VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V BRNĚ BRNO UNIVERSITY OF TECHNOLOGY
FAKULTA CHEMICKÁ ÚSTAV CHEMIE POTRAVIN A BIOTECHNOLOGIÍ FACULTY OF CHEMISTRY INSTITUTE OF FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY
STANOVENÍ CELKOVÉ ANTIOXIDAČNÍ AKTIVITY ČAJOVÝCH NÁLEVŮ VYBRANÝCH DRUHŮ ČAJŮ DETERMINATION OF THE TOTAL ANTIOXIDANT ACTIVITY OF DIFFERENT SORTS OF TEA
DIPLOMOVÁ PRÁCE MASTER’S THESIS
AUTOR PRÁCE
Bc. JITKA BARTOŠOVÁ
AUTHOR
VEDOUCÍ PRÁCE SUPERVISOR
BRNO 2009
RNDr. JANA SKOPALOVÁ Ph.D.
Vysoké učení technické v Brně Fakulta chemická Purkyňova 464/118, 61200 Brno 12
Zadání diplomové práce Číslo diplomové práce: Ústav: Student(ka): Studijní program: Studijní obor: Vedoucí diplomové práce: Konzultanti diplomové práce:
FCH-DIP0299/2008 Akademický rok: 2008/2009 Ústav chemie potravin a biotechnologií Bc. Jitka Bartošová Chemie a technologie potravin (N2901) Potravinářská chemie a biotechnologie (2901T010) RNDr.Jana Skopalová, Ph.D.
Název diplomové práce: Stanovení celkové antioxidační aktivity čajových nálevů vybraných druhů čajů
Zadání diplomové práce: 1) Vypracujte literární přehled k dané problematice 2) Popište použité metody hodnocení 3) Zpracujte naměřené výsledky z experimentů 4) Zhodnoťte získané výsledky formou diskuse
Termín odevzdání diplomové práce: 22.5.2009 Diplomová práce se odevzdává ve třech exemplářích na sekretariát ústavu a v elektronické formě vedoucímu diplomové práce. Toto zadání je přílohou diplomové práce.
----------------------Bc. Jitka Bartošová Student(ka)
V Brně, dne 1.10.2008
----------------------RNDr.Jana Skopalová, Ph.D. Vedoucí práce
----------------------doc. Ing. Jiřina Omelková, CSc. Ředitel ústavu ----------------------doc. Ing. Jaromír Havlica, DrSc. Děkan fakulty
ABSTRAKT Tato diplomová práce se zabývá stanovením celkové antioxidační aktivity (total antioxidant activity, TAA) různých druhů čajů (zelených, černých, polofermentovaných, bílých, maté, rooibosu a bylinných) v závislosti na způsobu a délce doby jejich zpracování. Hlavní důraz je kladen na ověření nové metody měření celkové antioxidační aktivity využívající průtokové coulometrie. Výsledky získané touto metodou jsou porovnány s výsledky zjištěnými chemiluminiscenční metodou (Trolox equivalent antioxidant capacity, TEAC), která se standardně využívá pro měření celkové antioxidační kapacity v různých materiálech a surovinách. V práci jsou diskutovány příčiny rozdílů v hodnotách TAA zjištěných oběma metodami.
ABSTRACT This thesis deals with the total antioxidant activity (TAA) evaluation of various sorts of tea (green, black, half-fermented, white, mate, rooibos and herbal) depending on the process and time of their treatment. The main emphasis is put on testing a new method of measuring the total antioxidant activity by flow coulometry. The results acquired by this method are compared to the results of the chemiluminescent Trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC) method which is a standard for measuring the total antioxidant capacity in various materials and raw materials. The work discusses the reasons for the differences in the values found by both methods.
KLÍČOVÁ SLOVA Celková antioxidační aktivita, volné radikály, antioxidanty, zelený čaj, černý čaj, polofermentovaný čaj, bílý čaj, maté, rooibos, bylinné čaje, fermentace, flavonoidy, chemiluminiscence, průtoková coulometrie
KEYWORDS Total antioxidant activity, free radicals, antioxidants, green tea, black tea, semifermented tea, white tea, mate, rooibos, herbal tea, fermentation, flavonoids, chemiluminescence, flow coulometry
1
BARTOŠOVÁ, J., Bc. Stanovení celkové antioxidační aktivity čajových nálevů vybraných druhů čajů. Brno, 2009. 50 s. Diplomová práce na Fakultě chemické Vysokého učení technického v Brně, ústav chemie potravin a biotechnologií. Vedoucí diplomové práce RNDr. Jana Skopalová, Ph.D.
PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci vypracovala samostatně a že všechny použité literární zdroje jsem správně a úplně citovala. Diplomová práce je z hlediska obsahu majetkem Fakulty chemické VUT v Brně a může být využita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana FCH VUT. ______________________
Děkuji své odborné vedoucí RNDr. Janě Skopalové, Ph.D. za zadání zajímavého tématu, odborné vedení práce a četné rady při konečném sepisování práce.
2
OBSAH ABSTRAKT .......................................................................................................................... 1 ABSTRACT .......................................................................................................................... 1 KLÍČOVÁ SLOVA............................................................................................................... 1 KEYWORDS ........................................................................................................................ 1 PROHLÁŠENÍ ...................................................................................................................... 2 OBSAH.................................................................................................................................. 3 ÚVOD.................................................................................................................................... 5 TEORETICKÁ ČÁST........................................................................................................... 6 1. VOLNÉ RADIKÁLY .................................................................................................... 7 1.1 Volné radikály ........................................................................................................ 7 1.2 Typy volných radikálů ........................................................................................... 7 1.3 Vznik volných radikálů .......................................................................................... 8 1.4 Zdroje a místa vzniku volných radikálů v organismu ............................................ 8 1.5 Působení volných radikálů ..................................................................................... 9 2. ANTIOXIDANTY ......................................................................................................... 9 2.1 Antioxidační enzymy ........................................................................................... 10 2.2 Antioxidační vitamíny.......................................................................................... 10 2.3 Metabolity, kofaktory a hormony......................................................................... 11 2.4 Antioxidační substráty.......................................................................................... 12 2.5 Stopové prvky ...................................................................................................... 12 2.6 Látky rostlinného původu..................................................................................... 12 3. ČAJ............................................................................................................................... 14 3.1 Čajovník ............................................................................................................... 15 3.2 Výroba čaje .......................................................................................................... 15 3.3 Jakostní stupnice čaje ........................................................................................... 16 3.4 Druhy čaje ............................................................................................................ 16 3.5 Chemické vlastnosti čaje...................................................................................... 17 3.6 Příprava čaje......................................................................................................... 19 4. NEČAJE A BYLINY ................................................................................................... 19 4.1 Maté...................................................................................................................... 19 4.2 Rooibos................................................................................................................. 20 4.3 Lípa obecná .......................................................................................................... 20 4.4 Máta peprná.......................................................................................................... 20 4.5 Mateřídouška úzkolistá ........................................................................................ 21 4.6 Meduňka lékařská ................................................................................................ 21 4.7 Plicník lékařský .................................................................................................... 21 4.8 Šalvěj lékařská...................................................................................................... 21 4.9 Třezalka tečkovaná............................................................................................... 21 5. METODY STANOVENÍ CELKOVÉ ANTIOXIDAČNÍ AKTIVITY....................... 22 5.1 Metody schopné eliminovat volné radikály ......................................................... 22 5.1.1 Trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC).......................................... 22 5.1.2 Metoda využívající DPPH............................................................................ 23 5.1.3 Další metody eliminující syntetické radikály............................................... 23 5.1.4 Oxygen radical absorbance capacity (ORAC) ............................................. 24
3
5.1.5 Metody vychytávající OH-radikály.............................................................. 24 5.1.6 Metody vychytávající superoxid .................................................................. 24 5.1.7 Lipidově peroxidační metody....................................................................... 24 5.2 Metody určující redoxní vlastnosti látek.............................................................. 24 5.2.1 Ferric reducting antioxidant potential (FRAP)............................................. 25 5.2.2 Cyklická voltametrie .................................................................................... 25 5.3 Metody založené na detekci oxidačního poškození organismu ........................... 25 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST ............................................................................................... 26 6. POUŽITÉ CHEMIKÁLIE ........................................................................................... 27 6.1 Chemikálie pro TEAC.......................................................................................... 27 6.2 Chemikálie pro průtokovou coulometrii .............................................................. 27 6.3 Přehled vzorků čajů a nečajů................................................................................ 28 7. PŘÍSTROJOVÉ VYBAVENÍ...................................................................................... 28 7.1 Přístrojové vybavení pro TEAC........................................................................... 28 7.2 Přístrojové vybavení pro průtokovou coulometrii ............................................... 29 8. POSTUP ....................................................................................................................... 30 8.1 Postup přípravy čajových nálevů ......................................................................... 30 8.2 Postup měření metodou TEAC ............................................................................ 30 8.3 Princip stanovení celkové antioxidační aktivity průtokovou coulometrií............ 30 8.4 Postup měření průtokovou coulometrií ................................................................ 30 9. VYHODNOCENÍ EXPERIMENTÁLNÍCH DAT...................................................... 31 10. VÝSLEDKY A DISKUSE....................................................................................... 32 10.1 TEAC ................................................................................................................... 32 10.2 průtoková coulometrie.......................................................................................... 37 10.3 porovnání výsledků celkové antioxidační aktivity stanovené metodami TEAC a průtokovou coulometrií ........................................................................................................ 42 11. ZÁVĚR..................................................................................................................... 48 12. POUŽITÁ LITERATURA....................................................................................... 49
4
ÚVOD Téma této diplomové práce, stanovení celkové antioxidační kapacity čajových nálevů vybraných druhů čajů, volně navazuje na moji bakalářskou práci, v níž jsem se zabývala stanovením celkové antioxidační aktivity medů chemiluminiscenční metodou. Cílem této práce bylo jednak sledovat, jak závisí celková antioxidační aktivita čajů a nečajů na jejich druhu a na způsobu a délce jejich zpracování, jednak vzájemně porovnat výsledky celkové antioxidační aktivity stanovené dvěma nezávislými metodami. První metoda založená na sledování vlastnosti vzorku zhášet luminiscenci produktů reakce luminolu s hydrogenperoxidovými radikály byla použita jako standardní. Druhá metoda využívající průtokovou coulometrii byla nově vyvinuta a byla testována její použitelnost pro stanovení celkové antioxidační aktivity čajových nálevů. Aby bylo možné srovnávat výsledky obou metod, byly naměřené hodnoty antioxidační aktivity vztaženy ke stejné standardní látce – troloxu. Diplomová práce je rozčleněna na tři části - teoretickou, experimentální a diskusní část. V první a druhé kapitole teoretické části jsou definovány základní pojmy - volný radikál a antioxidant, dále zde popisuji jednotlivé typy volných radikálů a antioxidantů včetně jejich působení na lidský organismus. Ve třetí a čtvrté kapitole uvádím druhy čaje, způsoby jeho zpracování a chemické vlastnosti, dále druhy a chemické vlastnosti tzv. nečajů (maté, rooibosu a některých léčivých bylin). V páté kapitole jsou v přehledu uvedeny nejpoužívanější metody a způsoby měření celkové antioxidační aktivity. V experimentální části diplomové práce jsou popsány materiály a metody, které jsem používala při stanovení celkové antioxidační aktivity, včetně použitého přístrojového vybavení a chemikálií. Část výsledky a diskuse sestává ze tří kapitol. V první jsou uvedeny a vzájemně porovnány výsledky měření celkové antioxidační aktivity čajových nálevů z jednotlivých druhů čaje a bylin chemiluminiscenční metodou. Výsledky jsou diskutovány v souvislosti se způsobem zpracování a chemickým složením rostlinného materiálu. Ve druhé kapitole shrnuji výsledky měření TAA metodou průtokové coulometrie a ve třetí srovnávám výsledky naměřené oběma metodami na základě jejich statistického vyhodnocení.
5
TEORETICKÁ ČÁST
6
1. VOLNÉ RADIKÁLY 1.1 Volné radikály Volné radikály jsou atomy, ionty nebo molekuly obsahující ve svém valenčním orbitalu jeden nebo více nepárových elektronů. Nejsou-li tyto nepárové elektrony konjugovány s dalšími valenčními elektrony, je volný radikál značně nestabilní a tudíž chemicky vysoce reaktivní. Volné radikály velmi snadno oxidují nebo redukují jiné atomy či molekuly, čímž se stabilizují. Tyto redoxní děje probíhají obvykle velice rychle (v řádech mikro- nebo milisekund), a proto je doba života většiny volných radikálů velmi krátká.
