Szilárd fázisú biokatalizátorok
SZFB.indd 1
2008.08.21. 12:01:28
SZFB.indd 2
2008.08.21. 12:01:29
Boross László – Sisak Csaba – Szajáni Béla
SZILÁRD FÁZISÚ BIOKATALIZÁTOROK Előállításuk, tulajdonságaik és gyakorlati alkalmazásuk
AKADÉMIAI KIADÓ, BUDAPEST
SZFB.indd 3
2008.08.21. 12:01:29
A kötet megjelenésének támogatói: Chinoin Zrt., Magyar Biokémiai Egyesület, Magyar Tudományos Akadémia, Pannon Egyetem
Lektorálta: Dr. Nyeste László ny. egyetemi tanár
ISBN 978 963 05 8577 4
Kiadja az Akadémiai Kiadó, az 1795-ben alapított Magyar Könyvkiadók és Könyvterjesztők Egyesülésének tagja 1117 Budapest, Prielle Kornélia u. 19. www.akademiaikiado.hu
Első magyar nyelvű kiadás: 2008 © Boross László, Sisak Csaba, Szajáni Béla, 2008 © Akadémiai Kiadó, 2008
Minden jog fenntartva, beleértve a sokszorosítás, a nyilvános előadás, a rádió- és televízióadás, valamint a fordítás jogát, az egyes fejezeteket illetően is.
Printed in Hungary
SZFB.indd 4
2008.08.21. 12:01:29
TARTALOM
ELŐSZÓ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .9 1. BEVEZETÉS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 2. TÖRTÉNETI ÁTTEKINTÉS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 3. SZILÁRD FÁZISÚ BIOKATALIZÁTOROK ELŐÁLLÍTÁSA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.1. Rögzítés fizikai módszerekkel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.1.1. Bezárás féligáteresztő hártyák közé . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.1.2. Bezárás gélek vagy szálak üregeibe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.1.3. Mikrokapszulázás, kapszulázás . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.1.3.1. Koacerváció . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.1.3.2. Határfelületi polimerizáció . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.1.3.3. Előgéloldás . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.1.3.4. Folyadékcseppképzés . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.1.3.5. Gyöngyök és kapszulák nagy léptékű termelése. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.1.4. Liposzómaképzés . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.1.5. Adszorpció nagy felületű hordozókon . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2. Rögzítés kémiai módszerekkel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2.1. Ionos rögzítés . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2.2. Kovalens kötések kialakítása . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2.3. Biokatalizátorok közötti intermolekuláris kovalens kötések . . . . . . . . . . . . . . . 3.2.4. Kémiai beépítés polimerek szerkezetébe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2.5. Fémkelátkomplexek . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.3. Hordozók szilárd fázisú biokatalizátorok előállításához . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.3.1. Természetes eredetű gélképzők . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.3.1.1. Alginátok . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.3.1.2. Karragenátok . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.3.1.3. Pektinek . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.3.1.4. Gellánmézga. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.3.1.5. Kitozán . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.3.1.6. Agar (agaróz) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.3.1.7. Dextrán . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.3.1.8. Fehérjealapú gélképzők . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.3.2. Szintetikusan előállított gélek . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.3.2.1. Poliakrilamid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
SZFB.indd 5
15 15 15 15 23 23 24 25 25 26 31 31 34 34 35 50 51 51 52 52 53 54 55 57 57 58 59 60 60 60
2008.08.21. 12:01:29
