SINTESIS SENYAWA DIMER KATEKIN DARI EKSTRAK TEH HIJAU DENGAN MENGGUNAKAN KATALIS ENZIM PEROKSIDASE DARI KULIT BAWANG BOMBAY (ALLIUM CEPA L

UNIVERSITAS INDONESIA

SINTESIS SENYAWA DIMER KATEKIN DARI EKSTRAK TEH HIJAU DENGAN MENGGUNAKAN KATALIS ENZIM PEROKSIDASE DARI KULIT BAWANG BOMBAY (ALLIUM CEPA L.)

TESIS

HERONIATY 1006734451

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM PROGRAM PASCASARJANA PROGRAM STUDI MAGISTER ILMU KIMIA DEPOK JULI 2012

Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012

UNIVERSITAS INDONESIA

SINTESIS SENYAWA DIMER KATEKIN DARI EKSTRAK TEH HIJAU DENGAN MENGGUNAKAN KATALIS ENZIM PEROKSIDASE DARI KULIT BAWANG BOMBAY (ALLIUM CEPA L.)

TESIS Diajukan Sebagai Salah Satu Syarat Untuk Memperoleh Gelar Magister Sains Ilmu Kimia

HERONIATY 1006734451

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM PROGRAM PASCASARJANA PROGRAM STUDI MAGISTER ILMU KIMIA DEPOK JULI 2012




KATA PENGANTAR

Rasa syukur terindah dan terdalam penulis panjatkan kepada pemilik raga yang Maha Agung Allah SWT berkat karunia dan izin-Nya maka penulis dapat menyelesaikan tesis yang berjudul ”Sintesis Senyawa Dimer Katekin Dari Ekstrak Teh Hijau Dengan Menggunakan Katalis Enzim Peroksidase Dari Kulit Bawang Bombay (Allium cepa L.)” dengan baik. Tesis ini disusun sebagai salah satu persyaratan untuk menempuh ujian akhir Program Studi Magister Ilmu Kimia pada Program Pascasarjana Universitas Indonesia. Dalam penyusunan tesis ini penulis telah dibantu berbagai pihak baik berupa dukungan materil maupun moril yang sangat berarti bagi penyelesaian tesis ini. Untuk itu, penulis mengucapkan terima kasih kepada: 1. Dr. Herry Cahyana, selaku pembimbing I penelitian yang telah banyak membantu dan memberikan bimbingan serta arahan sehingga tesis ini dapat diselesaikan dengan baik. 2. Dr. Widajanti Wibowo, selaku pembimbing II penelitian yang telah banyak membantu dan membimbing dalam penyelesaian tesis ini. 3. Dr. Emil Budianto, selaku pembimbing akademis yang telah banyak memberikan bimbingan selama penulis menjalani masa pendidikan di Universitas Indonesia. 4. Dr. Endang Saepudin, selaku ketua Program Studi Magister Ilmu Kimia, Program Pasca Sarjana Universitas Indonesia. 5. Seluruh Bapak Ibu dosen mata kuliah pada Program Studi Magister Ilmu Kimia yang telah banyak memberikan ilmu yang sangat menunjang dalam memahami penelitian ini dan sebagai sumber informasi dalam penulisan tesis. 6. Bapak Jaswanto, dari Pusat Laboratorium Forensik Maber Polri atas waktu dan bimbingannya dalam penelitian tugas akhir. 7. Ayahanda tercinta di surga, ibunda terkasih, kakak, dan adikku yang telah memberikan doa, semangat dan dukungan moril yang tiada terkira selama penelitian ini.

iv Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012

8. Teman-teman mahasiswa S2 atas bantuan, dan dorongan semangatnya. 9. Semua orang tercinta yang banyak memberikan dukungan dan doa kepada penulis. Tesis ini khusus penulis persembahkan kepada Almarhum Ayahanda Heri Suparto, yang telah memberikan kasih sayang yang tulus dan semua itu menjadi motivasi untuk penulis dalam menyelesaikan pendidikan di Universitas Indonesia. Penulis menyadari bahwa tesis ini masih jauh dari sempurna. Saran dan kritik sangat penulis harapkan. Semoga hasil penelitian ini dapat memberikan sumbangan yang bermanfaat bagi kita semua.

Depok, 22 Juni 2012 Penulis

v Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012


ABSTRAK

Nama Program Studi Judul

: Heroniaty : Magister Sains Ilmu Kimia : Sintesis Senyawa Dimer Katekin dari Ekstrak Teh Hijau Dengan Menggunakan Katalis Enzim Peroksidase dari Kulit Bawang Bombay (Allium cepa L.)

Penelitian ini bertujuan untuk meneliti aktivitas peroksidase yang berasal dari kulit bawang bombay (Allium cepa L) untuk dapat melakukan reaksi dimerisasi oksidatif dengan menggunakan substrat senyawa katekin dari ekstrak teh hijau. Sintesis senyawa dimer katekin yang dikatalis oleh peroksidase (EC 1.11.1.7) dari kulit bawang bombay, telah dilakukan dan menghasilkan suatu senyawa baru. Aktivitas peroksidase optimum terjadi pada pH 5 dan suhu 30 0C. Peroksidase merupakan enzim kelompok oksidoreduktase yang dapat mentransfer atom H dari senyawa fenolik sehingga menghasilkan radikal fenoksi. Dua radikal fenoksi yang bergabung melalui reaksi kopling oksidatif, menghasilkan senyawa dimer. Senyawa yang terbentuk diidentifikasikan dengan instrumen GC-MS. Pada radikal fenolik katekin, terjadi kopling pada posisi C-4’ dan C-8” yang membentuk senyawa 4’- 8” dikatekin. Senyawa hasil reaksi dan substrat asalnya dibandingkan aktifitas antioksidannya dengan menggunakan metode radical scavenger DPPH sehingga diketahui IC50 masing-masing sebesar katekin : dimer katekin = 60,248 : 58,928.

Kata kunci:

Peroksidase, Katekin, Reaksi Kopling Oksidatif, Aktivitas Antioksidan

vii Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012

ABSTRACT

Name Study Program Title

: Heroniaty : Magister of Chemistry Science : Synthesis of Catechin Dimer from Green Tea Extract using Peroxidase as Catalist from Onion (Allium cepa L.)

This study, aims to examine the activity of peroxidase from skin of onion (Allium cepa L) to be able to perform oxidative dimerization reaction with the substrate catechin compounds from green tea extract. Synthesis of catechin dimer which catalized by peroxidase (EC 1.11.1.7) from onion skins have been carried out and produce a compound of reaction. Optimum activity of peroxidase occurs at pH 5 and temperature 30 0C. Peroxidase is an oxidoreductase group that can transfer hidrogen from phenolic compound to produce phenoxy radicals. Two phenoxy radicals are joined through the oxidative coupling reaction, resulting a dimer compound. Compound formed were identified by GCMS instrument. In a catechin phenolic radical, coupling occurs at position C-4 'and C-8 "which form the compound 4'-8" dicatechin. Compounds of reaction and native substrate were identified antioxidant activity by using DPPH radical scavenger that is known IC50 respectively by catechins: catechin dimer = 60.248: 58.928. Keywords: peroxidase, catechin, oxidative coupling reaction, antioxidant activity

viii Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012

DAFTAR ISI Halaman HALAMAN JUDUL ................................................................................. HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS..................................... LEMBAR PEGESAHAN ......................................................................... KATA PENGANTAR ............................................................................... LEMBAR PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH .............. ABSTRAK ................................................................................................. DAFTAR ISI .............................................................................................. DAFTAR GAMBAR ................................................................................. DAFTAR TABEL...................................................................................... BAB I: PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang ................................................................................ 1.2 Perumusan Masalah.......................................................................... 1.3 Tujuan Penelitian.............................................................................. 1.4 Hipotesis ........................................................................................... 1.5 Ruang Lingkup ................................................................................. 1.6 Manfaat Penelitian............................................................................ 1.7 Batasan Penelitian ............................................................................ BAB II: TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Teh ................................................................................................... 2.2 Macam-Macam Teh ........................................................................ 2.3 Komponen Teh ................................................................................ 2.4 Antioksidaan Pada Teh Hijau ......................................................... 2.5 Katekin ............................................................................................ 2.6 Bawang Bombay ............................................................................. 2.7 Kandungan Bawang Bombay .......................................................... 2.2 Peroksidase ...................................................................................... 2.3 Reaksi Kopling Oksidatif ................................................................ 2.4 Antioksidan ..................................................................................... BAB III: METODE PENELITIAN 3.1 Alat dan bahan ................................................................................. 3.1.1 Alat yang digunakan ............................................................ 3.1.2 Bahan yang digunakan ........................................................ 3.2 Metode Kerja ................................................................................... 3.2.1 Preparasi Larutan ................................................................. 3.2.2 Isolasi Enzim Peroksidase dari Kulit Bawang Bombay................................................................................ 3.2.3 Pemurnian Enzim Peroksidase dengan Ammonium Sulfat.................................................................................... 3.2.4 Karakterisasi Enzim Peroksidase ........................................

ix Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012

i ii iii iv vi vii ix xi xiii 1 2 2 3 3 3 4

5 5 8 9 10 12 13 15 19 22

24 24 24 24 24 26 27 28

3.2.5 Penentuan Aktivitas Peroksidase ......................................... 3.2.6 Penentuan Kadar Protein Enzim Dengan Metode Lowry .................................................................................. 3.2.7 Reaksi Dimerisasi Katekin Menggunakan Enzim Peroksidase .......................................................................... 3.2.8 Uji KLT dan Pemisahan Komponen Hasil Reaksi .............. 3.2.9 Uji Aktivitas Antioksidan Dengan Metode DPPH ..............

30 31 31

BAB IV: HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Isolasi dan Pemurnian Enzim Peroksidase ...................................... 4.2 Karakterisasi Enzim Peroksidase .................................................... 4.3 Uji Aktivitas Enzim dan Penentuan Kadar Protein ......................... 4.4 Sintesis Senyawa Dimer Katekin .................................................... 4.5 Uji Aktivitas Antioksidan dengan Menggunakan DPPH ................

33 35 36 39 49

BAB V: KESIMPULAN DAN SARAN 5.1 Kesimpulan ..................................................................................... 5.2 Saran ................................................................................................

54 54

DAFTAR PUSTAKA ................................................................................

55

x Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012

28 29

DAFTAR GAMBAR

Halaman Gambar 2.1

Komponen Teh ..................................................................

8

Gambar 2.2

Struktur Katekin ................................................................

11

Gambar 2.3

Siklus Katalitik Enzim Peroksidase yang Mengandung Heme ........................................................... 18

Gambar 2.4

Reaksi Kopling Oksidatif Fenolik ..................................... 19

Gambar 2.5

Resonansi radikal senyawa katekin ................................... 20

Gambar 2.6

Kemungkinan Dimer katekin yang Terbentuk .................. 21

Gambar 4.1

Enzim kasar (a) dan enzim fraksi III hasil pemurnian (b) .................................................................... 34

Gambar 4.2

Grafik Penentuan pH optimum (atas) dan grafik penentuan suhu optimum (bawah) ......................... 35

Gambar 4.3

Pembentukan Kuinonimina ............................................... 36

Gambar 4.4

Uji aktivitas enzim (a) kadar protein (b) .......................... 38

Gambar 4.5

Kurva Larutan Standar BSA ............................................. 38

Gambar 4.6

Senyawa katekin (kiri (a)) hasil reaksi antara katekin dengan enzim peroksidase (kanan (a)), Ekstrasi hasil reaksi (b)............................................................................ 39

Gambar 4.7

KLT senyawa katekin (a) dan KLT senyawa hasil reaksi (b)............................................................................ 40

Gambar 4.8

Instrumen GCMS Mabes Polri .......................................... 41

Gambar 4.9

Kromatogram GC senyawa katekin .................................. 42

Gambar 4.10

Spektrum massa senyawa dimer dari katekin ................... 43

Gambar 4.11

Pola Fragmentasi Senyawa Hasil Reaksi .......................... 43

Gambar 4.12

Kromatogram GC senyawa hasil reaksi ............................ 44

xi Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012

Gambar 4.13

Spektrum Massa hasil reaksi ............................................. 45

Gambar 4.14

Struktur 4’-8” Dikatekin ................................................... 46

Gambar 4.15

Pola Fragmentasi senyawa hasil reaksi. ............................ 47

Gambar 4.16

Pembentukan Radikal Katekin .......................................... 48

Gambar 4.17

Struktur dimer katekin ...................................................... 48

Gambar 4.18

Reaksi antioksidan dengan DPPH..................................... 49

Gambar 4.19

Hasil uji aktivitas antioksidan (a) dan (c) kontrol, (b) senyawa katekin, (d) senyawa hasil reaksi .................. 50