1.2 Typy volných radikálů Volné radikály můžeme rozdělit do několika skupin podle různých kritérií. Jedním možným dělením je dělení podle druhu atomu, který obsahují, na reaktivní formy kyslíku (ROS) a reaktivní formy dusíku (RNS), tab. 1. Tabulka 1: Reaktivní formy kyslíku a dusíku (upraveno podle Darley-Usmara a Halliwella) [1] REAKTIVNÍ FORMY KYSLÍKU Volné radikály
Látky, které nejsou volnými radikály
O2·- superoxid
H2O2 peroxid vodíku
O22- anion
HClO kyselina chlorná
OH· hydroxylový radikál
O3 ozon
ROO· peroxyl
1
O2 singletový kyslík
RO· alkoxyl HO2· hydroperoxyl REAKTIVNÍ FORMY DUSÍKU Volné radikály
Látky, které nejsou volnými radikály
NO· oxid dusnatý
NO+ nitrosyl
NO2· oxid dusičitý
NO nitroxid HNO2 kyselina dusitá N2O3 oxid dusitý NO2 oxid dusičitý NO2+ nitronium ONOO peroxynitrid ROONO alkylperoxynitril
7
Superoxid O2·Tvoří se jednoelektronovou redukcí kyslíku. Jeho pohyblivost z místa vzniku je omezena jeho malou rozpustností v tucích. Má oxidační i redukční vlastnosti a podléhá tzv. dismutaci, kdy vzájemně reagují dva superoxidové radikály. Produkty reakce jsou kyslík a peroxid vodíku. O2 O2 2 H O2 H 2 O2 Mezi jeho nejdůležitější reakce patří zejména schopnost redukovat ionty železa a mědi. O2·- + Fe3+ → O2 + Fe2+ ·
Hydroxylový radikál OH Tato extrémně reaktivní látka je jedním z nejsilnějších oxidačních činidel. Kteroukoliv látku ve své blízkosti hydroxyluje nebo ji zbavuje vodíku. RH + OH· → R· + H2O Anion O22Vzniká redukcí superoxidu O2·- nebo molekulárního kyslíku O2. V organismu dokáže přijímat protony a přechází na peroxid vodíku H2O2. Poškozuje i místa vzdálená od svého vzniku díky své schopnosti velmi snadno prostupovat membránami. Singletový kyslík 1O2 V lidském těle vzniká po absorpci světla některými pigmenty (fotosenzitizace kůže) nebo při spontánní neenzymové dismutaci superoxidu. V těle reaguje například s nenasycenými mastnými kyselinami a tvoří z nich lipidové peroxidy. Reaguje také s nukleovými kyselinami a aminokyselinami. Peroxid vodíku Sám není radikálem. Často se nachází v reakcích, které jsou spojeny se vznikem volných radikálů. V prostředí, v kterém se nevyskytují kovy, je téměř netoxický, ale v přítomnosti kovů, hlavně železa Fe2+ a mědi Cu+, se redukuje a vytváří hydroxylový anion OHa hydroxylový radikál OH· (Fentonova reakce): H2O2 + Fe2+ → OH· + OH- + Fe3+
1.3 Vznik volných radikálů Volné radikály vznikají termickým štěpením kovalentní chemické vazby, a to už za normálních teplot, nebo fotochemicky. Další způsoby vzniku jsou působení záření s velkou energií a oxidačně-redukční procesy: O2 + e- → O2·O2·- + e- + 2H+ → H2O2 H2O2 + e- → OH- + HO· HO· + e- → OH-
1.4 Zdroje a místa vzniku volných radikálů v organismu Aktivované neutrofily, monocyty, mikrofágy a eosinofily
8
Tyto buňky imunitního systému produkují volné radikály po nějakém vnějším stimulu, například po napadení viry nebo bakteriemi. Dochází ke vzniku zejména O2·-, H2O2, OH·. Mitochondrie V mitochondriích vzniká radikál O2·-a H2O2. Vznik závisí na metabolickém stavu buňky. Je-li aktivita elektronového transportního řetězce příliš redukována a je-li nízká respirace, z transportního řetězce unikají elektrony ve větší míře a tvoří se O2·-a H2O2. K největším zdrojům mitochondriální tvorby radikálů patří CoQ reduktáza a CoQ. Cytosolické zdroje Zdrojem vzniku volných radikálů je cytosolický enzym xanthinoxidáza, který redukuje kyslík. Při tomto procesu dochází ke vzniku O2·-a H2O2. Endoplazmatické retikulum Zdrojem volných radikálů jsou peroxisomální oxidázy a flavoproteiny. Tvorba prostaglandinů Volné radikály vznikají během syntézy prostaglandinů za pomoci kyseliny arachidonové. [2]
1.5 Působení volných radikálů Volné radikály jsou velmi nestálé a reaktivní, proto vyhledávají další elektron, aby vytvořily nový pár. Z tohoto důvodu jsou příčinou patologických procesů v živých systémech. Nalezení a určení typu volných radikálů v živých organismech bývá dost obtížné. Největším zdrojem volných radikálů v organismech je molekulární kyslík, protože je snadným akceptorem elektronů. Působení volných radikálů na některé základní chemické složky organismů: Působení na lipidy Kyslíkové radikály slouží jako katalyzátory při oxidaci lipidů a tím se spustí řetězová peroxidační reakce. Ta napadá hlavně nenasycené mastné kyseliny. Reakcí vznikají hydroperoxidy, které inhibují proteiny a enzymy a zvyšují tak poškození volnými radikály. Působení na proteiny Kyslíkové radikály způsobují hydrolýzu peptidických vazeb a fragmentaci bílkovin. To má za následek porušení syntézy bílkovin, inaktivaci a dysregulaci enzymů. Působení na cukry Působení volných radikálů cukry nijak neovlivňuje, protože jsou na ně málo citlivé. Působení na DNA DNA je nejvíce citlivá na působení hydroxylového radikálu OH·. Dochází v ní ke zlomům a poškození nukleonových bází a pentóz. Poškození je upravováno reparačními enzymy. [2]
2. ANTIOXIDANTY Antioxidanty jsou látky, které chrání organismus před nežádoucími chemickými reakcemi. Dokážou snižovat riziko propuknutí řady nemocí a také zabraňují předčasnému stárnutí. Volné radikály poškozují organismus a antioxidanty tyto volné radikály zachytávají a „neutralizují“ je. Děje se to tak, že antioxidanty volným radikálům poskytnou vlastní elektron a tím zamezí odběru elektronu z jiných molekul v organismu. Po této reakci se z nich stávají také volné radikály, ale existují další antioxidanty, které jim pomohou vrátit se do původního stavu. Jako příklad lze uvést kyselinu α-lipoovou a pyknogenol, které mohou
9
obnovit spotřebovaný vitamín C, a ten je zase schopen regenerovat vyčerpaný vitamín E. Působí-li antioxidanty společně - synergicky, jejich účinek se zesiluje. [4] Antioxidanty se podle svého výskytu dělí do dvou velkých skupin: endogenní (vznikají v organismu) a exogenní (organismus je musí získat, protože si je neumí sám syntetizovat, např. příjmem z potravy). Antioxidanty je možné dělit podle mnoha různých kritérií. Jedním z důležitých kritérií je dělení podle jejich chemické povahy.
2.1 Antioxidační enzymy Mezi antioxidační enzymy patří: Kataláza - obsahuje minerální železo a rozkládá peroxid vodíku na vodu. Glutathion (obr. 1) - sloučenina s nízkým obsahem síry. Slučuje se s enzymy, které obsahují selen, s glutathionovými peroxidázami. Ty rozkládají peroxid vodíku na vodu. O OH H2N NH
O
O HS
NH O HO
Obr. 1: Vzorec molekuly glutathionu Superoxiddismutáza - vyskytuje se téměř ve všech organismech. Existují dva typy obsahující měď a zinek, nebo mangan. Neutralizují superoxid na peroxid vodíku. [4]
2.2 Antioxidační vitamíny Patří sem zejména: Vitamín C (kyselina askorbová, obr. 2) - nejvíce se ho nachází v citrusech, ale i v zelí, špenátu a zelené paprice. Je to jeden z nejdůležitějších antioxidantů. Snižuje výskyt některých druhů rakoviny, vznik očních zákalů, zabraňuje předčasnému stárnutí a má i protizánětlivé účinky. OH O
HO
O
OH
HO
Obr. 2 Vzorec molekuly kyseliny askorbové Vitamín E (tokoferol, obr. 3) - který se vyskytuje v celých obilných zrnech, ořeších a rostlinných olejích, rybím tuku a v meruňkách. Ukládá se ve všech částech buněk, které obsahují tuk (je v tucích rozpustný), v buněčných membránách a lipoproteinech. Snižuje výskyt onemocnění srdce tím, že chrání krevní destičky před poškozením stresem a kouřením.
10
CH3 HO CH3
CH3 H3C
CH3
CH3
O
CH3
H3C
Obr. 3 Vzorec molekuly tokoferolu Vitamín A (retinol, obr. 4) - vyskytuje se pouze v těle živočichů. Ovoce a zelenina obsahují mnoho karotenoidů, které lidské tělo dokáže přeměnit na vitamín A a slouží jako ochrana před UV zářením. CH3
CH3
CH3 OH
CH3 CH3
Obr. 4 Vzorec molekuly retinolu Karotenoidy - se vyskytují ve žlutém, oranžovém a červeném ovoci a zelenině. Nejznámější jsou α-karoten, β-karoten (obr. 5), luthein, zeaxanthin a lykopen. Snižují výskyt některých druhů rakoviny, zvyšují aktivity bílých krvinek - monocyty, chrání zrak před zákaly a pokožku před spálením slunečním zářením. [4] CH3
CH3
H3C
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
Obr. 5 Vzorec molekuly β-karotenu
2.3 Metabolity, kofaktory a hormony Koenzym Q10 - je schopen na sebe vázat peroxylový a alkoxylový radikál, regeneruje tokoferol. Zvyšuje energetický výkon srdce a posiluje ho. Zabraňuje vzniku některých typů rakoviny a má příznivý vliv na pacienty s AIDS. Nikotinamid (obr. 6) - váže hydroxylový radikál, příznivě působí na ischemická a neurologická onemocnění (napomáhá léčení Alzheimerovy choroby, Parkinsonovy choroby, depresí a chronického stresu). O NH2 N
Obr. 6 Vzorec molekuly nikotinamidu Melatonin - antioxidační hormon snižující vedlejší účinky po chemoterapii, působí antikarcinogenně a potlačuje záněty v akutních fázích. Glukóza - je schopna na sebe vázat hydroxylový radikál Bilirubin - váže singletový kyslík, superoxid a hydroxylový radikál. 11
Kyselina močová (obr. 7) - váže hydroxylový radikál a singletový kyslík. [4] O H N
HN
O O
N H
N H
Obr. 7 Vzorec molekuly kyseliny močové
2.4 Antioxidační substráty Thioly - chrání organismus před volnými radikály, které vznikají ionizačním zářením. Kyselina lipoová - prodlužuje životnost vitamínu C a zvyšuje plodnost, snižuje hladinu krevního cukru, je důležitá pro léčbu diabetu a pomáhá při otravě muchomůrkou zelenou. Plazmalogeny - skupina fosfolipidů vyskytující se v buněčné membráně, které zmírňují oxidační poškození při fotosenzibilizaci. [4]
2.5 Stopové prvky Selen - nachází se v celých obilných zrnech, v para ořeších a česneku, je potřebný k produkci glutathionové peroxidázy a při léčení kardiovaskulárních chorob a rakoviny. Zinek - v organismu je jako součást enzymů, snižuje postischemické poškození srdce a syntetizuje proteiny.
2.6 Látky rostlinného původu Polyfenoly – nacházejí se v rostlinách a jejich skupina obsahuje několik tisíc zástupců. Jejich společným znakem je, že obsahují jedno nebo více aromatických jader, která jsou substituována hydroxylovými skupinami. Lze je rozdělit do tří skupin: fenolické kyseliny, flavonoidy a stilbeny a lignany. Fenolické kyseliny Tato skupina je nejčastěji zastoupena hydroxyskořicovými kyselinami ve formě esterů. Nejběžnější je kyselina kávová (obr. 8) a její estery a kyselina gallová. O HO OH
HO
Obr. 8 Vzorec molekuly kyseliny kávové Nejčastějším derivátem kyseliny kávové je kyselina chlorogenová. Další fenolické deriváty, které patří do této skupiny, jsou kondenzované taniny, v nichž jsou fenolické kyseliny esterifikovány polyhydroxysloučeninami. Fenolové kyseliny se nacházejí v ovoci, zelenině a v kávě. Flavonoidy Skupina flavonoidů se dále dělí podle stupně oxidace pyranosového cyklu na další podskupiny, mezi které patří flavanoly (obr. 9), flavanony (obr. 10), flavony (obr. 11), flavonoly (obr. 12), proantokyanidiny, antokyanidiny (obr. 13) a izoflavonoidy (obr. 14).
