Tudományos Diákköri Dolgozat
VARGA VIKTÓRIA EVELIN
Száraztészták tojástartalmának meghatározása ELISA-val
Témavezető: Eke Zsuzsanna, PhD Analitikai Kémia Tanszék Elválasztástechnikai Kutató és Oktató Laboratórium
Eötvös Loránd Tudományegyetem Természettudományi Kar Budapest, 2011
-1-
Tartalomjegyzék 1. 2.
Bevezetés .................................................................................................... 3 Irodalmi áttekintés ........................................................................................ 4 2.1 A tojás összetétele .................................................................................... 4 2.1.1 A tojásfehérje ..................................................................................... 4 2.1.2 A tojássárgája .................................................................................... 4 2.2 Száraztészták tojástartalmának meghatározása ............................................ 5 2.2.1 Koleszterintartalom meghatározása ....................................................... 5 2.2.2 Tojásfehérjék meghatározása ............................................................... 6 2.2.3 Keverék módszerek ............................................................................. 7 2.3 Az ELISA ................................................................................................. 7 3. Célkitűzés ...................................................................................................11 4. Kísérleti rész................................................................................................12 4.1 Anyagok és eszközök ................................................................................12 4.1.1 ELISA kit ...........................................................................................12 4.1.2 További felhasznált eszközök ...............................................................12 4.1.3 Minták .............................................................................................13 4.1.3 A tészták készítése ............................................................................14 4.2 Mintaelőkészítés .......................................................................................15 4.3 A teszt menete ........................................................................................17 4.4 Az eredmények kiértékelése ......................................................................17 5. Saját eredmények ........................................................................................19 5.1 Saját készítésű tészták .............................................................................19 5.2 Bolti tészták ............................................................................................20 5.3 Különböző tojásokkal késztett tészták .........................................................22 5.5 Problémák magas tojástartalmú száraztészták esetén ...................................26 Köszönetnyilvánítás ..............................................................................................30 Irodalomjegyzék ...............................................................................................31
-2-
1.
Bevezetés
A száraztészták a Magyar Élelmiszerkönyv (MÉK) szabályai szerint Triticum aestivum (közönséges búza) vagy Triticum durum (durum búza) őrleményből, tojásból vagy a nélkül, víz és esetleg egyéb élvezeti- vagy tápértékjavító adalékanyagok hozzáadásával készülhetnek [1]. A tojás felhasználásával készült tészták minősége, fizikai és élvezeti tulajdonságaik legfőképpen tojástartalmuktól függ, továbbá a tojás számos, az emberi szervezet számára fontos ásványi anyagot is tartalmaz. A vásárlók számára ezért nagyon fontos, hogy tudják, tényleg olyan minőségű száraztészta készítményt
vásárolnak, mint
amilyennek az
a
csomagoláson
fel
van
tüntetve.
Minőségellenőrzési szempontból tehát mindezek miatt fontos, hogy a megfelelő analitikai módszerekkel pontosan meg tudjuk határozni e termékek tojástartalmát. A tojás felhasználásával készült tésztáknak a Magyar Élelmiszerkönyv [1] előírása szerint legalább annyi darab tojást – egy darab tojás ebben az esetben 45 g héj nélküli tojást jelent - kell tartalmazniuk száraztészta kg-onként, ahány tojásosnak a tészta a csomagoláson fel van tüntetve. Ennek az ellenőrzésére megfelelően pontos analitikai módszer kidolgozása még manapság is kihívást jelent.
-3-
2.
Irodalmi áttekintés
2.1
A tojás összetétele
A tojás, a C-vitamin kivételével, tartalmaz minden az emberi szervezet számára szükséges tápanyagot. Alapvetően három részből áll: tojáshéj (~10%), tojásfehérje (~60%) és tojássárgája (~30%) [2]. A tojás alkotórészeinek összetétele kis mértékben változhat a tojás méretével. Nagyobb mértékű eltérések figyelhetők meg egyes komponensek esetén a különböző tyúkok tojásai között illetve még inkább különböző fajtájú tyúkok tojásainak összehasonlításakor [3].
2.1.1 A tojásfehérje A
tojásfehérje
nagyrészt
vizet,
ezen
kívül
főleg
fehérjéket
valamint
kis
mennyiségben ásványi anyagokat és szénhidrátokat tartalmaz. A fehérje frakció főbb alkotóelemei a következőek: ovalbumin, conalbumin vagy ovotranszferrin, ovomucoid, lizozim, ovomucin, avidin, ovoglobulinok, ovoinhibitor és flavoproteinek [3]. Néhány fehérje antibakteriális hatású, aminek a tojások költési ideje alatti mikrobiális invázió elleni védekezésben van fontos szerepe. Ezek a mechanizmusok az emberi fogyasztásra szánt tojásoknál is ugyanilyen hatásosan működnek. A tojásfehérje egyáltalán nem tartalmaz zsírokat. A tojásfehérje vitamin tartalma könnyen módosítható a szárnyas étrend
vitamintartalmának
módosításával.
Az
ásványi
anyag
tartalma
szintén
módosítható. Az fehérjék aminosav összetétele is módosítható a szárnyasok étrendjének módosításával [2].
2.1.2 A tojássárgája A tojássárgája mindössze 48% vizet tartalmaz. A többi része két harmad részt zsírokat, egy harmad részt fehérjéket, valamint kis mennyiségben ásványi anyagokat és szénhidrátokat tartalmaz. A tojássárgája lipoproteinek keveréke, kivétel a foszvitin, ami egy foszfoprotein és nincs lipid része [2]. A tojássárgájában a fehérjetartalom körülbelül 16%, a lipid tartalom 32%-35%-ig változik a tyúk fajtájától függően. A lipid frakció körülbelül 66%-a trigliceridekből, 28%-a foszfolipidből, 5% koleszterinből és további kis mennyiségű egyéb lipidekből áll [4]. A zsírsavösszetétel változtatható, ha az állat
-4-
étrendjét különböző összetételű zsírokkal egészítjük ki [5,6,7]. A tojásban a koleszterin csak a tojássárgájában van jelen. A koncentrációja szárnyasonként különbözik. A tojás méretével a koleszterin tartalma is magasabb. A tojássárgájának a vitamin és ásványi anyag összetétele is megváltoztatható az étrend módosításával [2].
2.2
Száraztészták tojástartalmának meghatározása
A száraztészták tojástartalmának meghatározását számos különböző módszerrel végezték már. Ezek között leggyakoribbak, amelyek tészta egyes komponenseinek, különböző
elválasztástechnikai
módszerekkel
történő
meghatározásán
alapulnak.
Előfordult már erre a célra teljesen új módszer ismertetése is, mint például a Fourier transzformációs közeli infravörös (FT-NIR) spektroszkópia [8]. Magyarországon a MSZ 20500/4-87 szabvány [9] száraztészták tojástartalmának meghatározására alkalmazható analitikai módszereket ismertet: egy gyors, nyers zsírtartalom
alapú
meghatározást,
valamint
a
döntő,
koleszterin
tartalom
meghatározásán alapuló mérési módszert.