3.3.2.2. Poli(vinil-alkohol) (PVA) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.3.2.3. Egyéb bezáró közegek . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.3.3. Adszorbensek . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.3.3.1. Üveg . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.3.3.2. Cellulóz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.3.3.3. Poliuretán . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.3.3.4. Biospecifikus (affinitás) adszorbensek . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.3.4. Ioncserélők . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.3.4.1. Poliszacharid alapú ioncserélők . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.3.4.2. Polisztirol származékok . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.4. Az enzimek rögzítését befolyásoló tényezők . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.4.1. Az aktiváló reagens szerkezetének hatása . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.4.2. A reakcióelegy összetételének hatása . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.4.3. A reakcióelegy pH-jának hatása. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.4.4. A reakcióelegy ionerősségének hatása . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.4.5. A hordozó porozitásának hatása . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.4.6. A hordozó mátrix és a funkciós csoport közötti „kar” (spacer) hatása . . . . . . . . 3.5. A sejtek rögzítését befolyásoló tényezők . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.5.1. Gyökös polimerizáció hatása a sejtekre . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.5.2. Szerves oldószerek hatása a sejtek bezárására . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
63 63 63 63 64 64 65 65 65 65 65 65 67 69 71 71 73 73 73 74
4. SZILÁRD FÁZISÚ BIOKATALIZÁTOROK TULAJDONSÁGAI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76 4.1. Rögzített enzimek tulajdonságai . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76 4.1.1. Katalitikus tulajdonságok. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76 4.1.1.1. Katalitikus aktivitás . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77 4.1.1.2. A katalitikus aktivitás pH-függése . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83 4.1.1.3. A katalitikus aktivitás hőmérséklet-függése . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90 4.1.1.4. A szubsztrátkoncentráció hatása . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93 4.1.1.5. Specifitás . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102 4.1.2. Stabilitás . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104 4.1.2.1. Hőstabilitás . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105 4.1.2.2. pH-stabilitás . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114 4.1.2.3. Szerves oldószerekkel szembeni stabilitás . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117 4.1.2.4. Fehérjebontó enzimekkel szembeni stabilitás . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118 4.1.2.5. Karbamiddal és guanidin-hidrokloriddal szembeni ellenállás . . . . . . 118 4.1.2.6. Tárolási stabilitás . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119 4.1.2.7. Működési stabilitás . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123 4.2. Rögzített sejtek tulajdonságai . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124 4.2.1. A sejtek elhelyezkedése a hordozóban . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124 4.2.2. A rögzített sejtek morfológiai tulajdonságai . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 130 4.2.3. A rögzítés hatása a sejtek életképességére és anyagcseréjére . . . . . . . . . . . . . . 131 4.2.4. A fermentációs közeg pH-jának hatása a rögzített sejtekre . . . . . . . . . . . . . . . 133 4.2.5. A fermentációs elegy hőmérsékletének hatása a rögzített sejtekre . . . . . . . . . 136 4.2.6. Mérgek hatása a rögzített sejtekre . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137 4.2.7. A rögzítés hatása a plazmidstabilitásra . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 139 4.2.8. Rögzített sejtes rendszerek működési stabilitása . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 140
SZFB.indd 6
2008.08.21. 12:01:30
SZFB.indd 7
5. BIOREAKTOROK . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.1. A bioreaktorok általános szerkezeti és működési jellemzői . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.2. Bioreaktor típusok szilárd fázisú biokatalizátorral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.2.1. Szakaszos működésű mechanikusan kevert tankreaktor . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.2.2. Folyamatos átáramlású kevert tankreaktor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.2.3. Állóágyas oszlopreaktor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.2.4. Fluidizációs reaktor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.2.5. Cirkulációs reaktor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.2.6. Membránreaktorok . