Tartalomjegyzék TARTALOMJEGYZÉK

Tartalomjegyzék

TARTALOMJEGYZÉK Tartalomjegyzék ........................................................................................................... 1 Rövidítések jegyzéke .................................................................................................... 3 Ábrák és táblázatok jegyzéke ........................................................................................ 5 Ábrák ........................................................................................................................ 5 Táblázatok................................................................................................................. 5 Bevezetés ..................................................................................................................... 6 Irodalmi háttér .............................................................................................................. 8 Komplex öröklõdésû jellegek genetikája.................................................................... 8 Az örökölhetõség (heritabilitás).............................................................................. 8 A genetikai polimorfizmusok ................................................................................. 9 A monogénes és a komplex öröklésmenet összehasonlítása .................................. 11 Komplex betegségek genetikai faktorainak azonosítására alkalmazott eljárások ... 13 Kábítószerfüggõség ................................................................................................. 15 A kábítószerfüggõség neurobiológiája .................................................................. 16 A kábítószerfüggõség pszichológiai vonatkozásai................................................. 22 A kábítószerfüggõség genetikai faktorai ............................................................... 24 A D4-es dopamin receptor és genetikai polimorfizmusai ......................................... 25 A D4-es dopamin receptor (DRD4) ...................................................................... 25 A DRD4 gén polimorfizmusai .............................................................................. 27 A DRD4 gén polimorfizmusainak asszociáció vizsgálatai..................................... 31 A szerotonin transzporter és genetikai polimorfizmusai ........................................... 32 A szerotonin transzporter (SERT)......................................................................... 32 A SERT gén polimorfizmusai............................................................................... 32 A SERT gén polimorfizmusainak asszociáció vizsgálatai ..................................... 34 Célkitûzések ............................................................................................................... 35 Módszerek .................................................................................................................. 36 A vizsgálatban résztvevõ személyek ........................................................................ 36 Betegek ................................................................................................................ 36 Kontroll csoport ................................................................................................... 36 Mintavétel ............................................................................................................... 36 DNS izolálás............................................................................................................ 37

1

Rövidítések jegyzéke

Genotípus meghatározás .......................................................................................... 38 A vizsgált genotípusok és a meghatározás elve ..................................................... 38 A genotípus meghatározási módszerek részletes leírása ........................................ 42 Statisztikai módszerek ............................................................................................. 46 Eredmények................................................................................................................ 47 Módszertani eredmények ......................................................................................... 47 Nem invazív mintavétel során nyert DNS mennyiségi és minõségi vizsgálata....... 47 Genotípus meghatározás a szájnyálkahártyából nyert kis mennyiségû DNS felhasználásával ................................................................................................... 49 Érzékeny elválasztás technikák a kis mennyiségû DNS kimutatására.................... 52 A genetikai asszociáció vizsgálatok eredményei ...................................................... 55 A DRD4 gén polimorfizmusainak asszociáció vizsgálata kábítószerfüggõkben .... 55 A SERT gén polimorfizmusainak asszociáció vizsgálata kábítószerfüggõkben ..... 56 A DRD4 és a SERT gén polimorfizmusainak együttes vizsgálata kábítószerfüggõkben ............................................................................................ 57 Az eredmények megbeszélése..................................................................................... 58 Nem invazív DNS mintavételi módszerek................................................................ 58 Genotípus meghatározás kis mennyiségû DNS-bõl .................................................. 60 Érzékeny elválasztás technikák................................................................................ 61 Genetikai asszociáció vizsgálatok kábítószerfüggõkben........................................... 64 A dopaminerg rendszer genetikai polimorfizmusainak vizsgálata kábítószerfüggõkben ............................................................................................ 64 A szerotonerg rendszer genetikai polimorfizmusainak vizsgálata kábítószerfüggõkben ............................................................................................ 67 A DRD4 és a SERT gén polimorfzmusainak együttes hatása a kábítószerfüggõség kialakulására ........................................................................................................ 69 Köszönetnyilvánítás.................................................................................................... 73 Irodalomjegyzék ......................................................................................................... 74 Saját közlemények ...................................................................................................... 87 A dolgozat anyagát képezõ közlemények................................................................. 87 A dolgozat témájához szorosan nem kapcsolodó közlemények ................................ 87

2


RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE

120 bp dup

A D4-es dopamin receptor 5’ nem kódoló régiójában található 120 bp duplikáció (egy 120 bp-os szakasz egy vagy két kópiája) -521 C/T SNP A D4-es dopamin receptor promoterében a -521-es pozícióban elõforduló citozin/timin csere 5HT 5-hidroxi-triptamin, szerotonin 5HT1B, 5HT2A, szerotonin receptor altípusok 5HT2C , 5HT3 5HTTLPR

ACh ADHD AMPA ASA bp cAMP CB1, CB2 DRD4 4/7

DAT dATP dCTP dGTP dITP DNS dNTP DRD1, DRD2, DRD3, DRD4 DRD4 48 bp VNTR dsDNS

A szerotonin transzporter promoterében található hosszúságpolimorfizmus (5 hydroxy triptamine transporter linked polymorphic region) acetilkolin figyelemhiányos hiperaktivitás zavar (attention deficit hyperactivity disorder) glutamát receptor (? -amino-3-hidroxi-5 metilizoxazol-4propionsav) allél-specifikus amplifikáció (allele specific amplification) bázispár ciklikus adenozin-monofoszfát kannabinoid receptor altípusok A D4-es dopamin receptor gén harmadik exonjában található 48 bp hosszúság-polimorfizmus genotípusának jelölése, ahol az egyik allél 4, a másik 7 ismétlõdést tartalmaz, így a genotípus 4/7 Dopamin transzporter dezoxiadenozin-trifoszfát dezoxicitidin-trifoszfát dezoxiguanozin-trifoszfát dezoxiinozin-trifoszfát dezoxiribo-nukleinsav dezoxiribonukleozid-trifoszfát dopamin receptor altípusok A D4-es dopamin receptor gén harmadik exonjában található hosszúság-polimorfizmus, melyre egy 48 bp-nyi szekvencia különbözõ (2-10 közötti) számú ismétlõdése jellemzõ kettõsszálú (double stranded) DNS

DSM IV.

Diagnosztikai és Statisztikai Kézikönyv IV. kiadás (Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders)

dTTP

dezoxitimidin-trifoszfát

3


EC50 GABA GABAA, GABAB Glu GP kb Kd kDa mAChR MAO-A Mb mRNS NAc

glutamát globus pallidus kilobázis dissziciációs konstans kilo-Dalton muszkarinos acetilkolin receptor monoamino-oxidáz A izoenzim megabázis hírvivõ (messenger) ribonukleinsav nucleus accumbens

NAcc

nucleus accumbnes magi (core) része

nAChR NAcs NMDA

nikotinos acetilkolin receptor nucleus accumbens kérgi (shell) része glutamát receptor (N-metil-D-aszparaginsav)

OR

esélyhányados, Odds ratio

PCR RFLP SDS SERT SN

polimeráz láncreakció (polymerase chain reaction) restrikciós fragmentum hosszúság polimorfizmus (restriction fragment lenght polymorphism) nátrium-dodecil-szulfát (sodium-dodecil sulphate) szerotonin transzporter substantia nigra

SNP

egyedi nukleotid polimorfizmus (single nucleotide polymorphism)

SNpc

substantia nigra pars compacta

SNpr SPECT SPSS SSRI

substantia nigra pars reticularis

STin2 TAE TBE TDT

50%-os hatás eléréséhez szükséges hatóanyag koncentráció ?-aminovajsav GABA receptor altípusok

statisztikai programcsomag szelektív szerotonin visszavétel gátló (selective serotonin reuptake inhibitor) A szerotonin transzporter gén második intronjában található hosszúság-polimorfizmus tris-acetát-EDTA puffer tris-borát-EDTA puffer családvizsgálat statisztikai próbája (transmission disequilibrium test)

TE

tris-EDTA puffer

VNTR

ismétlõdési szám polimorfizmus (variable number of tandem repeats) ventralis tegmentalis area

VTA

4

Ábrák és táblázatok jegyzéke

ÁBRÁK ÉS TÁBLÁZATOK JEGYZÉKE Ábrák 1. Genetikai és környezeti tényezõk hatása komplex öröklõdésû kórképek, jellegek kialakulásában................................................................................................... 8 2. A monogénes és a komplex öröklõdés jellemzõi.............................................. 12 3. A mezolimbiko-kortikus pályarendszer ........................................................... 17 4. A dopamin felszabadulás szabályozása............................................................ 19 5. A DRD4 gén vizsgált polimorfizmusai ............................................................ 27 6. A szerotonin transzporter gén vizsgált polimorfizmusai................................... 33 7. A DRD4 -521 C/T SNP vizsgálatának elve kétirányú ASA-val ....................... 39 8. A DRD4 -521 C/T SNP vizsgálatának elve PCR-RFLP-vel ............................. 40 9. Hosszúság-polimorfizmusok genotipizálásának elve ....................................... 41 10. A DRD4 48 bp VNTR kimutatására alkalmazott primer párok ........................ 43 11. A nem invazív módszerrel vett szájnyálkahártya minták DNS tartalma ........... 47 12. A DRD4 48 bp VNTR genotípus meghatározása “Z” és “P” primerrel készített PCR amplifikációval ............................................................................................. 50 13. A -521 C/T SNP genotípus meghatározása kétféle módszerre.......................... 51 14. PCR termékek elválasztása ultravékony gél elektroforézissel .......................... 53 15. Hosszúság-polimorfizmusok genotípusának meghatározása agaróz gélen........ 54 16. A DRD4 -521 C/T SNP és az 5HTTLPR polimorfizmusok interakciója .......... 57

Táblázatok I. II. III. IV. V. VI. VII. VIII. IX. X. XI. XII. XIII. XIV.

Az ismétlõdõ polimorfizmusok osztályozása ................................................... 10 A kábítószerfüggõség diagnosztikus kritériumai a DSM IV szerint.................. 15 A kábítószerfüggõség kandidáns génjei ........................................................... 25 A DRD4 gén kódoló régió polimorfizmusai .................................................... 28 A DRD4 gén 5’nem-kódoló régiójában leírt polimorfizmusok........................ 30 A -521 C/T SNP vizsgálatára alkalmazott primerek......................................... 42 A DRD4 48 bp VNTR vizsgálatában alkalmazott két primer pár szekvenciája. 42 A DRD4 120 bp dup, a STin2 és az 5HTTLPR polimorfizmusok meghatározásához használt primerek............................................................... 43 A DRD4 gén általunk vizsgált polimorfizmusainak allél és genotípus eloszlása55 A SERT gén vizsgált polimorfizmusainak allél és genotípus eloszlása............. 56 Nem invazív mintavételi módszerek összehasonlító táblázata.......................... 59 Az elválasztani kívánt PCR termékek mérettartománya, és a termékek közötti méretkülönbség ............................................................................................... 63 A dopaminerg rendszer kábítószerfüggõkben vizsgált polimorfizmusai ........... 65 A szerotonerg rendszer kábítószerfüggõkben vizsgált polimorfizmusai ........... 68

5

Bevezetés

BEVEZETÉS Az elmúlt évtizedben a molekuláris genetika terén tapasztalható fejlõdés, a humán genom szekvenciájának feltérképezése, polimorfizmusok azonosítása, a génváltozatok funkciójának megismerése lehetõvé tette a monogénes betegségeknél sokkal gyakoribb, úgynevezett komplex öröklõdésû, multifaktoriális jellegek és kórképek – hagyományos genetikai vizsgálatokkal igazolt – örökletes hátterének a kutatását. Kábítószerfüggõség esetében a környezeti hatások szerepe mellett a genetikai tényezõk jelentõségét család-, adoptációs- és ikervizsgálatok igazolták, melyek alapján a kábítószerfüggõség becsült örökölhetõsége körülbelül 40-60%-ra tehetõ. A genetikai hajlamosító faktorok azonosítására egyik leggyakrabban alkalmazott módszer a kandidáns gének asszociáció analízise, melynek célja a kiválasztott gének egyes változatai és a vizsgált fenotípusos jegy, például a kábítószerfüggõség közötti kapcsolat elemzése. Ezekben a vizsgálatokban kandidánsként olyan molekulák génjeit jelölik ki, melyek szerepet játszhatnak a vizsgált betegség, fenotípusos jelleg kialakulásában. Az agyi mezolimbiko-kortikus dopaminerg jutalmazó rendszer mûködésének egyéni különbségei befolyásolhatják a kábítószerfüggésre való hajlamot, így a jutalmazó rendszerben szerepet játszó neurotranszmitterek, elsõsorban a dopamin és a szerotonin receptorainak, metabolizáló enzimeinek, transzporter fehérjéinek génjeit széles körben vizsgálják kandidáns génként. A D4-es dopamin receptor (DRD4) és a szerotonin transzporter (SERT) gén polimorfizmusainak kábítószerfüggõséggel kapcsolatos vizsgálatát indokolják továbbá a DRD4 gén polimorfizmusainak a kábítószerfüggõkre igen jellemzõ személyiségjeggyel, az újdonságkereséssel, a kábítószerfüggõségre hajlamosító gyermekkori figyelemhiányos hiperaktivitás zavarral (ADHD), valamint a SERT polimorfizmusainak a kábítószerfüggõséggel gyakran együtt elõforduló betegségekkel (depresszió, szorongásos kórképek) kimutatott összefüggései. A kandidáns gén asszociáció vizsgálatakor elsõsorban kis hatású gének mutathatók ki, melyek változatai hajlamosító faktorként szerepelhetnek a vizsgált kórkép kialakulásában. Gyakran sok kis hatású gén bizonyos változatainak együttes jelenléte esetében növekszik meg a genetikai kockázat, ezért érdemes lehet több kandidáns gén egyidejû vizsgálata. A fenotípus oldaláról tekintve ezeket a vizsgálatokat,

6

Bevezetés

asszociációt gyakran nem a klinikai diagnosztikus kritériumok által definiált tág fenotípus kategóriákkal lehet kimutatni, hanem az adott betegségre jellemzõ fenotípusos jellegekkel. Feltehetõen a génhatások a kábítószerfüggõség esetén sem közvetlenül, hanem inkább a személyiség alakításán keresztül érvényesülnek, (pl. újdonságkeresõ személyiség), és így járulnak hozzá a függõségre való hajlam növeléséhez. Jelen dolgozatban egy egyszerûsített nem invazív mintavételi technika kidolgozását és alkalmazását, valamint a DRD4 és a SERT gén 5 polimorfizmusának genotipizálását, majd kábítószerfüggõkben végzett asszociáció vizsgálatok eredményét mutatom be.

7

Irodalmi háttér

Komplex öröklõdésû jellegek genetikája

IRODALMI HÁTTÉR Komplex öröklõdésû jellegek genetikája Az örökölhetõség (heritabilitás) A komplex öröklõdésû betegségek, tulajdonságok közé azokat a gyakori kórképeket, jellegeket sorolják (pl. migrén (1), II típusú diabétesz (2), figyelemhiányos hiperaktivitás zavar (ADHD) (3), Alzheimer kór (4), asthma bronchiale (5), dyslexia (6), skizofrénia (7), személyiség (8), agresszivitás (9) stb.), melyek hátterében örökletes tényezõk és a környezet hatásának interakciója tételezhetõ fel. A genetikai faktorok jelentõségét támasztják alá a betegség vagy a jelleg érintett családokon belüli halmozott elõfordulása, valamint az iker-, és adoptációs vizsgálatok eredményei (1. ábra). hiperaktivitás autizmus major depresszió skizofrénia személyiség olvasási képtelenség H gyermek IQ

KK NK

felnõtt IQ 0

10 20 30 40 50 60 70 80 90 Részesedés (%)

1. ábra: Genetikai és környezeti tényezõk hatása komplex öröklõdésû kórképek, jellegek kialakulásában (10) Rövidítések: H: heritabilitás, KK: közös környezeti hatás, NK: nem közös környezeti hatás. A genetikai hatás mértékének számszerû kifejezésére használható a klasszikus vizsgálatok eredményeibõl becsült faktor, az örökölhetõség (heritabilitás), melynek

8

Irodalmi háttér


értéke 0 és 1 közé eshet. Az örökölhetõség úgy értelmezhetõ, mint egy populáció adott fenotípus variációinak azon aránya, mely genetikai tényezõknek tulajdonítható. Ha értéke 1, a fenotípus minden változata genetikai különbségbõl ered, vagyis az adott jegy 100%-ban genetikailag determinált. Ha értéke kisebb mint 1, akkor a fenotípus variációkat egyrészt genetikai, másrészt környezeti tényezõk alakítják (11). A Humán Genom Programnak az ezredforduló idején nyilvánosságra hozott eredményei, valamint a molekuláris genetikai technikák fejlõdése nagymértékben hozzájárultak a komplex öröklõdésû betegségek, jellegek genetikai hátterének megismerését célzó vizsgálatok elterjedéséhez és a genetikai hajlamosító faktorok vizsgálatához. A genetikai polimorfizmusok A Humán Genom Program 1990 októberében indult azzal a céllal, hogy meghatározzák az emberi genom nukleotid sorrendjét. 2000 áprilisában bejelentették, hogy a humán genom szekvenciájának 97%-át megfejtették, majd 2001 februárjában hozták elõször nyilvánosságra az emberi genom „nyers” szekvenciáját (12;13). 2003 áprilisára a teljes emberi genom szekvenálása befejezõdött. Az emberi genom mérete 3,2 gigabázis (3,2 milliárd bázis), melynek azonban mindössze 1,1-1,5%-a fehérjét kódoló szekvencia, a gének száma pedig, jóval kisebb mint azt korábban feltételezték; 80 -100 ezer gén helyett csak 30 -35 ezer génnel rendelkezünk (14). Két ember genetikai állománya 99,9%-ban azonos, azaz bármely két emberi genom kevesebb mint 0,1%-ban különbözik egymástól a nukleotid sorrend tekintetében. A humán genom diverzitását a ritka mutációk mellett genetikai polimorfizmusok biztosítják. Ezek olyan DNS szekvencia változatok, melyek gyakorisága egy populációban 1%-nál nagyobb (15). Újabb, szigorúbb kritériumok szerint a polimorfizmus ritkább alléljának legalább 5%-os gyakorisággal kell elõfordulnia (16). A

polimorfizmusoknak

két

formáját

különböztethetjük

polimorfizmusokat és az egyedi nukleotid polimorfizmusokat.

9

meg,

a

hosszúság-

Irodalmi háttér


Hosszúság-polimorfizmusok A teljes genom kb. 40-48%-át különbözõ hosszúságú ismétlõdõ szekvenciák alkotják (14). A hosszúság-polimorfizmusokat egyrészt az ismétlõdõ szekvencia elhelyezkedése alapján csoportosítják (egymás után ismétlõdõ vagy tandem, illetve szétszórt típus), másrészt hosszúságuk alapján kategorizálják (I. táblázat). I. táblázat: Az ismétlõdõ polimorfizmusok osztályozása TANDEM ISMÉTLÕ DÉSEK ? Mikroszatellita (<1 kb) ? Miniszatellita (1-30 kb) ? Makroszatellita (? Mb)

SZÉTSZÓRT ISMÉTLÕ DÉSEK ? Rövid (short interspersed repeats SINES) (<500 bp) ? Hosszú (long interspersed repeats LINES) (1-1,5 kb)

A tandem ismétlõdések közül a legrövidebbek a mikroszatelliták, melyek hosszúsága kisebb mint 1 kilobázis (kb), a sorban a következõk a miniszatelliták 1–30 kb hosszúsággal és a leghosszabbak a több megabázispár hosszúságú makroszatelliták. Ez utóbbi csoport leggyakrabban a kromoszómák karjainak a végén, vagy a centromérben

helyezkedik

el,

és

makroszkóposan

is

látható

kromoszóma

heteromorfizmusokat okoz. A szétszórt ismétlõdések két csoportját különböztetik meg, a rövid (kisebb mint 500 bp) és a hosszú (1–1,5 kb) ismétlõ szekvenciákat (17). Más terminológiai

szerint

a

különbözõ

számú

ismétlõdést

tartalmazó

hosszúság-

polimorfizmusokat VNTR-nek (variable number of tandem repeats) is nevezik. Az ismétlõdõ szekvenciák szerepe még nem tisztázott, azonban feltételezhetõ, hogy a korábbi elképzelésekkel szemben nem csupán „genetikai szemetek”, hiszen a sejtek sok energiát és anyagot fektetnek megõrzésükbe. Jelentõs szerepük lehet a genom struktúrájának fenntartásában, a rekombinációs készség meghatározásában és talán a transzkripció szabályozásában is. A mikro- és miniszatelliták genetikai markerként használhatók kapcsoltsági vagy igazságügyi vizsgálatokban (18). Egyedi nukleotid polimorfizmusok (SNP) A humán szekvenciák összehasonlító elemzése során nagy számban (1,2-1,9 kbként) találtak egyedi nukleotid polimorfizmusokat (single nucleotide polymorphism) is, melyek 1 bázis cseréjének (esetenként inszerciójának vagy deléciójának) következtében alakulnak ki, és a humán genom diverzitásához jelentõs mértékben hozzájárulnak (19).

10

Irodalmi háttér


Amennyiben egy SNP elõfordulása egy fajon belül ritkább mint 1%, a korábbi ismert terminológia szerint pontmutációnak nevezik. Az 1999-ben alakult SNP Konzorcium a humán genom egyedi nukleotid polimorfizmusainak feltérképezését tûzte ki célul. A Konzorcium nyilvános adatbázisában (http://snp.cshl.org) közel 1,8 millió SNP-t tartanak számon (20). A monogénes és a komplex öröklésmenet összehasonlítása Az egyes emberek között fennálló genetikai eredetû különbözõség a humán DNS szekvencia 0,1%-os variabilitásának köszönhetõ. A polimorfizmusok nemcsak a jól látható fenotípusos jegyek (az orr formája, az ujjak hossza) különbözõségéhez járulhatnak hozzá, de a karakter, a személyiség, a betegségekre való hajlam, illetve a gyógyszerekre adott individuális válasz kialakulásához is. Ily módon a polimorfizmusok feltérképezése hozzájárulhat a gyakori, komplex betegségek genetikai faktorainak megismeréséhez. A genetikai tényezõk szerepe a komplex- és a monogénes betegségek esetében eltér, ezért a komplex öröklõdésû betegségek esetében a genetikai faktorok szerepének értékelésekor szemléletváltásra van szükség (2. ábra). A 2. ábra a monogénes és a komplex öröklõdés fõbb jellemzõit mutatja be. Míg a monogénes betegségek esetén a génben bekövetkezõ mutáció szükséges és elégséges feltétele a betegség kialakulásnak, addig a komplex betegségek esetében a különbözõ gének variációi csak hajlamot hordoznak a fenotípus megjelenésére, az egyes gének polimorfizmusai általában nem szükséges és nem is elégséges feltételei a betegség kialakulásának (2. ábra C része). Monogénes betegségek esetében a mutáció jelenléte minden családban ugyanakkora rizikót jelent a betegség kialakulása szempontjából, komplex öröklõdésû betegségek esetében az egyes gének relatív hatása családonként is eltérõ lehet (2. ábra D része). Az ábrán például a 3-as családban a „C” gén nagymértékben hozzájárul a betegség megjelenéséhez, azonban a teljes populációt illetõn a hatása nem ennyire kifejezett. Ugyanígy az „A” gén hatása általában jelentõs, de a 3-as család tagjai körében elhanyagolható (21).

11

Irodalmi háttér


Monogénes betegség

A

Komplex öröklõdésû betegség C gén A gén

mutáció

D gén

gén B gén

polimorfizmus Öröklõdés mintázat (komplex)

A különbözõ génekben található variációik hatása a betegség fenotípusára

C

Öröklõdés mintázat (domináns-recesszív)

A génben található mutáció hatása a betegség fenotípusára

B

100 %

Genetikai rizikó a populációban

30 %

100 %

A

100 %

A

1

4

Genetikai rizikó különbözõ családokban

A

C

D 3

D

Genetikai rizikó a populációban (epidemiológiai adatok alapján)

B

D 2

B C

C

1

A

30 %

C

C B 2

D

AB

D

B D

3

4

Genetikai rizikó különbözõ családokban

2. ábra: A monogénes és a komplex öröklõdés jellemzõi (21) A komplex öröklõdésû betegségek tehát multifaktoriálisak és poligénesek, azaz több gén és a környezet hatásának interakciója következtében alakulnak ki. Öröklõdésük nem magyarázható a klasszikus mendeli monogénes modellel, melyben egyetlen gén variációi határozzák meg a fenotípus változatokat. Több génben különbözõ DNS szekvencia változatok egyenként csak minimális hatással járulnak hozzá a kórkép kialakulásához (22), együttes hatásuk azonban már jelentõs lehet. Genetikai heterogenitás, inkomplett penetrancia és pleiotropia is jellemezheti öröklõdésüket (23).

12

Irodalmi háttér


Komplex betegségek genetikai faktorainak azonosítására alkalmazott eljárások A komplex öröklõdésû rendellenességek genetikai hátterének kutatása alapvetõen kétféle módszerrel történik. A kapcsoltsági csoport vizsgálata (linkage analízis) a teljes genomot egyszerre vizsgálja, és számos marker polimorfizmus segítségével próbálja lokalizálni a rendellenesség kialakulásában szerepet játszó kromoszómális régiókat. A kandidáns gének asszociáció analízise elméleti megfontolások alapján kiválasztott gének polimorfizmusát vizsgálja. A két módszer elõnyeit és hátrányait összevetve még vita folyik az irodalomban arról, hogy melyik módszer lenne alkalmasabb a komplex betegségek genetikai vizsgálatában (24). Kapcsoltsági csoport vizsgálata (linkage analízis) A linkage analízis klasszikus módszer, lényege genetikai markerek és fenotípusos jegyek együtt-öröklõdésének vizsgálata többgenerációs nagycsaládokban, esetleg szülõk és érintett testvérpárok körében. (24;25). A kapcsolt öröklõdés alapja a genetikai marker és a fenotípusos jegyért felelõs gén közeli kromoszómális lokalizációja. Minél közelebb van egy marker szekvencia a betegségért felelõs génhez, annál kevésbé valószínû a rekombinációjuk, így együtt öröklõdnek. A vizsgálat alkalmas a fenotípusos jegy kialakításáért felelõs ismeretlen kromoszómális régió helyzeti meghatározására. Ez a módszer elsõsorban nagy hatású gének felderítésére alkalmazható, ezért komplex öröklõdésû betegségek esetében, ahol a különbözõ családokban más-más gének járulhatnak hozzá a betegség kialakításhoz, önmagában ritkán célravezetõ (24). Alkalmazásához 200-300 családban 300-400 genetikai marker, polimorfizmus vizsgálata szükséges. Az Alzheimer kór, az I és a II típusú diabétesz, az asztma bronchiale és a gyulladásos bélbetegségek esetében ezzel a módszerrel sikerült egyes hajlamosító gének lokalizációját meghatározni (26). A kapcsoltsági csoportok egy újabb vizsgálati módszere a teljes genom asszociáció analízise. Ebben az esetben nem családokat, hanem két populációt (esetkontroll) hasonlítanak össze. Az analízis alapja itt is a genetikai marker és a vizsgált fenotípusos jegy közös elõfordulása. Ez az eljárás a klasszikus módszerhez hasonlóan a nagyobb hatású gének kiszûrésére alkalmas (24;26).

