Výzkum možností minimalizace obsahů organických škodlivin ve zdrojích pitných vod v Krušných horách
Studium polymorfismu u vybraných populací smrku ztepilého Picea abies (L.) Karsten pomocí DNA analýz
Ing. Helena Cvrčková, Ph.D., Ing. Pavlína Máchová, Ph.D. Září 2013
Výzkumný ústav lesního hospodářství a myslivosti, v.v.i., e-mail:
[email protected],
[email protected]
Autor: Ing. Helena Cvrčková, Ph.D., Ing. Pavlína Máchová, Ph.D. Výzkumný ústav lesního hospodářství a myslivosti, v.v.i. Strnady 136, 252 02 Jíloviště, Doručovací pošta: 156 04 Praha 5 – Zbraslav E-mail:
[email protected],
[email protected]
© Foto: M. Krtička
Obsah Úvod Materiál a metodika Protokol izolace RAPD PCR - RFLP SSR markery Výsledky Diskuze Závěr Literatura
3 4 6 6 7 9 11 18 19 20
2
kám. V naší studii bylo také testováno zda různé úrovně vitality vybraných porostů jsou podmíněny i mírou genetické variability, tab. 1. Genetické vlastnosti vybraných populací byly studovány pomocí analýz DNA. DNA markery umožňují přímo studovat genom organismů, jsou založeny na polymorfismu sekvencí nukleotidů a nejsou ovlivněny podmínkami prostředí jako například izoenzymové markery. Významným přínosem pro rozvoj analýz DNA byl objev polymerázové řetězcové reakce, o který se zasloužil Kary Mullis v roce 1985 (BROWN 2006). Při této reakci se mnohonásobně namnoží malý úsek DNA, který lze následně detekovat a studovat. Většina současných metod studia DNA markerů je založena na PCR – polymerázové řetězové reakci, při které dochází k selektivní amplifikaci určitého úseku nukleové kyseliny. PCR je třístupňový proces v několika opakujících se cyklech, při kterém termostabilní DNA polymeráza namnoží úsek mezi dvěma oligonukleotidy (primery) na základě komplementarity bází se sekvencí templátové DNA. Při PCR reakci je využívána schopnost DNA opakovaně denaturovat a reasociovat v závislosti na různé teplotě. Směs, v níž PCR probíhá, obsahuje templátovou DNA, většinou dva různé primery, nukleotidtrifosfáty, termostabilní polymerázu a reakční pufr. Vzájemné poměry a koncentrace templátu, primerů a především hořečnatých iontů jsou v průběhu PCR klíčové. Velmi často je nezbytné optimalizovat složení reakční směsi tak, aby výtěžky namnožených úseků DNA byly dostatečně vysoké a spolehlivé. PCR reakce se provádí pomocí teplotních cyklovačů, které automaticky opakují nastavené teplotní cykly a za krátkou dobu se vytvoří miliardy kopií daného úseku DNA. Je to rychlá a specifická metoda, která má široké uplatnění při molekulárně - genetických studiích v mnoha oborech. Pro získání informací o genetické proměnlivosti zkoumaných vzorků je potřebné vyhledat DNA markery vykazující polymorfis-
Úvod Smrk ztepilý Picea abies (L.) Karsten je z ekonomického i ekologického hlediska jednou z nejvýznamnějších dřevin, do Evropy migroval pravděpodobně z východní Asie a v posledních dvou stoletích byl intenzivně vysazován v centrální Evropě (SCHUBERT et al. 2001). Na našem území jsou těžištěm původního rozšíření okrajová horstva. Protože má povrchovou kořenovou soustavu, je značně náročný na půdní vlhkost a vyžaduje i vyšší relativní vlhkost vzduchu. Na půdu a geologické podloží nemá velké nároky. Nedostatek vláhy je limitujícím faktorem jeho dobrého růstu. Snese i nadbytečnou vlhkost rašelinišť (ÚRADNÍČEK et al. 2009). Ale na chudých křemitých půdách a kyselých rašelinách roste špatně, protože těžko snáší nedostatečně provzdušněné půdy (CHMELAŘ 1980). Stabilita lesních porostů ovlivňuje možnost plnění jejich vodohospodářské a půdoochranné funkce a stabilní porost může regulovat případné vyplavování organických látek. Cílem práce bylo zjistit na základě úrovně polymorfismu sledovaných porostů z oblasti Krušných hor (Fláje a povodí potoka Rauschenbachu – Sasko) jejich stabilitu, porovnáním míry jejich variability zhodnotit schopnost dřevin přizpůsobit se extrémním klimatickým podmínkám lokality a vyššímu obsahu rašeliny. Bylo vybráno 5 porostů z oblasti Fláje a dva porosty z povodí potoka Rauschenbachu, porosty se vyskytují na rašelinných nebo kamenitých půdách, viz. tab. 1. Pro možnost porovnání genetických charakteristik porostů z této oblasti Krušných hor byly do studie zahrnuty i dvě původní populace chlumního ekotypu smrku ztepilého a to z oblasti Českosaského Švýcarska a Křivoklátska a dále jedna populace horského ekotypu z Orlických hor z oblasti Trčkova. Vývoj přirozené populace souvisí s její genetickou diverzitou, čím jsou populace v genetické výbavě rozmanitější, tím se lépe přizpůsobí měnícím se životním podmín3
šeliníku (obr. 1; dále jen Fláje) a Povodí potoka Rauschenbach z porostů nacházejících se na rozdílných stanovištích, a to z kamenitých lokalit nebo z lokalit s vyšším obsahem rašeliny. Odběry byly provedeny pro porovnání úrovně polymorfismu s vitálními porosty i z porostu SMA se sníženou vitalitou stromů - prosychající koruny (obr. 2, tab. 1). Odběry výchozího materiálu byly prováděny během roků 2011 a 2012, z Flájí, Saska i Orlických hor byly pro analýzy DNA odebírány jehlice. V případě cenných původních populací chlumního ekotypu smrku ztepilého rostoucích v lokalitách Českosaského Švýcarska a Křivoklátska byla DNA izolována z odvozených embryogenních linií. Embryogenní kultury smrku ztepilého byly založeny ze zygotických embryí nezralých semen a jsou kultivovány v bance explantátů jako zdroj reprodukčního materiálu (MALÁ et al.1995).
mus. Míry charakterizující genetickou strukturu a proměnlivost populací jsou založeny na alelických frekvencích jednotlivých alelických variant v lokusech (PAULE 1992). Pro testování polymorfismu vybraných populací smrku ztepilého byly využity DNA markerovací systémy (metody) RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), PCR – RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphis) pro mitochondriální úseky DNA a mikrosatelity - SSR (simple sequence repeats). Polymorfismus byl pozorován především u několika mikrosatelitových lokusů. K těmto polymorfním mikrosatelitovým lokusům se nechaly fluorescenčně označit primery a u amplifikačních produktů byla pro zjištění jejich přesných velikostí provedena fragmentační analýza na genetickém analyzátoru. Pomocí mikrosatelitů, které patří ke kodominantním markerům lze zjišťovat heterozygotnost, jednu ze základních charakteristik genetické proměnlivosti. Heterozygotnost vyjadřuje podíl heterozygotních jedinců v daném lokusu z celkového počtu pozorovaných jedinců (PAULE 1992). V rámci studie byla dále statisticky porovnávána genetická podobnost mezi populacemi na základě Neiových genetických vzdáleností, frekvence alel, diferenciace mezi populacemi a byl hodnocen polymorfismus sledovaných populací. Materiál a metodika Genetická proměnlivost byla testována u vzorků smrku ztepilého z Krušných hor z oblasti Fláje z porostů označených SM1, SM2, SM3, SMA, SMB a u dvou porostů z povodí potoka Rauschenbachu na území Saska označených SMK a SMR. Pro porovnání genetických charakteristik byly testovány i populace chlumního ekotypu smrku ztepilého rostoucího v lokalitách Českosaského Švýcarska a Křivoklátska a vzorky populace smrku horského ekotypu z oblasti Trčkova – Šerlišský kotel v Orlických horách. Odběry vzorků byly provedeny u lokalit povodí Ra4