2.2.1 Koleszterintartalom meghatározása A
száraztészták
tojástartalmának
meghatározására
leginkább
a
koleszterintartalom mérésén alapuló módszereket alkalmaznak [10-13]. A száraztészták koleszterin tartalmának meghatározása többféle módszerrel történt már. Az legelőször alkalmazott módszerek egyike a Liebermann-Burchard-féle színreakció volt [9]. Azóta koleszterintartalom
mérés
végezték
már
folyadékkromatográfiával
[20,21],
spektrofotometriásan [22], de a gázkromatográfiával történő mérés a leginkább alkalmazott módszer erre a célra [10-13]. Számos alkalommal bizonyították már, hogy a tojás koleszterin tatalma széles tartományon belül változik. Ezt befolyásolja a baromfival etetett táp összetétele, a tyúk fajtája, tartásának módja [23,24]. A tyúk kora szintén befolyásolja a tojás koleszterin tartalmát. Ez a hatás annak tudható, hogy a tojássárgája a baromfi
korának
előrehaladtával egyre nagyobb lesz. A tojás koleszterin koncentrációját főként a táplálék módosításával lehet változtatni [2]. A tojás koleszterintartalma akár a 170-1970 mg/100 g héj nélküli tojás tartományon belül is változhat [19]. A koleszterintartalom mérése alapján történő tojástartalom meghatározás tehát önmagában nem megbízható.
-5-
2.2.2 Tojásfehérjék meghatározása A tojás alkotóelemei közül, a koleszterinen kívül egyes tojásfehérjék mennyiségi meghatározását is ismertették már különböző élelmiszerekből (sajtok, borok, snack-ek, mirelit készételek) [14-18]. A tojás számos allergén fehérje fő forrása. Ezeknek a fehérjéknek a különféle élelmiszerekből történő kimutatása ezért is nagyon fontos. Mérésükre,
az
élelmiszerek
tojástartalmának
meghatározására
való
estleges
alkalmazhatóságán túl, ezért is irányul külön figyelem. Az
allergén
tojásfehérjék
élelmiszerekből
történő
kimutatása
végezhető
elektroforézissel [25], tömegspektrometiával [26], folyadékkromatográfiával [14] és immunoesszékel [16,17]. Ezek közül az ELISA különös figyelmet érdemel, egyszerű kivitelezhetősége, magas érzékenysége és specifikussága miatt. Létezik csak kvalitatív és kvantitatív formája is. Az ovalbumin csak a tojásban előforduló és ott a legnagyobb mennyiségben jelen lévő fehérje. Z. H. Reed és munkatársai [27] indirekt ELISA-val határozták meg az ovalbumin mennyiségét rákfalatkákban, egérben termeltetett ovalbuminra specifikus monoklonális antitestek felhasználásával. Y. Watanabe és munkatársai [28] szintén ovalbumin mennyiségi meghatározását végezték el különféle élelmiszer mintákból ovalbuminra specifikus antitesteket alkalmazó szendvics ELISA-val. A lizozim egy másik, a tojásban megtalálható szintén allergén fehérje. Gram pozitív baktériumok sejtfalára gyakorolt lítikus hatása miatt az élelmiszeriparban gyakran tartósítószerként
alkalmazzák.
Számos,
akár
tojás
felhasználása
nélkül
készült
élelmiszerben, mint például sajtokban és borokban is megtalálhatjuk a gyártás során alkalmazott tartósítási folyamatok maradványaként. A gyártási folyamat végeztével viszont jelenlétük általában, főként allergénhatásuk miatt, az előírások szerint már nem kívánatos ezekben a termékekben [6]. Az első kísérletek melyek a lizozim detektálására és mennyiségi meghatározására irányultak, főként a lizozim lítikus aktivitásának mérésén alapuló
mikrobiológiai
SDS-gélelektroforézissel
módszerek
voltak
[16]
éppen
vagy
másrészről
mérését
MALDI-TOF-MS-sel
is
végezték [26].
már
Mindezen
módszerek kivitelezése viszont bonyolult, ráadásul túlzottan anyag- és időigényesek, tehát
nem
megfelelőek
meghatározása
rutin
komplex
analízis
céljából.
Lizozim
élelmiszermátrixokból,
kvalitatív
ugyanakkor
és
kvantitatív elvégezhető
folyadékkromatográfiával vagy ELISA-val is [14,16,17].
-6-
Keverék módszerek
2.2.3
A közelmúltban történt olyan összetett kísérlet, amelyben párhuzamosan több tojás alkotórész
(lizozim
zsírsavösszetétel)
tartalom,
mérését
koleszterin
végezték
el
tartalom,
száraztésztából
teljes és
zsírtartalom
ezeknek
a
és
mérési
eredményeknek a felhasználásával számolták ki a száraztészták tojástartalmát [19].
2.3
Az ELISA
Az ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) széles körben alkalmazott technika a különböző humán allergének élelmiszerekből történő kimutatására és mennyiségének meghatározására. Ennek oka a módszer egyszerűsége, specifikussága és érzékenysége. Könnyen standardizálható és automatizálható, ami nagy mennyiségű minta vizsgálatát teszi lehetővé. Számos élelmiszerallergén kvalitatív és kvantitatív meghatározására alkalmas, kereskedelmi ELISA készlet létezik már. Egyes ELISA-k bizonyos fehérje csoportokat detektálnak, míg mások akár lehetnek csak egyetlen fehérjére specifikusak [29, 30]. Az ELISA egy immunanalitikai módszer, mely során enzimreakció segítségével történik a mintában jelen lévő antigén vagy antitest detektálása. Az ELISA technikának számos változata létezik. Az élelmiszer vizsgálatok esetén a két leggyakrabban alkalmazott típusú ELISA, az indirekt- és a szendvics ELISA. Az ELISA végrehajtása legtöbbször 16x8 darab azonos térfogatú cellát tartalmazó műanyag tálcán, úgynevezett microtiter plateken történik. Léteznek olyan kiszerelésű kitek is, melyek a cellákat és a cellatartót külön tartalmazzák. A cellák szükség esetén törhetők a minta darabszámának megfelelően és a cellatartóba illeszthetők (1. ábra).
-7-
1. ábra: 16x8 darab helyet tartalmazó cellatartó tálca. A képen 17 db kivehető cella látható benne. A szendvics ELISA során (2. ábra) az antigénre, vagyis a mintában lévő meghatározandó anyagra specifikus antitestek minden egyes lyukban, ugyanannyi mennyiségben a szilárd fázis felszínéhez vannak rögzítve. A minta hozzáadásakor a benne lévő, kimutatni kívánt antigének specifikusan kötődnek az antitestekhez. Ezután rendszerint mosási lépésekkel eltávolítjuk a minta egyéb nem kötődött felesleges komponenseit. Majd egy második, enzimkapcsolt antitest hozzáadása következik, amely az antigén egy másik epitópjához (antigén molekula antitestkötő helye) kötődik specifikusan. Így az antigénünk szendvicsszerűen a két antitest közé lesz zárva. Majd végül a második antitesthez kapcsolt enzim kromogén szubsztrátjának a hozzáadása következik, melynek enzimatikus átalakítását színváltozás kíséri. A végén a reakciót gyenge savval leállítjuk, majd fotometriás mérés következik. Minél több antigént tartalmazott a mintánk a kapott szín annál erősebb, tehát a mért jel arányos lesz a mért anyag
mintabeli
koncentrációjával.