13

Irodalmi háttér


Kandidáns gének asszociáció vizsgálata A kandidáns gének asszociáció vizsgálata populációk összehasonlításán alapul. Az eset-kontroll (case-control) vizsgálatok során a kiválasztott (kandidáns) gén polimorf változatainak elõfordulási gyakoriságát hasonlítják össze bizonyos fenotípusos jegyekkel rendelkezõ (az eset populációba tartozó) és nem rendelkezõ (a kontroll populációba tartozó) csoportokban (24). A kandidáns gén kiválasztásának alapja, hogy az adott gén terméke szerepet játszik a vizsgált betegség patomechanizmusában, ezáltal a génben történõ változások, polimorfizmusok esetlegesen megváltoztatják a fehérje szerkezetét, vagy a gén expresszióját. Amennyiben statisztikailag szignifikáns kapcsolat mutatható ki egy fenotípusos jelleg, betegség és valamilyen genetikai variáns között, akkor az adott genetikai variáns a jelleg kialakulásának rizikófaktoraként értékelhetõ (24). A kandidáns gén asszociáció vizsgálatának elõnye az érzékenység, ezzel a módszerrel kis hatású gének is kimutathatók. Ugyanakkor ez az érzékenység téves pozitív eredményekhez is vezethet elsõsorban akkor, ha az összehasonlított populációk genetikailag heterogének. A genetikai heterogenitás nagyrészt a polimorfizmusok etnikai és földrajzi eloszlásának különbözõségébõl, rétegzõdésébõl (stratifikációjából) adódik (15;24). A populáció stratifikáció okozta hiba kiküszöbölésére alkalmazott módszer a családi triók (apa–anya–vizsgált gyermek) genetikai analízisén alapuló és a polimorf allélok preferenciális átadását vizsgáló Transmission Disequlilibrium Test (TDT). Ebben az esetben a kiválasztott fenotípusos jelleg és egy allél között akkor kapunk asszociációt, ha a kérdéses allélt a vizsgált jelleggel rendelkezõ gyermekek statisztikailag szignifikánsan többször kapják heterozigóta szüleiktõl mint a másik allélt. A TDT módszerének számos továbbfejlesztett változata létezik, melyek azokban az esetekben alkalmazhatók, amikor a családi trió nem teljes, vagy ha testvérpárokat kívánnak a vizsgálatba bevonni, illetve ha a vizsgált gén az X kromoszómához kötött (27).

14

Irodalmi háttér

Kábítószerfüggõség

Kábítószerfüggõség A kábítószer abúzus, a kábítószerfüggõség és a szenvedélybetegség (az addikció) a kábítószer fogyasztás egymás után következõ, egyre súlyosbodó fázisait jelentik, mely fázisok közt nehéz a határt meghúzni. A kábítószerek abúzusszerû (nem megfelelõ indikációval, túlzott mennyiségben történõ) használata során a kábítószerek egyes hatásai azonos dózis mellett csökkennek (tolerancia), míg mások növekedhetnek (szenzitizáció, negatív tolerancia). Ezek a mechanizmusok hozzájárulnak a függõség (dependencia) kialakulásához (28). A függõség klinikai diagnózisa a DSM IV (Mentális Betegségek Diagnosztikai és Statisztikai Kézikönyve IV. kiadása), vagy a BNO-10 (Betegségek Nemzetközi Osztályozása 10) alapján történik (II. táblázat). II. táblázat: A kábítószerfüggõség diagnosztikus kritériumai a DSM IV szerint PSZICHOAKTÍV SZER DEPENDENCIA (DSM IV) A szer használatának maladaptív módja, mely klinikailag jelentõs károsodáshoz vagy zavarhoz vezet, s legalább 3 a felsorolt kritériumok közül ugyanabban a 12 hónapos idõszakban jelen van: 1. Tolerancia: 1, a szer jelentõsen fokozott mennyiségeinek az igénye a kívánt effektus elérése érdekében, vagy 2, a szer azonos adagjának folyamatos használata esetén jelentõsen csökken a hatás 2. Megvonás: 1, a szerrel kapcsolatban jellegzetes megvonásos szindróma, vagy 2, ugyanolyan (vagy hasonló) szer bevétele a megvonásos tünetek csökkentésére vagy elkerülésére 3. A szert gyakran nagyobb adagokban vagy hosszabb idõszakig szedik mint eredetileg szándékozták 4. Állandó kívánság vagy sikertelen kísérletek a szerhasználat abbahagyására vagy kontrollálására 5. Jelentõs idõ és aktivitás irányul a szer megszerzésére, a szer használatára vagy hatásaitól való megszabadulásra 6. Fontos szociális, foglalkozási vagy rekreációs tevékenységek feladása vagy csökkentése a szerhasználat miatt 7. A szerhasználat folytatása olyan állandó vagy visszatérõ fizikai vagy pszichológiai problémák megléte ellenére, amirõl tudja, hogy valószínûleg a szerhasználat okozza, vagy súlyosbítja

A szenvedélybetegség, azaz a kényszeres drogfogyasztás (addikció) kialakulása után a viselkedészavarokhoz hasonlóan elvész a drog bevétele feletti szabályozás, a szervezet kényszeres viselkedést folytat annak ellenére, hogy tapasztalja a viselkedés negatív következményeit. Az addikció kialakulásában az agyi jutalmazó rendszer (reward kör) jelentõs szerepet játszik a viselkedésszabályozás és a motiváció vezérlésén keresztül (29). Az addikció WHO szerinti meghatározása kibõvíti az addikcióspektrumot. A kémiai addikciókon kívül magába foglalja a viselkedési addikciókat (patológiás játékszenvedély, bulímia, kleptománia, kompulzív vásárlás), melyekben kémiai anyag

15

Irodalmi háttér


nem szerepel a viselkedést vezérlõ indítékok között, azonban ugyanúgy jellemzõ a sóvárgás, a viselkedés feletti kontroll elvesztése (30). Ezek hátterében szintén a jutalmazó rendszer kóros, természetes jutalmazó stimulusokkal nem megfelelõen kielégíthetõ mûködése áll (22). A kábítószerfüggõség neurobiológiája Az agyi jutalmazó rendszer Az agyi jutalmazó kört James Olds és tanítványa, Peter Milner 1954-ben írta le (31). Élettani szerepe olyan viselkedések támogatása, melyek alapvetõek egy faj túléléséhez. A jutalmazó rendszer aktiválódásával járó, ezáltal kellemes állapotot, elégedettséget elõidézõ és egyben a faj túlélését biztosító viselkedésforma például az élelemkeresés, a felfedezõ viselkedés, vagy a szexuális aktivitás (32). A természetes jutalmazó aktivitások az „averzív centrumok” (pl. jóllakottság központ) aktiválásával létrejövõ feedback mechanizmusok révén szabályozottak. A kábítószerek a jutalmazó rendszert kontroll nélkül aktiválják, és így szenvedélybetegség kialakulásához vezetnek. Az addikció jellemzõje a jutalmazó rendszer aktiválását fenntartó ismételt drogbevitel, ennek hiányában pedig, a minden más cselekvést elnyomó, a drog megszerzésére irányuló viselkedés, a sóvárgás (33). A jutalmazó rendszer elemei – a nucleus accumbens (NAc), a szeptális magok, a tuberculum olfactorium, az amygdala, a hypothalamus ventromedialis és laterális magjai, a prefrontalis kortex – az emberi agy legõsibb struktúrájában, a limbikus rendszerben helyezkednek el. A nucleus accumbens, melyet az agyi jutalmazó rendszer egyik központi elemének tartanak, heterogén szerkezetû és funkciójú magcsoport. A kérgi részben található ventromediális magcsoportja a „kiterjesztett amygdala” része, mely a ventrális tegmentalis areaból (VTA) kap rostokat. Mûködése a limbikus rendszerhez – tágabb értelmezésben a ventrális striátumhoz – kapcsolt, és az emóciók kialakításában, a motiváció vezérlésében játszik szerepet. A nucleus accumbens magjaként (NAcc) emlegetett dorsolateralis régió a substantia nigra pars compactájával (SNpc) áll kapcsolatban, és a dorzális striátum részeként elsõsorban a motoros funkciók szabályozásában vesz részt (33).

16

Irodalmi háttér


A központi jutalmazó pálya (3. ábra) a VTA dopaminerg sejtjeinek a bazális elõagyi struktúrák (a nucleus accumbens, a tuberculum olfactorium, az amygdala, a limbikus és a frontalis kortex) felé vetülõ hálózata. Periaqueductalis szürkeállomány Prefrontalis kéreg

Amygdala Mezolimbiko-kortikus Ventralis dopaminerg pálya tegmentalis area

Locus coeruleus Raphe magvak

3. ábra: A mezolimbiko-kortikus pályarendszer Ez

a

mezolimbiko-kortikus

dopaminerg

pályarendszer

bidirekcionális

kapcsolatban áll más agyi struktúrákkal, így az agytörzsi felszálló aktiváló rendszerrel, mely a környezeti stimulusokra adott figyelem kontrollálásában és az ébrenléti állapot szabályozásában vesz részt. Kapcsolatban van továbbá a bazális ganglionokkal és a kisaggyal is, melyek a motoros aktivitást befolyásolják, valamint a hypothalamusszal, melyen keresztül az endokrin és a vegetatív idegrendszer befolyásoló hatása érvényesül. A dopamin szerepe a jutalmazó hatásban A jutalmazó rendszer elsõdleges neurotranszmittere a dopamin, melynek transzmissziója megnövekszik a nucleus accumbens kérgi részében mind a természetes jutalmazó cselekvések, mind a legtöbb kábítószer fogyasztása során (34). Korábban úgy gondolták, hogy a dopamin, mint „boldogság hormon” közvetlenül járul hozzá a jutalmazó rendszer aktivitásán alapuló „jó érzés” kialakulásához, az újabb vizsgálatok azonban ennél sokkal komplexebb szerepet tulajdonítanak a dopaminnak.

17

Irodalmi háttér


A jutalmazó hatás kialakulásának két fázisát különítik el. Az elsõ a „serkentéses” (incentive) fázis, melyre a várható jutalom, öröm iránti kellemes vágyakozás jellemzõ, a második a „kielégülési” (consummatory) stádium, mely magába foglalja ennek az elõre várt kellemes érzésnek a megélését. A kutatások arra utalnak, hogy a dopamin elsõsorban az elsõ stádiumban szabadul fel, azaz nem közvetlenül a kellemes érzés kialakulásában

szerepel,

hanem

a

jutalmazó

hatás

kialakulásának

megelõzõ

stádiumában. Ennek alapján a dopamin olyan viselkedésformák, elsõsorban a motiváció vezérlésében játszik szerepet, mely hozzásegít a jutalom eléréséhez (22;33;34). Szerepe van továbbá az asszociált tanulásban és a kondicionálásban, mely tartóssá és nehezen kiolthatóvá teszi az abúzust, és ezáltal nagymértékben felelõs a relapszusokért (35). Újabb kutatások eredményei alapján az is feltételezhetõ, hogy vannak olyan jutalmazó mechanizmusok is, melyekben a dopamin hatás nem szükséges (36). A dopamin felszabadulást szabályozó endogén tényezõk A mezolimbiko-kortikus rendszerben felszabaduló dopamin mennyiségét számos más transzmitter, így a szerotonin (5HT), a ?-aminovajsav (GABA), az excitátoros aminosavak és az endogén opioidok direkt vagy indirekt módon modulálják (4. ábra). A VTA dopaminerg neuronjainak kisülését közvetlen módon a dendritekbõl felszabaduló dopamin D2-es (DRD2) auto-, valamint a substantia nigra pars reticularis (SNpr) és a VTA GABA-erg sejtjeibõl felszabaduló GABA és neurokinin GABAB és 2-es típusú neurokinin (NK2) heteroreceptorokon keresztül tónusosan gátolja. (Ezeket a gátló hatásokat a 4. ábrán folyamatos piros nyilak jelölik.) Serkentõ stimulusok (a 4. ábrán folyamatos zöld nyilakkal jelölve) érkeznek a prefrontális kortex, valamint a pedunculopontinus kolinerg sejtek felõl. A hatást glutamát receptorokon (AMPA és NMDA) keresztül a glutamát (Glu), illetve nikotinos és muszkarinos acetilkolin receptorokon (nAChR, mAChR) keresztül az acetilkolin (ACh) közvetíti (34). Az endogén kannabinoidok is aktiválják a VTA dopaminerg sejtjeit (37), ez a hatás valószínûleg CB1 kannabinoid receptorokon át érvényesül (38). A VTA nem dopaminerg – GABA-erg sejtként azonosított – neuronjai feltehetõen fontos szerepet játszanak a dopaminerg neuronok aktivitásának szabályozásában. A GABA felszabadulását ezekbõl a sejtekbõl AMPA és NMDA receptoron a glutamát serkenti (a 4. ábrán szaggatott zöld nyilakkal jelölve), míg a striátumból érkezõ GABA

18

Irodalmi háttér


GABAA receptorokon át gátolja (a 4. ábrán szaggatott piros nyilakkal jelölve) (34;36). Ezt a komplex szabályozást tovább bonyolítja a dendritikusan felszabaduló dopaminnak – mind a glutamáterg, mind a GABA-erg végzõdéseken megtalálható – D1-es receptoron (DRD1) keresztüli hatása (39).

HT DA

Gl u

5HT

enkefali n

DRD4 GABAerg

ka nn ab ino id

PC

GABAerg

h AC

VTA

DAergc

Amygdala DA

DA GA BA

BA GA SNpr

NAcc

DA

DA

DRD3 DRD4 DRD1

DRD4 GABAerg 5- H T Hippocampus

SNpc

NC

NAcs GPe

GPi

4. Ábra: A dopamin felszabadulás szabályozása A piros nyilak a gátló hatást, a zöldek a serkentõ hatást mutatják. Folyamatos nyilak jelzik a direkt, szaggatott nyilak az indirekt hatásokat. Rövidítések: PC: prefrontális kéreg, HT: hypothalamus, VTA: ventrális tegmentalis area, SNpr: Substantia nigra pars reticulata, SNpc: substantia nigra pars compacta, NC: nucleus caudatus, GPe: glubus pallidus externa, Gpi: globus pallidus interna , NAcc: nucleus accumbnes magi része, NAcs: nucleus accumbens kérgi része, DA: dopamin, 5-HT: szerotonin, ACh: acetilkolin, Glu: glutamát, GABA: ? -aminovajsav, DRD1, DRD3, DRD4: dopamin receptor altípusok Az endogén opioidok és a szerotonin indirekt módon hatva befolyásolják a dopamin felszabadulást. A jutalmazás második fázisa a jutalmazás bekövetkeztével kialakuló megelégedés, kielégülés, örömérzet és eufória elsõsorban az endogén opioid termelõdéssel kapcsolatos (22). A VTA GABA-erg axonterminálisain a µ-opioid receptorok aktiválódása gátolja a gátló hatású GABA felszabadulását. Ez a diszinhibíció a dopaminerg rendszer aktiválódásához és fokozott dopamin felszabaduláshoz vezet a nucleus accumbensben.

19

Irodalmi háttér


A szerotonin hatása a mezolimbikus dopaminerg rendszerre meglehetõsen komplex és még nem teljesen tisztázott. A dorzális raphe magvak szerotonerg sejtjeinek projekciója behálózza szinte az egész központi idegrendszert. Rostok vetülnek a VTA, a nucleus accumbens, az amygdala és a striátum, valamint a mediális raphe magvakból a hippocampus és a szeptális magvak felé (40;41). Egyes nézetek szerint a szerotonin a dopaminnal ellentétes hatásokért felelõs. Ezen hipotézisek alapján létezik egy „vágyakozási/jutalmazó” (appetitive) és egy „averzív/büntetõ” központ, melyek egymással ellentétes motivációkat szabályoznak. Ebben a rendszerben a jutalmazó hatás kiváltotta motivációkért a dopamin felelõs, míg az averzív hatásokra adandó adaptív válaszok kialakításában a szerotonin játszik szerepet. A szerotonin ezáltal a védekezõ rendszer része, és az averzív stimulusok által kiváltott elkerülõ magatartást közvetíti. A végrehajtó és az elkerülõ viselkedés közötti egyensúlyt a dopamin és a szerotonin ventrális striátumban történõ felszabadulása határozza meg (41). Ezt a teóriát támasztják alá azok a vizsgálatok, melyek a szerotoninnak a dopaminerg funkciókra a VTA, a substantia nigra (SN) valamint a NAc szintjén kifejtett antagonizáló hatását mutatták ki (42). Ugyanakkor a szerotonin a SNpr-ának GABA-erg sejtjeit indirekt – a gátló hatást közvetítõ hypothalamikus encephalinok felszabadulását serkentve (43)–, a hippocampus GABA-erg sejtjeit pedig közvetlenül – feltehetõen 5HT1B receptorokon keresztül – gátolja (44), és ezáltal a dopamin felszabadulás gátlásának a megszüntetéséhez, a dopamin kiáramlás fokozódásához vezet. A szerotonin komplex hatása feltehetõen a különbözõ szerotonin receptorokhoz, és különbözõ jelátviteli utakhoz kapcsolható. Hatását befolyásolja a dopaminerg és a szerotonerg aktivitás mértéke is. Feltételezhetõ, hogy a bazális mezoaccumbalis dopamin aktivitást az 5HT1B és az 5HT2C receptorok szabályozzák, míg az 5HT2A és az 5HT3 receptoroknak valószínûleg csak a VTA stimulálása következtében, vagy kokain, amphetamin hatására már megemelkedett dopamin transzmisszió további növelésében van szerepük (45). A kábítószerek hatása a jutalmazó rendszerre A természetes stimulusok és magatartásformák (táplálék, víz, újdonságok, szexuális aktivitás, felfedezõ viselkedés, gondoskodás) (32), valamint a különbözõ abúzusszerek (34) aktiválják a mezolimbiko-kortikus jutalmazó pályarendszert. Az

20

Irodalmi háttér


eredmény minden esetben az aktiválódásához kapcsolódó kellemes érzés kialakulása, mely hozzájárul a drogok akut megerõsítõ (reinforcing) hatásához. A pszichostimuláns hatású kábítószerek (kokain, amphetamin) direkt hatással növelik a jutalmazó rendszerben a dopamin transzmissziót. Az addiktív hatásért a NAcben, míg a pszichostimuláns hatásért a prefrontális kortexben létrejövõ fokozott dopamin transzmisszió a felelõs (34). A kokain gátolja a monoaminok extracelluláris szintjét meghatározó transzporter fehérjéket, így fokozza a monoaminok koncentrációját az

idegterminálisokon.

Bár

a

kokain

hatásáért

elsõsorban

a

dopaminerg

idegvégzõdéseken elhelyezkedõ dopamin transzporter (DAT) blokkolása felelõs, a dendritikusan felszabaduló dopamin visszavételének gátlása, és az így felszabaduló dopaminnak a GABA-erg és glutamáterg végzõdések D1-es receptorain kifejtett hatása is hozzájárul a hatáshoz (39). Az amphetamin és származékai a transzporterek segítségével önmaguk is bejutnak a monoamin idegvégzõdésbe, ahol a vezikuláris monoamin transzporter (VMAT2) gátlásával a monoamin tartalmú vezikulák kiürülését okozzák, majd reverz transzportot indukálva fokozzák a transzmissziót (34). A phenciklidin nem kompetitív NMDA glutamát receptor antagonista, mely a glutamát serkentõ hatását gátolva, csökkenti a GABA-erg sejtek kisülését a mezolimbikus rendszerben, így a VTA-ban is. Hatására megnövekszik a dopamin kiáramlás a prefrontális kéregben és a NAc magi részében. Egyes vizsgálatok szerint a dopaminerg aktivitást fokozó hatásához hozzájárul DAT gátló képessége is (34;46). Az ópiátok hatásukat az endogén opioid receptorokon fejtik ki. Jutalmazó hatás szempontjából a µ-opioid receptor tûnik a legfontosabbnak (33), melyen keresztül a heroin és a morfin gátolja a VTA dopaminerg sejtek kisülését gátló GABA-erg sejteket. Ez

a

diszinhibíció

megnövekedett

dopamin

felszabadulást

okoz

a

nucleus

accumbensben. A marihuána és a hasis fõ pszichoaktív összetevõje a ? 9-tetrahydrocannabinol (THC). A kannabisz származékok az endogén kannabinoid receptorokon hatnak. Az egyes típusú kannabinoid receptorok (CB1) az agyban, elsõsorban a laterodorzális cauda-putamenben, a SNpr-ban, a globus pallidusban (GP), kisebb koncentrációban a NAc-ben és a VTA-ban találhatók, míg a kettes típusú kannabinoid receptorok (CB2) inkább a periférián helyezkednek el (38). A kannabisz származékok növelik a dopamin

21

Irodalmi háttér


transzmissziót a mezolimbikus rendszerben (37), valószínûleg a NAc-ben és a VTA-ban található CB1 receptorokon keresztül (38). A nikotin direkt nAChR agonista. A nAChR-ok agyi eloszlása igen kiterjedt, fõleg preszinaptikusan helyezkednek el, stimulálásuk számos neurotranszmitter (ACh, 5HT, GABA, Glu) felszabadulását idézi elõ. Nikotinos receptorok a VTA dopaminerg neuronjain is expresszálódnak (33). Szisztémás nikotin adagolás fokozza a dopaminerg neuronok kisülését, melynek következtében megnövekszik a dopamin felszabadulás a NAc-ben (47) és a prefrontális kortexben. Nikotin hatására megnõ a szerotonin transzmisszió is ezeken a területeken, azonban ez a hatás függ az alap szerotonin aktivitástól (48). A hallucinogén hatású LSD (lizergsav-dietilamid) szerkezete a szerotoninéhoz hasonló, hatását többek között az 5HT2A és 5HT2C receptorokon fejti ki, és az excitátoros glutamát transzmissziót fokozza a kortexben (49;50). A kábítószerfüggõség pszichológiai vonatkozásai A kábítószerek használatát meghatározó igen fontos tényezõ a kábítószer fogyasztó személyisége (23). Az intenzív drogfogyasztás kialakulásának folyamata általában hosszú, azonban valószínûleg már a droggal való tényleges megismerkedés elõtt eldõl, vajon az adott személy kevéssé vagy fokozottan veszélyeztetett-e ebben a vonatkozásban (51). A modern személyiség-pszichológia Cloninger pszichobiológiai modellje alapján a személyiség négy olyan összetevõjét különíti el, melyek a különbözõ környezeti ingerekre adott automatikus, pre-konceptuális válaszmintázatot hordozzák (52). Ezeket az öröklött alapokkal rendelkezõ, már gyermekkorban megnyilvánuló, kulturális és szociális hatásoktól nagyrészt független, neurobiokémiai funkciókkal magyarázható, az implicit

ismeretek

megszerzésében

szerepet

játszó

személyiség-összetevõket

temperamentum faktornak nevezik. Cloninger az újdonságkeresést (novelty seeking) a dopaminerg, a fájdalomkerülést (harm avoidance) a szerotonerg, a jutalomfüggõséget (reward dependence) és ennek korábban alskálájaként ismert, késõbbiekben önálló temperamentum faktorként vizsgált kitartást (persistence) pedig a noradrenerg rendszer mûködéséhez kapcsolta (52;53). Ikreken és örökbefogadott gyermekeken végzett

22

Irodalmi háttér


viselkedés-genetikai

vizsgálatok

eredménye

alapján

a

személyiség-dimenzók

örökölhetõsége 0,4-0,5, azaz igen jelentõs a genetikai komponens (54;55). A temperamentum faktorok által meghatározott viselkedést módosítják az úgynevezett karakter faktorok, melyek elsõsorban tanult mintázatok, és csak felnõttkorban jelennek meg, illetve teljesednek ki. A személyiség objektív vizsgálatára az Eysneck-i vizsgálatokon alapuló személyiség kérdõíveket használják. Leggyakrabban a Zuckerman által kidolgozott (Zuckerman-Kuhlman Personality Questionnaire) és a Cloninger-féle (Tridimensional Personality Questionnaire (TPQ),

illetve

ennek

továbbfejlesztett

változata

a

Temperament and Character Inventory (TCI)) személyiség kérdõíveket alkalmazzák a pszichobiológiai kutatásokban. Újdonságkeresõ személyiség és a kábítószerfüggõség Klasszikus értelemben az újdonságkeresés olyan adaptív magatartásforma, mely a megváltozott életkörülményekhez való alkalmazkodást teszi lehetõvé felderítõ (pl. élelemkeresõ) viselkedéssel. Ez a tevékenység alapvetõ fontossággal bír az automatikus választendenciák kialakításában, míg a jutalomfüggõség és a fájdalomelkerülés dimenziói a válasz fenntartásában, illetve a viselkedés megszûntetésében játszanak kiemelkedõ szerepet (32;53). Állatokban

az

újdonságkeresõ,

felderítõ

magatartást

különbözõ

viselkedésteszteken (open-field arena, novel object arena, place preference) vizsgálják, emberekben az újdonságkeresés objektív becslésére a személyiség kérdõívek skáláit használják. Gyakran használt mérõszám a Zuckerman-féle személyiség kérdõív élménykeresõ

(sensation

seeking),

és

a

Cloninger-féle

személyiség

kérdõív

újdonságkeresõ skálája. A két skála jól korrelál egymással (32). Ezek a személyiség skálák az élményt, vagy az újdonságot, mint az emberek újdonságokra, új élményekre, változatos ingerekre való nyitottságát, és ezek keresésére irányuló szükségleteinek mértékét mérik. Az újdonságkeresés a többi temperamentum faktorhoz hasonlóan az öröklött viselkedés-mintázatok

közé

tartozik,

kialakításában

hozzájárulást igazoltak (56).

23

közel

50%-os

genetikai

Irodalmi háttér


Az állatok viselkedését elemzõ vizsgálatok eredménye arra hívta fel a figyelmet, hogy az újdonságkeresés és a drogkeresõ magatartás (drug seeking behaviour) vezérlésében a biológiai út azonos. Ezeknél a tevékenységeknél a mezolimbiko-kortikus dopaminerg rendszer aktiválódása játszik szerepet. Ezért felvetõdött a kérdés, vajon a két viselkedés között van-e valamilyen kapcsolat, azaz a jelentõs mértékben genetikailag meghatározott viselkedésmintázat, az újdonságkeresés szélsõséges formája hozzájárulhat-e a drogkeresõ magatartás kialakulásához. A nagyobb mértékû újdonságkeresés drogfogyasztásra prediszponáló hatását Piazza és mtsai. vizsgálták patkányokon. Az „open field arena” vizsgálattal meghatározott spontán újdonságkeresõ aktivitásuk alapján két, egy magas és egy alacsony újdonságkeresõ csoportba osztották az állatokat, majd amphetamin adagolást követõ válaszaikat (locomotor activity) mérték. A magas újdonságkeresõ csoportban szignifikánsan nagyobb aktivitást mértek (57). Humán

vizsgálatok

elsõsorban

a

kábítószerfüggõk

személyiségjegyeinek

tanulmányozásán alapulnak. Kábítószerfüggõk átlagosan magasabb pontszámot értek el az újdonságkeresõ skálán, mint a kontroll populáció tagjai (58-61). Az élmény- és újdonságkeresõ emberek gyakrabban ûznek veszélyes sportokat, mint például a hegymászás, sziklamászás, sikló repülés, autóversenyzés, ejtõernyõzés, bungie jumping. Ezek a stimulusok erõsen aktiválják a jutalmazó rendszert, és így valószínûleg egy öröklötten nagyobb újdonság iránti biológiai szükségletet elégítenek ki. Feltételezik, hogy a kábítószerfüggés alapját is – legalábbis részben – a jutalmazó rendszer nagyobb mértékû aktivitás igénye határozza meg (22;32). A kábítószerfüggõség genetikai faktorai A szociális és kulturális hatások jelentõsége mellett ma már egyre elfogadottabb nézet, hogy a kábítószerfüggõség kialakulásában a genetikai tényezõk is igen jelentõs szerepet

játszanak.