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.2.6.1. Közvetlen érintkezésű membránreaktorok . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.2.6.2. Diffúziós membránreaktorok . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.2.6.3. Többfázisú membránreaktorok . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.2.7. A különböző típusú bioreaktorok működésének összehasonlítása . . . . . . . . . 5.3. A bioreaktorok működését befolyásoló tényezők . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.3.1. A hordozó tulajdonságainak hatása . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.3.2. A biokatalizátor inaktiválódásának hatása a bioreaktor teljesítményére . . . . 5.3.3. A szubsztrátkoncentráció hatása. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.3.4. A közeg összetételének hatása . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.3.5. Az oxigénigény biztosítása . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.3.6. Külső és belső anyagátadási hatások . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.3.7. A hőmérséklet hatása . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.3.8. Reaktorméret . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.3.9. Nyomásesés . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.3.10. A visszakeveredés hatása . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.3.11. A működtetés módja . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.3.12. Integrált termékeltávolítás . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
141 141 144 144 145 147 150 153 157 160 161 162 165 166 166 167 168 171 171 173 175 176 178 178 179 180
6. SZILÁRD FÁZISÚ BIOKATALIZÁTOROK GYAKORLATI ALKALMAZÁSAI . . . . . . . . . . . 6.1. Szilárd fázisú biokatalizátorok ipari alkalmazása . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.1.1. Szilárd fázisú biokatalizátorok élelmiszeripari alkalmazása . . . . . . . . . . . . . . . 6.1.1.1. Tejipar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.1.1.2. Cukoripar, édesipar, cukrászat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.1.1.3. Keményítőfeldolgozás . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.1.1.3.1. Cukorszirupok előállítása . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.1.1.3.2. Ciklodextrinek előállítása . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.1.1.4. Tartósítóipar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.1.1.5. Húsipar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.1.1.6. Növényolajipar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.1.1.7. Erjedésiparok . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.1.1.7.1. Etanolgyártás . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.1.1.7.2. Sörgyártás . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.1.1.7.3. Borászat. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.1.1.7.4. Ecetgyártás . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.1.1.7.5. Egyéb erjedésipari termékek . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
182 182 184 184 188 189 189 198 201 205 205 206 206 220 224 226 228
2008.08.21. 12:01:30
6.1.2. Szilárd fázisú biokatalizátorok könnyűipari alkalmazása . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.1.2.1. Papíripar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.1.3. Szilárd fázisú biokatalizátorok gyógyszeripari alkalmazása . . . . . . . . . . . . . . . 6.1.3.1. Antibiotikumok előállítása . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.1.3.2. Szteroidátalakítások . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.1.3.3. Alkaloidok biotranszformációja . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.1.3.4. Monoklonális antitestek . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.1.3.5. Hormonok, biológiailag aktív anyagok . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.1.3.6. Egyéb gyógyszeripari termékek . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.1.4. Szilárd fázisú biokatalizátorok vegyipari alkalmazása . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.1.4.1. Finomkémiai termékek . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.1.4.1.1. Enzimek előállítása . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.1.4.1.2. Koenzimek előállítása . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.1.4.1.3. Aminosavak . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.1.4.1.3.1. Aminosavak előállítása rögzített sejtekkel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.1.4.1.3.2. Szintetikus aminosav-racemátok rezolválása rögzített enzimekkel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.1.4.1.4. Aminosav-származékok, peptidek . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.1.4.1.5. Szerves savak . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.1.4.1.6. Cukor-foszfátok . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.1.4.1.7. Mesterséges édesítőszerek és adalékanyagaik . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.1.4.1.8. Egyéb finomkémiai termékek . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.1.4.2. Vegyipari termékek . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.2. Szilárd fázisú biokatalizátorok környezetvédelmi alkalmazása. . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.2.1. Fenolos szennyvizek kezelése . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.2.2. Klórozott szénhidrogénekkel szennyezett vizek kezelése . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.2.3. Nehézfémionok eltávolítása szennyvizekből . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.2.4. Nitrifikáció-denitrifikáció rögzített sejtekkel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.2.5. Biofilterek . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.3. Szilárd fázisú biokatalizátorok analitikai alkalmazása . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.3.1. Szakaszos analitikai eljárások . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.3.2. Folyamatos rendszerek . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.3.3. Bioszenzorok . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.3.3.1. Bioszenzorok előállítása . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.3.3.2. Enzimelektródok . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.3.3.3. Rögzített sejtes bioszenzorok . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.4. Szilárd fázisú biokatalizátorok gyógyászati alkalmazása . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.4.1. Rögzített enzimek gyógyászati alkalmazása . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.4.2. Rögzített sejtek gyógyászati alkalmazása . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
230 230 230 230 239 245 247 250 251 252 252 252 258 261 261 270 276 279 285 286 288 289 290 290 292 297 300 301 302 303 304 309 310 316 320 320 320 321
7. IRODALOM. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 325
SZFB.indd 8
2008.08.21. 12:01:30
ELŐSZÓ
Napjaink egyik vezető tudományterülete a biotechnológia, amelyen belül kiemelt jelentőségű a biokatalizátorok (enzimek, sejtek, sejtalkotórészek) gyakorlati alkalmazása, az alkalmazott biokatalízis. Ahhoz, hogy a biokatalizátorokat egymást követő reakcióciklusokban ismételten felhasználhassuk, illetve hogy folyamatos eljárásokban alkalmazhassuk, nagy előnyökkel jár szilárd fázisú hordozón történő rögzítésük. Így jönnek létre az ún. szilárd fázisú biokatalizátorok. Ezekkel kapcsolatban – a széles gyakorlati alkalmazhatóságon túlmenően – jelentős elméleti kérdések is felmerülnek, amelyeknek megválaszolása gazdagíthatja a tudományt. Több évtizedes kutatásaink és a szilárd fázisú biokatalizátorok gyakorlati alkalmazása terén szerzett tapasztalataink alapján célul tűztük ki egy átfogó monográfia elkészítését. Reményeink szerint egy ilyen mű elősegítheti ennek a fontos alkalmazott kutatási területnek a színvonalas hazai művelését. További szempontunk volt, hogy a biológiai iparokban dolgozó szakemberek anyanyelvükön is hozzáférhessenek a korszerű ismeretekhez. Bemutatjuk a könyvben a szilárd fázisú biokatalizátorok előállításának legfontosabb módszereit, tulajdonságaikat, az alkalmazásukhoz nélkülözhetetlen, korszerű bioreaktorokat és gyakorlati felhasználásuk példáit. Természetesen az elmúlt mintegy négy évtizedben megjelent közlemények ezrei és a korlátozott terjedelem nem tették lehetővé a teljességre való törekvést. Könyvünk megjelentetése nem nélkülözhette a szponzori támogatást. Ezért köszönettel tartozunk a Magyar Tudományos Akadémia Kémiai és Biológia Osztályának, a Magyar Biokémiai Egyesületnek, a Pannon Egyetem Műszaki Kémiai Kutató Intézetének, a Veszprémi Universitas Alapítványnak, valamint a Chinoin Gyógyszer és Vegyészeti Termékek Gyára Zrt.-nek. Az ábrák jelentős részének közlését az Elsevier Media, Amsterdam, The Netherlands, a John Wiley & Sons Inc., New York, USA és az Academic Press, San Diego, USA kiadók engedélyezték. Hálánkat fejezzük ki a mű lektorának, Nyeste László ny. egyetemi tanárnak, a kémiai tudomány doktorának, aki nagy szakmai tudásával és tapasztalataival jelentősen segítette munkánkat. Köszönet illeti dr. Biró Eszter szerkesztőt rendkívüli gondosságáért és türelméért. Budapest–Veszprém, 2007. szeptember Boross László–Sisak Csaba–Szajáni Béla