12
R
R OH
HO
OH
O
HO
O
OH
OH
OH
OH
Obr. 9 Obecný vzorec molekuly flavanolů
O
Obr. 12 Obecný vzorec molekuly flavonolů
R
R
OH
OH HO
O HO
OH
+
OH
O
Obr. 10 Obecný vzorec molekuly flavanonů
OH
Obr. 13 Obecný vzorec molekuly antokyanidinů
R
HO
OH
HO
O
O
O
OH
O OH
OH
Obr. 14 Obecný vzorec molekuly izoflavonoidů
O
Obr. 11 Obecný vzorec molekuly flavonů
Nejznámějším flavonoidem je kvercetin (obr. 15). Ten se nachází ve velkých koncentracích v cibuli, jablkách, kapustě, červeném víně a v zelených a černých čajích. V ovoci a zelenině se nachází buď volný nebo vázaný na nějakou cukernou složku. OH OH
HO
O
OH OH
O
Obr. 15 Vzorec molekuly kvercetinu Hlavní skupinou flavanolů jsou katechiny a je známo pět základních: katechin (obr. 16), epikatechin (EC - obr. 17), epikatechingallát (ECG), epigallokatechin (EGC - obr. 18) a epigallokatechingallát (EGCG - obr. 19) a vyskytují se převážně v čaji, v červeném víně a v čokoládě. [23]
13
OH
OH
OH
OH
HO
HO
O
O OH
OH
OH
OH
OH
Obr. 16 Vzorec molekuly katechinu
Obr. č. 18 Vzorec molekuly epigallokatechinu
OH
OH
HO
O
OH
OH
OH
HO
O OH
OH
Obr. 17 Vzorec molekuly epikatechinu
O OH
OH O
OH OH
Obr. 19 Vzorec molekuly epigallokatechingallátu Proantokyanidiny jsou polymerní flavanoly a vyskytují se v jablkách, hruškách, hroznech, červeném víně, čaji, čokoládě a v kakau. Antokyanidiny jsou červená barviva a vyskytují se v třešních, švestkách, rybízu. Flavanony se často nazývají „citrusové“ flavonoidy, protože se vyskytují v citrusovém ovoci. Do této skupiny patří naringenin a hesperetin. Isoflavonoidy se nacházejí hlavně v luštěninách, nejvíce v soji. Flavoniody mají schopnost snižovat výskyt některých druhů rakoviny a brání propustnosti krevních kapilár. Mají protizánětlivý, protinádorový a protisklerotický účinek. Účinek polyfenolů má několik mechanismů. Flavonoidy, ale i některé polyfenoly, dokážou inhibovat enzymy, které způsobují produkci superoxidového anion-radikálu (např. xantinoxidasu, proteinkinasu C) a enzymy, které tvoří volné radikály (cyklooxygenasa, lipoxygenasa, mikrosomální monoxygenasy). Některé polyfenoly mohou vytvořit komplexy s kovy, které se vyskytují při tvorbě reaktivních forem kyslíku např. při Fentonově reakci. Je to měď a dvojmocné železo. Polyfenoly jsou taky snadno oxidovatelné, a proto jsou schopné redukovat volné radikály, které jsou odstraněny dřív, než mohou reagovat s některými buněčnými komponentami [23]. Některé polyfenoly působí jako prooxidanty, tj. látky, z kterých vnikají volné radikály[3]
3. ČAJ Čaj je nápoj přírodního původu, který pochází z čajovníku Cammelia sinensis (L.).
14
3.1 Čajovník Keř čajovníku je původem z Číny, kde ještě dnes roste divoce. Patří k rodu Camellia keméliovité, které náleží do čeledi Theaceae - čajovníkovité [7]. Čajovníky, jejichž listy se používají pro výrobu čaje, jsou keře s celoročně zelenými, silně žebrovitými listy, vyrůstajícími na krátkých větvičkách [10]. Ty, které jsou pěstované v horských polohách, mají sice menší výnosy, ale kvalita sklizeného listu bývá velmi vysoká. Květy všech druhů čajovníku jsou bílé a podobají se květům třešní. Pro listy čajovníků jsou typické dobře viditelné stříbřitě bílé chloupky, kterými je pokryta jejich spodní strana. Nerozvinuté pupeny listů jsou jimi pokryty zcela. Čajovníku se daří v různorodých původních podmínkách, není příliš choulostivý na teplotní výkyvy, vyžaduje však značné množství srážek během celého roku. Proti příliš prudkému slunci bývá v tropických oblastech zastiňován. Pravidelným stříháním se zvyšuje množství výhonů a keř se zahušťuje a formuje do požadovaného tvaru a výšky. Keře se kvůli snadnějšímu sběru čajového listu sází do pravidelných dlouhých pásů vedle sebe. Po výsadbě se za čtyři roky provádí první sběr čajových listů a čajovník dává úrodu dalších asi třicet let. Čajovník se vyskytuje ve třech variantách - čínské, assámské a indonéské. Rozdíl mezi nimi spočívá ve výšce rostliny a v různých variantách listů. Čínská varianta je spíše keř dva až tři metry vysoký s malými temně zelenými listy, které jsou užší a jemnější. Pěstuje se především pro výrobu zeleného čaje. Assámská varianta má listy větší a světlejší a může vyrůst až do výšky 20 - 30 metrů. V listech má více tříslovin a poskytuje větší výnosy, protože její listy rostou rychleji. Pěstuje se hlavně na výrobu zeleného čaje. Indonéská varianta může dorůst okolo šesti metrů. Jejich rozlišení komplikuje existence mnoha hybridů a klonů, které byly vypěstovány kvůli získání některých žádoucích vlastností [8].
3.2 Výroba čaje Výroba kvalitního čaje se skládá z několika za sebou jdoucích etap, tj. sklizně, zavadnutí listů, rolování, fermentace, sušení a třídění čaje. Dnešní výrobní procesy vycházejí ze starých čínských metod, jen v průběhu roků, s rozvojem mechanizace, došlo ke zvýšení produkce a výroba je nyní plně automatizována. Sklizeň - velký vliv na kvalitu čaje má sezóna jeho sklizně, a to zejména počasí, které panuje v době sklizně. Sklízí se několikrát ročně, v tropických oblastech s rovnoměrně rozvrženými srážkami i celoročně, kdy je v tomto období možné provést až 30 sklizní. Sběr čajových listů se provádí převážně ručně a to odštipováním prsty nebo pomocí nůžek. Podle typu sklizně je možné získat různou kvalitu sklizeného čaje. Kvalita čaje je hlavně dána stářím čajových lístků. Nejkvalitnější čaj poskytují nejmladší výhonky, jelikož mají nejvyšší obsah ceněných látek. Nejčastější způsob značení vysoce kvalitní sklizně je P+2 (Pekoe + 2, pozn.: Pekoe - neotevřené apikální, tj. vrcholové pupeny - z čínštiny; odštípne se pupen se dvěma lístky). Existují však také sklizně P + 3, P + 4 a více, které vedou k čaji horší kvality. [8] Zavadnutí - sklizené lístky se pak nechávají zavadnout a to v průměru asi deset hodin, až se stanou tak vláčné, že snesou rolování, aniž by došlo k jejich rozdrcení. V zavadajících listech začínají probíhat prvotní fermentační reakce, které ovlivňují aroma čaje. Rolování - při rolování se rozdrtí buňky listů a uvolní se z nich šťáva, ve které se nacházejí různé chemické látky a enzymy, které později umožňují správnou fermentaci. Rolování se podle potřeby opakuje. Jsou-li listy špatně srolovány, má to negativní vliv na vzhled, chuť a trvanlivost čaje.
15
Fermentace - je to jedna z nejdůležitějších operací při výrobě čaje. Závisí na ní chuť, aroma a zlatavá barva čaje. Není to klasická fermentace ve smyslu kvašení, ale jde o biochemickou reakci, kdy enzymy uvolněné z buněk způsobují oxidaci přítomných polyfenolů vzdušným kyslíkem. Bakterie se této reakce neúčastní a jejich přítomnost je při správně provedené fermentaci nevítaná, s výjimkou výroby čínských čajů typu Pu Erh. [8] Sušení - po fermentování se čaj co nejrychleji suší horkým vzduchem, aby klesl obsah vody pod 3 %. Když je čaj příliš vlhký, může při skladování rychle plesnivět, proto se doporučuje, aby se sušil opakovaně několikrát za sebou. Sušení je taktéž důležité pro chuť a aroma čaje. Při sušení je řada aromatických látek vyskytujících se v čaji částečně odpařena a složitými reakcemi za tepla v něm vzniknou jiné vonné a chuťové látky. Tyto látky jsou již charakteristické pro hotový čaj. Při sušení se čaj nesmí přehřát nebo připálit. Kdyby k tomu došlo, získá čaj nežádoucí karamelovou vůni nebo vůni praženého chleba. Třídění - již usušený čaj se prosévá a třídí na různé kvality podle velikosti částic čajového listu. Rozdrcené listy se třídí v třesadle. Jemné listy a špičky výhonků se prosívají jako první. Listy, které zůstaly v síti se znovu válejí a prosívají. To vše se opakuje ještě potřetí, až se získají celkem tři podíly. [7]
3.3 Jakostní stupnice čaje V Číně je zavedena stupnice kvality čaje, podle názvu lístků, které v čaji převažují. Nejkvalitnější je čaj Flowery Orange Pekoe (FOP), což je čaj ze zlatavých pupenů a prvních listů. Druhý jakostní stupeň je Orange Pekoe (OP), což představuje čaj ze směsi prvních a druhých čajových lístků a obsahující zlatavé listové pupeny. Třetím stupněm je Pekoe (P), tedy čaj z druhých a třetích čajových lístků. Jedná se o čaj střední kvality. Čtvrtým stupněm jakosti je Pekoe Souchong (PS), čaj z třetího až šestého listu. Pátým stupněm je Congo (C). Nejhorší kvalitu má zlomkový čaj, který je označovaný jako B (broken), který obsahuje pouze zlomky listů a pupenů. V řadě od nejkvalitnějšího se zlomkový čaj rozlišuje na Broken Orange Pekoe, Broken Pekoe, Broken Pekoe Congo až po čajový prach. Nejdrobnější druh čaje se dál zpracovává na deskový čaj. [10]
3.4 Druhy čaje Podle způsobu zpracování sklizených lístků se čaje nejčastěji dělí na čaje zelené, žluté, bílé, polozelené, černé (v Číně, podle barvy nálevu, známé jako červené) a tmavé (v Číně, podle barvy nálevu, známé jako černé), jejichž podskupinu tvoří čaje lisované. Nejdůležitějším hlediskem pro zařazení čaje do některé z těchto skupin je skutečnost, do jaké míry a ve které fázi zpracování proběhla fermentace. [10] Zelené čaje jsou čaje nefermentované. Aby fermentace nezačala, je třeba lístky utržené z keře co nejrychleji zahřát, a to buď na kovových pánvích (tradiční čínský způsob) nebo propařením (tradiční japonský způsob). Další postup záleží na třídě čaje, ale většinou následuje hnětení, tvarování, sušení, třídění a poslední fází bývá dosušování. Černé čaje jsou čaje dokonale fermentované. Sklizený list se při konstantních teplotách (okolo 22°C) a vlhkosti nechává zavadnout. Poté je počínající proces fermentace (obvykle netrvá déle než 120 minut) podpořen narušením buněčné struktury listu svinováním na speciálních strojích - rollerech. V konečné fázi je list sušen a tříděn. Bílé čaje jsou zlehka fermentované. Sklizený list není prudce zahříván, ale je bez jakéhokoli svinování poměrně rychle usušen. Tento čaj je charakteristický vysokým obsahem silně ochmýřených vrcholových výhonků . Podle jejich velikosti a podílu v listu se tyto čaje
16
dělí do tří základních tříd: Yin Zhen (vytříděné vrcholové výhonky určité velikosti bez dalšího listu), Pai Mu Tan (list s velmi vysokým obsahem středně velkých vrcholových výhonků) a Shou Mei (většinou tmavší list s obsahem menších vrcholových výhonků). Polozelené čaje jsou částečně fermentované. Ve sklizeném listu se nechá pomocí narušení okrajů lístků započít proces fermentace, který je v určitý moment přerušen prudkým zahřátím. Speciální úpravou vzniká původně čínský, jen velmi lehce fermentovaný čaj, který tvoří jakousi mezitřídu mezi zelenými a černými čaji. Žluté čaje jsou zlehka dodatečně fermentované čaje. Jde o dosti vzácnou a neobyčejně drahou čínskou specialitu. Přesný výrobní postup je držen v tajnosti, list je ihned po sklizení prudce zahříván na kovových pánvích, poté různě svinován a hněten. Pravděpodobně před konečným dosušováním a tříděním je uměle vyvolán proces fermentace, který je následně velmi rychle zastaven, čímž tento čaj získává své mimořádné vlastnosti. Je možná ještě jedna varianta výroby těchto čajů, a to dlouhodobé sušení čajových lístků v silnějších vrstvách pod plachtami za střídání vyšších a nižších teplot. Tmavé čaje jsou dokonale dodatečně fermentované. Po sklizení je list okamžitě zahříván, v konečné fázi zpracování je však proces fermentace uměle - mikrobiálně vyvolán a nechává se dokonale proběhnout, což dává těmto čajům jedinečné účinky zejména po zdravotní stránce. Nejznámějším zástupcem tohoto druhu zpracování je Pu Erh. Lisované čaje bývají obvykle slisované horší třídy čaje Pu Erh. Zvláštní kategorii tvoří lisované zelené čaje, jejichž technologické zpracování je velmi složité a neodpovídá žádnému výše uvedenému způsobu. [10]
3.5 Chemické vlastnosti čaje V součastné době známe asi 400 nejrůznějších látek obsažených v čaji. Jejich složení se liší podle oblasti původu čaje, podle druhu čaje a podle způsobu zacházení s čajovými lístky Alkaloidy Nejvýznamnějším alkaloidem je kofein (obr. 20), jehož množství v čaji může být až 7 %. Dříve byl zvaný jako tein, protože se vědci mylně domnívali, že se jedná o jinou látku. V černém čaji je ho vetší množství než v zeleném, ale nevyskytuje se v tak velkém množství, že by to způsobovalo návyk na tuto látku, jako je to v případě kávy. V nepatrném množství se v čaji nacházejí teobromin a teofylin. O H3C
N
N
O
CH3
N
N
CH3
Obr. č. 20 Vzorec molekuly kofeinu Polyfenoly Deriváty kyseliny gallové a katechinu. Nálev ze zeleného čaje obsahuje kolem 1g/l katechinů. V černém čaji je obsah redukován asi na polovinu v důsledku oxidace na komplexnější polyfenoly během fermentace[24], ale kromě katechinů je v něm ještě obsažen kvercetin (obr. 15). Nezoxidované polyfenoly v zeleném čaji jsou odpovědné za jeho svíravost, slabší barvu a výraznou chuť [8].