Gambar 4.20

Perubahan warna larutan pada reaksi radikal DPPH dengan antioksidan ................................................ 50

Gambar 4.21

Grafik Aktivitas Antioksidan Katekin .............................. 51

Gambar 4.22

Grafik Aktivitas Antioksidan Dimer Katekin .................. 51

Gambar 4.23

Grafik % inhibisi Katekin ................................................. 52

Gambar 4.24

% inhibisi Dimer Katekin ................................................. 52

Gambar 4.25

Nilai IC50 antara monomer dimer katekin (1) dan katekin (2) ......................................................................... 52

Gambar 4.25

Orientasi besarnya reduksi DPPH oleh gugus hidroksil............................................................................. 53

xii Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012

DAFTAR TABEL Halaman Tabel 2.1

Struktur Komponen Penyusun Teh ........................................ 9

Tabel 2.2

Komposisi Bermaca-Macam Katekin Pada Teh Hijau ......... 11

Tabel 2.3

Sifat Fisika dan Sifat Kimia Senyawa Katekin ..................... 12

Tabel 2.4

Kandungan Nutrisi Bawang Bombay .................................... 14

Tabel 2.5

Klasifikasi Enzim ................................................................... 16

Tabel 2.6

Rangkuman Kelompok dan Sub Kelompok Utama Enzim ..................................................................................... 17

Table 4.1

Aktivitas enzim peroksidase fraksi III ................................... 39

Tabel 4.2

Hasil Analisis GC-MS Katekin.............................................. 42

Tabel 4.3

Penbandingan antara spektrum massa hasil sintesis senyawa dimer katekin dengan hasil penelitian Angelyne Benavides dan Paolo Montoro ............................................... 45

xiii Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012

BAB I PENDAHULUAN

1.1

Latar Belakang Satu dari sekian banyak hasil riset kesehatan yang paling menarik

sekarang ini adalah bidang nutrien antioksidan. Berbagai perbincangan mengenai antioksidan, mau tidak mau harus menyertakan penjelasan mengenai oksidan termasuk didalamnya adalah radikal bebas. Radikal bebas acapkali dijumpai dalam bentuk oksigen yang reaktif. Molekul yang sangat reaktif ini, jika tidak dikendalikan dapat merusak tubuh dan berperan terhadap timbulnya berbagai penyakit. Secara sederhana antioksidan dinyatakan sebagai senyawa yang mampu menghambat

atau

mencegah

terjadinya

oksidasi.

Antioksidan

memiliki

kemampuan dalam memberikan elektron, mengikat dan mengakhiri reaksi berantai radikal bebas yang mematikan. Antioksidan yang dipakai kemudian didaur ulang oleh antioksidan lain untuk mencegahnya menjadi radikal bebas (bagi dirinya sendiri) atau tetap dalam bentuk tersebut tetapi dengan struktur yang tidak dapat merusak molekul lainnya. Salah satu antioksidan yang kini tengah mendapat perhatian yang sangat luas dalam berbagai penelitian adalah senyawa katekin dalam teh hijau. Berbagai penelitian memberikan bukti–bukti bahwa senyawa katekin yang banyak terdapat pada teh hijau bermanfaat dalam meningkatkan sistem imun. Teh hijau yang diminum secara teratur dalam kurun waktu tertentu dapat meningkatkan sistem imun tubuh dengan meningkatkan ketahanan limfosit dan respon proliferasi limfosit, daya fagositosis, dan sekresi IL-12 makrofag yang kemudian

menyebabkan

meningkatnya

sekresi

interferon-γ

yang

akan

mengaktifkan makrofag sehingga makrofag dapat membunuh kuman penyebab penyakit. Hasil ini bisa dilihat dari banyaknya gugus hidroksi (OH) yang dimiliki senyawa katekin. Gugus hidroksi ini dapat berfungsi sebagai antiradikal bebas

1

Universitas Indonesia


2

atau antioksidan. Semakin banyak gugus hidroksi suatu senyawa, maka kemampuannya sebagai senyawa antioksidan semakin baik. Efektivitas senyawa katekin sebagai antioksidan dapat ditingkatkan melalui proses dimerisasi oksidatif. Dimerisasi oksidatif dari beberapa senyawa fenolik banyak terjadi di alam dan mengarah pada pembentukan produk dimer, dimana proses biotransformasinya sendiri dikatalisis oleh enzim, yaitu enzim peroksidase. Enzim peroksidase dapat membentuk pertahanan terhadap oksidan atau radikal bebas di dalam tubuh dan mencegah kerusakan sel dengan cara mengkatalisa peroksida menjadi air dan oksigen. Karena kemampuannya inilah maka enzim ini disebut sebagai antioksidan. Pemanfaatan sampah dari tanaman seperti lobak, sawi, kentang dan bawang bombay ternyata dapat digunakan sebagai sumber enzim peroksidase yang dapat berkontribusi tidak hanya mengurangi limbah industri makanan tetapi juga dapat meningkatkan jumlah produk bernilai tinggi. Oleh karena itu, dalam penelitian ini digunakan bagian dari kulit bawang bombay yang dianggap sampah sebagai sumber dari enzim peroksidase untuk mengkatalisis reaksi dimerisasi senyawa katekin dari ekstrak teh hijau.

1.2

Perumusan Masalah Penggunaan senyawa fenolik saat ini yang cukup besar dalam bidang

industri membuat banyak penelitian yang ditujukan untuk mensintesis senyawa fenolik. Proses sintesis senyawa fenolik ini dilakukan dengan menggunakan reaksi kopling oksidatif dengan bantuan enzim peroksidase yang berasal dari ekstrak bawang bombay. Pada penelitian perumusan masalah yang dapat diambil dalam penelitian ini adalah sintesis senyawa dimer katekin dengan menggunakan katalis enzim peroksidase yang berasal dari kulit bawang bombay dan meneliti aktivitas antioksidannya dari senyawa dimer katekin yang dihasilkan.

1.3

Tujuan Penelitian

Tujuan penelitian ini adalah: 1. Mengisolasi enzim peroksidase dari bawang bombay yang akan digunakan sebagai katalis dalam reaksi dimerisasi senyawa katekin dari ekstrak teh hijau.

Universitas Indonesia Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012

3

2. Mengkarakterisasi enzim peroksidase yang diisolasi dari kulit bawang bombay 3. Mensintesis senyawa dimer katekin dari ekstrak teh hijau dengan menggunakan enzim peroksidase dari bawang bombay. 4. Mengetahui aktivitas antioksidan dari senyawa dimer katekin.

1.4

Hipotesis Hipotesis dari penelitian ini adalah dapat dibuat senyawa dimer katekin

dari ekstrak teh hijau dengan bantuan enzim peroksidase yang berasal dari kulit bawang bombay dan terdapat aktivitas antioksidan dari senyawa dimer yang dihasilkan tersebut.

1.5

Ruang Lingkup Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk menghasilkan senyawa dimer katekin dari

ekstrak teh hijau dengan menggunakan bantuan enzim peroksidase yang berasal dari kulit bawang bombay. Dan setelah senyawa dimer katekin terbentuk, senyawa

dimer

tersebut

akan

diteliti

aktivitas

antioksidannya

dengan

menggunakan metode radical scavenger DPPH. Dimerisasi dari senyawa katekin dengan bantuan enzim peroksidase ini dilakukan melalui reaksi kopling oksidatif. Pada reaksi kopling oksidatif, enzim peroksidase akan mengoksidasi senyawa katekin yang menyebabkan terbentuknya senyawa radikal katekin. Senyawa radikal ini dapat beresonansi dengan posisi orto atau para pada cincin aromatiknya dan selanjutnya akan bergabung dengan radikal yang lain membentuk senyawa dimer baru.

1.6

Manfaat Penelitian Penelitian ini diharapkan dapat memberikan sumbangan bagi dunia ilmu

pengetahuan, khususnya mengenai reaksi dimerisasi senyawa katekin dari ekstrak daun teh hijau dengan menggunakan katalis enzim peroksidase dari kulit bawang bombay dan senyawa ini memiliki aktivitas antioksidan yang dapat bermanfaat bagi kepentingan manusia.


4

1.7

Batasan Penelitian Penelitian ini terbatas pada studi pengaruh kondisi reaksi (temperatur dan

pH) terhadap mekanisme pembentukan dimer katekin dan menyimpulkan mekanisme reaksinya dan juga efek antioksidannya.


BAB II TINJAUAN PUSTAKA

2.1

Teh Di zaman dahulu, genus Camellia dibedakan menjadi beberapa spesies teh

yaitu sinensis, assamica, irrawadiensiesis. Menurut Graham HN (1984); Van Steenis CGGJ (1987) dan Tjitrosoepomo (1989), tanaman teh Camellia sinensis diklasifikasikan sebagai berikut (Tuminah, 2004).

Divisi

: Spermatophyte (tumbuhan biji)

Sub divisi

: Angiospermae (tumbuhan biji terbuka)

Kelas

: Dicotylydoneae (tumbuhan biji belah)

Sub Kelas

: Dialypetalae

Ordo (bangsa)

: Guttiferales (Clusiales)

Famili (suku)

: Camelliaceae (Tehaceae)

Genus (marga)

: Camellia

Spesies (Jenis)

: Camellia sinensis

2.2

Macam-Macam Teh Teh dikelompokan berdasarkan cara pengolahan. Daun teh Camellia

sinensis segera layu dan mengalami oksidasi kalau tidak segera dikeringkan setelah dipetik. Proses pengeringan membuat daun menjadi berwarna gelap,

5



6

karena terjadi pemecahan klorofil dan terlepasnya unsur tanin. Proses selanjutnya berupa pemanasan basah dengan uap panas agar kandungan air pada daun menguap dan proses oksidasi bisa dihentikan pada tahap yang sudah ditentukan. Pengolahan daun teh sering disebut sebagai "fermentasi" walaupun sebenarnya penggunaan istilah ini tidak tepat. Pemrosesan teh tidak menggunakan ragi dan tidak ada etanol yang dihasilkan seperti layaknya proses fermentasi yang sebenarnya. Pengolahan teh yang tidak benar memang bisa menyebabkan teh ditumbuhi jamur yang mengakibatkan terjadinya proses fermentasi. Teh yang sudah mengalami fermentasi dengan jamur harus dibuang, karena mengandung unsur racun dan unsur bersifat karsinogenik. Pengelompokan teh berdasarkan tingkat oksidasi: Teh putih Teh yang dibuat dari pucuk daun yang tidak mengalami proses oksidasi dan sewaktu belum dipetik dilindungi dari sinar matahari untuk menghalangi pembentukan klorofil. Teh putih diproduksi dalam jumlah lebih sedikit dibandingkan teh jenis lain sehingga harga menjadi lebih mahal. Teh putih kurang terkenal di luar Tiongkok, walaupun secara perlahan-lahan teh putih dalam kemasan teh celup juga mulai populer. Teh hijau Daun teh yang dijadikan teh hijau biasanya langsung diproses setelah dipetik. Setelah daun mengalami oksidasi dalam jumlah minimal, proses oksidasi dihentikan dengan pemanasan (cara tradisional Jepang dengan menggunakan uap atau cara tradisional Tiongkok dengan menggongseng di atas wajan panas). Teh yang sudah dikeringkan bisa dijual dalam bentuk lembaran daun teh atau digulung rapat berbentuk seperti bola-bola kecil (teh yang disebut gun powder). Oolong Proses oksidasi dihentikan di tengah-tengah antara teh hijau dan teh hitam yang biasanya memakan waktu 2-3 hari. Teh hitam atau teh merah Daun teh dibiarkan teroksidasi secara penuh sekitar 2 minggu hingga 1 bulan. Teh hitam merupakan jenis teh yang paling umum di Asia Selatan (India, Sri


