22.2.2012
Do jednoho prostoru dialysační nádoby je umístěn roztok proteinu o koncentraci 0,1 mmol/l (pI je 7,0) v 50mM fosfátovém pufru, pH 7,0 s 5mM NaCl. Do druhého prostoru o stejném objemu je umístěn roztok 50mM fosfátovém pufru, pH 7,0 s NaCl o koncentraci 25 mmol/l. Jaké bude rozložení iontů po ustanovení rovnováhy?
Srážení, extrakce a centrifugace
1
22.2.2012
VSTUPNÍ MATERIÁL DEZINTEGRACE PURIFIKAČNÍ TECHNIKY S NÍZKÝM ROZLIŠENÍM: •srážení síranem amonným •srážení organickými rozpouštědly •srážení organickými polymery a sloučeninami •srážení selektivní denaturací •afinitní precipitace, imunoprecipitace •extrakce
CENTRIFUGACE: •diferenciální •gradientová
PURIFIKAČNÍ TECHNIKY S VYSOKÝM ROZLIŠENÍM: Technika Vlastnost •ionexová chromatografie •chromatofokusace •reversní fáze •hydrofobní interakce •gelová chromatografie •afinitní chromatografie
náboj náboj, pI hydrofobicita relativní hydrofobicita molekulová hmotnost, tvar biospecifické interakce
VSTUPNÍ MATERIÁL
„OVEREXPRESE“ PROTEINU
AFINITNÍ CHROMATOGRAFIE FŮZNÍCH PROTEINŮ Ni NTA agarosa (6-His tag) Amylosa („maltose binding protein“) GST agarosa (glutathion transferasa)
ODŠTĚPENÍ FŮZNÍHO PROTEINU •Faktor Xa •thrombin •enterokinasa
2
22.2.2012
Frakcionace biomakromolekul na základě rozdílů v rozpustnosti •
Nezaměňovat s denaturací – bílkoviny zůstávají v nativním stavu
vsolování
vysolování
3
22.2.2012
Franz Hofmeister (1850-1922)
pro anionty: SO42- > F- > IO3- > NO2- >Br- > NO3- > I- > CNSpro kationty: Li+ > Na+ > K+ > NH4+ > Rb+ > Cs+
Mechanismus tvorby precipitátu •tvorba precipitátu je proces závislý na čase •zahrnuje tvorbu malých částic, které vznikají asociací makromolekul
Zákal
•precipitace může být sledována turbidimetricky
Čas
a: vstupující světlo, b: štěrbina, c: reakční kyveta, d: fotodetektory, e: zařízení pro pohlcení světla
4
22.2.2012
Srážení síranem amonným • • • • •
Mimořádně velká rozpustnost Rozpustnost se málo mění s teplotou Levný Stabilizuje bílkoviny Relativně čistý
množství (NH4)2SO4 (g/l roztoku) potřebného pro změnu koncentrace v roztoku z původních procent saturace na požadované nasycení při 0 °C
5
22.2.2012
Příklad: 1. Po dezintegraci jste získali 20 ml extraktu o koncentraci proteinů 0,5 mg/ml. Jako první krok purifikace hexokinasy si zvolíte srážení síranem amonným (Mr 132,14). Zjistili jste, že se sráží až při 50 % koncentraci síranu. Proto jste se rozhodli udělat dvoukrokové srážení (40 %, 50 %). Napište jak byste postupovali (konkrétní navážky a postup), 2. Pokud chcete zabránit lokálnímu zvýšení koncentrace, budete při srážení přidávat rozpuštěný síran amonný. Spočítejte kolik ml 5M síranu amonného musíte přidat k 40 ml extraktu, aby výsledná koncentrace byla 20 %.
6
22.2.2012
1. Po dezintegraci jste získali 20 ml extraktu o koncentraci proteinů 0,5 mg/ml. Jako první krok purifikace hexokinasy si zvolíte srážení síranem amonným (Mr 132,14). Zjistili jste, že se sráží až při 50 % koncentraci síranu. Proto jste se rozhodli udělat dvoukrokové srážení (40 %, 50 %). Napište jak byste postupovali (konkrétní navážky a postup), 2. Pokud chcete zabránit lokálnímu zvýšení koncentrace, budete při srážení přidávat rozpuštěný síran amonný. Spočítejte kolik ml 5M síranu amonného musíte přidat k 40 ml extraktu, aby výsledná koncentrace byla 20 %.