A
kvantifikálás
a
target
molekula
ismert
koncentrációjú oldatának hígítási sorából mért abszorbancia után készült standard görbe alapján történik.
-8-
1.
2.
3.
4.
2. ábra: A szendvics ELISA sémája. 1. Antitestek a felszínhez immobilizálva. 2. A mintában lévő antigének specifikusan kötődnek az antitestekhez. 3. Az antigén másik epitópjára specifikus enzimkonjugált antitest kötődése. 4. Kromogén szubsztrát hozzáadása és színreakció Az indirekt ELISA kissé eltérő (3. ábra). A mikrotiter plate-en lévő lyukak felszínére antigének vannak kikötve. A mintában jelen lévő, kimutatni kívánt antitestek ezekre az antigénekre specifikusak és az inkubáció során ennek megfelelően kötődni fognak hozzájuk. Ezután, a kötődött antitestre specifikus, úgynevezett másodlagos antitest hozzáadása következik. A másodlagos antitest egy enzim konjugátum. Végső lépésként itt is az enzim szubsztrátjának hozzáadása történik, amit színváltozás kísér, majd az enzimreakció leállítása következik. A kialakult szín itt a mintában jelenlévő antitest mennyiségével egyenesen arányos. Olyan változata is lehet, amikor az antigént akarjuk kimutatni, ez ugyanezen az elven történik, csak ekkor először a mintában jelenlévő antigéneket mi rögzítjük a szilárd fázis felszínéhez.
1.
2.
3.
4.
3. ábra: Az indirekt ELISA sémája. 1. Antigének a felszínhez immobilizálva. 2. A mintában lévő antitestek specifikusan kötődnek az antigénekhez. 3. Az elsődleges antitestre specifikus, úgynevezett másodlagos, enzimkonjugált antitest kötődése. 4. Kromogén szubsztrát hozzáadása és színreakció
-9-
A fehérjék komplex élelmiszermátrixokból ELISA-val történő meghatározásakor kapott értékek nagymértékben torzíthatak. Ennek többféle oka is lehet. Előfordulhat fals negatív eredmény az élelmiszer mátrixból történő nem megfelelő extrakció esetén. Az ELISA csak intakt fehérjék kimutatására alkalmas, ezért ha egy fehérje, akár csak limitált mértékben is,
de
hidrolizálva
van,
előfordulhat,
hogy
megszűnik
vele
szemben
az
ELISA
immunreaktivitása. A meghatározandó fehérjék illetve annak, az ELISA szempontjából fontos
epitópjai
kémiailag
módosulhatnak
egyes
élelmiszereknél
az
élelmiszer
feldolgozási folyamatok során, ami szintén a teszt immunreaktivitásának csökkenéséhez vezethet [29]. Előfordulhat, hogy a kimutatni kívánt fehérje interakcióba lép az élelmiszermátrix egyéb komponenseivel. Ez immunogenitásának csökkenését okozhatja, ezért nem kerül detektálásra. Az élelmiszermátrix egyéb komponensei keresztreakcióba is léphetnek a kimutatni kívánt fehérjékre specifikus antitestekkel, ami fals pozitív eredményt
okoz.
A
száraztészta
egy
viszonylag
egyszerű
élelmiszermátrix
(lásd 1. fejezet). A mátrixkomponensek esetleges keresztreakcióinak és a kimutatni kívánt fehérjékkel való interakcióknak a valószínűsége ezért jelentősen kisebb.
- 10 -
3.
Célkitűzés
Magyarországon,
megfelelően
pontos
analitikai
módszer
a
száraztészták
tojástartalmának meghatározására a mai napig kihívást jelent. Egyértelmű azonban, hogy bármely a célnak megfelelő analitikai módszer alapja valamely tojásra jellemző összetevő
mérése
kell,
hogy
legyen.
Az
élelmiszerek
tojásfehérje
tartalmának
meghatározására gyakran ELISA alkalmaznak. Ez a módszer egyszerű, érzékeny és nagyon specifikus. Könnyen standardizálható és automatizálható, ami nagy mennyiségű minta vizsgálatát teszi lehetővé. Ezért célkitűzésem az volt, hogy egy, a tojásfehérjék különböző élelmiszerekből történő megahatározására való standardizált ELISA kit használatával kiderítsem, hogy a több tojásfehérjére specifikus ELISA alkalmas lehet e száraztészták tojástartalmának meghatározására.
- 11 -
4.
Kísérleti rész
4.1
Anyagok és eszközök
4.1.1 ELISA kit A méréseket a Ridascreen FAST Ei/Egg protein (R-Biopharm, Németország) ELISA kittel végeztem. Ez különböző élelmiszerekből (tészták, salátaöntetek, borok, kenyér, fagylalt) történő tojástartalom kvantitatív meghatározására szolgáló szendvics ELISA. A tojástartalom meghatározás a 2.3-es fejezet szendvics ELISA-ra vonatkozó részben leírt elv alapján történik. A microtiter plate-eken lévő lyukak felszínére ovomucoid, ovalbumin ovotranszferrin
és
lizozim
mennyiségének
mérésével
specifikus határozzuk
antitestek meg
a
vannak
rögzítve.
tojástartalmat.
A
Ezen teszt
fehérjék végén
a
szubsztrát/kromogén oldat hozzáadásakor az enzim konjugátum a kromogént kék színű termékké alakítja át, majd a stop
raegens hozzáadása kékről
sárgára történő
színváltozást okoz. A mérés fotometriásan történik, 450 nm-en. Az abszorbancia a minták tojásfehérje tartalmával arányos. Egy Ridascreen FAST Ei/Egg protein ELISA kit a következő reagenseket tartalmazza: 48 darab tojásfehérje specifikus antitesttel borított cella, cellatartó tálcával (6 darab 8asával kiszerelt törhető cellák) 5 db standard oldat: 0 mg/kg (zero standard), 0,5 mg/kg, 1,5 mg/kg, 4,5 mg/kg és 13,5 mg/kg tojást tartalmazó mintának megfelelő egész tojáspor vizes oldatai. Peroxidáz konjugált antitest (20xos koncentrátum, desztillált vízzel hígítjuk) Szubsztrát/kromogén oldat Extrakciós puffer (10xes koncentrátum, desztillált vízzel hígítjuk) Mosó puffer (10xes koncentrátum, desztillált vízzel hígítjuk) Stop reagens
4.1.2
További felhasznált eszközök
További felhasznált eszközök: Daráló: Grindomix GM200, gyártó: Retsch. ELISA reader: Microplate Reader Model Σ960, gyártó: Metertech, értékelő szoftver: Ridasoft Win 1.5.