17
Charakteristickou hořkost a astringentní chuť čaje způsobují především třísloviny (taniny), které mají také antioxidační vlastnosti. Jsou to hlavně theaflavin a thearubigen, které vznikají během fermentace z katechinů a dávají černému čaji tmavé zabarvení a chuť. Fermentací se jejich složení mění. [10] Červená a žlutá barviva obsažená v čajových lístcích jsou deriváty anthokyaninů a flavonů. Polyfenoly jsou hlavními látkami, které mají vliv na antioxidační účinky čaje. Největší antioxidační sílu má epigallokatechingallát (obr. 19), jehož antioxidační aktivita se dá srovnat s vitamínem E. [8] Vitamíny V porovnání s ovocem a zeleninou jsou v čaji ve velmi malém množství. V čerstvých čajových lístcích a zeleném čaji se vyskytuje kyselina askorbová (vitamín C - obr. 2), v černém čaji je jí však málo, protože se rozkládá fermentačním procesem [7]. Jako další jsou přítomny thiamin (vitamin B1), riboflavin (vitamin B2), pyridoxin (vitamin B6), biotin (vitamin B7), kyselina folová (vitamín B10), kobalamin (vitamín B12), vitamín E, β-karoten a vitamín K.[8] Minerální látky Nejvýznamnějším prvkem je fluor, protože čaj je jeho největším rostlinným zdrojem pro člověka. Dále obsahuje vápník (0,46 %), fosfor (0,32 %), hořčík (0,22 %), železité sloučeniny (0,15 %), mangan (0,12 %), síru (0,088 %), hliník (0,069 %), sodík (0,030 %), křemík (0,024 %), zinek (0,003 %), měď (0,002 %) a ve stopovém množství draslík, stroncium, nikl, molybden, chrom, a kobalt. Obsah prvků je závislý na tom, zda rostlina pochází z půd chudých nebo bohatých na dané přítomné prvky. [10] Silice Bylo objeveno kolem pěti set různých druhů éterických olejů, avšak zatím byly jen z části prozkoumány. Mají zásadní úlohu v odlišnosti vůní a chutí čaje. Silice se během růstu rostliny hromadí a během sklizně čajových listů a po ní se jejich obsah snižuje. Zpracování může naopak přispívat ke vzniku některých silic, které v konečném výrobku zůstávají. [7] Jsou snadno těkavé a termicky labilní, proto se zelené čaje nesmí zalévat vařící vodou. Silice také působí antibakteriálně. Tvoří asi 0,01 - 0,05 % celkové hmotnosti čaje. [10] Aminokyseliny a bílkoviny Čaj obsahuje asi 1 - 2% volných aminokyselin. Jsou to kyselina aspartová, glutamová, glycin, serin, glutamin, tyrosin, threonin, alanin, valin, leucin, isoleucin a další. Kromě běžných aminokyselin obsahuje jednu aminokyselinu typickou jen pro čaj, a to theatin (2amino-4-(ethylkarbamoyl)butanová kyselina, obr. 21). Tvoří asi polovinu celkového obsahu aminokyselin v zeleném čaji a jeho přítomnost odpovídá za jeho kvalitu [8]. Má uklidňující účinky, působí na nervovou soustavu a zlepšuje paměť[28]. Je to jedna nejchutnějších složek čaje a také se podílí na biosyntéze polyfenolů. [10] O
O
HO
NH NH2
18
CH3
Obr. 21 Vzorec molekuly theaninu Cukry, škroby, pektiny a tuky V listech čaje se sice nacházejí cukry a škrob, ale pouze v malém množství. V protoplazmě lze najít i tuky. Pektiny se v čaji vyskytují v poměrně hojném množství. Pektinů je v čaji kolem 6,1 %, škrobů 0,82-2,96 % a cukrů 0,73-1,41 %. Enzymy Napomáhají při oxidaci čajových polyfenolů v procesu fermentace. Tato reakce by probíhala velmi dlouho, pokud by nebyla urychlena příslušným enzymem. Nejdůležitější reakci zajišťuje speciální oxidáza, jejíž významným prvkem je měď. Saponiny Nacházejí se jen v nepatrném množství. Z výše uvedeného chemického složení lze usuzovat, že čaj je bohatým zdrojem antioxidantů, jako jsou polyfenoly, vitamíny, minerální látky a enzymy, které příznivě působí na celý organismus. Čaj díky kofeinu posiluje koncentraci, duševní výkonnost a působí proti depresím. Jeho polyfenoly mají chemopreventivní účinek hlavně proti vzniku rakoviny trávící soustavy a močového měchýře. Mírní žaludeční a střevní problémy, podporuje funkci jater, brání tvorbě ledvinových kamenů a je močopudný, čímž zbavuje tělo jedů. Má také vliv na nemoci oběhového systému, snižuje hladinu cholesterolu v krvi, posiluje cévy, srdce a krevní oběh, brání vzniku arteriosklerózy, mozkové mrtvice a různých srdečních příhod. Zabraňuje vzniku zubního kazu, neboť obsahuje fluor, který působí proti bakterii streptococcus mutans, která se podílí na jeho vzniku. Taktéž bylo dokázáno, že zpomaluje proces stárnutí. [8]
3.6 Příprava čaje Čaj se skladuje na suchém, temném místě mimo dosah jakýchkoli dalších pachů, musí být pevně uzavřený ve skleněné či kovové dóze bez přístupu vzduchu. Vhodné jsou lahve z tmavého skla se zabroušeným hrdlem nebo dobře uzavíratelné plechové dózy. [10] Na přípravu je nejlépe používat porcelánovou, hliněnou nebo skleněnou konvičku a šálky. Šálky mají mít objem kolem 100ml. Voda nesmí být příliš tvrdá a vždy se musí převařit. Zelený čaj se nepřelévá vroucí vodou, aby z něj nevytěkaly silice. Proto se voda nechá nějakou dobu odstát. Nejvhodnější dávkování čaje je 2g (tj. zarovnaná čajová lžička) na jeden šálek. Větší dávka se nedoporučuje kvůli velkému obsahu kofeinu a hořké chuti.
4. NEČAJE A BYLINY 4.1 Maté Nepochází z čajovníku, ale je to druh jihoamerické cesmíny paraguayské, botanický název Ilex paraguarensis patří do čeledi cesmínovité (Aquifoliaceae). Je to stále zelený strom dorůstající do výšky až 15 m. Sklízí se celé větve s listy. Nejvhodnější jsou listy staré jeden nebo dva roky. Surovina je po sklizni sušena, a proto ztratí asi 70% své hmotnosti. Po rozdrcení lístků a odstranění zbytků stonku se rozbíhá proces zrání, který trvá 30-45 dnů, někdy až jeden rok. Při zrání se udržuje teplota na 50-600 °C. [18] Pozitivní účinky maté jsou dány obsahem mateinu - alkaloidu, který je chemicky velmi blízký kofeinu. Působí sice také povzbudivě, není však návykový. Vlivem jeho spolupůsobení s ostatními látkami se povzbuzující účinky utlumují. Maté taky obsahuje 8 % tříslovin,
19
0,05 % teofylinu, beta-karoten, vitaminy A, C, E, B-komplex, chlorofyl, cholin, inositol, kyselinu chlorogenovou, kyselinu chinovou, kyselinu kávovou, rutin, silice, hořčiny a minerální látky: hořčík, draslík, vápník, železo, mangan, křemík, fosfor, fosfát, síru Maté působí jako zdroj energie při duševní i fyzické vyčerpanosti. Dále se užívá pro posílení imunity, stimuluje funkci ledvin a odbourávání odpadních látek, je to tedy výborný prostředek k detoxikaci organismu, vyrovnává hladinu cukru v krvi a utlumuje pocit hladu. [19]
4.2 Rooibos Je to luskovitá rostlina rostoucí v Jižní Africe. Její botanický název je Aspalathus linearit, patří do čeledi bobovitých (Fabaceae). Dorůstá výšky až 1,5 metru. Rostlina se sklízí celá a pak seká a řeže na drobnější části. Podle dalšího zpracování se rozeznává rooibos fermentovaný (červený) a nefermentovaný (zelený). Následně se dosušuje, nejlépe přímo na slunci. [22] Na rozdíl od čaje a kávy neobsahuje žádný kofein. Obsahuje velká množství minerálních látek jako jsou železo, fluor, měď, sodík, draslík, vápník, zinek, hořčík a mangan. Dále obsahuje vitamín C, fenolické kyseliny, rutin, kvercetin a kvercitrin. Rooibos díky svému velkému obsahu železa působí preventivně proti chudokrevnosti, je účinný proti alergiím, ekzémům, stresu, nespavosti, depresím, bolestem hlavy a zánětům krku a dásní, vráskám, senné rýmě a zklidňuje akné a je vhodný v prevenci proti zubnímu kazu, zpevňuje sklovinu. [20]
4.3 Lípa obecná Lípa obecná - Tilia vulgaris (Hayne) patří do čeledi lípovitých (Tiliaceae). Chemické složení květu lípy není příliš podrobně prozkoumáno. Znám je obsah slizu, tříslovin, flavonového glykosidu tilirosidu, flavonoidů, organických kyselin, saponinů a fytosterolů. Jsou přítomny i látky podobné vitamínu C. Lípa má potopudný účinek s malým uklidňujícím, močopudným, žlučopudným a spasmolytickým účinkem. Reguluje tvorbu žaludečních a střevních šťáv. Podává se taky při chorobách z nachlazení, při křečových bolestech v oblasti trávícího ústrojí a močových cest a při narušené funkci žlučníku. [16]
4.4 Máta peprná Máta peprná - Mentha piperita (L.) patří do čeledi hluchavkovitých (Lamiaceae). V rostlině je hlavní účinnou látkou mentolová silice (s mentolem a jeho estery). Ještě se mohou vyskytovat menton, sabin, mentofuran, piperiton, třísloviny, hořčiny a flavonové glykosidy. Použití máty je dáno obsahem mentolu, který má silné antiseptické vlastnosti. Místním drážděním citlivých receptorů vyvolává pocit chladu, který je schopen překrýt slabší nepříznivé podněty jako například úporné svědění. Látka výrazně tlumí nadýmání a křečovité bolesti v trávícím ústrojí, zlepšuje trávení a příznivě ovlivňuje funkci žlučníku. Mírně snižuje krevní tlak a mírně stimuluje centrální nervovou soustavu. Osvědčily se mátové koupele při psychické labilitě, při revmatismu a při některých kožních onemocněních. [16]
20
4.5 Mateřídouška úzkolistá Mateřídouška úzkolistá - Thymus serpyllum (L.) patří do čeledi hluchavkovitých (Lamiaceae). Mateřídouška nabízí siličnou látku s obsahem cymolu, thymolu, karvakrolu, linalolu, borneolu, terpineolu, α a β pinenu. Dále zde nacházíme třísloviny, saponiny, hořčinu, serpyllin, flavony a minerální látky. Rostlina má poměrně silné antiseptické a desinfekční účinky. Lze ji aplikovat i při dyspeptických potížích, vzniklých při nedostatečné sekreci žaludečních šťáv. Můžeme ji využít i při desinfekci dýchacích cest, při bronchitidě a podobných nemocech, doprovázených kašlem. Svými tříslovinami a desinfekčním působením účinně přispívá k léčbě průjmů. Desinfikuje i močové cesty. [16]
4.6 Meduňka lékařská Meduňka lékařská - Melissa officinalis (L.) patří do čeledi hluchavkovitých (Lamiaceae). Meduňka poskytuje siličnou drogu s obsahem geraniolu, citronelalu, citronelolu, linalolu a citralu. Obsahuje i třísloviny, hořčiny, sliz, flavonoidy, triterpeny, organické kyseliny a minerální látky. Rostlina působí sedativně na nervovou soustavu i na vegetativní nervstvo. Používá se především jako gastrosedativum a kardiosedativum, tj. při žaludeční a střevní neuróze, při bušení srdce, arytmiích. Je vhodná při nervové vyčerpanosti, nespavosti, mírné úzkosti, při lehkých depresivních náladách a při nadýmání a křečovité bolesti břicha. [16]
4.7 Plicník lékařský Plicník lékařský - Pulmonaria officinalis (L.) patří do čeledi brutnákovitých (boraginaceae). Plicník obsahuje velké množství tříslovin, rozpustné soli kyseliny křemičité, sliz, saponiny, minerální látky, allantoin, fytosterin, cukry a cerylalkohol. Má i malé množství pyrolizidinových alkaloidů. Používá se hlavně na léčbu plicních onemocnění, protože podporuje vykašlávání a působí hojivě a regeneračně na sliznice dýchacích cest. Působí i na sliznice trávícího ústrojí, je protizánětlivý a mírně močopudný. Taky se využívá při omývání ran a při koupelích při krvácejících hemeroidech. Podporuje i léčbu lymfatických onemocnění. [16]
4.8 Šalvěj lékařská Šalvěj lékařská - Salvia officinalis (L.) patří do čeledi hluchavkovitých (Lamiaceae). Obsahuje silici s thujonem, cineolem, kafrem, borneolem, dále katechinové třísloviny a pseudotřísloviny jako jsou kyselina kávová, triterpeny, hořčinu, karnosol, diterpenové hořčiny abietanového typu, lakton salvin, saponiny, pryskyřičné látky, vitamíny skupiny B a látky podobné hormonu estrogenu. V malých dávkách snižuje pocení. Působí silně antibioticky na široké spektrum mikroorganismů při léčbě močových cest, bolesti v krku a angín, zažívacího ústrojí a gynekologických zánětů. Má i velké zevní použití na nehojící se rány. [16]