20% ⇒ 106 g / l ⇒ 0,8M c1.V1 = c2 .V2 5.V1 = 0,8.(0,04 + V1 ) V1 = 7,6ml
Srážení organickými rozpouštědly • •
nepolární vodou mísitelná rozpouštědla srážení za nízké teploty (< 0 °C)!!!
aceton, EtOH, isopropanol, MetOH, propanol, diethyleter Srážení acetonem (< 1µg/ml) přidat 5 objemů vychlazeného (– 20°C) acetonu ke vzorku a vortexova t. nechat 30 min při – 20°C. centrifugace 5 min, 6,000 – 10,000 g. odstranit supernatant a peletu nechat vysušit na vzduchu resuspendovat peletu
7
22.2.2012
Srážení organickými polymery a sloučeninami • PEG 4000 – 6000
–
nedenaturující, ve vodě rozpustný polymer, lze kombinovat se srážením síranem amonným
• tichloroctová kyselina – nukleové kyseliny > 20 nukleotidů, příprava vzorků na SDS-PAGE (>5µg/ml) přidat 1 objem 100 % TCA do vzorku a vortexovat nechat 20 min na ledu nebo 15 min při – 20 °C centrifugace 5 min, 6000 – 10000 g odstranit supernatant resuspendovat peletu v 0,1 M NaOH nebo opláchnout peletu směsí ethanol/ether (1/1) a resuspendovat peletu v pufru
Selektivní denaturace • Při této metodě denaturujeme balastní bílkoviny, cílová bílkovina (enzym) musí zůstat z 85 - 90 % v nativním stavu. • Denaturační vlivy – T, pH • Balastní bílkovina musí nejen denaturovat, ale i precipitovat
8
22.2.2012
• Přídavky některých látek (substráty, koenzymy, inhibitory) zvyšují stabilitu cílových bílkovin • pH při tepelné denaturaci musí být přesně definováno
%
Srážení vlivem teploty 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
Bílkovina 1 Bílkovina 2
teplota
Srážení vlivem pH •mnoho proteinů se sráží z roztoku v pH, které odpovídá pI •je dobré znát pI proteinu (chromatofokusace, isoelektrická fokusace)
9
22.2.2012
Afinitní precipitace
bifunkční ligandy – bis-NAD, bis-AMP, barevné ligandy
polymer – ligand – PEG- ligand
Imunoprecipitace •antigeny mohou být precipitovány použitím odpovídajících protilátek •protilátky mohou být precipitovány použitím odpovídajících antigenů •antigeny mohou být precipitovány použitím nerozpustné formy protilátky
10
22.2.2012
Centrifugace Při centrifugaci se separují částice od roztoku na základě jejich velikosti, tvaru, hustoty, viskozity media a rychlosti otáčení rotoru
Rychlost sedimentace čtástic
v=
d 2 ( ρ p − ρl ) 18µ
g
v = rychlost sedimentace
d = průměr částice
ρp = hustota částice
ρl = hustota kapaliny
g = centrifugační rychlost
µ = viskozita kapaliny
11
22.2.2012
Centrifugace - rozdělení Centrifugace
Pomalootáčková 5 000 ot/min
Rychlootáčková 25 000 ot/min
Ultracentrifugace 80 000 ot/min
RPM x RCF rychlost: počet otáček za minutu (rpm = revolutions per min.) odstředivá síla: relativní odstředivé zrychlení (RCF = relative centrifugal force)
rad
RCF = f x r x (rpm)2 f = přepočítavací faktor – 1,118.10-5 r - poloměr rotoru centrifugy (cm) jednotky: g (RCF udává, kolikrát je zrychlení centrifugy větší, než je normální tíhové zrychlení g = 9,81 m/s2)
12
22.2.2012
Centrifugace
Preparativní
diferenciální
gradientová
Analytická
sedimentační rovnováhy
sedimentační rychlost
Cetrifugace - aplikace Centrifugace = separační technika, separace na základě hustoty a rozdílu velikosti ve směsi látek •koncentrace buněk nebo precipitátu z velkého objemu tekutiny •stanovení molekulové hmotnosti, hustoty, sedimentačního koeficientu •separace buněčných komponent (frakcionace) celé buňky (a poškozené buňky) jádra lysosomy mitochondrie peroxisomy mikrosomy (z endoplasmatického retikula)
13
22.2.2012
Centrifugace - rotory •Úhlové – diferenciální centrifugace, kratší doba centrifugace •Výkyvné – gradientová centrifugace, lepší separace
