SZENZOROS-IMMUN INTERAKCIÓK SZEREPÉNEK VIZSGÁLATA ÍZÜLETI GYULLADÁS ÁLLATKÍSÉRLETES MODELLJEIBEN. Doktori (PhD) - értekezés. dr

SZENZOROS-IMMUN INTERAKCIÓK SZEREPÉNEK VIZSGÁLATA ÍZÜLETI GYULLADÁS ÁLLATKÍSÉRLETES MODELLJEIBEN

Doktori (PhD) - értekezés dr. Borbély Éva

Doktori Iskola vezetője, programvezető: Prof. Dr. Pintér Erika Témavezető: Prof. Dr. Helyes Zsuzsanna

Pécsi Tudományegyetem, Általános Orvostudományi Kar Farmakológiai és Farmakoterápiai Intézet

Pécs, 2015.

Tartalomjegyzék RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ....................................................................................... 4 ÁLTALÁNOS BEVEZETÉS, IRODALMI ÁTTEKINTÉS, KUTATÁSI KONCEPCIÓ ............................................................................................ 5 1. KRÓNIKUS ÍZÜLETI GYULLADÁS ELŐFORDULÁSA, KIALAKULÁSÁBAN SZEREPET JÁTSZÓ PATOMECHANIZMUSOK, JELENLEGI KEZELÉSI STRATÉGIÁK ............................... 5 2. KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG-VÉGZŐDÉSEK, NEUROGÉN GYULLADÁS ............... 9 3. PROTEÁZ-AKTIVÁLT RECEPTOROK ........................................................................... 13 4. TACHYKININEK, TACHYKININ RECEPTOROK ............................................................. 14 CÉLKITŰZÉSEK ......................................................................................................... 18 KÍSÉRLETI MODELLEK ÉS VIZSGÁLATI MÓDSZEREK ............................... 19 1. KÍSÉRLETI ÁLLATOK ................................................................................................ 19 2. KÍSÉRLETI MODELLEK ÉS VIZSGÁLATI PARADIGMÁK ............................................... 19 2.1. K/BxN szérum-transzfer artritisz ..................................................................... 19 2.2. PAR2 aktiváció által kiváltott ízületi gyulladás .............................................. 21 2.3. CFA-indukált artritisz ...................................................................................... 23 3. FARMAKOLÓGIAI MÓDSZEREK ................................................................................. 25 3.1. RTX-deszenzibilizáció..................................................................................... 25 3.2. PAR2 aktiváció ................................................................................................ 25 4. VIZSGÁLATI MÓDSZEREK ......................................................................................... 26 4.1. Mechanonociceptív küszöb mérése eszteziométerrel ...................................... 26 4.2. Mechanonociceptív küszöb mérése analgeziméterrel ...................................... 26 4.3. Spontán súlyeloszlás mérése incapacitance teszterrel ..................................... 27 4.4. Fájdalmas hőküszöb mérése emelkedő hőmérsékletű forró lapon (hot plate) . 27 4.5. Lábduzzadás mérése pletizmométerrel ............................................................ 28 4.6. Térdátmérő mérése mikrométerrel................................................................... 28 4.7. Ízületi gyulladás megítélése szemikvantitatív pontozással .............................. 28 4.8. Ízületi funkció megítélése (horizontal wire grid test) ...................................... 29 4.9. In vivo imaging ................................................................................................ 29 4.10. Szövettani vizsgálat ....................................................................................... 30 4.11. Gyulladásos citokinek koncentrációinak meghatározása .............................. 31 4.12. Etikai vonatkozások ....................................................................................... 31 EREDMÉNYEK ÉS MEGBESZÉLÉS ...................................................................... 32 1. A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG-VÉGZŐDÉSEK FONTOS SZABÁLYOZÓ SZEREPET JÁTSZANAK SZÉRUM-TRANSZFER ARTRITISZ EGÉRMODELLJÉBEN ................................ 32 1.1. Eredmények ..................................................................................................... 32 1.2. Összefoglalás, megbeszélés, következtetések ................................................. 43 2. A TRANZIENS RECEPTOR POTENCIÁL VANILLOID 1 SZEREPÉNEK VIZSGÁLATA PROTEÁZ-AKTIVÁLT RECEPTOR 2 ÁLTAL KIVÁLTOTT ÍZÜLETI GYULLADÁSBAN ÉS FÁJDALOMBAN ............................................................................................................. 48 2.1. Eredmények ..................................................................................................... 48 2.2 Összefoglalás, megbeszélés, következtetések .................................................. 54 3. TACHYKININEK ÉS TACHYKININ NK1 RECEPTOROK SZEREPÉNEK VIZSGÁLATA ADJUVÁNS-INDUKÁLT ARTRITISZ EGÉRMODELLJÉBEN ................................................. 58 3.1 Eredmények ...................................................................................................... 58 3.2. Összefoglalás, megbeszélés, következtetések ................................................. 64 2

ÚJ EREDMÉNYEK ÖSSZEFOGLALÁSA ÉS EGYSÉGES ÉRTELMEZÉSE ... 68 IRODALMI HIVATKOZÁSOK ................................................................................. 70 AZ ÉRTEKEZÉS ALAPJÁT KÉPEZŐ PUBLIKÁCIÓK ....................................... 88 EGYÉB EREDETI PUBLIKÁCIÓK.......................................................................... 89 IDÉZHETŐ ABSZTRAKTOK ................................................................................... 90 KONGRESSZUSI SZÓBELI ELŐADÁSOK JEGYZÉKE ..................................... 93 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS ...................................................................................... 96

3

RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE 12-HPETE: 12-hidroperoxi-eikozatetraénsav AEA: endokannabinoid N-arachidonoil-etanolamin CFA: komplett Freund adjuváns CGRP: kalcitonin gén-rokon peptid DMARD: disease-modifying antirheumatoid drug = betegség lefolyását módosító szer EKA/B/C/D: endokinin A/B/C/D ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay i.a.: intraartikuláris IL: interleukin i.p.: intraperitoneális i.pl.: intraplantáris HK-1: hemokinin-1 KO: knockout = génhiányos KRN: T sejt receptor transzgenikus egértörzs NADA: N-arachidonoil-dopamin NK1/2/3: tachykinin NK 1/2/3 receptor NKA/B: neurokinin A/B RA: reumatoid artritisz SP: P-anyag SRIF: somatotropine release inhibitory factor = szomatotropin felszabadulást gátló hormon RIA: radioimmunoassay ROI: Region of Interest = érdeklődésre számottartó terület TAC1/3/4: tachykinin 1/3/4 gén Th1/2: T helper 1/2 TNFα: tumor nekrózis faktor α TRPV1: Tranziens Receptor Potenciál Vanilloid 1 receptor

4

ÁLTALÁNOS BEVEZETÉS, IRODALMI ÁTTEKINTÉS, KUTATÁSI KONCEPCIÓ 1. Krónikus ízületi gyulladás előfordulása, kialakulásában szerepet játszó patomechanizmusok, jelenlegi kezelési stratégiák A reumatoid artritisz (RA) szerteágazó és súlyos klinikai képpel járó betegség, számos vonatkozásban még ma sem teljesen ismert kialakulása és pontos patomechanizmusa. Magyarországon összesen mintegy 70-80 ezer beteg (nők és férfiak aránya 3:1) érintettségével számolhatunk. Az RA egy autoimmun eredetű, krónikus progresszív sokízületi gyulladás (poliartritisz), mely elsősorban a kéz és a láb kis ízületeit érinti, és az

ízületek

destrukciója

és

deformitása

révén

a

betegek

fájdalmát,

mozgáskorlátozottságát és életminőségük jelentős romlását idézi elő (Jones és mtsai., 2003; Harris, 2005; Kourilovitch és mtsai., 2014). Gyakorisága, a nem kellőképp megoldott kezelés és a várható élettartamra gyakorolt kedvezőtlen hatásai miatt kiemelkedő jelentőségű népegészségügyi probléma. A betegség előidézésében a genetikai háttér mellett különböző infektív antigéneknek is szerepük lehet (Smith és Haynes, 2002), valamint számos egyéb tényezőt azonosítottak, melyek a betegséget súlyosbítani képesek (pl. dohányzás, hormonális eltérések, környezeti ártalmak). A betegség népegészségügyi jelentősége miatt világszerte igen intenzív kutatás folyik a molekuláris patomechanizmus felderítése érdekében. Egyre részletesebben ismert a kórállapot immunológiai háttere: a szinoviális membránon a T helper sejtek aktiválódása két irányba történik. A celluláris (T helper 1, Th1) vonalon a makrofágok/monociták jelentős mennyiségű proinflammatorikus citokint, közülük is elsősorban tumor nekrózis faktor α (TNFα)-t termelnek. A humorális (T-helper 2, Th2) vonalon az interleukin-4 (IL-4), -10, -13 közreműködésével a B limfociták, majd a plazmasejtek aktiválódnak. Jelen ismereteink szerint a reumatoid artritisz egyértelműen Th1 túlsúlyú, TNFα dominanciájú kórkép. A TNFα-nak és az általa beindított citokin kaszkádnak a különböző effektor molekulák (pl.: prosztanoidok, kemokinek, adhéziós molekulák stb.) révén kulcsszerepe van a krónikus ízületi destrukcióban (Venkatesha és mtsai., 2014). Fontos szerepet játszik még az interleukin-1β (IL-1β), amely hozzájárul az immunválasz patológiás módosításához és az oszteoklasztok aktivációjához (1., 2. ábra).

5

forrás: Gonzalez-Rey, E. és mtsai. (2007), Nat Rev Immunol.

1. ábra Az RA-s ízület szerkezete 1. Iniciáció

Lokális sérülés

2. Gyulladás

Autokrin aktiváció

Fertőzés

szinoviális membrán

Saját antigének bemutatása (citrullinált peptidek)

citokin hálózat (TNFα, IL-6, 23)

T sejt

keringő monociták aktiválódása

Csökkent TREG sejtszám

autoantigének módosítása

B sejt

APC aktiválás és következményként az adaptív immunrendszer sejtjeinekek aktiválása

természetes immunválasz aktiválása

T és B sejtek poliklonális aktivációja Gyulladásos citokinek termelődése Szinoviális invázió

adaptív immunválasz aktiválása

3. Önfenntartás

4. Destrukció

porc eredetű autoantigének

Porc lebomlás termékei

Proteoglikánok B sejt

membrán antigének szinoviális makrofág

környezeti faktorok proteázok, citokinek

porcsejt

B sejt

kollagenáz

Pannuszképződés

Oszteoklaszt aktiválás

kollagén

Oszteoklasztok autoantitestek általi aktiválása

Csont

forrás: Burmester és mtsai. (2014), Nat Rev Rheumatol.

2. ábra Az RA lefolyása és mechanizmusai

6

Az alapfolyamat a krónikus szinoviális proliferáció, mely az ún. pannuszképződéshez vezet, ráterjedve az ízületeket alkotó porcfelszínre és csontvégekre, azok károsodását, adott esetben pusztulását hozza létre. Az RA-hoz társuló porckárosodásban a termelt citokinek a porcsejtek katabolizmusát fokozzák, a metalloproteináz enzimek elsősorban a porcmátrix degradációját idézik elő. Az ismert immunológiai folyamatokon kívül fontos megemlíteni, hogy az ízületi tok és a szinovium gazdag szenzoros innervációt kap. Ezen idegvégződések a feszülést és a fájdalmat közvetítik, valamint a perifériás idegrendszer többi területéhez hasonlóan lokális és szisztémás efferens funkcióval is rendelkeznek. Számos irodalmi adat (Levine és mtsai., 1985; Ferrel és mtsai., 1996) igazolja ezen idegvégződések részvételét a krónikus gyulladásos folyamatban egyrészt az ereken, másrészt a gyulladásos sejteken kifejtett hatással. A betegség kezelésében ennek ellenére mindmáig nincs olyan szer, ami ezen idegvégződések működését befolyásolná.

Korai reumatoid állapot

Kifejlett reumatoid állapot

Szteroidok, DMARD

Szteroidok, DMARD monoterápia, DMARD kombinációban

DMARD monoterápia, DMARD kombinációban

T sejt kostimuláció gátlása

citokinek gátlása, T sejt kostimuláció gátlása, B sejt gátlás

citokinek gátlása, T sejt kostimuláció gátlása, B sejt gátlás

Prereumatoid állapot

Kovencionális terápia

Biológiai terápia

forrás: Scott (2012), Clin Pharmacol Ther.

3. ábra A reumatoid artritisz kezelésének alapelvei

7

Az RA gyógyszeres kezelésében jelenleg tüneti és a betegség progresszióját befolyásoló szereket különböztetünk meg, melyeket a tünetektől, súlyosságtól és a betegség előrehaladottságától függően különböző kombinációkban alkalmaznak (3. ábra). A tüneteket enyhítő szerek közé tartoznak a nem-szteroid illetve a szteroid típusú gyulladáscsökkentők, melyek alkalmazását súlyos mellékhatásaik korlátozzák. A betegség kezelésében helyet kapnak még a bázisterápiás szerek, ún. DMARD-ok, melyek a tünetek enyhítése mellett a strukturális károsodás progressziójának lassítására is szolgálnak, azonban ezen szerek is számos mellékhatással bírnak (1. táblázat).

DMARD

gyakori mellékhatások

(Hidroxi)klorokin

hasi fájdalom, kiütés, retinopátia, cornea károsodás

Szulfaszalazin

gasztrointesztinális erózió/fekély, folsavhiány, vérképzési zavarok, anafilaxiás reakció

Metotrexát

hányinger, gasztrointesztinális fekélyek, hepatotoxicitás

Leflunomid

hasmenés, hajhullás, májenzim-, vérnyomás emelkedés

Ciklofoszfamid

csontvelődepresszió, alopecia, hemorrágiás cisztitisz

D-penicillamin

anorexia, proteinuria, trombocitopénia

Arany (po., im.)

perifériás neuropátia, vesekárosodás, hepatitisz, vérképzési zavarok

Ciklosporin

nefrotoxicitás 1. táblázat DMARD terápia legfontosabb mellékhatásai

8

B sejt

Mezenhimális sejt T sejt

Plazmasejt

Oszteoklaszt prekurzur sejtek Oszteoklaszt

forrás: Schett és Gravallese (2012), Nat Rev Rheumatol.

4. ábra A biológiai terápia képviselői és hatásmechanizmusuk Ma a legfontosabb biológiai terápiás vonalat a celluláris (Th1) immunválaszban kulcsszerepet játszó TNFα blokkolása, valamint a humorális immunválaszban meghatározó B sejtek (CD20+) gátlása jelenti. Az anti-TNFα-terápia részben monoklonális ellenanyagok (infliximab, adalimumab), részben szolubilis TNFα receptor (etanercept) révén kivitelezhető (Nash és Florin, 2005) (4. ábra). Fokozott infekcióveszély, elsősorban lappangó tuberkulózis fellángolása lehet a potenciális mellékhatása ezen szereknek (Hochberg és mtsai., 2005), de nem zárható ki hosszabb alkalmazás után a daganatok keletkezésére való fokozott hajlam sem. Egyéb hátrányként említhető még, hogy a kezelés a többi szernél jelentősen magasabb költségeket jelent. 2. Kapszaicin-érzékeny érzőideg-végződések, neurogén gyulladás A primér szenzoros neuronok 40-50%-át kitevő kapszaicin-érzékeny, azaz Vanilloid Receptor 1 (VR1), vagy más néven Tranziens Receptor Potenciál Vanilloid 1 (TRPV1)et expresszáló populációjába tartoznak a C-polimodális nociceptorok és az A9

polimodális nociceptorok exteroceptív területeken, valamint a nyálkahártyák és viszcerális szervek kemonociceptorai az interoceptív területeken. A TRPV1 egy ligand-függő nem szelektív kation-csatorna, melynek aktiválódásakor a sejtbe Na+- és Ca2+-ionok áramlanak be, melyet K+-ion sejtből való kiáramlása követ. A Na+-ion főként az akciós potenciál generálásáért felelős, aminek következményeként kialakul a fájdalomérzet. A Ca2+-ion beáramlása pedig elsősorban a szenzoros neuropeptidek idegvégződésekből való felszabadulásához vezet. A receptor többféle módon, fizikai vagy kémiai ingerekkel aktiválható intra- és extracellulárisan is, ezen aktivátorok közé tartozik a fájdalmas, 43ºC feletti hőinger (Tominaga és mtsai., 1998), valamint a pH 6 alatti proton-koncentráció. Számos növényi eredetű vanilloid (pl.: reziniferatoxin, piperin, zingeron) képes nyitni az ioncsatornát, de léteznek a receptornak endogén ligandjai is (endokannabinoid N-arachidonoil-etanolamin: AEA, 12-hidroperoxi-eikozatetraénsav: 12-HPETE, N-arachidonoil-dopamin: NADA) (Yoo és mtsai., 2014). Továbbá ismert még számos olyan vegyület, melyek saját receptoraikon hatva érzékenyíteni képesek a TRPV1 receptorokat és ezáltal az idegvégződés

ingerelhetőségét

megnövelik.

Ezen

vegyületekről

(bradykininek,

prosztaglandinok, proteázok, szerotonin) tudjuk, hogy gyulladásos körülmények között igen magas koncentrációkat érnek el, és fontos mediátorai a proinflammatorikus folyamatoknak, így logikus az a következtetés, hogy az általuk kiváltott TRPV1 szenzibilizáció is részt vesz a gyulladás patomechanizmusában (5. ábra).

bradykininek

proteázok

prosztaglandinok

prokineticinek

fájdalmas hő

kapszaicin/RTX

protonok

szerotonin arachidonsav metabolitok

protein-kináz aktiváció

forrás: Szállási és mtsai. (2007), Nat Rev Drug Discov.

5. ábra A TRPV1 aktivátorai (fekete folytonos vonalak), érzékenyítő ágensei (fekete szaggatott vonalak), gátlói (piros vonalak), és a kísérleteinkben vizsgált vegyületek (piros keret) 10

A TRP receptorcsalád fontos tagja a TRPA1 receptor is, mely receptor altípus nagy százalékban koexpresszálódik a TRPV1-gyel, azonban jellemző aktivátorai (fahéjaldehid, allicin, acrolein) és érzékenyítői (bradykinin, hidrogén-szulfid) különböznek a TRPV1 receptorétól. Aktivációjakor, a TRPV1-hez hasonlóan fájdalomérzet és neuropeptid

felszabadulás

következik

be

(Banzawa

és

mtsai.,

2014).

6. ábra A kapszaicin-érzékeny idegvégződések hármas funkciója Napjainkban már kísérletekkel is alátámasztott és általánosan elfogadott tény, hogy a kapszaicin-érzékeny idegvégződések a klasszikus afferens funkciójukon kívül – melynek során a szenzoros idegvégződések a központi idegrendszer felé idegaktivitást közvetítenek, és létrejön a fájdalomérzet/nocicepció - lokális és szisztémás efferens funkciókkal is rendelkeznek. Antigén, vagy nem-immun gyulladásos provokáció hatására történő aktiváció következtében gyulladás- illetve fájdalomkeltő hatású szenzoros neuropeptidek, tachykininek (pl. P-anyag) és kalcitonin gén-rokon peptid (CGRP) szabadulnak fel. A CGRP artériás vazodilatáció előidézésével megnöveli a helyi vérátáramlást az innervációs területen, míg a P-anyag (SP) és a neurokinin A (NKA)

plazmaprotein

extravazációt

okoz

a

megnövekedett

mikrovaszkuláris 11

permeábilitásnak

és

a

gyulladásos

sejtek

(leukocita,

hízósejt,

makrofág)

akkumulációjának köszönhetően. Ezt a folyamatot nevezzük neurogén gyulladásnak, amely tehát az érző idegvégződések lokális efferens működésének következménye (Jancsó és mtsai., 1967; Holzer, 1988; Helyes és mtsai., 2003) (6. ábra). A neurogén gyulladás jelentős szerepet tölt be számos betegség patomechanizmusában, ilyenek a reumatoid artritisz, asztma, allergiás rinitisz, konjunktivitisz és dermatitisz, ekcéma, migrén vagy a gyulladásos bélbetegségek (Pintér és mtsai., 2014). Ugyanezen idegvégződésekből felszabaduló szomatosztatin és ópioid peptidek, melyek a vérárammal a test távolabbi részeire is eljuthatnak, gyulladáscsökkentő és fájdalomcsillapító hatással rendelkeznek (Szolcsányi, 1998a, b). A szomatosztatin (somatotropine release inhibitory factor, SRIF) 14 illetve 28 aminosavból álló ciklikus peptid formában fordul elő, befolyásolja számos sejttípus működését, közöttük vaszkuláris simaizom és endotél sejteket, gyulladásos és immunsejteket, fibroblasztokat vagy neuronokat. Élettani hatásai közé tartozik többek között a növekedési hormon, hasnyálmirigy enzimek vagy a kalcitonin felszabadulásának gátlása, az értágulat és hízósejt degranuláció, valamint a citokin felszabadulás és sejtproliferáció gátlása. Fontos kiemelni a neuronális transzmisszióban betöltött gátló szerepét. Ezen hatásait saját Gi-proteinhez kapcsolt receptorain keresztül fejti ki (sst1-sst5). A receptorokat két csoportba osztják a szomatosztatin szintetikus analóg iránti affinitásuk szerint. Az SRIF1 csoportba tartoznak az sst2, sst3 és sst5 receptorok, melyek főként az endokrin hatásért felelősek. Az SRIF2 csoport tagjai az sst1 és sst4 receptorok. A fájdalomcsillapító és gyulladáscsökkentő hatás a SRIF2 csoporthoz, vagyis az sst 1 és sst4 receptorokhoz köthető (Pintér és mtsai., 2006). Az ízületi tok és a szinovium is gazdagon innervált kapszaicin-érzékeny érzőidegvégződésekkel. A rajtuk található TRPV1 és TRPA1 aktiválásának köszönhetően felszabaduló gyulladás- és fájdalomkeltő, valamint gyulladásgátló és fájdalomcsillapító mediátorok szerepe megkérdőjelezhetetlen a betegségben, ugyanis RA-ban szenvedő betegek szérumában illetve szinoviális folyadékában kimutatható volt a megnövekedett proinflammatorikus, valamint a lecsökkent antiinflammatorikus neuropeptid mennyiség (Anichini és mtsai., 1997; Larsson és mtsai., 1991; Denko és Malemud, 2004). Bár az utóbbi évek intenzív kutatásainak köszönhetően, egyre növekszik tudásunk a reumatoid artritisz

patomechanizmusával

kapcsolatban,

a

kapszaicin-érzékeny

érzőideg-

végződések és neuro-immun interakciók szabályozó szerepe a mai napig nem teljesen tisztázott (Levine és mtsai., 2006; Pongratz és Straub, 2010; Meinel és mtsai., 2013; Stangelberg és mtsai., 2014). 12

3. Proteáz-aktivált receptorok trombin

gátlók

A

proteáz-aktivált

receptorok

(PAR)

családja 4 tagból áll: 3

tripszin

receptor

trombin

kötésére

alkalmas

(PAR1,

PAR3

PAR4)

és

és főleg

koagulációs folyamatokban vesznek részt, míg a trombin

tripszin/hízósejt triptáz főként a PAR2-höz képes kötődni és rajta keresztül

forrás: Noorbakhsh és mtsai. (2003), Nat Rev Neurosci.