4.9 Třezalka tečkovaná Třezalka tečkovaná - Hypericum perforatum (L.) patří do čeledi třezalkovitých (hypericacea).
21
Květ obsahuje katechinové třísloviny, flavonové glykosidy, rutin, quercetin, silici, červené barvivo hypericin, pryskyřici, organické kyseliny, provitamín A a vitamín C. Působí jako antibiotikum, čistí krev, podporuje látkovou výměnu, má silné protizánětlivé účinky, léčí většinu ekzémů včetně těžkých forem. Po úrazech hlavy léčí poškozenou tkáň a odstraňuje otoky, léčí plíce, slinivku břišní, játra, žaludek a dvanáctník, záněty, vředovou chorobu, žaludeční neurózu a hemeroidy. Působí jako mírné kardiotonikum. Pomáhá při těžkých srdce ohrožujících chřipkách s arytmiemi a fibrilacemi. Je vhodná při úzkosti, neklidu, psychickém napětí a lehčích depresích. Zevně i vnitřně je vhodná k léčení ran, pohmožděnin, zlomenin, naraženin a zanícených ran, pomáhá při léčbě závratí, tlumí vnitřní krvácení a zlepšuje kvalitu cévních stěn. [16]
5. METODY STANOVENÍ CELKOVÉ ANTIOXIDAČNÍ AKTIVITY V dnešní době existuje již mnoho způsobů chemické analýzy a biologického hodnocení materiálů s antioxidačními vlastnostmi a byly vypracovány četné metody, kterými lze stanovovat celkovou antioxidační aktivitu. Tyto metody se svými principy navzájem velmi odlišují a postupně se vyvíjejí jejich další modifikace. Hlavním principem těchto metod je určování antioxidační nebo také redukční schopnosti sumy všech antioxidačních látek přítomných ve vzorku. Metody lze rozdělit do dvou velkých skupin, na metody schopné eliminovat volné radikály a na metody určující redoxní vlastnosti látek. Samostatnou skupinou metod jsou metody testování antioxidační aktivity in vivo.
5.1 Metody schopné eliminovat volné radikály Tyto metody využívají schopnosti vzorku neutralizovat volné radikály, které se ke vzorku přidávají nebo se ve vzorku generují z vhodných činidel. Obvykle se jedná o kyslíkové radikály nebo radikály uměle připravené. Do této skupiny můžeme ještě zařadit metody, jejichž podstatou je schopnost zastavovat nebo zpomalovat lipidovou peroxidaci. 5.1.1 Trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC) Patří k metodám eliminujícím syntetické radikály. Celková antioxidační aktivita se vztahuje k ekvivalentní koncentraci roztoku troloxu (6-hydroxy2,5,7,8-tetramethylchroman-2-karboxylové kyseliny, což je ve vodě rozpustná látka strukturně podobná vitamínu E – obr. 22). CH3 HO O O
H3C CH3
CH3 OH
Obr. 22 Vzorec molekuly troloxu Místo troloxu se používají i jiné standardy, nejčastěji askorbát, galát a epikatechin [26]. Při rozkladu peroxidu vodíku katalyzovaném křenovou peroxidasou (HRP) dochází ke vzniku reaktivních forem kyslíku (ROS) a následné chemiluminiscenci luminolu (obr. 23).
22
O HN HN O
Obr. 23 Vzorec molekuly luminolu Antioxidanty přítomné ve vzorku ve většině případů reaktivní formy kyslíku vychytají nebo pozhášejí. Po vyčerpání antioxidantů v reakční směsi nastane opožděná luminiscence. Vlivem působení antioxidantů tedy dojde k časové prodlevě, která je předmětem měření. Jako standard se používá trolox, z naměřených hodnot sestrojíme kalibrační křivku jako závislost časové prodlevy na koncentraci troloxu. Koncentrace troloxu použité ke kalibraci se pohybují v rozmezí 0,003 - 0,050 mmol/l. [15] Jako další prekurzor radikálu můžeme použít látku ABTS, tj. 2,2´-azinobis.(3ethylbenzothiazolin)-6-sulfonát [26]. 5.1.2 Metoda využívající DPPH DPPH je stabilní radikál 1,1-difenyl-2-(2,4,6-trinitrofenyl)hydrazyl. Metoda je založena na redukci DPPH antioxidanty přítomnými ve vzorku za vzniku redukované formy DPPH-H. Sleduje se odbarvení modrého roztoku DPPH při jeho redukci [26,27]. Výsledek reakce můžeme sledovat různými způsoby, nejčastější tři jsou měření absorbance, metodou ESR – elektronové spinové rezonance a pomocí HPLC – vysoce účinné kapalinové chromatografie. Při spektrofotometrickém měření se po uplynutí konstantního času měří pokles absorbance při 517nm, nebo lze i pracovat v kinetickém režimu. V HPLC metodě se vyhodnocuje plocha píku náležícího radikálu DPPH. HPLC metoda se používá u těch vzorků, které jsou nadměrně zbarvené a spektrofotometrické sledování by bylo obtížné [25]. Celková antioxidační aktivita vzorků obsahujících směs antioxidantů se jako v předchozí metodě vztahuje k ekvivalentní koncentraci jiné látky, nejčastěji kyseliny askorbové nebo troloxu. 5.1.3 Další metody eliminující syntetické radikály Podobných metod může být mnoho. Může jich být tolik, kolik můžeme používat stabilních syntetických radikálů. Tyto metody jsou založené na stejném principu, jako ty předchozí, a to na reakci stabilního syntetického radikálu s antioxidanty ve vzorku, kdy se redukce radikálu projeví nějakou měřitelnou změnou fyzikálně chemických vlastností roztoku radikálu. Dalším syntetickým radikálem, který lze použít pro stanovení celkové antioxidační aktivity je např. gavixinol – 2,6-di-terc-butyl-4-[(3,5-di-terc-butyl-4-oxocyklohexa-2,5-dien-1yliden)methyl]fenoxyl, jehož redukce se sleduje spektrofotometricky při 428nm [25]. Dále se používá např. DMPD – dimethylfenylendiamin. Ten je v roztoku působením železité soli převeden na svoji radikálovou formu. Tato forma je stabilní a barevná. Po reakci se vzorkem se roztok radikálu odbarvuje a barevná změna se hodnotí spektrofotometricky [26]. Další možností je použití radikálu nazvaného Fremyho sůl – nitrosodisulfonan draselný, který se detekuje elektronovou spinovou rezonancí [25].
23
5.1.4 Oxygen radical absorbance capacity (ORAC) Tato metoda patří mezi metody, kde se pracuje s kyslíkovými radikály. Jejím principem je vytvoření peroxylového radikálu β-fykoeritrinu pomocí oxidačního činidla ABAP (2,2´azobis-2-methyl-propionamidinu). Radikál reaguje se vzorkem a stanovuje se schopnost vzorku zastavit nebo zpomalovat probíhající radikálovou reakci. Reakce se vyhodnocuje fluorimetricky a určuje se rychlost úbytku signálu fluorescence po přidání vzorku [26,27]. Při měření antioxidační aktivity v čajích není vhodné používat radikál β-fykoeritrin, protože u něho dochází k omezení fotostability. Je to vlivem polyfenolů, které se v hojné míře v čaji nachází. Proto je výhodnější místo něj použít fluorescein. 5.1.5 Metody vychytávající OH-radikály U této metody se nejprve připravují OH radikály, nejčastěji Fentonovou reakcí, fotolýzou peroxidu vodíku nebo fotolýzou syntetických derivátů. Principem této je sledování konkurenční reakce antioxidantů ze vzorku a standardní antioxidační látky s OH radikálem. Standardní antioxidační látky jsou voleny tak, aby reakcí s radikálem poskytovaly snadno stanovitelné produkty. Čím je ve vzorku více antioxidantů tím méně se tyto produkty tvoří [27]. Jako standardní antioxidační látka se používá kyselina salicylová, jejíž produkty se stanovují pomocí HPLC a UV detekcí, dále DMPO (2,2-dimethyl-2H-pyrrol-1-oxid) jehož produkty se stanovují pomocí elektronové spinové rezonance a používá se i deoxyribóza a její produkty se určují pomocí reakce s kyselinou thiobarbiturovou [25]. 5.1.6 Metody vychytávající superoxid K vytvoření superoxidového radikálu slouží reakce s 5-methylfenazinium-methyl-sulfátem NADH. NADH může být nahrazen systémem xanthin/xanthinoxidasa. Radikál reaguje se vzorkem a zbytkový nezreagovaný radikál redukuje nitrotetrazoliovou modř. Nitrotetrazoliovou modř je možné nahradit formazanovým barvivem WST-1. Reakce se detekuje spektrofotometricky při 550 – 560 nm nebo elektronovou spinovou rezonancí [25]. 5.1.7 Lipidově peroxidační metody Tyto metody vychází z toho, že volné radikály v organismu způsobují lipidovou peroxidaci. Přídavek vzorku s antioxidačními látkami se dávkuje k substrátu, v němž probíhá lipidová peroxidace a sleduje se její eliminace [26]. Antioxidační látky mohou reagovat s primárními kyslíkovými radikály, i se sekundárními radikálovými meziprodukty nebo chelatují ionty přechodných kovů [25]. Substrátem mohou být jakékoliv tukové materiály od nenasycených mastných kyselin až po homogenáty živočišné tkáně, v kterých se lipidová peroxidaci vzbuzuje tetrachlormetanem nebo peroxidem. Výsledná reakce se vyhodnocuje spekrofotometricky [26].