Tab. 1: Přehled míst odběrů a označení vzorků smrku ztepilého Lokality odběru smrku ztepilého
Označení populace/porostu
Označení vzorků
Fláje - u bloků (souřadnice N 50,663250°, E 13,574067°) lokalita s vyšším obsahem rašeliny
SM1
SM /1/ 1, SM /1/ 2, SM /1/ 3, SM /1/ 4, SM /1/ 5, SM /1/ 6, SM /1/ 7, SM /1/ 8, SM /1/ 9, SM /1/ 10, SM /1/ 11, SM /1/ 12, SM /1/ 13, SM /1/ 14, SM /1/ 15, SM /1/ 16, SM /1/ 17, SM /1/ 18, SM /1/ 19, SM /1/ 20, SM /1/ 21
Fláje – silnice „K Jiříku“ (souřadnice N 50,657933°, E 13,581083°) kamenitá lokalita
SM2
SM /2/ 1A, SM /2/ 2A, SM /2/ 3A, SM /2/ 4A, SM /2/ 5A, SM /2/ 6A, SM /2/ 7A, SM /2/ 8A, SM /2/ 9A, SM /2/ 10A, SM /2/ 11A, SM /2/ 12A, SM /2/ 13A, SM /2/ 14A, SM /2/ 15A,SM /2/ 16A, SM /2/ 17A, SM /2/ 18A, SM /2/ 19A, SM /2/ 20A
Fláje – u brány (souřadnice N 50,654433°, E 13,5710°) lokalita s vyšším obsahem rašeliny
SM3
SM /3/ 21A, SM /3/ 22A, SM /3/ 23A, SM /3/ 24A, SM /3/ 25A, SM /3/ 26A, SM /3/ 27A, SM /3/ 28A, SM /3/ 29A, SM /3/ 30A, SM /3/ 31A, SM /3/ 32A, SM /3/ 33A, SM /3/ 34A, SM /3/ 35A, SM /3/ 36A, SM /3/ 37A, SM /3/ 38A, SM /3/ 39A, SM /3/ 40A
Fláje – oblast A, porost se sníženou vitalitou* (souřadnice N 50,664322°, E 13,560389°) lokalita s vyšším obsahem rašeliny
SMA
SMA-1, SMA-2, SMA-3, SMA-4, SMA-5, SMA6, SMA-7, SMA-8, SMA-9, SMA-10, SMA-11, SMA-12, SMA-13, SMA-14, SMA-15, SMA-16 SMA-17, SMA-18, SMA-19, SMA-20 SMA-21, SMA-22, SMA-23, SMA-24, SMA-25, SMA-26, SMA-27, SMA-28, SMA-29, SMA-30
Fláje – oblast B, (souřadnice N 50,665717°, E 13,569940°) lokalita s vyšším obsahem rašeliny
SMB
SMB-1, SMB-2, SMB-3, SMB-4, SMB-5, SMB-6, SMB-7, SMB-8, SMB-9, SMB-10, SMB-11, SMB-12, SMB-13, SMB-14, SMB-15, SMB-16, SMB-17, SMB-18, SMB-19, SMB-20, SMB-21, SMB-22, SMB-23, SMB-24, SMB-25, SMB-26, SMB-27, SMB-28, SMB-29
Povodí Rauschenbachu - Sasko (souřadnice N 50,710633°, E 13,58630°) kamenitá lokalita
SMK
SMK-1, SMK-3, SMK-5, SMK-7, SMK-9, SMK-11, SMK-13, SMK-15, SMK-17, SMK-19, SMK-21, SMK-23, SMK-25
Povodí Rauschenbachu - Sasko (souřadnice N 50,714483°, E 13,589367°) lokalita s vyšším obsahem rašeliny
SMR
SMR-1, SMR-3, SMR-5, SMR-7, SMR-9, SMR-11, SMR-13, SMR-15, SMR-17, SMR-19, SMR-21, SMR-23, SMR-25
Českosaské Švýcarsko (souřadnice N 50,886248°, E 14,404954°)
SMCH ČS
1, 8, 10, 12D, 13, 16, 17, 22B, 26C, 27CH, 27N, 27I, 27J, 27S, 28, 29K, 34C, 35F, 35A, 36B, 37B
Křivoklátsko (souřadnice N 49,988259°, E 13,856309°)
SMCH KŘ
101A, 102G, 104D, 106L, 107L, 108A, 110A, 111A, 112A, 113D, 114A, 114F, 115A, 116B, 117A, 120H, 121A
Trčkov – Šerlišský kotel (Orlické hory), (souřadnice N 50,312756°, E 16,41596°)
SM02
SM02/1, SM02/2, SM02/3, SM02/4, SM02/11, SM02/12, SM02/13, SM02/14, SM02/21, SM02/22, SM02/23, SM02/24 SM02/31, SM02/32, SM02/33, SM02/34
* u porostu byla u stromů 1/3 korun proschlých
5
Jehlice byly po odběru zamraženy a embryogenní pletiva byla z důvodu vysokého obsahu vody v pletivech lyofilizována. Rostlinný materiál byl rozdrcen na prášek pomocí tekutého dusíku a DNA byla izolována pomocí kitu DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN) dle dodaného izolačního protokolu (DNeasy® Plant Handbook). U získaných vzorků byla měřena koncentrace DNA v ng/µl a její čistota (dána poměrem A260/280) přístrojem Nanophotometer (Implen). Hodnoty získané DNA se pohybovaly v rozmezí 10 – 50 ng/µl, eluáty DNA z embryogenních pletiv dosahovaly vyšších hodnot - až 220 ng/µl, čistota se průměrně pohybovala v hodnotách 1,7 - 1,9, které indikují vysokou čistotu získané DNA (dle manuálu protokolu DNeasy® Plant Handbook). Vzorky DNA s vyšší koncentrací byly pro PCR reakce naředěny na hodnotu cca 20 ng/µl. Pro detekci rozdílů v genetické informaci mezi analyzovanými vzorky bylo odzkoušeno několik DNA markerových systémů. Jejich princip je založen na amplifikaci fragmentů (určitých oblastí genomu) technikou PCR – polymerázové řetězové reakce. Byly odzkoušeny metody RAPD, PCR – RFLP a SSR markery.
Obr. 2: Odběr vzorků rostlinného materiálu z porostu SMA se sníženou vitalitou stromů
RAPD Pro předběžné ověření genetické proměnlivosti sledovaných jedinců smrku ztepilého byla použita metoda odvozená od PCR technik – metoda RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA – polymorfizmus náhodně amplifikované DNA). Jako primer se používá krátký oligonukleotid o délce kolem 10 nukleotidů s libovolnou sekvencí. Při této délce je značná pravděpodobnost, že v genomu bude mnoho míst homologních k použitému oligonukleotidu a některá z nich budou dostatečně blízko u sebe, aby v úseku mezi nimi při využití PCR docházelo k amplifikaci DNA. Tato metoda tedy nevyžaduje znalost cílových sekvencí DNA fragmentů. Výsledkem analýzy je velká skupina amplifikovaných fragmentů, které se pak rozdělí elektroforeticky. Genomy příbuzných, ale často i vzdálenějších druhů jsou velmi shodně organizovány. Většina proužků (záznam amplifikovaných fragmentů po elektroforetickém rozdělení na gelu) bývá shodná, proto je třeba vyhledat primer, který vykazuje různou polohu proužků i u velmi příbuzných organizmů. V naší studii byly testovány primery Operon Biotechnologie GmbH ze sad OPR, OPC a OPBC. PCR reakce probíhala v objemu 25 µl pro jeden vzorek a obsahovala 2,5 µl 10xPCR buffer (100mM Tris- HCl,
Obr. 1: Odběry biologického materiálu genetické studie
6
pH = 8,3, 500 mM KCl, 15 mM MgCl2), 2 µl směs dNTP (každý 2,5 mM ), 4 µl 10-mer primeru firmy Operon (18 – 25 pmol), 2 µl DNA a 0,3 µl Takara Taq polymerázy (5 units/µl) (TAKARA Biotechnology, CO., LTD.), doplněno sterilní ultračistou vodou (Sigma, Molecular biology) do objemu 25 µl. RAPD reakce probíhala v termocykleru Perkin Elmer 2400 a Bioer XP cycler. Teplotní režim teplotního cyklovače byl nastaven následovně - 93 °C 3 min pro počáteční separaci DNA řetězců, dále se opakovalo 45 cyklů: 92 °C 1 min – pro denaturaci DNA, 35 °C 2 min – pro nasedání primerů, 72 °C 3 min – elongační teplota pro vytváření řetězce, konečná elongační teplota 72 °C (10 min) a chlazení 4 °C. Amplifikační produkty byly analyzovány elektroforézou na 1,5% agarózových gelech v 0,5% TBE pufru a detekovány barvením ethidiem bromidem (SAMBROOK, RUSSELL 2001). 1,5% agarózový gel se připravil navážením 3 g agarózy (Agarose SERVA for DNA), která byla ve 200 ml roztoku 0,5% TBE (Tris borate EDTA pufr) zahříváním rozpuštěna. Do vychladlého (ale stále tekutého) čirého roztoku bylo přidáno 10 ml ethidium bromidu. Na gel v horizontální elektroforetické aparatuře se nanášelo 25 ml vzorku vyizolované DNA a 4 ml loading buffer (Sigma). Doba trvání elektroforézy byla 30 minut při napětí 40 V a potom 120 - 150 minut při napětí 90 V. Gely byly dokumentovány pod UV zářením pomocí kamerového systému Discovery 10gD. Jako standard pro porovnání velikosti amplifikovaných produktů byl použit 100 bp DNA Ladder (NEW ENGLAND Biolabs). RAPD profily byly vyhodnoceny pomocí specializovaného softwaru UltraQuant. Byl vytipován primer OPBC – 17 s nukleotidovou sekvencí CCGTTAGTCC, se kterým byly na gelu získány nejzřetelnější polymorfní profily proužků potvrzující genetickou proměnlivost sledovaných vzorků smrku ztepilého. Nevýhodou RAPD technik je, že výsledky nemusí být při hodnocení populačně genetických parametrů u diploidního materiálu spolehlivé (PERRY et al. 1999). U RAPD markerů