7

Langka, Bangladesh) dan sebagian besar negara-negara di Afrika seperti: Kenya, Burundi, Rwanda, Malawi dan Zimbabwe. Terjemahan harafiah dari aksara hanzi untuk teh bahasa Tionghoa (红茶) atau (紅茶) dalam bahasa Jepang adalah "teh merah" karena air teh sebenarnya berwarna merah. Orang Barat menyebutnya sebagai "teh hitam" karena daun teh berwarna hitam. Di Afrika Selatan, "teh merah" adalah sebutan untuk teh rooibos yang termasuk golongan teh herbal. Teh hitam masih dibagi menjadi 2 jenis: Ortodoks (teh diolah dengan metode pengolahan tradisional) atau CTC (metode produksi teh Crush, Tear, Curl yang berkembang sejak tahun 1932). Teh hitam yang belum diramu (unblended) dikelompokkan berdasarkan asal perkebunan, tahun produksi, dan periode pemetikan (awal musim semi, pemetikan kedua, atau musim gugur). Teh jenis Ortodoks dan CTS masih dibagi-bagi lagi menurut kualitas daun pasca produksi sesuai standar Orange Pekoe. Pu-erh (Póu léi dalam bahasa Kantonis) Teh pu-erh terdiri dari dua jenis: "mentah" dan "matang." Teh pu-erh yang masih "mentah" bisa langsung digunakan untuk dibuat teh atau disimpan beberapa waktu hingga "matang". Selama penyimpanan, teh pu-erh mengalami oksidasi mikrobiologi tahap kedua. Teh pu-erh "matang" dibuat dari daun teh yang mengalami oksidasi secara artifisial supaya menyerupai rasa teh pu-erh "mentah" yang telah lama disimpan dan mengalami proses penuaan alami. Teh pu-erh "matang" dibuat dengan mengontrol kelembaban dan temperatur daun teh mirip dengan proses pengomposan. Teh pu-erh biasanya dijual dalam bentuk padat setelah dipres menjadi seperti batu bata, piring kecil atau mangkuk. Teh pu-erh dipres agar proses oksidasi tahap kedua bisa berjalan, karena teh pu-erh yang tidak dipres tidak akan mengalami proses pematangan. Semakin lama disimpan, aroma teh pu-erh menjadi semakin enak. Teh pu-erh yang masih "mentah" kadang-kadang disimpan sampai 30 tahun bahkan 50 tahun supaya matang. Pakar bidang teh dan penggemar teh belum menemui kesepakatan soal lama penyimpanan yang dianggap optimal. Penyimpanan selama 10 hingga 15 tahun sering dianggap cukup, walaupun teh pu-erh bisa saja diminum setelah disimpan kurang dari setahun. Minuman teh pu-erh dibuat dengan merebus daun teh


8

pu-erh di dalam air mendidih seringkali hingga lima menit. Orang Tibet mempunyai kebiasaan minum teh pu-erh yang dicampur dengan mentega dari lemak yak, gula dan garam.

2.3

Komponen Teh Teh mengandung komponen volatile sebanyak 404 macam dalam teh

hitam dan sekitar 230 macam dalam teh hijau. Komponen volatile tersebut berperan dalam memberikan cita rasa yang khas pada teh. Komponen aktif yang terkandung dalam teh, baik yang volatile maupun yang nonvolatile. Seperti yang terlihat pada gambar diata ini, komponen teh terdiri dari polifenol (termasuk katekin), kafein, asam amino, vitamin, flavonoid, polisakarida dan florin. Polifenol dan kafein merupakan komponen yang paling penting dari teh.

Gambar 2.1. Komponen teh


9

Tabel 2.1. Beberapa Struktur Komponen Teh

Komponen Penyusun Teh 1. Katekin

Rumus Struktur Komponen Teh

2. Kafein

3. Theanine

4. Saponin

2.4

Antioksidan Pada Teh Hijau Salah satu zat antioksidan non nutrien yang terkandung dalam teh, yaitu

katekin dapat menyimpan atau meningkatkan asam askorbat pada beberapa proses metabolisme. Studi epidemiologi menunjukkan bahwa konsumsi teh hijau


10

berbanding terbalik dengan kadar serum kolesterol total (TC) dan low density lipoprotein (LDL-C), tetapi tidak terhadap trigliserida (TG) dan high density lipoprotein (HDL-C). Antioksidan digunakan untuk mencegah kerusakan tingkat seluler yang akan mengakibatkan penyakit tertentu, khususnya kanker. Antioksidan dalam makanan juga digunakan untuk mencegah terjadinya proses oksidasi, seperti pada lemak. Potensi antioksidan dari polifenol teh hijau khususnya senyawa katekin secara langsung berhubungan dengan kombinasi cincin aromatis dan kelompok hidroksil yang membangun struktur katekin dan sebagai hasilnya adalah mengikat dan menetralkan radikal bebas oleh grup hidroksil. Sebagai tambahan, polifenol teh hijau mendorong aktivitas detoksifikasi komponen xenobiotika, dan juga dapat mengikat (kelator) ion logam seperti besi yang mana dapat mengakibatkan radikal bebas oksigen (Anonymous, 2000 dalam skripsi Imannulkhan, 2006). Menurut Ong dan Pocker (1992) dalam skripsi Imanulkhan (2006) menyatakan bahwa cara kerja flavonoid sebagai antioksidan sebagai berikut: 1. Sebagai “Scavenger” radikal bebas yang terbentuk baik selama persiapan bahan pangan atau radikal bebas yang dihasilkan proses metabolik tertentu di dalam substrat. 2. Sebagai kelator, flavonoid dapat membentuk kompleks dengan logam transisi seperti tembaga, dan mencegah kerusakan asam askorbat dengan besi sehingga dapat mencegah reaksi inisiasi radikal bebas. 3. Mencegah peroksida lemak melalui cara mengkombinasikan sifat kelator dan sifat antioksidan flavonol. “Quercetin” ditemukan efektif mengahambat ion besi.

2.5

Katekin Kunci utama dari khasiat teh pada komponen bioaktifnya, yaitu polifenol

yang secara optimal terkandung dalam daun teh yang masih muda dan utuh. Katekin merupakan senyawa polifenol utama pada teh sebesar 90% dari total kandungan polifenol (Anonymous, 2007).


11

Katekin adalah senyawa dominan dari polifenol teh hijau yang merupakan senyawa larut dalam air, tidak berwarna dan memberikan rasa pahit (Alamsyah, 2006). Katekin merupakan kerabat tanin terkondensasi yang juga sering disebut polifenol karena banyaknya gugus fungsi hidroksil yang dimilikinya. Katekin teh hijau tersusun sebagian besar atas senyawa-senyawa katekin (C), epikatekin (EC), galokatekin (GC), epigalokatekin (EGC), epikatekin galat (ECG),

dan

epigalokatekin galat (EGCG). Perbedaan dari beberapa jenis katekin dilihat dari jumlah gugus hidroksilnya (Robinson, 1995).

Tabel 2.2. Komposisi Bermacam-Macam Katekin Pada Daun Teh Hijau

No

Komponen

Kadar (%)

1

Katekin

1-2

2

Epikatekin

1-3

3

Epikatekin galat

3-6

4

Gallokatekin

1-3

5

Epigallokatekin

3-6

6

Epigallokatekin galat

7-13

Konsentrasi katekin sangat tergantung pada umur daun. Pucuk dan daun pertama paling kaya katekin galat. Kadar katekin bervariasi tergantung pada varietas tanaman tehnya. Sifat-sifat kimia dan fisik pucuk daun teh akan mempengaruhi perubahan katekin dalam pucuk daun tehnya.

Gambar 2.2. Struktur Katekin

Katekin bersifat asam lemah (pKa1=7,72 dan pKa2=10,22). Sukar larut dalam air dan sangat tidak stabil diudara terbuka. Bersifat mudah teroksidasi pada pH mendekati netral (pH 6,9). Katekin juga mudah terurai oleh cahaya dengan laju reaksi lebih besar pada pH rendah (3,45) dibanding pH 4,9 (Lucida, 2006).


12

Sifat fisikokimianya menjadi tantangan tersendiri dalam formulasi katekin sebagai bahan alam. Katekin biasanya disebut juga asam catechoat dengan rumus kimia C15H14O6, tidak berwarna, dan dalam keadaan murni sedikit tidak larut dalam air dingin tetapi sangat larut dalam air panas, larut dalam alkohol dan etil asetat, hampir tidak larut dalam kloroform, benzen dan eter. Selain itu, Katekin berbentuk kristal halus menyerupai jarum, larut dalam air mendidih dan alkohol dingin. Katekin dalam larutan asam asetat akan membentuk larutan yang bening, tetapi jika direaksikan dengan besi klorida (FeCl 3) akan membentuk cairan berwarna hijau. Katekin merupakan senyawa fenolik yang komplek (polifenol). Katekin memiliki dua atom karbon yang simetris yang membuatnya memiliki 4 isomer, yaitu (+) katekin, (-) katekin, (+) epikatekin dan (-) epikatekin. (+) katekin dan (-) epikatekin paling banyak terdapat di alam. Katekin dan epikatekin memiliki tiga jenis turunannya, yaitu katekin galat, galokatekin, galokatekin galat, epikatekin galat dan epigalokatekin galat.

Tabel 2.3. Sifat Fisika dan Sifat Kimia Senyawa Katekin

Sifat Fisika Warna: putih Melting point: 104-106 ºC Boiling point: 254 ºC Tekanan uap: 1 mm Hg pada 75 ºC Densitas uap:3,8 g/m3 Flash point: 137 ºC Eksplosion limit:1,79 %

Sifat Kimia Sensitif terhadap oksigen Sensitif terhadap cahaya (dapat mengalami perubahan warna apabila mengalami kontak langsung dengan udara terbuka) Substansi yang dihindari: unsur oksidasi, asam klorida, asam anhidrida, basa, dan asam nitrit. Larut dalam air hangat Stabil dalam kondisi agak asam atau netral ( pH optimum 4-8)

Sumber: Anonim, 2001, Micheal dan Irene, 1997 dan Alamsyah, 2006.

2.6

Bawang Bombay Istilah bawang bombay berasal ketika komoditas ini pertama kali dibawa

oleh pedagang-pedagang dari kota Bombay (sekarang disebut Mumbay), India, ke Indonesia. Bawang bombay (Allium cepa L.) termasuk herba biennial

yang


13

dibudidayakan sebagai tanaman annual (semusim), kecuali untuk produksi benih. Bawang bombay adalah sejenis bawang yang biasa digunakan dalam memasak makanan di Indonesia, tidak hanya digunakan sebagai hiasan tapi juga bagian dari masakan karena bentuknya yang besar dan tebal dagingnya. Klasifikasi bawang bombay adalah sebagai berikut:

Kingdom

: Plantae (Tumbuhan)

Subkingdom : Tracheobionta (Tumbuhan berpembuluh) Super Divisi : Spermatophyta (Menghasilkan biji) Divisi

: Magnoliophyta (Tumbuhan berbunga)

Kelas

: Liliopsida (berkeping satu / monokotil)

Sub Kelas

: Liliidae

Ordo

: Liliales

Famili

: Liliaceae (suku bawang-bawangan)

Genus

: Allium

Spesies

: Allium cepa L.

Bawang bombay atau bawang timur berada dalam satu garis keturunan dengan bawang merah (Allium cepa L). Perbedaannya tidak terlalu menyolok, kecuali bentuk dan bau atau aromanya. Ia memiliki umbi yang berlapis, yang terbentuk dari pangkal daun / lapisan-lapisan yang membesar dan bersatu dan selanjutnya membentuk batang yang berubah bentuk dan fungsi, membesar, dan menjadi umbi berlapis. Tanamannya sendiri memiliki akar serabut dengan daun berbentuk silinder berrongga.

2.7

Kandungan Nutrisi Bawang Bombay Di dalam bawang bombay terdapat kandungan allicin, asam amino,

kalsium, mangan, sodium, sulfur, vitamin C, vitamin E, minyak asiri, quercitin,


14

dan curcumin Berdasarkan penelitian, bahan-bahan yang dikandung oleh bawang bombay memiliki manfaat untuk menekan kadar kolesterol dalam darah, meningkatkan jumlah HDL (kolesterol baik) hingga 30%, memperbaiki penyempitan pembuluh darah dan hipertensi, meredakan pilek, meredakan sakit perut, menurunkan kadar gula dalam darah, mencegah kanker, mencegah pemecahan insulin di hati, merangsang produksi insulin oleh pankreas, dan menekan serangan osteoporosis. Zat utama dalam bawang Bombai, alicin, memberikan manfaat untuk menstabilkan tekanan darah, mengontrol gula darah, sebagai anti kolesterol dan anti peradangan. Yang dimaksud peradangan ini adalah suatu reaksi dari tubuh yang berlebihan karena rangsangan dari luar. Berikut ini disajikan tabel kandungan nutrisi dari bawang bombay.