SZFB.indd 9
2008.08.21. 12:01:30
SZFB.indd 10
2008.08.21. 12:01:30
1. BEVEZETÉS
A természet erőforrásait feltáró és hasznosító ipari forradalom után előtérbe kerültek a biológiai erőforrások. A rohamosan növekvő számú emberiség mennyiségi és minőségi igényeit csak ezek minél tökéletesebb kiaknázásával lehet biztosítani. A fosszilis energiahordozók fogyása, az élelmiszer-ellátás javítása, a hulladék- és szennyvízkezelés megoldása, a természeti környezet védelme újszerű megközelítést igényel. A biológiai tudományok és a mezőgazdasági-, illetve ipari technológiák alkotó összekapcsolásának eredményeképpen létrejött a biotechnológia. A biotechnológia egyik fontos területe a biokatalízis gyakorlati alkalmazhatóságának kutatása. Biokatalizátoroknak az élőlények katalitikus aktivitású fehérjéit, az enzimeket tekintjük, bár ma már tudjuk, hogy egyes nukleinsavak (a ribozimok), illetve egyes antitestek (az abzimek) is rendelkeznek katalitikus aktivitással. Az enzimek bizonyos tulajdonságai, mint az általuk igényelt enyhe reakciókörülmények és a nagyfokú fajlagosság (reakciófajlagosság és szubsztrátfajlagosság) a gyakorlati hasznosítás szempontjából rendkívüli előnyöket nyújtanak. A gyakorlatban sokszor magát az élő- vagy holt sejtet, illetve annak egyes enzimtartalmú alkotórészeit alkalmazzák biokatalizátorként, különösen olyan esetekben, amikor az átalakulás egynél több enzimet vagy a katalízishez viszonylag drága kofaktort igényel. Bár valamennyi élő szervezet termel enzimeket, gyakorlati, elsősorban ipari célokra a mikrobiális enzimek a legelterjedtebbek. A mikrobiális enzimek hatásuk helye szerint lehetnek extracellulárisak vagy intracellulárisak. Az extracelluláris enzimeket a sejtek a környezetükbe, a tápközegbe bocsátják ki, és hatásukat ott, vagyis a sejten kívül fejtik ki, majd hasítási termékeik aktív vagy passzív transzport révén jutnak a sejt belsejébe. Extracellulárisak általában a makromolekulákat bontó enzimek. Ilyenek a fehérjebontó (proteolitikus), illetve a keményítőbontó (amilolitikus) vagy a cellulózbontó (cellulotikus) enzimek. Az intracelluláris enzimek hatásukat a sejten belül fejtik ki. Az intracelluláris enzimeknél esetenként indokolt a teljes sejtek vagy a sejtalkotórészek (sejtszervecskék) alkalmazása a kivonás és az elválasztás bonyolultsága, illetve az izolált enzim instabilitása miatt. Mivel a biokatalizátorok natív állapotban gyakran nem elégítik ki a gyakorlati felhasználás által támasztott követelményeket, célszerű a módosításuk, illetve rögzítésük megfelelő módszerekkel. A rögzített (immobilizált) biokatalizátorok döntő többsége a kémiai reakciókban hasonló módon alkalmazható, mint a hagyományos katalizátorok. Ilyen értelemben használjuk a „szilárd fázisú biokatalizátorok” elnevezést. Figyelembe véve a különböző meghatározásokat (Chibata és mtsai, 1986; Kierstan és Coughlan, 1985; The Working Party on Immobilized Biocatalysts, 1983) a szilárd fázisú
SZFB.indd 11
2008.08.21. 12:01:30
biokatalizátorok olyan enzimek és mikrobiális (baktérium, alga, gomba), növényi- és állati sejtek vagy sejtalkotórészek, amelyek katalitikus aktivitásukat megtartva a tér bizonyos meghatározott részén fizikai vagy kémiai kötésekkel lokalizálva vannak, és amelyeket ismételten vagy folyamatos eljárásban lehet felhasználni. Az elmúlt mintegy négy évtizedben közlemények ezrei jelentek meg a szilárd fázisú biokatalizátorok előállításával, tulajdonságaival és gyakorlati alkalmazásával kapcsolatban. Ugyanakkor a tényleges gyakorlati, elsősorban az ipari felhasználásuk köre meglehetősen korlátozott, amelynek oka igen összetett. Könyvünk célja éppen az, hogy a szilárd fázisú biokatalizátorokkal kapcsolatos ismeretek összefoglalása révén elősegítsük szélesebb körű alkalmazásukat, és egyúttal felhívjuk a figyelmet az egyes fontosabb kutatási irányokra.