Diferenciální centrifugace: •opakovaná centrifugace se zvyšující se rychlostí •na základě hustoty a velikosti částic
buněčná komponenta
otáčky [x g]
čas [min]
buňky (eukaryotické)
1 000
5
chloroplasty, buněčné membrány, jádra
4 000
10
mitochondrie
15 000
20
lysosomy, bakteriální membrány
30 000
30
ribosomy
100 000
180
14
22.2.2012
Gradientová centrifugace Kritéria pro výběr centrifugačního media: •musí v roztoku tvořit gradient •nesmí interferovat se vzorkem •musí být lehce odstranitelné ze vzorku
• • • •
Jednoduché cukry – sacharosa, sorbitol, glycerol Polysacharidy – Ficoll, dextran, glykogen Proteiny – BSA Anorganické soli – CsCl, Cs2SO4
15
22.2.2012
Gradientová centrifugace A. Izopyknická
B. zonální (sedimentační, nerovnovážná)
Gradientová centrifugace A. Izopyknická • separace na základě různých hustot, nezávisle na jejich velikosti a molekulové hmotnosti • molekuly separovány do rovnováhy, ne podle rychlosti sedimentace • rychlost 270000 x g, 18 hod
16
22.2.2012
složka směsi s největší hustotou
1
složka směsi s nejmenší hustotou složka směsi se střední hustotou
2 3
v= 4
d 2 ( ρ p − ρl ) 18µ
g
5
Možnosti uspořádání izopyknicné centrifugace 1
2
3
17
22.2.2012
http://www.biochem.arizona.edu/classes/bioc471/pages/Lecture2/Lecture2.ht ml
B. zonální (sedimentační, nerovnovážná) •hustota gradienu musí být menší než hustota dělených látek •vzorek se nanáší nad gradient •nejčastěji sacharosový gradient (5-20%) •gradient stabilizuje zóny
18
22.2.2012
Porovnání gradientových metod
Centrifugace
Zonální centrifugace
Izopyknicná centrifugace
nižší rychlost
vysoká rychlost
ukončení před kompletní sedimentací
Sedimentace do rovnováhy, dlouhý čas
Sedimentační rychlost Sedimentační rovnováha Vzorek
Obdobná hustota, různá Mw/tvar
Podobná Mw, různá hustota
Proteiny (podobná hustota, různá Mw)
Nukleové kyseliny, buněčné organely
Analytická centrifugace
19
22.2.2012
sedimentační rovnováha •měření molekulové hmotnosti •studium protein-protein interakcí určování nativního stavu proteinu (monomer, dimer, trimet, atd.) měření rovnovážné konstanty měření stechiometrie komplexů dvou nebo více různých proteinů (antigen-protilátka, receptor-ligand)
difuse
sedimentace
20
22.2.2012
sedimentační rychlost •měření rychlosti sedimentace v závislosti na centrifugační rychlosti •závisí jak na molekulové hmotnosti, tak i na tvaru molekul potvrzování homogenity vzorku detekce agregátů a kvantifikace detekce tvaru neglykosylovaných proteinů (globulární, tyčinkovité) detekce změn v konformaci proteinu detekce tvorby a stechiometrie komplexů (receptor-ligand, antigen-protilátka)
s=
(
m 1−V ρ
)
m=M /N
f
Svedberg (S), 1 S = 10-13 s
_ V – parciální specifický objem ρ – hustota f – frikční koeficient M - hmotnost 1 molu látky, N - Avogadrovo číslo
21
22.2.2012
22
22.2.2012
SEDIMENTAČNÍ RYCHLOST
SEDIMENTAČNÍ ROVNOVÁHA
ANALYTICAL Ultracentrifugation, John Burgner,
[email protected]
23
22.2.2012
Nukleové kyseliny
RNA vs. DNA RNA: •2´ OH skupina (ribosa) •Uracil se páruje s adeninem (A,U,C,G) •Mnoho typů a funkcí •Je modifikována sestřihem •Nejběžněji jednořetězcová DNA: • 2´ H (deoxyribosa) • Thymin se páruje s adeninem (A,T,C,G) • Permanentně modifikována (mutace) • Dvouřetězcová • Struktura helixu
24
22.2.2012
Isolace nukleových kyselin RNA •Messenger RNA (mRNA): 1-5 % slouží jako templát pro syntesu proteinů •Ribosomální RNA (rRNA): > 80 % tvoří součást ribosomů •Transferová RNA (tRNA): 10-15 % „překlad“ informace z mRNA do aminokyselinové sekvence
DNA •genomová (chromosomální) •organelová •plasmidová •fágová/virová (ds nebo ss)
Postup izolace nukleových kyselin kultivace buněk
lyse - „otevření“ buněk