převládá dominantní charakter, nelze rozlišit zda je DNA fragment naamplifikovaný z heterozygotního nebo homozygotního lokusu. RAPD markery bývají zřídka kodominantní (WILLIAMS et al. 1990). Dominantní charakter RAPD markerů může zkreslovat výsledky hodnocení genetických parametrů u organismů charakteru diploidů se vzdáleným křížením, k nimž patří i smrk. V případě polymorfního lokusu s recesivní alelou vyskytující se v nízké frekvenci, budou RAPD analýzou tyto lokusy hodnoceny jako monomorfní. Zhodnocení heterozygotů mohou poskytnout např. RFLP markery, které jsou kodominantní. (NKONGOLO 1999). U RAPD metody se také z důvodu krátké délky motivu (tzv. nespecifických primerů) a nižší teploty annealingu (35 °C) zvyšuje pravděpodobnost nasednutí primeru na mnoha místech molekuly DNA a mohou se vytvořit i falešné produkty. Výhodou této předběžné metody je rychlost analýz a finanční dostupnost. PCR - RFLP Další ověřovaný DNA marker odvozený od polymerázové řetezové reakce byl PCR RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphis – polymorfizmus délky restrikčních fragmentů). Metoda spočívá v tom, že po PCR amplifikaci určitého úseku DNA za použití specifických primerů jsou amplifikační produkty štěpeny pomocí restrikčních endonukleáz na fragmenty. Existuje velké množství bakteriálních restrikčních endonukleáz, které se liší tím, že rozpoznávají různé krátké sekvence nukleotidů a štěpí DNA na různě dlouhé fragmenty podle individuálního pořadí bází a podle rozpoznané sekvence. Počet i délka fragmentů je pro daného jedince specifická. Identifikace a analýza produktů štěpení se provádí elektroforetickým dělením. Sekvence specifických primerů dodaných od firmy Invitrogen byla zvolena dle literatury (MAGHULY et al. 2008) a byly odzkoušeny primery pro úseky mitochondriální DNA: mt15–D02 (F - TAT 7
CTG ACT TGC CTT ATC, R - ATC CGA ATA CAT ACA CC), mt23–D02 (F - CAC CCT TGC GTA GAC TGG, R - GGT TCA CGC AGT GCT TCT), mt1H01 (F - AAG ATG GAT CGC CCT TAC GC, R - GAG GAG GAG GCT TCG TCG TC). Byly optimalizovány postupy PCR reakce pro dvojici primerů k lokusu mh02 (F - TTT TAG GGC CAT TTG CCT GC, R - TCT ATG GAC AAG AGC CCG ACC T) (JEANDROZ et al. 2002). PCR reakce s polymerázou Takara Taq probíhala v objemu 25 µl pro jeden vzorek a obsahovala 2,5 µl 10xPCR buffer (100 mM Tris - HCl, pH = 8,3, 500 mM KCl, 15 mM MgCl2), 0,5 µl směsi dNTPs (každý 2,5 mM), specifické primery (forward a reverse 50 µM) každý 0,75 µl (v případě mh02 1 µl), 0,2 µl Takara Taq polymerázy (5 units/µl), 2 µl DNA a reakční směs byla doplněna sterilní ultračistou vodou (Sigma - Aldrich, Molecular biology) do objemu 25 µl. PCR reakce probíhaly v termocyklerech Perkin Elmer 2400 a Bioer XP cycler. Teplotní režim termocykleru byl pro reakce s markery mt15–D02, mt23–D02, mt1H01 nastaven na 94 °C 3 min. pro počáteční separaci DNA řetězců, dále se opakovalo v 35 cyklech: 94 °C 30 sec. pro denaturaci DNA do jednořetězcových molekul, 52 °C – 54 °C (podle druhu primeru) 3 min. pro nasedání primerů, 72 °C 1 min. elongační teplota pro syntézu nových vláken, po těchto cyklech následovala konečná elongační teplota 72 °C 10 min. a pak byly testované vzorky chlazeny při 4 °C. Pro reakci s markerem mh02 byl teplotní režim nastaven na: 94 °C 3 min., dále se opakovalo v 35 cyklech: 94 °C 45 sec., 56 °C 45 sec., 72 °C 2 min., po ukončení cyklů následovalo 72 °C 10 min. a nakonec byly testované vzorky chlazeny při 4 °C. Amplifikační produkty byly analyzovány elektroforeticky na 1,5% agarózových gelech v 0,5% TBE pufru (Tris borate EDTA pufr, Duchefa Biochemie B.V.) a vizualizovány pomocí ethidium bromidu (SAMBROOK, RUSSELL 2001). Na gel v horizontální elektroforetické aparatuře se nanášelo 5 ml PCR produktu a 5 ml loading buffer (Sigma - Aldrich). Doba
trvání elektroforézy byla 30 minut při napětí 40 V a pokračovala 150 minut při napětí 70 V. Gely byly dokumentovány pod UV zářením pomocí kamerového systému Discovery 10gD. Jako standard pro definování velikosti amplifikovaných produktů byl použit 100 bp DNA Ladder (NEW ENGLAND Biolabs). Byly získány amplifikační produkty po jednom bandu od každého vzorku, u markeru mh02 ve velikosti 1000 bp, u markeru mt23-D02 ve velikosti 400 bp, u markeru mt1H01 ve velikosti 700 bp, u markeru mt15-D02 byly detekovány 2 různé alely odpovídající velikosti fragmentů 1100 bp a 1250 bp (obr. 3). Srovnatelný výsledek ve velikosti amplifikovaných fragmentů v lokusu mt15-D02 uvádí MAGHULY et al. (2008) u potomstev smrku ztepilého z kontrolovaného křížení. Dále proběhlo testování různých druhů restrikčních endonukleáz, s cílem získat variabilní restrikční fragmenty. Pro štěpení amplifikovaných produktů byly testovány restrikční endonukleázy EcoRI, HinfI, AluI, MspI, HhaI, FspI, MfeI od New England BioLabs. Vzorky z PCR reakce byly společně s restrikční endonukleázou v reakční směsi s dodaným pufrem a sterilní ultračistou vodou inkubovány 5 hodin při 37 °C. Pak byly 15 minut vystaveny teplotě 70 °C a po prudkém zchlazení nanášeny do 2% agarózového gelu. Detekce štěpných produktů byla po elektroforéze vizualizována pomocí ethidium bromidu. Jako standard byla použita 100 bp DNA Ladder (NEW ENGLAND Biolabs). Gely byly dokumentovány pod UV zářením pomocí kamerového systému Discovery 10gD. Získané restrikční fragmenty nevykazovaly mezi sledovanými vzorky smrku ztepilého polymorfní charakter.
8
et al. (2000a) uvádí, že studium mikrosatelitů je u smrku ztepilého komplikované i z důvodu značné velikosti jeho genomu, který je 30 – 40 miliard párů bází dlouhý a obsahuje vysoký počet repetitivních oblastí (PFEIFFER et al. 1997), které způsobují tvorbu multilokusů a to komplikuje hodnocení amplifikačních produktů. Pro porovnání velikost lidského genomu je o řád nižší (přes 3 miliardy párů bází). Při genetickém studiu vybraných populací smrku ztepilého jsme vycházeli např. z práce SCOTTI et al. (2000a), který v kódující oblasti cDNA vyhledal několik mikrosatelitových lokusů s dinukleotidovou repeticí AG a AC. Protože lokusy byly získány z expresních sekvencí, lze u nich předpokládat, že by nemusely být v genomu tak četné a mohly by poskytovat jednotlivé amplifikační produkty SSR markerů. Autor navrhl pomocí programu PRIMER© v.0.5 primery k získaným mikrosatelitovým lokusům, jejich testování proběhlo na smrcích z původních populací Itálie a byly zjištěny sekvence primerů, které poskytovaly amplifikáty. Naším záměrem bylo mikrosatelitové primery otestovat na našich populacích smrku ztepilého, optimalizovat postupy PCR reakcí pro získání zřetelných amplifikačních produktů a vybrat sekvence primerů vedoucích k amplifikaci polymorfních mikrosatelitových lokusů. Z uvedené publikace byly testovány specifické primery pro lokusy PAAC3, PAAC11, PAAC 13, PAAC17, PAAC19 a PAAC23 (tab. 2). Dalšími ověřovanými mikrosatelitovými markery byly SpAG2 a SpAGD1, sekvence jejich primerů byly převzaty z práce MELNIKOVA et al. (2012). Reakční směs a teplotní cyklus PCR reakcí byly optimalizovány a modifikovány podle práce YAZDANI et al. (2003). Předběžné hodnocení získaných amplifikačních produktů bylo provedeno po proběhlé elektroforéze na 1,5% agarózových gelech v 0,5% TBE pufru (Tris borate EDTA pufr, Duchefa Biochemie B.V.) a vizualizováno pomocí ethidium bromidu (SAMBROOK, RUSSELL 2001) (obr. 4).
