SINTESIS GEL KITOSAN-HIALURONAT
PAJRI SAMSI NASUTION
DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2010
ABSTRAK PAJRI SAMSI NASUTION. Sintesis Gel Kitosan-Hialuronat. Dibimbing oleh GUSTINI SYAHBIRIN dan BUDI ARIFIN. Kitosan sebagai polikation dapat membentuk kompleks makromolekul dengan polianion seperti hialuronat. Namun, film yang dihasilkan campuran ini sifatnya labil dalam kondisi asam dan basa sehingga perlu dimodifikasi untuk memperbaiki sifat reologinya. Modifikasi yang dilakukan dalam penelitian ini adalah penambahan glutaraldehida sebagai penaut-silang kitosan. Sifat reologi gel yang diukur meliputi kekuatan, titik pecah, ketegaran, pembengkakan, dan pengerutan. Larutan hialuronat dibuat dengan konsentrasi 0; 0,5; dan 1,0% dalam asam laktat 18% (v/v). Kitosan lalu ditambahkan ke dalamnya hingga konsentrasinya 2,0%. Setelah itu, ditambahkan glutaraldehida 1,0; 2,0; dan 3,0% (v/v) sampai terbentuk gel. Kitosan yang digunakan memiliki bobot molekul 7,53 × 105 g mol-1 dengan kadar air 11,56% dan derajat deasetilasi 88,48%. Hialuronat yang digunakan memiliki bobot molekul 6,33 × 105 g mol-1 dengan kadar air 13,11%. Gel kitosan-hialuronat dengan sifat reologi optimum diperoleh dari konsentrasi kitosan 2,0%, hialuronat 0,3% dan glutaraldehida 1,4% (v/v) yang memberikan kekuatan, titik pecah, ketegaran, pembengkakan, dan pengerutan berturut-turut 678,4 g cm-2; 1,294 cm; 5,033 g cm-1; 2,634 g; dan 0,148 g.
ABSTRACT PAJRI SAMSI NASUTION. Synthesis of Chitosan-Hyaluronate Gel. Supervised by GUSTINI SYAHBIRIN and BUDI ARIFIN. As a polycation, chitosan can form macromolecular complexes with polianions such as hyaluronate. However, the film produced are unstable in acidic and basic conditions that modification is needed to improve the rheological properties. Modification was done in this study by adding
glutaraldehyde as chitosan crosslinker.The rheological properties measured ware gel strength, break point, rigidity, swelling, and shrinking. The hyaluronate solutions ware made with consentrations of 0; 0.5; and 1.0% in lactic acid 18% (v/v). Chitosan was then added into each solution until its concentration reached 2.0%. Afterwards, glutaraldehyde 1.0; 2.0; and 3.0% (v/v) was added, to form gel. Chitosan used in this reseach had molecular wight of 7.53 × 105 g mol-1 with moisture content of 11.56% and deacetylation of degree 88.48%. Hyaluronate had molecular wight of 6.33 × 105 g mol-1 with moisture content of 13.11%. The optimum chitosan-hyaluronate gel was at 2.0% of chitosan, 0.3 % of hyaluronate and 1.4% (v/v) of glutaraldehyde with gel strength, break point, rigidity, swelling, and shrinking 678.4 g cm-2, 1.294 cm, 5.033 g cm-1, 2.634 g, and 0.148 g, respectively.
Judul : Sintesis Gel Kitosan-Hialuronat Nama : Pajri Samsi Nasution NIM : G44076017
Disetujui
Pembimbing I,
Pembimbing II,
Dr. Gustini Syahbirin, MS NIP 19600819 198903 2 002
Budi Arifin, SSi NIP 19830109 200604 1 004
Diketahui Ketua Departemen Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor,
Prof. Dr. Tun Tedja Irawadi, MS NIP 19501227 197603 2 002
Tanggal Lulus:
SINTESIS GEL KITOSAN-HIALURONAT
PAJRI SAMSI NASUTION
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Kimia
DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2010
PRAKATA Segala puji dan syukur ke hadirat Allah SWT karena berkat rahmat dan hidayah-Nya, penulis dapat menyusun dan menyelesaikan karya ilmiah. Karya ilmiah ini disusun berdasarkan penelitian yang dilaksanakan pada bulan Juli sampai September 2009 di Laboratorium Kimia Organik, Departemen Kimia FMIPA IPB. Penulis mengucapkan terima kasih kepada Ibu Dr. Gustini Syahbirin, MS dan Bapak Budi Arifin, SSi selaku pembimbing yang telah banyak memberi arahan, motivasi, saran, dan solusi dari setiap permasalahan yang dihadapi penulis selama melaksanakan penelitian. Penulis mengucapkan terima kasih kepada Bapak, Mama, Kakak, Adik-adik, dan Elsera Br. Selain itu, penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Drs. Amin Sjaugi, Apt dan Dwi Astuty SSi, atas kebijaksanaanya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada seluruh staf dan laboran Kimia Organik: Bapak Sabur, Ibu Yenni Karmila, dan Ibu Siti Robiah atas bantuannya selama penulis melakukan penelitian. Tidak lupa, ungkapan terima kasih penulis sampaikan kepada seluruh rekan-rekan Ekstensi Kimia I dan rekan-rekan peneliti di Laboratorium Kimia Organik, atas bantuan dan kebersamaan, selama penulis menempuh studi dan menjalankan penelitian. Akhir kata, semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat.
Bogor, Desember 2009
Pajri Samsi Nasution
RIWAYAT HIDUP Penulis bernama lengkap Pajri Samsi Nasution, dilahirkan di Jakarta 25 November 1986. Penulis adalah anak ke dua dari empat bersaudara dari pasangan Bapak Basirun Nasution, SH dan Ibu Riswarita. Riwayat pendidikan penulis adalah lulusan SDN 3 Ciledug (1992‒1998), SMP Yadika 3 Ciledug (1998‒2001), SMU AlMasthuriyah Sukabumi (2001‒2004), dan D3 Analis Kimia IPB (2004‒2007). Tahun yang sama penulis juga diterima di S1 Kimia Penyelengaraan Khusus IPB untuk melanjutkan S1. Selama mengikuti perkuliahan S1, penulis juga bekerja di PT Arya Scientific dengan jabatan staf penelitian dan pengembangan.
DATAR ISI Halaman DAFTAR TABEL …………………………………………………………….. viii DAFTAR GAMBAR ………………………………………………………......
viii
DAFTAR LAMPIRAN ………………………………………………………..
ix
PENDAHULUAN ……………………………………………………………..
1
TINJAUAN PUSTAKA Kitin dan Kitosan ……………………………………………………… Hidrogel Kitosan …………………………………………………… Hialuronat ……………………………………………………………... Kompleks Polielektrolit Kitosan dengan Hialuronat ………………….. Tautan-Silang Kitosan …………………………………………………
1 2 3 3 3
BAHAN DAN METODE. Bahan dan Alat ………………………………………………………... Penentuan Kadar Air ………………………………………………….. Penentuan Derajat Deasetilasi………………………………………… Penetuan Bobot Molekul Kitosan dan Hialuronat ……………………. Pembuatan Gel Kitosan dan Hialuronat ………………………………. Pengukuran Sifat Reologi Gel ………………………………………... Analisis Data …………………………………………………………..
4 4 4 4 5 5 6
HASIL DAN PEMBAHASAN Penentuan Konsentrasi Kitosan, Glutaraldehida, dan Hialuronat untuk Pembentukan Gel ……………………………………………………… Analisis Reologi Gel Kitosan-Hialuronat …………………..…………. Perbandingan Gel Kitosan-Hialuronat Optimum dengan Modifikasi Gel Kitosan Lainnya …………………………………………………. Validasi ………………………………………………………………..
9 10
SIMPULAN DAN SARAN …………………………………………………...