Tabel 2.4. Kandungan Nutrisi Bawang Bombay (dalam 100 g bawang bombay)

Komponen Gizi

Jumlah

Komponen Gizi

Jumlah

Air

89,11 g

Tembaga

0,039 mg

Energi

40 kcal

Mangan

1,129 mg

Protein

1,1 g

Fluor

1,1 mg

Lemak

0,10 g

Selenium

0,15 g

Abu

0,35 g

Vitamin C

7,4 mg

Karbohidrat

7,34 g

Vitamin B1

0,046 mg

Serat

1,7 mg

Vitamin B2

0,116 mg

Gula Total

4,24 g

Vitamin B3

0,123 mg

Kalsium

23 mg

Vitamin B5

0,126 mg

Zat Besi

0,21 mg

Vitamin B6

0,120 mg

Magnesium

10 mg

Folat

19 mg

Fosfor

29 mg

Choline

6,1 mg

Kalium

146 mg

Vitamin E

0,02 mg

Natrium

4 mg

Vitamin K

0,4 mg

Seng

0,17 mg

Sumber: Direktorat Gizi Departemen Kesehatan RI (1992)


15

Pemanfaatan sampah dari tanaman seperti lobak, sawi, kentang dan bawang bombay ternyata dapat digunakan sebagai sumber enzim peroksidase yang dapat berkontribusi tidak hanya mengurangi limbah industri makanan tetapi juga dapat meningkatkan jumlah produk bernilai tinggi. Oleh karena itu, dalam penelitian ini digunakan bagian dari kulit bawang bombay yang dianggap sampah sebagai sumber dari enzim peroksidase.

2.8

Peroksidase Enzim atau biokatalisator adalah katalisator organik yang dihasilkan oleh

sel.Enzim sangat penting dalam kehidupan, karena semua reaksi metabolisme dikatalis oleh enzim. Jika tidak ada enzim, atau aktivitas enzim terganggu maka reaksi metabolisme sel akan terhambat hingga pertumbuhan sel juga terganggu. Reaksi-reaksi enzimatik dibutuhkan agar bakteri dapat memperoleh makanan/ nutrient dalam keadaan terlarut yang dapat diserap ke dalam sel, memperoleh energi Kimia yang digunakan untuk biosintesis, perkembangbiakan, pergerakan, dan lain-lain.Enzim bekerja dengan cara bereaksi dengan molekul substrat untuk menghasilkan senyawa intermediat melalui suatu reaksi kimia organik yang membutuhkan energi aktivasi lebih rendah, sehingga percepatan reaksi kimia terjadi karena reaksi kimia dengan energi aktivasi lebih tinggi membutuhkan waktu lebih lama. Meskipun senyawa katalis dapat berubah pada reaksi awal, pada reaksi akhir molekul katalis akan kembali ke bentuk semula. Sebagian besar enzim bekerja secara khas, yang artinya setiap jenis enzim hanya dapat bekerja pada satu macam senyawa atau reaksi kimia. Hal ini disebabkan perbedaan struktur kimia tiap enzim yang bersifat tetap. Kerja

enzim

dipengaruhi

oleh

beberapa

faktor,

terutama

adalah substrat, suhu, keasaman, kofaktor dan inhibitor. Tiap enzim memerlukan suhu dan pH (tingkat keasaman) optimum yang berbeda-beda karena enzim adalah protein, yang dapat mengalami perubahan bentuk jika suhu dan keasaman berubah. Di luar suhu atau pH yang sesuai, enzim tidak dapat bekerja secara optimal atau strukturnya akan mengalami kerusakan. Hal ini akan


16

menyebabkan enzim kehilangan fungsinya sama sekali. Kerja enzim juga dipengaruhi oleh molekul lain. Inhibitor adalah molekul yang menurunkan aktivitas enzim, sedangkan aktivator adalah yang meningkatkan aktivitas enzim. Banyak obat dan racun adalah inihibitor enzim. Penamaan enzim secara trivial, yaitu secara non –sistematik misalnya pepsin, tripsin, katalase tidak menerangkan sifat dan macam reaksi yang terjadi. Penamaan dan klasifikasi enzim secara sistematik telah ditentukan oleh suatu badan internasional bernama : Commission on Enzim of the international union of Biochemistry (CEIUB). Dalam sistim yang baru ini enzim dibagi menjadi sub bagian. Dalam beberapa hal tertentu, penanaman trivial masih dipakai, yaitu bila nama sistematiknya terlalu panjang. Klasifikasi enzim CEIUB meliputi nama golongan, nomor kode dan cara reaksi yang dikatalisernya dan tiap golongan utama terbagi menjadi kelompok– kelompok enzim berdasarkan gugus substrat yang diserangnya. Sistim CEIUB atau International Enzym Commision (IEC) adalah sebagai berikut.

Tabel 2.5. Klasifikasi Enzim


17

Tabel 2.6. Rangkuman Kelompok dan Sub Kelompok Utama Enzim

Peroksidase (EC 1.11.1.7) merupakan salah satu enzim yang tahan panas. Jenis reaksi yang dikatalis oleh peroksidase melibatkan hidrogen peroksida sebagai penerima, dan senyawa AH2 sebagai donor atom hidrogen, seperti ditunjukkan berikut ini:

Pada reaksi ini tidak ada oksigen molekul yang terbentuk. Kerja peroksidase dalam sayuran berguna untuk pendeteksian keefektifan pemutihan, sedangkan enzim tersebut dapat juga merusak sayuran sehingga mengakibatkan bau rasa yang menyimpang. Selain itu juga berguna dalam penentuan glukosa dalam suatu bahan pangan yang dikombinasikan dengan glukosa peroksidase. Kerja peroksidase dalam buah yaitu mengakibatkan terjadinya pencoklatan. Dalam buah terdapat peroksidase, itu sebabnya buah dan sayur yang dikupas atau dipotong akan berwarna kecoklatan jika didiamkan begitu saja. Dari hasil penelitian diketahui bahwa peroksidase memiliki peranan dalam proses lignifikasi, cross linking struktur protein pada dinding sel, katabolisme auksin, dan pertahanan diri terhadap pathogen. Peroksidase pada tumbuhan mengandung dua ion kalsium (Ca2+) yang sangat penting untuk stabilitas struktural dan stabilitas termal dari enzim agar


18

sama seperti aktivitas in vitro ketika dianalisis (Manu and Prasada Rao, 2009). Peroksidase secara luas digunakan pada laboratorium kesehatan dan industri sebagai aplikasi untuk konservasi lingkungan. Peroksidase merupakan enzim yang mengandung kofaktor “heme” pada sisi aktifnya, yang dapat mengkatalisis reaksi oksidasi dari berbagai senyawa organik maupun anorganik dengan adanya H2O2 sebagai akseptor elektron.

Gambar 2.3. Siklus Katalitik Enzim Peroksidase yang Mengandung Heme

Siklus katalitik dimulai dari bentuk Fe 3+. Molekul H2O2 berikatan koordinasi dengan ion Fe3+ dan sudut histidine menjadi perantara transfer proton sehingga kedua atom H ditempatkan pada atom O. Polarisasi ikatan secara serempak oleh rantai samping guanidinium menghasilkan pemutusan heterolitik ikatan O-O. Sebagian membentuk H2O dan sisanya terikat dengan Fe menghasilkan intermediet dengan bilangan oksidasi tinggi. Beberapa

peroksidase

seperti

Horse

Raddish

Peroxidase

(HRP)

mengalami keadaan inaktivasi permanen ketika H2O2 hadir secara berlebihan atau ketika produk akhir polimer berada pada sisi aktifnya yang menyebabkan


19

inaktivasi permanen yang disebabkan perubahan pada konfigurasi geometrisnya (Villalobos and Buchanan, 2002). 2.3

Reaksi Kopling Oksidatif Reaksi kopling oksidatif adalah suatu reaksi penggabungan antara dua

molekul fenol atau lebih melalui proses reaksi oksidasi. Penggabungan dari dua residu fenolat, dapat terjadi secara inetr dan intra molekuler dari dua radikal yang dibentuk melalui oksidasi elektron tunggal pada masing-masing senyawa fenol. Reaksi yang dikatalisis oleh peroksidase dengan adanya H2O2, menghasilkan produk radikal, dimana radikal tersebut akan mengalami penggabungan dengan senyawa lain yang memiliki radikal. Oleh karena itu, enzim peroksidase sering kali digunakan sebagai katalis pada reaksi polimerisasi dan reaksi kopling pada senyawa fenolik.

OH O

OH

OH

OH

OH

Ikatan eter

C-C linkage

C-C linkage

Gambar 2.4. Reaksi Kopling Oksidatif Fenolik


20

Hasil kopling radikal fenoksi ini dapat membentuk dimer fenol, baik pada posisi orto-orto, para-para, maupun orto-para. Selain itu, juga terdapat kemungkinan penggabungan O-para, O-orto, O-O, dan C-C. Reaksi yang dikatalis dengan menggunakan

peroksidase dengan

menggunakan H2O2 akan menghasilkan produk radikal dimana radikal tersebut akan mengalami penggabungan dengan senyawa lain yang memiliki radikal. Senyawa katekin dapat mengalami proses kopling oksidatif yang sama dengan senyawa fenolik.

Gambar 2.5. Resonansi radikal senyawa katekin


21

Dari kemungkinan resonansi radikal fenoksi katekin tersebut, maka dapat diduga kemungkinan-kemungkinan kopling oksidatif yang dapat terbentuk antara sesama radikal fenoksi katekin. Kemungkinan dimer yang terbentuk sebagai berikut: OH OH

OH OH HO

OH

O

O

OH

HO

OH

OH

5’-8” dimer katekin OH

OH

OH

OH HO

HO

O

HO

OH

O

OH

O OH

OH

OH

OH

HO

OH

2’-8” dimer katekin

Katekin

OH OH HO

O

OH

OH

HO

OH OH

O

HO

OH

4’-8” dimer katekin OH OH HO

O

OH OH OH

HO

O

OH

HO OH

4’-6” katekin dimer Gambar 2.6. Kemungkinan dimer katekin yang terbentuk


22

2.4

Antioksidan Antioksidan merupakan zat yang mampu memperlambat atau mencegah

proses oksidasi. Zat ini secara nyata mampu memperlambat atau menghambat oksidasi zat yang mudah teroksidasi meskipun dalam konsentrasi rendah. Antioksidan juga sesuai didefinisikan sebagai senyawa-senyawa yang melindungi sel dari efek berbahaya radikal bebas oksigen reaktif jika berkaitan dengan penyakit, radikal bebas ini dapat berasal dari metabolisme tubuh maupun faktor eksternal lainnya. Radikal bebas adalah spesies yang tidak stabil karena memiliki elektron yang tidak berpasangan dan mencari pasangan elektron dalam makromolekul biologi. Protein lipida dan DNA dari sel manusia yang sehat merupakan sumber pasangan elektron yang baik. Kondisi oksidasi dapat menyebabkan kerusakan protein dan DNA, kanker, penuaan, dan penyakit lainnya. Komponen kimia yang berperan sebagai antioksidan adalah senyawa golongan fenolik dan polifenolik. Senyawa-senyawa golongan tersebut banyak terdapat dialam, terutama pada tumbuh-tumbuhan, dan memiliki kemampuan untuk menangkap radikal bebas. Tipe radikal bebas turunan oksigen reaktif sangat signifikan dalam tubuh. Oksigen reaktif ini mencakup superoksida (O2•-), hidroksil (•OH), peroksil (ROO•), hidrogen peroksida (H2O2), oksigen singlet (1O2), oksida nitrit (NO•), peroksinitril (ONOO•) dan asam hipoklorit (HOCl). Sumber radikal bebas, bisa berupa sumber endogen maupun eksogen. Sumber endogenous berasal dari hasil metabolism tubuh. Hal ini berlangsung secara normal, dan tubuh memiliki enzim antioksidan alami yang dapat menangkalnya. Sedangkan sumber radikal bebas eksogen berasal dari luar system tubuh, diantaranya sinar UV dan zat kimia polutan. Keberadaan radikal bebas yang membahayakan ini dapat ditangkal oleh antioksidan. Antioksidan terbagi menjadi antioksidan enzim, vitamin, dan senyawa-senyawa fenolik. Antioksidan vitamin lebih popular sebagai antioksidan dibandingkan enzim. Antioksidan vitamin mencakup alfa tokoferol (vitamin E), beta karoten dan asam askorbat (vitamin C). Sedangkan senyawa fenolik merupakan antioksidan yang banyak terdapat pada teh, buah-buahan dan sayuran.


23

Aktivitas antioksidan fenolik tergantung pada struktur molekunya terutama gugus OH pada cincin aromatiknya.


BAB III METODE PENELITIAN

Penelitian ini terbagi menjadi empat tahap utama, yaitu isolasi enzim peroksidase dari kulit bawang bombay, karakterisasi enzim peroksidase, sintesis senyawa dimer katekin dengan menggunakan katalis enzim peroksidase dari kulit bawang bombay yang telah diisolasi dan uji aktivitas antioksidan dari senyawa dimer yang terbentuk.