- 12 -
Minták
4.1.3
Az egyes kísérleteknél különböző gyártóktól származó, különböző tojástartalmú és alakú száraztészták (3. táblázat), valamint saját kezűleg elkészített száraztészta minták (4. táblázat) mérését végeztem. Ezeket az egyes kísérleteknek megfelelően többféle liszt (1. táblázat) és kétféle tojás (2. táblázat) kombinált felhasználásával készítettem el. 1. táblázat: kísérletek során felhasznált lisztek Liszt jelölése BL BL2 DL
Név
Gyártó/Forgalmazó
Lejárati dátum
Nagyi titka Búzafinomliszt
Pannonmill Malomipari Zrt.
2011.12.14.
SBudget Búzafinomliszt
Sikér Zrt. Bicskei malom
2012.02.05.
Organic Biodurumliszt
Biorganic Kft.
2011.11.16.
Natur Pur Bio Teljes kiőrlésű búzaliszt
SPAR Magyarország kereskedelmi Kft.
2012.02.16.
TKL
2. táblázat: a kísérletek során felhasznált tojások Tojás jelölése T1 T2
Tojás neve
Forgalmazó
Lejárati idő
Tesco Value tojás (10 db-os)
Tesco Zrt.
2011.07.28.
Friss tojás (6db-os)
Biotojás Kft.
2011.08.07.
3. táblázat: gyárilag előállított száraztészta minták Minta neve
Feltüntetett tojástartalom
Tészta formája
S0sz
0
Gyártó
Lejárati dátum
szarvacska
Soós Kft.
2013.05.03.
S4e
4
eperlevél
Soós Kft.
2013.05.16.
S8b
8
boglyas cérna
Soós Kft.
2011.11.29.
S8fm
8
fektetett metélt
Soós Kft.
2013.05.19.
S8fc
8
fektetett cérna
Soós Kft.
2013.04.15.
S8c
8
csiga
Soós Kft.
2013.06.22.
10
cérna
Elyon Kft.
2012.09.07.
E10cs
- 13 -
4. táblázat: a kísérletek során felhasznált saját kezűleg elkészített száraztészta minták:
A1
0,988
Felhasznált tojás jelölése BL T1
A2
1,965
BL
T1
2011.07.25.
A3
3,530
BL
T1
2011.07.12.
A4
3,938
BL
T1
2011.07.25.
A5
5,157
BL
T1
2011.07.12.
A6/1
6,040
BL
T1
2011.07.12.
A6/2
5,857
BL
T1
2011.07.12.
A6/3
6,030
BL
T1
2011.07.12.
A7
6,937
BL
T1
2011.07.12.
A8
7,613
BL
T1
2011.07.25.
A9
9,161
BL
T1
2011.07.12.
A10
8,557
BL
T1
2011.07.25.
B2
1,994
BL
T2
2011.07.28.
B6/1
5,662
BL
T2
2011.07.28.
B6/2
5,573
BL
T2
2011.07.28.
B6/3
5,602
BL
T2
2011.07.28.
B9
8,470
BL
T2
2011.07.28.
C3
3,103
BL2
T2
2011.08.18.
C5
5,152
BL2
T2
2011.08.18.
C8
7,266
BL2
T2
2011.08.18.
D3
2,932
DL
T2
2011.08.18.
D5
5,027
DL
T2
2011.08.18.
D8
7,180
DL
T2
2011.08.18.
E3
3,047
TKL
T2
2011.08.18.
E5
5,097
TKL
T2
2011.08.18.
E8
7,950
TKL
T2
2011.08.18.
Minta jelölése
Pontos tojástartalom (db)
4.1.3
Felhasznált liszt jelölése
Készítés időpontja 2011.07.25.
A tészták készítése
A száraztésztákat úgy készítettem, hogy a tojásokat feltörtem egy külön tálba, majd alaposan felvertem. Ebből a homogenizált tojáskeverékből mértem be az egyes, különböző
tojásos
tésztáknak
megfelelő
mennyiségeket
egy
másik
tálba.
Majd
hozzáadtam az előre bemért megfelelő mennyiségű lisztet. Ezután összegyúrtam a lisztet és a tojást, annyi desztillált víz adagolása közben, amennyi szükséges volt a megfelelő állag eléréséhez. Egy kis lisztet a bemért mennyiségből meghagytam a tészta nyújtásához. Ezt követően kinyújtottam a tésztákat, majd szobahőmérsékleten hagytam
- 14 -
teljesen kiszáradni. Miután teljesen kiszárítottam a tésztákat, egyenként lemértem a pontos tömegüket. A tészták szárítás utáni és a készítés során hozzáadott tojás pontos tömegéből minden esetben visszaszámoltam az 1 kg-ra vonatkoztatott tojástartalmat. A tojástartalmat minden esetben darabszámban adtam meg, ahol az egy darab tojás 45g héj nélküli tojást jelent.
4.2
Mintaelőkészítés
Használat előtt a 10szeres koncentrátum formában kapott extrakciós puffert először 37oC-os vízfürdőbe helyeztem pár percre, hogy az esetleg jelen lévő kristályok feloldódjanak, majd jól összerázva homogenizáltam. Ezután 10szeresére hígítottam desztillált vízzel.
- 15 -
5. táblázat: A protokoll szerinti és a kísérletek során történt mintaelőkészítés leírása Mintaelőkészítés a RIDASCREEN®FAST Ei/Egg Protein ELISA kit-hez
A tojásfehérjék fokozott A kísérletek során elvégzett
extrakciója céljából végzett
mintaelőkészítés
mintaelőkészítés az 5.5-ös
mellékelt használati
fejezetben leírt kísérlet során
utasítás szerint 5g mintát óvatosan
Kb. 5g mintát darálóban
Kb. 5g mintát darálóban
összetörünk, majd teljesen
porszerűre darálunk
porszerűre darálunk
1g-ot mintához hozzáadunk 20
200 mg-ot bemérünk a mintából
100 mg-ot bemérünk a mintából
ml előre felhígított extrakciós
fiolába, hozzáadtam 20 ml előre
fiolába, hozzáadtam 25 ml előre
puffert és 10 percig 60C -os
felhígított extrakciós puffert és
felhígított extrakciós puffert és
vízfürdőben extraháljuk. Az
10 percig 60oC-os vízfürdőben,
10 percig 60oC-os vízfürdőben,
extrakciós puffer hozzáadás
időközönkénti rázogatással
időközönkénti rázogatással
előtt már kb. 60C -ra legyen
extraháltam. Az extrakciós
extraháltam. Az extrakciós
felmelegítve.
puffer hozzáadás előtt már kb.
puffer hozzáadás előtt már kb.
homogenizáljuk
o
o
o
60 C-ra felmelegítettem.
60oC-ra felmelegítettem.