10
DAFTAR PUSTAKA ………………………………………………………….
10
LAMPIRAN …………………………………………………………………...
13
6 7
DAFTAR TABEL Halaman 1 Spesifikasi kitosan niaga ………………………………………………… 2 2 Konsentrasi kitosan yang digunakan sebelumnya untuk pembentukan gel .
6
3 Hasil studi pendahuluan pembentukan gel dari kombinasi kitosan dan glutaraldehida ………………………………………………………...……
7
4 Hasil optimalisasi Modde 5.0 pembentukan gek kitosan dan sifat reologinya ……………………………………………………......………..
10
5 Validasi hasil penelitian terhadap Modde 5.0 ……….……….…………....
10
DAFTAR GAMBAR 1
Halaman Struktur unit berulang kitin dan kitosan ……………………………..….… 1
2
Pembentukan hidrogel kimia dan fisika ……………………………...……
2
3
Semi-IPN dan IPN-penuh …………………………………………………
2
4
Struktur unit berulang dari natrium hialuronat …………………………….
3
5
Pembentukan tautan-silang melalui kondensasi glutaraldehida dengan kitosan………………………………………………………………………
6
3
Bentuk umum kurva yang diperoleh dari penganalisis tekstur Stevens LFRA ………………………………………………………………………
5
7
Kurva viskositas larutan hialuronat …………..……………………………
7
8
Grafik tiga dimensi pengaruh konsentrasi hialuronat dan glutaraldehida terhadap kekuatan gel …………………………..…………………………
9
8
Grafik tiga dimensi pengaruh konsentrasi hialuronat dan glutaraldehida terhadap pembengkakan dan ………………………...……………………
8
10 Grafik tiga dimensi pengaruh konsentrasi hialuronat dan glutaraldehida terhadap pengerutan ………………………………………..……………..
8
11 Grafik tiga dimensi pengaruh konsentrasi hialuronat dan glutaraldehida terhadap titik pecah ……………...……………………………………….. 12 Grafik tiga dimensi ketegaran
hubungan hialuronat dan glutaraldehida terhadap
9 9
DAFTAR LAMPIRAN 1
Halaman Diagram alir penelitian …………………………………………………… 14
2
Metode pembuatan pereaksi ……………………………….……………...
15
3
Kadar air kitosan dan hialuronat……………………………..……..….….
15
4
Derajat deasetilasi kitosan ………………………………………………...
16
4
Penentuan bobot molekul kitosan ……………………….………………...
17
6
Penentuan bobot molekul hialuronat ………………………………………
18
7
Viskositas larutan hialuronat ………………………………………………
19
8
Hasil uji Anova untuk pembengkakan, pengerutan, kekuatan, titik pecah, dan ketegaran gel kitosan-hialuronat ………………………....……………
20
Kekuatan, titik pecah, dan ketegaran gel kitosan- hialuronat ……………..
21
10 Pembengkakan gel kitosan-hialuronat …………………………………….
23
11 Pengerutan gel kitosan-hialuronat ………………………………………...
24
9
1
PENDAHULUAN Kitosan merupakan biopolimer alami yang diturunkan dari kitin. Kitin sendiri merupakan polisakarida yang ketersediaannya terbesar kedua setelah selulosa. Kitin tersebar luas pada invertebrata dan tanaman tingkat rendah (Foster & Webber 1960). Sumber yang digunakan untuk memperoleh kitin dan kitosan pada umumnya ialah famili krustacea seperti udang dan kepiting. Kulit udang mengandung kitin sebesar 15–20% sedangkan cangkang kepiting mengandung 18–32% kitin. Pemanfaatan kitin dari limbah kulit udang dan cangkang kepiting merupakan hal yang selaras dengan program pelestarian lingkungan. Kitosan termasuk salah satu material pintar alami. Berbeda dengan polisakarida alami lainnya seperti selulosa, alginat, agarosa, dan pektin yang memiliki sifat netral atau asam, kitosan bersifat basa karena memiliki gugus amino dalam jumlah besar pada rantai tulang punggungnya (Mak & Sun 2008). Gugus ini dapat mengalami protonasi pada pH kurang dari 6,5, yang menjadikan kitosan polimer kationik. Muatan positif pada kitosan kemudian dapat berikatan dengan material lain yang bermuatan negatif seperti enzim, sel, polisakarida lainnya, asam nukleat, kulit, dan rambut (Argin-Soysal et al. 2007). Telah banyak penelitian yang memaparkan manfaat kitosan di bidang lingkungan hingga kesehatan. Keserbagunaan ini dikarenakan kitosan bersifat khas. Kitosan biodegradabel, biokompatibel, non-toksik, memiliki aktivitas antimikrob, dapat mengelat ion logam berat, dapat membentuk gel, serta memiliki afinitas yang tinggi pada protein (Mak & Sun 2008). Modifikasi kimia terhadap kitosan untuk meningkatkan kebergunaannya telah banyak dilaporkan. Salah satunya ialah penambahan hidrokoloid untuk memperbaiki sifat gel kitosan. Misalnya, alginat (Cardenas et al. 2003; Wahyono 2006), gom guar (Lestari 2006), gom xantan (Argin-Soysal et al. 2007), karboksimetil selulosa (Rachmanita 2006), dan hialuronat (Kim et al. 2003). Kompleks polielektrolit (PEC) dari campuran kitosan dan hialuronat telah dilaporkan peka terhadap stimulasi listrik. Sifat pembengkakan (swelling) kompleks ini juga bergantung pada pH. Kim et al. (2003) melaporkan bahwa nisbah pembengkakan film kitosan-hialuronat pada pH 4 dapat mencapai 1300% atau dengan kata lain, film tersebut dapat menyerap air 13 kali lebih besar daripada bobot awalnya. Namun, film ini labil pada kondisi asam dan basa sehingga perlu
dimodifikasi, agar terbentuk gel dengan sifat mekanik yang baik. Salah satu modifikasi yang diharapkan dapat meningkatkan sifat mekanik gel kitosan-hialuronat ialah penambahan penaut-silang glutaraldehida. Hidrogel hialuronat sendiri berpotensi sebagai sistem pengantaran obat antiradang. Sel yang mengalami peradangan akan menghasilkan radikal hidroksil (HO•) yang dapat mendegradasi hialuronat. Degradasi ini akan mengerosi permukaan gel sehingga pelepasan obat antiradang dapat berlangsung secara terkendali pada bagian yang sakit (Yui et al. 1992 dalam Kikhuchi & Okano 2005). Dalam penelitian ini, disintesis gel dari campuran kitosan dan hialuronat, dengan penaut-silang glurataldehida. Kondisi optimumnya ditentukan berdasarkan sifat reologi kekuatan gel, titik pecah (break point), ketegaran (rigidity), pembengkakan, dan pengerutan gel yang dihasilkan. Metode permukaan respons yang terdapat di dalam perangkat lunak Modde 5.0 digunakan dalam proses optimalisasi tersebut.
TINJAUAN PUSTAKA Kitin dan Kitosan Kitin adalah biopolimer polisakarida linear dari monomer 2-asetamido-2-deoksi-D-glukosa (N-asetil-D-glukosamina), dengan ikatan glikosidik -(1→4). Kitin merupakan analog selulosa dengan substitusi gugus hidroksil pada C2 oleh gugus amino. Karena itu, beberapa sifat kitin menyerupai selulosa (Foster & Webber 1960). Kitin yang direaksikan dengan larutan basa konsentrasi tinggi akan terdeasetilasi menjadi kitosan. Kitosan bukan zat tunggal, melainkan nama keluarga untuk produk deasetilasi kitin. Seperti halnya kitin, kitosan memiliki rantai linear dengan unit berulang 2-amino-2-deoksiD-glukopiranosa. Struktur kitin dan kitosan diberikan pada Gambar 1.
