat átalakítás
4
FFT amplitúdó
Az emitterből kijövő impulzus térben és időben kiterjedt energiacsomag, ami adott irányban terjed, esetünkben a spektrométer emitterétől a detektor irányába. A detektor segítségével lemért, véges számú pontból álló intenzitás-időfüggvényt intenzitásfrekvencia (vagy esetleg intenzitáshullámhossz) függvénnyé alakítjuk a mérés után. Ez a függvény az impulzus frekvencia (THz) spektruma, ami megadja, hogy az adott 4. ábra: Az impulzus spektruma, azaz az amplitúdó frekvencián (vagy hullámhosszon) mekkora a frekvencia függvényében. Az ábrán látható energiát, illetve intenzitást képvisel az spektrum a levegő víztartalma által elnyelt abszorpciós csúcsokat is tartalmazza. impulzus (4. ábra). A gyors Fourier transzformációval (Fast Fourier Transformation; FFT) képesek vagyunk az idő doménbeli impulzus lefutás adatsorunkat spektrummá konvertálni. A Fourier transzformáció alapja, hogy mindenféle (periodikus) időbeli jel felírható szinuszos jelek összegeként. Az egyszerű szinuszos jel intenzitását minden pillanatban (I(t)) a szinusz függvény frekvenciája (ω) és amplitúdója (A) határozza meg. 2. egyenlet Egy összetett periodikus jel tehát felírható az alábbi formában: 3. egyenlet, ahol k a komponensek száma. Egyszerűbb formába átírva az egyenletet kapjuk (i egész számokat jelent nullától, k-ig): ∑
. egyenlet
Az így kapott, összetevő elemeire felbontott jel esetén minden egyes komponensnek van egy jól meghatározott frekvenciája (ωi) és adott amplitúdója (Ai). Ezek az egyes amplitúdók a hozzájuk tartozó frekvencia függvényében ábrázolva a spektrumot adják. A (diszkrét) Fourier transzformációnál a jelet komplex térben bontjuk összetevőire: ∑
. egyenlet
ahol ω0 az alapfrekvencia, N az adathalmaz elemszáma, k egy kiválasztott frekvenciával arányos konstans és ejωt=cos(kω0t)+j⋅sin(kω0t). A jelen dokumentumnak nem célja az FFT módszer részletes bemutatása, kérjük további részletek érdekében keressen megfelelő matematikai szakirodalmat. A gyors Fourier transzformációs módszert alkalmazva (FFT) a számítások elvégzésekor bizonyos megfontolások alapján – melyek leírásától eltekintünk – a számolási igényt, illetve a komplexitást is jelentősen csökkenthetjük. A mai számítógépek és szoftverek segítségével ezek az FFT számítások könnyen és gyorsan elvégezhetők akár nagy mennyiségű mintavételezés, azaz nagy adathalmazok esetén is.
Terahertz spektroszkópia alkalmazhatósága A terahertzes spektrális tartománnyal vizsgálhatjuk többek között a kis energiájú másodrendű (pl. hidrogén) kötéseket, vagy a molekulák alacsony frekvenciájú intra- és intermolekuláris rezgéseit. A mikroszekundumos-pikoszekundumos időskálájú molekuláris mozgások megismerésével a más időléptékű és energiájú molekuláris mozgásokról megszerzett ismereteinket egészíthetjük ki. Az infravörös spektroszkópia a fs-ps (10-15 – 10-12 s) az elektron paramágneses spin rezonancia (EPR) spektroszkópia pedig a μs-ms (10-6 – 10-3 s) időtartományú molekuláris mozgások vizsgálatára alkalmas. A terahertzes (THz) sugárforrások technikai fejlődésének köszönhetően már lehetséges alapvető biológiai molekulák (peptidek és fehérjék) rezgéseinek, illetve a molekulák hidratációs burkának vizsgálata is. A hidrátburkot alkotó vízmolekulák szerepe a fehérjék működésében, illetve a gyógyszerek oldódásában és ezáltal felszívódásában jelentős szerepet játszik. A víz jelentős mértékben elnyeli az infravörös és így a THz-es sugárzást is. A levegő páratartalma miatt ha THz-es méréseket végzünk, akkor fontos, hogy vagy nagy precizitással stabilan tartsuk a páratartalmat. Ennek az oka, az hogy csak azonos körülmények között felvett mérések esetén összehasonlíthatók az egyes mérésadatok. A legjobb megoldás azonban az, ha valamilyen módon a levegő páratartalmát le tudjuk csökkenteni (lehetőleg 5% relatív páratartalom alá). Egyes frekvenciákon a vízre jellemző karakterisztikus abszorpciós csúcsok jelennek meg a spektrumban (lásd: 4. ábra). Ezek a karakterisztikus elnyelési vonalak a vízmolekulák között kialakuló hidrogénkötések rezgéseiből származnak. Vizes oldatok infravörös és THz spektroszkópiai mérése kisebb, mint 200 μm vastag vízrétegben lehetséges, különben a víz elnyelése eltakarja a vizsgálandó objektum, vagy molekula saját abszorpcióját. Az UV spektroszkópiához hasonlóan, ahol speciális – UV-ban áteresztő – anyagból készült küvettát kell használni, úgy a terahertzes spektroszkópia is speciális anyagok használatát igényli. Elsősorban műanyagból (teflon, nagy sűrűségű polietilén: HDPE) kialakított vékony mintatartók felelnek meg erre a célra – ha a látható tartományban is átlátszó az csak további előny.