Centrifugálás: 10 perc/2500g
Centrifugálás: 10 perc/2400rpm
Centrifugálás: 10 perc/2400rpm
A mintából 100 µl-t használunk
Mérőlombikban a felülúszóból
A felülúszót átpipettáztam egy
egy mérésnél lyukanként
pipettázott mintát még
üres főzőpohárba, majd a fiola
2000szeresére hígítottam, a
alján maradt mintához ismét
felhígított extrakciós pufferrel
adtam 25 ml előre felmelegített extrakciós puffert
A mintából 100 µl-t használtam
10 percig 60oC-os vízfürdőben,
egy mérésnél lyukanként
időközönkénti rázogatással extraháltam Centrifugálás: 10 perc/2400rpm A felülúszót átpipettáztam az első extrakciós lépés után leszedett felülúszót tartalmazó főzőpohárba. Ezt homogenizáltam, majd mérőlombikban 400szorosára hígítottam a felhígított extrakciós pufferrel A mintából 100 µl-t használtam egy mérésnél lyukanként
A
mintáink
előkészítésénél
az
ELISA
kit
használati
utasításában
leírtaktól
összességében annyiban tértem el, hogy 10.000szeresére hígítottam a mintáimat.
- 16 -
4.3
A teszt menete
Adott kísérletben mért minták számának megfelelő számú cellát egy üres cellatartó tálcába helyeztem. Az első 5 pozícióba felvitt standard sor (lásd: 4.4 fejezet) után következő pozíciókba mintáinkból mértem be 100 µl-eket. Az asztalon tartva kézzel óvatosan megrázogattam a tálcát majd a felvitt standard oldatokat és mintákat inkubáltam 10 percig szobahőmérsékleten. Ha letelt az inkubációs idő a folyadékot egy határozott mozdulattal a kiöntöttem a csapba, majd legalább háromszor hozzácsaptam abszorbens papírhoz erőteljesen, hogy a folyadékot teljesen eltávolítsam a lyukakból. Ezután mosási lépések következtek, a felesleges minta komponensek eltávolítására. Az előzőleg 37oC-os vízfürdőben történő melegítéssel és összerázással szintén homogenizált és 10szeresére hígított mosó pufferből 250 µl-t pipettáztam a lyukakba. Ezt egyből, az előzőhöz azonos módon határozott mozdulattal a csapba öntöttem, majd a tálcát háromszor erőteljesen abszorbens papírhoz csaptam. Ezt a mosási lépést még kétszer megismételtem.
Ezután a lyukakba pipettáztam 100 µl a desztillált vízzel 11szeresére
hígított enzim konjugátumot, finoman az asztalon tartva rázogattam kis ideig a tálcát, majd 10 percig ismét szobahőmérsékleten történő inkubáció következett. Inkubáció után a felesleges folyadékot leöntöttem, abszorbens papírhoz csaptam háromszor a tálcát, majd az előzőekhez hasonlóan megint három egymást követő mosási lépés következik, mindegyiknél 250 µl hígított mosó puffer hozzáadásával. Ezt azért tettem, hogy biztosan eltávolítsam az összes nem kötődött enzim konjugátumot. Ha ezzel végeztem egyből hozzáadtam a lyukakhoz 100 µl szubsztrát/kromogén oldatot, finoman kézzel kissé ráztam a tálcát, majd 10 percig szobahőmérsékleten, sötétben történő inkubáció következett. Ennek a letelte után 100 µl stop reagenst adunk az összes mintánkhoz és standard-ekhez. Ekkor, a kromogén szubsztrát enzimatikus átalakítása miatt már különböző mértékben kék színű mintáim sárga színűek lettek. A színváltozás mértékét fotometriásan mértem 450 nm-en.
4.4
Az eredmények kiértékelése
Az első öt pozícióba minden mérés esetén, a kitben megtalálható öt standard oldatot (0,0ppm; 0,5ppm; 1,5ppm; 4,5ppm és 14,5ppm) pipettáztam és ezekkel ugyanúgy végeztem el a tesztet, mint az összes többi mintával. Ezen standard minták mért abszorbancia értékei alapján, harmadfokú egyenes illesztésével végezte el a Ridawin
szoftver
a
kalibrációt,
és
számította
ki
az
egyes
minták
tojásfehérje
koncentrációit. Ezek után a tésztáknál kapott koncentráció értékeket valós tojástartalmuk
- 17 -
függvényében ábrázoltam. Az ábrázolt pontokra másodfokú egyenest illesztettem, majd ezen egyenes egyenlete alapján kiszámoltam a tészták mért tojástartalmát.
- 18 -
5.
Saját eredmények
5.1
Saját készítésű tészták
Az összes saját készítésű tészta (1. táblázat) egyszerre történő mérése után kapott abszorbancia értékekből számolt tojásfehérje koncentrációkat ábrázoltam a tojástartalom függvényében az 4. ábrán. Azt látjuk, amit várnánk is, hogy a tojásfehérje koncentráció egyenesen arányos a tészták tojástartalmával. Ez alól kivétel a 7 tojásos mintánk (A7), ahol kissé alacsonyabb értéket kaptunk a vártnál.
14 y = 1,1777x + 0,8805 R² = 0,955
Koncentráció (ppm)
12 10 8 6 4 2 0 0
2
4
6
8
10
Tojástartalom (db) 4. ábra: Az 1. táblázatban feltüntetett tésztáknak az abszorbancia értékek alapján, a Ridawin softwer által kiszámolt tojásfehérje koncentrációja az egyes tészták tojástartalmának a függvényében ábrázolva. A pontokra illesztett egyenes egyenlete alapján a tojásfehérje koncentráció értékeket
behelyettesítve,
kiszámoltam
a
tészták
tojástartalmát.
Majd
a
kapott
tojástartalom és az egyes tésztáknál a készítés után kiszámolt pontos tojástartalom alapján kiszámoltam a torzítatlanság értékeket, vagyis hogy hány százalékban egyeznek meg a kapott és a várt tojástartalmak (6. táblázat). Két, külön készített 6 tojásos száraztészta mintát is mértem, az egyik hat tojásosat pedig egyszerre háromszor (A6/1a, A6/1b, A6/1c). Egyazon 6 tojásos tészta háromszori méréseiből kapott tojásfehérje
- 19 -
koncentrációk relatív szórása (RSD%) 3,70%. Az összes 6 tojásos tészta tojásfehérje koncentráció értékeiből kapott RSD% pedig 7,40%. A várt és a kapott tojástartalmak alapján számolt torzítatlanság értékek 79,56% - 118,58% között változnak. 6. táblázat: Saját készítésű tészták mérési eredményei Készített
Pontos
Minta
tészta
jele
megcélzott
tojástartalom
tojástartalma
(db)*
Konc. (ppm)**
Számolt tojástartalom (db)***
Torzítatlanság (%)
A1
1
0,988
1,96
0,917
92,775
A2
2
1,965
3,29
2,046
104,119
A3
3
3,530
5,81
4,186
118,575
A4
4
3,938
6,24
4,551
115,562
A5
5
5,157
6,81
5,035
97,631
A6 /1a
6
6,040
7,98
6,028
99,806
A6/1b
6
6,040
7,84
5,909
97,838
A6 /1c
6
6,040
7,23
5,391
89,262
A6/2
6
5,857
8,66
6,606
112,783
A7
7
6,937
7,38
5,519
79,556
A8
8
7,613
9,39
7,226
94,910
A9
9
9,161
12,28
9,679
105,659
10
8,557
11,54
9,051
105,774
A10
* A tészták szárítás utáni és a készítés során hozzáadott tojás pontos tömegéből visszaszámolt, 1 kg-ra vonatkoztatott pontos tojástartalom. ** A Ridawin szoftver által az abszorbancia értékek alapján számolt tojásfehérje koncentráció *** A 4. ábrán látható egyenes egyenletéből visszaszámolt pontos tojástartalom
5.2
Bolti tészták
A 7. táblázatban szereplő, különböző gyártóktól származó bolti tészta mintákon elvégzett ELISA eredményeinek a kiértékelése után egyáltalán nem a vártnak megfelelő eredményeket kapunk. Szintén ábrázoltam az egyes tészták Ridawin szoftver által kiszámolt koncentráció értékeit a csomagoláson feltüntetett tojástartalmuk függvényében (5. ábra). Ezeknek a tésztáknak az esetében azonban nincs lineáris összefüggés a
- 20 -
tojásfehérje koncentráció és a feltüntetett tojástartalom között, nem illeszthető egyenes az ábrázolt pontokra. A 8 tojásos tésztákból három különböző fajta tésztát is mértem, valamint ezek közül a 8 tojásos boglyas tésztából három ismételt mérést végeztem el (S8b/1, S8b/2, S8b/3). A 8 tojásos boglyas tészta ismételt méréseiből kapott tojásfehérje koncentráció RSD%-a 1,09%. Az összes 8 tojásos tészta tojásfehérje koncentráció eredményeiből számolt RSD%, ami tartalmazza a nyolc tojásos tészták közül kiugróan alacsony értékű fektetett metéltet is, pedig 10,73%
8
Koncentráció (ppm)
7 6 5 4 3 2 1 0 0
2
4
6
8
10
12
Tojástartalom (db) 5. ábra: Az 1. táblázatban feltüntetett bolti tésztáknak az abszorbancia értékek alapján, a Ridawin softwer által kiszámolt tojásfehérje koncentrációja az egyes tészták tojástartalmának a függvényében ábrázolva.