(a)
(b)
Gambar 1 Struktur unit berulang kitin (a) dan kitosan (b).
2
Kitosan termasuk salah satu material pintar alami. Berbeda dengan polisakarida alami lainnya seperti selulosa, alginat, agarosa, dan pektin yang memiliki sifat netral atau asam, kitosan bersifat basa karena memiliki gugus amino dalam jumlah besar pada rantai tulang punggungnya (Mak & Sun 2008). Gugus ini dapat mengalami protonasi pada pH kurang dari 6,5, yang menjadikan kitosan polimer kationik. Muatan positif pada kitosan kemudian dapat berikatan dengan material lain yang bermuatan negatif seperti enzim, sel, polisakarida lainnya, asam nukleat, kulit, dan rambut (Argin-Soysal et al. 2007). Kitosan tidak larut dalam basa kuat dan hanya sedikit larut dalam HCl, HNO3, dan H3PO4 0,5%. Namun, kitosan larut dalam asam organik berair. Kitosan juga merupakan biopolimer yang tidak beracun dan mudah terbiodegradasi. Kitosan relatif banyak digunakan pada berbagai industri terapan dan kesehatan. Mutu kitin dan kitosan untuk aplikasi tersebut dapat ditentukan dari nilai derajat deasetilasi, kadar air, dan viskositasnya. Pada Tabel 1 diberikan spesifikasi kitosan niaga. Tabel 1 Spesifikasi kitosan niaga* Parameter Ciri Ukuran partikel Serpihan sampai bubuk Kadar air 10% Kadar abu 2% Derajat deasetilasi 70% Warna larutan Tidak berwarna Viskositas (cps): Rendah <200 Medium 200–799 Tinggi 800–2000 Sangat tinggi >2000
bertautan-silang secara kovalen jika ditambahkan bahan penaut-silang, sedangkan hidrogel fisika bertautan-silang secara ionik.
Gambar 2
Pembentukan hidrogel kimia dan fisika (Hoffman 2002).
Menurut Berger et al. (2004), tautan-silang kovalen dalam hidrogel kitosan dibedakan menjadi tiga jenis, yaitu tautan-silang kitosankitosan, jejaring polimer hibrida, dan jejaring saling-tembus (interpenetrating polymer network, IPN) sebagian atau penuh. Tautansilang kitosan-kitosan terjadi antara dua unit struktural pada rantai polimer kitosan yang sama, sementara pada jejaring hibrida, tautan silang terjadi antara satu unit struktur dari rantai kitosan dan unit lain dari struktur polimer tambahan. Berbeda dengan jejaring polimer hibrida, semi-IPN atau IPN-penuh terjadi jika polimer yang ditambahkan tidak bereaksi dengan kitosan sebelum terjadi tautan-silang. Semi-IPN merupakan kombinasi dua polimer yang saling melilit, hanya satu yang memiliki tautan-silang dan tidak ada ikatan antara keduanya. Sementara pada IPN-penuh, kedua polimer yang melilit memiliki tautan-silang (Gambar 3).
* Sumber: Anonim (1987), diacu dalam Jamaludin (1994).
Hidrogel Kitosan Gel adalah jejaring polimer yang bertautansilang secara fisika atau kimia yang memerangkap fasa cair sehingga bersifat semipadatan viskoelastis. Air yang terdapat dalam hidrogel merupakan tipe air imbibisi, yaitu air yang masuk ke dalam suatu bahan dan akan memperbesar volume, tetapi tidak menjadi komponen penyusun bahan tersebut (Winarno 1997). Hidrogel diklasifikasikan berdasarkan sifatnya menjadi hidrogel kimia dan fisika. Hidrogel kimia dibentuk dari reaksi ireversibel, sedangkan hidrogel fisika dibentuk dari reaksi reversibel. Gambar 2 menunjukkan ilustrasi pembentukan hidrogel kimia dan fisika. Hidrogel kimia, seperti hidrogel kitosan,
Gambar 3 IPN-penuh (kanan); Semi-IPN (kiri). Kestabilan hidrogel sangat dipengaruhi oleh keadaan lingkungan, terutama dalam lingkungan hayati, seperti pH, suhu, medan listrik, kekuatan ionik, dan kadar garam (Wang et al. 2004). Kekurangan inilah yang membatasi kegunaan gel kitosan, terutama untuk aplikasi dalam sistem hayati. Karena itu, diperlukan modifikasi gel kitosan, antara lain dengan menambahkan hidrokoloid untuk membentuk semi-IPN. Terbentuknya lilitan kedua polimer akan memberikan sifat mekanik yang lebih baik
3
pada produk akhir. Contoh hidrokoloid yang pernah ditambahkan ditunjukan pada Tabel 2. Tabel 2 Konsentrasi kitosan yang digunakan sebelumnya untuk pembentukan gel Campuran yang dibuat
DD (%)
Mrkit [g/mol]
[kit] [%]
M kit-alg
75,27
9,8×105
0,75
M kit-PVA
75,60
1,6×105
1,00
M kit-hia
76,00
2,0×105
1,00
Kim et al. 2003
M kit-cmcs
75,00
11,0×105
2,00
Shang et al 2008
M kit-alg
74,15
6,6×105
2,25
Asnel 2008
G kit-cmc
73,61
4,3×105
2,50
Rachmanita 2006
G kit-alg
73,61
4,5×105
2,50
Wahyono 2006
G kit-guar
73,61
4.5×105
2,50
Lestari 2006
Referensi
(hyaloid) dan asam uronat (uronic acid). Polisakarida berbobot molekul tinggi itu dikumpulkan dengan pengendapan menggunakan asam asetat. Pada kondisi fisiologis, hampir seluruh molekul asam hialuronat berada dalam bentuk ionnya (Kuo 2006).
Czubenko dan Druzynska 2009 CostaJunior et al. 2008
Keterangan: M = membran G = gel Mr = Bobot molekul DD = Derajat deasetilasi kit = kitosan alg = alginat PVA = poli(vinil alkohol) hia = hialuronat cmcs = karboksimetil kitosan cmc = karboksimetil selulosa guar = gom guar nd = tidak ada data
Hialuronat Hialuronat adalah polisakarida alami yang linear, dengan unit berulang berupa disakarida dari asam D-glukuronat dan Nasetilglukosamina. Hialuronat tergolong poliasam lemah dengan rapat muatan yang rendah, yaitu 1 muatan per 2 residu monomer (Kim et al. 2003). Hialuronat dapat membentuk larutan dengan viskositas tinggi dalam medium air (Kuo 2006). Hialuronat secara komersial tersedia dalam bentuk garam natriumnya (Gambar 4). Hialuronat ditemukan oleh Meyer dan Palmer pada tahun 1934, ketika mereka mengidentifikasi zat seperti mukoid yang diisolasi dari cairan mata sapi sebagai suatu polisakarida yang mengandung asam uronat dan gula amino, tetapi tidak mengandung sulfat. Nama hialuronat diturunkan dari hialoid
Gambar 4 Struktur unit berulang dari natrium hialuronat. Hialuronat merupakan komponen dari matriks ekstraselular hewan tingkat tinggi. Hialuronat dalam konsentrasi tinggi terdapat di tulang rawan, cairan mata, dan cairan sendi. Sifat viskoelastik hialuronat menjadikannya bekerja sebagai pelumas peredam guncangan dalam cairan sendi (Nishinari & Takahashi 2003). Kompleks Polielektrolit Kitosan dengan Hialuronat Polielektrolit adalah polimer yang mengemban muatan ketika larut atau membengkak dalam pelarut polar seperti air. Polimer ini juga dikenal dengan sebutan poliion karena muatannya berasal dari ionisasi gugus fungsi pada rantai polimernya. Kompleks polielektrolit (PEC) dibentuk melalui interaksi antara 2 polielektrolit yang berlawanan muatan di dalam. Gel PEC diketahui memiliki sifat fisik dan kimia yang unik, seperti interaksi elektrostatik di antara PEC yang lebih kuat dibandingkan dengan interaksi sekunder yang dibangun. Penggunaan gel PEC dari kitosan dan polianion sebagai pembawa untuk pengantaran obat dan sistem imobilisasi terus meningkat dalam dekade terakhir (Argin-Soysal et al. 2007). Hidrofilisitas kitosan disukai dalam pembentukan PEC dari campurannya dengan bahan yang bersifat anionik seperti hialuronat (Kim et al. 2003). Tautan-Silang Kitosan Senyawa yang lazim digunakan sebagai penaut–silang adalah glutaraldehida. Senyawa dwifungsi ini mempunyai rumus struktur OHC(CH2)3CHO dengan bobot molekul 100,1 g mol-1, titik didih 100 °C, dan rentang pH 3,2–
4
4,2. Glutaraldehida berupa cairan kuning yang larut dalam air, alkohol, dan benzena. Tautan-silang antarmolekul kitosan berasal dari reaksi kondensasi glutaraldehida dengan kitosan (Gambar 5). Glutaraldehida juga berfungsi sebagai penaut-silang untuk hialuronat (Tomihata & Ikada 1997), polivinil alkohol, dan beberapa polisakarida lainnya (Wang et al. 2004).