5.2 Metody určující redoxní vlastnosti látek U těchto metod se antioxidační aktivita hodnotí jako redukční schopnost antioxidantů, protože antioxidanty se zde považují za redukční činidla a redukují volné radikály.
24
5.2.1 Ferric reducting antioxidant potential (FRAP) Je také nazývaná Ferrous oxidation assay (FOX). Metoda spočívá v redukci železitých komplexů, které jsou skoro bezbarvé, pomocí antioxidantů ze vzorku. Železité komplexy se redukují na železnaté a vytvářejí barevné komplexy. Množství barevných komplexů je ekvivalentní k množství antioxidačních látek. Komplexy se detekují spektrofotometricky. Jako železité komplexy se používají TPTZ (2,4,6-tripyridyl-S-triazin a ferrokyanid) [26,27]. Pro měření antioxidační aktivity čaje není tato metoda moc vhodná, protože polyfenolické látky reagují pomalu a nemusí být kompletně změřeny[25]. 5.2.2 Cyklická voltametrie Tato metoda sleduje schopnost látek odštěpovat elektrony. Na pracovní elektrodu se přivádí určitou rychlostí potenciálový pulz a sledují se proudové odezvy v roztoku vzorku. Výsledkem je cyklický voltamogram. Redukční schopnost antioxidantů se určí z potenciálu anodického oxidačního píku EA: čím je látka silnější antioxidant, tím je tato hodnota menší. Z píku anodického proudu IA se zjišťuje množství antioxidační látky [25].
5.3 Metody založené na detekci oxidačního poškození organismu Při těchto metodách se používají pokusná zvířata, u kterých se vyvolává oxidační stres a současně nebo po určité době se podává testovaná látka. Kritérii oxidačního poškození jsou 8-hydroxy-2´-deoxyguanosin v moči, TBARS (thiobarbituric acid reactive substances) v krvi, hydroperoxidy a konjugované dieny v krvi, F2-isoprostany a etan + pentan ve vydechovaném vzduchu [26].
25
EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST
26
6. POUŽITÉ CHEMIKÁLIE 6.1 Chemikálie pro TEAC - luminol (zásobní roztok o koncentraci 2·10-3 mol/l v destilované vodě, výrobce Sigma Aldrich) - peroxid vodíku (zásobní roztok o koncentraci 3 % v destilované vodě, výrobce Sigma Aldrich) - fosfátový pufr (byl připraven titrací 2,7 g KH2PO4 rozpuštěných v objemu 0,3 l destilované vody a 21,49 g Na2HPO4 rozpuštěných v objemu 0,9 l destilované vody na výsledné pH 7,4, výrobce fosforečných solí Lachema) - křenová peroxidasa HRP (zásobní roztok o koncentraci 1 g/l v destilované vodě, výrobce Sigma - Aldrich) - trolox (zásobní roztok o koncentraci 1·10-3 mol/l v destilované vodě, výrobce Sigma Aldrich).
6.2 Chemikálie pro průtokovou coulometrii - základní elektrolyt: 0,1M-NaCl + 0,002M-HCl (pH = 3), (výrobce HCl a NaCl – Lachema) - trolox (Sigma-Aldrich), zásobní roztok o koncentraci 1·10-4 mol/l v destilované vodě
27
6.3 Přehled vzorků čajů a nečajů Tab. č. 2: přehled vzorků čajů a nečajů zelené
černé
polofermentované
bílé
nečaje
Cejlon Sencha
Assam OP blend
Formosa Fine Oolong
Pai Mu Tan
Lípa
Darjeeling Green Upper Fagu
Cejlon OP Ruhuna
Ti Kuan Yin
Shou Mei
Máta
En Shi Yu Lu
English Breakfast Tea
White monkey
Mate Green
China Gunpowden green
Gunpowden black
Mateřídouška
China Jasmin
Kenya GFOP I Milima
Meduňka
China Sencha
Nepal SFTGFOPMaloom
Plicník
Jade Rings
Pu-Erh
Rooibos
Silver Sprout
Vietnam FOP
Šalvěj
Yunnan Green
Třezalka
Všechny čaje od firmy OXALIS, spol. s r. o., K Tepláním 663, 763 15 Slušovice. Tyto čaje by měly být vyšší kvality, než čaje prodávané v nálevových sáčcích, neboť listy nejsou rozemlety na jemný prach a lze tedy u nich předpokládat větší množství účinných látek. Byliny byly sesbírány v okolí lokality Horní Němčí. Tyto byliny byly sbírány v jarních a letních měsících v roce 2007, výjimku tvoří třezalka, která byla sbírána v roce 2003. Po sesbírání byly sušeny za pomoci větráku na sítu v tmavé místnosti do jejich úplného vysušení a pak skladovány v tmavém prostoru ve vakuované nádobě.
7. PŘÍSTROJOVÉ VYBAVENÍ 7.1 Přístrojové vybavení pro TEAC Jako měřící přístroj byl použit Fluoroskan Ascent FL, jehož výrobcem je firma ThermoLabsystems, Finsko.
28
Obr. 24 Fluoroskan Ascent FL Měření se provádělo v mikrotitračních destičkách, které mají celkem 96 jamek. Přístroj umožňuje automatický nástřik reakční složky v rozsahu 5 - 1000 μl. Při nástřiku 5 μl proběhne dávkování destičky během 25 sekund. Luminiscence se měří v rozsahu mezi 270 670 nm. Měření bylo provedeno při teplotě 25 °C.
7.2 Přístrojové vybavení pro průtokovou coulometrii Jako měřící přístroj byl použit elektrochemický analyzátor EcaFlow 120 GLP (Istran, Bratislava) řízený počítačem (program Eca-titr) s kompaktní průtokovou měřící celou s pracovní porézní uhlíkovou elektrodou E53C.
Obr. 25 EcaFlow 120 GLP Přístroj obsahuje měřící jednotku s mikropočítačem a průtokovým systémem, který je umístěný na předním panelu přístroje pod odklopitelným krytem. Průtoková jednotka obsahuje: - teflonové dávkovací ventily, které umožňují správné dávkování vzorku a elektrolytu 29
- peristaltické čerpadlo na přepravu dávkovaných roztoků přes průtokový systém - jednotku na on-line filtraci nebo promíchávání roztoků před vstupem do měřící cely - průtokovou měřící celu EcaCell 353 s porézní pracovní uhlíkovou elektrodou E53C, platinovou pomocnou a termodynamickou chloridostříbrnou referentní elektrodou. Měření včetně dávkování vzorků probíhá plně automaticky a naměřený signál se automaticky koriguje na signál pozadí získaného měřením roztoku čistého elektrolytu. Měření má široký koncentrační rozsah od koncentrací několika stovek ng/l až po několik desítek mg/l. [23]
8. POSTUP 8.1 Postup přípravy čajových nálevů Byly naváženy vzorky čaje (cca 2 g), které byly zality 100 ml destilované vody. Zelené čaje byly zalévány vodou s teplotou 70 ºC a vyluhovaly se 3 minuty. Bílé čaje jsem zalévala vodou o teplotě 90 ºC a vyluhovaly se 5 minut. Polofermentované čaje, černé čaje a bylinky se zalévaly vodou o teplotě 100 ºC. Polofermentovené a černé čaje se vyluhovaly 10 minut a bylinky 15minut.
8.2 Postup měření metodou TEAC Čaje se ředily 10x fosfátovým pufrem. Následně se vzorky naředily na potřebnou koncentraci a to tak, že se všechny vzorky čaje ředily 2x, 3x, 5x, 10x, 20x, 30x a 50x fosfátovým pufrem (stejným způsobem byl ředěn roztok troloxu, o koncentraci 1·10-4 mol/l, pro kalibraci). Pipetou bylo zavedeno 20 μl naředěného vzorku do jamky mikrotitrační destičky a přidáno 20 μl křenové peroxidasy. Následně se provádělo vlastní měření v přístroji, kde došlo k nástřiku 160 μl reakční směsi (10 ml reakční směsi obsahuje 200 μl luminolu o koncentraci 2 x 10-3 mol/l, 100 μl 3 % -ního roztoku peroxidu vodíku a 9,7 ml fosfátového pufru o pH 7,4). Výsledky měření byly zpracovány v programu Microsoft Excel. Všechny čaje byly změřeny třikrát, z naměřených výsledků byl vypočítán aritmetický průměr, který byl použit při výpočtu celkové antioxidační kapacity z regresní rovnice kalibrační přímky. Kalibrační závislosti byly měřeny za stejných experimentálních podmínek vždy před každým měřením dané série čajových nálevů.
8.3 Princip stanovení celkové antioxidační aktivity průtokovou coulometrií Měří se elektrický náboj spotřebovaný na kvantitativní oxidaci antioxidačních látek uvnitř porézní uhlíkové elektrody pomocí konstantního proudu. Průběh oxidace se sleduje měřením potenciálu porézní elektrody (chronopotenciometrie). V průběhu oxidace se potenciál mění pomalu, po úplném zoxidovaní antioxidačních látek dochází ke skokové změně potenciálu, což indikuje konec vnitřněelektrodové titrace. Získaný signál dt/dE = f(t) má tvar píku, jehož plocha odpovídá přechodovému času úměrnému koncentraci antioxidantů ve vzorku.
8.4 Postup měření průtokovou coulometrií Byl připraven roztok troloxu o koncentraci 1·10-4 mol/l. Tento roztok byl naředěn základním elektrolytem v poměru 1:10. Čajové výluhy se také ředily základním elektrolytem v objemovém poměru 1:10. Před měřením byly na přístroji nastaveny následující parametry:
30
Tab. č. 3: přehled parametrů průtokové coulometrie Počáteční potenciál 0 mV Konečný potenciál 800 mV Prodleva při počátečním potenciálu 10 s Regenerace 10 s Objem vzorku 3 ml Konstantní rozpouštěcí proud 10 μA Maximální doba oxidace 60 s Průtoková rychlost 4,6 ml/min Oxidace při zastaveném průtoku Před měřením každého nového vzorku se přístroj automaticky promyl roztokem základního elektrolytu a vzorku. Každé měření se opakovalo třikrát. Nejprve se měřil standardní roztok troloxu, na nějž se kalibroval přístroj určením efektivního objemu cely: c Vef = 1 · V c2 kde Vef – efektivní objem cely (μl), c1 – koncentrace signálu troloxu, při nastaveném ředění 3 ml to 3 ml (v μg/l), c2 – koncentrace troloxu v μg/l, V – objem dávkovaného roztoku standardu , tj. 3 ml. Zjištěná hodnota efektivního objemu se nastavila do parametrů měření.
9. VYHODNOCENÍ EXPERIMENTÁLNÍCH DAT Vyhodnocení experimentálních dat jsem prováděla na počítači pomocí programu Microsoft Excel. Vytvořila jsem si závislost intenzity luminiscence na čase. Kalibrační závislosti byly proloženy regresní přímkou metodou nejmenších čtverců v programu MS Excel. Z parametrů regresních přímek byly vypočítány meze detekce a stanovitelnosti metodou ISO 11843 pomocí software Q.C. Expert (TriloByte, Pardubice). Experimentální meze detekce metody TEAC byly určeny jako koncentrace troloxu, pro něž byly naměřeny nejkratší časové prodlevy 16,21s v měřených závislostech intenzity luminiscence na čase. Při měření průtokovou coulometrií byl před každou sérií analýz čajových nálevů přístroj kalibrován na koncentraci troloxu 1.10-4 mol/l. Hodnoty TAA byly pak přímo odečítány z přístroje v jednotkách mg/l troloxu, ktreré se pak přepočítaly na mmol/l troloxu.
31
10.
VÝSLEDKY A DISKUSE
10.1 TEAC Před každým měřením touto metodou byly proměřeny odezvy roztoku troloxu naředěného 2x, 3x, 5x, 10x, 20x, 30x a 50x fosfátovým pufrem a byla sestrojena kalibrační přímka. Z její regresní rovnice byly počítány hodnoty TAA jednotlivých čajů. Pro zjištění opakovatelnosti odezvy přístroje byly jednotlivé rovnice regrese porovnány (graf 1). Kalibrační přímky troloxu 1200 1000
t (s)
800 600 400 200 0 0
5E-06
0,00001 1,5E-05 0,00002 2,5E-05 0,00003 3,5E-05 0,00004 4,5E-05 0,00005 c (mol/l)
Graf 1 : kalibrační přímky troloxu Z těchto pěti kalibračních přímek byly vypočítány metodou ISO 11843 pomocí software Q.C. Expert parametry regrese A a B kalibrační přímky spolu s jejich příslušnými směrodatnými odchylkami, detekční limit, mez stanovitelnosti a hodnota spolehlivosti. Jednotlivé vypočtené hodnoty jsou uvedeny v tabulce 4.