Család-,

iker-

és

adoptációs

vizsgálatok

alapján

a

kábítószerfüggõség genetikai komponensét 40-60%-ra becsülik (62). A drogfüggés, a legtöbb pszichiátriai betegséghez hasonlóan, a komplex öröklõdésû betegségek csoportjába sorolható (63-65), azaz a genetikai mintázat hajlamosíthat a függõség kialakulására, a biológiai és a pszichológiai sérülékenységen (vulnerabilitás) keresztül.

24

Irodalmi háttér

A D4-es dopamin receptor és genetikai polimorfizmusai

Az abúzusszerek célmolekulái, valamint a drogok metabolizmusában szerepet játszó enzimek génjeiben található polimorfizmusok a kábítószerek farmakokinetikai és farmakodinamiai paramétereit befolyásolva fogékonyabbá tehetik a szervezetet a függõség kialakulására (biológiai vulnerábilitás). A jutalmazó rendszer mûködésében szerepet játszó molekulák génjei, valamint azok a gének, melyeknek polimorfizmusai a kábítószerfüggõség

kialakulására

igazoltan

hajlamosító

személyiségjegyek

(újdonságkeresés) és rendellenességek (ADHD) megjelenésében rizikó faktorként szerepelnek, a pszichológiai sérülékenység örökletes tényezõiként jelenhetnek meg. Értelemszerûen ezek a gének szerepelhetnek kandidáns génként az asszociáció vizsgálatok során (III. táblázat). III. táblázat: A kábítószerfüggõség kandidáns génjei A kábítószerek célmolekuláinak génjei: ? és ? opioid receptorok, CB1 receptor, DAT1 Metabolizáló enzimek génjei: CYP 2D6 A jutalmazó rendszer génjei: Dopaminerg rendszer Szerotonerg rendszer Receptorok: DRD1 – DRD5 (DRD4) 5HT1B Transzport fehérjék: DAT SERT Enzimek: DBH, COMT MAO-A Hajlamosító rendellenességekkel, személyiségjegyekkel asszociált gének: ADHD: Újdonságkeresés:

DRD4, DAT1 DRD4

Rövidítések: CB1: egyes típusú kannabinoid receptor, DAT: dopamin transzporter, CYP 2D6: citokróm P450 izoenzim, DBH: dopamin-? -hidroxiláz, COMT: katekol-Ometiltranszferáz, 5HT1B: 1B szerotonin receptor, DRD1, DRD4, DRD5: dopamin receptor altípusok, SERT: szerotonin transzporter, MAO-A: monoamino-oxidáz A, ADHD: figyelemhiányos hiperaktivitás zavar

A D4-es dopamin receptor és genetikai polimorfizmusai A D4-es dopamin receptor (DRD4) A D4-es dopamin receptor a G fehérje kapcsolt, hét transzmembrán doménnel rendelkezõ receptor családba tartozik. A receptor aktiválás következtében az adenilcikláz gátlódik, és az intracelluláris cAMP szint csökken. A receptor mûködésében feltehetõen szerepe van más, a cAMP-tõl független, Gi fehérjékhez kapcsolt jelátviteli mechanizmusnak is. Feltételezik például a Na+/H + antiporter, vagy a G protein függõ,

25

Irodalmi háttér


befelé rektifikáló kálium csatorna (GIRK1) aktivációjának, illetve az L-típusú Ca++ csatorna gátlásának a szerepét (66). A D4-es dopamin receptorok lokalizációját illetõen a különbözõ módszerekkel végzett vizsgálatok azt mutatták, hogy a retina mellett elsõsorban a limbikus rendszerben, így a hippocampus és a prefrontális kéreg GABA-erg sejtjein, a prefrontális kéreg motoros neuronjain, valamint az amygdala és az enthorhinális kéreg egyes területein nagy a D4-es receptor denzitás. A prefrontális kéregben a D4-es receptorok száma nagyságrendileg a D2-es receptorokéhoz hasonló, míg a többi területen általában nagyságrendekkel kevesebb található. A korábbi feltételezésekkel ellentétben, érzékenyebb vizsgálatokkal kimutatták a D4-es receptorok jelenlétét a bazális ganglionokban (a SNpr és a GP GABA-erg sejtjein) is, elsõsorban preszinaptikus lokalizációban (67). A D4-es receptoron keresztül megvalósuló dopaminerg funkciók tanulmányozása szelektív DRD4 ligandokkal, valamint DRD4 knock-out egerek vizsgálatával történt. Rágcsálókban végzett vizsgálatok során szelektív DRD4 antgonistákkal (pl. PNU101,387G; NRA0045; NRA0160) kapott eredmények nem egységesek, de általában elmondható, hogy hatásukra csökkent az amphetamin kiváltotta hiperaktivitás, megnövekedett a dopamin turnover az elõagyban, és megszûnt a hosszú távú amphetamin adagolás hatására egyébként kialakuló viselkedési szenzitizáció (lokomotor aktivitás és sztereotíp mozgások) vagy fordított tolerancia (66). A viselkedési szenzitizáció hátterében feltehetõen biokémiai és genetikai neuroadaptáció áll, mely az ismételt amphetamin expozíció következtében pre- és posztszinaptikusan is kialakul. Preszinaptikusan a legkonzisztensebb adaptív válasz az amphetamin dopamin kiáramlást fokozó képességének növekedése a dorzális striátumban. Posztszinaptikusan pedig a nucleus accumbensben egyes transzkripciós faktorokat (c-fos és Fos-like antigének, CREB (cAMP-responsive element binding protein), NGFI-A (nerve growth factor-induced gene A)) és neuropeptideket (dinorfin, enkefalin, P anyag) kódoló gének expressziójának változása mutatható ki. DRD4 antagonista hatására csökkent az amphetamin dopamin szint növelõ képessége a nucleus accumbens kérgi részében, és csökkent az amphetamin c-fos expressziót fokozó kapacitása is (68). A legújabb kutatások alapján feltételezik, hogy a D4-es receptoron keresztül a dopamin gátolja a

26

Irodalmi háttér


frontális kortex glutamáterg piramis és GABA-erg sejtjeinek aktivitását, ezáltal befolyásolja a prefrontális kortex mediálta funkciókat (67). DRD4 knock-out egerek esetében ugyan nem találtak jelentõs anatómiai eltéréseket, azonban ezek az egerek olyan fenotípusos jegyekkel rendelkeztek, melyek a D4-es receptornak az újdonságkeresõ magatartásban, a lokomócióban és a drogok iránti érzékenységben betöltött szerepére hívták fel a figyelmet. Így ezen egerek spontán lokomotor aktivitása, és vertikális mozgásai (ágaskodás) csökkentek, ugyanakkor fokozottan érzékenyek voltak a kokain, az amphetamin és az alkohol lokomotor stimuláló hatására. Megnövekedett a dopamin szintézis és kiáramlás a dorzális striátumban, mely magyarázhatja a „rotarod” teszten mért, a vad típusú egerekhez képest jobb mozgáskoordinációt (69). A nem kondicionált fájdalmas stimulusokra („fear conditioning”) az állatok elkerülõ válasza fokozódott (70), míg az újdonság stimulusokra adott felfedezõ viselkedésük csökkent (71). A DRD4 gén polimorfizmusai A DRD4 gén a 11-es kromoszóma rövid karján helyezkedik el (11p15.5) a Harvey-Ras és a tirozin hidroxiláz enzim génje között, 4 exont és 3 intront tartalmaz. A génszekvenciát Van Tol és munkatársai állapították meg (72). A gén 5’ régióját Kamakura 1997-ben klónozta (73). A DRD4 génben számos polimorfizmus található (5. ábra). 11p15.5 1

5’

120 bp: 1-2x ? transzkripció (?)

2

3

48 bp: 2-10x ?

120 bp dup

4

3’

3. IC hurok

48 bp VNTR

- 521 C/T: T ? transzkripciós aktivitás 40% ?

5. ábra: A DRD4 gén vizsgált polimorfizmusai A DRD4 génben található polimorfizmusok helyét (az 5’ nem kódoló régióban, az 1. és 3. exonban, valamint az 1. intronban) szürke vonalak, illetve szakaszok jelzik. Az általunk vizsgált polimorfizmusokat (120 bp dup, -521 C/T, 48 bp VNTR) kiemeltem.

27

Irodalmi háttér


Az exonokban található, azaz a kódoló régiót érintõ polimorfizmusok megváltoztathatják a fehérje szerkezetét, így hatással lehetnek a receptor funkciójára is (IV. táblázat), míg a promoter régió polimorfizmusai a transzkripció mértékét befolyásolhatják. IV. táblázat: A DRD4 gén kódoló régiójának polimorfizmusai

I. exon

polimorfizmus

Lokalizáció Gyakoriság a Receptor populációban szerkezeti eltérés

12 bp duplikáció (74)

552-563

13 bp deléció (75)

711-723

G/C csere (76)

31

21 bp deléció (76)

III. exon

T/G csere (77)

3000

48 bp VNTR (78)

3163-

Receptor funkcionális eltérés Dup.: 94% +/-4 AS az 1 TM funkcionális eltérést (észak-európai) doménban nem igazoltak Del.: 2% Csonka fehérje teljes funkció kiesés (német) (korai stop kodon) C: 1% 1 TM domén 11. funkcionális eltérést (német) AS nem igazoltak Gly/Arg csere Del:1% - 7 AS 1 TM kényszer- és (német) pánikbetegekben írták le 5 TM domén 194 ligand iránti G: 12,5% AS:Val/Gly csere affinitás csökken (afrikai) 4x: 64,3% 7x: 20,6% 2x: 8,2% (79)

+/- n x 16 AS a III. IC hurokban

G fehérje kötés?

A III. exon 48 bp VNTR polimorfizmusa (DRD4 48 bp VNTR) Van Tol és munkatársai 1992-ben írták le a DRD4 gén III. exonjában található 48 bp-nyi szakasz ismétlõdési polimorfizmusát (78) (5. ábra, 48 bp VNTR). A munkacsoport háromféle allélvariációt talált, a 48 bp-nyi szakasz kétszeres, négyszeres és hétszeres ismétlõdését. A polimorf régió a fehérje 3. intracelluláris kanyarulatának G fehérje kötõ részét kódolja (78). További vizsgálatok eredményeként újabb formákat írtak le, így az ismétlõdések lehetséges száma 2 és 10 között változhat. A variabilitást tovább növeli, hogy az egyes ismétlõdéseken belül is találtak szekvenciabeli eltéréseket. Eddig 19 féle szekvencia-változatot azonosítottak, melyek 27 féle haplotípust és legalább 20 féle receptor fehérje formát eredményeznek (80). A IV-es táblázatban bemutatott allélgyakoriságok eloszlását 36 populáció vizsgálata alapján írták le. Érdekes, hogy míg az amerikaiak között a hetes allél frekvenciája magasabb (48,3%), addig az ázsiai populációban inkább a kettes allél a gyakoribb (18,1%) és a hetes forma meglehetõsen ritka (1,9%) (79).

28

Irodalmi háttér


A DRD4 48 bp VNTR farmakológiai és farmakogenetikai vizsgálata A leggyakoribb receptor formák in vitro vizsgálata során azt találták, hogy az egyik szálon négy, a másik szálon hét ismétlõdést tartalmazó (DRD4 4/7) izoforma esetében a dopamin forskolin által stimulált cAMP szint csökkentõ hatása (EC50: 36,9 ? 4,6 nM) körülbelül a fele a 2/4 (EC50: 18,8 ? 2,7 nM), a 4/4 (EC50: 13,8 ? 2,7 nM), illetve az ismétlõdõ szekvenciát egyáltalán nem tartalmazó (EC50: 17,6 ? 4,7 nM) izoformákon közvetített dopamin hatásnak (81). Más vizsgálatokban a dopamin hatáserõssége a 4/10 receptoron két-háromszor volt nagyobb (EC50: 10,0 ? 3,1 nM) mint a 2/4 izoformán (EC50: 27,5 ? 5,5 nM) (82). Ezek alapján valószínûleg nincsen lineáris összefüggés az ismétlõdési szám és a funkcionális aktivitás között. A három leggyakoribb (DRD4 2/4, 4/4, 4/7) receptor típus ligandkötési vizsgálata azt mutatta, hogy NaCl hiányában nincs szignifikáns különbség a spiperon egyes izoformákhoz való affinitásában (Kd: 46,14 ? 14; 54 ? 11; 66 ? 34 pM). Ugyanakkor 120 mM NaCl jelenlétében a spiperon disszociációs konstansa a kétszeres és a négyszeres ismétlõdést tartalmazó forma estében a kétszeresére nõtt (Kd: 81 ? 18; 100 ? 23 pM), míg a hétszeres forma esetében nem változott (67 ? 24 pM). Hasonló adatokat kaptak a 2/4 és 4/4 forma spiperonnal kompetícióban lévõ clozapin kötésének NaCl függését vizsgálva is, ugyanakkor a 4/7 izoforma nem mutatott ilyen sófüggést (78). A legrövidebb (2/4) és a leghosszabb (4/10) receptorok esetében találtak némi affinitásbeli különbséget

az

antagonista

(+)-butaclamol,

cis-flupentixol,

epidiprid,

illetve

fluphenazin esetében, a különbség azonban nem volt szignifikáns (82). Az egyes izoformák in vitro kimutatható affinitásbeli különbségei valószínûleg in vivo nem játszanak szerepet a gyógyszerek terápiás hatékonyságában, ugyanakkor biológiai szerepük lehet a viselkedési diverzitásnak a kialakulásában (81). Farmakogenetikai vizsgálatok elsõsorban skizofrén betegek körében zajlottak. Bár a clozapin affinitása a D4-es receptorhoz öt-tízszer nagyobb mint a D2-es, vagy D3ashoz (72), a clozapinra adott terápiás válaszban nem találtak genotípusosan meghatározott különbséget (83;84), ugyanakkor eltérést találtak a klasszikus neuroleptikumokra adott válaszkészségben. A 4/7 izoformával rendelkezõ betegek kevésbé reagáltak a klasszikus neuroleptikus terápiára, vagy érzékenyebbek voltak a mellékhatásokra (83). A 4/4-es genotípusú – fõleg férfi – betegek akut neuroleptikus

29

Irodalmi háttér


kezelésre adott terápiás válasza jobbnak tûnt, és ritkább volt a remisszió elõfordulása (85). Serdülõk elsõ skizofréniás epizódjának risperidonnal történt kezelése során gyakoribb volt a kedvezõ terápiás válasz kialakulása a 7 ismétlõdésnél kevesebbet tartalmazó izoformával rendelkezõk körében (86). A promoter régió - 521 C/T polimorfizmusa (- 521 C/T SNP) A D4-es dopamin receptor gén 5’ nem-kódoló régiójában Kamakura és munkatársai azonosították a szövetspecifikus expresszióért felelõs promoter régiót a -591 – -123 pozíciók közt, és leírtak egy negatív modulátor területet is a -770 – -697 területen (73). Az 5’ nem-kódoló régióban számos SNP található (V. táblázat). A felismert SNP-k száma napról napra nõ (87). V. táblázat: A DRD4 gén 5’nem-kódoló régiójában leírt polimorfizmusok SNP

-1106 -809 C/T A/G

-768 G/A

-616 C/G

-615 A/G

-603 G/T

-600 G/C

-521 C/T

-376 C/T

-364 A/G

-291 C/T

-128 G/T

NCBI SNP Database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/) alapján Okuyama és munkatársai a promoter régió -521-es helyén található citozin–timin (-521 C/T) cserével járó polimorfizmus esetében (5. ábra, -521 C/T) funkcionális különbséget mutattak ki a két polimorf allél között. Kloramfenikol acetil transzferáz riporter rendszerben a T változat esetében a transzkripciós aktivitást 40%-kal alacsonyabbnak találták a C változathoz képest (88). A promoter 120 bp duplikációja (120 bp dup) Az 5’ régióban, a start kodontól 1,24 kb-ra található hosszúság-polimorfizmusnál egy 120 bp-nyi szakasz egyszer (1x) vagy kétszer (2x) fordul elõ (5. ábra, 120 bp dup). Ez a 120 bp-nyi szakasz olyan konszenzus szekvenciákat tartalmaz, melyekhez transzkripciós faktorok (GR, MEP-1, Rad-1, Zeste, Sp-1, myogenin, MBF-I) kötõdnek. Feltételezik, hogy a különbözõ allélok esetében a transzkripciós aktivitás megváltozhat. Az Sp-1 transzkripciós faktor kötõdési kapacitásának vizsgálata során munkatársaim azt találták, hogy a duplikált forma esetében erõteljesebb a kötõdés, és feltételezhetõen erõteljesebb a transzkripció iniciációja (89). A duplikációt tartalmazó allél gyakorisága

30

Irodalmi háttér


40,4% (afrikai törzsekben) és 81% (dán populációban) között mozog 11 populáció vizsgálata alapján (90). A DRD4 gén polimorfizmusainak asszociáció vizsgálatai A DRD4 gén az újdonságkeresés és számos pszichiátriai betegség gyakran vizsgált kandidáns génje. Újdonságkeresõ személyiség-dimenzió Az asszociáció vizsgálatok körében elsõként jelent meg 1995/96 telén két, nemzetközileg is nagy érdeklõdést kiváltó tanulmány, melyek egymástól függetlenül mutattak ki statisztikai asszociációt egy személyiségjegy és a dopamin D4-es receptor III. exonjában található 48 bp VNTR polimorfizmusa között (91;92). A késõbbiekben számos vizsgálat megerõsítette az újdonságkeresés és a „hosszú DRD4 allél” asszociációját (93-96), míg szinte azonos számban jelentek meg az összefüggést cáfoló közlemények (97-100). A DRD4 gén promoter régiójában található -521 C/T polimorfizmust szintén az újdonságkeresõ személyiségjeggyel kapcsolatban vizsgálták. Az eredmények azt mutatták, hogy a CC homozigóták magasabb pontszámot értek el az újdonságkeresés dimenziójában, míg a TT homozigóták a legalacsonyabbakat (101;102). Nõkben ez a hatás erõsebbnek tûnt (102;103). Voltak, akik nem találtak asszociációt (104;105), vagy csak a 48 bp VNTR-rel interakcióban találtak hatást (105). A 120 bp duplikáció esetében a rövid/rövid (1/1) genotípus és a magasabb újdonságkeresõ pontszám között találtak összefüggést (106). Figyelemhiányos hiperaktivitás zavar (ADHD) További asszociáció elemzések során olyan komplex öröklõdésû kórképeket vizsgáltak, melyek hátterében a dopaminerg rendszer zavara áll. A hangulati élet betegségei (unipoláris és bipoláris depresszió) és a skizofrénia vonatkozásában nagyrészt negatív eredmények születtek (66). A DRD4 48 bp VNTR 7-es alléljának szignifikáns feldúsulását mutatták ki gyermekkori figyelemhiányos hiperaktivitás zavarban eset-kontroll vizsgálatok során (107;108), melyet családvizsgálatok is

31

Irodalmi háttér

A szerotonin transzporter és genetikai polimorfizmusai

megerõsítettek (109;110). Itt is születtek azonban ellentmondó eredmények (111;112). A publikált eredmények meta-analízise megerõsítette a DRD4 48 bp VNTR és az ADHD összefüggését (3). A szerotonin transzporter és genetikai polimorfizmusai A szerotonin transzporter (SERT) A plazmamembránban található szerotonin transzporter (5-hidroxi-triptamin transzporter, 5HTT, SERT) a 12 transzmembrán domainnel rendelkezõ fehérjecsaládhoz tartozik. A transzporter Na+ gradiens ellenében veszi vissza a szerotonint az extracelluláris térbõl a sejtekbe, ezáltal szabályozva a hozzáférhetõ szerotonin szintet. A SERT szerotonin turnovert szabályozó szerepét támasztják alá SERT génkiütött egérvizsgálatok, melyek szerint a génkiütött egerekben az extracelluláris szerotoninszint hatszorosára növekedett, miközben az intracelluláris szerotonin 60-80%-kal csökkent (113). Szerotonin transzporter expresszálódik a mediális és dorzális raphe magvak sejttestjén, valamint a szerotonerg rostok axon terminálisain, dendritjein és egyes asztrocitákon. Perifériásan kimutatható a trombocitákon, a gasztrointesztinális traktusban és a mellékvesevelõben (113). A SERT az egyik fõ célmolekulája számos pszichoaktív vegyületnek. A szelektív szerotonin visszavétel gátló (SSRI) antidepresszánsok gátolják a mûködését, a pszichostimulánsok (amphetamin) a transzport megfordításával növelik a szinaptikus szerotonin szintet. In vivo vizsgálatok során a SERT szint csökkenését találták alkoholistákban (114), major depresszióban (115) és impulzív-agresszív betegekben (116). Postmortem vizsgálatok során alacsonyabb SERT kötést mértek depressziós betegek prefrontális kortexében (117). A SERT gén polimorfizmusai A szerotonin transzporter gén a 17-es kromoszóma hosszú karján található (17q11.2), 14 exonból és 13 intronból áll. A SERT gén legtöbbet vizsgált polimorfizmusa a gén expresszióját szabályozó promoter régióban található hosszúság-

32

Irodalmi háttér


polimorfizmus, az 5HTTLPR (5HTT linked polymorphic region). A génexpresszió szabályozásában azonban szerepe lehet a második intron hosszúság-polimorfizmusának is (STin2, szerotonin transzporter intron 2 polimorfizmus) (6. ábra). 17q11.2 5’

1a 1b

2

3 4 5 67

8

9 10 11 12

16-17 bp 9-12x 12x ?

20-23 bp 5HTTLPR 14-16x 14x ? génexpresszió ?

13

14

3’

STin2 génexpresszió ?

6. ábra: A szerotonin transzporter gén vizsgált polimorfizmusai

A promoter hosszúság-polimorfizmusa (5HTTLPR) Az 5HTTLPR a szerotonin transzporter gén promoterének -1376– -1027 szakaszán található hosszúság-polimorfizmus, melyre egy változó hosszúságú (20-23 bp) szakasz leggyakrabban 14-16-szoros ismétlõdése jellemzõ. A szekvencia guaninban és citozinban gazdag (118). In vitro, JAR humán placenta choriocarcinoma sejtekben vizsgálták a génvariánsok expresszióra kifejtett hatását. A hosszú (l6x) allélt tartalmazó konstrukció esetében nagyobb volt a transzkripció, mind az alap, mind a forskolinnal (cAMP), illetve forbol észterrel (protein kináz C) aktivált rendszerekben (118). Különbözõ genotípusú (14/14, 14/16, 16/16) limfoblasztokban vizsgálva a következõ eredményeket kapták. Míg a 14/14 és 14/16 genotípusok transzkripciós aktivitásában nem volt lényeges különbség, a hosszú allélt (16x) homozigóta formában tartalmazó genotípus (16/16) esetében a transzkripciós aktivitás 2-3-szor, a keletkezõ mRNS mennyisége 1,4-1,7-szer, a transzporter aktivitás pedig, 2-szer nagyobb volt mint a többi genotípus esetén (119).

33

Irodalmi háttér


Farmakogenetika A szerotonin transzporter vonatkozásában széles körû farmakogenetikai vizsgálatokat végeztek, az eredmények azonban ellentmondásosak. Olasz populációban végzett vizsgálatok során a hosszú allélt egy vagy két példányban hordozó (14/16, l6/16 genotípusú), bipoláris vagy unipoláris depresszióban szenvedõ betegekben a fluvoxamin és paroxetin Hamilton skálán mért klinikai terápiás hatékonysága szignifikánsan jobb volt mint a 14/14 genotípusú betegeké. Ugyanakkor koreai populációban ezzel ellentétes eredményt kaptak. Kényszerbetegségben az SSRI-k terápiás hatékonysága és a polimorfizmus között nem találtak szignifikáns különbséget (120). A 2. intron hosszúság-polimorfizmusa (STin2) A szerotonin transzporter gén 2 intronjában található egy másik hosszúságpolimorfizmus (STin2), melyben egy 16-17 bp-os szakasz ismétlõdik leggyakrabban 9-, 10- vagy 12-szer (119). Bár ez a polimorfizmus intronban helyezkedik el, feltehetõen hatással van a transzkripcióra. A 12-es ismétlõdést tartalmazó riporter rendszerekben a 10-hez képest megnövekedett SERT expressziót találtak (121), valamint a 12-es allélt hordozó transzgenikus egerekben a SERT expressziója magasabb volt az embrionális fejlõdés alatt a dorzális raphe magvak környékén (122). A SERT gén polimorfizmusainak asszociáció vizsgálatai Az 5HTTLPR és a személyiségjegyek közti asszociáció vizsgálat során a 14-es ismétlõdést tartalmazó, rövid allél összefüggést mutatott a szorongással kapcsolt személyiségjegyekkel, illetve a fájdalomkerülés magasabb pontszámaival (119). A SERT polimorfizmusait vizsgálták többek között skizofréniában, depresszióban és affektív kórképekben, alkoholisták, obszesszív-kompulzív betegek és autisták körében, valamint az öngyilkosság rizikófaktoraként (120;123;124).

34

Célkitûzések


CÉLKITÛ ZÉSEK A kábítószerfüggõség molekuláris genetikai vizsgálatához biztonságos és megbízható módszertani technikák kidolgozását, majd ezek alkalmazásával kandidáns gének populáció alapú eset-kontroll asszociáció vizsgálatát tûztük ki célul. Kandidánsként azon géneket (DRD4, SERT génje) jelöltük ki, melyek funkcionális polimorfizmusai a monoaminerg rendszerek mûködésének befolyásolása révén hozzájárulhatnak a függõségre való hajlam és a szenvedélybetegség kialakulásához.