3.1

Alat dan bahan

3.1.1

Alat yang digunakan Alat-alat gelas laboratorium, icebath & magnetic stirrer, sentrifuge, pH

universal, kertas saring, KLT, spektrofotometer, vortex, dan GC-MS.

3.1.2

Bahan yang digunakan Ekstrak teh hijau sebagai sumber senyawa katekin, kulit bawang bombay

sebagai sumber enzim peroksidase, (NH4)2SO4 padat, metanol, H2O2 30%, air bidestilasi, 4-aminoantipyrine, katekin, Na2CO3, NaOH, CuSO4.5H2O, K-Na tartarat, glisin, HCl, NaH2PO4, Na2HPO4, CMC, asam sitrat, sodium nitrat, pereaksi follin ciocalteau, bovin serum albumin (BSA), etil asetat, Na2SO4 anhidrat, HCl, FeCl3.6H2O, MgSO4, kertas kromatografi lapis tipis.

3.2

Metode Kerja

3.2.1

Preparasi Larutan

a. Pembuatan Larutan Buffer HCl pH 2 Larutan Stok A: 0,1 M larutan glisin (7,507 g glisin dilarutkan dalam 1 L aquades) Larutan Stok B: 0,1 M larutan HCl Untuk membuat larutan buffer HCl pH 2 maka campurkan 50,7 mL larutan stok A dengan 49,3 mL larutan stok B.

24



25

b. Pembuatan Larutan Buffer Sitrat pH 3, 4, dan 5 Larutan Stok A: 0.1 M larutan asam sitrat (21.01 gram asam sitrat dilarutkan dalam 1 L aquades) Larutan Stok B: 0.1 M larutan sodium sitrat atau natrium sitrat (29.41 gram natrium sitrat atau C6H5O7Na3.2H2O dilarutkan dalam 1 L aquades) Untuk membuat larutan buffer sitrat pH 3 maka campurkan 46,3 mL larutan stok A dengan 3,5 mL larutan stok B, lalu cukupkan volumenya dengan aquades hingga 100 mL Untuk membuat larutan buffer sitrat pH 4 maka campurkan 33 mL larutan stok A dengan 17 mL larutan stok B, lalu cukupkan volumenya dengan aquades hingga 100 mL Untuk membuat larutan buffer sitrat pH 5 maka campurkan 20,5 mL larutan stok A dengan 29,5 mL larutan stok B, lalu cukupkan volumenya dengan aquades hingga 100 mL

c. Pembuatan Larutan Buffer Fosfat pH 6, 7, dan 8 Larutan Stok A: 0,2 M larutan monobasic sodium phosphate atau NaH2PO4 (2,78 gram NaH2PO4 dilarutkan dalam 100 mL aquades). Larutan Stok B: 0,1 M larutan dibasic sodium phosphate atau Na2HPO4 (5,365 gram Na2HPO4. 7H2O atau 7,17 gram Na2HPO4. 12H2O dilarutkan dalam 100 mL aquades). Untuk membuat larutan buffer fosfat pH 6 maka campurkan 87,7 mL larutan stok A dengan 12,3 mL larutan stok B, lalu cukupkan volumenya dengan aquades hingga 200 mL. Untuk membuat larutan buffer fosfat pH 7 maka campurkan 39 mL larutan stok A dengan 61 mL larutan stok B, lalu cukupkan volumenya dengan aquades hingga 200 mL. Untuk membuat larutan buffer fosfat pH 8 maka campurkan 5,3 mL larutan stok A dengan 94,7 mL larutan stok B, lalu cukupkan volumenya dengan aquades hingga 200 mL.


26

d. Pembuatan Larutan H2O2 mM Dalam Buffer Fosfat pH 7 Sebanyak 1 mL H2O2 30% dilarutkan dengan air bidestilasi hingga volumenya 100 mL. Sebanyak 1 mL larutan ini dilarutkan dalam buffer fosfat 0,2 M pH 7 hingga volumenya mencapai 50 mL.

e. Pembuatan Larutan 4-aminoantipirin 2,5 mM Dalam Fenol 0,17 M Melarutkan 810 mg fenol ke dalam 40 mL air bidestilasi. Ke dalam larutan tersebut ditambahkan sebanyak 25 mg 4-aminoantipirin dan dilarutkan dengan air bidestilasi hingga volumenya 50 mL.

f. Pembuatan Reagen Lowry Lowry A: 2 g Na2CO3 dalam 100 mL NaOH 0,1 N Lowry B: 0,25 g CuSO4.5.H2O 50 mL larutan K-Na tartrat 1% Lowry C: Campuran 50 mL larutan A dan 1 mL larutan B Lowry D: pereaksi follin ciocalteu 1 N

g. Pembuatan Standar Bouvine Serum Albumin Larutan standar BSA (0,0625; 0,1250; 0,2500; 0,5000; 0,7500; 1,000 mg/mL), 0,2 g bouvine serum albumin dilarutkan dala aquades hingga 100 mL, dari larutan ini kemudian diencerkan untuk membuat larutan konsentrasi diatas.

h. Pembuatan Larutan DPPH 0,1 mM Sebanyak 10 g DPPH dilarutkan dalam 25 mL aquades sehingga diperoleh konsentrasi DPPH 1mM. Lalu larutan tersebut diencerkan menjadi 0,4 mM dengan penambahan aquades.

3.2.2

Isolasi Enzim Peroksidasi dari Kulit Bawang Bombay Sebanyak 350 g kulit bawang bombay dihancurkan dengan blender

menggunakan larutan buffer fosfat pH 7 dalam keadaan dingin (0-50C). Homogentat kemudian disaring dengan kain katun, filtrat yang diperoleh kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 3400 rpm selama 6 menit untuk


27

memisahkan molekul enzim ekstrak kasar dari debris (serpihan sel). Supernatan yang diperoleh dipisahkan dari endapannya.

3.2.3

Pemurnian Enzim Peroksidase Dengan Ammonium Sulfat Ekstrak enzim kasar (supernatan) yang diperoleh dimurnikan dengan

penambahan garam (NH4)2SO4 dengan tingkat kejenuhan berturut-turut 0-30%, 30-50%, dan 50-70% (b/v). Ammonium sulfat yang ditambahkan ke dalam larutan dengan tingkat kejenuhan S1-S2% dihitung dengan menggunakan rumus:

Supernatan dalam beaker glass yang dilengkapi dengan ice salt bath ditambahkan ammonium sulfat 0-30% sedikit demi sedikit pada suhu 0-50C, lalu diaduk selama 2 jam. Kemudian larutan dibiarkan mengendap selama 1 malam di lemari pendingin. Selanjutnya larutan disentrifugasi pada 3400 rpm selama 6 menit pada suhu ruang. Hal yang sama juga dilakukan untuk penambahan (NH4)2SO4 30-50% dan 50-70%. Pada penambahan garam dengan kejenuhan 50-70% endapan yang diperoleh melalui sentrifugasi kemudian ditentukan aktivitas enzim dan kadar proteinnya.


28

Bagan 3.1.

Isolasi dan Pemurnian Enzim Peroksidasi dari Kulit bawang Bombay Kulit bawang bombay diblender dengan larutan buffer fosfat pH 7 disaring

Filtrat

Endapan

Sentrifugasi 3400 rpm 6 menit

Endapan

Supernatan

+ (NH4)2SO4 0-30%, Sentrifugasi 3400 rpm 6 menit

Supernatan

Endapan + (NH4)2SO4 30-50%, Sentrifugasi 3400 rpm 6 menit

Endapan

Supernatan

+ (NH4)2SO4 50-70%, Sentrifugasi 3400 rpm 6 menit

Endapan

3.2.4

Supernatan

Karakterisasi Enzim Peroksidase 3.2.4.1 Penentuan pH optimum Penentuan pH optimum enzim dilakukan dengan reaksi enzim pada berbagai pH mulai dari 2-8 (selang 1) dengan substrat CMC dalam buffer fosfat 0,2 M, diinkubasi pada suhu 390C selama 45 menit.

3.2.4.2 Penentuan Suhu Optimum Enzim Penentuan suhu optimum enzim dilakukan dengan menguji aktivitas enzim pada berbagai suhu percobaan mulai dari 10-600C (selang 100C) pada pH optimum selama 45 menit.

3.2.5

Penentuan Aktivitas Peroksidase

Substrat yang digunakan:


29

 Larutan H2O2 0,0017 M dalam buffer K-fosfat 0,2 M pH 7,0:  Larutan 4-aminoantipyrine 0,0025 M dalam katekin 0,17 M. Langkah kerja: 1,4 mL larutan 4-aminoantipyrine/katekin dan 1,5 mL H2O2 1,7 mM dicampur ke dalam tabung reaksi. Kemudian ditambahkan 0,1 mL enzim dan dibiarkan bereaksi selama 1 menit. Reaksi dihentikan setelah 1 menit dengan memanaskan larutan tersebut ke dalam penangas air mendidih (100 0C) selama 3 menit. Sebagai kontrol digunakan larutan blanko, dimana larutan enzim diganti dengan aquabides. Pengukuran aktivitas dilakukan dengan spektrofotometri pada λ 510 nm berdasarkan pembentukan produk dari substrat yang teroksidasi. Aktivitas spesifik enzim dihitung dengan menggunakan persamaan Wortington Manual Enzyme yang dimodifikasi:

3.2.6

Penentuan Kadar Protein Enzim Dengan Metode Lowry

Pereaksi Lowry: A. 2 g Na2CO3 dalam 100 mL NaOH 0,1 N B. 0,25 g CuSO4.5H2O dalam 50 mL K-Na Tartarat 1% C. Campuran 50 mL larutan A dan 1 mL larutan B D. Pereaksi follin ciocalteau 1N Langkah kerja: Sebanyak 1 mL larutan enzim (protein) dicampurkan dengan 5 mL pereaksi C, kemudian diaduk hingga merata lalu dibiarkan selama 10 menit. Selanjutnya ke dalam campuran di atas ditambahkan 0,5 mL pereaksi D, lalu diaduk kembali hingga merata dan dibiarkan selama 30 menit. Serapannya diukur pada spektrofotometer pada panjang gelombang 750 nm. Sebagai larutan standar digunakan BSA dengan variasi konsentrasi mulai dari 0,0625 mg/mL hingga 1,00 mg/mL. pada pengukuran blanko, larutan enzim diganti dengan air.


30

3.2.7

Reaksi Dimerisasi Katekin Menggunakan Enzim Peroksidase Ke dalam gelas kimk ukuran 100 mL, dimasukkan enzim peroksidase (15

mg dalam 2 mL buffer fosfat 0,2 M pH 5,0) dan 6,7 mmol H2O2 30%, kemudian ditambahkan 13,4 mmol katekin perlahan-lahan dengan menggunakan pipet tetes dan sambil dikontrol suhunya (tidak melebihi 37 0C). Reaksi berlangsung melalui proses pengadukan dengan magnetic stirrer pada suhu ruang, sampai semua katekin tercampur. Keberhasilan reaksi diamati secara kualitatif dengan terjadinya perubahan warna campuran reaksi. Kemudian campuran hasil reaksi diekstraksi dengan menggunakan pelarut etil asetat. Didapat fasa organik (etil asetat) dan fasa air. Fasa air dipisahkan, dan sisa air yang masih terdapat pada fasa organik dihilangkan dengan cara menambahkan Na 2SO4 anhidrat. Ekstrak yang diperoleh kemudian dipekatkan dengan cara menguapkan pelarutnya. Untuk memeriksa produk reaksi yang terbentuk, selanjutnya dilakukan pengecekan dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT), dimana sebagai pembanding digunakan larutan katekin dalam metanol. Bila hasil samping (by product) tidak terlalu banyak, dapat langsung dilakukan rekristalisasi dengan dua pelarut yang berbeda kepolarannya. Tetapi jika hasil samping cukup banyak, maka perlu dilakukan pemurnian melalui kromatografi kolom. Selanjutnya kristal murni hasil reaksi, ditimbang. Bagan 3.2.

Reaksi Dimerisasi Katekin Menggunakan Enzim Peroksidase Enzim Peroksidase + Buffer Fosfat pH 5 + H2O2 30% Aduk 60 menit pada suhu ruang

+ Katekin

Campuran Hasil Reaksi Ekstraksi dengan etil asetat Fase air

Fase organik + Na2SO4 lalu dipekatkan Cairan kental Uji KLT Isolat Identifikasi


31

3.2.8

Uji KLT dan Pemisahan komponen Hasil Reaksi Untuk mengetahui jumlah komponen yang terdapat di dalam senyawa

hasil reaksi, maka dilakukan uji KLT. Uji KLT dilakukan dengan menggunakan pelarut etil asetat : metanol dengan perbandingan yang paling optimum yaitu 1:3. Hasil uji KLT digunakan untuk mengidentifikasikan secara kualitatif berapa banyak komponen yang terdapat didalam senyawa hasil reaksi.