7. ábra PAR család és aktiválásuk PN1: proteáz nexin-1, AT3: antitrombin 3

hatást

kiváltani. A PAR-ok a heptahelikális

G-

proteinhez-kapcsolt

receptorokhoz tartoznak és proteolítikus hasítás útján aktiválódnak, melyet számos proteáz képes kiváltani (Molino és mtsai., 1997; Macfarlane és mtsai., 2001; Hollenberg and Compton, 2002; 7. ábra). A PAR2 mind lokalizációjában mind pedig funkciójában elkülönül a család többi tagjától. Megtalálható az ízületben (Ferrell és mtsai., 2003; Boileau és mtsai., 2007; Nakano és mtsai., 2007), a bőr epiteliális és endotél sejtjein (Steinhoff és mtsai., 1999), a szív-érrendszerben, a gyomor-bél traktusban és a légzőrendszerben (D’Andrea és mtsai., 1998; Cocks és mtsai., 1999; Kawabata és mtsai., 2002), valamint a kapszaicin-érzékeny érzőideg-végződéseken is (Steinhoff és mtsai., 2000; Vergnolle, 2005). Ezen kívül ismert még, hogy a szerin proteázok fontos szerepet töltenek be számos gyulladásos (Schmelz és mtsai., 1999; Kanke és mtsai., 2005; McIntosh és mtsai., 2007) és fájdalom folyamatban (Vergnolle és mtsai., 2001a, b; Coelho és mtsai., 2003). Számos új eredmény arra utal, hogy a különböző szervek gyulladásos folyamataiban és a következményes fájdalom kialakulásában a PAR2 agonisták hatásaikat a TRPV1-en keresztül tudják kifejteni, mivel e folyamatok kapszaicin deszenzitizációval gátolhatók voltak (Su és mtsai., 2005; Gu és Lee, 2006; Shimizu és mtsai., 2007; Paszcuk és mtsai., 2008; 29. ábra). 13

TRPV1 antagonisták, illetve TRPV1 génhiányos állatok segítségével bizonyították ezen ioncsatornák szerepét a PAR2-kiváltott hőhiperalgézia (Amadesi és mtsai., 2004) és hólyagkontrakciók (Shimizu és mtsai., 2007) valamint primer mechanikai hiperalgézia (Dai és mtsai., 2004) kiváltásában. Mivel a PAR2 stimuláció egér térdízületben szinoviális hiperémiát és duzzadást képes létrehozni (Ferrell és mtsai., 2003; Busso és mtsai., 2007), feltételezhető, hogy ezen receptorok szerepet játszanak az ízületi gyulladásos megbetegedések patogenezisében. 4. Tachykininek, tachykinin receptorok Az emlős tachykinineket tradicionálisan a neurotranszmitterekhez soroljuk. A tachykinin családnak 2000-ig 3 jelentős képviselője volt: a P-anyag, a neurokinin A és a neurokinin B (NKB), melyek mind rövid, 10-11 aminosavból álló peptidek és mind rendelkeznek ugyanazon hidrofób C-terminális régióval, amely központi szerepet tölt be mindhárom tachykinin receptor aktivációjában. Két tachykinin prekurzor gént azonosítottak eredetileg: a preprotachykinin-A (TAC1) és a preprotachykinin-B (TAC3) géneket (Nawa és mtsai., 1983; Kotani és mtsai., 1986). A TAC1 génnek „alternatív splicing” révén 4 variánsa van (α, β, γ és δTAC) (Nawa és mtsai., 1985; Harmar és mtsai., 1990). Mind a 4 splice-variáns kódolja az SP-t, míg a β és γTAC1 felelős az NKA kódolásáért. 2000-ben klónozták a 3. emlős tachykinin gént (PPT-C/TAC4) egérből. Miután eredetileg a B limfocitákban történő expresszióját írták le, az általa kódolt neuropeptidet hemokinin-1 (HK-1)-nek nevezték el (Zhang és mtsai., 2000). Ezután a TAC4 gén cDNS szekvenciájának és génstruktúrájának meghatározása számos fajból (egér, patkány, ember) megtörtént (Page, 2004). Ezen kutatások számos fajspecifikus Panyag-szerű peptid jelenlétét igazolták, ez egérben és patkányban a HK-1, emberben pedig a humán HK-1 és az endokinin A, B, C és D (EKA-D) (Steinhoff és mtsai., 2014). Sok évvel ezelőtt a tachykinineket majdnem kizárólagosan neuronális eredetű peptideknek tekintették. Az SP és az NKA a központi idegrendszerben és a primer afferens szenzoros neuronokban található, ellátva ezáltal számos perifériás szövetet, míg az NKB a központi idegrendszerben és a gerincvelőben van jelen (Lundberg, 1996). Az SP és az NKA mind a gerincvelőben, mind a periférián az idegvégződésekből szabadul fel, és excitátoros transzmitterként működik (Otsuka és Yoshioka, 1993). Újabb bizonyítékok azonban azt támasztják alá, hogy a tachykinineknek számos egyéb neuronális és nem-neuronális forrásai léteznek a periférián. Tachykinin expressziót találtak kapszaicin-rezisztens vastag Aβ-rostokkal bíró neuronokban (Neumann és 14

mtsai., 1996), más típusú kapszaicin-rezisztens neuronokban, a légutakban (Carr és mtsai., 2002) és az enterális idegrendszerben (Holzer és Holzer-Petsche, 1997). Az SP megtalálható ezenkívül az emberi endotél sejtekben (Linnik és Moskowitz, 1989), és különböző típusú gyulladásos és immunsejtekben (Pascual és Bost, 1990; Lai és mtsai., 1998). Ezzel szemben a HK-1 és az endokininek elsősorban nem-neuronális sejtekben expresszálódnak, illetve génjeik centrális és perifériás expressziójának mintázata és mértéke is igen eltérő az SP génjétől (Page és mtsai., 2003, Duffy és mtsai., 2003). Számos korábbi kísérleti adat bizonyította, hogy az SP/NKA illetve az NK1 receptorok fontos mediátorai a neurogén gyulladásnak (Cao és mtsai., 1998; De Felipe és mtsai., 1998). Továbbá, részt vesznek a vérképzés szabályozásában (Rameshwar, 1997; Zhang és mtsai., 2000; Bandari és mtsai., 2003a,b) és expressziójuk emelkedett különböző gyulladásos és fertőző betegségekben (Kennedy és mtsai., 2003). Ezért joggal feltételezhető, hogy ezek a molekulák parakrin vagy endokrin módon hatnak és szerepet játszanak a neuro-immun modulációban. A tachykinin receptorok a membrán-kötött G-proteinhez kapcsolt receptorok családjába tartoznak. Jelenleg 3 különböző tachykinin receptort, tachykinin NK1, NK2, és NK3, sikerült elkülöníteni különböző fajokban. A 3 tachykinin receptor különböző szelektivitással bír az endogén tachykininek iránt. Az SP, az NKA és az NKB is teljes agonista mindhárom receptoron, bár a receptorok eltérő erősséggel kötik a különböző tachykinineket – az SP legnagyobb affinitással az NK1 receptorhoz kötődik, az NKA leginkább az NK2 receptorhoz kapcsolódik, míg az NKB-nek fő receptora az NK3. Farmakológiai vizsgálatok kimutatták, hogy az egér és patkány HK-1, illetve az emberi EKA és EKB hatásaikat főként a P-anyaghoz hasonlóan, NK1 receptort preferáló agonistaként fejtik ki, bár teljes agonisták mind az NK2 mind az NK3 receptorokon. Feltételezhető, hogy az EKA és EKB lehet a perifériás tachykinin NK1 receptornak a fő ligandja, különösen a nem-innervált szövetekben (Morteau és mtsai., 2001; Page és mtsai., 2003) (8. ábra). A tachykinin receptorcsalád a közeljövőben újabb taggal bővülhet, mivel több olyan kísérleti eredmény látott napvilágot, amelyeket nem lehet a 3 jelenleg ismert tachykinin receptor jelenlétével magyarázni. Például, hogy az SP NK receptoroktól-független módon tudja aktiválni a hízósejteket (Lau és mtsai., 2001), illetve hogy a Tac4-kódolt EKC és D, mely peptidek a C-terminális 2 aminosavban különböznek a többi tachykinintől, nagyon enyhe affinitással bírnak mind a 3 eddig ismert NK receptor iránt (Page és mtsai., 2003; Page, 2005). 15

Receptorok

Preprotachykinin gének és a kódolt peptidek

NK1

PPT-A/ Tac1 SP

NK2

NKA

PPT-B/ Tac3 NKB

NK3

PPT-C/ Tac4 HK-1

HK

8. ábra TAC gének a kódolt tachykininekkel és azok receptorai (a nyilak a peptidek legnagyobb affinitással való kötődését mutatják)

Ízületi gyulladásos kórképekben való vizsgálatukat indokolja, hogy a kapszaicinérzékeny érzőideg-végződésekben található gyulladáskeltő neuropeptidek jelentős részét a tachykininek teszik ki. Ezen idegvégződések aktivációjakor felszabaduló, Tac1 gén-kódolt SP és NKA illetve NK receptoraik gyulladásos sejteket aktiváló, értágító és fájdalomkeltő funkciójára vonatkozóan számtalan irodalmi adat áll rendelkezésünkre (Schaible és mtsai., 2010; Graham és mtsai., 2004; Longmore és mtsai., 1997; Pernow, 1983), valamint szerepüket több gyulladásos kórképben is igazolták (Helyes és mtsai., 2010; Weinstock., 2014). Emellett az utóbbi időben több adat is bizonyítja a Tac1 gén nem-neurális

expresszióját

(gyulladásos

sejtekben,

kondrocitákban,

epiteliális

sejtekben), mely jelenség szintén hozzájárulhat a különböző típusú gyulladások elindításához és súlyosbításához (Stewart és mtsai., 2008; Millward-Sadler és mtsai., 2003; Howard és mtsai., 2008; Ho és mtsai., 1997). Artritiszben betöltött szerepüket ezenkívül alátámasztja az a tény is, hogy RA-ban szenvedő betegek szérum és szinoviális mintáiban (Anichini és mtsai., 1997; Larsson és mtsai., 1991) illetve artritisz állatmodelljeiben (Bileviciute és mtsai., 1993) is emelkedett SP-szerű immunreaktivitást mutattak ki. Ezzel megegyezően, korábbi kísérleteinkben azt találtuk, hogy CFA-indukált artritiszben a TRPV1 génhiányos 16

egerekben a gyulladás és a fájdalom is kisebb mértékű volt (Szabó és mtsai., 2005), ami arra utal, hogy az idegvégződésekből felszabaduló gyulladáskeltő neuropeptidek fontos szerepet játszanak ebben a modellben. A fent említett, jól körülírt és részletesen tanulmányozott hatások ismeretében a tachykinin kutatás és az arra épülő gyógyszerfejlesztés 15-20 éve élte virágkorát. Az SP hatását kivédő NK1 antagonisták állatkísérletekben igen jó hatékonyságú gyulladás-, és fájdalomcsökkentő vegyületeknek bizonyultak, de a klinikai vizsgálatok során nem váltották be a hozzájuk fűzött reményeket (Hill, 2000; Urban és Fox, 2000). Ennek oka azóta is ismeretlen. A tachykinin kutatásnak azonban néhány éve új lendületet adott a Tac4 gén és az általa kódolt HK-1 és endokininek felfedezése. Bár egyre növekvő mennyiségű információval rendelkezünk ezen peptidek lokalizációjára vonatkozóan (központi idegrendszer, gyulladásos sejtek -B és T limfociták, makrofágok, dendritikus sejtek (Zhang és mtsai., 2000; Metwali és mtsai., 2004; Nelson és Bost, 2004), azonban az ízületekben való expresszióra egyáltalán nem áll rendelkezésre irodalmi adat. Mindezek, valamint a jelentős NK1 receptor-preferencia alapján joggal feltételezhetjük, hogy a Tac4-kódolt tachykininek gyulladásos folyamatokban és a neuro-immun interakciókban fontos szerepet töltenek be.

17

CÉLKITŰZÉSEK A reumatoid artritisz terápiájában nem szerepel olyan gyógyszer, amely gátolni tudná a betegség neurogén gyulladásos komponensét. Kísérleteinkkel ízületi gyulladás állatkísérletes modelljeiben igyekeztünk a neurogén gyulladás és a neuro-immun interakciók szerepét feltárni, kulcsmechanizmusokat, célmolekulákat azonosítani, és ezzel olyan új hatásmechanizmusú gyógyszerek kifejlesztését megalapozni, amelyek hatékonyak lehetnek a kezelésben és emellett kevesebb mellékhatással bírnak. Munkám általános célkitűzései ezért a következők voltak: I.

A kapszaicin-érzékeny érzőideg végződések szerepének komplex vizsgálata az eddig kizárólag immun-mediált patomechanizmusúnak ismert egér szérumtranszfer artritisz modellben

II.

A TRPV1 receptorok részvételének vizsgálata a PAR2-indukált artritisz mechanizmusmodelljeiben

III.

A tachykininek és receptoraik szerepének vizsgálata adjuváns-indukált krónikus artritisz modellben

18

KÍSÉRLETI MODELLEK ÉS VIZSGÁLATI MÓDSZEREK 1. Kísérleti állatok Kísérleteinkben 20-25 g súlyú, azonos korú hím és nőstény C57BL/6J törzshöz tartozó (vad típusú, WT) egereken (Jackson Laboratories, Egyesült Államok), valamint 250300 g súlyú hím Wistar patkányokon végeztük. PAR2 és CFA-indukált artritisz modellekben a kontrollként használt C57Bl/6J egerekkel azonos korú Trpv1 génhiányos (Trpv1-/-; Jackson Laboratories, Egyesült Államok), illetve Tac1 (Tac1-/-), Tac4 (Tac4-/-) és NK1 receptor génhiányos (Tacr1-/-) illetve kettős génhiányos (Tac1-/-/Tac4-/-) megfelelőit használtuk. Ezen egereket Prof. John Quinn (Liverpool, Zimmer és mtsai, 1998) és Alexandra Berger (Toronto, Berger és mtsai., 2010) bocsátotta rendelkezésünkre, munkacsoportunkkal való kollaboráció keretein belül. Az állatok tenyésztése és tartása minden esetben a PTE ÁOK Farmakológiai és Farmakoterápiai Intézetének Állatházában történt 24-25°C-on, normál élelemmel és vízzel korlátlanul ellátva. 2. Kísérleti modellek és vizsgálati paradigmák 2.1. K/BxN szérum-transzfer artritisz A poliartritiszt KRN és NOD egerek artritisz tüneteit mutató leszármazottaitól gyűjtött szérum (K/BxN) beadásával váltottuk ki, míg a kontroll állatok a nem-artritiszes alomtestvérektől gyűjtött szérumot (BxN) kaptak. A K/BxN (pozitív) szérum tartalmazza az anti-GPI IgG antitestet. Az anti-GPI IgG egy anti-GPI B-sejtek által termelt glükóz-6-foszfát izomeráz autoantigén ellen termelt ellenanyag, melyről ismert, hogy az állatoknak beadva immunartritiszt idéz elő (9. ábra). A BxN (negatív) szérum ezen antitesttől mentes, de minden egyéb tekintetben megegyezik a K/BxN szérummal. A K/BxN modell az emberi betegség több tünetét is mutatja: fájdalom, mind a 4 végtagra kiterjedő disztális kisízületi duzzadás, ízületi funkcióvesztés. Molekuláris szinten fontos szerephez jutnak a neutrofil granulociták, makrofágok és a komplement rendszer tagjai mind a folyamat elindításában, mind pedig annak fenntartásában (Kouskoff és mtsai., 1996; Korganow és mtsai., 1999; Fukushima és mtsai., 2010). Antitestek bevitelével kiváltott artritisz modell lévén, kiválóan alkalmas a gyulladásért felelős immunológiai résztvevők azonosítására (Németh és mtsai., 2010; HickmanBrecks és mtsai., 2011), azonban az idegvégződések szerepét még soha nem vizsgálták (2. táblázat). 19

T sejt

9. ábra A K/BxN modell molekuláris mechanizmusa (TCR: T sejt receptor, GPI: glükóz-6-foszfát izomeráz, APC: antigén prezentáló sejt)

Anti-GPI antitestek RNáz

APC

Plazmasejt B sejt

forrás: Ditzel (2004), Trends Mol Med.

Az artritogén vagy kontroll szérumot (300-300 µl) i.p. adtuk a 0. és 3. napon. A lábtérfogatot pletizmométerrel, az érintési érzékenységet eszteziométerrel, a fájdalmas hőköszüböt emelkedő hőmérsékletű forró lapon mértük. A hidegtoleranciát 0°C-os vízfürdőben lábkihúzási latenciával, az ízületi funkciót kapaszkodási teszttel, az artritisz súlyosságát a súlyvesztés mértékével és szemikvantitatív pontozással vizsgáltuk két héten keresztül. A csontkárosodást microCT-vel, az ízületi mátrix metalloproteináz (MMP)-aktivitást fluoreszcens molekuláris tomográfiával, a mieloperoxidáz (MPO)aktivitást

Luminol

módszer

segítségével

mértük.

A

tibiotarzális

ízületekből

szemikvantitatív szövettani pontozást illetve radioimmunoassay (RIA) módszerrel szomatosztatin szint meghatározást végeztünk (10. ábra).

10. ábra K/BxN modell vizsgálati elrendezése Statisztikai módszerek: A hiperalgézia, ödéma, súlyvesztés és ízületi funkcióvesztés eredményeink esetén Bonferroni módosított posztteszttel kiegészített kétutas ANOVA-t; a klinikai súlyossági és a szövettani szemikvantitatív pontszámok esetén Dunn-féle posztteszttel kiegészített Kruskal-Wallis tesztet; míg a micro-CT-vel nyert eredmények esetén Dunett és Tukey poszttesztekkel kiegészített kétutas ANOVA-t alkalmaztunk. A biolumineszcens és 20

fluoreszcens képalkotás és a szomatosztatin koncentrációk mérésének eredményeit Student-féle t-teszttel értékeltük. Minden esetben a pozitív szérumot kapott, RTXelőkezelt vs. nem előkezelt csoportok összehasonlításakor a *p<0.05, **p<0.01 és ***p<0.001, illetve a pozitív vs. negatív szérumot kapott csoportok összehasonlításakor a ##

p<0,01 és

###

p<0,001 értékeket határoztuk meg szignifikánsnak. A negatív szérummal

kezelt állatok száma 4-5, a pozitív szérummal kezelteké 6-8 volt csoportonként. 2.2. PAR2 aktiváció által kiváltott ízületi gyulladás Az akut ízületi gyulladást PAR2 agonista térdízületbe illetve talpba történt beadásával váltottuk ki.

források: Cottrell és mtsai. (2003), Biochem Soc Trans.; Paus és mtsai. (2006), J Clin Invest.

11. ábra A PAR-2 indukált gyulladás mechanizmusa A PAR2 szerepe gyulladásos reakciók kiváltásában és fenntartásában ismert tény (Lindner és mtsai., 2000). A bőrben PAR2 agonista beadásának hatására gyulladásos változások jönnek létre (Seelinger és mtsai, 2003), melyeknek hátterében idegi mechanizmusok állnak – a folyamatot P-anyag és CGRP felszabadulás kíséri a kapszaicin-érzékeny, TRPV-1-et expresszáló idegelemekből (Steinhoff és mtsai., 2000; Coelho és mtsai., 2003). A beidegzett területen a CGRP felelős a jelentős értágulat létrejöttéért, valamint elősegíti az SP ödémaképző, leukocita kitapadást és plazma 21

extravazációt kiváltó hatását (11. ábra, 2. táblázat). A PAR2 aktiváció ízületekben betöltött szerepéről azonban igen kevés in vivo adat áll rendelkezésünkre (Russell and McDougall, 2009). Egerek esetében a mechanikai hiperalgéziát, patkányoknál a mechanikai allodíniát mértük eszteziométer segítségével a PAR2 agonista beadása után 6 órán keresztül, óránként. Patkányoknál a hiperalgézia meghatározására a Randall-Sellitto teszt szolgált. A fájdalom hatására kialakuló végtagok közötti spontán súlyeloszlásváltozás mértékét incapacitance teszterrel határoztuk meg, a lábduzzadás mértékét pletizmométerrel, míg a térdátmérő változásait mikrométerrel tudtuk detektálni. A kísérlet végén az eltávolított hátsó végtagok/térdízületek homogenizátumaiból a gyulladásos citokinek közül a TNFα és IL-1β koncentrációi kerültek meghatározásra ELISA módszerrel (12. ábra).

12. ábra PAR-2 agonista által kiváltott ízületi gyulladás modell vizsgálati elrendezése Statisztikai módszerek: A hiperalgézia, allodínia, spontán fájdalom és ödéma eredményeink értékelésénél Bonferroni módosított posztteszttel kiegészített kétutas ANOVA-t alkalmaztunk, míg a gyulladásos citokin-koncentrációk mérésének eredményeit Student-féle t-teszttel értékeltük. Patkányok esetében az aktív vs. inaktív peptiddel kezelt csoportok összehasonlításakor a *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, ill. az aktív peptiddel vs. aktív peptiddel + antagonistával kezelt csoportok összehasonlításakor a #p<0,05, ###

##

p<0,01,

p<0,001 értékeket határoztuk meg szignifikánsnak. Egerek esetében az aktív vs.

inaktív peptiddel kezelt WT csoportok összehasonlításakor a *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, az aktív peptiddel kezelt WT vs. TRPV1-/- csoportok összehasonlításakor a #

p<0,05,

##

p<0,01,

###

p<0,001, illetve az aktív vs. inaktív peptiddel kezelt TRPV1-/-

csoportok összehasonlításakor a

+

p<0,05,

++

p<0,01 értékeket határoztuk meg

szignifikánsnak. Az állatok száma 7-11 volt csoportonként.

22

2.3. CFA-indukált artritisz A reumatoid artritisz nemzetközileg elfogadott állatkísérletes modelljét alkalmaztuk (Hietala és mtsai., 2002). A krónikus ízületi gyulladást komplett Freund-adjuváns (CFA: complete Freund’s adjuvant; 1 mg/ml hővel elölt Mycobacterium tuberculosis paraffinolajos szuszpenziója) faroktőbe, valamint intraplantárisan történő adásával váltottuk ki az egerekben. A komplett adjuváns adásával a szervezet immunválaszkészsége stimulálható. A baktérium sejtfalában található muramil-dipeptid aktiválja a makrofágokat és a dendritikus sejteket, amely IL-12, IL-6, TNFα, IFN- fokozódó termeléséhez vezet. Ennek hatására poliklonális T limfociták aktiválódnak, elsősorban Th1 (CD4+) irányba differenciálódnak és limfokineket termelnek. Az adjuváns alkalmazásának helyén a sajtos granulóma képződésért a makrofágok fokozott mértékű antigén-feldolgozása felelős, a krónikus poliartritisz kialakulásában CD4+ T sejt klónok aktiválódása játszik szerepet (Joe és Wilder 1999; Billiau és Matthys 2001). Bár a CFAadás oldalán súlyosabb ízületi gyulladás alakul ki, az ellenoldalon is megfigyelhetők az artritisz jellemző tünetei (13. ábra, 2. táblázat).

kemokinek

CFA mikobaktériumok

Fibroblasztok, stróma sejtek

13. ábra A CFA modell molekuláris mechanizmusa (IFN-γ: interferongamma, MPC: mononukleáris sejt, DC: dendritikus sejt, NK: natural killer sejt)

NK sejt

forrás: Billiau és Matthys (2001), J Leukoc Biol.

A gyulladást CFA faroktőbe, valamint intraplantárisan történő adásával (50-50 μl) váltottuk ki az egerekben. A szisztémás hatás fokozása érdekében a faroktőbe történő CFA-adást a következő napon megismételtük, ezt a napot tekintettük a kísérlet első napjának (14. ábra). A mechanonociceptív küszöböket eszteziométerrel, a lábtérfogatot pedig pletizmométer segítségével mértük a kísérlet előtt, majd 21 napon keresztül a CFA-adás után. A kísérlet végén az állatok Na-pentobarbitallal (Nembutal, 100 mg/kg i.p.) történő túlaltatása után a tibiotarsalis ízületeket kimetszettük. Az így nyert

23

preparátumok egy részéből szövettani metszeteket készítettünk, másik részét citokinmeghatározás céljából feldolgoztuk (14. ábra).

14. ábra CFA modell vizsgálati elrendezése Statisztikai módszerek: A hiperalgézia és ödéma eredményeink értékelésénél Bonferroni módosított posztteszttel kiegészített kétutas ANOVA-t, míg a gyulladásos citokin-koncentrációk és szövettani szemikvantitatív pontszámok esetén Dunn-féle posztteszttel kiegészített Kruskal-Wallis tesztet alkalmaztunk. Minden esetben a génhiányos vs. WT csoportok összehasonlításakor a *p<0.05, **p<0.01 és ***p<0.001, illetve az intakt vs. CFAkezelt C57Bl/6 csoportok összehasonlításakor a

+++

p<0.001 értékeket határoztuk meg

szignifikánsnak. Az intakt állatok száma 4, a CFA-kezelteké 9-24 volt csoportonként.

