Száloptika, endoszkópok Optikai mikroszkópok a diagnosztikában Elektronmikroszkópia, fluorescens és konfokális mikroszkópia
Száloptika, endoszkópok Értékes diagnosztikus technikák elősegítik a vizsgálat közbeni gyógyító beavatkozásokat. A száloptikás eszközök megjelenése forradalmasította sok betegség diagnózisát, a kezelés módjait. Endoszkóp a belső üreges szervek vizsgálatára szolgáló eszköz.
PTE-ÁOK Biofizikai Intézet
Czimbalek Lívia 2009.03.16.
A száloptikás endoszkópot először 1957-ben alkalmazták.
Optikai alapismeretek
John Tyndall: a fény láthatóan elhajlik a sarkok körül (kísérlettel igazolta 1854-ben)
Fénytovábbító száloptika nyaláb
Optikai alapismeretek A száloptika eszközökben a fénytovábbítás hasonló alapelven történik, vagyis a teljes belső visszaverődés elvén.
Fénytovábbító száloptika nyaláb Egyes fénytovábbító üvegnyaláb hossza: 12-22 m. videoendoszkópok! miniatűr TV kamera nagy felbontóképességű, színes, jó minőségű kép, A videoscope szondájában: tárgyoptika.
A fénytovábbító száloptika nyaláb néhány ezer db. kb. 30 mikron vastagságú üvegszálból áll. A szálak rendezetlenül futnak, inkoherens elrendezésben. A nyaláb egy hajlékony fémspirál köpennyel van burkolva.
A tárgyoptika
microchip CCD - képalkotó lapocska
CCD analóg jel
processzor (analóg jel-digitalizálás)
Kép a monitoron! Színes képalkotás: RGB szekvenciális Real time rendszerű CAD-program: 3D mérési eljárás
1
Képalkotó száloptikai nyaláb koherensen rendezett optikai szálak által szállított kép
Fénytovábbító száloptika nyaláb
elemi szálak : 40-50 ezer Azonos geometriai alakzat a szál mindkét végén! A kép minősége: -szálak mérete, -mennyisége, -rendezettsége!
Elektronmikroszkópia Transzmissziós elektronmikroszkópia (TEM) Az 50-100 keV energiájú elektronoknak rövid a hullámhosszuk, elektromos és mágneses térrel jól fókuszálhatók. A leképezés valósághűsége: -felbontóképesség -kontraszt. Elektronoptikai kép: elektronoknak a szilárd test atommagjain, illetve elektronjain való rugalmas szóródásának, és elhajlásának következménye. Felbontása: 0,2-0,3nm. Minta: 10-100nm vastagságú metszet.
Pásztázó elektronmikroszkópia (SEM) A szekunder elektronok - a minta felszínének geometriája. A képernyőn megjelenő kép nagy mélységélességű (a kristály csúcsa és töve egyaránt éles). Olyan plasztikus képek nyerhetők vele, melyeket sem a fénymikroszkóppal, sem transzmissziós elektronmikroszkóppal nem lehet előállítani. Ez az előny azonban a felbontóképesség rovására megy, mert SEM-el legfeljebb 10-ezerszeres nagyítású éles képet készíthetünk. Felbontása: kb. 5 nm, szemben a TEM 0,2 nm felbontásával.
A megvilágításhoz szükséges fényt a fényforrás és az endoszkóp között nem száloptika, hanem folyadék közeg szállítja.
Elektronmikroszkópia Pásztázó elektronmikroszkópia (SEM) Egy jól fókuszált elektronnyalábbal a minta felületét letapogatják (végigpásztázzák). A mintáról visszaérkező elektronokkal (a TVképernyőjéhez hasonlóan) egy katódsugárcső fényintenzitását vezérlik. A mintán végigseprő elsődleges elektronok: -visszaszóródnak, -másodlagos (szekunder) elektronokat váltanak ki. A szekunder elektronok a minta domborzati viszonyairól adnak rendkívül éles, nagyfelbontású képet. A visszaszórt elektronok a minta összetételével arányos képekként jeleníthetõk meg (nagyobb tömegű atomok jobban visszaverik az elektronokat, az elektronképen világosabbnak látszanak ).
Konfokális mikroszkópia
Konfoká Konfokális felté feltéttel ellá ellátott epifluoreszcens lézer pásztá sztázó mikroszkó mikroszkóp (CLSM)
2
A konfoká konfokális mikroszkó mikroszkóp elő előnyei
fluoreszcensen jelö jelölt mintá minták vizsgá vizsgálatá latára alkalmas jobb felbontá felbontású képet ad optikai szeletelé szeletelés „3D” 3D” képek, ha a minta szemitranszparens néhány 100μ 100μm vastagsá vastagságú mintá minták rutinszerű rutinszerű vizsgá vizsgálata digitá digitális ké képalkotá palkotás in vivo kí kísérletek
Egy konfoká konfokális rendszer vá vázlata
A konfoká konfokális elv A hagyományos mikroszkópokkal szemben, a konfokális mikroszkópnál egyszerre csak a minta egy pontját világítják meg. A konfokális képalkotás lényege, hogy a rendszer csak a fókuszsíkból jövõ fényt detektálja.