Gambar 5 Pembentukan tautan-silang melalui kondensasi glutaraldehida dengan kitosan.
BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat Bahan-bahan yang digunakan antara lain kitosan dari cangkang kepiting, didapat dari PT Ajinomoto, asam hialuronat dalam bentuk garam natrium, didapat dari PT Bioland, dan asam laktat 90% (b/v) teknis, glutaraldehida 25% (v/v) teknis. Alat-alat yang digunakan antara lain penganalisis tekstur Stevens Leatherhead Food Research Association (LFRA) di Pusat Antar-Universitas IPB, penguji kadar air Sartorius dan viskometer Brookfield LV di PT Arya Scientific, FTIR Bruker, viskometer Ostwald, pengaduk magnet, dan alat-alat kaca lainnya. Penentuan Kadar Air Penentuan kadar air dilakukan sebagai pencirian kitosan dan hialuronat, seperti yang dilihat pada Lampiran 1. Contoh kitosan dan hialuronat ditimbang dalam penguji kadar air Sartorius sebanyak 0,500 g, kemudian alat dioperasikan pada suhu 105 oC. Pemanasan akan berhenti jika bobot sampel sudah konstan
dan kadar air akan ditunjukkan pada layar. Pengukuran dilakukan sebanyak 3 kali. Penentuan Derajat Deasetilasi Kitosan (Khan et al. 2002) Penentuan derajat deasetilasi (DD) kitosan diukur dengan menggunakan FTIR. Puncak tertinggi dicatat dan diukur dari garis dasar yang dipilih. Nilai absorbans dapat diukur dengan menggunakan rumus: P0 A = log P dengan P0 = transmitans pada garis dasar P = transmitans pada puncak minimum A = absorbans. DD dapat dihitung dengan membandingkan nilai absorbans pada bilangan gelombang 1655 cm-1 (serapan pita amida) dengan bilangan gelombang 3450 cm-1 (serapan pita hidroksi), Kitin yang tidak terdeasetilasi menghasilkan nilai perbandingan A1655/A3450 = 1,33. DD dihitung dengan persamaan: A1655 1 DD = 1× ×100% A3450 1,33 Penentuan Bobot Molekul Kitosan dan Hialuronat Bobot molekul kitosan dan hialuronat ditentukan dengan metode viskometri Oswald. Sekitar 0,1 g kitosan (bobot basah) dilarutkan dalam 100 mL asam asetat 0,50 M. Sebanyak 10 mL ditentukan waktu alirnya dalam viskometer sebanyak 3 kali ulangan. Pengukuran juga dilakukan untuk konsentrasi kitosan 0,02; 0,04; 0,06; dan 0,08% (b/v) dalam asam asetat 0,50 M (Tarbojevich & Cosani 1996). Densitas larutan kitosan dan pelarut ditentukan dengan piknometer. Untuk penentuan bobot molekul hialuronat, sekitar 0,1 g natrium hialuronat (bobot basah) dilarutkan dalam 100 mL NaCl 0,20 M. Sebanyak 10 mL ditentukan waktu alirnya dalam viskometer sebanyak 3 kali ulangan. Pengukuran juga dilakukan untuk konsentrasi hialuronat 1×10-4, 2×10-4, 3×10-4 4×10-4, dan 10×10-4 g/mL (Cheland et al. 1970, diacu dalam Kuo 2006). Densitas larutan hiluronat dan pelarut ditentukan dengan piknometer. Persamaan-persamaan yang digunakan ialah sebagai berikut: Viskositas relatif ηr = η/0η0 ≅ t/t0 Viskositas spesifik ηs = ηr – 1 Viskositas intrisik [η] = (ηsp/c)c=0 ln ηsp/c =ln [η] + K[η]2c
5
= KM = 3,5×10-4 (Tarbojevich & Cosani 1996) Khialuronat = 0,0228 (Cheland et al. 1970, diacu dalam Kuo 2006) kitosan = 0,76 (Tarbojevich & Cosani 1996) hialurona = 0,816 (Cheland et al.1970, diacu dalan Kuo 2006) t = waktu alir larutan sampel t0 = waktu alir pelarut densitas larutan sampel 0 = densitas pelarut η = viskositas larutan sampel η0 = viskositas pelarut M = bobot molekul sampel [η] Kkitosan
Pembuatan Gel Kitosan dan Hialuronat Studi Pendahuluan Studi pendahuluan untuk menentukan konsentrasi kitosan, dan glutaraldehida yang akan digunakan dalam pembuatan gel dilakukan dengan mengombinasikan konsentrasi kitosan 1,0; 2,0; dan 3,0% dalam asam laktat 18% (v/v) dengan konsentrasi glutaraldehida 0,5; 1,0; dan 4,0% (v/v). Berdasarkan studi pendahuluan ini, dipilih konsentrasi kitosan tetap 2,0% dan konsentrasi glutaraldehida 1,0; 2,0; dan 3,0% (v/v). Pemilihan konsentrasi hialuronat didasarkan pada kekentalan larutan yang terbentuk. Hialuronat dengan konsentrasi 0,5; 1,0; dan 1,5% dalam asam laktat 18% (v/v), diukur viskositasnya dengan viskometer Brookfield LV. Sebanyak 50 g larutan dimasukan ke dalam gelas piala 50 mL, kemudian dicelupkan batang pemutar (spindel) dengan kecepatan 6 rpm. Viskositas akan ditunjukkan pada layar jika telah konstan. Dipilih konsentrasi hialuronat yang digunakan 0,5 dan 1,0%. Pemilihan pelarut dilakukan dengan cara melarutkan 0,1 g hialuronat dalam 19,5 g pelarut. Kitosan sebanyak 0,4 g ditambahkan ke dalam larutan tersebut, lalu diaduk dengan pengaduk magnet hingga diperoleh konsentrasi hialuronat 0,5% dan kitosan 2%. Pelarut dipilih berdasarkan kehomogenan campuran hialuronat dan kitosan. Pelarut yang diujikan meliputi asam asetat 2%, asam laktat 2%, 10%, dan 18% (v/v), dan terpilih asam laktat 18% (v/v). Pembuatan gel Sebanyak 0,1; 0,2; dan 0,3 g hialuronat berturut-turut ditambahkan 19,5; 19,4; dan 19,3 g asam laktat 18% (v/v), kemudian diaduk hingga homogen. Kitosan sebanyak 0,4 g ditambahkan ke dalam setiap larutan tersebut