- 21 -
7. táblázat: Bolti tészták mérési eredményei Minta
Tojástartalom
neve
(db)**
Abszorbancia Konc (ppm)***
DL
0
0,042
nem értelmezhető
BL
0
0,039
nem értelmezhető
S4e
4
1,164
4,76
S8b/1
8
1,505
6,49
S8b/2
8
1,502
6,47
S8b/3
8
1,481
6,36
S8fc
8
1,538
6,67
S8fm
8
1,222
5,03
E10c
10
1,237
5,11
** A tészták szárítás utáni és a készítés során hozzáadott tojás pontos tömegéből visszaszámolt, 1 kg-ra vonatkoztatott pontos tojástartalom. *** A Ridawin szoftver által az abszorbancia értékek alapján számolt tojásfehérje koncentráció Csak a saját készítésű tészták esetén kaptam értékelhető, a várthoz közeli eredményeket. A bolti tésztáknál a tojásfehérje koncentráció értékek összefüggéstelen módon változnak a tojástartalommal. Ez több ok miatt is lehet. A gyárilag előállított tésztáknak különböző a lejárati dátumuk. Nagy valószínűséggel előfordulhatott, hogy a különböző tészták gyártásánál az alapanyagokat tekintve történtek olyan változtatások illetve akár adalék anyagok hozzáadása, amelyek befolyásolhatták a mérés eredményét. Az is előfordulhat, hogy ugyanúgy, mint a koleszterin esetében is a 2.2.1-es fejezetben leírt tényezők miatt, a különböző helyekről származó tojások fehérjetartalma is eltérő lehet.
5.3
Különböző tojásokkal késztett tészták
Ahogy az előzőekben már említettem, a totál tojásfehérje tartalom változhat a tojás származása szerint, különböző tényezőktől függően, mint ahogyan pl. a koleszterin tartalmuk is változik. Ezért a következő kísérlet célja az volt, hogy teljesen újonnan vásárolt, más helyekről származó tojásokból elkészített száraztészták ELISA-val történő mérési eredményeit összehasonlítsuk az előzőekkel. Az új, T2 tojások felhasználásával
- 22 -
készítettem 2, 6 és 9 tojásos száraztésztát. A 6 tojásos tésztát háromszor készítettem el. Ezekkel végeztem el a következő mérést. A 6 tojásos tészták közül az egyiket háromszor is mértem (B6/3a, B6/3b, B6/3c). Párhuzamosan szintén mértem T1 tojásokkal készített és gyárilag előállított különböző tojástartalmú száraztészta mintákat (3. táblázat). A gyárilag készített tésztaminták közül az egyikkel 3 ismételt mérést végeztem (S4e/1, S4e/2, S4e/3). A várt és a kapott tojástartalmakból számolt torzítatlanság értékek a T2 és a T1 tojásos tésztáknál 88,96% - 113,87% között változnak. 8. táblázat: különböző tojásokkal készített, saját készítésű száraztészták Készített Minta
tészta
Tojástartalom
jele
megcélzott
(db)*
Számolt Konc. (ppm)**
Torzítatlanság
tojástartalo
(%)
m (db)***
tojástartalma BL
-
0
nem értelmezhető
-
-
B2
-
1,994
2,58
2,271
113.87
B6/1
6
5,662
7,23
6,093
107.62
B6/2
6
5,573
6,74
5,691
102.11
B6/3a
6
5,602
6,18
5,230
93.36
B6/3b
6
5,602
5,88
4,984
88.96
B6/3c
6
5,602
5,88
4,984
88.96
B9
9
8,470
10,89
9,102
107.46
A3
3
3,530
5,73
3,654
103.51
A5
5
5,157
7,47
4,743
91.98
A8
8
7,613
12,41
7,836
102.93
S0sz S4e/1 S4e/2 S4e/3 E10c S8cs
-
nem 0
nem értelmezhető
-
értelmezhető nem értelmezhető nem
4
3,60
-
értelmezhető nem értelmezhető nem
4
3,17
-
értelmezhető nem értelmezhető nem
4
3,18
-
értelmezhető nem értelmezhető nem
10
5,61
-
értelmezhető nem értelmezhető nem
8
0,72
értelmezhető nem értelmezhető
* A tészták szárítás utáni és a készítés során hozzáadott tojás pontos tömegéből visszaszámolt, 1 kg-ra vonatkoztatott pontos tojástartalom.
- 23 -
** A Ridawin szoftver által az abszorbancia értékek alapján számolt tojásfehérje koncentráció *** A 6. ábrán látható két egyenes egyenleteiből visszaszámolt pontos tojástartalom Az egyik 6 tojásos tészta (B6/3) ismételt méréseiből kapott tojásfehérje koncentráció RSD%-a 2,90%. Az összes 6 tojásos tészta tojásfehérje koncentráció eredményeiből számolt RSD%, pedig 9,24% Az Se4 jelű minta tojásfehérje koncentráció eredményeiből számolt RSD%, 7,40%.