Szérumtranszfer artritisz

PAR2indukált artritisz

CFA-indukált artritisz

lefolyás

krónikus

akut

krónikus

érintett ízületek száma

poliartritisz

monoartritisz

döntő mértékben monoartritisz

kiváltó antigén

G6PI

-

Hsp65

legfontosabb résztvevő sejttípusok

neutrofil granulociták, makrofágok IL-1, TNF (változó)

idegsejtek, hízósejtek

makrofágok, T és B sejtek

IL-1

TNF, IL-1, IL-6

legfontosabb résztvevő citokin(ek)

2. táblázat Kísérleti modelljeink főbb jellemzői

24

3. Farmakológiai módszerek 3.1. RTX-deszenzibilizáció Az

egerek

egy

csoportjának

a

kísérlet

előtt

resiniferatoxin (RTX,

Sigma-

Aldrich) emelkedő dózisait (30, 70, 100 μg/kg s.c. 3 egymást forrás: Anand és Bley (2011), Br J Anaesth.

15. ábra Az RTX-előkezelés molekuláris hatása

követő

napon) adtuk, ezzel a

kapszaicin-

érzékeny érzőideg-

végződéseket testszerte működésképtelenné tettük (deszenzibilizáció; 15. ábra) (Szolcsányi, 1990). 14 nappal később a deszenzibilizáció sikerességét kapszaicin (50 μl, 0.1%) szembe cseppentésével ellenőriztük (wiping test) (Helyes és mtsai., 2004). 3.2. PAR2 aktiváció Az akut ízületi gyulladást PAR2-aktiváló peptid, SLIGRL-NH2 (Sigma-Aldrich, Magyarország) segítségével váltottuk ki, melyet egerek talpába (s.c injekció formájában, 100 µg/50 µl), illetve egerek (100 µg/50 µl) és patkányok (100 µg/100 µl) térdízületébe adtunk izoflurán anesztézia mellett. A kontroll csoport állatainak lábába/térdébe inaktív peptidet, LRGILS-NH2-t adtunk az aktív peptiddel megegyező koncentrációban és térfogatban. Patkányok egy csoportját szelektív TRPV1 antagonista, SB366791-gyel (50 µg/kg i.p.; Varga és mtsai., 2005) kezeltük elő 15 perccel az intraartikuláris SLIGRL-NH2 injekció, illetve az egyes mérések előtt, a TRPV1 receptorok szerepének vizsgálata érdekében.

25

4. Vizsgálati módszerek 4.1. Mechanonociceptív küszöb mérése eszteziométerrel A talp érintési érzékenységét Ugo Basile dinamikus plantáris eszteziométerrel (Olaszország) (16. ábra) mértük. Az egerek/patkányok szabadon mozoghattak egy alul rácsos plexiketrecben, amiben a kísérlet előtt kb. 15-20 percig kondícionáltuk őket. Ezután a tükörrel ellátott stimulátoregység segítségével az állatok talpának középső részét egy tompahegyű tűvel fokozódó erőhatásnak tettük ki. A maximális erőhatást egerek esetén 10 grammban, patkányok 16. ábra Ugo Basile eszteziométer

esetén 50 grammban határoztuk meg, az erőhatás növekedési dinamikáját 2 g/s értékre állítottuk be.

Amikor az állat elrántja a lábát, a számláló leáll, és a kijelzőről grammban leolvasható az erőhatás mértéke, ami megfelel a mechanonociceptív küszöbnek. A gyulladás hatására létrejövő küszöbcsökkenés mértékét, melyet az egerek vizsgálatánál hiperalgéziának (enyhe fájdalmat kiváltó inger hatására fokozódó fájdalomérzet), míg patkányok esetén allodíniának (alapvetően nem fájdalmas stimulus hatására kialakuló érzékenység fokozódás) nevezünk, a kísérlet előtt meghatározott kontrollértékekhez viszonyítva, százalékban adtuk meg (Bölcskei és mtsai., 2005). 4.2. Mechanonociceptív küszöb mérése analgeziméterrel Patkányok hátsó lábán a mechanikai hiperalgéziát Ugo Basile analgeziméter segítségével

(Olaszország)

határoztuk

meg

(Randall-Sellitto teszt) (17. ábra). Ebben az esetben egy tompahegyű plexikúppal fokozódó erőhatásnak tesszük ki az patkány lábhátát. Amikor az állat kirántja a lábát a kúp alól, a műszerről

leolvasható

a

mechanonociceptív

küszöb. A hiperalgéziát százalékban fejeztük ki a 17. ábra Ugo Basile analgeziméter

kontroll értékekhez viszonyítva (Sándor és mtsai., 2006).

26

4.3. Spontán súlyeloszlás mérése incapacitance teszterrel Egerek illetve patkányok hátsó lábaikra való spontán nehézkedés mértékét a Linton Instrumentation incapacitance teszter (Norfolk, Anglia) nevű készülékével állapítottuk meg (18. ábra). A készülékbe beépített két kis mérlegre állítottuk az állatokat,

melyek külön-külön

mérték a jobb és bal lábra eső terhelést grammban. A jobb lábak kezelése után, az erre eső százalékos terheléscsökkenést a következő egyenlet segítségével számoltuk ki: [jobb láb

18. ábra Linton Instrumentation Incapacitance teszter

terhelés/(jobb láb terhelés+bal láb terhelés)] x 100. Az így kapott értékeket ábrázoltuk a kiindulási értékekhez viszonyítva.

4.4. Fájdalmas hőküszöb mérése emelkedő hőmérsékletű forró lapon (hot plate) A talp fájdalmas hőküszöb értékét IITC Life Science emelkedő

hőmérsékletű

forró

lap

(increasing

temperature hot plate) (Woodland Hills, Egyesült Államok)

segítségével

fokozatosan,

előre

határoztuk

meghatározott

meg,

mely

dinamikával

növeli a fűthető lap hőmérsékletét (19. ábra). A vizsgált

állatok

egy

plexidobozban

szabadon

mozoghatnak, miközben a doboz alatt elhelyezkedő fém lapot melegítjük. A fájdalmas hőküszöb elérésekor

az

állatok

rázzák,

emelik

vagy

nyalogatják a fájdalmas végtagot. Ekkor a mérést 19. ábra IITC Life Sciences emelkedő hőmérsékletű forró lap

leállítjuk és a műszer kijelzőjéről leolvasható a fájdalom létrejöttéhez szükséges küszöbhőmérséklet 0

C-ban. A gyulladás hatására megváltozott hőküszöb

értékeket a kísérlet előtt felvett kontroll értékekhez viszonyítjuk, így megkapjuk a fájdalmas hőküszöb csökkenésének mértékét (Almási és mtsai., 2003).

27

4.5. Lábduzzadás mérése pletizmométerrel A lábtérfogatot Ugo Basile Plethysmometer (Olaszország) (20.

ábra)

segítségével

mértük,

amely

műszer

a

közlekedőedények elve alapján működik. A műszerhez tartozó, folyadékkal telt hengerbe merítjük az egerek hátsó lábát egy meghatározott jelig. A hengerhez csatlakozó szintén folyadékkal telt edényben ezáltal folyadéktérfogat-változás jön létre, melynek mértékét a benne található transzducer érzékeli. Így a láb térfogatát cm3-ben leolvashatjuk a digitális 20. ábra Ugo Basile pletizmométer

kijelzőről. A létrejött lábtérfogat változást, azaz ödémát, az artritisz kiváltása előtt mért kontrollértékekhez viszonyítva, százalékban adtuk meg (Helyes és mtsai., 2004).

4.6. Térdátmérő mérése mikrométerrel A

térdek

Mitutoyo

anteroposterior digitális

és

mediolaterális

mikrométer

(Japán)

átmérőit

segítségével

határoztuk meg (21. ábra). Az állatok térdét a műszer két kis karja közé illesztve a digitális kijelzőn leolvasható a térd átmérője

mm-ben.

A

gyulladás

hatására

kialakuló

térfogatnövekedést százalékosan ábrázoltuk a kiindulási 21. ábra Mitutoyo digitális mikrométer

értékekhez viszonyítva.

4.7. Ízületi gyulladás megítélése szemikvantitatív pontozással A mellső és hátsó lábakat is érintő gyulladás esetén a végtagokat az ödéma és a pirosság mértéke alapján szemikvantitatívan pontoztuk 0 és 10 pont között. 0-0,5 pont tartozott a legenyhébb, míg 10 pont a legsúlyosabb elváltozásokhoz (Jakus és mtsai., 2010).

28

4.8. Ízületi funkció megítélése (horizontal wire grid test) A

vizsgálat

során

az

állatok

ízületeinek

funkcióját monitorozzuk. A kísérleti állatok egy rácson lefelé lógva eltöltött idejét mérjük (22. ábra), maximum 30 másodpercig. Az ízületek funkcionális zavara esetén ez az idő jelentősen lerövidülhet. 22. ábra Grid teszt

A

vizsgálat

során

mért

eredményeket összehasonlítva a kísérlet előtti kontroll értékekkel a funkcióban bekövetkezett változás mértéke meghatározható (Botz és mtsai., 2014).

4.9. In vivo imaging Ezen vizsgálatok elvégzése nem saját, hanem Dr. Botz Bálint kollégám munkája. Elvük bemutatására a velük kapott eredmények értelmezhetősége céljából kerül sor.

4.9.1. In vivo mieloperoxidáz aktivitás mérés

A

A

luminol

ftálazindion) korrelációt

biolumineszcencia mutat

megfigyelhető

B

(5-Amino-2,3-dihidro-1,4az

neutrophil

atritisz

szoros során

mieloperoxidáz

aktivitással (Chen és mtsai., 2004; Gross és mtsai., 2009). A PBS-ben oldott Na-luminolt (Sigma-Aldrich,

Magyarország)

intraperitoneálisan alkalmaztuk 150 mg/kg 23. ábra MPO aktivitás (A) kontroll körülmények között és (B) artritiszes állatokban

dózisban, majd a biolumineszcencia mértékét a luminol beadását követően 10 perccel IVIS Lumina II (PerkinElmer, Waltham, Egyesült

Államok) készülékkel mértük (23. ábra). A bokák felett meghatározott területeken (Regions of Interests) a lumineszcencia mértékét teljes sugárzásként adtuk meg (total flux/s).

4.9.2. In vivo mátrix-metalloproteináz aktivitás mérés A matrix-metalloproteináz (MMP) aktivitás mérése MMPSense680 (PerkinElmer) festék segítségével történt 2 nmol/egér dózisban. Ez egy aktiválható fluoreszcens festék, mely az MMP-2, -3, -9 és -13 kimutatására alkalmas. A méréseket az FMT 2000 fluoreszcens molekuláris tomográf rendszer (PerkinElmer) segítségével végeztük el 24 29

órával a festék beadása után. A bokák területéről háromdimenziós rekonstrukciós felvételek készültek (24.

területek

B

A

ábra),

24. ábra MMP aktivitás (A) kontroll körülmények között és (B) artritiszes állatokban

és

felett

aktivitást

a

meghatározott

mérhető

pmol

MMP fluorofór

mértékegységgel adtuk meg.

4.9.3. A periartikuláris csontstruktúra in vivo vizsgálata micro-CT segítségével A tibiotarzális ízületet SkyScan 1176 in vivo micro-CT (Bruker, Kontich, Belgium) segítségével vizsgáltuk (voxel méret: 17.5 μm). Az artritisz hatására a csontstruktúrában bekövetkezett

változásokat

CT

Analyser®

software

használatával elemeztük (25. ábra). Egységes méretű ROI-kat alkalmaztunk a tibia és a fibula periartikularis régióiban illetve a tibiotarzális és tarzometatarzális ízületek felett. A csonttérfogatot (bone volume; BV) μm3-ben meghatároztuk és 25. ábra Bokaízület 3D rekonstrukciós felvéte

százalékos arányban ábrázoltuk a teljes ROI térfogathoz (total volume; TV) képest (BV/TV).

4.10. Szövettani vizsgálat A kísérletek végén, a túlaltatás után, a tibiotarsalis ízületeket kimetszettük. A mintákat fixáltuk - 8 órára 4%-os pufferolt formalinba helyeztük. Ezután következett a dekalcinálás 4°C-on, 8 órán keresztül, 7 V/V% AlCl3-ot, 5 V/V% hangyasavat, és 8,5 V/V% sósavat tartalmazó oldat segítségével (Schwab és mtsai., 1997). Amikor az ízületek kellően felpuhultak, Sörensen-féle foszfát-pufferben 8 órán keresztül mostuk, majd dehidráltuk a mintákat 8-8 óráig 4°C-on 10-15 V/V%-os szacharóz-oldatokban. Végül paraffinba ágyaztuk, mikrotómmal 5-7 μm-es szeletekre vágtuk és hematoxilineozinnal vagy safraninnal megfestettük (Helyes és mtsai., 2004). A metszeteken látható, gyulladás okozta elváltozásokat a kísérletektől független patológus értékelte előre meghatározott paraméterek alapján, melyek komplett Freundadjuvánssal kiváltott gyulladás esetén: -

a szinovium mononukleáris sejtes infiltrációja

-

a szinoviális sejtréteg hiperpláziája 30

-

a porcdestrukció mértéke

-

a csonterózió mértéke,

míg szérum-transzfer artritisz esetén: -

a szinovium mononukleáris sejtes infiltrációja

-

a szinoviális sejtréteg hiperpláziája

-

a fibroblaszt képződés és kollagén lerakódás mértéke

voltak. Minden paraméter esetén 0-3-ig terjedő skálán történt a pontozás, 0 pont tartozott a legenyhébb, míg 3 pont a legsúlyosabb elváltozásokhoz. A vizsgálat végén a pontszámokat összeadtuk, így az egyes metszetekhez, és ezáltal az egyes állatcsoportokhoz tartozó összetett artritisz pontszámot kaptuk meg (Weinberg és mtsai., 2003). 4.11. Gyulladásos citokinek koncentrációinak meghatározása A tibiotarsalis ízületeket –80oC-on tároltuk a vizsgálat megkezdéséig. A feldolgozást megelőzően a minták tömegét fagyottan megmértük, majd homogenizáló oldatba helyeztük őket. Az oldat 100:1 arányban tartalmazott RPMI 1640 tápoldatot (Biochrom Ltd., Berlin, Németország) és proteáz gátlót (fenil-metil-szulfonil-fluorid, PMSF, Sigma-Aldrich Kft.). Ezután késes homogenizátor (Kika Labortechnik, Németország) segítségével egyenként 3-3 percig 20500 fordulat/perc sebességgel homogenizáltuk. A homogenizátumokat 10 percig, 12500 fordulat/perc sebességgel 0oC-on centrifugáltuk (Janetzky K24), a felülúszókat -20 oC-on tároltuk. A gyulladásos citokinek koncentrációi ELISA módszerrel kerültek meghatározásra. Végül 450 nm-en optikai denzitásértékeket mértünk, majd egy standard sor segítségével számoltuk ki a koncentrációértékeket, pg/g nedves szövet egységben megadva. 4.12. Etikai vonatkozások Kísérleteink minden esetben megfelelnek az állatkísérletek végzéséről szóló 1998/XXVIII. számú kormányrendelet előírásainak, és igazodnak a fájdalom tanulmányozására létrehozott nemzetközi tanács javaslataihoz. A kísérleti eljárásokat a Pécsi Tudományegyetem állatkísérletekkel foglalkozó Etikai Bizottsága engedélyezte (engedélyszám: BA 02/2000–2/2012).

31

EREDMÉNYEK ÉS MEGBESZÉLÉS 1. A kapszaicin-érzékeny érzőideg-végződések fontos szabályozó szerepet játszanak szérum-transzfer artritisz egérmodelljében 1.1. Eredmények 1.1.1. A deszenzibilizáció súlyosbítja a lábduzzadás mértékét A pozitív (artritogén) szérumot kapott, nem előkezelt állatok esetén a pletizmométerrel mért lábtérfogat a 8. napra körülbelül 45%-os növekedést ért el hím és nőstény egekben egyaránt, míg a deszenzitizált csoport egyedei esetén mindkét nemben a lábtérfogat növekedése az 5. napra érte el a maximumát (90-95%), és a kísérlet során végig szignifikánsan magasabban maradt a nem előkezelt csoporthoz viszonyítva. A 12. napra mindkét pozitív szérummal kezelt csoportban visszatért a lábtérfogat a kontroll értékre (26. A, B ábra) A nem előkezelt, pozitív szérumot kapott csoport esetén a súlyosság megítélésére szolgáló pontszámok a 2. naptól szignifikáns emelkedést mutattak, majd a 8. napon érték el a maximumot (7 pont). Az előző módszerhez hasonlóan, a pontozásnál is az RTX-előkezelt állatokban nagyobb mértékű volt a lábduzzadás, a maximumot a hím állatoknál a 7., míg nőstény állatoknál a 8. napon érte el, ekkor a pontszám 9 pont volt. Így a kísérlet 1. hetében szignifikánsan nagyobb értékek tartoztak a deszenzibilizált csoport egyedeihez a nem előkezeltekhez viszonyítva. A 7. naptól mindkét csoportban csökkenni kezdett a duzzadás és a 13. napra minimálisra mérséklődött (27. A, B ábra).

32

A

Nem előkezelt + negatív szérum 110

RTX-előkezelt + negatív szérum RTX-előkezelt + pozitív szérum

Nem előkezelt + pozitív szérum

*** ***

100

Lábduzzadás (%)

90

** **

***

80 70 60 50 40

***

30 20 10 0 -10

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

napok a szérum beadása után

B 110 100

RTX-előkezelt + pozitív szérum

*** ***

***

90

Lábduzzadás (%)

RTX-előkezelt + negatív szérum

Nem előkezelt + negatív szérum Nem előkezelt + pozitív szérum

***

80 70 60

***

50 40

**

30 20 10 0 -10

1

2

3

4

5

6

7

8

9


10

11

12

26. ábra Szérum-indukált lábduzzadás (A) hím és (B) nőstény állatokban **p<0.01, ***p<0.001 RTX-előkezelt vs. nem előkezelt csoport, n=4-8/csoport

33

A

12

Nem előkezelt + negatív szérum




11

Artritisz súlyossági pontszám

10

***

9 8 7

***

6

***

*** ***

***

5 4 3 2 1 0

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13


B


12 11

Artritisz súlyossági pontszám

10 9

*** ***

8 7


*** ** ******

6 5

*

4 3 2 1 0

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13


27. ábra Szérum-indukált artritisz súlyossági pontszám (A) hím és (B) nőstény állatokban *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 RTX-előkezelt vs. nem előkezelt csoport, n=4-8/csoport

34

1.1.2. A deszenzibilizáció enyhíti a mechanikai hiperalgézia mértékét a késői fázisban, de nem befolyásolja a fájdalmas hőküszöb-változást A nem előkezelt csoport egyedeinél a pozitív szérum adása utáni 2. naptól kezdve szignifikáns csökkenés figyelhető meg a mechanonociceptív küszöbértékekben, mely a kísérlet végéig fennált (45%) mindkét nemben. A deszenzitizált állatok esetében a mechanonociceptív küszöbértékek az 8. napig hasonló tendenciával változtak, ám meglepő módon a 10. kísérleti naptól kezdve a hiperalgézia mértéke hím és nőstény állatokban is szignifikánsan kisebb volt (25%) a nem előkezeltekhez viszonyítva (28. A,

Mechanikai hiperalgézia (%)

A

10 5 0 -5 -10 -15 -20 -25 -30 -35 -40 -45 -50 -55 -60


B ábra).

10 5 0 -5 -10 -15 -20 -25 -30 -35 -40 -45 -50 -55 -60

B

napok a szérum beadása után 1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

*** * * Nem előkezelt + negatív szérum Nem előkezelt + pozitív szérum


napok a szérum adása után 1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

days

* ** * Nem előkezelt + negatív szérum




28. ábra Szérum-indukált mechanikai hiperalgézia (A) hím és (B) nőstény állatokban *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 RTX-előkezelt vs. nem előkezelt csoport, n=4-8/csoport

35

A fájdalmas hőküszöböt nem befolyásolta jelentősen az artritisz indukciója, azonban a hőküszöb értékek mindkét nemben szignifikánsan magasabbak (46-47°C) voltak az 1. és 5. nap között a deszenzibilizált csoportokban (negatív és pozitív szérummal kezeltekben egyaránt) a nem előkezelthez viszonyítva (44-45°C) (29. A, B ábra).

Fájdalmas hőküszöb (°C)

A

48


47

*

*

46


***

45 44 43 42

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

napok a szérum adása után

Fájdalmas hőküszöb (°C)

B

50 49





***

48

*

*

47 46 45 44 43 42

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11


29. ábra Szérum-indukált termális hiperalgézia (A) hím és (B) nőstény állatokban *p<0.05, ***p<0.001 RTX-előkezelt vs. nem előkezelt csoport, n=4-8/csoport

36

1.1.3. A deszenzibilizáció nincs hatással a súlyvesztés illetve az ízületi funkcióvesztés mértékére Az artritisz szisztémás következményeként testsúlycsökkenés volt megfigyelhető a 7. napig, amikor a csökkenés mértéke mindkét csoportban elérte a 15%-ot. A 7. naptól kezdve a testtömeg lassú gyarapodása volt tapasztalható, de a kísérlet végén sem érték el a kezdeti értéket (7-10%) (30. A, B ábra).

A

15





Súlyvesztés (%)

10 5 0 -5

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

-10 -15 -20


-25

B

15





Súlyvesztés (%)

10 5 0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

-5 -10 -15 -20


30. ábra Szérum-indukált súlyvesztés (A) hím és (B) nőstény állatokban n=4-8/csoport

37

A nem előkezelt csoport egyedei esetén a grid tesztben a rácson eltöltött idő a 7. napig folyamatosan csökkent, a 7. napon érte el a maximumot, ekkor a csökkenés mértéke megközelítette az 50%-t (14 sec), mely a 14. napra a visszatért a kiindulási értékekre. Az RTX-előkezelt állatok kapaszkodási képessége szintén a 7. napig csökkent, a kísérlet során a két csoport között nem mutatható ki eltérés sem a hím, sem a nőstény állatokban (31. A, B ábra). napok a szérum adása után

Rácson töltött idő (sec)

A 30 28 26 24 22 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0

1

2

3

4

5

6

7

8


Rácson töltött idő (sec)

10

11

12

13



B

9

napok a szérum adása után 30 28 26 24 22 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14





31. ábra Szérum-indukált ízületi funkcióvesztés (A) hím és (B) nőstény állatokban n=4-8/csoport

38

1.1.4. A deszenzibilizált állatokban magasabb a neutrofil-aktivitás az akut fázisban A Luminol módszer segítségével „in vivo” meghatározható volt a neutrofil sejtek által közvetített mieloperoxidáz (MPO)-aktivitás mértéke. Mindkét artritogén szérummal kezelt csoportban jelentős aktivitás-fokozódás volt megfigyelhető a bokaízületben, azonban ez az RTX-előkezelt állatokban szignifikánsan magasabb volt a korai fázisban (2. napon), azonban ez a különbség elhanyagolhatóvá vált a 6. napra (32. A ábra). 1.1.5. A deszenzibilizált állatokban magasabb a mátrix-metalloproteináz (MMP) aktivitás a korai fázisban Az MPO aktivitáshoz hasonlóan a korai fázisban (5. nap) az RTX-előkezelt állatokban szignifikánsan magasabb MMP-aktivitás értékeket mértünk a nem előkezeltekhez képest, ám később (8. nap) ez a különség már nem volt kimutatható (32. B ábra).