purifikace DNA nebo RNA stanovení koncentrace stanovení velikosti a kvality
25
22.2.2012
Cíle purifikace • odstranění proteinů • odstranění DNA nebo RNA Metody: • rozdílná rozpustnost • adsorpční metody • hustotní gradient
Isolace a purifikace genomové DNA Klasický postup lyse buněk – např. SDS, CTAB, sarkosyl + proteinasa K (55 oC, 1hod), RNasa •fenol-chloroform-isoamylalkoholová extrakce •odstředění
vodná fáze
organická fáze
Separace organické fáze od vodné fáze • Organické rozpouštědlo ve spodu • Vodná fáze nahoře (obsahuje DNA) • Buněčné zbytky a proteiny jako tenký film na rozhraní mezi dvěma fázemi •precipitace isopropanolem •opláchnutí ethanolem •rozpuštění ve vodě nebo TE pufru
26
22.2.2012
Isolace plasmidové DNA Klasický postup • • • • • •
resuspendace buněk lyse buněk (SDS, NaOH) neutralizace (CH3COOK, pH 5,2) chloroformová extrakce precipitace isopropanolem precipitace ethanolem
Isolace a purifikace RNA Komplikace - Ribonukleasy •Enzymy, které degradují RNA •Běžné kontaminanty laboratoří (lidský i mikrobiální původ) •Také se uvolňují během isolace RNA ze vstupního materiálu •Je obtížné je inaktivovat ochrana před ribonukleasami •ochranné rukavice •používání RNase-free zkumavek, pipet, špiček, atd. •používání RNase-free roztoků •přídavek inhibitorů RNas
27
22.2.2012
Isolace RNA Klasický postup obdobný isolaci DNA • • • • •
inhibitor RNas nižší pH fenolu (4-6) ošetření DNasou (RNase free) selektivní precipitace LiCl (rRNA, mRNA) oligo dT pro přečištění mRNA
AAAAAAAAAAAAA TTTTTTTTTTTTT
Isolace mRNA
•nanesení totální RNA
•poly-A konec mRNA se váže na oligo(dT) nosiče •odmytí rRNA a tRNA
•eluce mRNA z oligo(dT) nosiče
28
22.2.2012
Příklad využití mRNA •DNA •primární transkript - hnRNA ZÍSKÁME IZOLACÍ •sestřižená RNA – mRNA •primer poly T •reversní transkriptasa •jednořetězcová DNA •DNA polymerasa •cDNA
Využití metody MICROARRAY pro určení profilu produkovaných proteinů
isolace RNA ze zdravé tkáně
isolace RNA z nádoru
Příprava fluorescenčně značené cDNA (ZELENÁ)
Příprava fluorescenčně značené cDNA (ČERVENÁ)
29
22.2.2012
Využití metody MICROARRAY pro určení profilu produkovaných proteinů cDNA vytvořená ze zdravé tkáně
ČERVENÁ
cDNA vytvořená ze zdravé tkáně
ZELENÁ
•smíchání fluorescenčně značené cDNA z obou tkání •aplikace na destičku s imobilizovanou DNA
Využití metody MICROARRAY pro určení profilu produkovaných proteinů •zdravá tkáň značená zelenou fluorescenční barvou •intensita zelené barvy spotu (tečky) odpovídá hladině exprese daného genu intenzivně zelené spoty – silná exprese genu slabě zelené spoty - slabá exprese genu
30
22.2.2012
Využití metody MICROARRAY pro určení profilu produkovaných proteinů •nádorová tkáň značená červenou fluorescenční barvou •intensita červené barvy spotu (tečky) odpovídá hladině exprese daného genu intenzivně červené spoty – silná exprese genu slabě červené spoty - slabá exprese genu
Využití metody MICROARRAY pro určení profilu produkovaných proteinů překryti zelených a červených dat stejné destičky – rozdílná exprese genu ZELENÁ – geny přepisované ve zdravých buňkách ČERVENÁ - geny přepisované v nádorových buňkách ŽLUTÁ - geny přepisované v obou typech buněk
31
22.2.2012
Využití gradientové centrifugace pro purifikaci NK Příklad: experiment na potvrzení semikonzervativní teorie replikace Matt Meselson & Frank Stahl 1958 http://www.sumanasinc.com/webcontent/animations/content/meselson.swf
32
22.2.2012
•zonální centrifugace – sacharosový gradient •izopyknická centrifugace –CsCl gradient
33
22.2.2012
Purifikace NK pomocí kitů •vazba na resin •selektivní membrána
•magnetické částice •gelova chromatografie
34
22.2.2012
35