Nem invazív mintavételi eljárás kidolgozása, az izolált DNS mennyiségi és minõségi vizsgálata A molekuláris genetikai vizsgálatokhoz szükséges DNS-t leggyakrabban a vér limfocitáiból izolálják. Olyan egyszerûsített mintavételi technika kidolgozását tûztük ki célul, mely nem invazív, nem igényel speciális képzettséget és technikai felszerelést, széles körben alkalmazható, biztonságos, nem idõigényes, ugyanakkor az izolálható DNS mennyisége elegendõ, minõsége megfelelõ a kívánt molekuláris genetikai vizsgálatok elvégzéséhez. Genotípus meghatározás a szájnyálkahártyából nyert kis mennyiségû DNS felhasználásával A kidolgozott mintavételi módszerrel nyert mintákból izolált DNS molekuláris genetikai

vizsgálatához

a

laboratóriumban

korábban

alkalmazott

módszertani

technikákat (PCR, elektroforézis) olyan formában kívántuk alkalmazni, mellyel a rendelkezésre álló (kevesebb) DNS-bõl is megfelelõ biztonsággal és hatékonysággal tudtuk a genotípust meghatározni. A DRD4 és a SERT gén polimorfizmusai és a kábítószerfüggõség asszociáció vizsgálata Vizsgálni kívántuk a drogfüggõség és a DRD4 génnek, valamint a hozzáférhetõ szerotonin szintet szabályozó, ezáltal a dopaminerg transzmissziót is moduláló szerotonin transzporter génjének polimorfizmusai (5HTTLPR, STin2) közötti lehetséges összefüggést és a két rendszer molekuláris genetikai szintû interakcióját.

35

Módszerek

A vizsgálatban résztvevõ személyek

MÓDSZEREK A vizsgálatban résztvevõ személyek Betegek A vizsgálatban 77 nem rokon kábítószerfüggõ vett részt. A betegeket az Országos Pszichiátriai és Neurológiai Intézetben, dr. Gaszner Péter fõorvos pszichiátriai osztályán kezelték, majd a kezelést követõen a dr. Csernus Imre által vezetett rehabilitációs csoportban álltak gondozás alatt. A betegek tájékoztatása és az Etikai Bizottság által elfogadott Hozzájárulási Nyilatkozat aláírását követõen 77 személytõl vettünk DNS mintát, közülük 55 személy volt heroinfüggõ, 21 beteg más kábítószereket (kokain, LSD, marihuána, amphetamin származékok) használt. A vizsgálatból kizártuk az alkoholistákat, valamint azokat a betegeket, akik egyéb pszichiátriai betegségben – major depresszió, schizophrenia – is szenvedtek, így a munka folyamán 73 kábítószerfüggõ személy genotípus adatait használtuk fel (50 férfi, 23 nõ; 53 heroinfüggõ, 20 nem opioid függõ; átlagéletkoruk 28,23 ? 10,63 év ). A pszichiátriai diagnózisok felállítása minden esetben a DSM IV. szerint történt. Kontroll csoport Kontrollként 362 (248 férfi, 114 nõ) nem rokon, az eset csoporthoz nem szerint illesztett egészséges személy mintáit használtuk fel, akik a Semmelweis Egyetem Orvosi Vegytani, Molekuláris Biológiai és Pathobiokémiai Intézetében a dr. Sasvári Mária által vezetett munkacsoport más témájú kutatásaiban vettek részt. A résztvevõ személyek a vizsgálat menetérõl rövid írásos tájékoztatót olvastak el, majd az Etikai Bizottság által jóváhagyott Hozzájárulási Nyilatkozaton a vizsgálatba történõ beleegyezésüket aláírásukkal igazolták. Mintavétel Munkánk

elsõ

lépése

egy

nem

invazív

mintavételi eljárás (125;126)

egyszerûsített, könnyebben kivitelezhetõ változatának kidolgozása volt [I]. A DNS mintavételi eljárás lényege a szájnyálkahártya felszínérõl epithelialis sejtek ledörzsölése

36

Módszerek

DNS izolálás

fültörlõ pálcika segítségével. A mintavétel során a vizsgálati személyeket arra kértük, hogy a fültörlõ pálcika vattás végével dörzsöljék szájnyálkahártyájukat az egyik oldalon legalább 20 másodpercig, majd egy másik pálcikával ismételjék meg ezt a mûveletet a másik oldalon. A két fültörlõ pálcikát 400 ? l térfogatú lízis oldatot (0,1 M NaCl; 0,01 M Tris-HCl pH 8,0; 0,2 mg/ml proteináz-K enzim; 0,5% nátrium dodecil szulfát (SDS) (126)) tartalmazó, jól zárható, fagyálló, nem törékeny, azonosítási számmal és „A” jelzéssel ellátott csõbe helyeztük a vattás végükkel lefelé, és ebben a csõben szállítottuk, majd –20 °C-on tároltuk a feldolgozásig. Biztonsági okokból ezt a mintavételi procedúrát még egyszer megismételtük és „B” mintaként tároltuk. Ily módon egy személytõl 4 pálcikával 2 (A és B jelzéssel ellátott) mintát vettünk. A következõkben részletezésre kerülõ laboratóriumi munkákat a Semmelweis Egyetem Orvosi Vegytani, Molekuláris Biológiai és Pathobiokémiai Intézetében, dr. Sasvári Mária vezetésével az általa irányított laborban végeztem. DNS izolálás A sejtek feltárása az izolálást megelõzõ éjszaka 56 °C-on 12 órás inkubálással történt, melynek során a detergens hatású SDS a sejtmembrán permeabilitását megnövelve és a fehérjéket denaturálva elõsegítette az 56 °C-on maximális aktivitással mûködõ proteináz-K enzim hatását. A DNS izolálás további részei lényegében megegyeznek a klasszikus fenolkloroformos DNS tisztítási módszerrel (127). Az inkubációt követõen a fültörlõ pálcikákat egymáshoz és a mintavevõ csõ belsõ oldalához erõsítettük, majd 15-20 percig 400 g-vel (1000 rpm) centrifugáltuk. Az így nyert nyers kivonatból 400 ? l-t eppendorf csövekbe mértünk át. A DNS extrakcióhoz TE oldattal (10 mM Tris, pH=8,0; 1mM EDTA) telített fenolt, 24:1 arányú TE-vel telített kloroform-izoamil-alkoholt és TE-vel telített kloroformot használtunk a következõ módon. A nyers kivonathoz 200 ? l fenolt adtunk, 30 másodpercig kevertük (Vortex) és 5 percig állni hagytuk, majd mintánként 200 ? l kloroform-izoamil-alkoholt mértünk hozzá. Újabb fél perces keverést és állást követõen nagy fordulatszámú (10000 rpm) 1 perces centrifugálással választottuk szét a fenolos és a vizes fázist. A vizes fázist (felülúszót) óvatos leszívással mértük át egy másik eppendorf csõbe, és azonos térfogatú kloroform izoamil-alkoholt

37

Módszerek

Genotípus meghatározás

adtunk hozzá. A mintákat újra jól megkevertük (Vortex), majd centrifugálással szeparáltuk a fázisokat az elõzõvel azonos módon. Ezután a vizes fázishoz kloroformot adtunk, megkevertük, majd újra szétválasztottuk a fázisokat. Végül a vizes fázisból 200 ? l-t mértünk az 1? l 1mg/ml dextránt tartalmazó eppendorf csövekbe, majd 10 ? l ammónium acetátot és 630 ? l 96%-os etilalkoholt adtunk hozzá. Az alkoholos elegyet legalább egy éjszakán át –20 ?C-on tároltuk. Az izolálás utolsó lépéseként másnap, 20 perces nagy fordulatszámú (10000 rpm) centrifugálással a kicsapott nukleinsav frakciót összegyûjtöttük, majd 75%-os hideg alkohollal kétszer, elõször 500 ? l-el, majd 200 ? l-el átmostuk. A felülúszót leszívtuk, majd az alkohol maradékát Speed Vac vákuum centrifugával távolítottuk el. Az ily módon nyert DNS-t eleinte 20, a késõbbiekben 50 ? l TE-ben oldottuk. Az izolált DNS mennyiségét és minõségét 1%-os agaróz gél elektroforézissel ellenõriztük, nem emésztett, ismert mennyiségû (20 ng) ? fág DNS standardot használva és etidium bromidos festést alkalmazva. Genotípus meghatározás A vizsgált genotípusok és a meghatározás elve Munkám során a D4-es dopamin receptor gén három polimorfizmusának genotípusát határoztam meg. Ebbõl kettõ a gén 5’ nem kódoló régiójában található (120 bp duplikáció, és a -521 C/T egyedi nukleotid polimorfizmus), a harmadik a kódoló régió III. exonjában leírt 48 bp ismétlõdõ szekvencia variáns (DRD4 48 bp VNTR). A szerotonin transzporter gén két vizsgált polimorfizmusa közül az egyik a gén 5’ régiójában (5HTTLPR), a másik a 2. intronban (STin2) elhelyezkedõ VNTR. Módszertani szempontból ezek a polimorfizusok két fõ csoportba sorolhatók: egyedi nukleotid polimorfizmusok (single nucleotide polymorphism, SNP) és hosszúságpolimorfizmusok (variable number of tandem repeats, VNTR).

38

Módszerek


Egyedi nukleotid polimorfizmusok vizsgálatára alkalmazott módszerek elve Kétirányú allél-specifikus amplifikáció (ASA) Az ASA allél-specifikus primerek alkalmazásán alapul. Allél-specifikus primer párt úgy hozhatunk létre, hogy a primer pár a 3’ végén a polimorfizmus különbözõ változataival komplementer. Ha a két allél-specifikus primer ellentétes irányú, és két megfelelõ külsõ primert is alkalmazunk, akkor az amplifikáció eredményeképp létrejövõ PCR termékek méretébõl a genotípus meghatározható. A 7. ábra mutatja az általunk vizsgált DRD4 gén -521 C/T polimorfizmus ASAval történõ genotipizálásának elvét.

– 521 C/T

ctk2

SN0 – „C”

5’

3’ ctk1

T

MS0 – „T” 235 bp 405bp

C Külsõ fragment

605bp

7. ábra: A DRD4 – 521 C/T SNP vizsgálatának elve kétirányú ASA-val [II] A két külsõ primer, a ctk1 és ctk2 által kijelölt DNS szakasz hossza 605 bp (külsõ fragment). A C bázisra specifikus primer, melyet SN0-val jelöltünk, az "értelmes" (sense) iránynak felel meg, a - 521 C bázis jelenléte esetében tapad megfelelõen a templáthoz, és a ctk2 primerrel alkot párt. Az amplifikáció eredménye egy 405 bp hosszú allél-specifikus termék. A T bázisra specifikus MS0-ként jelölt primer, az "értelmetlen" (antisense) iránynak felel meg, és a -521 T allél esetében a ctk1 külsõ primerrel egy 235 bp hosszú termék keletkezését eredményezi. A 605 bp hosszú külsõ fragment a polimorfizmustól független, nem allél-specifikus, külsõ primerekkel keletkezik. A primereket és azok irányát nyilak jelzik.

Restrikciós fragmentum hossz polimorfizmus (RFLP) Az egyedi nukleotid polimorfizmusok megváltoztathatják egy restrikciós enzim hasítási helyét, eltüntetik azt, vagy éppen kialakíthatnak egy újat. Ebben az esetben a

39

Módszerek


restrikciós helyen található polimorfizmus restrikciós emésztéssel vizsgálható. A PCRRFLP elsõ lépéseként elkészítjük a polimofizmust tartalmazó amplikont PCR segítségével, második lépésként a DNS fragmentumot a megfelelõ restrikciós endonukleázzal emésztjük, majd az emésztés után keletkezõ fragmentumok méretét gél elektroforézissel azonosítjuk. Az emésztett, illetve a nem megemésztett termék alapján a genotípus meghatározható. A DRD4 gén promoterének -521 C/T polimorfizmusát vizsgálva az elõ lépésben történõ amplifikációhoz az ASA külsõ primereit használtuk fel (ctk1 és ctk2 ld. VI. táblázat). A következõ lépésben a PCR során keletkezõ 605 bp hosszúságú terméket FspI restrikciós endonukleáz enzimmel emésztettük (8. ábra) [II].

FspI

–521 C/T

ctk1

FspI ctk2

TGCGCA

TGCGCA

5’

T C

3’

218bp

342 bp 560 bp

45bp 45bp

605bp

8. ábra: A DRD4 -521 C/T SNP vizsgálatának elve PCR-RFLP-vel [II] A ctk1 és ctk2 primerek alkalmazásával végzett PCR amplifikáció során keletkezett 605 bp nagyságú termékeket FspI restrikciós enzimmel emésztettük. A keletkezett termékek mérete a polimorf helyen található bázistól függ; T allél esetében az enzim két helyen hasít, így három (45 bp, 218 bp, 342 bp nagyságú), C bázis jelenlétében egy helyen hasít, így két (45 bp, 560 bp nagyságú) fragment keletkezik. A függõleges nyilak az FspI enzim hasítási helyét jelzik, a vízszintes nyilak az alkalmazott primereket. A szaggatott vonalak kijelölik a keletkezõ fragmentumokat. Az FspI a TGCGCA szekvenciát ismeri fel. A DRD4 gén promoterében több helyen is megtalálható ez a szekvencia, így az ASA külsõ primereivel készített 605 bp hosszú DNS fragmenten a -180 – -175 közötti proximálisabb, valamint a -521-es helyen a T allélt tartalmazó, a starttól távolabb esõ -521 – -516 közötti szakaszon. Ebben a

40

Módszerek


rendszerben az FspI enzim mindenképpen hasítja termékünket a proximálisabb hasítási helyen, ezért ez az emésztés belsõ kontrolljaként hasznosítható. Így a -521T allél esetében három (218bp, 342bp, 45 bp) fragmentum keletkezik, citozint tartalmazó allél esetében viszont csak két (560bp, 45 bp) terméket kapunk (8. ábra). Hosszúság-polimorfizmusok vizsgálatának elve Hosszúság-polimorfizmus vizsgálatakor a PCR során kapott termékek alapján a genotípus közvetlenül meghatározható, hiszen a különbözõ alléváltozatokról készült PCR termékek mérete eltérõ. Ilyenkor a reakciótermékek nagysága az ismétlõdések számától függ, melyek molekulatömeg-markerek segítségével az elektroforetikus elválasztás után közvetlenül meghatározhatóak (9. ábra). 2? 4? 6? 2?

6? /6?

4? /6?

4? /4?

2? /4?

2? /2?

4? 6?

9. ábra: Hosszúság-polimorfizmusok genotipizálásának elve Egy génszakasz kétszeres (2x), négyszeres (4x) és hatszoros (6x) ismétlõdését ábrázolja a kép felsõ része. Egyetlen, az ismétlõdõ szakaszon kívül esõ primer pár alkalmazásával az ismétlõdések számától függõ méretû termékek keletkeznek. A lehetséges genotípusok sematikus elektroforetikus képe az ábra alsó részén látható.

41

Módszerek


A genotípus meghatározási módszerek részletes leírása PCR amplifikálási módszerek Primerek -521 C/T kimutatására alkalmazott primerek Az ASA reakció során alkalmazott SN0- és MS0-ként jelölt allél-specifikus, valamint a ctk1- és ctk2-ként jelölt külsõ primereket munkatársaim tervezték (128). Az SN0 jelû primer a C variánssal, az MS0 jelû pedig a T variánssal komplementer. A PCR-RFLP-ben az irodalomban leírtaktól (128) eltérõen az ASA külsõ primereit alkalmaztuk (VI. táblázat) [II]. VI. táblázat: A -521 C/T SNP vizsgálatára alkalmazott primerek név 521ctk1 521ctk2 SN0 MS0

Szekvencia (5’? 3’) GGA ATG GAG GAG GGA GCG GG CGC TCC ACC GTG AGC CCA GTA T GGA GCG GGC GTG GAG GGC GCC TCG ACC TCG TGC GCA

Tm (? C) 61,4 62,0 62,3 64,4

521ctk1 és ctk2 külsõ primerek, SN0 és MS0 allél-specifikus primerek, ahol a specifikus bázist vastag betûvel, szürke mezõben jelöltem. Tm: a primerek olvadáspontja A DRD4 III. exon 48 bp VNTR meghatározása A D4-es dopamin receptor III. exonjában található hosszúság-polimorfizmust kétféle primer párral is vizsgáltuk. Az irodalomban leírt „P” primer pár mellett egy, a laboratóriumunkban tervezett (129) másik primerpárt, a „Z” primereket is alkalmaztuk, melyek közelebb helyezkednek el az ismétlõdõ régióhoz. A VII. táblázat mutatja a „P” és „Z” primerek szekvenciáját, és olvadáspontját, a 10. ábra a polimorfizmushoz viszonyított helyzetüket és a keletkezõ PCR fragmentek méretét. VII. táblázat: A DRD4 48 bp VNTR vizsgálatában alkalmazott két primer pár szekvenciája [I] név 48 bp P1 48 bp P2 48 bp Z1 48 bp Z2

Szekvencia (5’? 3’) GCG ACT ACG TGG TCT ACT CG AGG ACC CTC ATG GCC TTG TGC TCT ACT GGG CCA CGT TC TGC GGG TCT GCG GTG GAG TCT

Tm: a primerek olvadáspontja

42

Tm (? C) 49,9 51,9 55,1 63,5

Módszerek


DRD4 gén III. exon VNTR P2

P1

283bp + (4 x 48)= 475 bp Z1

Z2

171bp + (4 x 48)= 363 bp 10. ábra: A DRD4 48 bp VNTR kimutatására alkalmazott primer párok [I] A DRD4 gén 120 bp duplikáció és a SERT gén promoter (5HTTLPR), illetve 2 intron (STin2) hosszúság-polimorfizmusainak vizsgálata A DRD4 gén 5’nem kódoló régiójának 120 bp duplikációját (DRD4 120 bp dup), a szerotonin transzporter 2. intronjában elhelyezkedõ VNTR-t (STin2), valamint a szerotonin transzporter 5’ nem kódoló régiójának 20-23 bp VNTR polimorfizmusát (5HTTLPR) a szakirodalomban leírtak szerint vizsgáltuk (90;130;131). A primerek adatait a VIII. táblázatban foglaltam össze. VIII. táblázat: A DRD4 120 bp dup, a STin2 és az 5HTTLPR polimorfizmusok meghatározásához használt primerek. név 120dup1c 120dup2c STin2 1b STin2 2b 5HTTLPR1b 5HTTLPR2b

Szekvencia (5’? 3’) GTT GGC TGT CTT TTC TCA TTG TTT CCA TTG GAA GGA GCA GGC ACC GTG AGC CAA TGT CTG GCG CTT CCC CTA CAT AT GAC ATA ATC TGT CTT CTG GCC TCT CAA G GGC GTT GCC GCT CTG AAT GC GAG GGA CTG AGC TGG ACA ACC AC

Tm: a primerek olvadáspontja

43

Tm (? C) 63,6 60,7 62,1 58,9 74,2 70,3

Módszerek


PCR reakcióelegy A PCR reakciók eleinte 20 ? l, a késõbbiekben 10 ? l térfogatban zajlottak. A térfogat csökkentésénél a reagenseket arányosan csökkentettük. Templátként kb. 1 ng DNS-t használtunk, a DNS koncentráció becslése a gélelektroforetikus kép alapján történt. A VI., VII., VIII. táblázatban felsorolt primerek mindegyikébõl 1? M-t használtunk a megfelelõ reakciók során. A dezoxiribonukleozid trifoszfát szubsztrátokat (dNTP: dATP, dTTP, dCTP és dGTP) 200 ? M koncentrációban alkalmaztuk. A DRD4 III. exon 48 bp VNTR esetében a sokszorozni kívánt DNS szakasz guaninban és citozinban gazdag, ami megnehezíti a nagyobb fragmentumok képzõdést, mert a denaturáció során a több ismétlõdést tartalmazó szálak nehezebben válnak szét, így a rövidebb fragmentek preferenciálisan képzõdnek. Ennek a problémának, az úgynevezett „allél kiesés” jelenségnek (132) a kiküszöbölésére a 200 ? M dGTP-t 50%-ban dITP-tal (dezoxiinozin trifoszfáttal) helyettesítettük, azaz 100 ? M dGTP-t és 100 ? M dITP-t adtunk a reakcióelegyhez. Az inozin egy guanozin analóg, amely azonban citozinnal, csak két, így gyengébb, könnyebben denaturálódó H-híd kialakítására képes, ezért csökkenti a DNS olvadáspontját. A replikációt végzõ HotStarTaq? polimerázt (Qiagen) 0,5 egység/20 ? l, illetve 0,25egység/10 ? l koncentrációban használtuk. Az enzim a 94 kDa molekulatömegû, rekombináns Taq-polimeráz enzim módosított változata, melynek templát igénye a széles körben alkalmazott Taq, illetve Vent polimerázoknál kisebb, így kifejezetten alkalmas a szájnyálkahártyából nyert DNS-es vizsgálatára. Az enzim optimális reakcióelegyét a cég által forgalmazott „10 x puffer” (1,5 mM Mg2+) biztosította. Az enzimmel együtt forgalmazott „Q oldat” 5%-os végkoncentrációban alkalmazva jelentõsen növelte a reakció specifitását. Termociklus A reakció elsõ lépése egy 15 perces inkubáció 95 °C-on, melynek során a genomiális DNS denaturálódása mellett a HotStarTaq polimeráz enzim aktiválódott. Ezt követte 35 ciklus, mely ciklusonként 1 perc denaturálást (94 °C), 30 másodperc annelálást (5HTTLPR és DRD4 -521 C/T: 65 °C; DRD4 48 bp VNTR: 60 °C; DRD4 120 bp duplikáció: 58 °C), valamint 1 perc extenziót (72 °C) foglalt magába. A DNS

44

Módszerek


darabok végsõ meghosszabbítása 72 °C-on 10 percig tartott, végül a mintákat 4 °C-ra hûtöttük A PCR reakciókhoz PERKIN ELMER GeneAmp PCR system 2400 és Hybaid PCR Express típusú gépeket használtunk. Restrikciós emésztés A restrikciós emésztéshez a PCR-RFLP elsõ fázisában keletkezett PCR termék 10 µl-éhez 2 µl restrikciós reakcióelegyet adtunk. Az emésztés így 1 egység FspI restrikciós

endonukleázt,

1

mM

végkoncentrációjú

ditiotreitolt

és

10

mM

végkoncentrációjú MgCl2-t tartalmazó 12 µl végtérfogatú restrikciós reakcióelegyben történt 37 °C-on, 3 órán át. Ezt követte az enzim 20 perces inaktiválása 65 °C-on. A mintákat ezután 4 °C-on tartottuk legfeljebb egy éjszakán át, majd -20 °C-on tároltuk az elektroforetikus elválasztásig. Elektroforetikus módszerek Hagyományos agaróz gél elektroforézis A PCR termékek azonosítására leggyakrabban hagyományos, horizontális agaróz gél elekroforézist használtunk. A 2,5%-os agaróz gél készítéséhez 1,25 g agarózt (Sigma) oldottunk fel 50 ml TAE futtató pufferben (40 mM Tris-acetátot pH 8, 1 mM Na2EDTA, 1% ecetsav pH 8). Az elektroforézis 6,6 V/cm térerõ alkalmazásával (standard elektroforetikus készülékeinkben 100 V feszültségre kapcsolva, 26 mA áram generálásával) történt, szobahõmérsékleten, egy-két órán át. Az elektroforézis befejezése után a gélt 10 percig 1 µg/ml etidium bromidot (EtBr) tartalmazó TAE puffer oldatban festettük 4 °C-on. A vizualizálás és a gél fényképezése UV átvilágítással, BioRad GelDoc 1000 gél dokumentációs rendszerrel történt. Ultravékony gél elektroforézis A DRD4 48 bp VNTR polimorfizmusa esetén a PCR termékek analízisére ultravékony gél elektroforézist is alkalmaztunk [I]. A PCR termékek elválasztása ebben az esetben 1% agaróz – 2% lineáris poliakrilamid keverék gélmátrixban történt TBE puffer (TBE: 89 mM tris, 89 mM borát, 2 mM Na2EDTA) és 75 V/cm térerõ

45

Módszerek

Statisztikai módszerek

alkalmazása mellett kevesebb mint 20 perc alatt. Az elválasztással egyidejû (real-time) detektálás érdekében a gél készítése során 20 ng/ml etidium bromidot kevertünk a gél anyagába. A DNS–EtBr komplexek azonosítása lézer indukált fluoreszcenciával történt 532 nm-nél. Statisztikai módszerek A kábítószerfüggõk mintáiban vizsgált polimorfizmusok allél és genotípus gyakoriság értékeit a nem szerint illesztett kontroll csoport allél és genotípus gyakoriság értékeihez hasonlítottuk ? 2 próba segítségével. A kontroll csoport genotípus eloszlása megfelelet a Hardy-Weinberg egyensúlynak (-521 C/T: ? 2=0.02, p=0.99; 5-HTTLPR: ? 2=1.46, p=0.48). Az interakció vizsgálata az SPSS 11.5 programcsomag segítségével történt. A különbözõség elfogadásának szignifikancia szintje minden esetben p? 0,05 volt. A statisztikai számításokat Dr. Székely Anna (ELTE, Pszichológia Tanszék) végezte.

46

Eredmények

Módszertani eredmények

EREDMÉNYEK Módszertani eredmények Nem invazív mintavétel során nyert DNS mennyiségi és minõségi vizsgálata A DNS mintavétel buccalis szájnyálkahártya sejtek vattapálcával való összegyûjtésével történt (lásd „Módszerek”). A kicentrifugált sejtekbõl történõ DNS izolálás egyes fázisaiban a kivont DNS mennyiségét és minõségét 1%-os agaróz gél elektroforézissel ellenõriztük. A 11. ábra A részén látható, hogy a sejtek feltárását követõen a lizátumban jelenlévõ nagy molekulasúlyú DNS a 20 ng-os ? fág DNS-éhez hasonló molekulatömeget és intenzitást mutatott. Ennek alapján mintavételünkkel közel 1 µg DNS-t sikerült kinyernünk. Ez a mintavétel hatékonyságát jelzi [I].

?