32
Tab. 4: Parametry regresních kalibračních přímek t = A + Bc , chemiluminiscenční metoda TEAC Směrodatná Hodnota Detekční Mez odchylka A spolehlivosti limit xd stanovitelnosti (s) R2 (mol/l) xq (mol/l)
Směrodatná odchylka B (l/mol)
Úsek A (s)
1
21041285,53 536451,01
- 37,40
12,18
0,996
0,00024
0,00038
2
17471481,35 1527726,34
- 29,12
34,70
0,956
0,00083
0,00133
3
17601643,16 577167,90
- 25,76
13,11
0,993
0,00031
0,00050
4
19819237,69 1376180,4
6,56
31,26
0,971
0,00066
0,00105
5
18762291,21 952489,83
- 11,71
21,63
0,984
0,00048
0,00077
Měření
Směrnice B (l/ mol)
Vzorky čaje byly změřeny při různém ředění. Jednotlivé hodnoty byly zprůměrňovány. Hodnoty TAA při různých koncentracích ukazuje graf 2.
Kalibrační přímka
TAA (mmol/l troloxu)
30 25 20 15 10 5 0 0
0,0001
0,0002
0,0003
0,0004
0,0005
c ředění (1/2, 1/3, 1/5, 1/10, 1/20, 1/30, 1/50)
Graf 2: Závislost TAA jednoho čaje (máty peprné) v mmol/l troloxu na ředění čaje Hodnoty celkové antioxidační aktivity stanovené chemiluminiscenční metodou jsou shrnuty v tabulce 5.
u
jednotlivých
druhů
čaje
33
Tab. 5: Přehled naměřených hodnot antioxidační aktivity (vyjádřené v mmol/l troloxu) čajových nálevů z různých druhů čajů určených chemiluminiscenční metodou Druh čaje Cejlon Sencha Darjeeling Green Upper Fagu En Shi Yu Lu China Gunpowden green China Jasmin China Sencha Jade Rings Silver Sprout Yunnan Green Assam OP blend Cejlon OP Ruhuna English Breakfast Tea Gunpowden black Kenya GFOP I Milima Nepal SFTGFOP-Maloom Pu-Erh
c (mmol/l) 10,80 16,81 21,99 14,04 10,07 18,67 19,88 16,19 10,94 9,20 8,40 7,19 7,98 5,36 3,69 7,98
Druh čaje Vietnam FOP
c (mmol/l) 9,32
Formosa Fine Oolong Pai Mu Tan Shou Mei Ti Kuan Yin White monkey Lípa Máta Mate Green Mateřídouška Meduňka Plicník Rooibos Šalvěj Třezalka
8,57 3,37 4,24 10,05 3,25 7,84 13,58 30,05 12,39 16,50 14,33 1,17 9,50 0,00
Porovnání antioxidační aktivity nálevů ze sledovaných čajů určené chemiluminiscenční metodou je znázorněno v grafech 3 - 7.
Zelené čaje TEAC 25,0
mmol/l
20,0 15,0 10,0
druhy čaje
Graf 3 : srovnání antioxidační aktivity nálevů ze zelených čajů
34
Silver Sprout Yunnan Green
Jade Rings
0,0
Cejlon Sencha Darjeeling Green En Shi Yu Lu China Gunpowden China Jasmin China Sencha
5,0
Vietnam FOP
Pu-Erh
Nepal SFTGFOPMaloom
Kenya GFOP I Milima
Gunpowden black
English Breakfast Tea
Cejlon OP Ruhuna
10,0 9,0 8,0 7,0 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0
Assam OP blend
mmol/l
Černé čaje TEAC
druhy čaje
Graf 4 : srovnání antioxidační aktivity nálevů z černých čajů
Polofermentované a bílé čaje TEAC 12,0
mmol/l
10,0 8,0 6,0 4,0
White monkey
Ti Kuan Yin
Shou Mei
Pai Mu Tan
0,0
Formosa Fine Oolong
2,0
druhy čaje
Graf 5 : srovnání antioxidační aktivity nálevů z polofermentovaných a bílých čajů
35
Bylinkové čaje a nečaje TEAC 35,0 30,0
mmol/l
25,0 20,0 15,0 10,0
Třezalka
Šalvěj
Rooibos
Meduňka
Mateřídouška
Mate Green
Máta
Lípa
0,0
Plicník
5,0
druhy čaje
Graf 6 : srovnání antioxidační aktivity nálevů z bylinných čajů a nečajů Všechny čaje - TEAC 30,0000
25,0000
20,0000 mmol/l 15,0000
10,0000
5,0000
0,0000 Máta Třezalka Plicník Lípa Meduňka Šalvěj Mateřídouška White monkey Shou Mei Pai Mu Tan Ti Kuan Yin Formosa Fine Oolong Vietnam FOP Kenya GFOP I Milima Gunpowden black Nepal SFTGFOPAssam OP blend Cejlon OP Ruhuna Pu-Erh English Breakfast Tea Mate Green Rooibos China Sencha Silver Sprout En Shi Yu Lu Cejlon Sencha China Gunpowden green Darjeeling Green Upper China Jasmin Yunnan Green Jade Rings Druhy čajů
Graf 7 : srovnání antioxidační aktivity nálevů ze všech čajů a nečajů Z uvedených výsledků vyplývá, že největší antioxidační aktivitu mají zelené čaje, následují polofermentované a černé čaje a nejnižší naměřené hodnoty byly u bílých čajů. Vyplývá to ze způsobu výroby těchto čajů, a to hlavně z procesu fermentace. U zelených čajů neprobíhá proces fermentace vůbec, a tedy nedochází k oxidaci polyfenolů, které působí jako hlavní antioxidanty v čajích. U čajů polofermentovaných již probíhá částečný proces fermentace, a tedy obsah polyfenolů je oxidací poněkud snížen. U čajů černých se proces 36
fermentace ještě prohlubuje, a tedy se i snižuje obsah antioxidačních látek. Malé hodnoty celkové antioxidační kapacity u čajů bílých zřejmě nelze vysvětlit způsobem jejich zpracování. Bílé čaje se zpracovávají jen lehkou fermentací, tudíž by nemělo docházet k rozsáhlejší oxidaci antioxidačních látek. Malá antioxidační aktivita těchto čajů může být dána procesem sušení, které probíhá pomaleji než u zelených čajů a může poskytovat dostatečný čas na oxidaci labilnějších polyfenolických sloučenin. Z nečajů má největší celkovou antioxidační kapacitu Maté green, což je způsobeno jednak jeho šetrným zpracováním, kdy nedochází k procesu fermentace, jednak vysokým obsahem vitamínů a beta-karotenu v této rostlině. V některých bylinách jako jsou meduňka, plicník, máta a mateřídouška byly naměřeny celkové antioxidační srovnatelné se zelenými čaji, v lípě a v šalvěji byly celkové antioxidační kapacity o něco málo menší. Velká celková antioxidační aktivita bylinných nálevů vyplývá také ze způsobu jejich zpracování, protože u nich také nedošlo k žádnému procesu fermentace. Dále mají velký obsah flavonoidů, vitamínů a dalších antioxidačních látek. U jediné byliny, třezalky, nebyla zaznamenána žádná antioxidační aktivita. Třezalka byla zpracována stejným způsobem jako ostatní byliny a podle literárních zdrojů Herbáře léčivých rostlin [16] obsahuje značné množství antioxidačních látek. Důvodem zjištěné velmi nízké antioxidační aktivity u sledovaného vzorku je zřejmě stáří použité drogy. Po pětiletém skladování mohlo dojít k degradaci antioxidantů a léčivých látek, které tato rostlina obsahuje. Z toho lze usuzovat, že celková antioxidační kapacita klesá se stářím vzorků. Překvapivě v Rooibosu byla změřena velmi malá celková antioxidační kapacita, i když tento nečaj obsahuje velmi velké množství polyfenolů. To může být zase způsobeno zpracováním, protože pro své měření jsem si vybrala červenou variantu rooibosu, která je fermentovaná.
10.2 průtoková coulometrie Pro zjištění lineárního kalibračního rozsahu metody byly opakovaně měřeny kalibrační závislosti troloxu v koncentračním rozsahu 5·10-6 až 1·10-4 mol/l . Každá koncentrace troloxu byla změřena 5x a z hodnot byl sestrojen kalibrační graf (graf 8) a vypočteny parametry regresního modelu (tabulka 6).
37
Kalibrační závislost troloxu
plocha chronopotenciometrického píku
120 100 80 60 40 20 0 0
0,0001
0,0002
0,0003
0,0004
0,0005
0,0006
0,0007
0,0008
0,0009
0,001
c (mol/l)
Graf 8 : Kalibrační závislost troloxu změřená metodou průtokové coulometrie Tab. 6: Parametry regrese kalibrační přímky, metoda průtokové coulometrie Měření
Směrnice B (l/mol)
1
101490,19
Směrodatná Hodnota Detekční Směrodatná Mez Úsek A odchylka A spolehlivosti limit xd stanovitelnosti odchylka B (s) (s) R2 (l/mol) (mol/l) xq (mol/l)
4194,14
9,52
2,14
0,997
0,00253
0,00374
Hodnoty celkové antioxidační aktivity stanovené průtokovou coulometrií u jednotlivých druhů čajových nálevů shrnuje tabulka 7.
38
Tab. 7: Hodnoty antioxidační aktivity čajových nálevů určené průtokovou coulometrií (vyjádřené v mmol/l troloxu). Druh čaje Cejlon Sencha Darjeeling Green Upper Fagu En Shi Yu Lu China Gunpowden green China Jasmin China Sencha Jade Rings Silver Sprout Yunnan Green Assam OP blend Cejlon OP Ruhuna English Breakfast Tea Gunpowden black Kenya GFOP I Milima Nepal SFTGFOP-Maloom Pu-Erh
c (mmol/l) 2,75 2,75 3,02 2,67 2,68 2,87 2,84 2,77 2,13 0,99 0,32 0,40 0,63 0,35 0,07 0,30
Druh čaje Vietnam FOP
c (mmol/l)
0,51
Formosa Fine Oolong Pai Mu Tan Shou Mei Ti Kuan Yin White monkey Lípa Máta Mate Green Mateřídouška Meduňka Plicník Rooibos Šalvěj Třezalka
0,95 0,11 0,16 1,09 0,17 0,19 2,56 2,71 2,45 2,75 2,71 0,09 0,40 0,04
Porovnání celkové antioxidační aktivity čajových nálevů určené metodou průtokové coulometrie znázorňují grafy 9 – 13.
Zelené čaje - coulometrické titrace 3,5 3,0
mmol/l
2,5 2,0 1,5 1,0
Silver Sprout Yunnan Green
Jade Rings
0,0
Cejlon Sencha Darjeeling Green En Shi Yu Lu China Gunpowden China Jasmin China Sencha
0,5
druhy čaje
Graf 9: srovnání antioxidační aktivity nálevů ze zelených čajů
39
Vietnam FOP
Pu-Erh
Nepal SFTGFOPMaloom
Kenya GFOP I Milima
Gunpowden black
English Breakfast Tea
Cejlon OP Ruhuna
1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0
Assam OP blend
mmol/l
Černé čaje - coulometrické titrace
druhy čaje
Graf 10: srovnání antioxidační aktivity nálevů z černých čajů
Polofermentované a bílé čaje - coulometrické titrace 1,2
mmol/l
1,0 0,8 0,6 0,4
White monkey
Ti Kuan Yin
Shou Mei
Pai Mu Tan
0,0
Formosa Fine Oolong
0,2
druhy čaje Graf 11 : srovnání antioxidační aktivity nálevů z polofermentovaných a bílých čajů
40
Bylinkové čaje a nečaje - coulometrické titrace 3,0
mmol/l
2,5 2,0 1,5 1,0
Třezalka
Šalvěj
Rooibos
Plicník
Meduňka
Mateřídouška
Mate Green
Máta
0,0
Lípa
0,5
druhy čaje
Graf 12 : srovnání antioxidační aktivity nálevů z bylinných čajů a nečajů Všechny čaje - coulometrické titrace 3,0000 2,5000 2,0000 mmol/l 1,5000 1,0000 0,5000 0,0000 Máta Třezalka Plicník Lípa Meduňka Šalvěj Mateřídouška White monkey Shou Mei Pai Mu Tan Ti Kuan Yin Formosa Fine Oolong Vietnam FOP Kenya GFOP I Milima Gunpowden black Nepal SFTGFOPAssam OP blend Cejlon OP Ruhuna Pu-Erh English Breakfast Tea Mate Green Rooibos China Sencha Silver Sprout En Shi Yu Lu Cejlon Sencha China Gunpowden green Darjeeling Green Upper China Jasmin Yunnan Green Jade Rings Druhy čajů
Graf 13 : Srovnání celkové antioxidační aktivity nálevů ze všech čajů a nečajů Z naměřených hodnot je patrné, že tak jako u předešlé metody vykazují největší antioxidační aktivitu zelené čaje, následují polyfermentované a černé čaje a nejnižší hodnoty antioxidační aktivity jsou u bílých čajů.