Legtöbb esetben egy több hullámhosszú lézer szolgál fényforrásként. [Ar-ion: 457nm (ibolya), 488nm (kék),514nm (zöld), ;He-Ne: 633nm (vörös).] A fényútba helyezett szûrõkkel kiválasztható a kívánt hullámhosszú gerjesztés. A lézer fényét egy dikroikus tükör a pásztázó tükrökre vetíti. A dikroikus tükröt a használt lézer hullámhosszának függvényében kell megválasztani, mégpedig úgy, hogy visszaverje a lézer fényét, de átengedje a mintából visszatérõ fluoreszcenciát. A mintából eredõ fluoreszcens fény ugyanazon az úton, visszafelé halad, és áthalad az elsõ dikroikus tükrön, amely átengedi a gerjesztõ fénynél magasabb hullámhosszú fluoreszcenciát. A második tükör a fluoreszcencia különbözõ színû komponenseit szétválasztja, és különbözõ detektorokhoz irányítja.
A rendszer fontos eleme a számítógép által vezérelt fókuszmotor, amely az optikai szeletelés során meghatározott határok között pontosan eltolja a fókuszsíkot, miközben a koordinátákat a számítógép rögzíti. A mintából érkezõ fluoreszcens jel gyakran igen gyenge. A felvett kép jobb minõségû lesz, ha a rendszer több fényt gyűjt egy adott pontból, vagyis a nyaláb többet idõz egy pontban. Ez azt jelenti, hogy a pásztázás lassúbb, egy kép felvétele pedig hosszabb idõt vesz igénybe. Sokszor, különösen kinetikai méréseknél, kompromisszumot kell kötnünk a pásztázás gyorsasága és a képminõség között.
A kettős jelölés lehetősége
Alkalmas detektorral mérhetõ a mintán áthaladt fény intenzitása, amely alapján a rendszer létrehoz egy transzmissziós képet.
3
A kettős jelölés feltétele
Képkészítés A konfokális mikroszkóp által készített képek digitálisak. A folytonos képet a digitalizálás során véges számú képpontra osztják fel, a végsõ képet pedig sorokban és oszlopokban elhelyezkedõ képpontok, az ún. pixelek alkotják. Az egyes képpontok fényességét egy 256 árnyalatból álló skálán adják meg, ahol 0 a fekete, 255 a fehér, a közöttük lévõ értékek pedig köztes árnyalatokat jelentenek. A digitális kép tehát egy pontrács.
Képkezelő eljárások
Végezetül néhány példa…
fényessé nyesség, kontraszt, kü küszö szöb simí simítás és szű szűrés nagyí nagyítás és kicsinyí kicsinyítés szí színtá ntáblá blák, álszí lszínek 3D ké képalkotá palkotás
Végezetül néhány példa…
Fluoreszcencia anizotrópia mérése konfokális mikroszkóppal
4
Fluoreszcencia
Polarizáció
Gerjesztő fény
A fé fény transzverzá transzverzális hullá hullám, tehá tehát polarizá polarizálható lható
Fluoreszcencia
Síkban polá poláros (polarizá (polarizált) fény
Gerjeszté Gerjesztést kö követő vető relaxá relaxáció ciós folyamatok
λfluor > λgerjesztés
A fluoreszcencia polarizált molekula
Poláros gerjesztő fény
A polarizációfok jellemzése Polarizá Polarizáció ció
emissziós vektor abszorpciós vektor
p= Fluoreszcencia
IVV − IVH IVV + IVH
Anizotró Anizotrópia r=
Fotoszelekció Fotoszelekció
IVV − IVH IVV + 2 IVH
Elő Előnye: az anizotró anizotrópia addití additív!
Miről ad információt az anizotrópia?
Korrekció fluoriméteres mérésnél
Molekuláris (mozgékonyság) mobilitás Molekuláris méret, alak, flexibilitás Közeg fluiditása Rendparaméterek (pl. lipid kettősrétegekben, membránokban)
r=
IVV − G ⋅ IVH IVV + 2G ⋅ IVH
G=
I HV I HH
5
Anizotrópia mérése konfokális mikroszkópban Fluoriméterben Átlagérték (egy populáció anizotrópiája) Sejtek esetén nehézkes és pontatlan a fényszórás zavaró hatása miatt.
A konfokális rendszer szükséges módosításai polarizátor Polarizációs nyalábosztó síkelforgató
Konfokális mikroszkópban Egyedi sejteken mérve és csak a minta kiválasztott szeletét gerjesztve a fényszórás zavaró hatása megszűnik. Anizotrópia kép létrehozása (térbeli eloszlás)!
Kísérletes fejlesztések Polarizációs síkelforgató elhelyezése a gerjesztő fényútba
Korrekció konfokális rendszerben A különböző fényutak miatt más, mint fluoriméterben.
Fluoriméter
Gerjesztő fény
Emissziós polarizációs nyalábosztó elhelyezése az emissziós fényútba
Fluoreszcencia
G=
I HV I HH
Konfokális mikroszkóp
Gerjesztő fény
G=
Fluoreszcencia
IVV I HV IVH I HH
6