1

2

3

4

B ? A

11. ábra: A nem invazív módszerrel vett szájnyálkahártya minták DNS tartalma [I] A: 10 ? l lízis oldat (össztérfogat 400 ? l) DNS tartalma a proteináz K-val történt emésztést követõen, különbözõ személyektõl (1-4) nyert mintákban. B: 2 ? l izolált DNS (össztérfogat 20 ? l) elektroforetikus képe a lizátum alkoholos kicsapását (1. és 3. oszlop), valamint a klasszikus izolást (2. és 4. oszlop) követõen. DNS standard: 20 ng ? DNS 20 (? ) A továbbiakban kétféle módszerrel próbáltuk a DNS-t a lizátumból kinyerni. A klasszikus fenol-kloroformos extrakció és alkoholos kicsapás módszere mellett megkíséreltük a lizátum közvetlen alkoholos precipitációját a megelõzõ fenolkloroformos extrakció nélkül. A 11. ábra B részén bemutatott DNS termékek elektroforetikus képe azt mutatta, hogy a klasszikus fenol-kloroformos módszer esetében sokkal nagyobb méretû DNS fragmentumokat sikerült izolálnunk (2. és 4. minta) mint a közvetlen alkoholos kicsapás esetén (1. és 3. minta). Ezen eredmények

47

Eredmények


alapján feltételeztük, hogy a fenol-kloroformos extrakció elhagyása a DNS degradációjához vezet, ezért a továbbiakban a klasszikus fenol-kloroformos extrakciót használtuk. A különbözõ módszerekkel tisztított DNS preparátumok PCR amplifikációjának hatékonysága is jelentõsen eltért. Azt tapasztaltuk ugyanis, hogy a közvetlenül alkohollal kicsapott minták amplifikációs hatékonysága nagyságrendekkel kisebb mint a fenol-kloroform extrakció módszerével kapott DNS. Ennek feltehetõ magyarázata a lízis pufferben található SDS kicsapódása a közvetlen alkoholos precipitáció során, melyet a további lépések alatt nem sikerült kimosnunk. Így az SDS szennyezés a DNS-el együtt feloldódott, és feltehetõen zavarta a DNS polimeráz mûködését. Megpróbáltuk az SDS-t más denaturáló anyagokkal helyettesíteni a lízis pufferben, azonban ebben az esetben nem kaptunk hatékony feltárást, és sok DNS-t vesztettünk a lízist követõ centrifugálási lépésnél. Bemutatott eredményeink alapján a szájnyálkahártya sejtekbõl történõ DNS izolálás a klasszikus fenol-kloroformos extrakcióval történt a továbbiakban. Több száz izolálás eredménye azt mutatta, hogy az izolált DNS – az elektroforetikus kép alapján – nagy molekulatömegû, nem tartalmaz túl sok törmeléket abban az esetben sem, ha a szájnyálkahártya minták szállítása hosszabb idõt vett igénybe (fél – 1 nap). A kinyerhetõ DNS mennyiségét az extrahált DNS és a 20 ng ? fág összehasonlítása alapján 0,1 – 10 ? g-ra becsültük. A kinyerhetõ DNS mennyiségét a dörzsölés ideje (10 – 120 s) és a dörzsölés erõssége nem befolyásolta. Ezeknél a tényezõknél fontosabbnak tûnt az, hogy a dörzsölt felület viszonylag nagy legyen. Ezért a továbbiakban használt protokollban hangsúlyoztuk, hogy a vattapálcával történõ dörzsölés ne csak egy pontban történjen, hanem a szájnyálkahártya különbözõ területein. Hangsúlyozzuk azt is, hogy az „A” és a „B” minta a jobb és baloldalról történjen. Érdemes megjegyezni, hogy az erre a célra árusított kefék (Gentra) esetében a DNS kinyerése alig tizedrésze annak, amit a vattapálcák használatával kapunk. Gyakorlati munkánk során az is kiderült, hogy a fültörlõ pálca egyik végét érdemes elõre levágni, hogy ne fordulhasson elõ, hogy a pálca üres felét nyomják a mintavétel során a lízis oldatba. Az is kiderült, hogy rendkívül rontja a DNS extrakció

48

Eredmények


hatékonyságát, ha a pálca valamilyen nedvszívó anyaggal van bevonva, mely felszívja a lízis oldatot, és az nem centrifugálható ki megfelelõen. Genotípus meghatározás a szájnyálkahártyából nyert kis mennyiségû DNS felhasználásával A szájnyálkahártyából izolálható DNS minõségileg megfelelõnek bizonyult, azonban mennyiségileg kevesebb – az esetek többségében azonban legalább 1000 ng – mint ami a vér limfocitákból általában kinyerhetõ. A szakirodalomban közölt PCR protokollokban 50-100 ng genomiális templát DNS használatát javasolják (133;134). Ez a mennyiség mintáinkból átlagosan maximum 10 PCR-t tenne lehetõvé. Ezért a genotipizálási reakciókat megpróbáltuk érzékenyebbé tenni. Egyrészt megfelelõen érzékeny enzimet kerestünk, amely 1-10 ng templáttal is képes létrehozni a szükséges mértékû amplifikációt. Emellett az elektroforetikus módszerek érzékenységét is próbáltuk fokozni. A DRD4 48 bpVNTR genotípus meghatározása Az amplifikáció hatékonyságát a „fészek PCR” módszerével próbáltuk tovább növelni. A DRD4 48 bp VNTR esetében a „P” primer párral készült amplikonról a „Z” primer párral lehetett újabb terméket készíteni (10. ábra). A reamplifikáció (rePCR) azonban hosszadalmas és bizonytalan eljárásnak tûnt a gyakorlat során, ezért tovább kerestünk alacsony templát igényû enzimeket. A Qiagen HotStarTaq enzime igen kis mennyiségû (kevesebb mint 1 ng) templáttal is igen jól mûködött. Ezen enzim alkalmazásával a DRD4 48 bp VNTR genotipizálása reamplifikáció nélkül is lehetséges volt. A továbbiban összehasonlítottuk a két primer pár („P” és „Z”) hatékonyságát. A PCR HotStarTaq enzim használata esetén mindkét primerrel kiválóan mûködött, és bár a „Z” primerrel készült PCR esetében a keletkezett fragmentek jobban elváltak az elektroforézis során, mindkét esetben biztonsággal meg lehetett határozni a keletkezõ fragmentek méretét, így a genotípust. A 12. ábrán négy személy genotípusának meghatározását mutatom be a „Z” primer pár és a „P” primer pár felhasználásával. Az elsõ („A”) személy mindkét kromoszómája 4 ismétlõdést tartalmaz, azaz 4/4 homozigóta. Ezt mutatja az 1. mintában a „Z” primer párral kapott 400 bp feletti méret,

49

Eredmények


és a „P” primer párral kapott 500 bp alatti fragment méret, valamint az, hogy egyetlen csíkot kaptunk mindkét esetben. A második („B”) személy nagyobbik fragment mérete a 3. és 4. mintában megegyezik az 1. és 2. minta amplikon méreteivel, figyelembe véve, hogy a frontvonalnak van egy íve. A „B” személy (3. és 4. minta) ezen kívül egy kisebb fragmentumot is tartalmaz, mely a 100 bp létra és a táblázatban megadott éretek alapján 3 ismétlõdésnek felel meg, tehát a „B” személy 3/4 heterozigóta. A „C” személy genotípusa megegyezik a „B” személlyel a kapott fragmentumok alapján. A „D” személy (7. és 8. minta) az „A” személlyel megegyezõ fragmentumon kívül tartalmaz egy hosszabb PCR terméket is, mely mérete alapján 7 ismétlõdésnek felel meg. Jól látható egy harmadik, a többinél nagyobb méretû DNS darab is a „D” mintákban (7. és 8. minta), mely a kétféle PCR termék heteroduplexe. Ennek alapján a „D” személy 4/7 genotípusú heterozigóta.

DRD4

P1-P2

Z1-Z2

VNTR

283+48 n

171+48 n

2n

379

267

3n

427

315

4n

475

363

5n

523

411

6n

571

459

7n

619

507

8n

667

555

9n

715

603

10n

763

651

A

B

C

1

2

3

4

Z

P

Z

P

L

D

5

6

7

8

Z

P

Z

P

500 bp

4/4

3/4

3/4

4/7

12. ábra: A DRD4 48 bp VNTR genotípus meghatározása “Z” és “P” primerrel készített PCR amplifikációval A táblázatban az egyes primer párokhoz tartozó amplikon mérete (bp) látható az ismétlési szám (n) függvényében. Az ábra 4 személy (A, B, C, D) két (a „Z” és a „P”) primer pár alkalmazásával meghatározott genotípusát mutatja. A PCR termékek elektroforetikus elválasztása 2,5%-os agaróz gélen 6,6 V/cm térerõ alkalmazásával történt. L: 100 bp létra (Promega) a DNS fragmentumok méretének meghatározásához. A meghatározott genotípusok: A=4/4; B=3/4; C=3/4 és D=4/7

50

Eredmények


Mivel a szakirodalomban a „P” primer párt használják, a további kísérletekben ennek a használata mellett döntöttünk. A DRD4 -521 C/T polimorfizmus vizsgálata A DRD4 gén promoter régiójában található -521 C/T polimorfizmus vizsgálatára kétféle módszert, kétirányú allél-specifikus amplifikációt és PCR-RFLP-t alkalmaztunk, melyek részletes leírása a módszerek részben található (7. és 8. ábra) [II]. A két módszer párhuzamos alkalmazása növelte a genotipizálás megbízhatóságát. A 13. ábra 7 személy kettõs genotipizálását mutatja be. Allél-specifikus amplifikáció genotípus

1

605

405

- 521 CT

605

405

235

405

235

- 521 TT

L

4

5

CT 1

560

- 521 CT

560

342

218

342

218

7

8

2

CC CT CT TT CC

CT 3

4

5

L

6

7

8

600 bp

PCR fragment (bp)

- 521 CC

6 600 bp

PCR-RFLP

- 521 TT

3

PCR fragment (bp)

- 521 CC

genotípus

2

CT

-

CT CC CT

CT TT CC

13. ábra: A -521 C/T SNP genotípus meghatározása kétféle módszerrel [II] Az ábra táblázatai a PCR amplifikáció során keletkezett termékek méreteit foglalják össze a genotípus függvényében. Az ábrán 7 személy (1, 3, 4, 5, 6, 7, 8) és a – DNS-t nem tartalmazó – negatív kontroll (2) PCR termékeinek elektroforetikus képe látszik. A keletkezett PCR termékek mérete alapján meghatározott genotípus az elektroferogramok alsó részén van feltüntetve. Az elválasztás 2,5%-os agaróz gélen 6,6 V/cm térerõ alkalmazásával történt. L: 100 bp létra (Gibco). Az allél-specifikus amplifikáció során T allél jelenlétében egy rövidebb amplikon, C allél jelenlétében egy hosszabb darab keletkezik, míg CT heterozigóták esetében mindkét fragmentum létrejön. A reakcióban egy külsõ, 605 bp hosszú fragmentum is keletkezhet. Ennek alapján a 13. ábra allél-specifikus amplifikációjának eredménye az

51

Eredmények


1., 3., 5. és 6. személyre -521 CT heterozigóta, a 4. és a 8. személy -521 CC homozigóta, míg a 7. személy -521 TT homozigóta. A -521 C/T polimorfizmus PCR-RFLP-vel való meghatározása során a 605 bp amplikonból az FspI a polimorfizmustól függetlenül levág egy 45 bp darabot (kontroll hasítás). Ha további hasítás nem történik, akkor az 560 bp hosszú fragment a -521 CC genotípusra utal (lásd PCR-RFLP 4. és 8. személy). Ha a -521-es helyen T van, akkor az FspI itt is hasít. Így -521 CT heterozigóták esetén az összes lehetséges fragment keletkezik (lásd PCR-RFLP 1., 3., 5. és 6. személy), -521 TT homozigóták esetében pedig csak a kisebb fragmentumok keletkeznek (lásd PCR-RFLP 7. személy). A bemutatott ábrákon mind a 7 személy esetében mindkét módszer azonos genotípust eredményezett. Érzékeny elválasztás technikák a kis mennyiségû DNS kimutatására Ultravékony és agaróz gél elektroforézis A D4DR III. exon 48 bp VNTR vizsgálatakor, mely az elsõ polimorfizmus volt, melyet a szájnyálkahártyából izolált DNS felhasználásával analizáltunk, a PCR termékek elválasztására a konvencionális agaróz gélnél nagyobb hatékonyságú és jobb felbontású ultravékony gél elektroforézist is alkalmaztunk. A PCR amplifikáció módszere és a keletkezett termékek mérete megegyezett a 12. ábrán feltüntetett értékekkel. Az ultravékony elválasztási technika elõnye, hogy a vékony gélréteg intenzíven hûthetõ, és így az elválasztás jóval magasabb feszültség alkalmazásával is szép eredményeket ad. A technika másik elõnye az, hogy a lézer detektor alkalmazása nagyságrendekkel kisebb mennyiségû PCR termék detektálására is képes. A 14. ábra egy ultravékony gél elektroforézissel elválasztott PCR terméksorozatot mutat be. Ez az elektroferogram 12 személy genotipizálását mutatja be a „P” primer pár és a „Z” primer pár alkalmazásával. Az ultravékony elektroforézis nemcsak gyorsabb a hagyományos rendszernél, de a minta felvitele is egyszerûbb. A 32, 64 vagy 128 „fogú” mintafelvivõ membránra a minták 0,2 - 0,5 µl-e az elektroforézis elõtt felcseppenthetõ, sõt a minták tárolhatók is. A mintafelvivõ membrán megköti a DNS-t, mely csak az elektromos áram hatására válik le a membránról.

52

Eredmények


L

1

2 3

4

5

6

7

8

9 10 11 12 L

600 bp 400 bp 200 bp 600 bp 400 bp 200 bp 4/7 4/4 4/4 4/4 4/4 3/4 3/4 4/7 4/4 4/7 4/7 4/4 14. ábra: PCR termékek elválasztása ultravékony gél elektroforézissel [I] A DRD4 III. exon 48 bp VNTR polimorfizmus kimutatására két primerpárt alkalmaztunk párhuzamos PCR-ekben. A felsõ ábrán a „P” az alsó ábrán a „Z” primerekkel készült, ultravékony gélen elválasztott PCR termékek láthatók. A termékek méretei alapján a genotípus meghatározható. A genotípusokat az ábra alján tüntettem fel. Az elválasztás 1% agaróz – 2% lineáris poliakrilamid keverék gélmátrixban történt 75 V/cm térerõ alkalmazása mellett 20 perc alatt. L: 100 bp létra (Promega) A többi hosszúság-polimorfizmus esetében a PCR termékeket hagyományos, 2,5%-os agaróz gélen választottuk el. Az 5HTTLPR allélokat 2 órás, a STin2 allélokat 1,5 órás, a 120 bp duplikáció alléljait 1 órás futtatással 100V feszültséget alkalmazva tudtuk megfelelõen elválasztani. Az elválasztás után a 10 perces etídium-bromidos utófestést alkalmaztunk. A genotípus meghatározás elve azonos a DRD4 III. exon hosszúság-polimorfizmus vizsgálatánál leírtakkal. A polimorf régió ismétlõdésének számától függõen különbözõ hosszúságú PCR termékeket kapunk, melyek azonosítása DNS létra segítségével történik. A 15. ábrán a három említett hosszúság-polimorfizmus vizsgálata során az ismétlõdési szám függvényében várható PCR termékek nagysága, valamint az elválasztott termékek elektroforetikus képe látható. A hatékonyságot több futtatókád párhuzamos használatával, illetve 1 gélben 2 fésûsor alkalmazásával tudtuk növelni.

53

Eredmények


1 2

3 L

4 5

6 7

A 5HTTLPR

PCR

600 bp

STin2

PCR

2 3

4

5 6

7

8

9

10 11

10/12

L 1

B

16/16

-

14/14

530 bp

14/14

16x

16/16

490 bp

14/16

14x

16/16

fragment

-

500 bp

1x

428 bp

2x

548 bp

12/12

8 9 10 11

10/10

12/12 7

6

600 bp

-

1/1

fragment

5

4

1/2

dup

3

2/2

PCR

2

1/2

120 bp

1

2/2

L

C

10/12 10/12

315 bp

2/2

12x

12/12 12/12

280 bp

1/2 1/2

10x

10/12

265 bp

2/2 1/1

9x

12/12

fragment

15. ábra: Hosszúság-polimorfizmusok genotípusának meghatározása agaróz gélen Az ábra A része az 5HTTLPR, B része a STin2, C része a DRD4 120 bp duplikációjának adatait tartalmazza. A táblázatokban az egyes hosszúságpolimorfizmusok leggyakrabban elõforduló ismétlõdési számait, illetve az ismétlõdési szám által meghatározott, a PCR során keletkezõ termékek méretét foglaltam össze. A leolvasható genotípusokat az elektroforetikus képek alsó részén tüntettem fel. Mindhárom képen a legnagyobb méretû termékek a hetrozigóták esetében képzõdõtt heterodudplexek. Az „üres” (-) oszlopokra felvitt minta nem tartalmazott DNS-t (negatív kontroll). Az elválasztás minden esetben 2,5%-os agaróz gélen 6,6 V/cm térerõ alkalmazásával történt. A futtatás ideje 2 (A), 1,5 (B) illetve 1 (C) óra volt. A keletkezõ termékek méretét – a Gibco (A, C), illetve a Promega (B) által forgalmazott –100 bp-os DNS létrához (L) viszonyítottuk

54

Eredmények

A genetikai asszociáció vizsgálatok eredményei

A genetikai asszociáció vizsgálatok eredményei A DRD4 gén polimorfizmusainak asszociáció vizsgálata kábítószerfüggõkben DRD4 gén három vizsgált polimorfizmusának (-521 C/T SNP, 120 bp duplikáció és a III. exon 48bp VNTR) allél és genotípus eloszlását a IX. táblázat tartalmazza. Szignifikáns különbséget kaptunk a -521 C/T polimorfizmus genotípus gyakoriság eloszlásában

a

kontroll

csoport

és

a

heroinfüggõk

genotípus

adatainak

összehasonlításakor (? 2=6,24, df=2, p=0,044). Heroinfüggõk esetében a -521 CC homozigóta genotípus szignifikánsan gyakoribbnak mutatkozott mint a kontroll csoportban (35,9% vs. 20,7%; OR:2,14), a C allél elõfordulása pedig, ugyanebben a csoportban tendencia szinten megnövekedett (? 2 =3,01; df=1; p=0,083). Amennyiben az eset csoportba az összes általunk genotipizált kábítószerfüggõ (heroinfüggõk és a nem heroinfüggõk) személy adatait belevettük, nem kaptunk szignifikáns különbségeket [IV]. IX. táblázat: A DRD4 gén általunk vizsgált polimorfizmusainak allél és genotípus eloszlása [IV] Polimorfizmus

Kontroll

- 521 C/T CC CT TT C T

N=362 20.7% 50.0% 29.3% 45.7% 54.3%

Kábítószerfüggõk N=73 30.1% 38.4% 31.5% 49.3% 50.7%

120 bp dup. 1/1 1/2 2/2 1 2 III exon VNTR 77+ 2 3 4 5 6 7 8 9

N=362 3.6% 27.9% 68.5% 17.5% 82.5% N=362 63.5% 36.5% 9.3% 3.7% 64.1% 0.8% 0.4% 20.6% 1.1% 0%

N=73 2.7% 32.9% 64.4% 19.2% 80.8% N=71 64.8% 35.2% 5.0% 4.9% 67.6% 0.7% 0% 19.0% 1.4% 1.4%

Heroinfüggõk

n.s. n.s.

n.s. n.s.

n.s.

n.s.

55

N=53 35.9% 37.7% 26.4% 54.7% 45.3% N=53 3.8% 26.4% 69.8% 17.0% 83.0% N=52 65.4% 34.6% 4.8% 6.7% 68.3% 0% 0% 19.2% 1.0% 0%

? 2 =6.24 p=0.044 ? 2 =3.01 p=0.083

n.s. n.s.

n.s.

n.s.

Eredmények


A III. exon 48 bp VNTR polimorfizmusának allél- és genotípus eloszlásában nem kaptunk szignifikáns különbséget a teljes kábítószerfüggõ, a heroinfüggõ és a kontroll csoport adatainak összehasonlítása során. A nemzetközi irodalmi mintákat követve (97) megvizsgáltuk az újdonságkeresésre valószínûleg hajlamosító 7 allélt tartalmazó (7) és nem tartalmazó (non-7) genotípusok eloszlását is az egyes csoportokban, azonban szignifikáns eltérést ebben az esetben sem találtunk (IX. táblázat). A 120 bp duplikáció esetében nem kaptunk szignifikáns eltéréseket (IX. táblázat). A SERT gén polimorfizmusainak asszociáció vizsgálata kábítószerfüggõkben A szerotonin transzporter promoter régiójában található polimorfizmus esetében nem találtunk szignifikáns eltérést sem a genotípus, sem az allél gyakoriság eloszlásának tekintetében (X. táblázat) [IV]. X. táblázat: A SERT gén vizsgált polimorfizmusainak allél és genotípus eloszlása [IV] Polimorfizmus

Kontroll

5HTTLPR 14/14 14/16 16/16 14 16 STin2 9/10 9/12 10/10 10/12 12/12 12/13 9 10 12 13

N=362 17.7% 45.0% 37.3% 40.2% 59.8% N=362 0.6% 2.2% 11.6% 47.2% 38.1% 0.3% 1.4% 35.5% 63.0% 0.1%

Kábítószerfüggõk N=70 24.3% 44.3% 31.4% 46.4% 53.6% N=73 1.4% 2.7% 9.6% 46.6% 39.7% 0% 2.0% 33.6% 64.4% 0%

Heroinfüggõk

n.s. n.s.

n.s.

n.s.

N=52 23.1% 48.1% 28.8% 47.1% 52.9% N=53 0% 1.9% 9.4% 54.7% 34.0% 0% 0.9% 36.8% 62.3% 0%

n.s. n.s.

n.s.

n.s.

A STin2 polimorfizmusa esetében nem kaptunk szignifikáns összefüggést (X. táblázat).

56

Eredmények


A DRD4 és a SERT gén polimorfizmusainak együttes vizsgálata kábítószerfüggõkben Megvizsgáltuk a két gén polimorfizmusainak együttes elõfordulását az egyes csoportokban. Azt találtuk, hogy az 5HTTLPR genotípusok függvényében megváltozott a D4-es receptor promoterének polimorfizmus eloszlása. Az alacsonyabb aktivitású szerotonin transzportert kódoló (14/14 homozigóta és 14/16 heterozigóta) genotípusok jelenlétében kifejezettebbé vált a korábban tapasztalt különbség, azaz a -521 CC genotípus gyakorisága heroininfüggõk körében a CT és TT genotípusokhoz viszonyítva még jobban megnövekedett (? 2=9,89, df=1; p=0,0017; OR:2,86). Ez az asszociáció a teljes kábítószerfüggõ csoportban is kimutatható volt (? 2=6,71; df=1; p=0,0096; OR=2.26). Ugyanakkor az 5HTTLPR ellentétes (16/16 homozigóta) genotípus változata esetén nem találtunk különbséget a CC genotípus eloszlásban kábítószerfüggõk és a kontroll populáció között (16. ábra) [III, IV]. 5HTTLPR genotípus

Genotípus gyakoriság (%)

60

14/14+14/16

16/16

40

*

*

20 kontroll kábítószer heroin

0 CC

CT+TT

CC

CT+TT

- 521C/T genotípus

16. ábra: A DRD4 -521 C/T SNP és az 5HTTLPR polimorfizmusok interakciója A szerotonin transzporter 5HTTLPR genotípusa alapján csoportosítottuk a személyeket (14-es allélt tartalmazó 14/14 és14/16 vs. 14-es allélt nem tartalmazó 16/16). Az egyes csoportokon belül megvizsgáltuk a dopamin D4-es receptor promoter régiójának -521 C/T genotípus gyakoriság értékeit két kategóriát használva: a -521 CC kategóriát, és a 521 CT+TT összevont kategóriát. A kontroll csoporthoz képest statisztikailag szignifikáns eltérést mutató csoportokat csillaggal jelöltük.

57

Az eredmények megbeszélése

Nem invazív DNS mintavételi módszerek

AZ EREDMÉNYEK MEGBESZÉLÉSE Nem invazív DNS mintavételi módszerek A

genetikai

vizsgálatokhoz

szükséges

DNS-t

hagyományosan

a

vér

fehérvérsejtjeibõl nyerik. A vérvétel, bár rutin beavatkozás, mégis számos kellemetlenséggel, kényelmetlenséggel jár. Ezek közé tartozik, hogy csak kórházi vagy rendelõintézeti

körülmények

között

végezhetõ,

képzett

személyzet

kell

a

végrehajtásához, a vizsgált személyek egy részében (pl. egészséges kontroll csoport, egészséges családtagok) indokolatlan terhelést jelent, ha a vérvételnek más indikációja nincs, gyermekek esetében pedig, felesleges stressz helyzetet teremthet. A vérvétel, valamint a vérminta feldolgozása során fennáll a személyzet vér útján terjedõ kórokozókkal fertõzõdésének

(Hepatitis veszélye,

C

vírus,

Human

melynek

bizonyos

Immundeficiencia populáció

vírus)

vizsgálatakor,

történõ így

a

kábítószerfüggõk esetében is az átlagosnál nagyobb a kockázata. A molekuláris genetikai technikák mind a kutatás, mind a diagnosztika terén gyorsan terjednek, és alkalmazásukkal párhuzamosan fogalmazódott meg az igény neminvazív mintavételi módszerek kifejlesztésére. A 80-as évek végén a 90-es évek elején próbálkoztak néhány alternatív mintavételi módszer (pl. hajgyökérbõl, nyálkahártya törmelékbõl, vizeletbõl történõ DNS kivonás) bevezetésével, azonban a korlátozott és nem konzisztensen kinyerhetõ DNS mennyiség miatt alkalmazásuk nem terjedt el. A legígéretesebb módszernek a száj nyálkahártyájának sejtjeibõl történõ DNS izolálás bizonyult. A szájnyálkahártya sejtek egyik kinyerési módja a szájöblítõ folyadék használata. A folyékony minta szállítása azonban nehézkes, és a feldolgozás kezdeti szakasza is hosszadalmas, mely korlátozta széles körû elterjedését (135). A minta folyadéktartalmának redukálását lehetõvé tette, hogy a szájnyálkahártya sejtek a szájüreg belsõ felszínérõl dörzsöléssel is kinyerhetõk. Erre a célra leggyakrabban citológiai kefét, vagy vattás végû fa, illetve mûanyag pálcikát alkalmaznak (125;126;136;137). Az általunk használt, könnyen hozzáférhetõ, olcsó fültörlõ pálcikák kiválóan alkalmasak voltak a mintavételre, sõt a mintavétel hatékonyabbnak bizonyult fültörlõ pálcika alkalmazása esetén, összevetve a mintavételre gyártott kefével.

58


Nem invazív DNS mintavételi módszerek

Az irodalomban leírt módszerek szerint naponta háromszor (reggel, délben és este) (125;136), vagy két alkalommal, 4 órás különbséggel (126) összesen 10-20-szor kellett megismételni az ugyan nem kellemetlen, de mégis a napi tevékenység megszakítását igénylõ mintavételi procedúrát. Az általunk leírt módszerrel egyszeri kettõs (egymás után két fültörlõ pálcikával történõ, 2-szer 20 másodpercig tartó) mintavétel elegendõ volt a fenti eljárásokhoz hasonló mennyiségû DNS minta kinyeréséhez (XI. táblázat) [I]. XI. táblázat: Nem invazív mintavételi módszerek összehasonlító táblázata Mintavevõ eszköz

Mintavétel módja

Feldolgozási g eltelt idõ

Citológiai kefe vagy tampon Vattás végû pálcika

Szájnyálkahártya dörzsölése (30 s)

1 hónapig 4?C-on

Szájnyálkahártya dörzsölése 10x, 4 óra múlva újra 10x Vattás végû Szájnyálkahártya pálcika dörzsölése (20 s) Reggel 3x Délben 3x Este 4x

Citológiai kefe Szájöblítõ folyadék Szájöblítõ folyadék Fültörlõ pálcika

A

Szájnyálkahártya dörzsölése (30 s) 3x Szájüreg öblögetés (60 s) Szájüreg öblögetés 20x étkezés után 1 órával Szájnyálkahártya dörzsölése (20 s) 2x

kutatásban

3 héten belül

Izolálási módszer

Átlagosan stabilitás kinyert DNS/személy NaOH, Tris 10 hónapig 4 ?C-on Fenolkloroform

1-3 hét szobahõn

Fenolkloroform (Autogen 740 robot) 10 nap – 1 év ODPR szobahõn (szerves fehérjementesítõ reagens) QIA amp -80 ?C-on mini kit

Nem vizsgálták (126)

38 ? g (? 1–108 ? g)

4 év – 80 ?C-on (125)

53 ? g.