Total flux (p/s)

A

8.010 5

*** ###

Nem előkezelt RTX-előkezelt

6.010 5

### 4.010 5

###

### 2.010 5

0

B

45

Fluorofór (pmol)

40

Kontroll Nem előkezelt RTX-előkezelt

2. nap

6. nap

*

35 30 25 20 15 10 5 0

+

+

Kontroll

5. nap

8. nap

32. ábra Szérum-indukált (A) mieloperoxidáz- és (B) mátrix-metalloproteináz aktiviás

*p<0.05, ***p<0.001 RTX-előkezelt vs. nem előkezelt, ###p<0,001 pozitív vs. negatív szérummal kezelt csoport, +: detektálási határ alatt, n=6-8/csoport

39

1.1.6. A deszenzibilizáció befolyásolja az artritisz során kialakuló csontstruktúra változásokat A specifikus csontfelszín (BV/TV) egy származtatott paraméter, mely segítségével elemezhetjük a csontstruktúra változásait. A kezdeti értékek a nőstény állatokban alacsonyabbak voltak a hímekhez viszonyítva, illetve a deszenzitizált nőstény állatok értékei alacsonyabbak a nem előkezelt nőstényekhez viszonyítva. A nem előkezelt állatokban mérsékelten, míg az RTX-előkezelt nőstényekben jelentősen megemelkedik a BV/TV érték az artritisz következményeként. Ez a folyamat a tibiotarzális ízületekben, a tibia és fibula periartikuláris régióiban is megfigyelhető (33. A, B ábra).

A B V /T V ( % )

8

N e m e lő k e z e lt h ím

R T X -e lő k e z e lt h ím

N e m e lő k e z e lt n ő s té n y

R T X -e lő k e z e lt n ő s té n y

7

##

##

##

#*#*#

6

###

* 5 K o n t r o ll

B

12

7. nap

14. nap

N e m e lő k e z e lt h ím

R T X -e lő k e z e lt h ím

N e m e lő k e z e lt n ő s té n y

R T X -e lő k e z e lt n ő s té n y

B V /T V ( % )

11

10

9

##

8

*

*

7 K o n t r o ll

7. nap

14. nap

33. ábra Szérum-indukált csontstruktúra-változások az (A) boka és a (B) tibia területén *p<0.05, **p<0.01 RTX-előkezelt vs. nem előkezelt, p<0,01, ###p<0,001 pozitív vs. negatív szérummal kezelt csoport, n=6-8/csoport

##

40

1.1.7. Az RTX-előkezelés súlyosbítja az ízületi gyulladás szövettani elváltozásait A negatív szérummal kezelt ízületekben nem találtunk különbséget a nem előkezelt és RTX-előkezelt csoportok között (34. A, B ábra). A nem előkezelt állatokban mérsékelt fokú gyulladást (mononukleáris sejtes akkumuláció, szinoviális megvastagodás) és fibroblaszt képződéssel, valamint kollagén lerakódással járó folyamatok egyidejű jelenlétét figyelhettünk meg a pozitív szérummal kezelt állatokban (34. C, D ábra), amelyek összpontszáma 2 körüli érték volt. A deszenzitizált állatokban ez a pontérték szignifikánsan magasabbnak (3) adódott (34. E, F; 35. A, B ábra).

34. ábra (A, B) Normál ízületi sruktúra (C, D) Szérum-indukált szövettani elváltozások nem előkezelt és (E, F) RTX-előkezelt állatokban (indexben: fibroblaszt szaporulat) (ti: tibia, ta: tarsus, si: szinóvium) 41

A Összetett artritisz pontszám

5.0 4.5 4.0

3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5

Összetett artritisz pontszám

5.0 4.5

14. nap

Kontroll


*

###

4.0 3.5

##

3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0

Szomatosztatin szint (fmol/g nedves szövet)

C

### ##

3.5

0.0

B

*


80 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0

14. nap

Kontroll Nem előkezelt RTX-előkezelt

Kontroll

###

**

###

10. nap

35. ábra Szérum-indukált összetett szövettani artritisz pontszám (A) hím és (B) nőstény állatokban és (C) szomatosztatin-szint változások *p<0.05, **p<0.01 RTX-előkezelt vs. nem előkezelt, p<0,01, ###p<0,001 pozitív vs. negatív szérummal kezelt csoport, n=6-8/csoport

##

42

1.1.8. A tibiotarzális

ízületek

szomatosztatin

koncentrációja

alacsonyabb

deszenzibilizált állatokban Az ízületi gyulladás hatására a 10. napra jelentősen emelkedett a nem előkezelt állatokban az ízületek szomatosztatin koncentrációja (25,2 ± 1,5-ről 75,5 ± 3,1 fmol/mg nedves szövetre), míg az RTX-előkezelt állatokban ez az emelkedés nem volt ilyen jelentős (62,4 ± 2,6 fmol/mg nedves szövet). Így az RTX-előkezeltek értékei szignifikánsan kisebbnek bizonyultak a nem előkezeltekhez viszonyítva (35. C ábra). 1.2. Összefoglalás, megbeszélés, következtetések Kísérletsorozatunkkal elsőként bizonyítottuk, hogy a kapszaicin-érzékeny érzőidegvégződések fontos és összetett szabályozó szerephez jutnak a szérum-traszfer artritisz egérmodelljében. Ennek megfelelően ezen idegelemek működésképtelenné tétele számos szerteágazó hatásban nyilvánul meg: az artritisz gyulladásos paramétereinek (duzzadás, neurtofil- és MMP-aktivitás) súlyosbításában az akut fázisban, azonban a mechanikai fájdalom enyhítésében a krónikus fázisban. (3. táblázat)

Artritisz paraméterei Lábduzzadás Artritisz súlyossági pontszám Neutrofil aktivitás Mátrix-metalloproteináz aktivitás Patológiás csontképződés (nőstényekben) Összetett szövettani pontszám Mechanikai hiperalgézia Ízületi szomatosztatin szint Hőhiperalgézia Ízületi funkció Súlyvesztés

RTX-előkezelés hatása

↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↓ ↓ -

3. táblázat RTX-kezelés hatása a szérum-transzfer artritisz paramétereire 43

Jelen eredmények nagyrészt megegyeznek a korábbi kísérleteinkben megfigyeltekkel. A komplett Freund-adjuvánssal (CFA) kiváltott ízületi gyulladás során patkányokban a deszenzibilizáció hatására jelentősen növekedett az ödéma mértéke, akárcsak a mostani kísérleti elrendezésben (Helyes és mtsai., 2004). Az is megállapítható, hogy a négy végtag szemikvantitatív pontozása jól korrelál a hátsó végtagok térfogatmérésének eredményével, bár némi eltérés tapasztalható, így a két módszer együttes használata teljesebb képet adhat a gyulladás időbeli lefutásáról. Korábbi kísérletünkben azt figyeltük meg, hogy CFA-val kiváltott artritisz modellben a TRPV1 génhiányos egerekben kisebb duzzadás alakul ki vad típusú társaikhoz képest (Szabó és mtsai., 2005). Ez a különbség jelenlegi eredményeinkhez képest könnyen magyarázható azzal a ténnyel, hogy a kapszaicin-szenzitív afferensek a TRPV1-en kívül még számos egyéb receptort és ioncsatornát expresszálnak a felszínükön, így a deszenzitizáció ezek működését is befolyásolja, nem is beszélve a végződés neuropeptid-tartalmáról és kibocsátásáról. Mivel a korábbi kísérletek során nem volt megfelelő eszköztárunk a megfigyelések hátterében álló mechanizmusok felderítésére, így a jelenleg rendelkezésre álló, in vivo képalkotó eszközeink segítségével kívántuk kideríteni az RTX-előkezelés kiváltotta, súlyosabb gyulladás és patológiás csontújdonképződés okát. Bár a funkcionális vizsgálatok során nem találtunk jelentős különbséget a hím és nőstény állatok között, azonban az önkontrollos CT felvételek elemzése során kimutatható volt, hogy a vad típusú nőstény egerek csonttömege kezdetben (artritisz kiváltása előtt) alacsonyabb volt az azonos korú hímekhez viszonyítva. Ezt a megfigyelést, illetve az általunk is mért BV/TV értéket, más kutatócsoportok is hasonlóan alacsonynak találták nőstény állatokban a hímekhez viszonyítva (Cai és mtsai., 2014), valamint azt is leírták, hogy ez az érték a nőkben alacsonyabbnak adódott humán radius vizsgálatakor, mint azonos korú férfiakban (Vanderschueren és mtsai., 2014). Továbbá, a nőstény állatokban az RTX előkezelés hatására szignifikánsan kisebb volt a kezdeti csonttömeg a nem előkezeltekhez

viszonyítva,

valamint

ebben

a

csoportban

a

patológiás

csontújdonképződés súlyosabb mértékű volt a nem előkezeltekhez képest, mely tendencia a hímekben nem volt megfigyelhető. Ezt a jelenséget magyarázhatja az androgének esetleges védő funkciója, különösen gyulladásos körülmények között, hiszen számos irodalmi adat igazolja, hogy a nemi hormonok fontos szerepet töltenek be az oszteoklaszt/oszteocita/kondrocita metabolizmusban, és a férfiakban nemcsak a csontdenzitás, hanem a csontstruktúra is eltérő a nőknél tapasztaltaktól (Vanderschueren és

mtsai.,

2014).

A

peptidtartalmú

idegvégződések/TRP

csatornák 44

csontmetabolizmusban betöltött szerepe azonban továbbra sem tisztázott, tekintettel arra, hogy nagyon kevés irodalmi adat áll rendelkezésre. A deszenzitizációról ismert, hogy csak az idegvégződéseken található TRPV1-et érinti, míg a nem neurális eredetű TRPV1-et nem (Czikora és mtsai., 2013; Kun és mtsai., 2012; Bíró és mtsai., 1998). Mindemellett az endovanilloid/endocannabinoid rendszer szerepét nemrég igazolni tudták a csontképződés és lebomlás folyamataiban oszteoartritiszes betegekből nyert mintákon (Rossi és mtsai., 2011). Jól ismert tény, hogy a szérum-transzfer artritisz akut fázisában a neutrofil granulociták aktivációja domináns (Bevaart és mtsai., 2010), és a neutrofilek a fő forrásai az MPOnak. A humán betegségben is jelentőséggel bírhat ez az enzim, hiszen az aktív RA-ban szenvedő betegek szérumában emelkedett szintet tudtak kimutatni, illetve az MPO és az IgM szintek pozitív korrelációját is megfigyelték (Wang és mtsai., 2014). Kísérletünk során megemelkedett MPO és MMP enzimaktivitást találtunk a deszenzibilizált állatokban, mely megegyezik azon korábbi kísérleti eredményekkel, melyekben az RTX-előkezelés más gyulladásos modellben (LPS-indukálta tüdőgyulladás modell) megnövekedett MPO-szinthez vezetett (Elekes és mtsai., 2007), illetve hogy a TRPV1 aktivációja csökkent MMP-9 szekrécióval jár (Tauber és mtsai., 2012). Fontos megjegyezni azonban, hogy mindkét enzim fontos, de nem egyedüli részvevője a gyulladásos folyamatnak, az ödémával, fájdalommal vagy a csont patofiziológiával való kapcsolatuk valószínűleg csak indirekt. Mivel ezen enzimek számos gyulladásos sejt és más enzim (pl. NOS; Arnhold és Flemmig, 2010) aktivációjához vezetnek, a korai szakaszban mért magas szintjük nem zárja ki a gyulladás késői szakaszának súlyosbítását/fenntartását. A megfigyelt változások hátterében álló patomechanizmusokat szerettük volna feltérképezni az ízületek szomatosztatin szintjének meghatározásával. A szomatosztatin (és receptorainak) idegrendszeri és immunrendszeri expressziójának köszönhetően számos gyulladásos kórképben igazolódott már szabályozó szerepe (Pintér és mtsai., 2006; 2014). Ismert az is, hogy e peptid, illetve szintetikus analógjainak beadása mind állatmodellekben (Imhof és mtsai., 2011) mind reumatoid artritiszes betegekben (Fioravanti és mtsai., 1995; Paran és mtsai., 2001) a tünetek enyhüléséhez vezettek. Mivel a gyulladás hatására jelentős szomatosztatin-szint emelkedést figyelhettünk meg, és ez a mennyiség szignifikánsan alacsonyabb volt az RTX előkezelés hatására, ebből és a funkcionális adatokból arra következtethetünk, hogy a szomatosztatinnak fontos gátló szerepe van az ízületi gyulladást kísérő duzzadás kialakulásában. Érdekes megfigyelés, hogy az MMP szintek, a duzzadáshoz hasonlóan, magasabbak voltak az RTX-előkezelt 45

csoportban. Ennek a megfigyelésnek a hátterében állhat az, hogy a szomatosztatinról már korábban leírták, hogy képes csökkenteni a RA-s betegek szinoviális sejtjeinek MMP-1, -2 és -9 mRNS expresszióját és az MMP-1 termelést (Takeba és mtsai., 1997). Korábbi, patkányokban leírt ereményeink azt igazolták, hogy az RTX-előkezelés után tapasztalt

fokozott

gyulladás

nem

járt

együtt

fokozott

fájdalomérzettel.

Kísérletsorozatunkban azonban, a késői fázisban, miután a kifejezett gyulladásos jelek elmúltak, de a mechanikai hiperalgézia még fennállt, az RTX-előkezelt egerekben szignifikánsan kisebb fájdalom volt mérhető. Figyelembe véve tehát, hogy a kísérlet kezdetén az RTX-előkezelt állatokban sokkal jelentősebb gyulladás alakult ki, viszont a fájdalom a kísérlet első 9 napján nem különbözött a két csoportban, feltételezhető, hogy a kapszaicin-érzékeny idegvégződések az egész folyamat során részt vesznek a fájdalom közvetítésében és súlyosbításában, azonban a két csoport közötti különbség csak akkor lesz látható, mikor a gyulladás mértéke már mindkét csoportban megegyezik. A kapszaicin-érzékeny idegvégződések polimodális nociceptorok, tehát a fájdalmas hő, kémiai és mechanikai ingerek is képesek aktiválni, továbbá termonocicepcióban betöltött szerepük in vivo is bizonyításra került (Almási és mtsai., 2003; Mishra és Hoon, 2010; Danigo és mtsai., 2014; Bölcskei és mtsai., 2010). Azonban a mechanonociceptív küszöb nem tért el a deszenzitizált állatokban, ha von Frey filamentummal vizsgálták őket (Mishra és Hoon, 2010), de megnövekedett mechanikai küszöböket írtak le Randall-Selitto tesztben (Danigo és mtsai., 2014). Valószínű, hogy ez utóbbi módszer, az általunk használt eszteziométerhez hasonlóan más neuron típusokat képes aktiválni, ami magyarázhatja az RTX-előkezelés különböző hatásait. Továbbá nemrégiben leírták, hogy a K/BxN artritisz késői fázisában, a duzzadás és hyperemia lecsengése után, neuropátiás fájdalom figyelhető meg, mely fájdalom egyedül adjuváns analgetikum (gabapentin) adásával volt felfüggeszthető (Christianson és mtsai., 2010). A fájdalmas hőinger és mechanikai fájdalom közvetítésében a TRPV1 receptorok központi szerepet töltenek be (Sousa-Valente és mtsai., 2014). Ennek megfelelően mi is csökkent fájdalomérzetet tudtunk detektálni az RTX előkezelés hatására (a 10. naptól kezdve), amely alátámasztja azon korábbi irodalmi adatokat miszerint TRPV1-hez köthető a fájdalom mediálása mind neuropátiás állapotokban (Brito és mtsai., 2014), mind pedig artritiszben (Fernandes és mtsai., 2011). Az viszont, hogy ez a funkció esetleg a betegség időbeli lefolyásához köthető, eddig nem került leírásra. A termális hiperalgézia a K/BxN artritisz modellben nem jellemző eltérés, és az RA-s betegben sem típusos tünet (Edwards és mtsai., 2009; Leffler és mtsai., 2002). Ennek 46

ellenére szignifikáns különbséget találtunk az első hét során a nem előkezelt és RTXelőkezelt csoportok között, mely valószínűleg az RTX jól ismert termális hőküszöbemelő hatásának volt köszönhető (Almási és mtsai., 2003), de az artritisz hatására nem változott ez a hőküszöb. Mindezek alapján azt mondhatjuk, hogy a kapszaicin-érzékeny érzőidegek és a szenzoros-immun interakciók fontos és összetett szabályozói az immun-mediált artritisznek. Működésüknek köszönhetően gátolni képesek az artritisz számos tünetét (ödéma, gyulladásos sejt aktiváció és funkció), mely hatást, legalább részben, a felszabaduló szomatosztatin közvetít, azonban a potens gyulladáscsillapító hatás ellenére a késői fájdalomfolyamatok mediálásában is fontos szerepet töltenek be. Más gyulladásos modellekkel összehasonlítva megfigyelhetjük, hogy a kapszaicin-érzékeny idegvégződések inaktiválása LPS-indukálta pneumonitis gyulladásos tüneteit (sejt akkumuláció, ödéma) súlyosbítja, míg a bronchiális hiperreaktivitást csökkenti (Elekes és mtsai., 2007), azonban a pszoriaziform dermatitisz modellben enyhítette a klinikai tünetek súlyosságát (Riol-Blanco és mtsai., 2014). Következésképpen megállapíthatjuk, hogy a neuropeptid-tartalmú érző-idegvégződések komplex szabályozó szereppel bírnak gyulladásos körülmények között, és hatásuk függ a betegség által érintett szövettől és a patomechanizmustól is.

47

2. A tranziens receptor potenciál vanilloid 1 szerepének vizsgálata proteáz-aktivált receptor 2 által kiváltott ízületi gyulladásban és fájdalomban 2.1. Eredmények 2.1.1 Patkány ízületben a TRPV1 csökkenti a PAR2 aktivációval kiváltott fájdalmat A PAR2 aktiváló peptid, SLIGRL-NH2 térdízületbe történő adásakor mérsékelt, de szignifikáns mértékű érintési érzékenység csökkenés volt megfigyelhető az azonos oldali talpon. A 12-17%-os mechanikai allodínia jelentősen csökkenthető volt TRPV1 antagonista, SB366791 ip. előkezeléssel 5-6%-ra (36. A ábra). A mechanikai hiperalgézia sokkal nagyobb mértékűnek bizonyult (35%) a PAR2 aktiváció hatására, de az allodíniához hasonlóan, hatásosan csökkenthető volt TRPV1 antagonista előkezeléssel (36. B ábra). Továbbá, a mechanikai allodínia és hiperalgézia mellett, az ízületi PAR2 aktiváció csökkentette az érintett oldal terhelését, mely a spontán fájdalom kialakulását jelezte. Ezt a tünetet a TRPV1 antagonista csak a 3, 4 és 5 órás időpontokban tudta mérsékelni (36. C ábra). Az inaktív peptid beadása sem mechanikai allodíniát vagy hiperalgéziát, sem pedig spontán súlyeloszlás változást nem okozott. 2.1.2. A TRPV1 nem befolyásolta a gyulladásos citokin koncentrációkat patkány ízületben A patkány ízületek TNF koncentrációja mind az aktív mind az inaktív peptid beadása után az ELISA módszer detektálási határ alatt maradt 6 órával az injekció beadása után. Az IL-1 koncentrációja szignifikánsan megemelkedett a PAR2 aktiváció hatására (792 ± 32,6 pg/g nedves szövet) az inaktív peptidhez képest (687 ± 48,4 pg/g nedves szövet), azonban az SB366791 előkezelés nem csökkentette szignifikánsan az IL-1 mennyiségét (709 ± 45.5 pg/g nedves szövet).

48

B

Érintési érzékenység változása (%)

5

0

-5

2

#

4

5

6

##

# #

#

**

*

*

*

*

-15

-20

SLIGRL-NH2 SB366791 + SLIGRL-NH2 LRGILS-NH2

1

órák az i.a. injekció után 2

3

4

5

6

0

-10

#

###

-30

-40

*

***

##

###

###

-20

54

Spontán súlyeloszlás (%)

3

*

-10

-50

C

órák az i.a. injekció után

1

10


A

** ***

*

***

SLIGRL-NH2 SB366791+SLIGRL-NH2 LRGILS-NH2

SLIGRL-NH2 SB366791 +SLIGRL-NH2 LRGILS-NH2

52

50

# 48

#

#

46

*

44

42

40

0

1

**

*

2

3

*

* 4

5

6


36. ábra Patkány térdízületbe adott PAR-2 aktiváló peptid által kiváltott A: érintési érzékenység-változás, B: mechanikai hiperalgézia és C: spontán súlyeloszlás-változás

*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001 aktív vs. inaktív peptiddel kezelt, #p<0,05, ##p<0,01, ###p<0,001 aktív peptiddel vs. aktív peptiddel + antagonistával kezelt csoport, n=7-11/csoport

49

2.1.3. Egér ízületben a TRPV1 szerepet játszik a PAR2 aktivációval kiváltott fájdalom kialakulásában, de a citokin-felszabadulásban nem A PAR2 aktiváló peptid térdízületbe adásakor 15%-os mechanikai hiperalgézia volt megfigyelhető egerek azonos oldali talpán. A TRPV1 génhiányos állatokban a másodlagos hiperalgézia a 3. és 4. órában nem volt megfigyelhető, és bár a fájdalom a későbbi időpontokban is mérsékeltebb volt a vad típusú állatokban tapasztaltakhoz képest, azonban ez már nem bizonyult statisztikailag szignifikánsnak (37. A ábra). A patkányoknál megfigyelthez hasonlóan, a térdbe adott SLIGRL-NH2 hatására jelentős spontán súlyeloszlás-változás alakult ki a vad típusú egerekben, míg a TRPV1 génhiányos állatokban az első 4 órában nem volt, azonban az 5. és 6. órában szignifikáns eltérés volt tapasztalható a vad típushoz képest (37. B ábra). A gyulladásos citokinek tekintetében a patkányokon megfigyelt változásokkal nagyfokú hasonlóságot találtunk egerekben is. A TNF koncentrációja az ELISA módszer mérési határa alatt maradt mind az aktív mind pedig az inaktív peptid adása után. Ezzel szemben, az aktív peptid jelentős IL-1 koncentráció-emelkedést eredményezett (az inaktív peptid által kiváltott citokin felszabaduláshoz viszonyítva) a vad és a génhiányos csoportokban egyaránt, közöttük azonban szignifikáns eltérés nem volt mérhető (37. C ábra). 2.1.4. A TRPV1-nek nincs hatása az ödéma kialakulására egér térdízületben Az egerek térdének anteroposzterior átmérője 4,4 ± 0,1 mm, míg a mediolaterális átmérője 4,3 ± 0,1 mm volt a kísérlet kezdetén. 1 órával az aktív peptid intraartikuláris beadása után ezek az értékek csak 5,1 ± 0,4% illetve 1,8 ± 0,1%-kal emelkedtek a vad típusú állatokban, mely változás nem tekinthető szignifikáns duzzadásnak. Ez a mérsékelt térdátmérő-növekedés végig megmaradt a kísérlet során, de a 6. órára sem vált jelentőssé a növekedés (4,9 ± 0,3% és 1,3 ± 0,2%). Hasonló változások voltak megfigyelhetők a TRPV1 génhiányos egerek esetében, azonban a két csoport között nem volt szignifikáns különbség.

50

A



10

1

2

5

*

*

#

#

0

-5

*

*

*

-10

+

-15

-20

WT (SLIGRL-NH2)

WT (LRGILS-NH2)

TRPV1-/- (SLIGRL-NH2)

TRPV1-/- (LRGILS-NH2)

WT (LRGILS-NH2)

WT (SLIGRL-NH2)

53

-/-


4

5

-25

B

3

TRPV1

52


(SLIGRL-NH2)

51 50

##

49 48

46

+

+

45 44

*

**

47

0

1

2

3

##

**

4

5

** 6

C

IL-1ß koncentráció (pg/g nedves szövet)

órák az i.a. injekció után 1100 1000

WT

*

-/-

TRPV1

++

900 800 700 600 500 400 300 200 100 0

LRGILS-NH2

SLIGRL-NH2

6 órával az i.a. injekció után

37. ábra Egér térdízületbe adott PAR-2 aktiváló peptid által kiváltott A: mechanikai hiperalgézia, B: spontán súlyeloszlás-változás és C: IL-1β koncentráció-változás

*p<0,05; **p<0,01 aktív vs. inaktív peptiddel kezelt WT, #p<0,05, ##p<0,01 aktív peptiddel kezelt WT vs. TRPV1-/-, +p<0,05, ++p<0,01 aktív vs. inaktív peptiddel kezelt TRPV1-/-, n=7-11/csoport

51

2.1.5.