Obr. 3: Ukázka záznamu amplifikačních produktů na gelovém nosiči získaných po amplifikaci s primery k markeru mt15-D02, S je označení pro velikostní standard 100 bp DNA Ladder
SSR markery V současné době se za vysoce polymorfní DNA markery považují mikrosatelity – SSR (simple sequence repeats), proto byly použity ke studiu genetické variability i u námi sledovaných vzorků smrku ztepilého. Mikrosatelity jsou sekvence DNA složené z mnohokrát se opakujících krátkých zpravidla 2 - 4 báze dlouhých motivů. Mikrosatelitové lokusy patří mezi nejvariabilnější oblasti genomu, polymorfismus je dán zejména rozdílem v počtu opakování základního motivu. Uspořádání motivů v mikrosatelitových lokusech může být jednoduché, složené nebo přerušované. Kodominantní charakter markerů SSR umožňuje rozlišit homozygoty od heterozygotů. Mikrosatelitové lokusy získáme PCR reakcí s primery, které jsou komplementární se sekvencemi sousedícími s mikrosatelitovým lokusem. Sekvence primerů je možné získat prohledáváním zveřejněných sekvencí v různých databázích (např. EMBL, GenBank, DDBJ) nebo v publikacích. Další možností je navržení nových mikrosatelitových lokusů pomocí genomových knihoven, což je postup časově i finančně velmi náročný. Nejprve musí být provedena konstrukce genomové knihovny, dále detekce pozitivních klonů pomocí hybridizace s mikrosatelitovou sondou, sekvenování pozitivních klonů, navržení primerů pro amplifikaci mikrosatelitových lokusů a jejich testování. V genomu smrku ztepilého již byly vyhledávány mikrosatelitové lokusy a k nim navrženy sekvence primerů. SCOTTI 9
nutí primeru), 72 °C 45 sec. (elongace – zabudování volných nukleotidtrifosfátů na základě templátu do nově vznikajicího řetězce). Pak následovala teplota 72 °C 20 min. (konečná elongační teplota pro dobudování fragmentů) a nakonec byly testované vzorky chlazeny při 4 °C. Pro PCR reakce s primery k lokusům SpAGD1 a PAAC19 probíhal teplotní režim 94 °C 5 min., dále se opakovalo v 37 cyklech: 94 °C 45 sec., 57 °C 45 sec., 72 °C 45 sec. a nakonec následovala 20 min. teplota 72 °C. Amplifikační produkty byly před fragmentační analýzou denaturovány. Ke každému vzorku bylo přidáno 11 µl Formamidu (Hi-DiTM Formamide, Applied Biosystem) a 0,4 µl velikostního standardu (Gene ScanTM – 600 LIZ® Size standard v 2.0, Applied Biosystem) a probíhala inkubace 4 minuty při teplotě 94 °C, pak byly vzorky rychle zchlazeny na ledu. Fragmentační analýza byla provedena na genetickém analyzátoru Applied Biosystem 3500. Další ověřované mikrosatelitové lokusy WS00716.F13, WS0092.A19, WS0022. B15 pro testování polymorfismu u sledovaných populací smrku ztepilého byly získány na pracovišti ASP (Bavarian office for forest Seeding and Planting) v Teisendorfu (Německo). Tyto markery vyvinul RUNGIS et al. (2004) z kódující oblasti DNA tzv. EST (expressed sequence tags) - SSR markers (tab. 2). Polymerázová řetězová reakce probíhala s primery těchto lokusů formou multiplexu s primery fluorescenčně označenými 6FAM, VIC, NED. Pro každý vzorek byla reakce provedena v celkovém objemu 15 µl s využitím Type-it® Microsatellite PCR Kit (QIAGEN), koncentrace každého primeru byla 0,1 µM a vyizolované DNA bylo 10 – 20 ng. PCR reakce probíhala v termocykleru Veriti Thermal cycler (Applied Biosystem). Teplotní režim teplotního cyklovače byl nastaven na 95 °C 15 min. (denaturace DNA a aktivace polymerázy), dále se opakovalo v 26 cyklech: 94 °C 30 sec. (denaturace DNA do jednořetězcových molekul), 53 °C 90 sec. (teplota annealingu – přisednutí primeru), 72 °C 30 sec. (elongace – za-
Obr. 4: Ukázka záznamu amplifikačních produktů na gelovém nosiči získaných s primery k lokusu PAAC23 u vzorků z porostu Fláje - SM3 (velikostní standard 100 bp DNA Ladder je uprostřed amplifikátů)
Mezi blízkými genotypy je polymorfismus nižší. Při hodnocení jedinců stejného druhu, je pravděpodobné, že se mohou lišit jen v několika nebo i v jednom opakování motivu (u dinokluotidů to představuje 2 báze) a rozdíly nelze detekovat na agarózovém gelu. Je nutné primery nechat fluorescenčně označit a u získaných amplifikačních produktů provést fragmentační analýzu na genetickém analyzátoru. Hodnotitelné polymorfní fragmenty byly získány s primery k lokusům PAAC19, PAAC23 a SpAGD1. Tyto primery se nechaly nasyntetizovat fluorescenčně označené s modifikacemi 6FAM, VIC a NED. PCR probíhala pro každý vzorek v celkovém objemu 15 µl s použitím polymerázy Platinum® Taq DNA Polymerase (Invitrogen by Life technologies) a s ní dodanými komponenty. Obsahovala 1,5 µl 10xPCR buffer, 2 mM MgCl2 , 0,2 mM směsi dNTP, 0,37 jednotek Platinum Taq DNA Polymerase, specifické primery každý 0,1 µM k lokusům PAAC19 a SpAGD1, 0,2 µM k lokusu PAAC23, 10 – 20 ng vyizolované DNA a sterilní ultračistou vodou (Sigma - Aldrich, Molecular biology) byla reakční směs doplněna do objemu 15 µl. PCR reakce probíhaly v termocyklerech Bioer XP cycler, Biorer GenePro a Veriti Thermal cycler. Teplotní režim teplotního cyklovače byl nastaven pro PCR s primery k lokusu PAAC23: 94 °C 3 min. (denaturace DNA a aktivace polymerázy), dále se opakovalo v 40 cyklech: 94 °C 45 sec. (denaturace DNA do jednořetězcových molekul), 54 °C 45 sec. (teplota annealingu – přised10
budování volných nukleotidtrifosfátů na základě templátu do nově vznikajicího řetězce). Pak následovala teplota 60 °C 30 min. (konečná elongační teplota pro dobudování fragmentů) a nakonec byly testované vzorky chlazeny při 4 °C. Amplifikační produkty byly před fragmentační analýzou denaturovány stejným postupem jako u předcházejících studovaných mikrosatelitových lokusů. Velikost fragmentů byla odečtena pomocí genetického analyzátoru Applied Biosystem 3500. Genetický analyzátor pracuje na principu elektroforetického rozdělení fragmentů DNA v tenké kapiláře naplněné speciálním polymerem. Polymer i zkoumaný vzorek je do kapiláry naplňován automaticky. Detekce sekvenovaných úseků je založena na hodnocení fluorescence z fluorescenčně označených primerů po excitaci argonovým laserem. Přístroj je schopen souběžně detekovat vícebarevnou fluorescenci, což umožňuje v multiplexovém uspořádání hodnotit najednou více markerů. Hodnocení velikosti amplifikačních produktů bylo provedeno pomocí softwarového programu GeneMapper 4.1 (Applied Biosystems), který z výsledku měření velikostního standardu, který je přidáván ke všem vzorkům, stanoví kalibrační křivku a na jejím podkladě ohodnotí velikosti analyzovaných fragmentů. Výstupem programu je elektroforetogram získaných dat ve formátu matice všech spočítaných parametrů. Pro posouzení genetických charakteristik sledovaných populací smrku ztepilého byla získaná data mikrosatelitových markerů statisticky zpracována.