(136)

12 ? g

Szobahõn 5 nap (137) - 70 ?C-on 3 év

7-14 napig szobahõn

PUREGENE DNS kit

12-60 ? g

-20 ?C-on hónapokig

Fenolkloroform

(1-20 ? g)

személyek

(135)

40 ? g

15,8 ? g

résztvevõ

Hiv.

mintavétellel

2-8 ?C-on rövid (138) -20-80 ?C-on hosszú távon (-20 ?C-on 3 [I] év)

történõ

terhelésének

minimalizálása több szempontból is fontos volt számunkra. Azon kábítószerfüggõk esetében, akik már nem álltak kórházi kezelés alatt, és naponta vagy hetente egyszer jelentek meg az ambulancián vagy a rehabilitációs csoportban, nehéz lett volna megoldani, hogy a nap folyamán többször, az idõpontokat betartva végezzék el a mintavételt. Az egyszeri, alig 1 percet igénybevevõ mintavételbe azonban szívesen beleegyeztek. Hasonló okok miatt igen hasznos ez a mintavételi módszer kontroll

59


Genotípus meghatározás kis mennyiségû DNS-bõl

személyek esetében is, akiknek a kutatásban való önkéntes részvétele ily módon nem igényel jelentõs idõráfordítást. A minták gyûjtése nedves úton történt, azaz a mintavevõ pálcikákat azonnal a lízis puffert tartalmazó csõbe helyeztük, mely a szállítást megnehezítette. Újabban úgynevezett száraz mintavételt is sikeresen alkalmazunk, melynek során a mintavevõ fültörlõket üres csõbe helyezzük, (ily módon a levett minta akár postai úton is eljuttatható a feldolgozás helyére). Ebben az esetben a lízis puffert az izolálás elõtti napon adjuk hozzá a mintákhoz. A lízis puffer összeállítását, a minták elõkészítését és a DNS izolálást ismert protokollok szerint végeztük (126;127). A DNS izolálás idejének lerövidítésére tett elsõ kísérleteink nem vezetettek eredményre, a fenol-kloroformos extrakció elhagyásával nyert DNS nem volt alkalmas PCR templátnak, feltehetõen a nagy SDS tartalom miatt. Újabban laboratóriumunk áttért a kisózásos módszerre (Gentra kit), így a mérgezõ szerves oldószerek használatát el tudjuk kerülni, valamint az izolálás hatásfoka is növekedett. A kit használata mellett a kinyert DNS mennyisége 1-40 ? g közé esik. A DNS minõségének ellenõrzése agaróz gél elektroforézissel történt, mellyel a DNS épsége mellett a kinyert mennyiséget is meg tudtuk becsülni. A mennyiség meghatározása esetenként spektrofotometriával történt. Genotípus meghatározás kis mennyiségû DNS-bõl A nem invazív mintavétel során nyert DNS mennyisége kb. 1-10%-a a vérbõl izolálható mennyiségnek, ezért fontos volt az érzékenyebb genotipizálási és elválasztási módszerek kidolgozása. A DRD4 III. exon hosszúság-polimorfizmusának vizsgálatára elõször fészek PCR-t terveztünk abból a meggondolásból, hogy ily módon a polimorf régió amplifikálása megfelelõ érzékenységû lesz kisebb mennyiségû templát DNS felhasználásával is. A DRD4 gén III. exon 48 bp polimorfizmusa esetében Taq, illetve Vent polimeráz enzimek mellett a „P” és „Z” primer alkalmazása során a reakció templát igénye továbbra is 50-100 ng volt (134). A Qiagen által forgalmazott HotStarTaq polimeráz enzim alkalmazásának bevezetésével azonban a templát DNS mennyiségét sikerült 1 ng-ra csökkenteni, és feleslegessé vált a rePCR lépés. Kezdetben a biztos genotipizálás érdekében mindkét primer párral párhuzamosan végeztük az

60


Érzékeny elválasztás technikák

amplifikációt, azonban az eredmények konzisztensek voltak (ld. 12. és 14. ábra), ezért a késõbbiekben, a szakirodalom által elfogadott „P” primer párt használtuk. A továbbiakban valamennyi polimorfizmus vizsgálatánál bevezettük az alacsony DNS koncentrációt, és amplifikálásra kizárólag a HotStarTaq enzimet használtuk. Ezek a módszerek számos vizsgálat elvégzését tették lehetõvé a szájnyálkahártyából nyert genomiális DNS-bõl. Az egyedi nukleotid polimorfizmusok meghatározására általában két, független módszert használtunk [II]. SNP-k kimutatására az irodalomban leggyakrabban a PCRRFLP módszerét alkalmazzák. A restrikciós enzimekkel meghatározott genotípus akkor lehet téves, ha egy reakciókban nem történik emésztés annak ellenére, hogy a restrikciós felismerési hely a mintában jelen van. Ezért a megfelelõ emésztési körülmények ellenõrzésére egy kontroll (nem polimorf) emésztési helyet is kell tartalmaznia a PCR terméknek. A belsõ kontroll alkalmazásával elkerülhetõ az eredmények torzulása. A DRD4 -521 C/T polimorfizmusának vizsgálata esetében az eredetileg leírt RFLP-t (88) laboratóriumunkban úgy módosították, hogy a primerek által kijelölt DNS szakasz egy stabilan jelenlévõ, nem polimorf FspI hasítási helyet is tartalmaz, így az emésztetlen, illetve a polimorf helyen hasítási szekvenciát nem tartalmazó termékek mérete különbözik (128). Hasonló okok miatt alkalmaztuk az ASA nem allél specifikus primereit a DRD4 -521 C/T PCR-RFLP-vel történõ meghatározása során. Az így kijelölt szakasz ugyanis szintén tartalmaz egy stabil hasítási helyet (ld. 8. ábra), és bár a 45 bp hosszú kontroll fragment az általunk alkalmazott elválasztási technikákkal nem látható, azonban az egyáltalán nem hasított 605 bp-os és a polimorf helyen mindkét szálon C bázist tartalmazó homozigóta genotípusnak megfelelõ 560 bp hosszúságú termékek az elektroforézis során jól elkülöníthetõk. Az így módosított PCR-RFLP és a korábbiakban leírt ASA (128) együttes alkalmazásával a genotípus meghatározás igen megbízhatónak bizonyult, mivel a kétféle módon meghatározott genotípus az esetek kevesebb mint 1%-ában tért el egymástól. Érzékeny elválasztás technikák Az elválasztás érzékenységének fokozása céljából a hagyományos agaróz gél elektroforézis mellett a nagyobb hatékonyságú és jobb felbontású ultravékony gél

61



elektoroforézist is használtuk. Ezt a módszert laboratóriumunk elõször a DRD4 48 bp VNTR meghatározására alkalmazta (129;132;134). Az ultravékony gél elektroforézist a hagyományos horizontális gél elektorforézis és a kapilláris elektroforézis elõnyeinek kombinálásával fejlesztették ki. A planáris gél elektroforézis többzónás rendszere és a kapilláris elektroforézis nagy hatékonysága összegzõdik ebben a technikában. A kapilláris elektroforézis nagy hatékonysága az alkalmazott nagy feszültség hatására keletkezõ jelentõs térerõ (750V; ? 40 V/cm) eredménye. Ilyen nagy térerõ a hagyományos rendszerekben nem alkalmazható, mivel igen jelentõs mértékben felmelegedne a rendszer. A szûk kapillárisokat azonban igen vékony rétegû lineáris poliakrilamid gél tölti ki, mely nagy felület/térfogat arányt hoz létre. Így az elválasztás során termelõdõ extra hõ kedvezõ eloszlása lehetõvé teszi a nagy feszültség alkalmazását. Ultravékony gél esetében a nagy felület/térfogat arányt a kapillárishoz közelítõ vékony gélréteg (maximum 0,25 mm) kialakításával érték el (139). A felbontóképességet tovább növeli az alkalmazott elválasztó mátrix megfelelõ összetétele. Az agaróz alapú, lineáris poliakrilamid composit gél alkalmazásával néhány száz bp hosszúságú DNS fragmentek is jól elválaszthatók, és csupán néhány bázispárnyi méretkülönbség is kimutatható. Ugyanebben a rendszerben a hosszabb fragmentek elválasztása is lehetséges (140). Az ultravékony gél elektroforézissel szemben a hagyományos agaróz gél elektroforézis esetében kisebb a hõelvezetõ képesség, ezért általában csak kisebb feszültség, illetve térerõ alkalmazható (kb. 100V; 1-4 V/cm). A hagyományos agaróz gél elektroforézis során az elválasztás jóval lassabb, a felbontóképesség is kisebb. Ebben a rendszerben a megfelelõ elválasztást a megfelelõ koncentrációjú mátrix alkalmazása biztosítja. A PCR termékek – leggyakrabban 100-1000 bp nagyságú dsDNS fragmentek – elválasztására a 2-3%-os agaróz mátrix alkalmas (141). Az ultravékony gél elektroforézis esetében a lézer detektor lehetõvé teszi az elválasztással egyidejû, real-time detektálást, míg a hagyományos rendszerben a dsDNS fragmentumok festése és vizualizálása utólag történik. Az etidium bromid hozzáadása az elválasztó mátrixhoz növeli az elválasztás érzékenységét, mert az etidium bromidDNS komplexek jobban szétválnak egymástól (139). Ezért gyakran alkalmazzák a hagyományos rendszerben is a futtatás alatti komplexképzést, mely az etidium

62



bromidnak a gélhez és a futtató pufferhez való hozzáadásával lehetséges. Ez azonban jelentõsen növeli ennek a mérgezõ anyagnak a felhasználását, ezért rendszerünkben a kevésbé szennyezõ utófestést alkalmaztuk. Ultravékony gél elektroforézis esetében az automatizált mintafelvitel szintén csökkenti az elválasztás idejét, továbbá a mintafelvivõ membránra igen kis mennyiségû (0,2-0,5 ? l) PCR termék felvitele is elegendõ. Az ultravékony gél elektroforézis mellett elterjedt módszer még a denaturáló HPLC (142), az SSCP (143), a denatruráló gél elektroforézis (144) és a kapilláris elektroforézis (145). A kivitelezés költségei miatt azonban a leggyakrabban alkalmazott eljárás továbbra is a hagyományos agaróz gél elektroforézis.

Jelen

kutatásainkhoz

az

itthon

könnyen

elérhetõ,

kevésbé

automatizálható, több manualitást igénylõ hagyományos agaróz gél elektroforézis is megfelelõen hatékonynak bizonyult [II]. Az általunk elválasztani kívánt PCR termékek méretét úgy terveztük meg, hogy mind a vizsgált hosszúság-polimorfizmusok, mind pedig a vizsgált SNP esetében az elválasztás megfelelõ felbontású legyen, és így a genotípus meghatározása ne okozzon problémát (ld. 12. 13. és15. ábra és XII. táblázat) XII. táblázat: Az elválasztani kívánt PCR termékek mérettartománya és a termékek közötti méretkülönbség polimorfizmus 48 bp VNTR -521 C/T ASA -521 C/T PCR-RFLP 120 bp dup 5HTTLPR STin2

PCR termék tartomány (bp) 379-763 235-605 218-560 430-550 490-570 265-315

Termékek közötti különbség (bp) legkisebb legnagyobb 48 384 170 370 124 342 120 120 44 88 50 15

Az elválasztandó PCR termékek mérete 200-800 bp közé, a fragmentek közötti méretkülönbség, pedig 15 és 384 bp közé esett. A hagyományos agaróz gél elektroforézis alkalmazása során a feldolgozási idõ csökkenthetõ párhuzamos elektroforetikus kádak, több fésûsor és többcsatornás pipettákkal való mintafelvitel alkalmazásával, mellyel akár 96 minta egyidejû elválasztása is lehetséges. A horizontális agaróz gél elektroforézis további elõnye, hogy preparatív célra is könnyen felhasználható, mely lehetõvé teszi például a PCR termékek szekvencia analízisét, vagy a termék klónozását. Az ultravékony gél elektroforézis elsõsorban olyan vizsgálatokra alkalmas, ahol több száz minta egyidejû feldolgozására van szükség.

63


Genetikai asszociáció vizsgálatok kábítószerfüggõkben

Genetikai asszociáció vizsgálatok kábítószerfüggõkben A dopaminerg rendszer genetikai polimorfizmusainak vizsgálata kábítószerfüggõkben A dopaminerg rendszer mûködésének megváltozása és a kábítószerfüggõség kialakulása közötti kapcsolatot többirányú megfigyelések támasztják alá. A dopamin az agyi jutalmazó kör fõ neurotranszmittere. A jutalmazó rendszer megváltozott érzékenysége, magasabb ingerküszöbe hajlamosíthat kábítószerfüggõség kialakulására (32). A

kábítószerfüggés

kialakulására

hajlamosító

személyiség-dimenzió,

az

újdonságkeresõ magatartás neurobiológiai alapjai szintén a dopaminerg rendszerhez köthetõek (52). Ezen felül klinikai vizsgálatok támasztják alá, hogy a gyermekkorban kezdõdõ, és felnõttkorban is megmaradó ADHD esetében az egészséges populációhoz képest gyakrabban alakul ki nemcsak pszichoaktív szerhasználat, hanem egyéb kábítószerfüggõség, vagy alkoholizmus (146). Az ADHD hátterében a bazális ganglionok, a frontalis lebeny és a mezokortikus dopaminerg pálya, valamint a kisagy funkcionális eltérései állhatnak (147). Mindezekbõl következik, hogy a dopaminerg rendszer mûködését meghatározó molekulák génjei kandidáns gének lehetnek a függõség kialakulásának molekuláris genetikai vizsgálataiban. Kábítószerfüggõk körében a dopaminerg rendszeren belül vizsgálták az egyes dopamin receptor gének, a dopamin metabolizmusában szerepet játszó fehérjék génjei és a dopamin transzporter gén polimorfizmusait (XIII. táblázat). Az általunk is vizsgált D4-es dopamin receptor több megfigyelés alapján került az érdeklõdés középpontjába. A III. exonban található 48 bp VNTR polimorfizmusát az elsõ polimorfizmusok között írták le (78), majd asszociáció vizsgálatokkal a 7-es allél (91;92), késõbb a -521 C allél (101;102) és legújabban a 120 bp dup rövid allélja (106) és az újdonságkeresõ magatartás között találtak összefüggést. A D4-es dopamin receptor lokalizációja szintén felveti a lehetõségét annak, hogy a receptor megváltozott mûködése, expressziója hozzájárulhat a vulnerábilitás kialakulásához. A DRD4 gén promoter régiójának -521 C/T polimorfizmusa esetében egyetlen vizsgálat történt, melyben nem találtak összefüggést a polimorfizmus és a heroinfüggõség között, de a C allél, és a CC genotípus gyakoribbnak mutatkozott intravénás heroin használat esetében (148). Az eredmények elemzéséhez a munkacsoportunk által már az újdonságkereséssel összefüggésben vizsgált – T és nem-

64



T, azaz T-t tartalmazó (CT és TT) és nem tartalmazó (CC) – genotípus csoportosítást alkalmaztuk. Eredményeink molekuláris genetikai szinten megerõsítik azt a feltevést, miszerint a magasabb újdonságkeresés hajlamosít a kábítószerfüggõség kialakulására, hiszen a CC genotípus, mely gyakoribbnak mutatkozott magasabb újdonságkeresõ pontszámot elérõ személyekben (101;102), szignifikánsan gyakoribb volt a heroinfüggõ csoportban [III. IV]. XIII. táblázat: polimorfizmusai

A

dopaminerg

Kandidáns gén D1DR D2DR

polimorfizmus DdeI RFLP 3’TaqI–A RFLP

D3DR

-141DeltaC BalI RFLP

D4DR

III. exon 48 bp VNTR

D5DR COMT

DAT1

- 521 C/T (CT/GT/GA) 108Val/Met 900 InsC/delC -287 A/G 3’40bp VNTR

rendszer

kábítószerfüggõkben

Vizsgált csoport különbözõ drogfogyasztók különbözõ drogfogyasztók heroinfüggõk metamphetamin fogyasztók heroinfüggõk heroinfüggõk/ opioid függõk heroinfüggõk

vizsgált

eredmény + (149) +/- (65) - (150) - (151)

+ (150) + (63) - (150;152) + (148;153;154) - (148) különbözõ drogfogyasztók + (97;155) - (156) * metamphetamin fogyasztók - (151) heroinfüggõk - (148) iv. különbözõ drogfogyasztók + (157) heroinfüggõk - (158;159) * - (158) + (160) 16 év alatti férfi heroinfüggõk + (161) metamphetamin fogyasztó - (162) férfiak különbözõ drogfogyasztók + (163)

Az asszociációt +, a negatív eredményt – jelzi. Csillaggal (*) jelöltem azokat a publikációkat, ahol családvizsgálat is történt. CC genotípus esetében feltételezhetõ, hogy a DRD4 gén transzkripciós aktivitása fokozódik, így több receptor keletkezik (88). D4-es receptorok a hippocampus és a prefrontális kortex GABA-erg sejtjein nagy mennyiségben expresszálódnak, a GABA felszabadulást gátolják, ezáltal a VTA dopaminerg neuronjainak kisülésére kifejtett gátló hatást gátolják. Több receptoron keresztül ez a hatás nagyobb mértékben jelentkezhet, tehát CC genotípusú emberekben a mezolombiko-kortikus körnek magasabb lehet az alap aktivitása. Ugyanakkor elképzelhetõ, hogy a több D4-es

65



receptor jelenléte magasabb dopamin szintet igényel, s ezt egyéb pozitív megerõsítõ inger hiányában a kábítószerek okozta fokozott dopamin kiáramlás biztosítja. A 120 bp duplikációról feltételezik, hogy a transzkripcióra hatással van, azonban ezt kísérleti adatok nem támasztják alá. Egy vizsgálat az újdonságkeresés és a rövid/rövid

(1/1)

homozigóta

genotípus

között

talált

összefüggést

(106),

kábítószerfüggõséggel kapcsolatos eredményekre azonban nincsenek még adatok a szakirodalomban. Asszociáció vizsgálatok esetében igen fontos az eredmények megerõsítése más munkacsoportok, más módszerek által, ezért az általunk kapott negatív eredmény ellenére, a 120 bp duplikáció egyszeresen ismétlõdõ alléljának a hajlamosító szerepe a kábítószerfüggõségre nem zárható ki. A DRD4 III. exon 48 bp VNTR polimorfizmusát vizsgálva nem kaptunk összefüggést sem az allél, sem a genotípus eloszlás és a kábítószer- vagy heroinfüggõség között [IV]. A legtöbb irodalmi adat ezzel a polimorfizmussal kapcsolatos, azonban az eredmények továbbra is ellentmondásosak. Gelernter és munkacsoportja, kábítószerfüggõk között magasabb újdonságkeresõ pontszámokat mért, de a 7-es allél elõfordulását nem találta gyakoribbnak (58). Franke hagyományos eset-kontroll vizsgálatok mellett család analízist (TDT-t) is végzett: 111 heroinfüggõ személy és szüleik genotípizálása alapján vizsgálta, hogy jellemzõ-e valamilyen hajlamosító allél átvitele az érintett utódokba, de feltevése nem igazolódott (156). A nemzetközi irodalomban azonban két munkacsoport is talált összefüggést a heroin függõség és a D4-es receptor gén hosszú allélja között. Kotler izraeli populációban 141 heroinfüggõ és 110 kontroll férfi genotípus vizsgálata során a 7-es allél elõfordulását szignifikánsan gyakoribbnak találta a kábítószerfüggõk között (153). Li kínai populációban 121 heroinfüggõ és 154 kontroll személy vizsgálatával próbálta megismételni Kotler eredményét. Mivel az ázsiai populációkban a 7-es allél elõfordulási gyakorisága kisebb, Li hosszú (5–8 ismétlõdést tartalmazó) és rövid (2–4 ismétlõdést tartalmazó) forma alapján csoportosította a genotípusokat, és szignifikánsan gyakoribbnak találta a hosszú forma jelenlétét heroinfüggõk között (154). Ugyanakkor egy késõbbi, nagyobb mintaszám elemezésével járó vizsgálat során Li és mtsai a hosszú allél szignifikánsan gyakoribb elõfordulását csak azon heroinfüggõk körében tudták kimutatni, akik inhaláció útján juttatták szervezetükbe a kábítószert (148). Vandenbergh

66



184 kábítószer élvezõ és 121 kontroll személyt genotipizált. A „hosszú (? 6 ismétlõdést tartalmazó) allél” gyakorisága megnövekedett kábítószerfüggõ férfiakban (155). Comings összefoglaló tanulmányában különbözõ pszichiátriai kórképek (kóros játékszenvedély, ADHD, Tourette szindróma, alkoholizmus) mellett kábítószerfüggõk esetében is elemezte a DRD4 48 bp VNTR polimorfizmust, mind a 7-es allélra, mind a „hosszú allélra” nézve, illetve homo- és heterozigóta genotípus tekintetében. Összefüggést talált a 7-es allélt és a 2-es allélt tartalmazó genotípusok és a kábítószerfüggõség Addiction Severity Index alapján mért súlyossága között. A legsúlyosabb függõséget a 2/2 és a 7/7 homozigóta genotípúsú személyekben mérte, a legkevésbé súlyosakat a 4/4 homozigóták körében (97). Az ellentmondásos eredmények magyarázata részben az lehet, hogy a 48 bp polimorfizmus „többaléllos” polimorfizmus, így a genotípus variációk száma igen széles tartományban mozoghat. Amennyiben a különbözõ genotípus kategóriák nem összevonhatók, nagyobb mintaszám elemzésével lehetne a pontos hatást elemezni. Ezen túlmenõen a DRD4 48bp VNTR polimorfizmusra jellemzõ az erõs etnikai és geográfiai rétegzõdés (79), mely kevert populációk vizsgálata esetén jelentõsen zavarja az asszociáció analízist (164). A szerotonerg rendszer genetikai polimorfizmusainak vizsgálata kábítószerfüggõkben A szerotonin változatos funkciójú neurotranszmitter a központi idegrendszerben. Számos fiziológiás folyamatban, mint például az alvás-, az étkezés-, a hõszabályozás, a fájdalomérzékelés, a szexuális viselkedés, a hangulati élet (szorongás, félelem, depresszió, agresszió) szabályozásában játszik szerepet. Modulálja a jutalmazó rendszer mûködését is, feltehetõen annak aktivitásától függõen. Valószínû azonban, hogy a szerotonin rendszer a dopaminnal ellentétes hatású, és inkább az elkerülõ viselkedések szabályozásában játszik szerepet (41), a személyiségjegyek közül a fájdalomkerülés neurobiológiai hátterét biztosítja (52). A szerotonerg rendszerben bekövetkezõ zavar különféle neuropszichiátriai betegségek, affektív kórképek, kényszeres viselkedések, epilepszia, migrén kialakulásához vezethet. A szerotonint intracellulárisan bontó MAO-A enzim mellett a szerotonin transzporter játszik jelentõs szerepet a szinaptikus résben hozzáférhetõ szerotoninszint

67



szabályozásában. A szerotonerg rednszer polimorfizmusait a különbözõ affektív kórképek mellett a kábítószerfüggõség rizikófaktoraként is vizsgálták (XIV. táblázat). XIV. táblázat: polimorfizmusai Kandidáns gén 5HT2A 5HT1B

SERT

A

szerotonerg

rendszer

Polimorfizmus -1438G/A T102C T -261 G -184/-183 dinukleotid deléció -182/-181 dinukleotid deléció A-161T C129T G861C A1180G 5HTTLPR

STin2

MAO-A

Dinukleotid repeat

kábítószerfüggõkben

Vizsgált csoport heroinfüggõk

vizsgált

eredmény - (150) - (150) - (165)

kokain függõk

opioid függõk kokain függõk metamphetamin fogyasztók 16 év alatti opioid függõ fiúk heroinfüggõk kokain függõk metamphetamin fogyasztók alkoholisták/ különbözõ drogfogyasztók

- (150;152) - (166) - (162) + (161) + (167) - (150) - (166) - (162) + (168)

Az asszociációt +, a negatív eredményt – jelzi. Munkám során a SERT két olyan polimorfizmusát vizsgáltam, melyek feltehetõen hatással vannak a SERT gén kifejezõdésére. A szerotonin transzporter promoterében elhelyezkedõ

hosszúság-polimorfizmus

(5HTTLPR)

funkcionális

jelentõsége

egyértelmûen bizonyított (118;119). Farmakogenetikai vizsgálatok és különbözõ pszichiátriai kórképek mellett a kábítószerfüggõség rizikófaktoraként is vizsgálták, de sem heroin (118;150;152), sem kokain abúzussal (166) nem kaptak összefüggést. Vizsgálataink során mi sem kaptunk szignifikáns eltérést a különbözõ 5HTTLPR genotípusok gyakoriságértékei között a kontroll és a kábítószerfüggõ populációban. Ezen vizsgálatok alapján az 5HTTLPR nem tekinthetõ a kábítószerfüggõség önálló rizikófaktorának [III, IV]. A STin2 polimorfizmus esetében, hasonlóan egy kínai heroinfüggõ (150) és egy afro-amerikai kokainfüggõ (166) populációban végzett vizsgálathoz, szintén negatív eredményeket kaptunk. Egy szingapúri munkacsoport azonban 63 kínai származású heroinfüggõ és 72 származás és életkor szerint illesztett kontroll személyben vizsgálta a

68



2 intronban található hosszúság-polimorfizmust. Ebben a vizsgálatban a 10-es allélt, valamint a 10-es allélt tartalmazó genotípusokat (10/10; 10/12,) szignifikánsan gyakoribbnak találta heroinfüggõkben (167). A STin2 polimorfizmusa jól példázza a polimorfizmusok etnikai és földrajzi rétegzõdését. Ázsiában élõ kínai és japán populációban a 10-es allél elõfordulása általában ritkább, összehasonlítva a kaukázusi populációban mérhetõ gyakoriságokkal (5%, 11% vs. 42%) (167;169;170). Ezért a keleti populációkban, kisebb mintaszám esetén az elsõfajú hiba (fals pozitív eredmény) elõfordulásának az esélye megnövekszik. Ez lehet a magyarázata annak, hogy a kínai populáció vizsgálatakor kapott korábbi pozitív eredményt (167) nagyobb mintaszám mellett nem tudták megerõsíteni (150). A szerotonin hatása a jutalmazó rendszerre és a kábítószerfüggõség kialakulására valószínûleg komplex mechanizmusok révén érvényesül. Ily módon a szerotonin transzporter allélváltozatai ha hozzá is járulnak a jutalmazó kör kábítószerek iránti fogékonyságának a növeléséhez, olyan kis hatáskülönbséget hordoznak, mely még az érzékeny, 1-2%-os genetikai hozzájárulást is kimutatni tudó kandidáns gén asszociáció vizsgálatokkal sem detektálható. A DRD4 és a SERT gén polimorfzmusainak együttes hatása a kábítószerfüggõség kialakulására A dopaminerg és a szerotonerg rendszer egymással kölcsönhatásban befolyásolja a jutalmazó rendszer mûködését. A dopamin valószínûleg azon viselkedések irányításában szerepel, melyek a jutalmazó hatást kiváltó szerek, viselkedésformák megszerzésére, kialakítására irányulnak. A szerotonin inkább az elkerülõ, védekezõ magatartás kialakítására vonatkozó információkat közvetíti (41). Molekuláris szinten a két rendszer mûködése már bonyolultabb, a szerotoninnak olykor a dopaminerg rendszer mûködését fokozó, olykor gátló hatását írták le (42-44). Eredményeink azt mutatják, hogy a két rendszer között molekuláris genetikai szinten is kimutatható a kölcsönhatás. Azt találtuk, hogy az 5HTTLPR 14-es allél (14/14 homozigóta vagy 14/16 heterozigóta genotípus) és a -521 CC homozigóta genotípus együttes jelenléte mind heroinfüggõk körében, mind a kábítószerfüggõ csoportban szignifikánsan gyakoribb. Számításaink alapján a -521 CC genotípusú