A

TRPV1

szerepe

az

intraplantáris

PAR2-aktivációval

kiváltott

ödémaképződésben egérmodellben A SLIGRL-NH2 segítségével kiváltott lábduzzadás jelentős mértékű, 22-26%-os volt a vad típusban, míg ez az érték szignifikánsan kisebb (10%) volt a TRPV1 génhiány hatására, mely különbség a kísérlet végéig fennmaradt (38. A ábra). 2.1.6. A TRPV1 nincs hatással a gyulladásos fájdalom kialakulására és a citokin koncentrációkra A primer hiperalgézia, melyet a PAR2 aktiváló peptid talpba történő adásával váltottunk ki, 15-25%-osnak bizonyult WT egerekben és végig fennmaradt a 6 órás kísérleti periódus alatt. Bár kisebb eltérések megfigyelhetők voltak a vad és génhiányos egerek hiperalgézia értékei között, mégis az egész kísérletet tekintve ezek a különbségek nem voltak jelentősek (38. B ábra). A súlyeloszlás változása az aktív peptid intraplantáris adásakor is megfigyelhető volt, bár ebben a paraméterben sem találtunk jelentős különbséget a vad és génhiányos csoportok között (38. C ábra). Az egerek talpába adott SLIGRL-NH2 által kiváltott gyulladásos citokin-koncentráció emelkedése nagy hasonlóságot mutat a térdbe történt adáshoz. A TNF koncentrációja a mérési határ alatt maradt, míg az IL-1 jelentősen megemelkedett mindkét csoportban, azonban szignifikáns különbség itt sem volt kimutatható (38. D ábra).

52

A

30

WT (SLIGRL-NH2)

WT (LRGILS-NH2)



Lábduzzadás (%)

25

*

20

***

***

**

***

***

15

## #

10

###

###

5

0

###

###

0

1

2

3

4

5

6

5

6

órák az i.pl. injekció után


B


C

6 4 2 0 -2 -4 -6 -8 -10 -12 -14 -16 -18 -20 -22 -24 -26 -28 -30 -32

órák az i.pl. injekció után 1

2

**

**

3

4

*

+

*

++

+

**

++ WT (LRGILS-NH2)

WT (SLIGRL-NH2)



52

50

48

46

WT (SLIGRL-NH2)

44

WT (LRGILS-NH2)

TRPV1-/- (SLIGRL-NH2) 0

1

2

TRPV1-/- (LRGILS-NH2) 3

4

5

6

órák az i.pl. injekció után

53


D

**

3000 2800

WT

2600

TRPV1-/-

**

2400 2200 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0

LRGILS-NH2

SLIGRL-NH2

6 órával az i.pl. injekció után

38. ábra Egér talpba adott PAR-2 aktiváló peptid által kiváltott A: ödéma, B: mechanikai hiperalgézia, C: spontán súlyeloszlás-változás és D: IL-1β koncentráció-változás ##

*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001 aktív vs. inaktív peptiddel kezelt WT, #p<0,05; ##p<0,01, p<0,01 aktív peptiddel kezelt WT vs. TRPV1-/-, +p<0,05; ++p<0,01 aktív vs. inaktív peptiddel kezelt TRPV1-/-, n=7-11/csoport

2.2 Összefoglalás, megbeszélés, következtetések Az ízületi megbetegedéseket kísérő fájdalom mechanizmusának pontos megértése igen nagy klinikai jelentőséggel bír, mégis e téren ismereteink igen hiányosak (McDougall, 2006). A PAR aktivációról ismert, hogy szabályozó szereppel bír gyulladásos folyamatokban és néhány adat arról is beszámol, hogy szerepe lehet a fájdalom kialakulásában (Cenac és mtsai., 2007), azonban artritiszben és a gyulladás hatására fellépő fájdalomban betöltött funkciója egyelőre az orvostudomány kevéssé ismert területei közé tartozik. Azon kevés kutatások egyike, melyek ezt a területet kívánják feltérképezni, azt bizonyította, hogy a PAR-4 aktiváció ízületi gyulladást és fájdalmat váltott ki, és PAR-4 antagonista segítségével mind az artritisz súlyossága, mind pedig a kísérő fájdalom sikeresen csökkenthető volt (McDougall és mtsai., 2009). Jelen eredményeink szolgáltatnak elsőként bizonyítékot arra, hogy a szelektív PAR2 aktiváló peptid SLIGRL-NH2 térdízületbe való adása jelentős szekunder mechanikai hiperalgéziához/allodíniához vezet, valamint spontán súlyeloszlás-változást idéz elő patkányban és egérben egyaránt. Mindezeket a hatásokat az IL-1 koncentrációjának növekedése követi. Ezzel ellentétben, egy másik jellemző gyulladásos citokin, a TNF koncentrációja nem emelkedik meg a 6 órás kísérleti időtartam végére. A 6 órás időpont kiválasztása irodalmi adatok alapján történt, melyek szerint a PAR2 aktivációja után 54

gyorsan deszenzitizálódik és rendszerint akut gyulladásos reakciók közvetítésében vesz részt, melyek általában 6 óra után lecsengenek. A PAR2 aktiváció jellemzőit vizsgálták már talpban (Kawabata és mtsai., 2001), a gyomor-bélrendszerben (Cenac és mtsai., 2002; Kawao és mtsai., 2004) és a légzőrendszerben (Schmidlin és mtsai., 2002; Fiorucci és Distrutti, 2002; Kanke és mtsai., 2005) is. Az ízületi PAR2 aktivációját Ferrell és mtsai. (2003) vizsgálták és gyulladást, hiperémiát és jól látható gyulladásos szövettani elváltozásokat írtak le. Kutatócsoportunk ezzel szemben nem talált jelentős ízületi duzzadást 100 g PAR2 aktiváló peptid hatására, bár az IL-1 koncentrációjának emelkedése jól mutatja a gyulladásos reakció létrejöttét. Ezen kívül eredményeink elsőként bizonyították, hogy az ízületi PAR2 aktiváció fájdalom kiváltásához vezet. Továbbá, a szelektív TRPV1 antagonistával (SB366791) történt előkezelés patkányokban illetve a TRPV1 génhiányos egerekkel történt kísérletsorozatok azt is igazolták, hogy a TRPV1 receptorok közvetítik a szekunder hiperalgézia/allodínia kialakulását és a spontán súlyeloszlás-változást. Megjegyzendő azonban, hogy míg patkányban a PAR2-aktiváció által kiváltott változások teljes mértékben felfüggeszthetők voltak a TRPV1 antagonista használatával, addig egérben a TRPV1 genetikai hiánya csupán mérsékelni tudta a válaszokat. Ez a különbség magyarázható mind az ízületi TRPV1-közvetítette mechanizmusok jelentőségének fajbeli különbségeivel, mind pedig a receptor hiányát kompenzáló mechanizmusokkal. Megjegyzendő, hogy a fájdalomválaszok eltérő dinamikájúak voltak a két fajban: míg patkányoknál a 2. órától a hiperalgézia/allodínia, 3. órától a súlyeloszlásváltozás különbségei figyelhetők meg az antagonistával előkezelt csoportokban, addig a TRPV1 génhiányos egerekben csak a 3. órától volt különbség a hiperalgézia és az 5. órától a nehézkedés tekintetében. Ezek alapján azt mondhatjuk, hogy a patkányoknál a TRPV1 aktivációja gyorsabban következik be, mint egerek esetében. A PAR2 receptorok aktivációja a szinoviális sejteken, fibrocitákon, gyulladásos és immunsejteken, valamint az érzőideg-végződéseken számos gyulladáskeltő vívőanyag, mint például a bradykinin, leukotriének, prosztaglandinok, citokinek és szenzoros neuropeptidek, felszabadulásához vezet, melyek viszont aktiválják/szenzibilizálják a TRPV1 receptort. A perifériás idegvégződéseken található TRPV1 direkt szenzitizációja protein-kináz C, protein-kináz A vagy foszfolipáz C által valósul meg, melyet mind in vitro mind in vivo körülmények között igazoltak a primer termális hiperalgézia hátterében (Amadesi és mtsai., 2006). Azonban ez valószínűleg nem tekinthető jelentős mechanizmusnak a másodlagos hiperalgézia és spontán fájdalom kialakulásában. 55

A talpba adott PAR2 aktiváló peptid egerekben nagymértékű lábduzzadást idézett elő TRPV1-közvetített

mechanizmussal,

mely

hatásért

valószínűleg

az

aktivált

idegvégződésből felszabaduló SP és CGRP tehető felelőssé, ahogy ez már számos korábbi vizsgálatban bebizonyosodott (Vergnolle és mtsai., 2001b; Cottrell és mtsai., 2003). Azonban ezen ioncsatornák kísérleteink alapján feltehetőleg nem játszanak szerepet a PAR2 által kiváltott primer hiperalgézia kialakulásában és nehézkedéscsökkenésben. A PAR2-ről ismert, hogy képes az aktiváció helyén termális hiperalgéziát kiváltani (Hoogerwerf és mtsai., 2001; Vergnolle és mtsai., 2001b) és a perifériás idegvégződéseken található TRPV1 receptoroknak szerepét is leírták ebben a folyamatban (McLean és mtsai., 2002). Mégis az intraplantárisan beadott PAR2 agonisták mechanikai hiperalgéziát és allodíniát okozó hatásai vitatottak. Korábbi tanulmányokban a TRPV1 génhiányos egerekben csökkent vagy megszűnt a PAR2 által kiváltott hő- és mechanikai hiperalgézia (Amadesi és mtsai., 2004; Dai és mtsai., 2004), azonban kutatócsoportunk ezt a megfigyelést nem tudta megerősíteni. Az intraplantáris injekció hatására kialakuló mechanonociceptív küszöbcsökkenést az egerek talpán mértük, így ezt a paramétert primer hiperalgéziának nevezzük. Amikor a gyulladást

a

térdízületi

küszöbcsökkenést

a

anyagadással talpon

mérjük,

váltjuk

ki

abban

és az

a

mechanonociceptív esetben

szekunder

hiperalgéziáról/allodíniáról beszélünk. A primer és szekunder hiperalgézia alapvetően más mechanizmussal jön létre. Míg a primer hiperalgézia, különösen hőinger hatására, főként a primer nociceptív idegvégződések perifériás szenzitizációja útján jön létre, addig a szekunder hiperalgézia a központi idegrendszeri megváltozott feldolgozásnak tulajdonítható (Treede és Magerl, 2000). A szekunder hiperalgézia létrejöttében valószínűleg nem a perifériás idegvégződések kóros válaszkészsége az alapvető, hanem a neuronális transzmisszió megváltozása a gerincvelőben és magasabb agyterületeken (talamusz, szomatoszenzoros kéreg). Számos folyamatot aktiválnak fájdalmas ingerek a gerincvelő hátsó szarvában, melyek fokozott szinaptikus aktivációhoz (centrális szenzitizációhoz) vezetnek. Mégis, az intraartikuláris PAR2 aktiváció által kiváltott szekunder hiperalgézia enyhébb volt, mint az intraplantáris adással indukált primer hiperalgézia. Ennek hátterében esetleg a szinoviális folyadék jelentősebb endopeptidáz aktivitása állhat, mely limitálja a PAR2 által kiváltott válaszokat. Az idegvégződésekre jellemző PAR2 expresszió mellett ismert a receptor jelenléte az ízületek különböző sejttípusain is, mint a szinoviális sejtek, immun- és gyulladásos sejtek, beleértve a hízósejteket is. A belőlük felszabaduló gyulladásos mediátorok is valószínűleg szerepet 56

játszanak a TRPV1 receptorok aktivációjában/szenzitizációjában (Kelso és mtsai., 2006). Bár a PAR2 aktiváció önmagában nem elég akciós potenciál generálására, azonban ezen receptorok képesek kapcsolatba lépni más receptorokkal és ioncsatornákkal (pl. TRPV4; Grant és mtsai, 2007) és ezáltal depolarizációt előidézni a gerincvelőben a megövekedett Na+-beáramlásnak, c-Fos expressziónak vagy az intracelluláris Ca2+kiváltotta szenzoros neuropeptid (SP, CGRP) felszabadulásnak köszönhetően (Seeliger és mtsai., 2003; Dai és mtsai., 2004; Cenac és Vergnolle, 2005). Az említett mechanizmusok valószínűleg a mechanonociceptív jelek fokozott továbbításában nyilvánulnak meg. Mindezek alapján elmondható, hogy a TRPV1 fontos szerepet játszik a PAR2 indukált fájdalom mediálásában (4. táblázat), valószínűleg magasabb központi idegrendszeri struktúrák befolyásolása révén.

Artritisz paraméterei Patkány térd

Allodínia Hiperalgézia Spontán fájdalom IL-1β

Egér térd

Ödéma Hiperalgézia Spontán fájdalom IL-1β

Egér talp

Ödéma Hiperalgézia Spontán fájdalom IL-1β

PAR2 agonista hatása

TRPV1 antagonista hatása

↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑

↓ ↓ ↓ -

TRPV1 génhiány hatása

↓ ↓ ↓ -

4. táblázat PAR-2 agonista és TRPV1 antagonista kezelés illetve TRPV1 génhiány hatásai akut artritisz paramétereire 57

3. Tachykininek és tachykinin NK1 receptorok szerepének vizsgálata adjuvánsindukált artritisz egérmodelljében 3.1 Eredmények 3.1.1

Tachykininek

szerepe

a

CFA-indukált

mechanikai

hiperalgézia

kialakulásában WT állatokban 40%-os mechanonociceptív küszöbcsökkenés alakult ki a CFA-adást követő 4. napra, amely a kísérlet 21. napjára 20%-ra mérséklődött. A 11. naptól a kísérlet végéig a hiperalgézia szignifikánsan enyhébbnek bizonyult a Tac4-/- és a Tacr1-/csoportokban, míg a Tac1-/- és Tac1-/-/Tac4-/- csoportokban ez a különbség nem volt megfigyelhető (39. ábra).


A

napok a CFA-adás után

0 -5

-10

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

C57Bl/6 Tac1-/-

-15 -20 -25 -30 -35 -40 -45


B0 -5 -10

napok a CFA-adás után 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

C57Bl/6 Tacr1-/-

*** *

-15 -20

** *** **

*

-25 -30 -35 -40 -45

58


C0 -5 -10

napok a CFA-adás után 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

C57Bl/6 Tac4-/-

-15

*

-20

*

**

*** ****

-25 -30 -35 -40 -45


D

napok a CFA-adás után 0 -5

-10

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

C57Bl/6 Tac1-/-/Tac4-/-

-15 -20 -25 -30 -35 -40 -45

39. ábra Gyulladásos mechanikai hiperalgézia A: Tac1-/-, B: Tac4-/-, C: Tacr1-/-, D: Tac1-/-/Tac4-/- egerekben *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 génhiányos vs. C57Bl/6, n=9-24/csoport

3.1.2.

A

tachykininek

nem

játszanak

szerepet

a

CFA-indukált

ödéma

kialakulásában A WT csoportban az anyagadás hatására 90%-os lábduzzadás alakult ki a 4. napra, mely a maximumát a 11. napra érte el, ekkor 98%-osnak bizonyult, azonban egyik vizsgált peptid hiánya sem befolyásolta számottevően az ödéma mértékét (40. ábra).

59

A

110 100

Lábduzzadás (%)

90 80 70 60 50 40 30

C57Bl/6 Tac1-/-

20 10 0

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21


B

100 90

Lábduzzadás (%)

80 70 60 50 40 30

C57Bl/6 Tac4-/-

20 10 0

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

napok a CFA-adás után 110

C 100 Lábduzzadás (%)

90 80 70 60 50 40 30

C57Bl/6 Tacr1-/-

20 10 0

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21


60

D

120

Lábduzzadás (%)

100 80 60 40

C57Bl/6 Tac1-/-/Tac4-/-

20 0

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21


40. ábra Lábduzzadás A: Tac1-/-, B: Tac4-/-, C: Tacr1-/-, D: Tac1-/-/Tac4-/- egerekben n=9-24/csoport

3.1.3. Tachykininek szerepe a CFA-indukált szövettani elváltozásokban A vad típusú és génhiányos törzsek intakt ízületi mintáiban szövettani eltérést nem találtunk. A CFA-adást követő 21. napon, a WT csoportban erőteljes gyulladásos reakciók és pannuszképződés volt megfigyelhető a szinoviális tér kiszélesedésével, szinoviális

hiperpláziával

és

gyulladásos

sejtes

beszűrtséggel,

-/-

-/-

valamint

-/-

porcdestrukcióval és minimális csonterózióval. A Tac4 és Tac1 /Tac4 csoportokban a szinoviális membrán megvastagodása, a leukocita akkumuláció és a porcdestrukció mértéke minimális volt, míg csonterózió egyáltalán nem fordult elő. Ezzel szemben a Tac1-/- és Tacr1-/- csoportokban a gyulladás súlyosságát tekintve nem volt különbség a WT állatokhoz viszonyítva. Az említett hisztopatológiai paraméterek alapján szemikvantitatív

pontozással

értékeltük

számszerűsíthető volt a Tac4

-/-

az -/-

ízületi

és Tac1 /Tac4

-/-

gyulladás

mértékét.

Így

csoportokban megfigyelhető

szignifikáns különbség a WT csoporthoz képest (41, 42. ábra).

61

41. ábra Ép és CFA-val kezelt állatok ízületeinek szövettani metszetei (40X-es nagyítás, HE festés; ti: tibia, ta: tarsus, s: szinovium) A: intakt és CFA kezelt B: C57Bl/6, C: Tac1-/- D: Tacr1-/-, E: Tac4-/-, F: Tac1-/-/Tac4-/-

62

Összetett artritisz pontszám

8

+++

7 6 5

*

4 3

***

2 1 0

Intakt C57Bl/6

C57Bl/6

Tac1 -/-

Tacr1 -/-

Tac4 -/-

Tac1 -/-/Tac4 -/-

CFA-kezelt

42. ábra Összetett szövettani pontszám

+++

p<0.001 intakt vs. CFA-kezelt C57Bl/6, *p<0.05, ***p<0.001 génhiányos vs. C57Bl/6, n=4-7/csoport

3.1.4. Tachykininek szerepe a CFA-indukált ízületi IL-1ß termelődésben A gyulladásos citokinek közül az IL-1ß koncentrációját vizsgáltuk, mely fehérje nemcsak az immunválasz módosításában, hanem az oszteoklasztok aktiválásában is fontos szerepet játszik. Intakt ízületi homogenizátumokban (mind a WT, mind pedig a génhiányos törzsekben) a IL-1ß koncentrációja az ELISA technika mérési határa alatt van. CFA adás hatására körülbelül 9000pg/g nedves szövet mennyiségű IL-1ß termelődés volt detektálható a WT csoportban. A génhiányos állatokban a szövettani elváltozásoknak megfelelő tendenciát találtunk: a Tac4-/- és Tac1-/-/Tac4-/- csoportokban szignifikánsan alacsonyabb volt a gyulladásos citokin koncentráció, míg a Tac1-/- és


Tacr1-/- egerekben nem volt jelentős különbség a vad típushoz viszonyítva (43. ábra). 16000 15000 14000 13000 12000 11000 10000 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0

*

C57Bl/6

Tac1 -/-

Tacr1 -/-

Tac4 -/-

*

Tac1 -/-/Tac4 -/-

43. ábra Gyulladásos citokin koncentráció (IL-1β) *p<0.05 génhiányos vs. C57Bl/6, n=5-7/csoport

63

3.2. Összefoglalás, megbeszélés, következtetések Kutatásunk elsőként bizonyította a hemokinin-1 fájdalomkeltő szerepét a CFAindukálta artritisz késői fázisában, valamint, hogy e peptid fontos szerepet játszik a gyulladásos szövettani elváltozások és a citokin termelés szabályozásában. Ezen kívül kísérleteink első alkalommal igazolták, hogy e hatások hátterében különböző receptoriális mechanizmusok feltételezhetők: míg a mechanikai hiperalgézia kiváltása NK1 receptor közvetített módon valósul meg, addig a perifériás gyulladásos elváltozások valószínűleg nem NK1 receptor-mediáltak. Ez a megfigyelés felveti egy esetleges új, eddig még ismeretlen tachykinin receptor létezését (5. táblázat).

Tac1-//Tac4-/-

Tacr1-//Tac1-/-

↓

-

-

-

-

-

-

-

-

↓

↓

↓

-

-

↓

↓

↓

Artritisz paraméterei

Tac1

Hiperalgézia

-

↓

Ödéma

-

Összetett szövettani pontszám IL-1β

-/-

Tacr1

-/-

Tac4

-/-

5. táblázat Tac1, Tac4, Tacr1 és kettős génhiányok hatása a CFA artritisz paramétereire Már igen korai adatok beszámolnak arról, hogy az érzőideg-végződések átvágása nem csak a fájdalmat, hanem a gyulladás több tünetét is képes csökkenteni (Levine és mtsai., 1986) illetve korábbi kísérleteink is bizonyították, a kapszaicin-érzékeny szenzoros rostok és a rajtuk expresszálódó TRPV1 receptorok fontos szerepet játszanak CFAindukált artritisz modellben (Helyes és mtsai., 2004; Szabó és mtsai., 2005). A szabaddá váló neuropeptidek egyrészt felelősek a helyi gyulladásos reakció kialakításáért (Maggi és Meli, 1988; Szolcsányi, 1996), másrészt a gerincvelő hátsó szarvában található centrális végződésből való felszabadulásuk is fontos szerephez jut a fájdalom közvetítésében (DeFelipe és mtsai., 1998; Ribeiro-da-Silva és Hökfelt, 2000). Továbbá, jelentős számú SP-pozitív szenzoros idegvégződés is található a szinoviális szövetben (DeFelipe és mtsai., 1998; Keeble és Brain, 2004). Ezen idegvégződések sűrűségének 64

változását is megfigyelték különböző ízületi patológiás állapotokban: RA-ban a denzitásuk növekedett, míg oszteoartritiszben éppen csökkent (Weidler és mtsai., 2005). Bár a gyulladás előtt jellemző Tac1 és Tac4-kódolt peptidszinteket és expressziós mintázatot nem ismerjük, a jelen eredmények bizonyítják a tachykinin rendszer komplexitását az artritisz, és az azt kísérő fájdalom különböző mechanizmusaiban (Millward-Sadler és mtsai., 2003; Howard és mtsai., 2008). Évtizedekkel ezelőtt az SP volt az egyetlen tachykinin, amit ki lehetett a SP-ellenes antitestekkel mutatni, ezért a radioimmunoassay eredményeket minden esetben SP-ként interpretálták. A Tac4 gén felfedezése azonban ezt a paradigmát is megváltoztatta, ugyanis a HK-1 SP-hez való nagyfokú hasonlóságnak köszönhetően radioimmunoassay módszerrel nem különíthető el (Page, 2004), így az irodalmi adatok értelmezésénél sok esetben nehézségekbe ütközünk, illetve nem tudjuk, hogy az adott kísérleti elrendezésben SP vagy HK-1, esetleg mindkettő szintje változik. A HK-1-et elsőként hemopoetikus sejtekből mutatták ki, ám azóta számos sejtben igazolták jelenlétét: T és B limfocitákban, dendritikus sejtekben és makrofágokban. Több irodalmi adat is bizonyítja vérképzési és gyulladásos folyamatokban betöltött szerepét, néhány éve azt is leírták, hogy mind a HK-1, mind pedig az SP befolyásolni tudja a CD4+ T sejtek differenciálódását, míg a család többi tagjáról, az NKA-ról és az NKB-ről ez nem mondható el (Cunin és mtsai., 2011). Ezen tulajdonságok alapján joggal

feltételezhető

a

HK-1

reguláló

szerepe

különböző

gyulladásos

megbetegedésekben és ígéretes célpontja lehet a jövőbeli terápiának. Perifériás expressziója mellett jól ismert, hogy a központi idegrendszer számos területén is kimutatható a Tac4 gén expressziója, valamint, hogy a HK-1 az ismert tachykinin receptorok közül legnagyobb affinitással és szelektivitással az NK1 receptorhoz kötődik. Ezek alapján feltételezhető a fájdalom folyamatokban való részvétele is. A HK-1 ebben a tekintetben, valamint szerkezeti és immunológiai vonatkozásaiban is nagymértékű hasonlóságot mutat a SP-hez, ezért évekig azt feltételezték, hogy a két peptid funkciói is megegyeznek. Mivel azonban a HK-1 hatásai számos kísérleti elrendezésben nem hasonlítottak a SP által kiváltott hatásokhoz, valószínű, hogy e peptid az NK1 receptoron más kötőhellyel rendelkezik, mint az SP, valamint a receptor aktiváció és a beindított jelátviteli kaszkád is különböző lehet (Kurtz és mtsai., 2002). Az eltérő viselkedés magyarázatul szolgálhat továbbá, ahogyan ezt már más munkacsoport néhány éve felvetette (Endo és mtsai., 2006), hogy a tachykinin receptorcsaládnak létezik egy negyedik, eddig még ismeretlen tagja is. Ezek a megállapítások választ adhatnak arra a régóta fennálló kérdésre, hogy az 65