14
Koncentráció (ppm)
12
y = 1,2164x - 0,182 R² = 0,9675
10
T2 tojással készített tészták y = 1,5974x - 0,107 R² = 0,9922
8 6
T1 tojással készített tészták
4 2 0 -2
Bolti tészták 0
2
4
6
8
10
12
Tojástartalom (db)
6. ábra: A 8. táblázatban feltüntetett tésztáknak az abszorbancia értékek alapján, a Ridawin softwer által kiszámolt tojásfehérje koncentrációja az egyes tészták tojástartalmának a függvényében ábrázolva. Az 6. ábrán láthatjuk, hogy mind a T1 tojásokból, mind a T2 tojásokból készült tészták méréseinek eredményeiből kapott pontokra külön-külön egyenes illeszthető. A tojásfehérje koncentráció lineárisan nő a tojástartalommal. Viszont a kétféle tojásból készült tészták ELISA-val történő méréséből kapott eredményei nem illeszthetők egyetlen közös egyenesre. Ez azt jelenti, hogy a tojás különböző fehérjéinek mennyisége függ a tojás származásától, azaz befolyásolhatja akár a baromfi kora, tartásának módja, táplálékának összetétele. Ez megmagyarázná azt, amit a 3. ábrán a bolti tészták esetén megfigyelhetünk, vagyis hogy az ebben az esetben a kapott pontok egyáltalán nem mutatnak linearitást. Ez tehát lehet azért, mert ezek a tészták különböző helyekről illetve különböző időpontokban beszerzett tojások felhasználásával készültek.
- 24 -
5.4
Különböző lisztekkel készített száraztészták
A következő kísérlet arra irányult, hogy kizárjam azt, hogy a tojáson kívül a gyártás során felhasznált liszt típusától is függhet a mérési eredmény, vagyis hogy a lisztben jelen lévő fehérjék keresztreakciót okozhatnak a teszt során. Ezért a következő mérést különböző típusú lisztekkel készített száraztésztákon végeztem el (9. táblázat). 9. táblázat: Saját készítésű, különböző időpontokban illetve különböző típusú lisztekkel elkészített száraztészták mérési eredményei Minta neve
Készített tészta megcélzott tojástartalma
BL
Tojástartalom
Koncentráció
(db)*
(ppm)**
Számolt tojástartalom
Torzítatlanság
(db)***
(%)
0
nem értelmezhető
-
-
A3
3
3,530
5,73
3,654
96,49
A5
5
5,157
7,47
4,743
108,02
A8
8
7,613
12,41
7,836
97,07
0
0,925
-
-
ÚBL C3
3
3,103
5,19
2,956
104,74
C5
5
5,152
7,82
4,634
110,05
C8
8
7,266
12,62
7,696
94,08
0
1,09
-
-
TKL E3
3
3,047
5,3
3,544
83,68
E5
5
5,097
7,5
5,663
88,89
E8
8
7,950
9,3
7,396
106,96
0
nem értelmezhető
-
-
DL D3
3
2,932
5,011
3,459
82,04
D5
5
5,027
8,26
6,114
78,37
D8
8
7,180
8,37
6,204
113,59
*A tészták szárítás utáni és a készítés során hozzáadott tojás pontos tömegéből visszaszámolt, 1 kg-ra vonatkoztatott pontos tojástartalom. ** A Ridawin szoftver által az abszorbancia értékek alapján számolt tojásfehérje koncentráció *** A 6. ábrán látható két egyenes egyenleteiből visszaszámolt pontos tojástartalom
- 25 -
14 BL jelű lisztből készített tészták
Koncentráció (ppm)
12 10
BL2 jelű lisztből készített tészták
8 6
TKL jelű lisztből készített tészták
4 2
DL jelű lisztből készÍtett tészták
0 0
2
4
6
8
10
Tojástartalom (db) 7. ábra: A 3. táblázatban feltüntetett, különböző típusú lisztek hozzáadásával készült tésztáknak az abszorbancia értékek alapján, a Ridawin softwer által kiszámolt tojásfehérje koncentrációja az egyes tészták tojástartalmának a függvényében ábrázolva A 7. ábrán azt látjuk, hogy az összes tészta esetén a mért pontok egy egyenesre illeszthetők. Kissé kilógnak a magasabb tojástartalmú, 8 tojásos durumlisztből és 8 tojásos teljes kiőrlésű lisztből készített száraztészták esetén számított tojásfehérje koncentráció
értékek.
A
különböző
lisztekkel
elkészített
száraztészták
mérési
eredményeiből tehát arra lehet következtetni, a magas tojástartalmú két 8 tojásos tészták kivételével, hogy a liszt fehérjéi nem okoznak keresztreakciót az ELISA során, így a liszt illetve a liszt típusa nem befolyásolja a mérési eredményeinket. A kapott tojástartalom és az egyes tésztáknál a készítés után kiszámolt pontos tojástartalom alapján ez esetben is kiszámoltam a torzítatlanság értékeket, melyek 78,37%-113,59% között változnak (9. táblázat).
5.5
Problémák magas tojástartalmú száraztészták esetén
Az 5.1-es fejezetben elvégzett kísérletnél a 4. ábrán látható, hogy a 7 tojásos tésztánál a tojásfehérje koncentráció kiugróan alacsony, a magas tojástartalomhoz képest. Ugyanez látható a 7. ábrán a BL jelű liszt és a TKL jelű liszt felhasználásával készített 8 tojásos tészták esetén is. Továbbá az 5. ábrán alacsony a kapott fehérjekoncentráció érték a gyárilag előállított 10 tojásos tésztánál is. Tehát magas
- 26 -
tojástartalmú tészták esetén előfordult többször is hogy a várthoz képes jóval alacsonyabb tojásfehérje koncentráció értékeket kaptunk. Ez a jelenség több ok miatt is lehet. Lehet az ún. hook effektus vagy kioltási effektus miatt, ami azt jelenti, hogy azért kapunk túl alacsony értékeket, mert a mintánkban túl sok az antigén, ez esetben a tojásfehérje. Ilyenkor az antigén antitest komplexek felbomlanak és emiatt kapunk tévesen alacsony eredményt. A másik lehetséges magyarázat az lehet, hogy a nagyon magas tojástartalmú tészták esetén már nem megfelelő az extrakciós eljárás hatásfoka. A következő kísérlet célja az volt, hogy kiderítsem, az egyes elkészített magas tojástartalmú tészták fals negatív eredményét az elégtelen extrakció okozza-e, vagy a hook effektus. Elvégeztem a mintaelőkészítést a többi kísérletnél is elvégzettek szerint, BL jelű liszttel, az A3, A5, és A8 jelű tészta mintával, valamint három alkalommal is az A10 jelű tésztával. Emellett az 5. táblázatban leírt, tojásfehérjék fokozott extrakciója céljából végzett mintaelőkészítést is elvégeztem az A8 és az A10 jelű mintákkal. Az A10 jelű tésztával ezt három párhuzamos alkalommal végeztem el. A 10. ábrán az látszik, hogy a 10 tojásos tészta esetén a fokozott extrakcióval előkészített mintáknál jelentősen magasabb tojásfehérje koncentráció értékeket kaptunk. Ugyanakkor a másik eljárás szerint előkészített, 10 tojásos tésztával végzett méréseknél a
kapott
fehérjekoncentráció
értékek
túlzottan
alacsonyak,
nem
arányosak
a
tojástartalommal. A 8 tojásos tésztánál a két mintaelőkészítési eljárással végzett mérési eredmények között már kevésbé jelentős az eltérés. Tehát a magas tojástartalmú tészták esetleges fals negatív eredményeit az extrakció nem megfelelő hatásfoka okozta. Az előírt extrakcióval előkészített három 10 tojásos tészta kapott tojásfehérje koncentráció értékeinek RSD%-a, 3,20%, míg a fokozott extrakcióval előkészített mintáké 3,47%, míg az összes 10 tojásos mintáé 6,32%.