69



személyek esetében a heroinfüggésre való hajlam 2,14-es rizikója legalább egy 14-es allélt hordozó (14/14+14/16) 5HTTLPR genotípus esetében 2,86-ra, a két homozigóta genotípus (-521 CC és 14/14 5HTTLPR) együttes jelenlétében pedig, 4,82-re növekedett [III, IV]. In vitro transzfekciós rendszerekben (118) és in vivo SPECT (171) vizsgálatok során kimutatták, hogy az 5HTTLPR 14-es allél jelenlétében kevesebb SERT fejezõdik ki. Ennek következtében a szerotonin hosszabb ideig, ismételt ürülés következtében pedig nagyobb mennyiségben marad a szinaptikus résben, fokozott szerotonerg aktivitást eredményezve. A hippocampusban a szerotonin gátolja a GABA-erg sejtek kisülését (ld. 4. ábra) hasonlóan a dopamin D4-es receptoron kifejtett hatásához, illetve fokozza az enkefalinok GABA felszabadulást gátló hatását a VTA GABA-erg axon terminálisain. Eredményeink alapján tehát a -521 CC genotípusnak megfelelõen a több D4-es receptoron keresztüli dopaminerg és a 14/14 vagy 14/16 genotípusnak megfelelõ nagyobb szerotonin aktivitás együttes gátló hatása jelentõsebb GABA gátlást és nagyobb mezolimbikus dopaminerg aktivitást eredményez a többi genotípus kombinációhoz viszonyítva. A nagyobb mezolimbikus dopaminerg alapaktivitás hozzájárulhat az újdonságkeresõ személyiségjegy dominánssá válásához, és ezáltal hajlamosíthat a kábítószerfüggõség kialakulására. Az asszociáció vizsgálatok eredményeinek értékelésekor számos nehézség vetõdik fel, ezért az eredményeinket óvatosan kell kezelni. A kontroll populációnk meglehetõsen nagy és homogén, genotípus frekvenciái Hardy-Weinberg egyensúlyban vannak, nem szerint illeszkednek a kábítószerfüggõ populációhoz. A vizsgált kábítószerfüggõk

száma

azonban

relatíve

alacsony

(73

kábítószerfüggõ,

53

heroinfüggõ), mely megnöveli az elsõfajú statisztikai hiba (fals pozitív döntés) elkövetésének az esélyét (172). Asszociáció vizsgálatok esetében fontos az egyes eredmények megerõsítése, akár kibõvített mintaszám mellett, akár más munkacsoport által. Ugyanakkor a polimorfizmusok rétegzõdése következtében sokszor nagyon eltérõ genetikai állományú populációban gyakran nem ismételhetõek meg az eredmények. A polimorfizmusok rétegzõdésének kizárására legalkalmasabb eljárás a család alapú asszociáció vizsgálat, mely fõleg gyermekkorban jelentkezõ betegségek, mint az ADHD (109;110) vagy a migrén (173) esetében alkalmazható jól, hiszen ezekben az esetekben

70



a gyermekeket és szüleiket viszonylag könnyen be lehet vonni a vizsgálatba. Ez a módszer kábítószerfüggõk esetében nehezen kivitelezhetõ a gyakori szociális problémák miatt. A nemzetközi irodalomban is csak két tanulmány számol be kábítószerfüggõk körében végzett családalapú asszociáció vizsgálatról (156;159). Az asszociáció vizsgálatok másik típusa a teljes genom asszociáció vizsgálata, melynek során nem kandidáns gének polimorfizmusait vizsgálják, hanem genetikai markerek segítségével a teljes genomot pásztázzák végig. A vizsgálat célja azon kromoszóma régiók azonosítása, melyek tartalmazzák a kábítószerfüggõség genetikai rizikófaktorait. Uhl és munkatársai 1494 SNP-t vizsgáltak 239 európai- és 99 afrikai származású amerikai által alkotott kontroll csoportban és 415 európai- és 252 afrikai származású kábítószerfüggõben. 41 olyan kromoszóma régiót azonosítottak, mely mindkét populációban kimutatható volt (174). Tovább elemezve a fenti vizsgálatok eredményeit Uhl 104 olyan informatív markert talált, mely legalább az egyik vizsgálat során pozitív eredményt adott. A markereket lokalizációjuk alapján csoportokba rendezte, így összesen 8 kromoszómán 15 olyan régiót jelölt meg, melyek nagy eséllyel tartalmazzák a kábítószerfüggésre hajlamosító kandidáns géneket. Ezek közé tartozott a 11 kromószóma telomer régiója is, mely tartalmazza a D4-es dopamin receptor génjét (62). Egy másik vizsgálat kábítószerfüggõ serdülõkkel foglalkozott. Ebben a vizsgálatban a 3-as és a 9-es kromoszóma 1-1 régiója mutatott összefüggést a kábítószerfüggõség kialakulásával (175). Sajnos, a teljes genom vizsgálat a kandidáns génvizsgálatokhoz

hasonlóan reprodukálhatósági problémákkal küzd. Ezért

a

kábítószerfüggésre hajlamosító gének azonosítása még további vizsgálatokat igényel. A genetikai vizsgálatok során problémát jelent a „kábítószerfüggõ” fenotípus pontos meghatározása is. A nemzetközi klinikai standard (DSM IV) ellenére a fenotípus pontos meghatározása nem teljesen egységes, és ez szintén hozzájárulhat a különbözõ munkacsoportok között tapasztalható eltérésekhez. Gyakran egy igen tág fenotípus kategóriába, a „substance use disorder”-be sorolják a kábítószer fogyasztást, az abúzust és a függõséget is, esetenként az alkoholizmust és a dohányzást is beleértve. Sokszor a függõség kialakulása nem is maga a primer betegség, hanem más pszichiátriai betegség major depresszió, skizofrénia tünete lehet. Ez a diagnosztikus probléma nem csak a kábítószerüggõség esetében, hanem a legtöbb komplex öröklõdésû betegségnél fennáll, ahol a fenotípusos jegyeket nehéz objektíven vizsgálni. Újabban bevezették az

71



intermedier fenotípus, vagy endofenotípus fogalmát, mely olyan kvantitatívan mérhetõ fenotípusos jegyeket foglal magába, melyek akár különbözõ betegségekre is jellemzõek lehetnek (pl. vér lipid szint arteriosclerosisban, IgE szint aszthma bronchiáléban). Az endofenotípus olyan fenotípus egység, melynek kialakulását genetikai és környezeti tényezõk határozzák meg (21). Kábítószerfüggõség esetében ilyen objektíven mérhetõ endofenotípus lehet példál a személyiség újdonságkeresõ dimenziója (8). Nemrég felvetették a Humán Fenom Program elindításának lehetõségét, melynek célja olyan endofenotípusok definiálása és nemzetközi összefogással végzett felmérése, melyek jól mérhetõk, és genetikai hátterük objektíven vizsgálható (176). Egy további, az értékelést nehezítõ probléma magából a komplex öröklõdés jellemzõibõl adódik. A komplex jellegek kialakulására a környezet mellett több gén van hatással, azonban nincs egyértelmû ok-okozati összefüggés a genetikai változat jelenléte és a fenotípus megjelenése között. Ez azt jelenti, hogy míg a monogénes öröklõdésû mutációk megléte egyértelmû okozója a betegség kialakulásának, a poligénes rendszereknél a genetikai rizikófaktorok csak valószínûsítik a fenotípus kialakulását. A poligénes rendszerek kishatású génjeinek kimutatása módszertanilag is nehéz, mivel a legtöbb génváltozat csak minimális hatással, pl. 1-2%-ban járul hozzá a betegség, a fenotípusos jelleg kialakulásához (22). Így egy adott génváltozat járulékos szerepe igen kicsi, éppen ezért az azonosításuk nehéz. Továbbá, amikor egynél több gén szerepel egy fenotípusos jegy kialakításában, fontossá válnak a gének közötti interakciók. Az egyik gén hatása függhet egy másik génváltozat egyidejû jelenlététõl vagy hiányától (8). Mindezek figyelembevételével azt mondhatjuk, hogy a DRD4 génjének -521 CC formája, valamint a -521 CC együttes elõfordulása a SERT promoterében található polimorfizmus (5HTTLPR) alacsonyabb aktivitású transzportert kódoló formáival (14/14 és 14/16 genotípus) hajlamosíthatja, de nem determinálja a függõség kialakulását. A vizsgált polimorfizmusok szerepe nem közvetlenül a kábítószerek celluláris szintû hatásmechanizmusának módosításában keresendõ, hatásuk inkább a mezolimbiko-kortikus

jutalmazó

rendszer

mûködésének

befolyásolásán

és

a

kábítószerfüggõkre kiemelten jellemzõ újdonságkeresõ személyiségvonás alakításán keresztül érvényesül.

72

Köszönetnyilvánítás

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Ezúton szeretnék köszönetet mondani Dr. Szõke Évának a Gyógyszertudományok Doktori Iskola és Dr. Magyar Kálmánnak az Experimentális és Klinikai Farmakológiai Doktori Program vezetõjének, akik lehetõvé tették, hogy a doktori képzés keretein belül végezhessem kutatómunkámat, Dr. Fürst Zsuzsannának a Semmelweis Egyetem Farmakológiai és Farmakoterápiás Intézet és Dr. Mandl Józsefnek az Orvosi Vegytani, Molekuláris Biológiai és Pathobiokémiai Intézet igazgatójának, akik az általuk vezetett intézetben helyet biztosítottak számomra és támogattak ott végzett munkámban, Dr. Kalász Hubának témavezetõmnek, aki mindvégig segítségemre volt, sok hasznos tanáccsal látott el, Dr. Sasvári Máriának az Orvosi Vegytani, Molekuláris Biológiai és Pathobiokémiai Intézetben mûködõ molekuláris genetikai laboratórium vezetõjének, akinél tudományos diákkörösként kezdtem el kutatni és aki azóta is folyamatosan irányította és segítette munkámat, Dr. Gaszner Péternek az Országos Pszichiátriai és Neurológiai Intézet fõorvosának, aki az asszociáció vizsgálathoz szükséges mintavételben segített, illetve számos lehetõséget teremtett, hogy eredményeimet bemutathassam, Dr. Barta Csabának, Dr. Rónai Zsoltnak és Dr. Nemoda Zsófiának, az Orvosi Vegytani, Molekuláris Biológiai és Pathobiokémiai Intézetben mûködõ molekuláris genetikai laboratórium munkatársainak, akik munkám molekuláris genetikai részében nyújtottak elméleti és gyakorlati segítséget, Dr. Székely Annának, aki a statisztikai számításokban volt segítségemre, a biokémiai és farmakológiai laboratórium többi munkatársának, Szilágyi Ágnes hallgatótársamnak, aki a szakmai segítségen túl úgy érzem, barátságával is megajándékozott és végezetül barátaimnak, akik mindig felvidítottak, ha szükség volt rá és természetesen Édesanyámnak és Nagymamámnak, akiknek a szeretete minden nap elkísért.

73

Irodalomjegyzék

IRODALOMJEGYZÉK

1. Monragna P, Cortelli P, Mochi M. The "typical" migraines: genetic studies and some practical considerations. Journal of Headache and Pain 2003;4:47-56. 2. Hansen L. Candidate genes and late-onset type 2 diabetes mellitus. Susceptibility genes or common polymorphisms? Dan.Med.Bull. 2003;50(4):320-46. 3. Faraone SV, Doyle AE, Mick E, Biederman J. Meta-analysis of the association between the 7-repeat allele of the dopamine D(4) receptor gene and attention deficit hyperactivity disorder. Am.J.Psychiatry 2001;158(7):1052-7. 4. Rocchi A, Pellegrini S, Siciliano G, Murri L. Causative and susceptibility genes for Alzheimer's disease: a review. Brain Res.Bull. 2003;61(1):1-24. 5. Daniels SE, Bhattacharrya S, James A, Leaves NI, Young A, Hill MR et al. A genome-wide search for quantitative trait loci underlying asthma. Nature 1996;383(6597):247-50. 6. Francks C, Fisher SE, Marlow AJ, Richardson AJ, Stein JF, Monaco AP. A sibling-pair based approach for mapping genetic loci that influence quantitative measures of reading disability. Prostaglandins Leukot.Essent.Fatty Acids 2000;63(1-2):27-31. 7. Berry N, Jobanputra V, Pal H. Molecular genetics of schizophrenia: a critical review. J.Psychiatry Neurosci. 2003;28(6):415-29. 8. Ebstein RP, Benjamin J, Belmaker RH. Personality and polymorphisms of genes involved in aminergic neurotransmission. Eur.J.Pharmacol. 2000;410(2-3):20514. 9. Feldker DE, De Kloet ER, Kruk MR, Datson NA. Large-scale gene expression profiling of discrete brain regions: potential, limitations, and application in genetics of aggressive behavior. Behav.Genet. 2003;33(5):537-48. 10. McGuffin P, Riley B, Plomin R. Genomics and behavior. Toward behavioral genomics. Science 2001;291(5507):1232-49. 11. Sham PC. Statistical methods in psychiatric genetics. Stat.Methods Med.Res. 1998;7(3):279-300. 12. Aach J, Bulyk ML, Church GM, Comander J, Derti A, Shendure J. Computational comparison of two draft sequences of the human genome. Nature 2001;409(6822):856-9. 13. Venter JC, Adams MD, Myers EW, Li PW, Mural RJ, Sutton GG et al. The sequence of the human genome. Science 2001;291(5507):1304-51. 14. Pennisi E. The human genome. Science 2001;291(5507):1177-80. 15. Taylor JG, Choi EH, Foster CB, Chanock SJ. Using genetic variation to study human disease. Trends Mol.Med. 2001;7(11):507-12.

74

Irodalomjegyzék

16. Encyclopedia of Genetics. JH, Orlando US: 2002. 17. Connor M, Ferguson-Smith M. Medical Genetics . 1997. 18. Dunham I. Human genome sequences: enigmatic variations. Mutagenesis 2002;17(6):457-61. 19. Sachidanandam R, Weissman D, Schmidt SC, Kakol JM, Stein LD, Marth G et al. A map of human genome sequence variation containing 1.42 million single nucleotide polymorphisms. Nature 2001;409(6822):928-33. 20. Thorisson GA, Stein LD. The SNP Consortium website: past, present and future. Nucleic Acids Res. 2003;31(1):124-7. 21. Peltonen L, McKusick VA. Genomics and medicine. Dissecting human disease in the postgenomic era. Science 2001;291(5507):1224-9. 22. Comings DE, Blum K. Reward deficiency syndrome: genetic aspects of behavioral disorders. Prog.Brain Res. 2000;126:325-41. 23. Merikangas KR, Avenevoli S. Implications of genetic epidemiology for the prevention of substance use disorders. Addict.Behav. 2000;25(6):807-20. 24. Baron M. The search for complex disease genes: fault by linkage or fault by association? Mol.Psychiatry 2001;6(2):143-9. 25. Baron M. Behavioral Genetics . In: Alan Stoudemire, editor. Human Behavior, An Introduction for Medical Students. 2 ed. Lippincott-Raven; 1997. p. 413-28. 26. Mathew C. Science, medicine, and the future: Postgenomic technologies: hunting the genes for common disorders. BMJ 2001;322(7293):1031-4. 27. Schulze TG, McMahon FJ. Genetic association mapping at the crossroads: which test and why? Overview and practical guidelines. Am.J.Med.Genet. 2002;114(1):1-11. 28. Fürst Zsuzsanna. A központi idegrendszer gyógyszertana, Kábítószerabúzus. Élvezeti szerek. In: Fürst Zsuzsanna, editor. Farmakológia. Budapest: Medicina; 2001. 29. Rácz József. A drogok: hatások és tünetek . In: Rácz József, editor. A drogkérdésrõl - õszintén . first ed. B+V (medical&technical) Lap- és Könyvkiadó Kht; 2000. 30. Gerevich József. A drogok használatával összefüggõ pszichiátriai problémák és betegségek. In: Füredi János, editor. A pszichiátria magyar kézikönyve. first ed. Budapest: Medicina; 1998. p. 238-53. 31. OLDS J, MILNER P. Positive reinforcement produced by electrical stimulation of septal area and other regions of rat brain. J.Comp Physiol Psychol. 1954;47(6):419-27. 32. Bardo MT, Donohew RL, Harrington NG. Psychobiology of novelty seeking and drug seeking behavior. Behav.Brain Res. 1996;77(1-2):23-43. 33. Vetulani J. Drug addiction. Part II. Neurobiology of addiction. Pol.J.Pharmacol. 2001;53(4):303-17.

75

Irodalomjegyzék

34. Di Chiara G. The role of dopamine in drug abuse viewed from the perspective of its role in motivation. Drug Alcohol Depend. 1995;38(2):95-137. 35. Lichtermann D, Franke P, Maier W, Rao ML. Pharmacogenomics and addiction to opiates. Eur.J.Pharmacol. 2000;410(2-3):269-79. 36. Steffensen SC, Svingos AL, Pickel VM, Henriksen SJ. Electrophysiological characterization of GABAergic neurons in the ventral tegmental area. J.Neurosci. 1998;18(19):8003-15. 37. Tanda G, Pontieri FE, Di Chiara G. Cannabinoid and heroin activation of mesolimbic dopamine transmission by a common mu1 opioid receptor mechanism. Science 1997;276(5321):2048-50. 38. Wenger T, Moldrich G, Furst S. Neuromorphological background of cannabis addiction. Brain Res.Bull. 2003;61(2):125-8. 39. Ranaldi R, Wise RA. Blockade of D1 dopamine receptors in the ventral tegmental area decreases cocaine reward: possible role for dendritically released dopamine. J.Neurosci. 2001;21(15):5841-6. 40. Broderick PA, Phelix CF. I. Serotonin (5-HT) within dopamine reward circuits signals open-field behavior. II. Basis for 5-HT--DA interaction in cocaine dysfunctional behavior. Neurosci.Biobehav.Rev. 1997;21(3):227-60. 41. Daw ND, Kakade S, Dayan P. Opponent interactions between serotonin and dopamine. Neural Netw. 2002;15(4-6):603-16. 42. Kapur S, Remington G. Serotonin-dopamine interaction and its relevance to schizophrenia. Am.J.Psychiatry 1996;153(4):466-76. 43. Blum K, Braverman ER, Holder JM, Lubar JF, Monastra VJ, Miller D et al. Reward deficiency syndrome: a biogenetic model for the diagnosis and treatment of impulsive, addictive, and compulsive behaviors. J.Psychoactive Drugs 2000;32 Suppl:i-112. 44. Boulenguez P., Rawlins J.N.P., Chauveau J, Joseph H., and Mitchell S.N.and Gray J.A. Modulation of dopamine release in the nucleus accumbens by 5-HT1B agonists: involvment of the hippocampo-accumbens pathway. Neuropharmacology 35(11), 1521-1529. 1-14-1997. 45. Bubar MJ, McMahon LR, De Deurwaerdere P, Spampinato U, Cunningham KA. Selective serotonin reuptake inhibitors enhance cocaine-induced locomotor activity and dopamine release in the nucleus accumbens. Neuropharmacology 2003;44(3):342-53. 46. Schiffer WK, Gerasimov M, Hofmann L, Marsteller D, Ashby CR, Brodie JD et al. Gamma vinyl-GABA differentially modulates NMDA antagonist-induced increases in mesocortical versus mesolimbic DA transmission. Neuropsychopharmacology 2001;25(5):704-12. 47. Batra V, Patkar AA, Berrettini WH, Weinstein SP, Leone FT. The genetic determinants of smoking. Chest 2003;123(5):1730-9. 48. Seth P, Cheeta S, Tucci S, File SE. Nicotinic--serotonergic interactions in brain and behaviour. Pharmacol.Biochem.Behav. 2002;71(4):795-805.

76

Irodalomjegyzék

49. Aghajanian GK, Marek GJ. Serotonin Neuropsychopharmacology 1999;21(2 Suppl):16S-23S.

and

hallucinogens.

50. Backstrom JR, Chang MS, Chu H, Niswender CM, Sanders-Bush E. Agonistdirected signaling of serotonin 5-HT2C receptors: differences between serotonin and lysergic acid diethylamide (LSD). Neuropsychopharmacology 1999;21(2 Suppl):77S-81S. 51. Komáromi Éva. A droghasználat kialakulásának okai. In: Rácz József, editor. A drogkérdésrõl – õszintén. B+V (medical&technical) Lap- és Könyvkiadó Kht.; 2000. 52. Cloninger CR. A systematic method for clinical description and classification of personality variants. A proposal. Arch.Gen.Psychiatry 1987;44(6):573-88. 53. Cloninger CR, Svrakic DM, Przybeck TR. A psychobiological model of temperament and character. Arch.Gen.Psychiatry 1993;50(12):975-90. 54. Bouchard TJ, Jr. Genes, 1994;264(5166):1700-1.

environment,

and

personality.

Science

55. Rose RJ. Genes and human behavior. Annu.Rev.Psychol. 1995;46:625-54. 56. Koopmans JR, Boomsma DI, Heath AC, van Doornen LJ. A multivariate genetic analysis of sensation seeking. Behav.Genet. 1995;25(4):349-56. 57. Piazza PV, Deminiere JM, Le Moal M, Simon H. Factors that predict individual vulnerability to amphetamine self-administration. Science 1989;245(4925):1511-3. 58. Gelernter J, Kranzler H, Coccaro E, Siever L, New A, Mulgrew CL. D4 dopamine-receptor (DRD4) alleles and novelty seeking in substance-dependent, personality-disorder, and control subjects. Am.J.Hum.Genet. 1997;61(5):114452. 59. Howard MO, Kivlahan D, Walker RD. Cloninger's tridimensional theory of personality and psychopathology: applications to substance use disorders. J.Stud.Alcohol 1997;58(1):48-66. 60. Nixon SJ, Parsons OA. Application of the Tridimensional Personality Questionnaire to a population of alcoholics and other substance abusers. Alcohol Clin.Exp.Res. 1990;14(4):513-7. 61. Wills TA, Vaccaro D, McNamara G. Novelty seeking, risk taking, and related constructs as predictors of adolescent substance use: an application of Cloninger's theory. J.Subst.Abuse 1994;6(1):1-20. 62. Uhl GR, Liu QR, Naiman D. Substance abuse vulnerability loci: converging genome scanning data. Trends Genet. 2002;18(8):420-5. 63. Duaux E, Gorwood P, Griffon N, Bourdel MC, Sautel F, Sokoloff P et al. Homozygosity at the dopamine D3 receptor gene is associated with opiate dependence. Mol.Psychiatry 1998;3(4):333-6. 64. Uhl GR. Molecular genetics of substance abuse vulnerability: a current approach. Neuropsychopharmacology 1999;20(1):3-9.

77

Irodalomjegyzék

65. Vanyukov MM, Tarter RE. Genetic studies of substance abuse. Drug Alcohol Depend. 2000;59(2):101-23. 66. Oak JN, Oldenhof J, Van Tol HH. The dopamine D(4) receptor: one decade of research. Eur.J.Pharmacol. 2000;405(1-3):303-27. 67. Wong AH, Van Tol HH. The dopamine D4 receptors and mechanisms of antipsychotic atypicality. Prog.Neuropsychopharmacol.Biol.Psychiatry 2003;27(7):1091-9. 68. Feldpausch DL, Needham LM, Stone MP, Althaus JS, Yamamoto BK, Svensson KA et al. The role of dopamine D4 receptor in the induction of behavioral sensitization to amphetamine and accompanying biochemical and molecular adaptations. J.Pharmacol.Exp.Ther. 1998;286(1):497-508. 69. Rubinstein M, Phillips TJ, Bunzow JR, Falzone TL, Dziewczapolski G, Zhang G et al. Mice lacking dopamine D4 receptors are supersensitive to ethanol, cocaine, and methamphetamine. Cell 1997;90(6):991-1001. 70. Falzone TL, Gelman DM, Young JI, Grandy DK, Low MJ, Rubinstein M. Absence of dopamine D4 receptors results in enhanced reactivity to unconditioned, but not conditioned, fear. Eur.J.Neurosci. 2002;15(1):158-64. 71. Dulawa SC, Grandy DK, Low MJ, Paulus MP, Geyer MA. Dopamine D4 receptor-knock-out mice exhibit reduced exploration of novel stimuli. J.Neurosci. 1999;19(21):9550-6. 72. Van Tol HH, Bunzow JR, Guan HC, Sunahara RK, Seeman P, Niznik HB et al. Cloning of the gene for a human dopamine D4 receptor with high affinity for the antipsychotic clozapine. Nature 1991;350(6319):610-4. 73. Kamakura S, Iwaki A, Matsumoto M, Fukumaki Y. Cloning and characterization of the 5'-flanking region of the human dopamine D4 receptor gene. Biochem.Biophys.Res.Commun. 1997;235(2):321-6. 74. Catalano M, Nobile M, Novelli E, Nothen MM, Smeraldi E. Distribution of a novel mutation in the first exon of the human dopamine D4 receptor gene in psychotic patients. Biol.Psychiatry 1993;34(7):459-64. 75. Nothen MM, Cichon S, Hemmer S, Hebebrand J, Remschmidt H, Lehmkuhl G et al. Human dopamine D4 receptor gene: frequent occurrence of a null allele and observation of homozygosity. Hum.Mol.Genet. 1994;3(12):2207-12. 76. Cichon S, Nothen MM, Catalano M, Di Bella D, Maier W, Lichtermann D et al. Identification of two novel polymorphisms and a rare deletion variant in the human dopamine D4 receptor gene. Psychiatr.Genet. 1995;5(3):97-103. 77. Seeman P, Ulpian C, Chouinard G, Van Tol HH, Dwosh H, Lieberman JA et al. Dopamine D4 receptor variant, D4GLYCINE194, in Africans, but not in Caucasians: no association with schizophrenia. Am.J.Med.Genet. 1994;54(4):384-90. 78. Van Tol HH, Wu CM, Guan HC, Ohara K, Bunzow JR, Civelli O et al. Multiple dopamine D4 receptor variants in the human population. Nature 1992;358(6382):149-52.