állatkísérletekben fájdalom- és gyulladáscsökkentőként hatékonynak bizonyult NK1 receptor antagonisták, melyeket a SP kötődésének gátlására terveztek, miért nem voltak eredményesek a humán gyógyszervizsgálatok során. Az autoimmun/gyulladásos betegségek körébe tartozó colitis ulcerosáról nemrégiben írták le, hogy patogenezisében szerepet tulajdonítanak a HK-1-nek (Liu és mtsai., 2011), a reumatoid artritisz tekintetében azonban ilyen adat még nem áll rendelkezésünkre. Bíztató azonban az az új terápiás felfogás, miszerint a rituximabbal (anti-CD20 monoklonális antitest) történő B sejt depléciós kezelés hatékonyan enyhítette az ízületi gyulladással küzdő betegek tüneteit (Chen és mtsai., 2012; Popa és mtsai., 2007). Mivel a B sejtek a HK-1 egyik fontos forrását képezik, megfontolandó, hogy ebben a jótékony hatásban a HK-1 gyulladáskeltő tulajdonságának kiiktatása is szerepet játszik. A HK-1-gyel szemben az NK1 receptorok szerepét hosszú ideje vizsgálták már gyulladásos

ízületi

betegségekben,

különböző

állatmodellekből

és

klinikai

vizsgálatokból rengeteg adat áll rendelkezésre. Az NK1 receptor mRNS expressziója magas RA betegek szinoviumában, melyet a TNFα csökkenteni képes (Krause és mtsai., 1995). Az intraartikulárisan adott NK1 receptor antagonistával történt előkezelés csökkentette a karragénnel-kiváltott artritiszes fájdalmat, de az ödémát nem befolyásolta patkányban (Hong és mtsai., 2002). CFA-indukált artritisz 7 napos vizsgálati periódusa alatt a dexametazon-kezelés ödéma- és fájdalomcsökkentő hatását fokozni tudta az NK1 antagonista (Lam és Ng, 2010), illetve intraartikuláris és intraplantáris adás után önmagában is képes volt enyhíteni a fájdalmat, valamint csökkenteni az ödémát és a progresszív ízületi károsodást (Uematsu és mtsai., 2011). Kísérletünkben a gyulladásos mechanikai hiperalgézia a 11. naptól kezdve volt szignifikánsan kisebb mértékű a Tac4-/- és Tacr1-/- állatokban, míg a többi génhiányos csoportban ez nem volt megfigyelhető. Ebből arra következtethetünk, hogy a HK-1 az NK1 receptorokon keresztül aktiválja a szenzoros neuronokat, azonban a perifériás mechanizmusok mellett a gerincvelői centrális szenzitizációnak is szerepe lehet ezekben a folyamatokban. Bár annak pontos magyarázata nem ismert, hogy a NK1 receptor génhiány esetén tapasztaltakat miért nem láttuk az SP és NKA együttes hiányakor, azonban több feltételezés is magyarázatul szolgálhat: a) az SP hiperalgéziát vált ki az NK1 receptorokon keresztül, ezt a hatást azonban ellensúlyozza az NKA központi idegrendszeri NK2 receptorokon való hatása (Tauer és mtsai., 2012) illetve 66

b) A HK-1 és az SP azonos receptoron hat (NK1), de különböző a kötődési helyük, affinitásuk vagy intrinszik hatékonyságuk, illetve eltérő az aktiválási mechanizmusuk vagy az általuk beindított jelátviteli útvonal. Ha mindkét peptid hiányzik a rendszerből a HK-1 hiányában létrejövő gátlást esetleges intracelluláris molekuláris mechanizmusok ellensúlyozzák. A duzzadás tekintetében ellentmondásos adatokkal rendelkezünk a tachykininek szerepéről. Néhány adat azt bizonyítja, hogy az NK1 receptor antagonisták csökkentik az ödémát (Hong és mtsai., 2002; Lam és Ng, 2010), a mi adataink azonban azt támasztják alá, hogy a tachykininek a duzzadásban nem játszanak kulcsszerepet. A Tac4-/- állatokban a gyulladásos szövettani elváltozások és a citokin-koncentrációk is alacsonyabbak voltak a vad típushoz viszonyítva. Több irodalmi adat is alátámasztja a gyulladásos citokinek és a tachykinin rendszer kapcsolatát. RA betegekből nyert monociták nagyobb mennyiségű TNFα-t szekretálnak, mint az egészséges kontrollokból származó monociták (Lavagno és mtsai., 2001). Továbbá, csökkent SP szint és betegség aktivitás volt megfigyelhető TNFα blokkoló etanercept kezelés után RA-s betegekben (Origuchi és mtsai., 2011). Bár az RA alapvetően egy TNFα-domináns kórkép, más interleukinek is fontos szerephez jutnak a krónikus ízületi károsodásban, ilyen például az IL-1β, melyről ismert, hogy képes szabályozni az immunválaszt és az oszteoklaszt aktivitást (Gonzalez-Rey és mtsai., 2007), azonban a hiperalgéziával ellentétben, a Tacr1-/- egerekben nem figyelhettük meg a gyulladásos paraméterek (szövettani elváltozások, IL-1β koncentráció) csökkenését. Következésképpen megállapítható, hogy a HK-1 fontos gyulladás- és fájdalomkeltő szerepet játszik krónikus artritisz modellben, és az általa kiváltott hatások hátterében eltérő mechanizmusok valamint egy, még ismeretlen tachykinin receptor jelenléte is feltételezhető.

67

ÚJ EREDMÉNYEK ÖSSZEFOGLALÁSA ÉS EGYSÉGES ÉRTELMEZÉSE 1. Elsőként bizonyítottuk, hogy kapszaicin-szenzitív peptidtartalmú érzőidegvégződések összetett szabályozó funkcióval rendelkeznek reumatoid artritisz egérmodelljében. A gyulladásos tüneteket, mint az ödémát, gyulladásos enzimaktivitást (MPO, MMP) és a szövettani elváltozásokat csökkenteni képesek, amely hátterében -legalábbis részben- a belőlük felszabaduló szomatosztatin játszhat szerepet. Emellett azonban a neuropeptid-tartalmú végződések fontos szerepet töltenek be a gyulladást kísérő fájdalom kialakulásában és/vagy súlyosbításában, elsősorban a késői fázisban. Mindezek alapján azt mondhatjuk, hogy a kapszaicinérzékeny idegvégződések egyoldalú aktivációja vagy gátlása nem megfelelő terápiás perspektíva a betegség gyógyításában. További vizsgálatok szükségesek annak tisztázására, hogy melyik felszabaduló neuropeptid játszik jelentős szerepet az említett hatások kiváltásában. Eredményeinkkel elsőként mutattuk ki, hogy egy alapvetően immun-mediált betegségmodellben az érzőideg-végződések befolyásolni képesek az immunválaszt, tehát a neuro-immun interakciók fontos részvevői a krónikus ízületi gyulladásos folyamatoknak. 2. Az idegvégződéseken és hízósejteken egyaránt expresszálódó PAR2 aktivációjáról elsőként igazoltuk, hogy mind patkány, mint pedig egér ízületben jelentős fájdalom kiváltására képes, emellett IL-1β termelődés-fokozódást és lábduzzadást tud előidézni. Bár találtunk különbségeket a két fajban kiváltott válaszok, valamint a térdbe és talpba adott PAR2 agonista hatásai között, összességében azonban elmondható, hogy a PAR2 aktivációval előidézett gyulladás és kísérő fájdalom csökkenthető, illetve bizonyos fájdalomkvalitások megszűntethetők, azonban a citokin-szint változások nem befolyásolhatók a TRPV1 receptorok funkciójának gátlásával/hiányával. Ezek alapján elmondható, hogy a PAR2-mediált akut ízületi gyulladás és a szekunder mechanikai hiperalgézia közvetítésében fontos szerepet játszanak a TRPV1 receptorok. Ezen eredmények igazolták, hogy egy kevert típusú neurogén és nem-neurogén komponenseket is magába foglaló - artritisz mechanizmus-modellben is fontos szabályozó szerephez jutnak a neuro-immun köncsönhatások.

68

3. Kísérleteink első alkalommal igazolták, hogy a tachykinin család legújabb, eddig kevésbé ismert hatású tagja, a HK-1 fontos gyulladás- és fájdalomkeltő szereppel bír krónikus ízületi gyulladás egérmodelljében. Ezen kívül bizonyítottuk, hogy e hatások hátterében különböző receptoriális mechanizmusok feltételezhetők: míg a mechanikai hiperalgézia kiváltása NK1 receptor által közvetített módon valósul meg, addig a perifériás gyulladásos elváltozások valószínűleg nem. Ez a megfigyelés felveti egy esetleges új, eddig még ismeretlen tachykinin receptor létezését. Mivel a) a CFA-indukált artritisz elsősorban nem neurogén eredetű, és b) a HK-1-et kódoló Tac4 gén expressziója sokkal jelentősebb a periférián, mint a központi idegrendszerben (bár ott sem elhanyagolható). Ezen eredményeink is alátámasztják a szenzoros-immun interakciók fontosságát az ízületi gyulladás patomechanizmusában. Az ideg- és az immunrendszer együttműködése illetve betegségekben betöltött szerepe régóta ismert. A világszerte folyó intenzív kutatás eredményeképpen számos közlemény ismerteti a reumatoid artritisz eddig feltárt patomechanizmusait, melyek között ma már felsorolásra kerül a neuro-immun interakciók jelentősége (McInnes és Schett, 2011). Az azonban továbbra sem ismert, hogy ezen folyamatokat hogyan lehet úgy befolyásolni, hogy azzal hatékony fájdalom- és gyulladáscsökkentő hatást érjünk el és emellett kevés mellékhatással kelljen számolni. Elengedhetetlen ezért, hogy e két rendszer komplex szabályozását mind mechanizmus-, mind pedig betegségmodellek segítségével minél jobban feltárjuk, és olyan kulcsmolekulákat határozzunk meg, amelyek hatásának befolyásolása a későbbiekben a reumatoid artritisz terápiájában hasznosítható lesz. Kísérleteinkkel bizonyítást nyert, hogy mind az idegvégződésekből felszabaduló szomatosztatin, mind az ideg- és immunsejteken található PAR2 és a belőlük felszabaduló HK-1 fontos szerepet tölt be az ízületi gyulladás és a következményes fájdalom kialakulásában és súlyosbításában (44. ábra). Ezen mediátorok pontos hatásmechanizmusának

azonosítása

hozzájárulhat

új

típusú

fájdalom-

és

gyulladáscsökkentő gyógyszerek kifejlesztéséhez.

69

44. ábra Új eredményeink összefoglalása (1., 2., 3. modellünkben igazolt összefüggések) (internetes források felhasználásával)

70

IRODALMI HIVATKOZÁSOK Almási R, Pethö G, Bölcskei K, Szolcsányi J (2003). Effect of resiniferatoxin on the noxious heat threshold temperature in the rat: a novel heat allodynia model sensitive to analgesics. Br J Pharmacol. 139: 49-58. Amadesi S, Cottrell GS, Divino L, Chapman K, Grady EF, Bautista F, Karanjia R, Barajas-Lopez C, Vanner S, Vergnolle N, Bunnett NW (2006). Protease-activated receptor 2 sensitizes TRPV1 by protein kinase C- and A-dependent mechanisms in rats and mice. J Physiol. 575: 555–71 Amadesi S, Nie J, Vergnolle N, Cottrell GS, Grady EF, Trevisani M, Manni C, Geppetti P, McRoberts JA, Ennes H, Davis JB, Mayer EA, Bunnett NW (2004). Proteaseactivated receptor 2 sensitizes the capsaicin receptor transient receptor potential vanilloid receptor 1 to induce hyperalgesia. J Neurosci. 24: 4300–12. Anand P, Bley K (2011). Topical capsaicin for pain management: therapeutic potential and mechanisms of action of the new high-concentration capsaicin 8% patch. Br J Anaesth. 107: 490-502. Anichini M, Cesaretti S, Lepori M, Maddali Bongi S, Maresca M, Zoppi M (1997). Substance P in the serum of patients with rheumatoid arthritis. Rev Rhum Engl Ed. 64: 18-21. Arnhold J, Flemmig J (2010). Human myeloperoxidase in innate and acquired immunity. Arch Biochem Biophys. 500: 92-106. Bandari PS, Qian J, Oh HS, Potian JA, Yehia G, Harrison JS, Rameshwar P (2003a). Crosstalk between neurokinin receptors is relevant to hemopoietic regulation: cloning and characterization of neurokinin-2 promoter. J Neuroimmunol. 138: 65-75. Bandari PS, Qian J, Yehia G, Joshi DD, Maloof PB, Potian JA, Oh HS, Gascon P, Harrison JS, Rameshwar P (2003b). Hematopoietic growth factor inducible neurokinin1 type: a transmembrane protein that is similar to neurokinin 1 interacts with substance P. Regul Pept. 111: 169-178. Banzawa N, Saito S, Imagawa T, Kashio M, Takahashi K, Tominaga M, Ohta T (2014). Molecular Basis Determining Inhibition/Activation of Nociceptive Receptor TRPA1: A Single Amino Acid Dictates Species-specific Actions of the Most Potent Mammalian TRPA1 Antagonists. J Biol Chem. 289: 31927-39. Berger A, Benveniste P, Corfe SA, Tran AH, Barbara M, Wakeham A, Mak TW, Iscove NN, Paige CJ (2010). Targeted deletion of the tachykinin 4 gene (TAC4-/-) influences the early stages of B lymphocyte development. Blood. 116: 3792-801. 71

Bevaart L, Vervoordeldonk MJ, Tak PP (2010). Evaluation of therapeutic targets in animal models of arthritis: how does it relate to rheumatoid arthritis? Arthritis Rheum. 62: 2192-205. Bileviciute I, Lundeberg T, Ekblom A, Theodorsson E (1993). Bilateral changes of substance P-, neurokinin A-, calcitonin gene-related peptide- and neuropeptide Y-like immunoreactivity in rat knee joint synovial fluid during acute monoarthritis. Neurosci Lett 153: 37–40. Billiau A, Matthys P. (2001) Modes of action of Freund's adjuvants in experimental models of autoimmune diseases. J Leukoc Biol. 70: 849-60. Bíró T, Maurer M, Modarres S, Lewin NE, Brodie C, Acs G, Paus R, Blumberg PM (1998). Characterization of functional vanilloid receptors expressed by mast cells. Blood. 91: 1332-40. Boileau C, Amiable N, Martel-Pelletier J, Fahmi H, Duval N, Pelletier J-P (2007). Activation of protease-activated receptor 2 in human osteoarthritic cartilage upregulates catabolic and pro-inflammatory pathways capable of inducing cartilage degeneration: a basic science study. Arthritis Res Ther. 9: R121–30. Bölcskei K, Helyes Zs, Szabó Á, Sándor K, Pethő G, Szolcsányi J (2005). Investigation of the role of TRPV1 receptors in acute and chronic nociceptive processes using genedeficient mice. Pain. 117: 368–76. Bölcskei K, Tékus V, Dézsi L, Szolcsányi J, Petho G (2010). Antinociceptive desensitizing actions of TRPV1 receptor agonists capsaicin, resiniferatoxin and Noleoyldopamine as measured by determination of the noxious heat and cold thresholds in the rat. Eur J Pain 14: 480-486. Brito R, Sheth S, Mukherjea D, Rybak LP, Ramkumar V (2014). TRPV1: A Potential Drug Target for Treating Various Diseases. Cells. 3: 517-45. Burmester GR, Feist E, Dörner T (2014). Emerging cell and cytokine targets in rheumatoid arthritis. Nat Rev Rheumatol. 10: 77-88. Busso N, Frasnelli M, Feifel R, Cenni B, Steinhoff M, Hamilton J, So A (2007). Evaluation of protease-activated receptor 2 in murine models of arthritis. Arthritis Rheum. 56: 101–7. Cai A, Hutchison E, Hudson J, Kawashima Y, Komori N, Singh A, Brush RS, Anderson RE, Sonntag WE, Matsumoto H, Griffin TM (2014). Metabolic enrichment of omega-3 polyunsaturated fatty acids does not reduce the onset of idiopathic knee osteoarthritis in mice. Osteoarthritis Cartilage. 22: 1301-9. 72

Cao YQ, Mantyh PW, Carlson E, Gillespie AM, Epstein CJ, Basbaum AI (1998). Primary afferent tachykinins are required to experience moderate to intense pain. Nature. 392: 390-394. Carr MJ, Hunter DD, Jacoby DB, Undem BJ (2002). Expression of tachykinins in nonnociceptive vagal afferent neurons during respiratory viral infection in guinea-pigs. Am J Respir Crit Care Med. 165: 1071-1075. Cenac N, Andrews CN, Holzhausen M, Chapman K, Cottrell G, Andrade-Gordon P, Steinhoff M, Barbara G, Beck P, Bunnett NW, Sharkey KA, Ferraz JG, Shaffer E, Vergnolle N (2007). Role of protease activity in visceral pain in irritable bowel syndrome. J Clin Invest. 117: 636–47. Cenac N, Coelho AM, Nguyen C, Compton S, Andrade-Gordon P, McNaughton WK, Wallace JL, Hollenberg MD, Bunnett NW, Garcia-Villar R, Bueno L, Vergnolle N (2002). Induction of intestinal inflammation in mouse by activation of proteaseactivated receptor-2. Am J Pathol. 161: 1903–15. Cenac N, Vergnolle N (2005). Proteases and protease-activated receptors (PARs): novel signals for pain. Curr Top Med Chem. 5: 569–76. Chen DR, Cohen PL (2012). Living life without B cells: is repeated B-cell depletion a safe and effective long-term treatment plan for rheumatoid arthritis? Int J Clin Rheumtol. 2: 159-166. Chen WT, Tung CH, Weissleder R (2004). Imaging reactive oxygen species in arthritis. Mol Imaging. 3: 159-62. Christianson CA, Corr M, Firestein GS, Mobargha A, Yaksh TL, Svensson CI (2010). Characterization of the acute and persistent pain state present in K/BxN serum transfer arthritis. Pain. 151: 394-403. Cocks TM, Fong B, Chow JM, Anderson GP, Frauman AG, Goldie RG, Henry PJ, Carr MJ, Hamilton JR, Moffatt JD (1999). A protective role for protease-activated receptors in the airways. Nature. 198: 156–60. Coelho A-M, Ossovskaya V, Bunnett NW (2003). Protease-activated receptor-2: physiological and pathophysiological roles. Curr Med Chem Cardiovasc Hematol Agents. 1: 61–72. Cottrell GS, Amadesi S, Schmidlin F, Bunnett N (2003). Protease-activated receptor 2: activation, signalling and function. Biochem Soc Trans. 31: 1191-7. Cottrell GS, Amadesi S, Schmidlin F, Bunnett NW (2003). Protease-activated receptor 2: activation, signalling and function. Biochem Soc Trans. 31: 1191–7. 73

Cunin P, Caillon A, Corvaisier M, Garo E, Scotet M, Blanchard S, Delneste Y, Jeannin P (2011). The tachykinins substance P and hemokinin-1 favor the generation of human memory Th17 cells by inducing IL-1β, IL-23, and TNF-like 1A expression by monocytes. J Immunol. 186: 4175-82. Czikora Á, Rutkai I, Pásztor ET, Szalai A, Pórszász R, Boczán J, Édes I, Papp Z, Tóth A (2013). Different desensitization patterns for sensory and vascular TRPV1 populations in the rat: expression, localization and functional consequences. PLoS One. 8, e78184. D’Andrea MR, Derian CK, Leturcq D, Baker SM, Brunmark A, Ling P, Darrow AL, Santulli RJ, Brass LF, Andrade-Gordon P (1998). Characterization of protease-activated receptor-2 immunoreactivity in normal human tissues. J Histochem Cytochem. 46: 157– 64. Dai Y, Moriyama T, Higashi T, Togashi K, Kobayashi K, Yamanaka H, Tominaga M, Noguchi K (2004). Protease-activated receptor-2-mediated potentiation of transient receptor potential vanilloid subfamily 1 activity reveals a mechanism for proteaseinduced inflammatory pain. J Neurosci. 24: 4293–9. Danigo A, Magy L, Richard L, Sturtz F, Funalot B, Demiot C (2014). A reversible functional sensory neuropathy model. Neurosci Lett. 571: 39-44. De Felipe C, Herrero JF, O'Brien JA, Palmer JA, Doyle CA, Smith AJH, Laird JMA, Belmonte C, Cervero F, Hunt SP (1998). Altered nociception, analgesia and agression in mice lacking the receptor for substance P. Nature 392: 394-397. De Felipe C, Herrero JF, O'Brien JA, Palmer JA, Doyle CA, Smith AJ, Laird JM, Belmonte C, Cervero F, Hunt SP (1998). Altered nociception, analgesia and aggression in mice lacking the receptor for substance P. Nature. 26: 394-7. Denko CW, Malemud CJ (2004). The serum growth hormone to somatostatin ratio is skewed upward in rheumatoid arthritis patients. Front Biosci. 9: 1660-4. Ditzel HJ (2004). The K/BxN mouse: a model of human inflammatory arthritis. Trends Mol Med. 10: 40-5. Duffy RA, Hedrick JA, Randolph G, Morgan CA, Cohan-Williams ME, Vassileva G, Lachowicz JE, Laverty M, Maguire M, Shan LS, Gustafson E, Varty GB (2003). Centrally administered hemokinin-1 (HK-1), a neurokinin NK1 receptor agonist, produces substance P-like behavioral effects in mice and gerbils. Neuropharmacology 45: 242-250.