Tab. 2: Použité SSR markery a sekvence primerů lokus
Forward primer
Reverse primer
PAAC3
CGC TAC CTC AGA TTT CTC CA
AGA TAT TCC CTC ACA AAG TTG G
PAAC11
GTA ATG AAA TGT AGT AGC GAG GGT GTG TGT GTG TGT GT GGA GAT GG
PAAC13
GAT ATT GAT GTA CGC ACT GG
AAT TTT TTG AAC AAG AAG TTT TC
PAAC17
GAA ACA AAA ATT ATT ACG CG
ATG CCC TCC TAA TGA ATG
PAAC19
ATG GGC TCA AGG ATG AAT G
AAC TCC AAA CGA TTG ATT TCC
PAAC23
TGT GGC CCC ACT TAC TAA TAT CAG
CGG GCA TTG GTT TAC AAG AGT TGC
SpAGD1
GTC AAC CAA CTT GTA AAG CCA
ACT TGT TTG GCA TTT TCC C
SpAG2
GCT CTT CAC GTG TAC TTG ATC
TTC GAA GAT CCT CCA AGA TA
WS00716.F13 TCA AGT AAT GGA CAA ACG ATA CA
TTT CCA ATA GAA TGG TGG ATT T
WS0092.A19
GAT GTT GCA GGC ATT CAG AG
GCA CCA GCA TCG ATT GAC TA
WS0022.B15
TTT GTA GGT GCT GCA GAG ATG
TGG CTT TTT ATT CCA GCA AGA
Výsledky Pro předběžné ověření genetické proměnlivosti sledovaných jedinců smrku ztepilého byla použita metoda RAPD a byl vytipován primer OPBC – 17 potvrzující genetickou proměnlivost vzorků smrku ztepilého. V případě metody PCR - RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphis – polymorfizmus délky restrikčních fragmentů) nebyl u námi sledovaných vzorků zjištěn polymorfismus. Při použití metody SSR bylo pro testování vzorků smrku ztepilého vyhledáno 6 mikrosatelitových markerů, které vykazovaly polymorfismus a výsledky byly interpretovatelné. Jejich amplifikační produkty dosahovaly velikosti v rozmezí 272 - 310 bp u markeru PAAC23, 114 - 164 bp u markeru SpAGD1, 153 - 195 bp u markeru PAAC19, 214 – 316 bp u markeru WS00716.F13, 207 – 243 bp u markeru WS0092.A19, 177 – 221 bp u markeru WS0022.B15. Hraniční velikosti alel pro sledované populace jsou uvedeny v tab. 3. 11
Tab. 3: Rozsah velikostí alel u hodnocených lokusů pro populace smrku ztepilého Populace smrku ztepilého
Lokus PAAC23
Lokus PAAC19
Lokus SpAGD1
Lokus WS00716.F13
Lokus WS0092.A19
Lokus WS0022.B15
SM1
272-310
153-195
124-162
220-296
207-243
177-205
SM2
272-284
153-175
122-164
220-296
207-233
177-219
SM3
272-310
153-173
114-164
220-316
207-233
177-201
SMA
272-310
153-173
120-162
218-314
207-243
177-201
SMB
272-284
153-173
120-164
216-296
207-243
177-221
SMR
272-282
157-171
126-146
222-316
207-223
177-221
SMK
272-284
153-175
122-162
220-296
207-213
179-221
SMCH ČS
274-286
157-175
120-164
214-300
207-223
177-201
SMCH KŘ
276-294
153-173
122-164
222-316
207-211
177-221
SM02
272-310
153-185
122-164
216-296
207-211
177-199
čené SM3. Nejnižší hodnoty Ho = 0,668 pak byly získány u populace chlumního ekotypu z Křivoklátska. V tabulce 6 jsou uvedeny i průměrné hodnoty počtu efektivních alel, který byl nejvyšší u populace z Flájí SMA 6,644, tato populace má také nejvyšší počet alelických variant 12,333. Další genetická charakteristika uvedená v tabulce 6 je Shannonův informační index ukazující míru genetické diverzity pro jednotlivé populace. Nejvyšší hodnotu dosáhla populace SMA 1,969 a nejnižší SMR 1,619. Jedna z nejvýznamnějších genetických charakteristik je ohodnocení genetických vzdáleností mezi populacemi, které byly pro sledované vzorky vypočítány na základě Neiovy standardní genetické vzdálenosti (NEI 1972), (tab. 7). Získané hodnoty byly dále zpracovány pomocí analýzy PCoA (Principal Coordinate Analysis – analýza hlavních koordinát), která slouží k hodnocení vzdáleností největší variability v datech na základě koeficientů podobnosti mezi jedinci, viz obr. 6. Z PCoA analýzy vyplývá, že geneticky nejblíže jsou si populace z oblasti Krušných hor, více se od nich pouze vzdaluje populace SMR ze Saska. Populace chlumního ekotypu z lokalit Českosaské Švýcarsko a Křivoklátsko jsou seskupeny vzdáleněji od ostatních populací. Geneticky nejvzdálenější se jeví populace SM02 z Orlických hor, která také dosahuje nejvyšších hodnot Neiovy míry ge-
Výsledky analýz byly zpracovány pomocí statistického programu GenAlEx 6.5 (PEAKALL, SMOUSE 2006, 2012). U hodnocených 200 jedinců z 10 populací bylo celkově detekováno 582 různých polymorfních alel v 6 lokusech, v průměru na populaci 9,7 alel na lokus. Nejvíce polymorfní se jevil lokus SpAGD1 u kterého bylo v průměru na populaci detekováno 14,8 alel, u lokusu WS00716.F13 to bylo 11,9 alel, u WS0022.B15 10,7 alel, u PAAC19 9,7, u PAAC23 6,6 alel, nejméně polymorfní byl lokus WS0092.A19 u kterého bylo detekováno 4,5 alel. Alelické varianty u sledovaných populací a jednotlivých lokusů jsou uvedeny v tabulce 4. Alelické frekvence u sledovaných populací pro jednotlivé lokusy jsou graficky znázorněné na obrázku 5. Všech 6 lokusů u sledovaných populací bylo 100% polymorfních, na základě vypočítané hodnoty P (procentní podíl polymorfních lokusů). Hodnoty heterozygotnosti, což je podíl heterozygotních jedinců v daném lokusu udává tabulka 5. Pozorovaná heterozygotnost (Ho) u celkového souboru 200 jedinců byla nejvyšší u lokusu WS0022.B15 a to 0,931, očekávaná heterozygotnost (He) byla pro tento lokus nižší 0,826. Průměrné hodnoty heterozygotnosti pro jednotlivé populace jsou uvedeny v tabulce 6. Nejvyšší podíl pozorovaných heterozygotů (hodnota Ho = 0,842) se ukázal v populaci z Flájí ozna12
netických vzdáleností vzhledem k ostatním sledovaným populacím, nejvyšší hodnota byla 0,438 mezi SMR (Sasko) a SM02 (Trčkov – Šerlišský kotel - Orlické hory). Hodnoty genetických vzdáleností mezi populacemi jsou vzestupně seřazeny v tabulce 8. Dalším vyhodnoceným genetickým kriteriem byl FST - koeficient Inbreedingu, který porovnává míru genetické diferenciace vzájemně mezi populacemi (tab. 9). Populace
jsou párově separovány podle podílu na celkové genetické rozdílnosti. FST koeficient se pohybuje v hodnotách od 0 – 1 a v případě, že populace jsou v Hardy - Weinbergově rovnováze se stejnou alelickou frekvencí je roven 0. Zjištěné FST párové hodnoty pro hodnocené populace se pohybovaly od 0,011 do 0,067. Což představuje malou až střední genetickou diferenciaci mezi populacemi (WRIGHT 1965).