14 Koncentráció (ppm)
12 10 8 6 4 2 0 0
2
4 6 Tojástartalom (db)
8
10
- 27 -
8. ábra: A 10. táblázatban feltüntetett tésztáknak az abszorbancia értékek alapján, a Ridawin szoftver által kiszámolt tojásfehérje koncentrációja az egyes tészták tojástartalmának a függvényében ábrázolva 10. táblázat: Az extrakció hatásának vizsgálatához használt száraztészták és mérési eredményeik Minta Tojástartalom Koncentráció jele (db)* (ppm)** 0 nem értelmezhető BL 3,53 6,34 A3 5,157 8,14 A5 6,937 7,68 A7 7.613 11,27 A8 8,557 10,09 A10 8,557 9,99 A11 8,557 11 A12 7,613 11,84 A8 8,557 13,22 A10 8,557 12,46 A11 8,557 11,58 A12 *A tészták szárítás utáni és a készítés során hozzáadott tojás pontos tömegéből visszaszámolt, 1 kg-ra vonatkoztatott pontos tojástartalom. ** A Ridawin szoftver által az abszorbancia értékek alapján számolt tojásfehérje koncentráció
6. A
Összefoglalás több
tojásfehérjére
specifikus
ELISA,
száraztészták
tojástartalmának
a
meghatározására önmagában nem megfelelő módszer. Annak ellenére sem, hogy a liszt fehérjéi nem okoznak keresztreakciót és a magas tojástartalmú tészták túlzottan alacsony eredményei az extrakció hatásfokának növelésével kiküszöbölhetők. Olyan tészták esetén, melyek ugyanazon lejárati idejű és valószínűleg ugyanazon helyről származó tojásokkal készültek sem elég pontos a tojástartalom ELISA-val történő meghatározása. Továbbá a többféle helyről származó tojásokkal elkészített tészták mérési eredményei egyáltalán nem vethetők össze. Ezek szerint, ha a tojás ugyanarról a helyről származik, akkor valószínűleg a fehérjetartalmát befolyásoló tényezők nem
- 28 -
változnak olyan mértékben, hogy azt jelentősen módosítsák. Viszont a különböző helyekről származó tojások fehérjetartalma nagymértékben változhat. Bár az ELISA önmagában nem bizonyult alkalmas módszernek a száraztészták tojásfehérje tartalmának meghatározására, más tojás alkotórészek méréseivel együtt, kombinált módszerben alkalmazva, még mindig fontos szerepet kaphat a száraztészták tojástartalmának meghatározásában.
- 29 -
Köszönetnyilvánítás Ezúton szeretném megköszönni Dr. Eke Zsuzsannának azt a sok segítséget és hasznos tanácsot, amit szakdolgozatom elkészítésében nyújtott.
- 30 -
Irodalomjegyzék [1]
Magyar Élelmiszerkönyv, II. Kötet 20-85
[2]
W. J. Stadelman, Encyclopedia of Food Sciences and Nutrition 2nd Ed. (2003) 2005-2009.
[3]
W. J. Stadelman, Encyclopedia of Food Sciences and Nutrition 2nd Ed. (2003) 2009-2012.
[4]
S. Fredriksson, K. Elwinger, J. Pickova, Food Chem. 99 (2006) 530-537.
[5]
M. C. Milinsk, A. E. Murakami, S. T. M. Gomes, M. Matsushita, N. E. de Souza, Food Chem., 83 (2003) 287-292.
[6]
S. Samman, F. P. Kung, L. M. Carter, M. J. Foster, Z. I. Ahmad, J. L. Phuyal, P. Petocz, Food Chem., 116 (2009) 911-914.
[7]
A. Cobos, L. de la Hoz, M. I. Cambero, J. A. Hordónez, Food Research Int., 28 (1995) 71-76.
[8]
M. Fodor, A. Woller, S. Turza, T.
Szigedi, J. of Food Engineering, 107 (2011)
195-199 [9]
MSZ 20500/4-87
[10]
E. Agulló, B. S. Gelós, Food Research Int., 29 (1996) 77-80.
[11]
B. S. Hwang, J. T. Wang, Y. M. Choong, Journal of Food Comp. and Anal., 16 (2003) 169-178.
[12]
J. D. Beyer, F. X. Milani, M. J. Dutelle, J. AOAC Int., 72 (1989) 746-748.
[13]
M. I. P. Kovacs, J. of Cereal Sci., 11 (1990) 291-297.
[14]
L. Pellegrino, A. Tirelli, Int. Diary Journal, 10 (2000) 435-442.
[15]
0,
0. M. Williams, C. D. Westphal, J. AOAC Int., 87 (2004) 1485-1491. [16]
M. L. Vidal, J. Gautron, Y. Nys, J. Agric. Food Chem., 53 (2005) 2379-2385.
[17]
B. Kerkaert, F. Mestdagh, B. De Meulenaer, Food Chem., 120 (2010) 580-584.
[18]
N. Schneider, I. Weigel, K. Werkmeister, M. Pischetsrieder, J. Agr. Food Chem., 58 (2010) 76-81.
[19]
H. Čížková, V. Prokorátová, M. Kvasnička, V. Soukupová, Czech J. Food Sci., 22 (2004) 197-203.
[20]
A. Daneshfar, T. Khezeli, H. J. Lotfi, J. Chrom. B, 877 (2009) 456-460.
[21]
Y. T. Lin, S. S. Wu, H. L. Wu, J. Chrom. A, 1156 (2007) 280-287.
[22]
SOP-6172-01
[23]
L. Vorlová, E. Sieglová, R. Karpíšková, V. Kopřiva, Acta Vet. 70 (2001) 387-390.
- 31 -
[24]
Ľ. Zemková, J. Simeonovová, M. Lichovníková, K. Somerlíková, Czech J. Anim. Sci., 52 (2007) 110-115.
[25]
F. Kwasnicka, Electrophoresis, 24 (2003) 860-864
[26]
N. Schneider, C. M. Becker, M. Pischetsrieder, J. Chrom. B, 878 (2010) 201-206.
[27]
Z. H. Reed, J. W. Park, Food Chem., 118 (2010) 575-581
[28]
Y. Watanabe, K. Aburatani, T. Mizumura, S. Muraoka, J. Imm. Methods, 300 (2005) 115-123
[29]
S. L. Taylor, J. A. Nordlee, L. M. Niemann, Anal. Bioanal. Chem., 395 (2009) 83-92
[30]
C. D. Amigo, Anal. Biol. Chem., 3 (2010) 344-350
- 32 -