74

Edwards RR, Wasan AD, Bingham CO 3rd, Bathon J, Haythornthwaite JA, Smith MT, Page GG (2009). Enhanced reactivity to pain in patients with rheumatoid arthritis. Arthritis Res Ther. 11: R61. Elekes K, Helyes Z, Németh J, Sándor K, Pozsgai G, Kereskai L, Börzsei R, Pintér E, Szabó A, Szolcsányi J (2007). Role of capsaicin-sensitive afferents and sensory neuropeptides in endotoxin-induced airway inflammation and consequent bronchial hyperreactivity in the mouse. Regul Pept. 141: 44-54. Endo D, Ikeda T, Ishida Y, Yoshioka D, Nishimori T. (2006) Effect of intrathecal administration of hemokinin-1 on the withdrawal response to noxious thermal stimulation of the rat hind paw. Neurosci Lett. 392: 114–117. Fernandes ES, Russell FA, Spina D, McDougall JJ, Graepel R, Gentry C, Staniland AA, Mountford DM, Keeble JE, Malcangio M, Bevan S, Brain SD (2011). A distinct role for transient receptor potential ankyrin 1, in addition to transient receptor potential vanilloid 1, in tumor necrosis factor α-induced inflammatory hyperalgesia and Freund's complete adjuvant-induced monarthritis. Arthritis Rheum. 63: 819-29. Ferrell WR, Lockhart JC, Kelso EB, Dunning L, Plevin R, Meek SE, Smith AJ, Hunter GD, McLean JS, McGarry F, Ramage R, Jiang L, Kanke T, Kawagoe J (2003). Essential role for protease-activated receptor-2 in arthritis. J Clin Invest. 111: 35–41. Fioravanti A, Govoni M, La Montagna G, Perpignano G, Tirri G, Trotta F, Bogliolo A, Ciocci A, Mauceri MT, Marcolongo R (1995). Somatostatin 14 and joint inflammation: evidence for intraarticular efficacy of prolonged administration in rheumatoid arthritis. Drugs Exp Clin Res. 21: 97-103. Fiorucci S, Distrutti E (2002). Role of PAR2 in pain and inflammation. Trends Pharmacol Sci. 23: 153–5. Fukushima A, Boyle DL, Corr M, Firestein GS (2010). Kinetic analysis of synovial signalling and gene expression in animal models of arthritis. Ann Rheum Dis. 69: 91823. Gonzalez-Rey E, Chorny A, Delgado M (2007). Regulation of immune tolerance by anti-inflammatory neuropeptides. Nat Rev Immunol. 7: 52-63. Graham GJ, Stevens JM, Page NM, Grant AD, Brain SD, Lowry PJ, Gibbins JM (2004). Tachykinins regulate the function of platelets. Blood. 104: 1058–1065. Grant AD, Cottrell GS, Amadesi S, Trevisani M, Nicoletti P, Materazzi S, Altier C, Cenac N, Zamponi GW, Bautista-Cruz F, Lopez CB, Joseph EK, Levine JD, Liedtke W, Vanner S, Vergnolle N, Geppetti P, Bunnett NW (2007). Protease- activated receptor 2 75

sensitizes the transient receptor potential vanilloid 4 ion channel to cause mechanical hyperalgesia in mice. J Physiol. 578: 715–33. Gross S, Gammon ST, Moss BL, Rauch D, Harding J, Heinecke JW, Ratner L, PiwnicaWorms D (2009). Bioluminescence imaging of myeloperoxidase activity in vivo. Nat Med. 15: 455-61. Gu Q, Lee L-Y (2006). Hypersensitivity of pulmonary chemosensitive neurons induced by activation of protease-activated receptor-2 in rats. J Physiol. 574: 867–76. Harmar AJ, Hyde V, Chapman K (1990). Identification and cDNA sequence of deltapreprotachykinin, a fourth splicing variant of the rat substance P precursor. FEBS Lett. 275: 22-4. Harris ED (2005). Prednisolon in early rheumatoid arthritis: an antiinvasive effect. Arthritis Rheum. 52: 3324-5. Helyes Z, Elekes K, Sándor K, Szitter I, Kereskai L, Pintér E, Kemény A, Szolcsányi J, McLaughlin L, Vasiliou S, Kipar A, Zimmer A, Hunt SP, Stewart JP, Quinn JP (2010). Involvement of preprotachykinin A gene-encoded peptides and the neurokinin 1 receptor in endotoxin-induced murine airway inflammation. Neuropeptides. 44: 399406. Helyes Zs, Pintér E, Németh J, Szolcsányi J (2003). Pharmacological targets for the inhibition of neurogenic inflammation. Curr Med Chem 2: 191-218. Helyes Zs, Szabó Á, Németh J, Jakab B, Pintér E, Bánvölgyi Á, Kereskai L, Kéri Gy, Szolcsányi J (2004). Anti-inflammatory and analgesic effect of somatostatin released from capsaicin-sensitive sensory nerve terminals in Freund’s adjuvant-induced chronic arthritis model of the rat. Arthritis Rheum.50: 1677-1685. Hickman-Brecks CL, Racz JL, Meyer DM, LaBranche TP, Allen PM (2011). Th17 cells can provide B cell help in autoantibody induced arthritis. J Autoimmun. 36: 65-75. Hietala MA, Jonsson IM, Tarkowski A, Kleinan S, Pekna M (2002). Complement deficiency ameliorates collagen-induced arthritis in mice. J Immunol.169: 454-459. Hill R (2000). NK1 (substance P) receptor antagonists--why are they not analgesic in humans? Trends Pharmacol Sci. 7: 244-6. Ho WZ, Lai JP, Zhu XH, Uvaydova M, Douglas SD (1997). Human monocytes and macrophages express substance P and neurokinin-1 receptor. J Immunol.159: 56545660.

76

Hochberg MC, Lebwohl MG, Plevy SE, Hobbs KF, Yocum DE (2005). The benefit/risk profile of TNF-blocking agents: findings of a consensus panel. Semin Arthritis Rheum. 34: 819-836. Hollenberg MD, Compton SJ (2002). International union of pharmacology. XXVIII: protease-activated receptors. Pharmacol Rev. 54: 203–17. Holzer P (1988). Local effector functions of capsaicin-sensitive sensory nerve endings: involvement of tachykinins, calcitonin gene-related peptide and other neuropeptides. Neuroscience 24: 739-768. Holzer P, Holzer-Petsche U (1997). Tachykinins in the gut. Part I. Expression, release and motor function. Pharmacol Ther. 73: 173-217. Hong SK, Han JS, Min SS, Hwang JM, Kim YI, Na HS, Yoon YW, Han HC (2002). Local neurokinin-1 receptor in the knee joint contributes to the induction, but not maintenance, of arthritic pain in the rat. Neurosci Lett. 322: 21-4. Hoogerwerf WA, Zou L, Shenoy M, Sun D, Micci MA, Lee-Hellmich H, Xiao SY, Winston JH, Pasricha PJ (2001). The protease-activated receptor 2 is involved in nociception. J Neurosci. 21: 9036–42. Howard MR, Millward-Sadler SJ, Vasilliou AS, Salter DM, Quinn JP (2008). Mechanical stimulation induces preprotachykinin gene expression in osteoarthritic chondrocytes which is correlated with modulation of the transcription factor neuron restrictive silence factor. Neuropeptides. 42: 681-686. Imhof AK, Glück L, Gajda M, Lupp A, Bräuer R, Schaible HG, Schulz S (2011). Differential antiinflammatory and antinociceptive effects of the somatostatin analogs octreotide and pasireotide in a mouse model of immune-mediated arthritis. Arthritis Rheum. 63: 2352-62. Jakus Z, Simon E, Balázs B, Mócsai A (2010). Genetic deficiency of Syk protects mice from autoantibody-induced arthritis. Arthritis Rheum. 62: 1899-910. Jancsó N, Jancsó-Gábor A, Szolcsányi J (1967). Direct evidence for neurogenic inflammation and its prevention by denervation and by pretreatment with capsaicin. Br J Pharmacol Chemother. 31: 138-51. Joe B, Wilder RL (1999). Animal models of rheumatoid arthritis. Mol Med Today. 5: 367-369. Jones G, Halbert J, Crotty M, Shanahan EM, Batterham M, Ahern M (2003). The effect of treatment on radiological progression in rheumatoid arthritis: a systematic review of randomized placebo-controlled trials. Rheumatology (Oxford). 42: 6-13. 77

Kanke T, Takizawa T, Kabeya M, Kawabata A (2005). Physiology and pathology of protease-activated receptors (PARs): PAR-2 as a potential therapeutic target. J Pharmacol Sci. 97: 38–42. Kawabata A, Kawao N, Kuroda R, Tanaka A, Itoh H, Nishikawa H (2001). Peripheral PAR-2 triggers thermal hyperalgesia and nociceptive responses in rats. NeuroReport. 12: 715–9. Kawabata A, Kinoshita M, Kuroda R, Kakehi K (2002). Capsazepine partially inhibits neurally mediated gastric mucus secretion following activation of proteaseactivated receptor 2. Clin Exp Pharmacol Physiol. 29: 360–1. Kawao N, Ikeda H, Kitano T, Kuroda R, Sekiguchi F, Kataoka K, Kamanaka Y, Kawabata A (2004). Modulation of capsaicin-evoked visceral pain and referred hyperalgesia by protease-activated receptors 1 and 2. J Pharmacol Sci. 94: 277–85. Keeble JE, Brain SD (2004). A role for substance P in arthritis? Neurosci Lett. 6: 176-9. Kelso EB, Lockhart JC, Hembrough T, Dunning L, Plevin R, Hollenberg MD, Sommerhoff CP, McLean JS, Ferrell WR (2006). Therapeutic promise of proteinaseactivated receptor-2 antagonism in joint inflammation. J Pharmacol Exp Ther. 316: 1017–24. Kennedy PG, Rodgers J, Bradley B, Hunt SP, Gettinby G, Leeman SE, De Felipe C, Murray M (2003). Clinical and neuroinflammatory responses to meningoencephalitis in substance P receptor knockout mice. Brain 126: 1683-1690. Korganow AS, Ji H, Mangialaio S, Duchatelle V, Pelanda R, Martin T, Degott C, Kikutani H, Rajewsky K, Pasquali JL, Benoist C, Mathis D (1999). From systemic T cell self-reactivity to organ-specific autoimmune disease via immunoglobulins. Immunity. 10: 451-61. Kotani H, Hoshimaru M, Nawa H, Nakanishi S (1986). Structure and gene organization of bovine neuromedin K precursor. Proc Natl Acad Sci U S A.83: 7074-7078. Kourilovitch M, Galarza-Maldonado C, Ortiz-Prado E (2014). Diagnosis and classification of rheumatoid arthritis. J Autoimmun. 48-49: 26-30. Kouskoff V, Korganow AS, Duchatelle V, Degott C, Benoist C, Mathis D (1996). Organ-specific disease provoked by systemic autoimmunity. Cell. 87: 811-22 Krause JE, Blount P, Sachais BS (1994). Molecular Biology of receptors. Stuctures, Expression and Regulatory Mechanisms. Buck SH (Ed.). The tachykinin receptors 165218.

78

Krause JE, DiMaggio DA, McCarson KE (1995). Alterations in neurokinin 1 receptor gene expression in models of pain and inflammation. Can J Physiol Pharmacol. 73: 854-9. Kun J, Helyes Z, Perkecz A, Bán Á, Polgár B, Szolcsányi J, Pintér E (2012). Effect of surgical and chemical sensory denervation on non-neural expression of the transient receptor potential vanilloid 1 (TRPV1) receptors in the rat. J Mol Neurosci. 48: 795803. Kurtz MM, Wang R, Clements MK, Cascieri MA, Austin CP, Cunningham BR, Chicchi GG, Liu Q (2002). Identification, localization and receptor characterization of novel mammalian substance P-like peptides. Gene. 296: 205-212. Lai JP, Dougls SD, Ho WZ (1998). Human lymphocytes express substance P and its receptor. J Neuroimmunol. 86 (1): 80-86. Lam FF, Ng ES (2010). Substance P and glutamate receptor antagonists improve the anti-arthritic actions of dexamethasone in rats. Br J Pharmacol. 159: 958-69. Larsson J, Ekblom A, Henriksson K, Lundeberg T, Theodorsson E (1991). Concentration of substance P, neurokinin A, calcitonin generelated peptide, neuropeptide Y and vasoactive intestinal polypeptide in synovial fluid from knee joints in patients suffering from rheumatoid arthritis. Scand J Rheumatol 20: 326–35. Lau AH, Chow SS, Ng YS (2001). Immunologically induced histamine release from rat peritoneal mast cells is enhanced by low levels of substance P. Eur J Pharmacol. 414: 295-303. Lavagno L, Bordin G, Colangelo D, Viano I, Brunelleschi S (2001). Tachykinin activation of human monocytes from patients with rheumatoid arthritis: in vitro and exvivo effects of cyclosporin A. Neuropeptides. 35: 92-9. Leffler AS, Kosek E, Lerndal T, Nordmark B, Hansson P (2002). Somatosensory perception and function of diffuse noxious inhibitory controls (DNIC) in patients suffering from rheumatoid arthritis. Eur J Pain. 6: 161-76. Levine JD, Collier DH, Basbaum AI, Moskowitz MA, Helms CA (1986). Hypothesis: the nervous system may contribute to the pathophysiology of rheumatoid arthritis. J Rheumatol 12: 406–11. Levine JD, Khasar SG, Green PG (2006). Neurogenic inflammation and arthritis. Ann N Y Acad Sci. 1069: 155-67. Levine JD, Moskowitz MA, Basbaum AI (1985). The contribution of neurogenic inflammation in experimental arthritis. J Immunol. 135: 843-847. 79

Lindner JR, Kahn ML, Coughlin SR, Sambrano GR, Schauble E, Bernstein D, Foy D, Hafezi-Moghadam A, Ley K (2000). Delayed onset of inflammation in proteaseactivated receptor-2-deficient mice. J Immunol. 165: 6504–10. Linnik MD, Moskowitz MA (1989). Identification of immunoreactive substance P in human and other mammalian endothelial cells. Peptides. 10: 957-962. Liu L, Markus I, Saghire HE, Perera DS, King DW, Burcher E (2011). Distinct differences in tachykinin gene expression in ulcerative colitis, Crohn's disease and diverticular disease: a role for hemokinin-1? Neurogastroenterol Motil. 23: 475-83 Longmore J, Hill RG, Hargreaves RJ (1997). Neurokinin-receptor antagonists: pharmacological tools and therapeutic drugs. Can J Physiol Pharmacol. 75: 612–621. Lundberg JM (1996). Pharmacology of cotransmission in the autonomic nervous system: integrative aspects on amines, neuropeptides, adenosine triphosphate, amino acids and nitric oxide. Pharmacol Rev. 48: 113-178. Macfarlane SR, Seatter MJ, Kanke T, Hunter GD, Plevin R (2001). Protease-activated receptors. Pharmacol Rev. 53:245–82. Macfarlane SR, Seatter MJ, Kanke T, Hunter GD, Plevin R (2001). Protease-activated receptors. Pharmacol Rev. 53: 245–82. Maggi CA, Meli A (1988). The sensory-efferent function of capsaicin-sensitive sensory neurons. Gen Pharmacol. 19: 1-43. McDougall JJ (2006). Arthritis and pain: neurogenic origin of joint pain. Arthritis Res Ther. 8: 220–9. McDougall JJ, Zhang C, Cellars L, Joubert E, Dixon C, Vergnolle N (2009). Triggering of protease-activated receptor 4 leads to joint pain and inflammation in mice. Arthritis Rheum. 60: 728–37. McInnes IB, Schett G (2011). The pathogenesis of rheumatoid arthritis. N Engl J Med. 365: 2205-19. McIntosh KA, Plevin R, Ferrell WR, Lockhart JC (2007). The therapeutic potential of protease-activated receptors in arthritis. Curr Opin Pharmacol. 7: 334–8. McLean PG, Aston D, Sarkar D, Ahluwalia A (2002). Protease-activated receptor-2 activation causes EDHF-like coronary vasodilation: selective preservation in ischemia/ reperfusion injury: involvement of lipoxygenase products, VR1 receptors, and C-fibers. Circ Res. 90: 465–72. 80

Meinel T, Pongratz G, Rauch L, Straub RH (2013). Neuronal α1/2-adrenergic stimulation of IFN-γ, IL-6, and CXCL-1 in murine spleen in late experimental arthritis. Brain Behav Immun. 33: 80-9. Metwali A, Blum AM, Elliott DE, Setiawan T, Weinstock JV (2004). Cutting edge: hemokinin has substance P-like function and expression in inflammation. J Immunol. 172: 6528-6532. Millward-Sadler SJ, Mackenzie A, Wright MO, Lee HS, Elliot K, Gerrard L, Fiskerstrand CE, Salter DM, Quinn JP (2003). Tachykinin expression in cartilage and function in human articular chondrocyte mechanotransduction. Arthritis Rheum. 48: 146-156. Mishra SK, Hoon MA (2010). Ablation of TrpV1 neurons reveals their selective role in thermal pain sensation. Mol Cell Neurosci. 43: 157-163. Molino M, Barnathan ES, Numerof R, Clark J, Dreyer M, Cumashi A, Hoxie JA, Schechter N, Woolkalis M, Brass LF (1997). Interactions of mast cell tryptase with thrombin receptors and PAR-2. J Biol Chem. 272: 4043–9. Morteau O, Lu B, Gerard C, Gerard NP (2001). Hemokinin 1 is a full agonist at the substance P receptor. Nat Immunol. 2: 1088. Nakano S, Mishiro T, Takahara S, Yokoi H, Hamada D, Yukata K, Takata Y, Goto T, Egawa H, Yasuoka S, Furouchi H, Hirasaka K, Nikawa T, Yasui N (2007). Distinct expression of mast cell tryptase and protease activated receptor-2 in synovia of rheumatoid arthritis and osteoarthritis. Clin Rheumatol. 26: 1284–92. Nash PT, Florin TH (2005). Tumor Necrosis Factor Inhibitors. Med J Aust.183: 205208. Nawa H, Hirose T, Takashima H, Inayama S, Nakanishi S (1983). Nucleotide sequenses of cloned cDNAs for two types of bovine brain substance P precursor. Nature. 306: 3236. Nawa H, Kotani H, Nakanishi S (1985). Tissue-specific generation of two preprotachykinin mRNAs from one gene by alternative RNA splicing. Nature. 312: 729-734. Nelson DA, Bost KL (2004). Non-neuronal mammalian tachykinin expression. Front Biosci. 9: 2166–2176. Németh T, Futosi K, Hably C, Brouns MR, Jakob SM, Kovács M, Kertész Z, Walzog B, Settleman J, Mócsai A (2010). Neutrophil functions and autoimmune arthritis in the absence of p190RhoGAP: generation and analysis of a novel null mutation in mice. J Immunol. 185: 3064-75. 81

Neumann S, Doubell TP, Leslie T, Woolf CJ (1996). Inflammatory pain hypersensitivity mediated by phenotypic switch in myelinated primary sensory neurons. Nature. 384: 360-364. Noorbakhsh F, Vergnolle N, Hollenberg MD, Power C (2003). Proteinase-activated receptors in the nervous system. Nat Rev Neurosci. 4: 981-90. Origuchi T, Iwamoto N, Kawashiri SY, Fujikawa K, Aramaki T, Tamai M, Arima K, Nakamura H, Yamasaki S, Ida H, Kawakami A, Ueki Y, Matsuoka N, Nakashima M, Mizokami A, Kawabe Y, Mine M, Fukuda T, Eguchi K (2011). Reduction in serum levels of substance P in patients with rheumatoid arthritis by etanercept, a tumor necrosis factor inhibitor. Mod Rheumatol. 21: 244-50. Otsuka M, Yoshioka K (1993). Neurotransmitter functions of mammalian tachykinins. Physiol Rev. 73: 230-307. Page NM (2004). Hemokinins and endokinins. Cell Mol Life Sci.61: 1652-1663. Page NM (2005). New challenges in the study of the mammalian tachykinins. Peptides. 26: 1356-1368. Page NM, Bell NJ, Gardiner SM, Manyonda IT, Brayley KJ, Strange PG, Lowry PJ (2003). Characterization of the endokinins: human tachykinins with cardiovascular activity. Proc Natl Acad Sci U S A.100: 6245-6250. Paran D, Elkayam O, Mayo A, Paran H, Amit M, Yaron M, Caspi D (2001). A pilot study of a long acting somatostatin analogue for the treatment of refractory rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis. 60: 888-91. Pascual DW, Bost KL (1990). Substance P production by P388D1 macrophages: a possible autocrine function for this neuropeptide. Immunology. 71: 52-56. Paszcuk AF, Quintao NLM, Fernandes ES, Juliano L, Chapman K, Andrade-Gordon P, Campos MM, Vergnolle N, Calixto JB (2008). Mechanisms underlying the nociceptive and inflammatory responses induced by trypsin in the mouse paw. Eur J Pharmacol. 581: 204–15. Paus R, Schmelz M, Bíró T, Steinhoff M (2006). Frontiers in pruritus research: scratching the brain for more effective itch therapy. J Clin Invest. 116: 1174-86. Pernow B (1983). Substance P – a putative mediator of antidromic vasodilation. Gen Pharmacol. 14: 13–16.

82

Pintér E, Helyes Z, Szolcsányi J (2006). Inhibitory effect of somatostatin on inflammation and nociception. Pharmacol Ther. 112: 440-56. Pintér E, Pozsgai G, Hajna Z, Helyes Z, Szolcsányi J (2014). Neuropeptide receptors as potential drug targets in the treatment of inflammatory conditions. Br J Clin Pharmacol. 77: 5-20. Pongratz G, Straub RH (2010). The B cell, arthritis, and the sympathetic nervous system. Brain Behav Immun. 24: 186-92. Popa C, Leandro MJ, Cambridge G, Edwards JC (2007). Repeated B lymphocyte depletion with rituximab in rheumatoid arthritis over 7 yrs. Rheumatology (Oxford). 4: 626-30. Rameshwar P (1997). Substance P: a regulatory neuropeptide for hematopoiesis and immune functions. Clin Immunol Immunopathol. 85: 129-133. Ribeiro-da-Silva A, Hökfelt T (2000). Neuroanatomical localisation of Substance P in the CNS and sensory neurons. Neuropeptides. 34: 256–271. Riol-Blanco L, Ordovas-Montanes J, Perro M, Naval E, Thiriot A, Alvarez D, Paust S, Wood JN, von Andrian UH (2014). Nociceptive sensory neurons drive interleukin-23mediated psoriasiform skin inflammation. Nature. 510: 157-61. Rossi F, Bellini G, Luongo L, Torella M, Mancusi S, De Petrocellis L, Petrosino S, Siniscalco D, Orlando P, Scafuro M, Colacurci N, Perrotta S, Nobili B, Di Marzo V, Maione S (2011). The endovanilloid/endocannabinoid system: a new potential target for osteoporosis therapy. Bone. 48: 997-1007. Russell FA, McDougall JJ (2009). Protease activated receptor (PAR) involvement in mediating arthritis pain and inflammation. Inflam Res. 58: 119–26. Sándor K, Elekes K, Szabó Á, Pintér E, Engström M, Würster S, Szolcsányi J, Helyes Z (2006). Analgesic effects of the somatostatin sst4 receptor selective agonist J-2156 in acute and chronic pain models. Eur J Pharmacol. 539: 71–5. Schaible HG, von Banchet GS, Boettger MK, Bräuer R, Gajda M, Richter F, Hensellek S, Brenn D, Natura G (2010). The role of proinflammatory cytokines in the generation and maintenance of joint pain. Ann N Y Acad Sci. 1193: 60-9. Schett G, Gravallese E (2012). Bone erosion in rheumatoid arthritis: mechanisms, diagnosis and treatment. Nat Rev Rheumatol. 8: 656-64. Schmelz M, Zeck S, Raithel M, Rukwied R (1999). Mast cell tryptase in dermal neurogenic inflammation. Clin Exp Allergy. 29: 695–702. 83

Schmidlin F, Amadesi S, Dabbagh K, Lewis DE, Knott P, Bunnett NW, Gater PR, Geppetti P, Bertrand C, Stevens ME (2002). Protease-activated receptor 2 mediates eosinophil infiltration and hyperreactivity in allergic inflammation of the airway. J Immunol. 169: 5315–21. Schwab W, Bilgicyldirim A, Funk RH (1997). Microtopography of the automatic nerves in the rat knee: a fluorescence microscopic study. Anat Rec. 247: 109-118. Scott DL (2012). Biologics-based therapy for the treatment of rheumatoid arthritis. Clin Pharmacol Ther. 91: 30-43. Seeliger S, Derian CK, Vergnolle N, Bunnett NW, Nawroth R, Schmelz M, Von Der Weid PY, Buddenkotte J, Sunderkötter C, Metze D, Andrade-Gordon P, Harms E, Vestweber D, Luger TA, Steinhoff M (2003). Proinflammatory role of proteaseactivated receptor-2 in humans and mice during cutaneous inflammation in vivo. FASEB J. 17: 1871–85. Shimizu N, Nakahara T, Saito M, Ishii K (2007). Role of capsaicin-sensitive sensory nerves in protease-activated receptor-2-mediated contraction of rat urinary bladder. Eur J Pharmacol. 569: 145–8. Smith JB, Haynes MK (2002). Rheumatoid Arthritis: A Molecular Understanding. Ann Intern Med. 136: 908–922. Sousa-Valente J, Andreou AP, Urban L, Nagy I (2014). Transient receptor potential ion channels in primary sensory neurons as targets for novel analgesics. Br J Pharmacol. 171: 2508-27 Stangenberg L, Burzyn D, Binstadt BA, Weissleder R, Mahmood U, Benoist C, Mathis D, (2014). Denervation protects limbs from inflammatory arthritis via an impact on the microvasculature. Proc Natl Acad Sci U S A. 111: 11419-24. Steinhoff M, Corvera CU, Thoma MS, Kong W, McAlpine BE, Caughey GH, Ansel JC, Bunnett NW (1999). Protease-activated receptor-2 in human skin: tissue distribution and activation of keratinocytes by mast cell tryptase. Exp Dermatol. 8: 282–94. Steinhoff M, Vergnolle N, Young SH, Tognetto M, Amadesi S, Ennes HS, Trevisani M, Hollenberg MD, Wallace JL, Caughey GH, Mitchell SE, Williams LM, Geppetti P, Mayer EA, Bunnett NW (2000). Agonists of protease-activated receptor 2 induce inflammation by a neurogenic mechanism. Nat Med. 6: 151–8. Steinhoff MS, von Mentzer B, Geppetti P, Pothoulakis C, Bunnett NW (2014). Tachykinins and their receptors: contributions to physiological control and the mechanisms of disease. Physiol Rev. 94: 265-301. 84