Mérések A rendelkezésünkre álló idő-domén terahertzes spektroszkóp (Time Domain THz Spectroscope, TDTS) segítségével jól meghatározott spektrummal rendelkező molekulákat vizsgálunk. A különálló aminosavaknak, nukleinsavaknak jellegzetes abszorpciós spektruma van a 0-3 THz-es tartományban. Ezeknek vízmentes porított formáját kell a mintatartóba helyezni a megfelelő előkészítés követően. A spektroszkóp elindítása és a terahertzes impulzusok amplitúdójának optimalizálása után a szoftverrel első lépésben a két nyaláb számára azonos optikai úthosszat biztosító állapotot kell elérni a késleltető egység pozíciójának beállításával. Ez jelenti a kiindulási helyzetet (és időt), amihez képest fogjuk léptetni a rendszert. Jó minőségű időbeli és ezáltal spektrális felbontás eléréséhez 0,1 ps-os (100 fs) lépésekkel kell felvenni a jel időbeli lefutását. A THz-es jel ~100 fs hosszú, de a mintán áthaladva kiszélesedik és ezért 60
5
pikoszekundumnyi (6·1011 s) időtartomány gyűjtését érdemes elvégezni. Ez a megadott felbontás mellett 600 pontot jelent, ami a jel alakjának elég pontos rekonstrukcióját eredményezi. Az FFT transzformációhoz a nullszint pontos meghatározása fontos, amihez az impulzus előtti 5-10 ps-nyi tartományból is szükséges mintát vételezni, ami összesen ~70 ps időablakot és 700 méréspontot jelent. A mérés végén a Fourier transzformációs eljáráson alapuló szoftver segítségével hasonlítsa össze a kontroll és a mintával végzett mérés során transzmittált jelet, vagyis határozza meg az egyes molekulákra jellemző abszorpciós spektrumot a 0-3 THz frekvencia tartományban. Vonjon le következtetést az egyes molekulákhoz tartozó spektrumokról: azonosítsa az egyes molekulákhoz tartozó karakterisztikus csúcsokat, határozza meg azok központi frekvenciáját, maximális amplitúdóját és a csúcs szélességét (félértékszélesség). 1) Műszer elindítása (termosztáló egység, lézer tápegység, lock-in erősítő, számítógép, vezérlő szoftver elindítása) 2) Indítsa el a spektroszkópot vezérlő szoftvert, majd az inicializálási lépés után állítsa be az emitter és detektor nyalábok azonos úthosszához tartozó pozíciót a késleltető egység mozgatásával. 3) A lézer az impulzusos működéshez szükséges állapotot automatikusan beállítja, ha a termosztáló egység már a megfelelő hőmérsékletre fűtötte a lézert (35ºC). Ezután keresse meg az optimális THz intenzitást az emitter és a detektor mozgatására alkalmas mikrométer csavarokkal. 4) Állítsa be a méréshez tartozó késleltető egység pozíciókat úgy, hogy 5-10 ps-mal a mérendő impulzusok előtt induljon a mérés (nullaszint meghatározáshoz szükséges) és még 60 ps-nyi időablakot mérjen az impulzusról. Az időbeli felbontáshoz úgy állítsa be az egyes késleltető egység pozíciók közötti lépésközt, hogy körülbelül 5-600 méréspont keletkezzen. Ez nagyjából 0,1 ps-os (100 fs) időbeli felbontást jelent. 5) Végezze el a kontrollmérést. Ez lehet levegőn, vagy az üres mintatartón átmenő THz impulzus. A mintatartót a két optikai lencse közé középre, a sugárzás terjedési irányára merőlegesen helyezze be. 6) Helyezze a mintát a lencsék közé és határozza meg az egyes mintákon áthaladó impulzusok időbeli lefutását. Több minta esetén a mérés lépéseit ismételje meg és mindegyik mintának egyedi mérésfájl nevet adjon. 7) Határozza meg a referencia és a mintá(k)hoz tartozó THz transzmittancia jeleket, majd számítsa ki a mintá(k)ra jellemző abszorbancia spektrumot. Ehhez használhatja az ( ) 1. egyenletet, vagy a megfelelő mellékelt szoftvert. 8) Vonjon le spektroszkópiai jellegű következtetéseket az abszorpciós spektrum típusára vonatkozólag (vonalas, sávos, folytonos karakterek). Fogalmazza meg lehet különböztetni a különböző molekulákat a spektrumuk alapján?
6
7
Dr. Orbán József, jelen oktatási segédanyagot megalapozó munkája a TÁMOP 4.2.4.A/1-11-12012-0001 azonosító számú Nemzeti Kiválóság Program – Hazai hallgatói, illetve kutatói személyi támogatást biztosító rendszer kidolgozása és működtetése országos program című kiemelt projekt keretében zajlott. A projekt az Európai Unió támogatásával, az Európai Szociális Alap társfinanszírozásával valósul meg (2013-14.).
Az oktatási segédanyag a Pécsi Tudományegyetem Általános Orvosi Kar Biofizikai Intézetében történő oktatáshoz kiegészítő anyagként készült, az MTA TKI Nagy Intenzitású Terahertzes
Kutatócsoport tagjaként.