Tab. 4: Alelické varianty u populací smrku ztepilého v jednotlivých lokusech SM1
SM2
SM3
SMA
SMB
SMK
SMR
SMCH ČS
SMCH KŘ
SM02
PAAC 23
8,000
6,000
8,000
8,000
6,000
6,000
5,000
6,000
6,000
7,000
PAAC 19
12,000
11,000
11,000
12,000
9,000
7,000
5,000
10,000
9,000
11,000
SpAGD1
14,000
16,000
17,000
21,000
19,000
14,000
10,000
14,000
10,000
13,000
WS00716.F13
10,000
12,000
14,000
14,000
14,000
12,000
12,000
10,000
10,000
11,000
WS0092.A19
6,000
5,000
4,000
7,000
8,000
3,000
4,000
4,000
2,000
2,000
WS0022.B15
11,000
12,000
11,000
12,000
11,000
9,000
9,000
11,000
11,000
10,000
Obr. 5: Alelické frekvence u hodnocených populací smrku ztepilého v jednotlivých lokusech
Frequency
Allele Frequency for PAAC23
SM1 SM2 SM3
0,800 0,600 0,400 0,200 0,000
SMA SMB SMK 268
272
274
276
278
280
282
284
286
288
294
298
310
SMCH ČS
PAAC23
SMCHKŘ
Locus
SM02
Allele Frequency for PAAC19
SM1 SM2 SM3
0,500 0,400 0,300 0,200 0,100 0,000
SMA SMB
PAAC19 Locus
13
195
193
185
183
176
175
174
173
172
171
169
167
165
164
163
161
159
157
156
155
SMK
153
Frequency
SMR
SMR SMCH ČS SMCHKŘ SM02
SM1 SM2 SM3
0,400 0,300 0,200 0,100 0,000
SMA SMB
160 162 164
156 158
150 152 154
146 148
140 142 144
136 138
130 132 134
126 128
120 122 124
SMK
114 118
Frequency
Allele Frequency for SpAGD1
SMCH ČS
SpAGD1
SMCHKŘ
Locus
SM02 SM1 SM2
316
314
300
296
270
268
266
256
250
242
240
238
236
234
232
230
228
226
SMK
224
SMB
0,000
222
0,100
220
SMA
218
SM3
0,200
216
0,300
214
Frequency
Allele Frequency for WS00716.F13
SMCHKŘ
Locus
SM02
Allele Frequency for WS0092.A19 Frequency
SMR SMCH ČS
WS00716.F13
SM1 SM2 SM3
1,000 0,800 0,600 0,400 0,200 0,000
SMA SMB SMK 189
207
211
213
217
223
225
227
233
241
243
WS0092.A19 Locus
Allele Frequency for WS0022.B15 Frequency
SMR
SMR SMCH ČS SMCHKŘ SM02 SM1 SM2 SM3
0,500 0,400 0,300 0,200 0,100 0,000
SMA SMB SMK 177 179 181 183 185 187 189 191 193 195 197 199 201 205 211 219 221 WS0022.B15 Locus
14
SMR SMCH ČS SMCHKŘ SM02
Tab. 5: Průměrné hodnoty heterozygotnosti u všech sledovaných vzorků pro jednotlivé lokusy Lokus
PAAC 23
PAAC 19
SpAGD1
WS00716.F13
WS0092.A19
WS0022.B15
Ht
0,647
0,851
0,936
0,911
0,443
0,855
Mean He
0,618
0,802
0,884
0,872
0,408
0,826
Mean Ho
0,611
0,889
0,693
0,890
0,444
0,931
Ho = Heterozygotnost pozorovaná He = Heterozygotnost očekávaná Ht = Celková očekávaná heterozygotnost
Tab. 6: Průměrné hodnoty statistických charakteristik pro jednotlivé populace ze všech pozorovaných lokusů Populace
Na
Ne
I
Ho
He
SM1
Mean
10,167
5,309
1,785
0,706
0,722
SM2
Mean
10,333
6,171
1,836
0,724
0,730
SM3
Mean
10,833
6,042
1,910
0,842
0,771
SMA
Mean
12,333
6,644
1,969
0,715
0,763
SMB
Mean
11,167
5,908
1,831
0,706
0,725
SMK
Mean
8,500
5,008
1,619
0,744
0,685
SMR
Mean
7,500
4,754
1,611
0,790
0,722
SMCH ČS
Mean
9,167
4,948
1,721
0,722
0,724
SMCH KŘ
Mean
8,000
4,978
1,684
0,668
0,731
SM02
Mean
9,000
5,997
1,844
0,813
0,776
Na = Počet různých alel Ne = Počet efektivních alel I = Shannonův informační index Ho = Heterozygotnost pozorovaná He = Heterozygotnost očekávaná
Tab. 7: Genetické vzdálenosti mezi populacemi na základě Neiovy míry genetických vzdáleností SM1 SM1
SM2
SM3
SMA
SMB
SMK
SMR
SMCH ČS
SMCH KŘ
SM02
0,000
SM2
0,062
0,000
SM3
0,085
0,079
0,000
SMA
0,075
0,071
0,085
0,000
SMB
0,090
0,069
0,095
0,062
0,000
SMK
0,172
0,138
0,151
0,095
0,164
0,000
SMR
0,202
0,178
0,234
0,163
0,182
0,221
0,000
SMCH ČS
0,151
0,168
0,175
0,104
0,139
0,227
0,280
0,000
SMCH KŘ
0,150
0,178
0,154
0,098
0,161
0,211
0,238
0,107
0,000
SM02
0,285
0,306
0,290
0,287
0,297
0,401
0,438
0,267
0,306
15
0,000
Obr. 6: Grafické znázornění genetických vzdáleností sledovaných populací smrku ztepilého
Principal Coordinates (PCoA)
Coord. 2
SMR
SM02
SMK
SM2 SM1 SMB SM3 SMA SMCHKŘ SMCH ČS Coord. 1
Tab. 8: Vzestupné seřazení genetických vzdáleností mezi populacemi 1.
0,062
SM1-SM2
22.
0,164
SMB-SMK
2.
0,062
SMA-SMB
23.
0,168
SM2-SMCH ČS
3.
0,069
SM2-SMB
24.
0,172
SM1-SMK
4.
0,071
SM2-SMA
25.
0,178
SM2-SMR
5.
0,075
SM1-SMA
26.
0,178
SM2-SMCH KŘ
6.
0,079
SM2-SM3
27.
0,182
SMB-SMR
7.
0,085
SM1-SM3
28.
0,202
SM1-SMR
8.
0,085
SM3-SMA
29.
0,211
SMK-SMCH KŘ
9.
0,090
SM1-SMB
30.
0,221
SMK-SMR
10.
0,095
SM3-SMB
31.
0,227
SMK-SMCH ČS
11.
0,095
SMA-SMK
32.
0,238
SMR-SMCH KŘ
12.
0,098
SMA-SMCH KŘ
33.
0,267
SMCH ČS-SM02
13.
0,104
SMA-SMCH ČS
34.
0,280
SMR-SMCH ČS
14.
0,107
SMCH ČS-SMCH KŘ
35.
0,285
SM1-SM02
15.
0,138
SM2-SMK
36.
0,287
SMA-SM02
16.
0,139
SMB-SMCH KŘ
37.
0,290
SM3-SM02
17.
0,150
SM1-SMCH KŘ
38.
0,297
SMB-SM02
18.
0,151
SM1-SMCH ČS
39.
0,306
SM2-SM02
19.
0,151
SM3-SMK
40.
0,306
SMCH KŘ-SM02
20.
0,154
SM3-SMCH KŘ
41.
0,401
SMK-SM02
21.
0,163
SMA-SMR
42.
0,438
SMR-SM02
16
Tab. 9: FST - Koeficient Inbreedingu určující genetickou rozdílnost mezi populacemi Pairwise Population Fst Values
SM1
SM2
SM1
0,000
SM2
0,011
0,000
SM3
0,014
0,014
SM3
SMA
SMB
SMK
SMR
SMCH ČS
SMCH KŘ
SM02
0,000
SMA
0,013
0,013
0,013
0,000
SMB
0,016
0,013
0,017
0,011
0,000
SMK
0,031
0,028
0,029
0,020
0,032
0,000
SMR
0,036
0,032
0,036
0,028
0,031
0,046
0,000
SMCH ČS
0,025
0,028
0,025
0,017
0,023
0,040
0,045
0,000
SMCH KŘ
0,024
0,030
0,022
0,016
0,028
0,037
0,043
0,018
0,000
SM02
0,044
0,047
0,036
0,039
0,044
0,067
0,057
0,038
0,043
0,000
A19 a nejvyšší (0,928) u populace SMA v lokusu SpAGD1. Dle průměrných hodnot byly sledované populace nejvariabilnější v lokusu SpAGD1 (0,884), nejméně variabilní v lokusu WS0092.A19 (0,408). Nejvýraznější rozdíly v míře polymorfismu mezi populacemi byly zjištěny v lokusu WS0092.A19. Průměrné hodnoty polymorfního informačního obsahu souhrnně za všechny lokusy se mezi populacemi výrazně nelišily. Nejvíce polymorfní byla populace SM02 (0,776), nejméně polymorfní SMK (0,685). Největší rozdíl ve variabilitě ve stejném lokusu byl mezi populacemi SMK (0,210) a SMR (0,565) v lokusu WS0092.A19.