agar konsentrasi kitosan dalam larutan akhir 2,0%, kemudian diaduk lagi hingga homogen. Campuran kitosan dan hialuronat ini ditambahkan NaOH 30% sebanyak 2,0 g hingga tercapai pH 4, lalu 1 mL glutaraldehida ditambahkan dan kembali diaduk hingga homogen. Larutan yang terbentuk didiamkan selama semalam, agar mengegel. Pengukuran Sifat Reologi Gel Sifat reologi gel yang ditentukan meliputi kekuatan gel, titik pecah, ketegaran, pembengkakan, dan pengerutan. Kekuatan gel, titik pecah, dan ketegaran ditentukan dengan menggunakan penganalisis tekstur Stevens LFRA. Contoh dalam cetakan diletakkan dalam tabung plastik ukuran 50 mL, lalu alat dioperasikan untuk mengukur gaya (g) yang diperlukan untuk memecah gel (kekuatan gel), dan kedalaman penetrasi (cm) saat gel pecah (titik pecah). Ketegaran gel ditentukan sebagai nisbah antara besarnya gaya yang memecah gel dan titik pecahnya (Angalett 1986). Alat yang dipakai memiliki luas bidang penekan (probe) 0,192 cm2, beban penekan 97 g, dan jarak penekan ke gel 5,025 cm. Kurva yang dihasilkan ditunjukkan pada Gambar 6. Kemudian sifat reologi dihitung dengan persamaan-persamaan berikut:
Gambar 6 Bentuk umum kurva yang diperoleh dari penganalisis tekstur Stevens LFRA. Kekuatan gel (g cm-2 )=
beban pecah (BC) ×nilai kalibrasi luas bidang penekan
Nilai kalibrasi Titik pecah (cm)
=
beban penekan jarak penekan ke gel
= penetrasi pecah (AC)
6
Ketegaran (g cm-1 )=
beban penekan (BC) penetrasi pecah (AC)
Uji pembengkakan dilakukan dengan merendam sekitar 1,0000 g gel dalam 30 mL larutan bufer asetat pH 4 (pembuatan bufer diberikan pada Lampiran 2) selama 24 jam pada suhu kamar. Selama proses pembengkakan, wadah ditutup untuk mencegah menguapnya larutan 6buffer. Setelah 24 jam, gel ditimbang kembali untuk mengetahui bobot air yang terserap (Wang et al. 2004). Uji pengerutan dilakukan dengan merendam sekitar 2,0000 g gel dalam 30 mL larutan bufer fosfat pH 7 (pembuatan bufer diberikan pada Lampiran 2) selama 24 jam pada suhu 10 °C. Setelah itu, gel ditimbang kembali untuk mengetahui bobot air yang keluar dari gel (Wang et al. 2004). Analisis Data Rancangan percobaan yang dilakukan dalaha rancangan acak lengkap dengan variabel bebas adalah konsentrasi hialuronat level 0,0; 0,5; dan 1,0% dan konsentrasi glutaraldehida level 1,0; 2,0; dan 3,0% v/v. ® Hasil penelitian diolah dengan Modde 5.0 untuk mengetahui kombinasi hialuronat dan glutaraldehida yang memberikan gel kitosanhialuronat dengan sifat reologi optimum, yakni kekuatan, titik pecah, dan pembengkakan gel yang maksimum, serta ketegaran dan pengerutan yang minimum. Setiap sifat reologi diukur sebanyak 6 kali. Untuk setiap perlakuan dan respon, dipilih 3 data yang menghasilkan simpangan baku terendah. Pengaruh perubahan konsentrasi hialuronat dan glutaraldehida terhadap masing-masing sifat reologi juga dikaji dengan uji analisis ragam dan metode permukaan respons.
HASIL DAN PEMBAHASAN Penentuan Konsentrasi Kitosan, Glutaraldehida, dan Hialuronat untuk Pembentukan Gel Kitosan yang digunakan Dalam penelitian ini berasal dari cangkang kepiting dengan kadar air 11,56% (Lampiran 3). Nilai ini tidak sesuai dengan spesifikasi kitosan niaga. Walaupun kadar airnya tidak sesuai dengan spesifikasi niaga kitosan masih dapat digunakan. Derajat deasetilasi yang diperoleh sebesar 88,48% (Lampiran 4), nilai ini memenuhi spesifikasi kitosan niaga.
Konsentrasi kitosan yang digunakan untuk pembentukan gel sangat ditentukan oleh bobot molekulnya. Semakin besar bobot molekul kitosan, semakin rendah konsentrasi yang diperlukan. Kitosan dari bahan baku dan produsen yang berbeda biasanya berbeda pula bobot molekulnya. Karena itu, konsentrasi kitosan untuk pembentukan gel harus selalu ditentukan terlebih dulu jika kitosan yang digunakan berbeda. Penentuan bobot molekul kitosan secara viskometri memberikan Mr = 7,53 × 105 g mol-1 (Lampiran 5). Tabel 2 menunjukkan pengunaan bobot molekul dan konsentrasi kitosan yang digunakan untuk membuat gel lebih tinggi daripada untuk membuat membran. Hal ini dikarenakan kitosan dengan konsentrasi yang tinggi cepat membentuk gel sehingga sulit dituang ke cetakan membran (Asnel 2008). Penelitian-penelitian sebelumnya yang membentuk gel dari kitosan atau dari campuran kitosan dengan hidrokoloid menggunakan konsentrasi kitosan yang beragam. Kisaranya dari 0,75% sampai 2,50% (Tabel 2). Konsentrasi kitosan terpilih berdasarkan hasil studi pendahuluan ialah kitosan 2,0%. Sebagai mana ditunjukan pada Tabel 3, kitosan 1,0% tidak menghasilkan gel yang kokoh. Disisi lain, kitosan 2,0 dan 3,0% memiliki waktu gelasi, kondisi gel, dan waktu pengerutan yang hampir serupa, oleh karena itu dalam penelitian ini digunakan konsentrasi kitosan yang lebih sedikit, yaitu 2%. Konsentrasi kitosan yang digunakan pada penelitian ini lebih rendah dibandingkan dengan yang digunakan Rahmanita (2006), Wahyono (2006), dan Lestari (2006). Hal ini karena derajat deasetilasi dan bobot molekul kitosan yang digunakan lebih tinggi (Tabel 2). Lebih lanjut penggunaan glutaraldehida 0,5% (v/v) untuk semua konsentrasi kitosan dan glutaraldehida 1,0% (v/v) dengan kitosan 1,0% tidak membentuk gel (Tabel 3). Hal ini dikarenakan tautan-silang antara kitosan dan glutaraldehida sedikit terbentuk. Sementara itu, pada penggunaan glutaraldehida 4,0% (v/v), terjadi pengerutan setelah 7 hari pada gel kitosan 2 dan 3% dan setelah 8 hari pada gel kitoasn 1,0%. Diduga struktur 3 dimensi yang dibentuk terlalu rapat sehingga air yang terperangkap di dalam gel terperas keluar. Berdasarkan hasil ini, selang konsentrasi glutaraldehida yang dipilih ialah 1,0−3,0% (v/v).