Stewart JP, Kipar A, Cox H, Payne C, Vasiliou S, Quinn JP (2008). Induction of tachykinin production in airway epithelia in response to viral infection. PLoS ONE 3: e1673. Su X, Camerer E, Hamilton JR, Coughlin SR, Matthay MA (2005). Protease-activated receptor-2 activation induces acute lung inflammation by neuropeptidedependent mechanisms. J Immunol. 175: 2598–605. Szabó Á, Helyes Zs, Sándor K, Bite A, Pintér E, Németh J, Bánvölgyi A, Bölcskei K, Elekes K, Szolcsányi J (2005). Role of TRPV1 receptors in adjuvant-induced chronic arthritis: in vivo study using gene-deficient mice. J Pharmacol Exp Ther. 314: 111–9. Szallasi A, Cortright DN, Blum CA, Eid SR (2007). The vanilloid receptor TRPV1: 10 years from channel cloning to antagonist proof-of-concept. Nat Rev Drug Discov. 6: 357-72. Szolcsanyi J (1996). Capsaicin-sensitive sensory nerve terminals with local and systemic efferent functions: facts and scopes of an unorthodox neuroregulatory mechanism. Prog Brain Res. 113: 343-59. Szolcsányi J, Helyes Zs, Oroszi G, Németh J, Pintér E (1998a). Release of somatostatin and its role in the mediation of the anti-inflammatory effect induced by antidromic stimulation of sensory fibres of rat sciatic nerve. Br J Pharmacol. 123: 936-942. Szolcsányi J, Pintér E, Helyes Zs, Oroszi G, Németh J (1998b). Systemic antiinfammatory effect induced by counter-irritation through a local release of somatostatin from nociceptors. Br J Pharmacol.125: 916-922. Szolcsanyi J, Szallasi A, Szallasi Z, Joo F, Blumberg PM (1990). Resiniferatoxin: an ultrapotent selective modulator of capsaicin-sensitive primary afferent neurons. J Pharmacol Exp Ther. 255: 923-8. Takeba Y, Suzuki N, Takeno M, Asai T, Tsuboi S, Hoshino T, Sakane T (1997). Modulation of synovial cell function by somatostatin in patients with rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 40: 2128-38. Tauber S, Paulsen K, Wolf S, Synwoldt P, Pahl A, Schneider-Stock R, Ullrich O (2012). Regulation of MMP-9 by a WIN-binding site in the monocyte-macrophage system independent from cannabinoid receptors. PLoS One. 7: e48272. Tauer U, Zhao Y, Hunt SP, Culman J (2012). Are biological actions of neurokinin A in the adult brain mediated by a cross-talk between the NK1 and NK2 receptors? Neuropharmacology. 63: 958-65.

85

Tominaga M, Caterina MJ, Malmberg AB, Rosen TA, Gilbert H, Skinner K, Raumann BE, Basbaum AI, Julius D (1998). The cloned capsaicin receptor integrates multiple pain-producing stimuli. Neuron. 21: 531-543. Treede R-D, Magerl W (2000). Multiple mechanisms of secondary hyperalgesia. Prog Brain Res. 129: 331–41. Uematsu T, Sakai A, Ito H, Suzuki H (2011). Intra-articular administration of tachykinin NK1 receptor antagonists reduces hyperalgesia and cartilage destruction in the inflammatory joint in rats with adjuvant-induced arthritis. Eur J Pharmacol. 668: 163-8. Urban LA, Fox AJ (2000). NK1 receptor antagonists--are they really without effect in the pain clinic? Trends Pharmacol Sci. 12: 462-4. Vanderschueren D, Laurent MR, Claessens F, Gielen E, Lagerquist MK, Vandenput L, Börjesson AE, Ohlsson C (2014). Sex steroid actions in male bone. Endocr Rev. 9: er20141024. Varga A, Németh J, Szabó Á, McDougall JJ, Zhang C, Elekes K, Pintér E, Szolcsányi J, Helyes Z (2005). Effects of novel TRPV1 receptor antagonist SB266791 in vitro and in vivo in the rats. Neurosci Lett. 385: 137–42. Venkatesha SH, Dudics S, Acharya B, Moudgil KD (2014). Cytokine-Modulating Strategies and Newer Cytokine Targets for Arthritis Therapy. Int J Mol Sci. 16: 887906. Vergnolle N (2005). Protease-activated receptors and inflammatory hyperalgesia. Mem Inst Oswaldo Cruz. 100: 173–6. Vergnolle N, Bunnett NW, Sharkey KA, Brussee V, Compton SJ, Grady EF, Cirino G, Gerard N, Basbaum AI, Andrade-Gordon P, Hollenberg MD, Wallace JL (2001a). Protease-activated receptor-2 and hyperalgesia: a novel pain pathway. Nat Med. 7: 821– 6. Vergnolle N, Wallace JL, Bunnett NW, Hollenberg MD (2001b). Protease-activated receptors in inflammation, neuronal signalling and pain. Trends Pharmacol Sci. 22: 146–52. Wang W, Jian Z, Guo J, Ning X (2014). Increased levels of serum myeloperoxidase in patients with active rheumatoid arthritis. Life Sci. 117: 19-23. Weidler C, Holzer C, Harbuz M, Hofbauer R, Angele P, Schölmerich J, Straub RH (2005). Low density of sympathetic nerve fibres and increased density of brain derived neurotrophic factor positive cells in RA synovium. Ann Rheum Dis. 64: 13-20. 86

Weinberg A, Halpern M, Zahalka MA, Quintana F, Traub L, Moroz C (2003). Placental immunomodulator ferritin, a novel immunoregulator, suppresses experimental arthritis. Arthritis Rheum. 48: 846-853. Yoo S, Lim JY, Hwang SW (2014). Sensory TRP channel interactions with endogenous lipids and their biological outcomes. Molecules. 19: 4708-44. Zhang Y, Lu L, Furlonger C, Wu GE, Paige CJ (2000). Hemokinin is a hematopoieticspecific tachykinin that regulates B lymphopoiesis. Nat Immunol. 1: 392-397. Zimmer A, Zimmer AM, Baffi J, Usdin T, Reynolds K, König M, Palkovits M, Mezey E (1998). Hypoalgesia in mice with a targeted deletion of the tachykinin 1 gene. Proc Natl Acad Sci U S A. 3: 2630-5.

87

AZ ÉRTEKEZÉS ALAPJÁT KÉPEZŐ PUBLIKÁCIÓK Borbély É, Botz B, Bölcskei K, Kenyér T, Kereskai L, Kiss T, Szolcsányi J, Pintér E, Csepregi JZ, Helyes Z (2015). Capsaicin-sensitive sensory nerves exert important antiinflammatory functions in the serum-transfer mouse model of autoimmune arthritis. Brain Behav Immun. 45: 50-9. doi: 10.1016/j.bbi.2014.12.012. (IF: 6.128) Helyes Zs., Sándor K., Borbély É., Tékus V., Pintér E., Elekes K., Tóth D.M., Szolcsányi J., J.J. McDougall (2010). Involvement of Transient Receptor Potential Vanilloid 1 receptors in Protease-Activated Receptor 2-induced joint inflammation and nociception. Eur J Pain. 14: 351-8. (IF: 3.819) Borbély É, Hajna Z, Sándor K, Kereskai L, Tóth I, Pintér E, Nagy P, Szolcsányi J, Quinn J, Zimmer A, Stewart J, Paige C, Berger A, Helyes Z (2013). Role of tachykinin 1 and 4 gene-derived neuropeptides and the neurokinin 1 receptor in adjuvant-induced chronic

arthritis

of

the

mouse.

PLoS

One.

8:

e61684.

doi:

10.1371/journal.pone.0061684. (IF: 3.534) Összesített impact faktor: 13,481 Összes független citáció: 8

88

EGYÉB EREDETI PUBLIKÁCIÓK Hajna Z, Borbély É, Kemény A, Botz B, Kereskai L, Szolcsányi J, Pintér E, Paige CJ, Berger A, Helyes Z (2015). Hemokinin-1 is an important mediator of endotoxininduced acute airway inflammation in the mouse. Peptides. 64: 1-7 (IF: 2.614) Borbély É, Scheich B, Helyes Z (2013). Neuropeptides in learning and memory. Neuropeptides. 47: 439-50. (IF: 2.546) Tékus V, Hajna Z, Borbély É, Markovics A, Bagoly T, Szolcsányi J, Thompson V, Kemény Á, Helyes Z, Goebel A (2014). A CRPS-IgG-transfer-trauma model reproducing inflammatory and positive sensory signs associated with complex regional pain syndrome. Pain. 155: 299-308. (IF: 5.836) Összesített impact faktor: 10,996 Összes független citáció: 5

89

IDÉZHETŐ ABSZTRAKTOK É Borbély, K Bölcskei, K Békefi, A Berger, C J Paige, J J McDougall, A Mócsai, T Németh, M Kovács, E Pintér, J Szolcsányi, Zs Helyes (2014). Hemokinin-1 is a potent inflammatory and pro-nociceptive peptide in acute and chronic mouse arthritis models. Acta Physiol. 211:(s697) pp. 1-61. Éva Borbély, Bálint Scheich, Alexandra Berger, Christopher J Paige, János Szolcsányi, Erika Pintér, Zsuzsanna Helyes (2014). Regulatory role of hemokinin-1 in chronic restraint stress model of mice J Mol Neurosci. 53:((Suppl 1)) pp. S138-S183. Zsuzsanna Helyes, Éva Borbély, Kata Bölcskei, Katinka Békefi, Alexandra Berger, Christopher J Paige, Jason J McDougall, Attila Mocsai, Tamás Németh, Miklós Kovács, Erika Pintér, János Szolcsányi (2014). Hemokinin-1 is a potent inflammatory and pronociceptive peptide in acute and chronic mouse arthritis models. J Mol Neurosci. 53:((Suppl 1)) pp. S138-S183. Borbély É, Hajna Zs, Nabi L, Tékus V, László K, Ollmann T, Karádi Z, Lénárd L, Quinn JP, Berger A, Paige CJ, Keeble J, Szolcsányi J, Pintér E, Helyes Zs (2013). Role of hemokinin-1 and NK1 receptors in anxiety, stress and depression-like behaviour in mice. In: Csillag András (szerk.) XIV. Conference of the Hungarian Neuroscience Society. 282 p. (ISBN:978-963-88224-2-0) Borbely E, Hajna Z, Berger A, Sandor K, Toth I, Kereskai L, Pinter E, Szolcsanyi J, Paige CJ, Quinn JP, Zimmer A, Helyes Z (2012). Hemokinin-1 plays an important role in adjuvant-induced joint and lung inflammation of the mouse. Eur J Clin Invest. 42:(1) p. 66. 1 p. Helyes Z, Borbely E, Sandor K, Markovics A, Pinter E, Szolcsanyi J, Quinn JP, McDougall JJ (2012). Capsaicin-sensitive sensory nerves, TRPV1 receptors and substance P are differentially involved in mast cell tryptase-induced inflammatory processes in the mouse joint Eur J Clin Invest. 42:(1) p. 63. 1 p.

90

Kemeny A, Boros M, Borbely E, Hajna Z, Setalo G, Pinter E, Szolcsanyi J, Helyes Z (2012). Cytokine profiling of inflamed mouse tissues obtained from different in vivo models. Eur J Clin Invest. J Mol Neurosci. 48:(1) p. S199. 1 p. Markovics A, Borbely E, Nagy P, Sandor K, Toth I, Kereskai L, Berger A, Paige C, Pinter E, Zimmer A, Szolcsanyi J, Quinn JP, Helyes Z (2012). Role of tachykinins in mouse models of chronic inflammatory and degenerative joint diseases. J Mol Neurosci. 48:(1) pp. S198-S199. Scheich B, Kormos V, Tékus V, Hajna Zs, Borbély É, Gaszner B, László K, Lénárd L, Karádi Z, Pintér E, Szolcsányi J, Helyes Zs (2012). A szomatosztatin 4 receptor szerepének vizsgálata funkcionális tesztekkel és C-FOS immunhisztokémiával szorongás és depresszió-szerű viselkedés egérmodelljeiben. In: Dr. Csernoch László (szerk.) A Magyar Élettani Társaság, a Magyar Anatómusok Társasága, a Magyar Biofizikai Társaság és a Magyar Mikrocirkulációs és Vaszkuláris Biológiai Társaság Kongresszusa. p. 175. Borbély É, Sándor K, Markovics A, Pintér E, Szolcsányi J, Quinn J P, McDougall J J, Helyes Zs (2011). Role of capsaicin-sensitive sensory nerves and techykinins in mast cell tryptase-induced acute arthritis of the mouse. Acta Physiol. 202:(Suppl. 684.) p. 16. Kemény Á, Boros M, Borbély É, Hajna Zs, Sétáló Gy, Pintér E, Szolcsányi J, Helyes Zs (2011). Cytokine Profiling in different inflammatory in vivo mice models. Acta Physiol. 202:(Suppl. 684) pp. 53-54. Markovics A, Borbély E, Nagy P, Sándor K, Tóth I, Kereskai L, Berger A, Paige C, Pintér E, Zimmer A, Szolcsányi J, Quinn J P, Helyes Zs (2011). Role of tahykinins in mouse models of chronic inflammatory and degenerative joint diseases. Acta Physiol. 202:(Suppl. 684.) pp. 74-75. Borbély É, Hajna Z, Simon G, Berger A, Paige C, Quinn J, Pintér E, Szolcsányi J, Helyes Z (2011). Investigation of the role of preprotachykinin A and C (TAC1 and 4) gene-derived peptides in anxiety, stress and depression-like behaviour in mice. Front Neurosci. p. online. 91

Hajna Z, Borbély É, Quinn JP, Zimmer A, Pintér E, Szolcsányi J, Helyes Z (2011). Role of preprotachykinin A (TAC1) gene-derived peptides and the neurokinin 1 (NK1) receptor in acute nocifensive behaviours and hyperalgesia. Front Neurosci. p. online. Összes független citáció: 2

92

KONGRESSZUSI SZÓBELI ELŐADÁSOK JEGYZÉKE Éva Borbély, Katalin Sándor, István Tóth, László Kereskai, Alexandra Berger, Erika Pintér, János Szolcsányi, John P. Quinn, Christopher J. Paige, Andreas Zimmer, Zsuzsanna Helyes: Role of tachykinin 1 and 4 gene-derived neuropeptides and the neurokinin 1 receptor in adjuvant-induced arthritis of the mouse 31st Winter Neuropeptide Conference, Liverpool, UK 2011. Borbély Éva: A preprotachykinin A és C (TAC1 és TAC4) gén-kódolt neuropeptidek szerepének vizsgálata szorongás, stressz és depresszió-szerű viselkedés egérmodelljeiben Korányi Frigyes Szakkollégium XVI. Tudományos Fóruma, Budapest 2011. (2. helyezés) Zsuzsanna Helyes, Éva Borbély, Katalin Sándor, Adrienn Markovics, Erika Pintér, János Szolcsányi, John P Quinn, Jason J McDougall: Capsaicin-sensitive sensory nerves, TRPV1 receptors and tachykinins play important roles in mast cell tryptaseinduced arthritis and hyperalgesia 17th Scientific Symposium of the Austrian Pharmacological Society, Innsbruck, Austria, 2011. Borbély É, Hajna Zs, Berger A, Sándor K, Tóth I, Kereskai L, Pintér E, Szolcsányi J, Paige CJ, Quinn JP, Zimmer A, Helyes Zs: Hemokinin-1 plays an important role in adjuvant-induced joint and lung inflammation of the mouse 46th Annual Scientific Meeting of the European Society for Clinical Investigation, Budapest, 2012. Helyes Zsuzsanna, Dezső-Tékus Valéria, Hajna Zsófia, Borbély Éva, Kormos Viktória, Botz Bálint, Gaszner Balázs, Nagy Péter, Bölcskei Kata, Szolcsányi János: Neuropátiás állapotok állatkísérletes modellezése: szenzoros, motoros és vaszkuláris működések vizsgálati lehetőségei Magyar Élettani Társaság, a Magyar Anatómusok Társasága, a Magyar Biofizikai Társaság és a Magyar Mikrocirkulációs és Vaszkuláris Biológiai Társaság Kongresszusa, Debrecen, 2012. Éva Borbély, Zsófia Hajna, Alexandra Berger, Katalin Sándor, István Tóth, László Kereskai, Erika Pintér, János Szolcsányi, Christopher J. Paige, John P. Quinn, Andreas Zimmer, Zsuzsanna Helyes: Role of hemokinin-1 in murine adjuvant-induced joint and lung inflammation I. International Doctoral Workshop of Natural Sciences, Pécs 2012. (2. helyezés) 93

Borbély Éva, Botz Bálint, Kiss Tamás, Pintér Erika, Szolcsányi János, Németh Tamás, Mócsai Attila, Helyes Zsuzsanna: A kapszaicin-érzékeny érzőideg-végződések szerepének vizsgálata immunarthritis egérmodelljében Magyar Élettani, Farmakológiai és Mikrocirkulációs Társaságok 2013. Évi Közös Tudományos Kongresszusa, Budapest, 2013. Helyes Zs, Borbély É, Botz B, Tékus V, Hajna Zs, Sándor K, Markovics A, Pintér E, Szolcsányi J, Quinn JP, Berger A and McDougall JJ: Role of capsaicin-sensitive afferents and sensory-immune interactions in arthritis Neuroinflammation, Prága, Csehország, 2013. Helyes Zsuzsanna, Borbély Éva, Botz Bálint, Mócsai Attila, Németh Tamás, Kovács Miklós, Kereskai László, Bölcskei Kata, Pintér Erika, Kenyér Tibor, Szolcsányi János: A kapszaicin-érzékeny érzőideg-végződések komplex szabályozó szerepe szérumtranszfer arthritis egérmodelljében Erdélyi Múzeum-Egyesület Orvos- és Gyógyszerész-Tudományi Szakosztály XXIV. Tudományos Ülésszak, Marosvásárhely, Románia, 2014. É. Borbély, K. Bölcskei, K. Békefi, A. Berger, C. J. Paige, J. J. McDougall, A. Mócsai, T. Németh, M. Kovács, E. Pintér, J. Szolcsányi, Zs. Helyes: Hemokinin-1 is a potent inflammatory and pro-nociceptive peptide in acute and chronic mouse arthritis models Joint Meeting of the Federation of European Physiological Societies (FEPS) and the Hungarian Physiological Society; Budapest, 2014. Zsuzsanna Helyes, Éva Borbély, Kata Bölcskei, Katinka Békefi, Alexandra Berger, Christopher J. Paige, Jason J. McDougall, AttilaMocsai, Tamás Németh, Miklós Kovács, Erika Pintér, János Szolcsányi: Hemokinin-1 is a potent inflammatory and pronociceptive peptide in acute and chronic mouse arthritis models 20th International Symposium on Regulatory Peptides (REGPEP2014), Kyoto, 2014.

94

Helyes Zsuzsanna, Scheich Bálint, Borbély Éva, Vincze Patrícia, Menghis Awt, Keeble Julie, Szolcsányi János: Krónikus fájdalom és stressz kapcsolatrendszereinek komplex vizsgálata egérmodellekben A Magyarországi Fájdalom Társaság 2014. évi kongresszusa és a IV. Neurostimulációs Szimpózium a Magyar Neurológiai Társaság részvételével, Pécs, 2014. dr. Borbély Éva: A hemokinin-1 fontos szerepet játszik akut és krónikus stressz és depresszió-szerű viselkedésben Pécsi Tudományegyetem Idegtudományi Centrum és Szentágothai János Kutatóközpont PhD és TDK konferencia, Pécs, 2014. (1. helyezés) dr. Borbély Éva: A hemokinin-1 fontos szerepet játszik akut és krónikus stressz és depresszió-szerű viselkedésben 3. Pécs-Oklahoma Symposium, Pécs, 2014.

95

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Ezúton szeretném megköszönni témavezetőmnek, Dr. Helyes Zsuzsannának azt a rengeteg segítséget, megértést és támogatást, amit az itt eltöltött idő alatt, úgy a TDK-s, mint a PhD-s évek során kaptam. Köszönöm, hogy rendkívüli kitartásával, és semmihez nem fogható lelkesedésével megmutatta a kutatómunka szépségeit, és hogy nem csak szakmai, de az élet minden területén számíthattam és számíthatok a segítségére. Köszönetemet fejezem ki Dr. Pintér Erikának, a doktori iskola vezetőjének és intézetvezetőnknek, hogy mind a kutató- mind az oktató munkámban támogatott. Köszönettel tartozom Dr. Sándor Katalinnak, akitől a kutatómunka gyakorlati oldalát sajátíthattam el, kivételes szorgalma és precizitása példaértékű volt számomra. Köszönöm szobatársaimnak, Dr. Hajna Zsófiának és Dr. Tékus Valériának a munkában és még inkább a mindennapokban nyújtott rengeteg segítséget és türelmet, amivel segítették a kutatást és e dolgozat létrejöttét. Köszönettel tartozom Dr. Botz Bálint, Dr. Bölcskei Kata, Dr. Kemény Ágnes és Kiss Tamás kollégáimnak a kísérletek során nyújtott rengeteg segítégért, Kenyér Tibor, Hunyady Ágnes, Békefi Katinka és Tóth István diákköröseimnek pedig a lelkes és szorgalmas munkájukért. Köszönöm Dr. Scheich Bálint és Dr. Szőke Éva kollégáimnak, hogy mindig számíthattam szakmai és baráti segítségükre és támogatásukra. Köszönöm PhD hallgató társaimnak, hogy inspiráló és vidám légkörben végezhettem munkámat. Köszönetet szeretnék mondani Perkecz Anikónak, aki kiváló minőségű szövettani metszetek készítésével, Szentes Nikolettnek, Ömböli Dórának és Bagoly Teréznek, akik asszisztensi munkájukkal járultak hozzá kísérleteink sikerességéhez, valamint Dr. Kereskai Lászlónak a szövettani metszetek értékeléséért. Szeretnék köszönetet mondani Dr. Szolcsányi János professzorúrnak aki követendő pédát mutatott a kutatói pálya iránti elhivatottságból és lelkesedésből, Dr. Pethő Gábor és Dr. Barthó Loránd professzornak pedig, hogy lehetővé tették és támogatták oktatómunkámat. Köszönöm külföldi kollaborátorainknak, John Quinn professzornak, Jason J. McDougall-nek és Alexandra Berger-nek, hogy rendelkezésünkre bocsátották a génhiányos egértörzsek tenyészpárjait, segítséget nyújtottak a kéziratok megírása során illetve hogy kísérletsorozataink folytatásában is számíthatunk együttműködésükre. Végül szeretném megköszönni családomnak azt a sok türelmet, önfeláldozó segítséget és támogatást, amely nélkül e dolgozat nem jöhetett volna létre.

96

SZENZOROS-IMMUN INTERAKCIÓK SZEREPÉNEK VIZSGÁLATA ÍZÜLETI GYULLADÁS ÁLLATKÍSÉRLETES MODELLJEIBEN. Doktori (PhD) - értekezés. dr

Recommend Documents