Polymorfní informační obsah (PIC - Polymorphism Information Content ) pro vyjádření genetické variability (stupně polymorfismu) sledovaných populací v hodnocených lokusech (tab. 10) byl vypočítán z hodnot získaných pomocí programu GenAlEx 6.5 (PEAKALL, SMOUSE 2006, 2012). PIC hodnoty pro každý mikrosatelitový lokus byly stanoveny na základě frekvencí alel na lokus pomocí vzorce PIC =1− Σ xi2, kde xi je relativní frekvence i-té alely mikrosatelitového lokusu. Markery byly klasifikovány jako informativní, když hodnota PIC byla ≥ 0,5 (SHARMA et al. 2009). Stupeň polymorfismu stanovený hodnotou PIC byl zjištěn nejnižší (0,210) u populace SMK v lokusu WS0092. Tab. 10: Polymorfní informační obsah (PIC) u sledovaných populací pro jednotlivé lokusy. Lokus
SM1
SM2
SM3
SMA
SMB
SMK
SMR
SMCH ČS
SMCH KŘ
SM02
PAAC 23
0,611
0,516
0,730
0,650
0,471
0,645
0,556
0,569
0,742
0,693
PAAC 19
0,839
0,867
0,844
0,827
0,784
0,734
0,639
0,789
0,811
0,884
SpAGD1
0,902
0,910
0,904
0,928
0,920
0,896
0,858
0,837
0,839
0,843
WS00716.F13
0,836
0,890
0,875
0,897
0,896
0,885
0,870
0,862
0,831
0,883
WS0092.A19
0,336
0,375
0,441
0,448
0,485
0,210
0,565
0,422
0,305
0,491
WS0022.B15
0,809
0,823
0,833
0,827
0,794
0,743
0,846
0,867
0,859
0,861
Průměr
0,722
0,730
0,771
0,763
0,725
0,685
0,722
0,724
0,731
0,776
17
sia). SCOTTI et al. (2000b) analyzoval pomocí SCAR markerů 7 italských populací z oblasti Alp, hodnoty očekávané heterozygotnosti se pohybovaly od 0,358 do 0,468, u námi sledovaných populací se pohybovaly od 0,685 (SMK) do 0,776 (SM02). Ve srovnání s italskými populacemi studovanými výše uvedenými autory vykazovaly námi sledované populace na základě hodnot očekávané heterozygotnosti vyšší genetickou diverzitu. SCHUBERT et al. (2001) zjistil u 110 stromů z bavorské populace smrku ztepilého průměrnou hodnotu pozorované heterozygotnosti 0,635, hodnoty pozorované heterozygotnosti u námi sledovaných populací byly od 0,668 (SM3) do 0,842 (SMCH KŘ), u námi sledovaných populací byla pozorována opět vyšší genetická diverzita. U 18 stromů pocházejících ze 3 italských a 1 švýcarské populace při použití 7 SSR markerů se hodnoty očekávané heterozygotnosti pohybovaly od 0,43 do 0,94 (PFEIFFER et al. 1997). Ke genetické charakterizaci sedmi populací (Rusko, severní Švédsko, jižní Švédsko, Německo, Švýcarsko, Itálie, Rumunsko) HEUERTZ et al. (2006) použili FST - koeficient Inbreedingu. Protože porovnávali geograficky vzdálené populace získali vyšší hodnoty FST ve srovnání s populacemi, které jsme hodnotili jen na území ČR. Nejvíce se odlišovala populace z Rumunska, která dosahovala s ostatními populacemi hodnot FST od 0,194 do 0,262. U našich populací jsme získali nejvyšší párovou hodnotu FST 0,067 mezi populacemi SM02 (Trčkov – Šerlišský kotel - Orlické hory) a SMK (povodí Rauschenbachu, Sasko). V práci MELONI et al. (2007) byla u sledovaných 6 italských populací nalezena celková hodnota FST 0,05, což naznačuje poměrně nízkou genetickou diverzitu vyplývající ze sledovaných genetických rozdílů mezi populacemi, nejvyšší párová hodnota FST mezi sledovanými populacemi byla 0,089, podobné výsledky uvádí SCOTTI et al. (2006) při použití dinukleotidových, trinukleotidových a chloroplastových SSR markerů. Ve srovnání s výsledky práce MELONI
Diskuse V současnosti mnoho autorů studujících genetickou variabilitou u smrku ztepilého využívá pro analýzy SSR markery. Pro genetický průzkum sledovaných populací smrku ztepilého byly v naší práci použity mikrosatelitové markery (SSR lokusy) vybrané na základě práce RUNGIS et al. (2004), kde autoři pro porovnání genetických charakteristik 23 druhů rodu Picea použili 37 mikrosatelitových markerů. Porovnali jsme velikosti získaných amplifikovaných alel vybraných totožných lokusů pro smrk ztepilý s velikostmi alel uvedených v článku. U lokusu PAAC23 autoři uvádějí velikosti alel 290 a 300 bp (naše výsledky byly 272 - 310 bp), u lokusu PAAC19 je uvedena velikost 167 a 175 bp (naše výsledky byly 153 -195 bp), u lokusu WS0092.A19 232 a 244 bp (naše výsledky byly 207 – 243), u lokusu WS0022.B15 je uvedena velikost 210 a 222 (naše výsledky byly 177 – 221 bp). Rozpětí velikostí alel u našich vzorků bylo podstatně vyšší vzhledem k tomu, že jsme sledovali 200 jedinců, v rámci námi zjištěného rozpětí se nachází i velikosti alel uvedených v práci Rungise, který uvádí velikosti alel ke každému lokusu zjištěné z analýzy jednoho stromu. V případě existence dvou velikostí alel je hodnocený jedinec smrku ztepilého v uvedených lokusech heterozygotní. Dále autor u vybraných druhů smrků (Picea sitchensis, P. glauca a P. mariana) hodnotil pozorovanou a očekávanou heterozygotnost, hodnocení provedl na souborech o velikosti cca 20 jedinců. U námi sledovaného souboru 200 vzorků si byly hodnoty očekávané a pozorované heterozygotnosti podobnější při srovnání s Rungisem sledovaných malých souborů tří druhů smrků. Genetickou variabilitu pro 6 původních populací z oblasti západních Alp při použití 7 SSR markerů zjišťovali ve své studii MELONI et al. (2007). Průměrné hodnoty očekávané heterozygotnosti u sledovaných italských populací se pohybovaly od 0,588 (populace Valdieri) do 0,671 (populace Valse18
et al. (2007) uvádí při použití SCAR markerů u italských populací z oblasti západních Alp SCOTTI et al. (2000b) vyšší úroveň celkové hodnoty FST (0,118). U 37 populací z oblasti severní Evropy (Norsko, Švédsko, Rusko, Pobaltské republiky) TOLLEFSRUD et al. (2009) zjistili při použití 7 mikrosatelitových markerů nízkou celkovou hodnotu FST (0,029). U námi sledovaných populací se párové hodnoty FST mezi populacemi pohybovaly od 0,011 do 0,067. Nízká úroveň genetické diverzity mezi populacemi vyjádřená pomocí koeficientu FST se vyskytuje obecně u lesních dřevin a zvláště u jehličnanů (HAMRICK et al. 1992). TOLLEFSRUD et al. (2008) ve své rozsáhlé studii analyzující 369 evropských populací smrku ztepilého pomocí mitochondriálního markeru zjistili pro populace Českého masivu ve srovnání s populacemi východních Alp a karpatskými populacemi (populace střední Evropy) nízkou genetickou diverzitu (GST). U 9 euroasijských populací smrku ztepilého zjištovali MELNIKOVA et al. (2012) genetické parametry i pomocí lokusu SpAGD1, hodnota očekávané heterozygotnosti byla 0,9 a pozorované heterozygotnosti 0,432 a koeficient inbreedingu - FST byl 0,145. Námi sledované populace smrku v ČR měly v tomto lokusu hodnotu očekávané heterozygotnosti nižší (0,884) a pozorované heterozygotnosti vyšší (0,693), což by mohlo být způsobeno vyšší frekvencí nulových alel u euroasijských populací. Hodnota FST (hodnotící genetickou diferenciaci mezi populacemi), která byla dosažena u euroasijských populací byla vyšší, to je nejspíše způsobeno většími geografickými vzdálenostmi mezi euroasijskými populacemi. Hodnotu FST 0,6 uvádí ve své práci VENDRAMIN et al. (2000) při sledování 97 euroasijských populací smrku ztepilého pomocí chloroplastových mikrosatelitových markerů.
mocí DNA analýz. Pro získání polymorfních lokusů byly testovány DNA markery jako RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), PCR – RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphis) pro mitochondriální úseky DNA a mikrosatelity - SSR (simple sequence repeats). U 6 mikrosatelitových lokusů (PAAC23, PAAC19, SpAGD1, WS00716.F13, WS0092.A19, WS0022.B15) amplifikační produkty vykazovaly významný polymorfismus, byly interpretovatelné a proto byly užity ke studiu polymorfismu sledovaných smrků. Cílem práce bylo pomocí genetických charakteristik porovnat proměnlivost sledovaných porostů z oblasti povodí nádrží Fláje a Rauschenbach. Pro porovnání byly studovány i dvě populace chlumního ekotypu smrku ztepilého a to z oblasti Českosaského Švýcarska a Křivoklátska a dále jedna populace horského ekotypu z Orlických hor z oblasti Trčkova. Zpracováním molekulárních dat získaných ze souboru 200 jedinců byly získány statistické charakteristiky všech 6 mikrosatelitových markerů. Byly hodnoceny počty a frekvence alel, pozorovaná i očekávaná heterozygotnost, FST - koeficient Inbreedingu, Shannonův informační index, proběhlo ohodnocení genetických vzdáleností mezi populacemi na základě Neiovy standardní genetické vzdálenosti, na které navazovalo grafické zpracování vzdáleností pomocí analýzy PCoA (Principal Coordinate Analysis), byl kalkulován PIC- polymorfní informační obsah. Z těchto hodnocení vyplývá, že u sledovaných 200 jedinců bylo celkově detekováno 582 různých polymorfních alel v 6 lokusech. Nejvíce alel bylo detekováno u lokusu SpAGD1, u kterého bylo v průměrně 14,8 alel na populaci. Nejvyšší podíl pozorovaných heterozygotů byl zjištěn v populaci z lokality Fláje – SM3. Z hodnocení genetických vzdáleností mezi populacemi a grafického znázornění se ukázalo, že populace z oblasti Krušných hor jsou si geneticky nejblíže a vytvořily samostatnou skupinu, pouze populace SMR ze Saska je od ní vzdálená.