3.2.9

Uji Aktivitas Antioksidan Dengan Metode Radical Scavenger dengan

Menggunakan Larutan DPPH dalam Metanol Disiapkan sampel yang masing-masing terdiri dari larutan katekin, dan senyawa hasil reaksi dengan konsentrasi 10 ppm, 20 ppm, 30 ppm, 40 ppm, 50 ppm, 60 ppm, dan 70 ppm dalam metanol, dan juga disiapkan larutan DPPH 0,4 mM dalam metanol. Pertama kali diukur absorbansi larutan DPPH, sebagai kontrol (A0) dengan menggunakan spektrometer pada panjang gelombang 515 nm. Sebanyak 2 mL larutan sampel 10 ppm ditambahkan 2 mL larutan DPPH kemudian diaduk segera hingga bereaksi sempurna, dan diukur absorbansinya (Ab).

Pengukuran diulangi dengan menggunakan larutan sampel dengan

konsentrasi berbeda. Aktivitas antioksidan diukur sebagai penurunan serapan campuran larutan DPPH dan sampel, akibat adanya aktivitas antioksidan dari sampel. Aktivitas antioksidan dapat dihitung berdasarkan % inhibisi dengan rumus:

Berdasarkan % inhibisi yang didapat dari perhitungan dapat ditentukan nilai IC 50 dari sampel dengan menggunakan grafik % inhibisi dengan konsentrasi.


32

Bagan 3.3.

Uji Aktivitas Antioksidan Dengan Metode Radical Scavenger dengan Menggunakan Larutan DPPH dalam Metanol

4 mL DPPH 0,4 mM dalam metanol (kontrol) 2 mL DPPH 0,4 mM + 2 mL sampel 10 ppm dalam metanol (kontrol) 2 mL DPPH 0,4 mM + 2 mL sampel 20 ppm dalam metanol

2 mL DPPH 0,4 mM + 2 mL sampel 30 ppm dalam metanol

Diukur absorbansinya pada maks 515 nm

2 mL DPPH 0,4 mM + 2 mL sampel 40 ppm dalam metanol 2 mL DPPH 0,4 mM + 2 mL sampel 50 ppm dalam metanol 2 mL DPPH 0,4 mM + 2 mL sampel 60 ppm dalam metanol 2 mL DPPH 0,4 mM + 2 mL sampel 70 ppm dalam metanol


BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

Pada penelitian ini, dilakukan sintesis suatu senyawa dimer katekin dengan menggunakan katalis peroksidase dari kulit bawang bombay. Setelah peroksidase berhasil diisolasi, kemudian dilakukan pemurnian dengan menggunakan ammonium sulfat pada berbagai tingkat konsentrasi. Kemudian dilakukan karakterisasi enzim meliputi pH optimum, dan suhu optimum. Untuk mengetahui aktivitas dari peroksidase yang diperoleh maka dilakukan uji aktivitas dan kadar protein dari enzim. Sedangkan penentuan kadar protein pada peroksidase dilakukan dengan menggunakan metode Lowry. Peroksidase yang diperoleh kemudian digunakan untuk mensintesis senyawa dimer katekin dari daun teh. Pada senyawa hasil reaksi kemudian dilakukan uji kromatigrafi lapis tipis (KLT), untuk mengetahui kehadiran senyawa baru yang terbentuk. Untuk mengetahui struktur senyawa yang terbentuk maka dilakukan pengujian dengan menggunakan Gas chromatography – mass spectrometry (GC-MS). Hasil reaksi yang diperoleh, kemudian diuji aktivitas antioksidannya dengan menggunakan metode radical scavenger menggunakan larutan DPPH dalam metanol.

4.1

Isolasi Peroksidase dari Bawang Bombay Pada penelitian ini digunakan bagian kulit dari bawang bombay sebagai

sumber enzim karena aktivitas peroksidase tertinggi ditemukan pada bagian kulit. Peroksidase tergolong ke dalam jenis enzim intraseluler sehingga untuk melepaskan enzim diperlukan pemecahan dinding sel, salah satunya dengan alat homogenizer seperti blender. Kulit bawang bombay dihaluskan dengan blender dalam buffer Na-fosfat pH 7,0 pada suhu 40C. pada kondisi tersebut akan diperoleh aktivitas enzim peroksidase yang optimum. Selain itu, suhu dingin juga akan mencegah terjadinya degradasi proteolitik.

33



34

Setelah dinding sel dipecahkan, maka enzim yang dihasilkan harus dipisahkan dari sel penghasilnya dan senyawa-senyawa lain seperti enzim–enzim lain, protein, metabolit, dan lain-lain. Pemisahan ini dilakukan dengan sentrifugasi yang akan menghasilkan filtrat sebagai enzim kasar dan endapan. Pemisahan dengan sentrifugasi akan berlangsung lebih cepat dan lebih mudah tercapai salah satunya dengan radius putaran yang besar. Ekstrak enzim kasar selanjutnya dimurnikan dengan menggunakan metode pengendapan dengan garam (NH4)2SO4 pada berbagai tingkat konsentrasi. Prinsip pengendapan ini didasarkan pada perbedaan kelarutan dari protein-protein. Protein-protein yang mempunyai berat molekul besar mempunyai tingkat kelarutan yang rendah sehingga akan mengendap terlebih dahulu, lalu diikuti dengan protein-protein yang memiliki berat molekul lebih kecil. Dengan memvariasikan tingkat konsentrasi (NH4)2SO4, diharapkan protein-protein dapat dipisahkan dalam berbagai kelompok (fraksi) yang memiliki berat molekul sama ataupun sangat berdekatan. Penelitian ini menggunakan enzim fraksi III yang dihasilkan dari pemurnian dengan menggunakan (NH4)2SO4 50 – 70% untuk mengkatalisis reaksi karena diperoleh aktivitas peroksidase tertinggi pada fraksi ketiga. Volume enzim fraksi III yang diperoleh pada penelitian ini sebanyak 5 mL yang seluruhnya akan digunakan untuk mengkatalisis reaksi.

(a)

(b)

Gambar 4.1 Enzim kasar (a) dan enzim fraksi III hasil pemurnian (b)


35

4.2

Karakterisasi Peroksidase Karakterisasi peroksidase meliputi penentuan pH dan suhu optimum.

Pengujian pada berbagai pH dilakukan pada pH 2 sampai dengan pH 8 dengan selang 1 unit menggunakan buffer glisin HCl (pH 2), buffer sitrat (pH 3-5) dan buffer fosfat (pH 6-8). Suhu yang digunakan adalah 10˚C sampai dengan 60˚C dengan selang 10˚C dalam substrat CMC 1% dalam buffer pH optimum dan inkubasi selama 30 menit.

0.012

Absorbansi (nm)

0.01 0.008 0.006 0.004 0.002 0 0

2

4

6

8

10

pH

0.004 Absorbansi (nm)

0.0035 0.003 0.0025 0.002 0.0015 0.001 0.0005 0 0

10

20

30 Suhu

40

50

60

70

(0C)

Gambar 4.2 Grafik Penentuan pH optimum (atas) dan grafik penentuan suhu optimum (bawah)


36

4.3

Uji Aktivitas Enzim dan Penentuan Kadar Protein Enzim hasil karakterisasi yang telah didapat kemudian ditentukan

aktivitasnya berdasarkan reaksi oksidasi aminoantipyrine dan fenol dengan H 2O2. Reaksi yang terjadi adalah:

Fenol 4-aminoantipirin

Kuinonimina

Gambar 4.3 Pembentukan Kuinonimina

Adapun tahapan reaksi pembentukan kuinonimina adalah sebagai berikut: Inisiasi

Propagasi


37

Terminasi

Dalam reaksi ini, 4-amoniantipyrine dan fenol bertindak sebagai substrat donor H yang akan membentuk senyawa berwarna merah, quinonimina. Senyawa ini mempunyai serapan maksimum pada λ = 510 nm. Aktivitas enzim ditentukan dengan mengukur absorbansi pada λ = 510 nm. Satu unit enzim dihasilkan dari dekomposisi 1 µmol H2O2 per menit pada 300C dan pH = 5,0 pada kondisi spesifik. Uji aktivitas enzim merupakan cara untuk mengetahui apakah enzim yang sudah diisolasi dan dimurnikan merupakan enzim peroksidase atau bukan serta memiliki aktivitas atau tidak. Senyawa quinonimina berwarna merah yang terbentuk menandakan bahwa enzim peroksidase bekerja mengkatalis reaksi redoks. Penggunaan substrat 4-aminoantipyrine dan fenol didasarkan pada kemudahan kedua senyawa ini dalam mendonorkan H dan menghasilkan produk berwarna merah yang intensif yang dapat dideteksi secara spektroskopi pada daerah visible. Uji aktivitas ini pun dapat menggunakan substrat lain yang mudah menghasilkan produk berwarna yang intensif, seperti substrat guaikol. Penentuan kadar protein pada peroksidase dilakukan dengan menggunakan metode Lowry. Metode ini memiliki tingkat sensitivitas yang tinggi karena menghasilkan warna yang intensif. Dalam metode ini, terjadi reaksi biuret yaitu ion Cu2+ dari CuSO4 bereaksi dengan ikatan peptide protein membentuk kompleks dan mengalami reduksi menjadi Cu1+. Kemudian pereaksi Follin direduksi oleh gugus tirosin dan triptofan. Reaksi Biuret ini tidak terlalu sensitive karena tidak


38

menghasilkan warna yang jelas, namun saat ditambahkan Follin terbentuk warna ungu muda dan lebih sensitive dibanding reaksi Biuret saja.

(a)

(b)

Gambar 4.4 Uji aktivitas enzim (a) kadar protein (b)

Sebagai larutan standar, digunakan larutan BSA dengan berbagai konsentrasi sehingga menghasilkan kurva standar. Pada uji aktivitas enzim diperoleh absorbansi pada λ 510 nm = 1,411 dan pada uji kadar protein diperoleh absorbansi pada λ 750 nm = 1,278. Dengan menggunakan persamaan yang diperoleh dari grafik regresi, maka akan diperoleh nilai kadar protein enzim sebesar 0,756 mg/mL dengan perhitungan sebagai berikut:

mg/mL

Absorbansi (nm)

2 y = 1.5942x + 0.0721 R² = 0.9871

1.5 1 0.5 0 0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

Konsentrasi (mg/mL) Gambar 4.5. Kurva Larutan Standar BSA


39

Setelah menentukan kadar protein pada enzim, maka dapat dihitung aktivitas spesifik enzim dengan menggunakan persamaan Wortington Manual Enzyme yang dimodifikasi:

Table 4.1 Aktivitas enzim peroksidase fraksi III

A510

A750

Kadar Protein (mg/mL)

Aktivitas Spesifik (U/mg)

1,411

1,278

0,756

0,284

4.4

Pembentukan Senyawa Dimer Katekin Senyawa katekin yang digunakan dalam penelitian ini berasal dari ekstrak

tek hijau yang berwujud cairan kental berwarna coklat tua. Katekin adalah senyawa fenolik yang mampu menyumbangkan proton dari gugus fenolnya jika direaksikan dengan larutan H2O2, yang bertindak sebagai akseptor proton. Enzim peroksidase yang digunakan dalam penelitian ini berfungsi sebagai biokatalisator. Enzim peroksidase pada kulit bawang bombay memiliki aktivitas optimum pada pH 5 dan suhu 300C, sehingga pada penelitian ini enzim peroksidase dilarutkan dalam larutan buffer pH 5. Terjadinya reaksi kopling oksidatif antara katekin dengan enzim peroksidase dapat dilihat secara visual dengan adanya perubahan warna, yang semula berwarna coklat tua, berubah menjadi hijau tua, hal ini menandakan adanya senyawa baru yang terbentuk. Seperti terlihat pada gambar dibawah ini.

(a)

(b)

Gambar 4.6. Senyawa katekin (kiri (a)) hasil reaksi antara katekin dengan enzim peroksidase (kanan (a)), Ekstrasi hasil reaksi (b).