7
1,0
2,0
3,0
0,5
Tg
cair
-
1,0
Tg
cair
-
4,0
8 jam
kurang padat
8 hari
dengan laporan Lindblad (2003) bahwa gugus amino kitosan dapat dicangkok oleh asam laktat tanpa katalis. Karena itu, pelarut yang digunakan adalah asam laktat 18% (v/v). Viskositas (cps)
Tabel 3 Hasil studi pendahuluan pembentukan gel dari kombinasi kitosan dan glutaraldehida. [glut] [kit] Waktu Kondisi Waktu % % gelasi gel pengerutan (v/v)
20000 18000 16000 14000 12000 10000 8000
0,5
Tg
cair
-
6000
1,0
20 jam
padat
Stabil
4000
4,0
1,2 jam
padat
7 Hari
0,5
Tg
cair
-
1,0
15 jam
padat
Stabil
4,0
1,2 jam
padat
7 Hari
Keterengan: kit = kitosan glut = glutaraldehida tg = tidak terbentuk gel
Hialuronat yang digunakan memiliki kadar air 13,11% (Lampiran 3) dan penentuan bobot molekul secara viskometri memberikan Mr = 6,33×105 g mol-1 (Lampiran 6). Hialuronat dapat membentuk larutan dengan viskositas yang tinggi. Viskositas larutan hialuronat dalam asam laktat 18% ditunjukkan pada Gambar 7 (data selengkapnya di Lampiran 7). Semakin tinggi konsentrasi hialuronat, viskositasnya semakin meningkat. Peningkatan tajam viskositas terjadi pada konsentrasi lebih dari 1%. Jika larutan hialuronat yang digunakan terlalu kental akan terbentuk gelembung saat pengadukan yang dihilangkan. Oleh karena itu konsentrasi hialuronat yang digunakan tidak lebih dari 1%. Hal ini sesuai dengan pernyataan BeMiller dan Whistler (1996) bahwa gel polisakarida umumnya mengandung 1% polimer. Pelarut asam asetat 2% (v/v), asam laktat 2% (v/v) dan 10% (v/v) dapat melarutkan kitosan, namun ketika ditambahkan hialuronat terbentuk gumpalan-gumpalan yang tidak larut air. Diduga terbentuk gel PEC antara kitosan dan hialuronat. Larutan asam laktat 18% (v/v) dapat melarutkan kitosan dan hialuronat dengan homogen. Interaksi ionik antara gugus karboksil pada asam laktat dan gugus amino pada kitosan, diperkirakan mencegah kitosan berinteraksi dengan hialuronat. Hasil ini sesuai
2000 0 0
0.5
1
1.5
2
[Hialuronat] % (b/b)
Gambar 7 Kurva viskositas larutan hialuronat. Analisis Reologi Gel Kitosan-Hialuronat Konsentrasi hialuronat dan glutaraldehida berdasarkan uji analisis ragam pada Lampiran 8 memberikan pengaruh nyata pada semua sifat reologi yang diujikan pada = 5%. Kurva 3 dimensi pada Gambar 8 (data ditunjukkan pada Lampiran 8) menunjukkan bahwa peningkatan konsentrasi glutaraldehida dari 1,0% (v/v) ke 2,0% (v/v) menaikkan kekuatan gel, tetapi terjadi penurunan ketika dinaikkan lagi ke 3,0% (v/v). Hasil ini sesuai dengan penelitian Shang et al. (2008): selang konsentrasi glutaraldehida 0,5 sampai 1,0% memberikan nilai kekuatan pecah dan elastisitas yang optimum pada gel kitosan-karboksimetil kitosan. Pengaruh yang sama dijumpai pada konsentrasi hialuronat. Glutaraldehida dapat membentuk tautansilang dengan hialuronat. Gugus karbonil pada glutaraldehida dapat membentuk hemiasetal dengan gugus hidroksil pada hialuronat (Tomihata & Ikada 1997). Namun, glutaraldehida agaknya lebih suka membentuk tautan silang dengan gugus amino pada kitosan dibandingkan dengan hialuronat. Diduga karena nukleofilisitas RNH2 lebih besar daripada ROH. Hal ini dibuktikan dengan tidak tampaknya pengaruh yang besar penambahan hialuronat terhadap kekuatan gel (Gambar 9). Hialuronat agaknya hanya berfungsi sebagai pengisi ruang kosong yang terbentuk dari gel kitosan. Semakin banyak hialuronat yang mengisi ruang kosong tersebut, semakin stabil struktur gel yang dihasilkan, namun pengaruhnya jauh lebih
Inves tigation: G el K itos an-Hialuronat has il reduk s i (P LS , c om p.= 3)
8
Res pons e S urfac e P lot
P em bengk ak a n
kecil daripada pengaruh penambahan glutaraldehida. Penurunan kekuatan gel ketika konsentrasi hialuronat dinaikkan dari 0,5 ke 1,0% merupakan impikasi mengecilnya ruang kosong dalam struktur gel ketika konsentrasi Investigation: Gel Kitosan-Hialuronat hasil reduksi (PLS, comp.=3) glutaraldehida tinggi. Data pada Responseterlalu Surface Plot Lampiran 8 menunjukan tren tersebut. Kekuatan
784 718 652 586 520 454 387 321 255 dimensi189pengaruh 123 hialuronat dan 57
Gambar 9 Grafik tiga konsentrasi glutaraldehida pembengkakan gel.
Gambar 8 Grafik tiga dimensi pengaruh konsentrasi hialuronat dan glutaraldehida terhadap kekuatan gel. Dugaan ini didukung oleh lebih sulitnya gel membengkak dan sebaliknya lebih mudah mengerut, sebagaimana ditunjukkan berturutturut pada Gambar 9 dan 10 (data lengkap di Lampiran 10 dan 11), ketika konsentrasi glutaraldehida dinaikkan dari 1,0% (v/v) ke 2,0% (v/v) ke 3,0% (v/v). Hasil ini sejalan dengan laporan Berger et al. (2004) yang menjelaskan bahwa senyawa penaut-silang dapat menurunkan pembengkakan hidrogel kitosan. Tautan silang yang semakin rapat pada jejaring gel menyulitkan cairan masuk ke dalamnya. Sebaliknya, cairan yang terperangkap menjadi mudah terperas keluar dari matriks gel. Di sisi lain, menambah hialuronat tidak mengubah secara signifikan pembengkakan gel (Gambar 9) dan justru menurunkan pengerutan gel (Gambar 10). Hasil ini semata membuktikan bahwa jumlah tautan silang yang dibentuk oleh glutaraldehida lebih menentukan kapasitas penyerapan air oleh gel, dan bahwa hialuronat hanya mengisi ruang kosong yang tersisa di antara jejaring gel. Semakin banyak hialuronat yang ditambahkan, semakin sedikit ruang kosong yang tersisa untuk cairan, maka pembengkakan gel sedikit menurun dari konsentrasi hialuronat 0,5% ke 1,0% .
terhadap
Penambahan hialuronat menurunkan pengerutan, sebab muatan negatif dari gugus karboksil pada natrium hialuronat yang terjebak dalam matriks dapat menahan air agar tidak keluar dari gel. Interaksi ion-dipol yang kuat berperan di sini. Menurut Nishinari dan Takahashi (2003) salah satu fungsi hialuronat dalam tubuh ialah sebagai penahan cairan. Karena itu, hialuronat banyak terdapat dalam persendian tulang. Bufer yang dipakai untuk proses pengerutan adalah bufer fosfat. Ukuran molekul fosfat yang lebih besar daripada asam laktat dan air yang terdapat dalam matriks gel mampu mendesak keluarnya cairan tersebut. Investigation: Gel Kitosan-Hialuronat hasil reduksi (PLS, comp.=3) Response Surface Plot
Pengerutan 0.87 0.74 0.60 0.46 0.32 0.18 0.04 -0.10 -0.23 -0.37 -0.51 -0.65
Gambar 10 Grafik tiga dimensi pengaruh konsentrasi hialuronat dan glutaraldehida terhadap pengerutan gel.