41
10.3 porovnání výsledků celkové antioxidační aktivity stanovené metodami TEAC a průtokovou coulometrií V grafech 14-17 jsou porovnány hodnoty celkové antioxidační aktivity čajových nálevů stanovené oběma použitými metodami.
Zelené čaje TEAC
PRŮTOKOVÁ COULOMETRIE
25,0
mmol/l
20,0 15,0 10,0
Silver Sprout Yunnan Green
Jade Rings
0,0
Cejlon Sencha Darjeeling Green En Shi Yu Lu China Gunpowden China Jasmin China Sencha
5,0
druhy čaje
Graf 14: Srovnání antioxidační aktivity zelených čajů měřených metodou TEAC a průtokovou coulometrií
Vietnam FOP
PRŮTOKOVÁ COULOM ETRIE
Pu-Erh
Nepal SFTGFOP-
TEAC
Kenya GFOP I
Gunpowden black
Cejlon OP Ruhuna English Breakfast
10,0 9,0 8,0 7,0 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0
Assam OP blend
mmol/l
Černé čaje
druhy čaje
Graf 15: Srovnání antioxidační aktivity černých čajů měřených metodou TEAC a průtokovou coulometrií
42
Polofermentované a bílé čaje TEAC
PRŮTOKOVÁ COULOMETRIE
12,0 10,0
mmol/l
8,0 6,0 4,0
White monkey
Ti Kuan Yin
Pai Mu Tan
Formosa Fine Oolong
0,0
Shou Mei
2,0
druhy čaje
Graf 16: Srovnání antioxidační aktivity polofermentovaných a bílých čajů měřených metodou TEAC a průtokovou coulometrií
Bylinkové čaje a nečaje TEAC
PRŮTOKOVÁ COULOMETRIE
30,0 25,0
mmol/l
20,0 15,0 10,0
Třezalka
Šalvěj
Rooibos
Plicník
Meduňka
Mateřídouška
Mate Green
Máta
0,0
Lípa
5,0
druhy čaje
Graf 17: Srovnání antioxidační aktivity bylin a nečajů měřených metodou TEAC a průtokovou coulometrií Z uvedených grafů je zřejmé, že hodnoty celkové antioxidační aktivity vztažené na mmol/l troloxu stanovené průtokovou coulometrií jsou mnohem nižší v porovnání se standardní metodou TEAC (v průměru asi 12 krát). Tyto rozdíly můžeme přisuzovat rozdílnému principu měření obou metod. Zatímco metodou TEAC se antioxidanty přítomnými v čajových nálevech vychytávají reaktivní formy kyslíku v roztoku (homogenní reakce), při průtokové coulometrii dochází k oxidaci volných snadno oxidovatelných látek na velkoplošné uhlíkové
43
elektrodě (heterogenní reakce). Je zřejmé, že v elektrochemické metodě bude hrát významnou roli rychlost přenosu náboje mezi elektrodovým povrchem a elektroaktivní látkou u elektrody. Zatímco oxidace troloxu probíhá ve vodném prostředí velmi rychle (prakticky reverzibilně), oxidace dalších (zejména polyfenolických) složek čajových nálevů může probíhat ireverzibilně, zvláště, jsou-li vázány ve složitějších komplexech. To se projeví menší intenzitou chronopotenciometrického signálu, a tedy i nižší hodnotou antioxidační aktivity vztažené na koncentraci troloxu. Vzájemný vztah mezi hodnotami celkové antioxidační aktivity stanovené oběma technikami byl sledován pomocí korelace (grafy 18 - 22) a byl určen Spearmanův korelační koeficient (tabulka 8).
Průtoková coulometrie (mmol/l)
Korelace - zelené čaje
y = 0,0396x + 2,1121 2 R = 0,4788
3,5000 3,0000 2,5000 2,0000 1,5000 1,0000 0,5000 0,0000 0,0000
5,0000
10,0000
15,0000
20,0000
TEAC (mmol/l)
Graf 18: Korelace hodnot celkové antioxidační aktivity nálevů ze zelených čajů
44
25,0000
y = 0,0987x - 0,278 2 R = 0,4947
Průtoková coulometrie (mmol/l)
Korelace - černé čaje 1,2000 1,0000 0,8000 0,6000 0,4000 0,2000 0,0000
0,0000 1,0000 2,0000 3,0000 4,0000 5,0000 6,0000 7,0000 8,0000 9,0000 10,000 0
TEAC (mmol/l)
Graf 19: Korelace hodnot celkové antioxidační aktivity nálevů z černých čajů - 0,3839 Korelace - polofermentované a bílé čaje y = 0,15x 2 R = 0,9817 Průtoková coulometrie (mmol/l)
1,2000 1,0000 0,8000 0,6000 0,4000 0,2000 0,0000 0,0000
2,0000
4,0000
6,0000
8,0000
10,0000
12,0000
TEAC (mmol/l)
Graf 20: Korelace hodnot celkové antioxidační aktivity nálevů z polofermentovaných a bílých čajů
45
Průtoková coulometrie (mmol/l)
Korelace - nečaje
y = 0,1151x + 0,2018 2 R = 0,6241
4,0000 3,5000 3,0000 2,5000 2,0000 1,5000 1,0000 0,5000 0,0000 0,0000
5,0000
10,0000
15,0000
20,0000
25,0000
30,0000
35,0000
TEAC (mmol/l)
Graf 21: Korelace hodnot celkové antioxidační aktivity nálevů z bylinných čajů a nečajů y = 0,1518x - 0,195 R2 = 0,6872
Průtoková coulometrie (mmol/l)
Korelace - všechny vzorky 5,0000 4,5000 4,0000 3,5000 3,0000 2,5000 2,0000 1,5000 1,0000 0,5000 0,0000 0,0000
5,0000
10,0000
15,0000
20,0000
25,0000
30,0000
35,0000
TEAC (mmol/l)
Graf 22: Korelace hodnot celkové antioxidační aktivity všech nálevů z čajů a nečajů
46
Tab.8: Hodnoty Spearmanova korelačního koeficientu u jednotlivých skupin čajů Spearmanův korelační Druh čaje koeficient 0,7667 zelené 0,6429 černé 0,7000 bílé a polofermentované 0,9833 nečaje 0,9512 všechny čaje Z uvedených korelačních přímek a jejich korelačních koeficientů je patrné, že mezi hodnotami TAA zjištěnými oběma metodami existuje statisticky významná lineární závislost. Z toho lze usuzovat, že průtoková coulometrie je použitelná ke zjišťování celkové antioxidační aktivity čajových nálevů.
47
11.
ZÁVĚR
Z provedených měření oběma metodami jsem zjistila, že největší celkovou antioxidační aktivitu mají zelené čaje, za nimi jsou polofermentované čaje. Ještě menší antioxidační aktivitu mají černé čaje a nejmenší antioxidační aktivita byla naměřena u bílých čajů, přičemž průměrné hodnoty u jednotlivých čajů byly naměřeny u zelených čajů metodou TEAC kolem 15,43 mmol/l a průtokovou coulometrií kolem 2,68 mmol/l, u polofermentovaných čajů metodou TEAC kolem 9,25 mmol/l a průtokovou coulometrií kolem 1,02 mmol/l, u černých čajů metodou TEAC kolem 7,33 mmol/l a průtokovou coulometrií kolem 0,44 mmol/l a u bílých čajů metodou TEAC kolem 3,56 mmol/l a průtokovou coulometrií kolem 0,14 mmol/l. Většina bylin má antioxidační aktivitu srovnatelnou se zelenými čaji. Největší antioxidační aktivita byla naměřena u nečaje Maté, a to dokonce 30 mmol/l. Průměrná hodnota antioxidační aktivity zjištěná metodou TEAC u nálevů z bylinných čajů činí 12,31 mmol/l, průtokovou coulometrií byla zjištěna průměrná aktivita 1,58 mmol/l. Podle mého názoru jsou výsledné hodnoty TAA závislé na zpracování čaje při výrobě a to hlavně na průběhu a délce fermentace. Čaje s nejvyššími hodnotami celkové antioxidační aktivity nejsou vůbec fermentované, a čím déle fermentace probíhá, tím se celková antioxidační aktivita zmenšuje. Dalším významným parametrem ovlivňujícím antioxidační aktivitu je stáří měřeného vzorku. U bylinného čaje z třezalky tečkované nebyla naměřena žádná antioxidační aktivita, a to z důvodu, že vzorek čaje byl starý 5 let. Z podobného trendu měření obou metod usuzuji, že obě dvě metody spolu korelují a proto si myslím, že lze průtokovou coulometrii použít jako metodu vhodnou k měření celkové antioxidační aktivity a považovat ji za rovnocennou ostatním metodám při měření antioxidační aktivity ve vzorcích čaje.
48
12. 1.
POUŽITÁ LITERATURA
3. 4.
Štípek S. a kol.: Antioxidanty a volné radikály ve zdraví a nemoci, Grada Publishing, Praha (2000). Sklenovský A.: Pokroky v patologické fyziologii: význam volných kyslíkových radikálů pro etiopatogenezi chorob, Olomouc (1988). Bancířová M.: Soubor přednášek o reaktivních formách kyslíku, Olomouc (2004). Passwater R.A.: O antioxidantech, Pragma, Praha (2002).
5.
Trotman-Dickenson: Volné radikály, Státní nakladatelství technické literatury, Praha
2.
(1963). 6.
Serafini M.: The role of antioxidants in disease prevention, Medicine, (2006).
7.
Zelený čaj – pohoda pro tělo i duši, nakladatelství Svojtka, Praha (2002).
8.
Valter K.: Vše o čaji pro čajomily, Granit, Praha (2005).
9.
Oppliger P.: Nová kniha o zeleném čaji, Pragma, Praha (2003).
10.
Mitscher L.A., Dolby V.: Kniha o zeleném čaji, Pragma, Praha (2006).
11.
Dolby V.: O zeleném čaji, Pragma, Praha (2005).
12.
www.ropacek.cz, staženo ( stáhnuto leden 2004)
13.
Bartošová J.: Chemiluminiscenční stanovení celkové antioxidační kapacity medu, bakalářská práce, ÚP Olomouc (2007).
14.
Girotti S., Ferri E., Fini F., Boleli L., Sabatini A. G., Budini R., Sichertova D.: Automated and manual luminescent assay of antioxidant kapacity, Talanta 64, 665 – 670 (2004).
15.
Janča J., Zentrich J.A.: Herbář léčivých rostlin, Eminent, Praha (1995).
16.
Rubcov V.G., Beneš K.: Zelená lékárna, Lidové nakladatelství, Praha (1984).
17.
http://www.oxalis.cz/mate/cz/, staženo ( stáhnuto 25.3.2009)
18.
http://www.fiftyfifty.cz/Caj-Yerba-Mate-pro-povzbuzeni-detoxikaci-a-hubnuti2201739.php, staženo ( stáhnuto 25.3.2009)
19.
http://www.cajovykramek.cz/lecive-caje-mate/, staženo ( stáhnuto 25.3.2009)
20.
http://www.biotox.cz/enpsyro/pj3rilp.html, staženo ( stáhnuto 25.3.2009)
21.
http://www.fiftyfifty.cz/Rooibos-
zdravy-a-vytecny-caj-bez-kofeinu-4004514.php,
staženo ( stáhnuto 25.3.2009) 22.
www.istran.sk ( stáhnuto 15.2.2009)
23.
www.med.muni.cz/biochem/seminare/priranox.rtf, staženo ( stáhnuto 18.4.2009)
24.
Paulová H., Bochořákvá H., Táborská E.: Metody stanovení antioxidační aktivity přírodních látek iv vitro, Chem. Listy 98, 174 – 179 (2004).
49
25.
26. 27. 28.
50
Zloch Z., Čelakovský J., Aujezdská A.: Stanovení obsahu polyfenolů a celkové antioxidační kapacity v potravinách rostlinného původu - závěrečná zpráva o plnění výzkumného projektu podpořeného finančně Nadačním fondem Institutu Danone, Ústav hygieny Lékařské fakulty UK, Plzeň (2004). Huang D., Ou B., Prior R.L.: The chemistry behind antioxidant kapacity assays, J. Agric. Food Chem. 53, 1841 –1856 (2005) http://www.celostnimedicina.cz/l-theanin.htm, ( stáhnuto 18.4.2009) www.amana.cz ( stáhnuto 25.3.2009)