40

Enzim peroksidase dapat mengkatalisa reaksi karena adanya gugus heme protoforfirin IX besi yang bereaksi dengan H2O2 menghasilkan intermediet radikal hidroksi yang berikatan dengan enzim. Radikal ini akan berikatan dengan senyawa katekin dan menghasilkan radikal fenoksi yang dapat mengalami terminasi kopling. Reaksi dihentikan setelah 30 menit, kemudian larutan diekstraksi dengan etil asetat sebanyak 3 kali masing-masing 25 mL. Hasil ekstraksi yang diperoleh berwarna hijau kekuningan. Ekstrak ini kemudian dipekatkan (diuapkan) sampai kering dan diperoleh berat endapan campuran produk sebesar (0,2170 g). Untuk mengetahui jumlah senyawa yang terdapat pada hasil reaksi antara katekin dengan enzim peroksidase, maka dilakukan uji KLT. KLT dilakukan sebagai analisis kualitatif dari suatu sampel dengan memisahkan komponenkomponen sampel berdasarkan perbedaan kepolaran. Umumnya fasa diam (silica gel) pada KLT bersifat polar dan senyawa polar akan melekat lebih kuat pada lempeng daripada senyawa nonpolar akibat interaksi tarik-menarik dipol-dipol. Senyawa nonpolar kurang melekat erat pada fasa diam polar sehingga bergerak maju lebih jauh ke atas lempeng. Jadi, jarak tempuh ke atas lempeng merupakan gambaran dari polaritas suatu senyawa. Peningkatan polaritas pelarut akan menurunkan ineraksi senyawa dengan fasa diam sehingga memungkinkan senyawa dalam fasa gerak bergerak lebih jauh pada lempeng. Uji KLT dilakukan dengan mengunakan pengembang etil asetat:metanol = 1:3.

Katekin (monomer) Hasil reaksi

Gambar 4.7. KLT senyawa katekin dan KLT senyawa hasil reaksi


41

Dari hasil pengujian, diperoleh 3 spot yang terdiri dari spot 1 dengan Rf = 0,91 (spot ini sama dengan spot katekin, berarti menunjukkan bahwa masih ada katekin yang belum bereaksi), spot 2 dengan Rf = 0,60 (berukuran lebih kecil daripada spot ketiga, berarti menunjukkan hasil samping reaks, by product). Spot 3 dengan Rf = 0,45 (berukuran lebih besar dibandingkan dengan spot kedua, berarti menunjukkan hasil reaksi utama, main product). Pada senyawa substrat (katekin) dan senyawa hasil reaksi dilakukan uji dengan menggunakan instrument GC-MS untuk melihat berat molekul senyawa yang dihasilkan. GC-MS adalah metode yang menggabungkan kromatografi gas (pemisahan senyawa) dan spektrometer massa untuk mengidentifikasi zat-zat yang terdapat dalam sampel dan menentukan berat molekulnya serta pola fragmentasinya untuk mengetahui struktur molekul suatu senyawa. Saat sampel diinjeksikan dalam injector GC, kemudian sampel diubah menjadi gas pada suhu tinggi. Gas yang terbentuk dibawa oleh fase gerak, gas nitrogen melewati kolom kapiler yang berisi fasa diam. Zat yang memiliki afinitas lebih rendah terhadap fasa diamnyanakan keluar terlebih dahulu sehingga waktu retensinya rendah. Sebaliknya zat yang memiliki afinitas lebih besar akan keluar lebih lama sehingga waktu retensinya tinggi.

Gambar 4.8. Instrumen GC-MS Mabes Polri


42

Setelah zat terpisah dalam GC, dalam bentuk aliran gas akan masuk kedalam separator jet, yang akan mempercepat momentum molekul analit yang berat, sedangkan atom nitrogen yang ringan sebagai fasa gerak akan dibelokkan oleh pompa vakum. Molekul analit akan masuk dan ditembak oleh sumber ion dalam spektrometer massa, sehingga terbentuk spektrum massa berbagai puncak dalam bentuk fragmen-fragmen. Setelah pemisahan selesai, rekonstruksi spektrum massa untuk tiap puncak dapat ditampilkan pada komputer. Senyawa katekin dari ekstrak teh hijau dianalisis dengan GC-MS, menghasilkan kromatogram sebagai berikut:

Gambar 4.9. Kromatogram GC senyawa katekin

Dilihat dari kromatogram di atas, terlihat adanya 2 puncak yang memiliki waktu retensi 8, 499 menit dengan luas area 73,34%, dan 8,697 menit dengan luas area 26,66%, seperti disajikan pada Tabel 4.2 dibawah ini:

Tabel 4.2. Hasil Analisis GC-MS senyawa katekin

Waktu Retensi (menit)

Luas Area (%)

m/z

8, 499

73,34

280,9

8,697

26,66

290,0


43

Dari data GC, selanjutnya dilakukan analisis lebih lanjut dengan menggunakan Mass Spectroscopy (MS) hasil analisis GC-MS diketahui pada waktu retensi 8,697 menit terdapat senyawa dengan berat molekul 290 yang diduga merupakan senyawa katekin dengan rumus molekul C15H14O6, seperti terlihat pada Gambar 4.10 di bawah ini:

Gambar 4.10. Spektrum massa senyawa katekin

Dari data ini dapat terlihat bahwa terdapat senyawa dengan merat molekul 290 dengan pola fragmentasi seperti ditunjukkan pada Gambar 4.11 di bawah ini: OH HO

O

OH

H+

O

OH

OH

HO

CH2

OH OH

HO

m/z = 290

OH

m/z = 139

m/z = 152

Gambar 4.11. Fragmentasi senyawa katekin


44

Setelah diperoleh senyawa katekin dari ekstrak teh hijau, maka dilakukan reaksi dimer senyawa katekin. Pada senyawa hasil reaksi dilakukan analisis dengan menggunakan instrumen yang sama yaitu GC-MS. Hasil analisis ditunjukkan oleh Gambar 4.12 di bawah ini:

Gambar 4.12. Kromatogram GC senyawa hasil reaksi

Dari kromatogram di atas dapat dilihat bahwa ada satu puncak tertinggi dengan waktu retensi 13,878 menit. Pada waktu retensi tersebut diketahui terdapat senyawa dengan berat molekul 578,1. Senyawa ini diduga sebagai senyawa dimer katekin. Data m/z sebesar 578,1 ini menunjukkan terbentuknya kopling dari 2 molekul katekin yang masing-masing kehilangan 2 atom H, dengan perhitungan: 2 x (Mr katekin) – 2H = (2 x 290) – 2 = 578. Gambar spektrum massa hasil reaksi dapat dilihat pada Gambar 4.13 di bawah ini:


45

Gambar 4.13. Spektrum massa hasil reaksi

Spektrum massa yang dihasilkan dibandingkan dengan penelitian yang dilakukan oleh Angelyne Benavides dan Paola Montoro tentang senyawa turunan katekin. Ternyata terdapat persamaan antara nilai m/z dari senyawa hasil reaksi yang terbentuk dengan m/z senyawa hasil penelitian Angelyne Benavides dan Paola Montoro, seperti ditunjukkan pada Tabel 4.3 berikut ini:

Tabel 4.3 Perbandingan antara spektum massa hasil sintesis senyawa dimer katekin dengan hasil penelitian Angelyne Benavides dan Paola Montoro

Spektrum massa senyawa hasil reaksi (m/z) 247,0 288,9 300,8 302,9 408,9 426,8 438,9 452,9 560,8 578,1

Spektrum masaa penelitian Angelyne Benavides dan Paola Montoro (m/z) 247,0 288,9 300,8 302,9 408,9 426,8 438,9 452,9 560,8 578,1


46

Dalam penelitian Angelyne Benavides dan Paola Montoro, senyawa tersebut diidentifikasikan sebagai 4’-8” dikatekin. OH OH HO

O

OH HO

OH OH OH

O

HO

OH

Gambar 4.14 Struktur 4’-8” dikatekin

Dalam sebuah spektrometer massa, sampel dalam keadaan gas dibombardir dengan elektron berenergi tinggi. Tumbukan ini menyebabkan lepasnya sebuah elektron n (lone pair electron) dari molekul suatu sampel dan terbentuknya suatu ion organik. Ion organik yang dihasilkan ini tidak stabil dan pecah menjadi fragmen kecil, dapat terbentuk radikal bebas ataupun ion-ion lain. Dari peak untuk radikal ion (biasanya terletak paling kanan dalam spektrum) ini, bobot molekul suatu senyawa dapat ditentukan. Setelah ionisasi awal, ion molekul akan mengalami fragmentasi, dimana radikal-radikal bebas atau molekul netral kecil dilepaskan dari ion molekul tersebut. Sebuah ion molekul tidak pecah secara acak, melainkan cenderung membentuk

fragmen-fragmen

yang

sestabil

mungkin.

Adapun

pola

fragmentasinya dapat dilihat pada Gambar 4.15 dibawah ini:


47

OH OH HO

O

OH

OH

HO

OH OH

O

m/z = 126

_

_

HO

m/z = 170

OH

m/z = 578 _

m/z = 152 m/z = 408 m/z = 452 _

OH

m/z = 426

HO

O

OH OH

OH

m/z = 120 m/z = 332

m/z = 290

Gambar 4.15 Pola Fragmentasi Senyawa Hasil Reaksi

Pembentukan dimer katekin pada penelitian ini didasarkan pada reaksi radikal, dimana digunakan enzim peroksidase dan H2O2. Peroksidase membentuk suatu komplek dengan hidrogen peroksida yang kemudian dipecah menjadi dua radikal hidroksi. Atom hidrogen pada gugus –OH senyawa katekin akan diambil oleh radikal hidroksi, sehingga dihasilkan radikal katekin yang distabilkan oleh resonansi. Dimer yang mungkin terbentuk dari dua radikal katekin terjadi pada atom C-4’ dan C-8”, karena pada posisi ini senyawa mempunyai hambatan ruang yang lebih kecil sehingga didapat struktur yang stabil. Mekanisme yang terjadi:


48

Gambar 4.16. Pembentukan radikal katekin dan resonansi radikalnya.

Gambar 4.17. Struktur dimer katekin


49

4.5

Uji Aktivitas Antioksidan Senyawa Katekin dan Dimer Katekin Senyawa fenolik merupakan salah satu sumber antioksidan yang

menghambat reaksi radikal dengan cara bereaksi dengan radikal bebas tersebut, memberikan hidrogen, dan membentuk radikal fenolik yang tidak reaktif dan terstabilkan dengan adanya resonansi. Senyawa katekin dan senyawa yang dihasilkan pada reaksi ini merupakan senyawa yang mengandung gugus fenolik yang akan diuji aktivitas bioaktifnya sebagai antioksidan. Metode yang dipakai adalah metode radical scavenger dengan menggunakan DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil). Metode DPPH dipilih karena sedernaha, cepat dan peka serta hanya memerlukan sedikit sampel. Radikal DPPH secara luas digunakan untuk mengukur kemampuan suatu senyawa yang dapat bertindak sebagai penangkap radikal bebas atau donor hidrogen. Radikal yang ditangkap oleh senyawa antioksidan melalui donor elektron membentuk DPPH yang tereduksi, sehingga terjadi perubahan warna larutan dari ungu menjadi kuning yang dapat diukur absorbansinya pada panjang gelombang 515 nm.

Gambar 4.18. Reaksi antioksidan dengan DPPH


50

(a)

(b)

(c)

(d)

Gambar 4.19. Hasil uji aktivitas antioksidan (a) dan (c) kontrol, (b) senyawa katekin, (d) senyawa hasil reaksi

DPPH memberikan warna ungu karena adanya radikal bebas pada atom N yang dapat membentuk diazo, dimana absorbansi maksimumnya adalah 515 nm. Adanya penambahan sampel yang diduga berperan sebagai antioksidan dapat menangkap radikal bebas DPPH. Penangkapan ini menurunkan terjadinya pembentukan diazo, sehingga penurunan warna warna ungu selaras dengan kemampuan aktivitas sebagai radical scavenger. Proses perubahan warna dari ungu menjadi kuning ini diukur pada panjang gelombang 515 nm.

Gambar 4.20. Perubahan warna larutan pada reaksi radikal DPPH dengan antioksidan (Witt, Lalk, Hager, dan Voigt, 2010)

Pengujian terhadap aktivitas antioksidan ini dilakukan dengan variasi konsentrasi 10 ppm, 20 ppm, 30 ppm, 40 ppm, 50 ppm, 60 ppm dan 70 ppm untuk senyawa katekin dan senyawa hasil reaksi.