12
SZFB.indd 12
2008.08.21. 12:01:30
2. TÖRTÉNETI ÁTTEKINTÉS
Az első rögzített enzimet Nelson és Griffin állították elő 1916-ban, akik invertázt adszorbeáltattak aktív szénen, illetve aluminium-hidroxid-gélen úgy, hogy az enzim megőrizte katalitikus aktivitását. Az első szintetikusan előállított, vízoldhatatlan polimerhez kötött enzimeket Grubhofer és Schleith írták le 1953-ban. Diasztázt, pepszint, ribonukleázt és karboxipeptidázt rögzítettek diazotált poli(amino-sztirol)-on és így vízoldhatatlan, aktív enzim-polimer komplexeket kaptak. Az N-klóracetil-dl-fenil-alanin rögzített karboxipeptidázzal katalizált rezolválása kapcsán rámutattak a rögzített enzimek preparatív munkában való alkalmazásának előnyére: a termék könnyen elválasztható a rögzített enzimtől, amely ismételten felhasználható (Grubhofer és Schleith, 1954). A célirányos kutatás az 1960-as években indult meg. Ebből az időből kiemelendő Katchalski és munkatársainak a mikrokörnyezeti hatások megismerésére irányuló munkája (Goldstein és mtsai, 1964; Levin és mtsai, 1964). A rögzített enzimek ipari alkalmazása terén az első fontos eredmény Chibata és munkatársai nevéhez fűződik, akik aminoaciláz enzimet ionosan rögzítettek, és 1969-ben azt a Tanabe Seiyaku Co. Ltd.-nél, Oszakában (Japán) ipari méretben alkalmazták szintetikusan előállított dl-metionin optikai izomerjeinek szétválasztásánál (vö. Chibata és mtsai, 1972). K. Mosbach és R. Mosbach 1966-ban felhívták a figyelmet arra, hogy ha a szubsztrát és a termék a sejtfalon képes áthatolni, akkor a teljes sejt bezárásával megtakarítható a gyakran nehéz és munkaigényes enzimizolálás. Ennek példájaként a kormos zuzmó (Umbilicaria pustulata) sejtjeit térhálósított poliakrilamidba zárták be, és oszlopreaktorban orcinol és orcinol-monometil-éter előállítására használták. A rögzített sejtes rendszerek előállítása és gyakorlati felhasználása valójában nem újkeletű. Egyik legrégebbi példája a Schützenbach által 1823-ban ismertetett gyors ecetgyártási eljárás. Ennél perforált fenekű kádakat alkalmaztak, amelyeket bükkfaforgáccsal töltöttek meg. A faforgácson ecetsav baktériumokból álló, filmszerű réteget fejlesztettek ki. Ez a mikrobiális film a kádakon átcsörgedeztetett, hígított etanolt ecetsavvá oxidálta. A felülethez kötött mikroorganizmusok alkalmazása régóta fontos részét képezi egyes szennyvízkezelési eljárásoknak (csepegtetőtestes rendszerek). A korszerű rögzített sejtes eljárások kifejlesztése az 1970-es években indult meg. Az első ipari alkalmazás 1973-ban az l-aszparaginsav előállítása volt fumársavból rögzített Escherichia coli sejtekkel, amely szintén Chibata és munkacsoportjának eredménye volt. Ugyanezen munkacsoport 1974-ben megoldotta az l-almasav előállítását fumársavból rögzített Brevibacterium ammoniagenes sejtekkel (vö. Yamamoto és mtsai, 1976, 1977). 13
SZFB.indd 13
2008.08.21. 12:01:30
Az 1970-es évektől a figyelem elsősorban a rögzített élesztő- és baktériumsejtekkel történő etanolfermentáció irányába fordult. Japánban 1980-ban a Nemzetközi Kereskedelmi és Ipari Minisztérium (MITI) védnöksége alatt, 23 vállalat összefogásával jött létre a Research Association for Petroleum Alternatives Development (RAPAD). A RAPAD keretei között dolgozták ki a rögzített élesztősejtekkel történő, folyamatos etanolgyártást. A kísérleti üzemi gyártás 1982 áprilisában indult meg, 4 m3 reaktor-össztérfogattal. A kísérleti üzemben kalcium-alginát-gélbe zárt, megfelelően kiválasztott Saccharomyces cerevisiae sejteket alkalmaztak, fluidágyas reaktorban, nem sterilizált melaszt használva az erjesztéshez. 1983 áprilisában a Kyowa Hakko cég hofui üzemében két sorba kötött 10 m3-es reaktorral félüzemi berendezést építettek, amely 1983 májusában kezdett üzemelni (vö. Nagashima és mtsai, 1983, 1987). A mikrobák rögzítésénél szerzett tapasztalatokra támaszkodva növényi- és állati sejteket, illetve sejtszervecskéket is rögzítenek, de ezek gyakorlati alkalmazása gyakran nehezen megoldható problémákat vet fel. Az utóbbi két évtizedben előtérbe került a szilárd fázisú biokatalizátorokat alkalmazó folyamatos eljárások kivitelezésére alkalmas bioreaktorok fejlesztése, szabályozástechnikája, valamint a működésük során felmerülő anyag- és energiaátadási problémák kutatása.
14
SZFB.indd 14
2008.08.21. 12:01:30