78

Irodalomjegyzék

79. Chang FM, Kidd JR, Livak KJ, Pakstis AJ, Kidd KK. The world-wide distribution of allele frequencies at the human dopamine D4 receptor locus. Hum.Genet. 1996;98(1):91-101. 80. Van Tol HH. Structural and functional characteristics of the dopamine D4 receptor. Adv.Pharmacol. 1998;42:486-90. 81. Asghari V, Sanyal S, Buchwaldt S, Paterson A, Jovanovic V, Van Tol HH. Modulation of intracellular cyclic AMP levels by different human dopamine D4 receptor variants. J.Neurochem. 1995;65(3):1157-65. 82. Jovanovic V, Guan HC, Van Tol HH. Comparative pharmacological and functional analysis of the human dopamine D4.2 and D4.10 receptor variants. Pharmacogenetics 1999;9(5):561-8. 83. Cohen BM, Ennulat DJ, Centorrino F, Matthysse S, Konieczna H, Chu HM et al. Polymorphisms of the dopamine D4 receptor and response to antipsychotic drugs. Psychopharmacology (Berl) 1999;141(1):6-10. 84. Rao PA, Pickar D, Gejman PV, Ram A, Gershon ES, Gelernter J. Allelic variation in the D4 dopamine receptor (DRD4) gene does not predict response to clozapine. Arch.Gen.Psychiatry 1994;51(11):912-7. 85. Hwu HG, Hong CJ, Lee YL, Lee PC, Lee SF. Dopamine D4 receptor gene polymorphisms and neuroleptic response in schizophrenia. Biol.Psychiatry 1998;44(6):483-7. 86. Zalsman G, Frisch A, Lev-Ran S, Martin A, Michaelovsky E, Bensason D et al. DRD4 exon III polymorphism and response to risperidone in Israeli adolescents with schizophrenia: a pilot pharmacogenetic study. Eur.Neuropsychopharmacol. 2003;13(3):183-5. 87. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP. 2001. 88. Okuyama Y, Ishiguro H, Toru M, Arinami T. A genetic polymorphism in the promoter region of DRD4 associated with expression and schizophrenia. Biochem.Biophys.Res.Commun. 1999;258(2):292-5. 89. Ronai Z, Guttman A, Keszler G, Sasvari-Szekely M. Capillary electrophoresis study on DNA-protein complex formation in the polymorphic 5' upstream region of the dopamine D4 receptor (DRD4) gene. Curr.Med.Chem. 2004;11(8):10239. 90. Seaman MI, Fisher JB, Chang F, Kidd KK. Tandem duplication polymorphism upstream of the dopamine D4 receptor gene (DRD4). Am.J.Med.Genet. 1999;88(6):705-9. 91. Benjamin J, Li L, Patterson C, Greenberg BD, Murphy DL, Hamer DH. Population and familial association between the D4 dopamine receptor gene and measures of Novelty Seeking. Nat.Genet. 1996;12(1):81-4. 92. Ebstein RP, Novick O, Umansky R, Priel B, Osher Y, Blaine D et al. Dopamine D4 receptor (D4DR) exon III polymorphism associated with the human personality trait of Novelty Seeking. Nat.Genet. 1996;12(1):78-80.

79

Irodalomjegyzék

93. Ebstein RP, Nemanov L, Klotz I, Gritsenko I, Belmaker RH. Additional evidence for an association between the dopamine D4 receptor (D4DR) exon III repeat polymorphism and the human personality trait of Novelty Seeking. Mol.Psychiatry 1997;2(6):472-7. 94. Noble EP, Ozkaragoz TZ, Ritchie TL, Zhang X, Belin TR, Sparkes RS. D2 and D4 dopamine receptor polymorphisms and personality. Am.J.Med.Genet. 1998;81(3):257-67. 95. Ono Y, Manki H, Yoshimura K, Muramatsu T, Mizushima H, Higuchi S et al. Association between dopamine D4 receptor (D4DR) exon III polymorphism and novelty seeking in Japanese subjects. Am.J.Med.Genet. 1997;74(5):501-3. 96. Tomitaka M, Tomitaka S, Otuka Y, Kim K, Matuki H, Sakamoto K et al. Association between novelty seeking and dopamine receptor D4 (DRD4) exon III polymorphism in Japanese subjects. Am.J.Med.Genet. 1999;88(5):469-71. 97. Comings DE, Gonzalez N, Wu S, Gade R, Muhleman D, Saucier G et al. Studies of the 48 bp repeat polymorphism of the DRD4 gene in impulsive, compulsive, addictive behaviors: Tourette syndrome, ADHD, pathological gambling, and substance abuse. Am.J.Med.Genet. 1999;88(4):358-68. 98. Jonsson EG, Nothen MM, Gustavsson JP, Neidt H, Forslund K, MattilaEvenden M et al. Lack of association between dopamine D4 receptor gene and personality traits. Psychol.Med. 1998;28(4):985-9. 99. Malhotra AK, Virkkunen M, Rooney W, Eggert M, Linnoila M, Goldman D. The association between the dopamine D4 receptor (D4DR) 16 amino acid repeat polymorphism and novelty seeking. Mol.Psychiatry 1996;1(5):388-91. 100. Vandenbergh DJ, Zonderman AB, Wang J, Uhl GR, Costa PT, Jr. No association between novelty seeking and dopamine D4 receptor (D4DR) exon III seven repeat alleles in Baltimore Longitudinal Study of Aging participants. Mol.Psychiatry 1997;2(5):417-9. 101. Okuyama Y, Ishiguro H, Nankai M, Shibuya H, Watanabe A, Arinami T. Identification of a polymorphism in the promoter region of DRD4 associated with the human novelty seeking personality trait. Mol.Psychiatry 2000;5(1):649. 102. Ronai Z, Szekely A, Nemoda Z, Lakatos K, Gervai J, Staub M et al. Association between Novelty Seeking and the -521 C/T polymorphism in the promoter region of the DRD4 gene. Mol.Psychiatry 2001;6(1):35-8. 103. Bookman EB, Taylor RE, Adams-Campbell L, Kittles RA. DRD4 promoter SNPs and gender effects on Extraversion in African Americans. Mol.Psychiatry 2002;7(7):786-9. 104. Ekelund J, Suhonen J, Jarvelin MR, Peltonen L, Lichtermann D. No association of the -521 C/T polymorphism in the promoter of DRD4 with novelty seeking. Mol.Psychiatry 2001;6(6):618-9. 105. Lee HJ, Lee HS, Kim YK, Kim SH, Kim L, Lee MS et al. Allelic variants interaction of dopamine receptor D4 polymorphism correlate with personality

80

Irodalomjegyzék

traits in young Korean female population. Am.J.Med.Genet. 2003;118B(1):7680. 106. Rogers G, Joyce P, Mulder R, Sellman D, Miller A, Allington M et al. Association of a duplicated repeat polymorphism in the 5'-untranslated region of the DRD4 gene with novelty seeking. Am.J.Med.Genet. 2004;126B(1):95-8. 107. LaHoste GJ, Swanson JM, Wigal SB, Glabe C, Wigal T, King N et al. Dopamine D4 receptor gene polymorphism is associated with attention deficit hyperactivity disorder. Mol.Psychiatry 1996;1(2):121-4. 108. Muglia P, Jain U, Macciardi F, Kennedy JL. Adult attention deficit hyperactivity disorder and the dopamine D4 receptor gene. Am.J.Med.Genet. 2000;96(3):2737. 109. Sunohara GA, Roberts W, Malone M, Schachar RJ, Tannock R, Basile VS et al. Linkage of the dopamine D4 receptor gene and attention-deficit/hyperactivity disorder. J.Am.Acad.Child Adolesc.Psychiatry 2000;39(12):1537-42. 110. Tahir E, Yazgan Y, Cirakoglu B, Ozbay F, Waldman I, Asherson PJ. Association and linkage of DRD4 and DRD5 with attention deficit hyperactivity disorder (ADHD) in a sample of Turkish children. Mol.Psychiatry 2000;5(4):396-404. 111. Castellanos FX, Lau E, Tayebi N, Lee P, Long RE, Giedd JN et al. Lack of an association between a dopamine-4 receptor polymorphism and attentiondeficit/hyperactivity disorder: genetic and brain morphometric analyses. Mol.Psychiatry 1998;3(5):431-4. 112. Todd RD, Neuman RJ, Lobos EA, Jong YJ, Reich W, Heath AC. Lack of association of dopamine D4 receptor gene polymorphisms with ADHD subtypes in a population sample of twins. Am.J.Med.Genet. 2001;105(5):432-8. 113. Torres GE, Gainetdinov RR, Caron MG. Plasma membrane monoamine transporters: structure, regulation and function. Nat.Rev.Neurosci. 2003;4(1):1325. 114. Heinz A, Ragan P, Jones DW, Hommer D, Williams W, Knable MB et al. Reduced central serotonin transporters in alcoholism. Am.J.Psychiatry 1998;155(11):1544-9. 115. Malison RT, Price LH, Berman R, van Dyck CH, Pelton GH, Carpenter L et al. Reduced brain serotonin transporter availability in major depression as measured by [123I]-2 beta-carbomethoxy-3 beta-(4-iodophenyl)tropane and single photon emission computed tomography. Biol.Psychiatry 1998;44(11):1090-8. 116. Tiihonen J, Kuikka JT, Bergstrom KA, Karhu J, Viinamaki H, Lehtonen J et al. Single-photon emission tomography imaging of monoamine transporters in impulsive violent behaviour. Eur.J.Nucl.Med. 1997;24(10):1253-60. 117. Mann JJ, Huang YY, Underwood MD, Kassir SA, Oppenheim S, Kelly TM et al. A serotonin transporter gene promoter polymorphism (5-HTTLPR) and prefrontal cortical binding in major depression and suicide. Arch.Gen.Psychiatry 2000;57(8):729-38.

81

Irodalomjegyzék

118. Heils A, Teufel A, Petri S, Stober G, Riederer P, Bengel D et al. Allelic variation of human serotonin transporter gene expression. J.Neurochem. 1996;66(6):2621-4. 119. Lesch KP, Bengel D, Heils A, Sabol SZ, Greenberg BD, Petri S et al. Association of anxiety-related traits with a polymorphism in the serotonin transporter gene regulatory region. Science 1996;274(5292):1527-31. 120. Veenstra-VanderWeele J, Anderson GM, Cook EH, Jr. Pharmacogenetics and the serotonin system: initial studies and future directions. Eur.J.Pharmacol. 2000;410(2-3):165-81. 121. Fiskerstrand CE, Lovejoy EA, Quinn JP. An intronic polymorphic domain often associated with susceptibility to affective disorders has allele dependent differential enhancer activity in embryonic stem cells. FEBS Lett. 1999;458(2):171-4. 122. MacKenzie A, Quinn J. A serotonin transporter gene intron 2 polymorphic region, correlated with affective disorders, has allele-dependent differential enhancer-like properties in the mouse embryo. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 1999;96(26):15251-5. 123. Bayle FJ, Leroy S, Gourion D, Millet B, Olie JP, Poirier MF et al. 5HTTLPR polymorphism in schizophrenic patients: further support for association with violent suicide attempts. Am.J.Med.Genet. 2003;119B(1):13-7. 124. Gorwood P, Batel P, Ades J, Hamon M, Boni C. Serotonin transporter gene polymorphisms, alcoholism, and suicidal behavior. Biol.Psychiatry 2000;48(4):259-64. 125. Freeman B, Powell J, Ball D, Hill L, Craig I, Plomin R. DNA by mail: an inexpensive and noninvasive method for collecting DNA samples from widely dispersed populations. Behav.Genet. 1997;27(3):251-7. 126. Meulenbelt I, Droog S, Trommelen GJ, Boomsma DI, Slagboom PE. High-yield noninvasive human genomic DNA isolation method for genetic studies in geographically dispersed families and populations. Am.J.Hum.Genet. 1995;57(5):1252-4. 127. Sambrook J, Fritsch E.F, Maniatis T. Molecular cloning. seconded. Plainwiev,NY: Cold Spring Harbor Lab.Press.; 1989. 128. Ronai Z, Barta C, Guttman A, Lakatos K, Gervai J, Staub M et al. Genotyping the -521C/T functional polymorphism in the promoter region of dopamine D4 receptor (DRD4) gene. Electrophoresis 2001;22(6):1102-5. 129. Szoke M, Sasvari-Szekely M, Barta C, Guttman A. Human dopamine D4 receptor allele genotyping by ultrathin agarose gel electrophoresis with To-Pro-3 complexation. Electrophoresis 1999;20(3):497-501. 130. Lesch KP, Balling U, Gross J, Strauss K, Wolozin BL, Murphy DL et al. Organization of the human serotonin transporter gene. J.Neural Transm.Gen.Sect. 1994;95(2):157-62. 131. Nemoda Z, Ronai Z, Szekely A, Kovacs E, Shandrick S, Guttman A et al. Highthroughput genotyping of repeat polymorphism in the regulatory region of

82

Irodalomjegyzék

serotonin transporter gene by gel microchip electrophoresis. Electrophoresis 2001;22(18):4008-11. 132. Ronai Z, Guttman A, Nemoda Z, Staub M, Kalasz H, Sasvari-Szekely M. Rapid and sensitive genotyping of dopamine D4 receptor tandem repeats by automated ultrathin-layer gel electrophoresis. Electrophoresis 2000;21(10):2058-61. 133. Lichter JB, Barr CL, Kennedy JL, Van Tol HH, Kidd KK, Livak KJ. A hypervariable segment in the human dopamine receptor D4 (DRD4) gene. Hum.Mol.Genet. 1993;2(6):767-73. 134. Szoke M, Sasvari-Szekely M, Guttman A. Ultra-thin-layer agarose gel electrophoresis. I. Effect of the gel concentration and temperature on the separation of DNA fragments. J.Chromatogr.A 1999;830(2):465-71. 135. Richards B, Skoletsky J, Shuber AP, Balfour R, Stern RC, Dorkin HL et al. Multiplex PCR amplification from the CFTR gene using DNA prepared from buccal brushes/swabs. Hum.Mol.Genet. 1993;2(2):159-63. 136. Freeman B, Smith N, Curtis C, Huckett L, Mill J, Craig IW. DNA from buccal swabs recruited by mail: evaluation of storage effects on long-term stability and suitability for multiplex polymerase chain reaction genotyping. Behav.Genet. 2003;33(1):67-72. 137. King IB, Satia-Abouta J, Thornquist MD, Bigler J, Patterson RE, Kristal AR et al. Buccal cell DNA yield, quality, and collection costs: comparison of methods for large-scale studies. Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev. 2002;11(10 Pt 1):1130-3. 138. Heath EM, Morken NW, Campbell KA, Tkach D, Boyd EA, Strom DA. Use of buccal cells collected in mouthwash as a source of DNA for clinical testing. Arch.Pathol.Lab Med. 2001;125(1):127-33. 139. Guttman A, Barta C, Szoke M, Sasvari-Szekely M, Kalasz H. Real-time detection of allele-specific polymerase chain reaction products by automated ultra-thin-layer agarose gel electrophoresis. J.Chromatogr.A 1998;828(1-2):4817. 140. Guttman A, Lengyel T, Szoke M, Sasvari-Szekely M. Ultra-thin-layer agarose gel electrophoresis II. Separation of DNA fragments on composite agaroselinear polymer matrices. Journal of Chromatography A 2000;871:289-98. 141. Smith DR. Gel electrophoresis of DNA. In: Rapley R, Walker JM, editors. Molecular Biomethods Handbook. New Yersey: HUmana Press Inc; 1998. p. 17-33. 142. Underhill PA, Jin L, Lin AA, Mehdi SQ, Jenkins T, Vollrath D et al. Detection of numerous Y chromosome biallelic polymorphisms by denaturing highperformance liquid chromatography. Genome Res. 1997;7(10):996-1005. 143. Orita M, Suzuki Y, Sekiya T, Hayashi K. Rapid and sensitive detection of point mutations and DNA polymorphisms using the polymerase chain reaction. Genomics 1989;5(4):874-9. 144. Fodde R, Losekoot M. Mutation detection by denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE). Hum.Mutat. 1994;3(2):83-94.

83

Irodalomjegyzék

145. Barta C, Sasvari-Szekely M, Guttman A. Simultaneous analysis of various mutations on the 21-hydroxylase gene by multi-allele specific amplification and capillary gel electrophoresis. J.Chromatogr.A 1998;817(1-2):281-6. 146. Biederman J, Wilens TE, Mick E, Faraone SV, Spencer T. Does attention-deficit hyperactivity disorder impact the developmental course of drug and alcohol abuse and dependence? Biol.Psychiatry 1998;44(4):269-73. 147. Giedd JN, Blumenthal J, Molloy E, Castellanos FX. Brain imaging of attention deficit/hyperactivity disorder. Ann.N.Y.Acad.Sci. 2001;931:33-49. 148. Li T, Zhu ZH, Liu X, Hu X, Zhao J, Sham PC et al. Association analysis of polymorphisms in the DRD4 gene and heroin abuse in Chinese subjects. Am.J Med.Genet. 2000;96(5):616-21. 149. Comings DE, Gade R, Wu S, Chiu C, Dietz G, Muhleman D et al. Studies of the potential role of the dopamine D1 receptor gene in addictive behaviors. Mol.Psychiatry 1997;2(1):44-56. 150. Li T, Liu X, Zhao J, Hu X, Ball DM, Loh e et al. Allelic association analysis of the dopamine D2, D3, 5-HT2A, and GABA(A)gamma2 receptors and serotonin transporter genes with heroin abuse in Chinese subjects. Am.J.Med.Genet. 2002;114(3):329-35. 151. Tsai SJ, Cheng CY, Shu LR, Yang CY, Pan CW, Liou YJ et al. No association for D2 and D4 dopamine receptor polymorphisms and methamphetamine abuse in Chinese males. Psychiatr.Genet. 2002;12(1):29-33. 152. Kotler M, Cohen H, Kremer I, Mel H, Horowitz R, Ohel N et al. No association between the serotonin transporter promoter region (5-HTTLPR) and the dopamine D3 receptor (BalI D3DR) polymorphisms and heroin addiction. Mol.Psychiatry 1999;4(4):313-4. 153. Kotler M, Cohen H, Segman R, Gritsenko I, Nemanov L, Lerer B et al. Excess dopamine D4 receptor (D4DR) exon III seven repeat allele in opioid-dependent subjects. Mol.Psychiatry 1997;2(3):251-4. 154. Li T, Xu K, Deng H, Cai G, Liu J, Liu X et al. Association analysis of the dopamine D4 gene exon III VNTR and heroin abuse in Chinese subjects. Mol.Psychiatry 1997;2(5):413-6. 155. Vandenbergh DJ, Rodriguez LA, Hivert E, Schiller JH, Villareal G, Pugh EW et al. Long forms of the dopamine receptor (DRD4) gene VNTR are more prevalent in substance abusers: no interaction with functional alleles of the catechol-o-methyltransferase (COMT) gene. Am.J.Med.Genet. 2000;96(5):67883. 156. Franke P, Nothen MM, Wang T, Knapp M, Lichtermann D, Neidt H et al. DRD4 exon III VNTR polymorphism-susceptibility factor for heroin dependence? Results of a case-control and a family-based association approach. Mol.Psychiatry 2000;5(1):101-4. 157. Vanyukov MM, Moss HB, Kaplan BB, Kirillova GP, Tarter RE. Antisociality, substance dependence, and the DRD5 gene: a preliminary study. Am.J Med.Genet. 2000;96(5):654-8.

84

Irodalomjegyzék

158. Cao L, Li T, Liu X. [Association study of heroin dependence and catechol-Omethyltransferase gene]. Zhonghua Yi.Xue.Yi.Chuan Xue.Za Zhi. 2003;20(2):127-30. 159. Horowitz R, Kotler M, Shufman E, Aharoni S, Kremer I, Cohen H et al. Confirmation of an excess of the high enzyme activity COMT val allele in heroin addicts in a family-based haplotype relative risk study. Am.J.Med.Genet. 2000;96(5):599-603. 160. Cao L, Li T, Xu K, Liu X. [Association study of heroin-dependence and -287 A/G polymorphism of catechol-O-methyltransferase gene]. Zhonghua Yi.Xue.Yi.Chuan Xue.Za Zhi. 2002;19(6):499-501. 161. Galeeva AR, Gareeva AE, Iur'ev EB, Khusnutdinova EK. [VNTR polymorphisms of the serotonin transporter and dopamine transporter genes in male opiate addicts]. Mol.Biol.(Mosk) 2002;36(4):593-8. 162. Hong CJ, Cheng CY, Shu LR, Yang CY, Tsai SJ. Association study of the dopamine and serotonin transporter genetic polymorphisms and methamphetamine abuse in Chinese males. J.Neural Transm. 2003;110(4):34551. 163. Uhl GR, Vandenbergh DJ, Rodriguez LA, Miner L, Takahashi N. Dopaminergic genes and substance abuse. Adv.Pharmacol. 1998;42:1024-32. 164. Hamer D, Sirota L. Beware the chopsticks gene. Mol.Psychiatry 2000;5(1):11-3. 165. Cigler T, LaForge KS, McHugh PF, Kapadia SU, Leal SM, Kreek MJ. Novel and previously reported single-nucleotide polymorphisms in the human 5HT(1B) receptor gene: no association with cocaine or alcohol abuse or dependence. Am.J.Med.Genet. 2001;105(6):489-97. 166. Patkar AA, Berrettini WH, Hoehe M, Thornton CC, Gottheil E, Hill K et al. Serotonin transporter polymorphisms and measures of impulsivity, aggression, and sensation seeking among African-American cocaine-dependent individuals. Psychiatry Res. 2002;110(2):103-15. 167. Tan EC, Yeo BK, Ho BK, Tay AH, Tan CH. Evidence for an association between heroin dependence and a VNTR polymorphism at the serotonin transporter locus. Mol.Psychiatry 1999;4(3):215-7. 168. Vanyukov MM, Moss HB, Yu LM, Tarter RE, Deka R. Preliminary evidence for an association of a dinucleotide repeat polymorphism at the MAOA gene with early onset alcoholism/substance abuse. Am.J Med.Genet. 1995;60(2):122-6. 169. Kunugi H, Hattori M, Kato T, Tatsumi M, Sakai T, Sasaki T et al. Serotonin transporter gene polymorphisms: ethnic difference and possible association with bipolar affective disorder. Mol.Psychiatry 1997;2(6):457-62. 170. Rees M, Norton N, Jones I, McCandless F, Scourfield J, Holmans P et al. Association studies of bipolar disorder at the human serotonin transporter gene (hSERT; 5HTT). Mol.Psychiatry 1997;2(5):398-402. 171. Heinz A, Jones DW, Mazzanti C, Goldman D, Ragan P, Hommer D et al. A relationship between serotonin transporter genotype and in vivo protein expression and alcohol neurotoxicity. Biol.Psychiatry 2000;47(7):643-9.

85

Irodalomjegyzék

172. Dinya Elek. A hipotézisvizsgálat fogalmai. In: Dinya Elek, editor. Biometria. Budapest: Medicina; 2001. 173. Del Zompo M, Cherchi A, Palmas MA, Ponti M, Bocchetta A, Gessa GL et al. Association between dopamine receptor genes and migraine without aura in a Sardinian sample. Neurology 1998;51(3):781-6. 174. Uhl GR, Liu QR, Walther D, Hess J, Naiman D. Polysubstance abusevulnerability genes: genome scans for association, using 1,004 subjects and 1,494 single-nucleotide polymorphisms. Am.J Hum.Genet. 2001;69(6):1290300. 175. Stallings MC, Corley RP, Hewitt JK, Krauter KS, Lessem JM, Mikulich SK et al. A genome-wide search for quantitative trait loci influencing substance dependence vulnerability in adolescence. Drug Alcohol Depend. 2003;70(3):295-307. 176. Freimer N, Sabatti C. The human phenome project. Nat.Genet. 2003;34(1):1521.

86

Saját közlemények

SAJÁT KÖZLEMÉNYEK

A dolgozat anyagát képezõ közlemények I. K. Boór, Z. Rónai, Z. Nemoda, P. Gaszner, M. Sasvári-Székely, A. Guttman and H.

Kalász: Noninvasive genotyping of dopamine receptor D4 (DRD4) using

nanograms of DNA from sunstance-dependent patients. Current Medicinal Chemistry, 9, 793-798 (2002). IF: 4,966 II. K. Boór, Z. Rónai, M. Sasvári-Székely, P. Gaszner and H. Kalász: The use of planar electrophoresis for detection of single nucleotide polymorphism. J. Planar Chromatogr. – Modern TLC, 15, 101-106 (2002). IF: 1,047 III. Boór Krisztina, Gaszner Péter, Barta Csaba, Kalász Huba és Sasvári-Székely Mária:

A

kábítószerfüggés

genetikai

hátterének

vizsgálati

módszerei

Neuropshychofarmacologia Hungarica 2003, V/3;143-151 IV. C Barta*, K Boor*, A Szekely, A Szilagyi, P Gaszner, H Kalasz and M SasvariSzekely: Combined effect of promoter polymorphisms in he dopamine D4 receptor and the serotonin transporter genes in heroin dependence kézirat *társ elsõ-szerzõk Elõadáskivonatok V. Barta C, Ronai Z, Nemoda Z, Boor K, Tarnok Z, Gadoros J, Zelenai K, KataySzabo I and Sasvari-Szekely M: Molecular haplotyping of the dopamine D4 receptor gene promoter region: applications in clinical association studies. Am J Med Gen Part B Psyciatric Genet 2003, 122B(1) pp.68 (Imp. F. 2,334)

A dolgozat témájához szorosan nem kapcsolodó közlemények VI. Huba Kalász, Krisztina Boór and Ágnes Szilágyi: Special Aspects of the Analysis of (-)-Deprenyl Metabolites Using Liquid Chromatography, Chem. Anal. (Warsaw)48, 521 (2003) IF:0,539

87

Saját közlemények

VII. Agnes Szilagyi, Krisztina Boor, Viktor Farkas, Eszter Szantai, Anna Szekely, Zsolt Ronai, Huba Kalasz and Maria Sasvari-Szekely: Vomiting as an endophenotype in pediatric migraine associated with polymorphisms of the serotonin transporter kézirat Elõadáskivonatok VIII. Farkas V, Boor K, Szilagyi A, Sasvari-Szekely M: Genetic polymorphisms of the dopaminergic and serotoninergic system in pediatric migraine Cephalalgia 2003, 23 (7): 572-572. (Imp. F. 3,775) IX. K. Boór, Á. Szilágyi, I. Orosz, H. Kalász, M. Sasvári-Székely, V Farkas: Genetic association study of the serotonergic system in pediatric migraine The Journal of Headache and Pain 2004, 5(1): 68 X. Á. Szilágyi, K. Boór, I. Orosz, H. Kalász, M. Sasvári-Székely, V Farkas: Familybased association study of polymorphisms of the dopaminergic system in pediatric migraine The Journal of Headache and Pain 2004, 5(1):59

88

Tartalomjegyzék TARTALOMJEGYZÉK

Recommend Documents