9 Investigation: Gel Kitosan-Hialuronat hasil reduksi (PLS, comp.=3)
Gel memiliki sebagian sifat padatan dan sebagian sifat cairan dan karena itu, disebut semipadatan viskoelastik. Gel dapat mempertahankan bentuknya seperti padatan elastik, namun fase cair kontinu yang diperangkapnya membuat gel tidak sekaku padatan biasa, dan dalam beberapa hal berlaku seperti cairan kental (BeMiller dan Whistler 1996). Jadi semakin banyak cairan yang terperangkap dalam gel, semakin elastis sifat gel itu. Elastisitas gel ditunjukkan oleh titik pecah yang tinggi. Penekan akan dapat berpenetrasi lebih jauh ke dalam gel yang elastik. Seperti ditunjukkan pada Gambar 11, penambahan hialuronat sebanyak 0,5% dan glutaraldehida sebanyak 2,0% (v/v) relatif tidak mengubah titik pecah gel. Akan tetapi, titik pecah ini menurun tajam ketika digunakan hialuronat 1,0% dan glutaraldehida 3,0% (v/v). Berkurangnya jumlah air yang terperangkap ketika tautan silang dan hialuronat yang Investigation: Gel Kitosan-Hialuronat hasil reduksi (PLS, comp.=3) terjebak menjadi sangat banyak sangat Response Surface Plot menurunkan elastisitas gel. Titik Pecah
Plot (GambarResponse 8) jauhSurface melebihi penurunan titik pecah (Gambar 11). Rigiditas
(a) Gambar 12
Grafik tiga dimensi pengaruh konsentrasi hialuronat dan glutaraldehida terhadap ketegaran gel.
Perbandingan Gel Kitosan-Hialuronat Optimum dengan1.332 Modifikasi Gel Kitosan 1.242 Lainnya 1.152 1.063 0.973 0.883 0.794 0.704 0.614 0.525 0.435 0.345
Gambar 11
Grafik tiga dimensi pengaruh konsentrasi hialuronat dan glutaraldehida terhadap titik pecah gel.
Kekuatan dan titik pecah menentukan ketegaran suatu gel. Semakin kuat gel dan semakin kecil titik pecah (artinya semakin kurang elastis), gel akan semakin kaku. Terlihat pada Gambar 12 bahwa peningkatan konsentrasi hialuronat ke 1,0% meningkatkan secara signifikan ketegaran gel. Hal ini disebabkan hialuronat sangat menurunkan titik pecah (Gambar 11), melampaui penurunan kekuatan gel yang ditimbulkannya (Gambar 8). Sebaliknya, penambahan glutaraldehida ke 3,0% (v/v) menurunkan ketegaran gel, sebab penurunan kekuatan gel yang ditimbulkan
Optimalisasi dengan perangkat lunak Modde 5,0® untuk setiap sifat reologi memberikan hasil sebagai berikut: kekuatan gel yang maksimum yaitu sebesar 773,2 g/cm2 didapat dari konsentrasi hialuronat 0,3% dan glutaraldehida 1,8% (v/v). Titik pecah maksimum sebesar 1,332 cm terdapat pada konsentrasi hialuronat 0,1% dan glutaraldehida 1,2% (v/v). Pembengkakkan gel terbesar sebesar 2,887 g didapat pada hialuronat 0,1% dan glutaraldehida 1,0% (v/v). Ketegaran gel yang maksimum (2,931 g/cm) didapat pada hialuronat 0,1% dan glutaraldehida 1,0% (v/v). Pengerutan minimun (-1,067 g) didapat pada hialuronat 1,5% dan glutaraldehida 1,0 % (v/v). Menurut Lindblad (2003) gel yang baik bersifat elastis, lembut, dan mudah membengkak dalam air. Lebih jauh, gel untuk sistem pengantaran obat yang baik harus memiliki kekuatan, titik pecah, ketegaran, dan pembengkakan yang maksimum, serta pengerutan yang minimum. Gel kitosanhialuronat yang memenuhi kriteria ini secara optimum didapat dengan menggunakan konsentrasi glutaraldehida 1,4% (v/v) dan konsentrasi hialuronat 0,3%. Jika dibandingkan dengan hidrokoloid yang lain, konsentrasi hialuronat yang diperlukan paling sedikit (Tabel 4). Hal ini tentu baik karena pemakaian bahan lebih hemat.
10
Seperti yang ditunjukan pada Tabel 4, gel kitosan-hialuronat baik dalam hal pengerutan dan titik pecah dibandingkan dengan gel kitosan dengan alginat, CMC, atau gom guar. Namun, kekuatan gel dan pembengkakannya paling rendah, sementara ketegarannya masih lebih rendah daripada gel kitosan-alginat. Validasi Hasil valiadasi gel kitosan-hialuronat menunjukkan sifat kekuatan, titik pecah, ketegaran, dan pengerutan lebih rendah dari
pada hasil optimum dari Modde 5.0, hanya pembengkakan yang lebih besar dari nilai Modde 5.0 (Tabel 5). Pembengkakan dan pengerutan memiliki nilai yang mendekati hasil optimasi. Namun, sifat kekuatan, titik pecah, dan pengerutan jauh dari nilai optimum. Hal ini dapat dikarenakan keterulangan sifat yang rendah diberikan hialuronat. Hal ini agaknya dapat diminimalisir dengan mempersempit selang konsentrasi hialuronat, karena penyimpangan data diperoleh dari pengunaan konsentrasi hialuronat yang tinggi.
Tabel 4 Hasil optimalisasi Modde 5.0 pembentukan gel kitosan dan sifat reologinya Gel yang dibuat kit-alg kit-cmc kit-guar [Hidrokoloid] 0,830% (b/v) 0,880% (b/v) 0,330% (b/v) [Glutaraldehida] 4,00% (v/v) 6,00% (v/v) 4,86% (v/v) Kekuatan gel (g/cm2) 891,3 738,9 598,4‒731,4 Titik pecah (cm) 1.025 1,068 0,912‒1,115 Ketegaran gel (g/cm) 8,518 3,510 3,23 ‒3,948 Pembengkakan (g) 4,069 5,337 4,077‒4,983 Pengerutan (g) 1,456 1,208 1,167‒1,426 Wahyono Rachmanita Referensi Lestari (2006) (2006) (2006)
kit-hia 0,3% 1,4% (v/v) 678,4 1,294 5,033 2,634 0,148 Penelitian ini
Keterangan: kit = kitosan alg = alginat cmc = karboksimetil selulosa guar = gom guar hia = hialuronat
Tabel 5 Validasi hasil penelitian terhadap Modde 5.0 Hasil pengukuran Respons Ulangan Modde Penelitian 5.0 kk 1 678,4 190,7 2 192,7 3 190,7 tp 1 1,294 0,770 2 0,765 3 1,135 kt 1 5,033 2,468 2 1,692 3 1,659 pb 1 2,634 2,857 2 2,832 3 2,739 pg 1 0,148 0,034 2 0,340 3 0,356 Keterangan: kk : kekuatan (g cm-2) tp : titik pecah (cm) kt : ketegaran (g cm -1) pb : pembengkakan (g) pg : pengerutan (g)
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Berdasarkan hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa gel kitosan-hialuronat optimum menurut MODDE 5.0® dengan konsentrasi kitosan 2,0% terjadi pada konsentrasi hialuronat dan glutaraldehida berturut-turut 0,3% dan 1,4% (v/v). Saran Perlu dilakukan penelitian sintesis gel kitosan-hialuronat dengan selang konsentrasi hialuronat antara 0,0–0,5%.
DAFTAR PUSTAKA Angalett SA. 1986. Evaluation of the Voland Stevens LFRA texture analyzer for measuring the strength of pectin sugar jellies. J Texture Studies 17:87- 96.