Závěr Genetická proměnlivost 10 vybraných porostů smrku ztepilého byla studována po19
Literatura:
Dvojice populací chlumního ekotypu z lokalit Českosaské Švýcarsko a Křivoklátsko mají k sobě geneticky nejblíže a jsou vzdálenější od ostatních populací. Geneticky nejvzdálenější se jeví populace SM02 z Orlických hor. Při hodnocení míry genetické diferenciace mezi populacemi pomocí FST - koeficient Inbreedingu se zjistila malá až střední genetická diferenciace mezi populacemi. Při porovnávání genetické variability sledovaných populací pomocí polymorfního informačního obsahu se ukázalo, že průměrná hodnota míry polymorfismu pro sledované lokusy je u všech hodnocených populací poměrně vysoká a hodnoty polymorfismu se od sebe výrazně neliší. Významné rozdíly v míře polymorfismu byly zjištěny na úrovni jednotlivých lokusů, nejnižší polymorfismus byl v lokusu WS0092.A19 u populace SMK a nejvyšší v lokusu SpAGD1 u populace SMA. Zhoršený zdravotní stav této populace je vzhledem k poměrně vysoké úrovni polymorfismu pravděpodobně způsoben nepříznivým vlivem stanoviště. Analýzy mikrosatelitových markerů se ukázaly jako vhodné pro detekci genetických charakteristik u studovaných populací smrku ztepilého. Hodnocení variability porostů na sledovaných lokalitách bylo provedeno na základě analýzy 6 mikrosatelitových lokusů. Vybrané lokusy byly ověřeny jako vysoce polymorfní a mohou být využity jako genetické markery pro genetickou analýzu populací smrku ztepilého. Při porovnání genetické variability původních populací smrku ztepilého (horský ekotyp - Orlické hory a chlumní ekotyp – Českosaské Švýcarsko a Křivoklátsko) s genetickou variabilitou vyselektované zbytkové populace smrku ztepilého vzniklé umělou obnovou v povodí Rašeliníku, nebyly zjištěny rozdíly v úrovni polymorfismu, což je předpokladem přežití tohoto druhu dřeviny v místních extrémních přírodních podmínkách.
BROWN T. A. 2006. Klonování genů a analýza DNA. Z anglického originálu Gene Cloning and DNA Analysis: An Introduction (fifth edition - ISBN 13: 978-14051-1121-8, ISBN-10: 1-4051-1121 6). Vydala Univerzita Palackého v Olomouci. 1. české vydání. Translation © Martin Fellner a kol., 2007. ISBN 978-80-244-1719-6. HAMRICK J. L., GODT M. J. W., SHERMAN-BROYLES S. L. 1992. Factors influencing levels of genetic diversity in woody plant species. New Forest, 6: 95 – 124. HEUERTZ M., DE PAOLI E., KÄLLMAN T., LARSSON H., JURMAN I., MORGANTE M., LASCOUX M., GYLLENSTRAND N. 2006. Multilocus Patterns of Nukleotide Diversity, Linkage Disequilibrium and Demographic History of Norway Spruce [Picea abies (L.) Karst]. Genetics, 174: 2095 2105. CHMELAŘ J. 1980. Dendrologie s ekologií lesních dřevin. Část I. Jehličnany. Vysoká škola země dělská v Brně. JEANDROZ S., BASTIEN D., CHANDELIER A., DU JARDIN P., FAVRE J. M. 2002. A set of primers for amplification of mitochondrial DNA in Picea abies and other conifer species. Molecular Ecology Notes, 2: 389 – 392. MALÁ J., DUJÍČKOVÁ M., KÁLAL J. 1995. The develop ment of encapsulated somatic embryos of Norway Spruce (Picea abies /L./ Karst.). Communicationes Instituti Forestalis Bohemicae, 18: 59 - 73. MAGHULY F., BURG K., PINSKER W., NITTINGER F., PRAZNIK W., FLUCH S. 2008. Development of Mitochondrial Markers for Population Genetics of Norway Spruce [Picea abies (L.) Karst.]. Silvae Genetica, 57 (1): 41 - 44. MELONI M., PERINI D., BINELLI G. 2007. The distribution of genetic variation in Norway spruce (Picea abies Karst.) populations in the western Alps. Journal of Biogeography, 34: 929 – 938. MELNIKOVA M. N., PETROV N. B., LOMOV A. A., LA PORTA N., POLITOV D. V. 2012. Testing of Microsatellite Primers with Different populations of Eurasian Spruces Picea abies (L.) Karst. and Picea obovata Ledeb. Russian Journal of Genetics, 48: 562 – 566. NEI M. 1972. Genetic distance between populations. American Naturalist, 106: 283 - 392. NKONGOLO K. K. 1999. RAPD variations among pure and hybrid populations of Picea mariana, P. rubens, and P. glauca (Pinaceae), and cyto genetic stability of Picea hybrids: identification of species-specific RAPD markers. Plant Syste matics and Evolution, 215: 229 -239.
20
PAULE L. 1992. Genetika a šľachtenie lesných dre vín. 1. vyd., Príroda a. s. Bratislava: 304 s. ISBN 80-07-00409-2. PEAKALL R., SMOUSE P. E. 2006. GENALEX 6: ge netic analysis in Excel. Population genetic soft ware for teaching and research. Molecular Eko logy Notes, 6: 288 - 295. PEAKALL R., SMOUSE P. E. 2012. GenAlEx 6.5: genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research-an update. Bioinformatics, 28: 2537 - 2539. PERRY D. J., ISABEL N., BOUSQUET J. 1999. Sequence-tagged–site (STS) markers of arbit rary genes: the amount and nature of varia tion revealed in Norway spruce. Heredity, 83: 239 – 248. PFEIFFER A. M., OLIVIERY A. M., MORGANTE M. 1997. Identification and Characterization of Microsatellites in Norway Spruce (Picea abies K.), Genome, 40: 411 - 419. RUNGIS D., BÉRUBÉ Y., ZHANG J., RALPH S., RITLAND C. E., ELLIS B. E., DOUGLAS C., BOHLMANN J., RITLAND K. 2004. Robust simple sequence repeat markers for spruce (Picea spp.) from expressed sequence tags. Theor. Appl.Genet., 109: 1283 – 1294. SAMBROOK J., RUSSELL D. W. 2001. Molecular cloning – a laboratory manual. New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 3 vol. SHARMA M. V, KANTARTZI S. K., STEWART J. M. 2009. Molecular Diversity and Polymorphism Information Content of Selected Gossypium hirsutum Accessions. Summaries of Arkansas Cotton Research 2009, Research Series 582, Agricultural communication services, 124 – 127. SCHUBERT R., MUELLER-STARCK G., RIEGEL R. 2001. Development of EST-PCR markers and monitoring their intrapopulational genetic varition in Picea abies (L.) Karst. Theor Appl Genet, 103: 1223 - 1231. SCOTTI I., MAGNI F., FINK R., POWELL W., BINELLI G., HEDLEY P. E. 2000a. Microsatellite repeats ara not randomly distributed within Norway spruce (Picea abies K.) expressed sequences. Genome, 43: 41 – 46. SCOTTI I., VENDRAMIN G. G., MATTEOTTI L. S., SCARPONI C., SARI-GORLA M., BINELLI G. 2000b. Postglacial recolonization routes for Picea abies K. in Italy as suggested by the analysis of sequence-characterized amplified region (SCAR) markers. Molecular Ekology, 9: 699 – 708. SCOTTI I., PAGLIA G., MAGNI F., MORGANTE M. 2006. Populations genetics (Picea abies Karst.) at regional scale: sensitivity of different micro satellite motif classes in detecting differentiation. Ann. For. Sci., 63: 485 – 491.
TOLLEFSRUD M. M., KISSLING R., GUGERLI F., JOHNSEN Ø., SKRØPPA T., CHEDDADI R., VAN DER KNAAP W. O., LATAŁOWA M., TERHÜRNE BERSON R., LITT T., GEBUREK T., BROCHMANN C., SPERISEN CH. 2008. Genetic consequences of glacial survival and postglacial colonization in Norway spruce: combined analysis of mito chondrial DNA and fossil pollen. Molecular Ekology, 17: 4134 – 4150. TOLLEFSRUD M. M., SØNSTEBØ J. H., BROCHMANN C, JOHNSEN Ø., SKRØPPA T., VENDRAMIN G. G. 2009. Combined analysis of nuclear and mito chondrial markers provide new insight into the genetic stucture of North European Picea abies. Heredity, 10: 549 – 562. ÚRADNÍČEK L., MADĚRA P., TICHÁ S., KOBLÍŽEK J. 2009. Dřeviny České republiky. Nakladatelství a vydavatelství Lesnická práce, s.r.o. ISBN 978 80-87154-62-5. 366 s. YAZDANI R., SCOTTI I., JANSSON G., PLOMION CH., MATHUR G. 2003. Inheritance and diversity of simple sequence repeat (SSR) microsatellite markers in various families of Picea abies. Hereditas, 138: 219 - 227. VENDRAMIN G. G., ANZIDEI M., MADAGHIELE A., SPERISEN C., BUCCI G. 2000. Chloroplast micro satellite analysis reveals the presence of popu lation subdivision in Norway spruce (Picea abies K.). Genome, 43: 68 – 78. WILLIAMS J. G. K., KUBELIK A. R., LIVAK K. J., RAFALSKI J. A., TINGEY S. V. 1990. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids. Research, 18 (22): 6531 – 6535. WRIGHT S. 1965. The interpretation of population structure by F-Statistics with special regard to system of mating. Evol., 19: 395 - 20.
21
Toto dílo vzniklo v rámci Programu na podporu přeshraniční spolupráce mezi Českou republikou a Svobodným státem Sasko.