Absorbansi (515 nm)

51

1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0

20

40

60

80

Konsentrasi (ppm)

Absorbansi (515 nm)

Gambar 4.21. Grafik Aktivitas Antioksidan Katekin

0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0

20

40

60

80

Konsentrasi (ppm) Gambar 4.22. Grafik Aktivitas Antioksidan Senyawa Hasil Reaksi

Semakin besar konsentrasi senyawa yang ditambahkan ke dalam larutan DPPH, semakin besar penurunan intensitas warna larutan DPPH. Hal ini menandakan semakin tinggi kemampuan senyawa sebagai radical scavenger. Dari grafik di atas terlihat aktivitas antioksidan dari senyawa hasil reaksi katekin hampir sama dibandingkan dengan substrat awalnya, katekin. Dapat dikatakan bahwa pembentukan senyawa baru dengan cara dimerisasi dengan katalis enzim peroksidase dapat memiliki aktivitas antioksidan yang sama baiknya dengan substrat awal. Dari data pengukuran pada menit ke 30, maka dapat dihitung % inhibisi untuk masing-masing konsentrasi sampel. Aktivitas radical scavenger ditentukan berdasarkan persamaan:


52

60

%inhibisi

50

40 y = 0.4953x + 20.159 R² = 0.9708

30 20 10 0 0

20

40

60

80

Konsentrasi (ppm)

% inhibisi

Gambar 4.23. Grafik % inhibisi Katekin

60.000 50.000 40.000 30.000 20.000 10.000 0.000

y = 0.4265x + 24.867 R² = 0.9787

0

20

40

60

80

Konsentrasi (ppm) Gambar 4.24. % inhibisi Senyawa Hasil Reaksi

Dari hasil perhitungan, diperoleh kemampuan menginhibisi (IC50) senyawa hasil reaksi sebesar 58,928 ppm dan katekin sebesar 60,248 ppm. Perbandingan IC50 dapat dilihat pada Gambar 4.25 dibawah ini:

60.5 60 59.5 59

58.5 58 Katekin

Hasil Reaksi

Gambar 4.25. Nilai IC50 antara katekin dan senyawa hasil reaksi


53

Gambar di atas menunjukkan bahwa senyawa hasil reaksi mempunyai aktivitas antioksidan yang lebih tinggi dibandingkan dengan monomernya (katekin) yang ditandai dengan nilai IC50 yang lebih kecil. Reduksi DPPH menjadi DPPH-H disebabkan adanya donor hidrogen dari senyawa katekin atau dimer produk. Oleh karena itu dapat diprediksikan bahwa didalam katekin maupun senyawa hasil reaksi terdapat senyawa yang berperan dalam aktivitas antioksidan yaitu golongan flavonoid dengan jumlah gugus hidroksil cukup sedikit. Jadi, semakin banyak gugus hidroksil bebas yang dapat menyumbangkan hidrogen maka semakin banyak juga reduksi yang dapat dilakukan terhadap DPPH.

Gambar 4.26. Orientasi besarnya reduksi DPPH oleh gugus hidroksil.


BAB V KESIMPULAN DAN SARAN

5.1.

Kesimpulan Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan dapat disimpulkan

bahwa: 1. Bawang bombay (Allium cepa L.) mengandung enzim peroksidase dengan aktivitas spesifik 0,284 unit/mg protein. 2. Senyawa dimer dari katekin berhasil disintesis dengan katalis enzim peroksidase dari kulit bawang bombay dengan kondisi optimum peroksidase pada pH 5 dan suhu 300C. 3. Reaksi antara katekin dan H2O2 yang dikatalisis oleh peroksidase menghasilkan produk berupa padatan hijau tua dengan berat 0,2170 gram. 4. Produk dimer yang terbentuk merupakan senyawa 4’-8” dikatekin, melalui mekanisme reaksi kopling oksidatif radikal katekin pada posisi C-4’ dan C-8”. 5. Senyawa 4’-8” dikatekin mempunyai aktivitas antioksidan yang lebih besar dibandingkan dengan katekin dengan perbandingan IC 50 adalah 60,248 : 58,928. (katekin : dimer katekin).

5.2.

Saran Berdasarkan hasil dan kesimpulan yang diperoleh, maka disarankan

sebagai berikut: 1. Belum maksimalnya hasil yang diperoleh dari sintesis senyawa dimer katekin yang telah dilakukan, maka disarankan untuk melakukan penelitian lanjutan dengan menggunakan optimasi terhadap perbandingan substrat, H2O2, dan enzim yang dipakai, serta optimasi kondisi reaksi yang berlangsung. 2. Perlu dilakukan pemurnian kristal yang diperoleh dari hasil reaksi sehingga bisa dianalisis dengan menggunakan alat yang lain.

54



DAFTAR PUSTAKA

Anonymous,

2007.

Mengenal

http://www.sosro.com/indonesia/it_Mengenal

Tanaman Teh.htm.

Teh,

diakses

pada

tanggal 11 April 2012. Alamsyah,

2007.

Antioksidan

dan

Peranannya

Bagi

Kesehatan.

http://www.beritaiptek.com/zberita-beritaiptek-2007-01-23-Antioksidandan-peranannya-Bagi-Kesehatan.shtml. Diakses tanggal 27 Feb 2012. Benadives, Angelyne et al. 2006. Catechin derivatives in Jatropha macrantha stems: Characterisation and LC/ESI/MS/MS quali–quantitative analysis. Dipartimento di Scienze Farmaceutiche, Facolt´a di Farmacia, Universit´a di Salerno, Via Ponte don Melillo, 84084 Fisciano, SA, Italy 40 (2006) 639–647. D’ Archivio M., Filesi C., Di Benedetto R., Gargiulo R., Giovanni C and Masella R. (2007). Polyphenols, dietary sources and bioavailability. Ann Istituto Superior di Sanita 43(4), 348-361. Gunawijaya, F. A. 1999. Efek Pemberian Katekin Teh Hijau Pada Pertumbuhan Tumor Kelenjar Susu Mencit Strain Gr. (J Kedokteran Trisakti 1999; (2): 61-7). Imanulkhan, 2006. Karakterisasi “Edibel Film” Beraktivitas dari Pati Ganyong (Canna Edulis Kerr) dan Ekstrak Teh Hijau (Camellia Sinensis). Skripsi Mahasiswa Jurusan Teknologi Hasil Pertanian, Fakultas Teknologi Pertanian, Universitas Brawijaya. Koleva, I.I., van Beek, T.A., Linssen, J.P.H., de Groot, A., dan Evstatieva, L.N., 2002, Screening of Plant Extracts For Antioxidant Activity: A Comparative Study on Three Testing Methods, Phytochemical Analysis, 13, 8-17.

55



56

Lindiyah. (2008). Reaksi Dimerisasi Eugenol dan Isoeugenol dengan bantuan Enzim Peroksidase dari Horseradish. FMIPA-UI: Depok. Lucida, H. 2006. Determination of the ionization constants and the stability of catechin from gambir (uncaria gambir (Hunter) Roxb), ASOPMS 12 International Conference, Padang November 2006. Puspitasari, Agriana. 2006. Pengaruh Pemberian Katekin Teh Hijau Terhadap Jumlah Sel Mononuklear Darah Tepi Pada Manusia, Karya Tulis Ilmiah. Semarang: Universitas Diponegoro. Robinson, T., 1995. Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi, Penerbit ITB, Bandung, hal 57 dan 211. Rohdiana, Dadan. 2005. Aktivitas Antioksidan Beberapa Klon Teh Unggulan. Bandung: Jurusan Teknologi Pangan Universitas Pasundan Sonia, Mousounni. 2011. Crude Peroxidase From Onion Solid Waste as a Tool For Organic Synthesis. Part II: Oxidative Dimerization-Cyclization of Methyl p-Coumarate, Methyl Caffeat and Methyl Ferulate. Greece: Elsevier. Tuminah, S., 2004. [(Camellia sinensis O.K. var. Assamica (Mast)] Sebagai Salah Satu Sumber Antioksidan, Pusat Penelitian dan Pengembangan Pemberantasan Penyakit, Balai Penelitian dan Pengembangan Kesehatan, Departemen Kesehatan RI, Jakarta, Cermin Dunia Kedokteran No. 144, 2004. Urquiaga I. and Leighton F. (2000). Plant Polyphenol Antioxidants and Oxidative Stress Biological Research. 33(2), 55-64. Villalobos D. A., and Buchanan I. D. (2002). Removal of Aqueous phenol by Arthomyces Ramosus Peroxidase. Journal of environmental Engineering Science I, 65-73.


57

Witt, S., Lalk, M., Hager, C., dan Voigt, B., 2010, DPPH-Test: Determination of Scavenger

Properties,

http://www.baltic-analytics.de/index.

php?id=7&L=1, diakses tanggal 14 April 2012. Zaveri, Nurulain. 2005. Green tea and its polyphenolic catechins: Medicinal uses in cancer and noncancer applications. USA: Science direct.


Lampiran 1 Tabel hasil pengukuran kadar protein dengan metode Lowry Konsentrasi BSA (mg/ml) Absorbansi pada λ 750 nm 0.0625 0.1280 0.1250 0.2600 0.2500 0.4590 0.5000 0.9500 0.7500 1.3450 1.0000 1.5750 Sampel 1.2780

Kurva Larutan Standar BSA Absorbansi (nm)

2.0000 y = 1.5942x + 0.0721 R² = 0.9871

1.5000 1.0000 0.5000

0.0000 0.0000 0.2000 0.4000 0.6000 0.8000 1.0000 1.2000 Konsentrasi (mg/mL)

Perhitungan aktivitas spesifik enzim: dari persamaan regresi linier di atas, maka:

Aktivitas spesifik enzim: ⁄

=

6,58

=

,

,

⁄

,

⁄

= 0,756 mg/mL =

1,411 = 0,284 6,58 0,756


⁄

Lampiran 2 Absorbansi kontrol yaitu DPPH 0,4 mM = 1,074 Absorbansi No Konsentrasi (ppm) Katekin 1 2 1 10 0.845 0.836 2 20 0.725 0.728 3 30 0.686 0.677 4 40 0.647 0.625 5 50 0.589 0.590 6 60 0.539 0.547 7 70 0.485 0.508

Absorbansi Hasil Reaksi 1 2 0.734 0.751 0.712 0.714 0.695 0.676 0.642 0.633 0.582 0.587 0.533 0.541 0.453 0.479

Absorbansi

Aktivitas Antioksidan Katekin 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0

20

40

60

80

Konsentrasi (ppm)

Aktivitas Antioksidan Senyawa Hasil Reaksi Absorbansi

0.8 0.6 0.4 0.2 0 0

20

40

60

80

Konsentrasi (ppm)

0.8405 0.7265 0.6815 0.636 0.5895 0.543 0.4965


Lampiran 3 Contoh Perhitungan % inhibisi dan tabel % inhibisi Katekin 10 ppm: =

,

,

Tabel % inhibisi Katekin Konsentrasi (ppm) 10 20 30 40 50 60 70

,

100 % = 21,788 % Katekin (%) 21.788 32.356 36.546 40.782 45.112 49.441 53.771

60 50 %inhibisi

%

40

y = 0.4953x + 20.159 R² = 0.9708

30 20 10 0 0

20

40

60

80

Tabel % inhibisi Senyawa Hasil Reaksi Konsentrasi (ppm) Katekin (%) 10 30.866 20 33.613 30 36.173 40 40.642 50 45.577 60 50.000 70 56.611

% inhibisi

Konsentrasi (ppm)

60.000 50.000 40.000 30.000 20.000 10.000 0.000

y = 0.4265x + 24.867 R² = 0.9787

0

20

40

60

Konsentrasi (ppm)

Penentuan nilai IC50 antara Katekin dan Senyawa Hasil Reaksi 60.5 Sampel IC50 Katekin 60.248 60 Hasil Reaksi 58.928 59.5 59 58.5 58 Katekin


Hasil Reaksi

80

Abundance TIC: CATECHIN SIM.D\ data.ms 900000 800000 700000 600000 500000 400000 300000 200000 100000 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00 7.50 8.00 8.50 9.00 9.50 10.00 10.50 Time--> Abundance

# 1 1 8 2 7 4 : C a t e c h in 1 3 9 .0 9000

8000

7000

6000

5000

4000

3000

2000

2 9 0 .0 6 9 .0

1000

3 9 .0

1 0 7 .0

1 6 7 .0 1 8 7 .0 2 0 8 .0

8 8 .0

0 40

60

80

100

120

140

160

180

200

220

m / z -->


2 4 5 .0 240

2 7 1 .0 260

280

Abundanc e

T IC: CA T E CH IN S CA N .D \ d a ta .m s 1 3 .8 7 8 600000 550000 500000 450000 400000 350000 300000 250000 200000

6 .0 0

8 .0 0

1 0 .0 0

1 2 .0 0

1 4 .0 0

1 6 .0 0

1 8 .0 0

T im e -->


2 0 .0 0

2 2 .0 0

SINTESIS SENYAWA DIMER KATEKIN DARI EKSTRAK TEH HIJAU DENGAN MENGGUNAKAN KATALIS ENZIM PEROKSIDASE DARI KULIT BAWANG BOMBAY (ALLIUM CEPA L

Recommend Documents