11
Argin-Soysal S, Kofinas P, Martin L. 2007. Effect of complexation conditions on xanthan-chitosan polyelectrolyte complex gels. Food Hydrocolloids 23:202-209. Asnel RS. 2008. Perilaku disolusi ketoprofen melalui membran kitosan-alginat [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. BeMiller JN, Whistler RL. 1996. Carbohydrates. Di dalam: Fennema OR, editor. Food Chemistry. Ed ke-3. New York: Marcel Dekker. hlm 157-224. Berger J et al. 2004. Structure and interactions in covalently and ionically crosslinked chitosan hydrogels for biomedical applications. Eur J Pharm Biopharm 57:1934. Cardenas A, Monal WA, Goycoolea FM, Ciapara IH, Peniche C. 2003. Diffusion through membranes of the polyelectrolyte complex of chitosan and alginate. Macromol Biosci 3:535-539. Costa-Junior ES, Barbosa-Stancioli EF, Mansur AP, Vasconcelos WL, Mansur HS. 2008. Preparation and characterization of chitosan/poly(vinyl alcohol) chemically crosslinked blends for biomedical applications. Carbohydr Polym 76:472481. Czubenko JO, Druzynska MG. 2009. Effect of ionic crosslinking on the water state in hydrogel chitosan membranes. Carbohydr Polym 77:590-598. Foster AB, Webber JM. 1960. Chitin. Di dalam: Wolform ML, editor. Advance in Carbohydrate Chemistry. London: Academic Pr. Hoffman AS. 2002. Hydrogels for biomedical applications. Adv Drug Delivery Rev 43:312. Jamaludin MA. 1994. Isolasi dan pencirian kitosan limbah udang windu (Penaeus monodon fabricus) dan afinitasnya terhadap ion logam Pb2+, Cr6+, dan Ni2+ [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Khan TA, Peh KK, Ch’ng HS. 2002. Reporting degree of deacetylation values of chitosan: the influence of analytical methods. J Pharm Pharmaceut Sci 5:205-212. Kikhuchi A, Okano T. 2005. Hydrogels: Stimuli-sensitive hydrogels. Di dalam: Kwon GS, editor. Polymeric Drug Delivery Systems. Wisconsin: Taylor & Francis. Hl. 275-231. Kim SJ et al. 2003. Electrical sensitive behavior of a polyelectrolyte complex composed of chitosan/hyaluronic acid. Solid State Ionics 164:99-204. Kuo JW. 2006. Practical Aspects of Hyaluronan Based Medical Products. Boca Raton: CRC Pr. Lestari SI. 2006. Sintesis dan optimalisasi gel kitosan-gom guar [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Lindblad MS. 2003. Strategies for building polymers from renewable source: Using prepolymers from steam treatment of wood and monomers from fermentation of agricultural products [tesis]. Stockholm: KTH Fibre and Polymer Technology, Royal Institute of Technology Stockholm. Mak A, Sun S. 2008. Intelligent chitosan-based hydrogels as multifunctional materials. Di dalam: Shahinpoor M, Schnieder HJ, editor. Intelligent Materials. Cambridge: RSC. Hlm 447-461. Nishinari K, Takahashi K. 2003. Interaction in polysaccharide solutions and gels. Curr Opin Colloid Interface Sci 8:396-400. Rachmanita. 2006. Sintesis dan optimalisasi gel kitosan-karboksimetil selulosa [skripsi] Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Shang J, Shao Z, Chen X. 2008. Chitosan-based electroactive hydrogel. Polym 49: 55205525. Tomihata K, Ikada Y. 1997. Crosslinking of hialuronat with glutaraldehyde. J Polym Sci 35:3553-3559. Tarbojevich M, Cosani A. 1996. Molecular weight determination of chitin and chitosan. Di dalam: Muzarelli RAA, Peter MG,
12
editor. Chitin Handbook. Grotammare: European Chitin Society. hlm 85-108. Wahyono D. 2006. Optimalisasi sintesis dan kajian adsorpsi gel kitosan-alginat terhadap ion Cu(II) [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Wang T, Turhan M, Gunasekaram S. 2004. Selected properties of pH-sensitive, biodegradable chitosan-poly(vinyl alcohol) hydrogel. Polym Int 53:911-918. Winarno FG. 1997. Kimia Pangan dan Gizi. Jakarta: Gramedia.
LAMPIRAN
14
Lampiran 1 Diagram alir penelitian Pencirian kitosan dan hialuronat (Penetapan kadar air, bobot molekul, dan derajat deasetilasi)
Studi pendahuluan: Pemilihan konsentrasi kitosan, glutaraldehida, dan hialuronat yang digunakan
[kit] [hia] [glut]
Penganalisis tekstur Steven Leatherhead Food Research Association bobot penekan 97 g Luas bidang penekan 1,27 cm2 Kec. penekan 2 mm/detik
Pembuatan gel = 2,0% = 0; 0,5; dan 1,0% = 1,0; 2,0; dan 3,0% (v/v)
Pembengkakan (dalam bufer asetat pH 4)
Optimalisasi Metode permukaan respons (Modde 5.0®)
Gel optimum
Validasi
Pengerutan (dalam bufer asetat pH 7)
15
Lampiran 2 Metode pembuatan bufer Bufer asetat pH 4 Sebanyak 11,55 mL CH3COOH diencerkan dengan akuades sampai volumenya 1 L sehingga terbentuk larutan 0,2 M. Sebanyak 16,4 g CH3COONa juga dilarutkan dengan akuades sampai 1 L sehingga terbentuk larutan 0,2 M. Sebanyak 410 mL CH3COOH 0,2 M dan 90 mL CH3COONa 0,2 M dimasukkan ke dalam labu takar 1 L lalu ditera dengan akuades. Larutan bufer asetat ini diukur pHnya dengan pH meter. Jika pH masih kurang atau lebih dari 4, ditambahkan berturut-turut larutan basa atau asam dari campuran tersebut. Bufer fosfat pH 7 Sebanyak 27,8 g NaH2PO4H2O dilarutkan dengan akuades hingga diperoleh 1 L larutan NaH2PO4H2O 0,2 M. Sebanyak 52,65 g Na2HPO47H2O juga dilarutkan dengan akuades membentuk larutan Na2HPO47H2O 0.2 M. Larutan NaH2PO4H2O 0.2 M sebanyak 390 mL dicampurkan dengan 610 mL larutan Na2HPO47H2O 0.2 M, kemudian diencerkan dengan akuades sampai volume totalnya 2 L. Larutan bufer fosfat ini diukur pH-nya dengan pH meter. Jika pH masih kurang atau lebih dari 7, ditambahkan berturut-turut larutan basa atau asam dari campuran tersebut. Lampiran 3 Kadar air kitosan dan hialuronat Contoh
Ulangan
Bobot awal (g)
Kadar air (%)
Rerata
Kitosan
1
0,528
11,17
11,56
2
0,513
11,89
3
0,501
11,62
1
0,587
13,15
2
0,517
13,15
3
0,548
13,03
Hialuronat
13,11
16
Lampiran 4 Derajat deasetilasi kitosan
P0 P0
P
P
Spektrum FTIR kitosan. Contoh perhitungan: P = log 0 P dengan P0 = transmitans pada garis dasar P = transmitans pada puncak minimum A = absorbans. A1655 =log
3,298 =0,138 2,399
A3450 =log
5,505 =0,902 0,689
Derajat deasetilasi (DD) kitosan dihitung dengan rumus: DD = 1-
A1655 1 × A3450 1,33
×100%
= 1-
0,138 1 × 0,902 1,33
×100%
= 88,48%
17
Lampiran 5 Data penentuan bobot molekul kitosan Konsentrasi, c, kitosan (% b/v dalam asam asetat 0,5 M)
Waktu alir, t (detik)
0
60,91 61,38 61,53 74,46 74,40 74,41 88,11 88,04 88,39 104,64 104,96 105,09 119,99 120,24 120,24
0,02
0,04
0,06
0,08
g/mL)
Viskositas spesifik t ηsp = -1
61,27
0,998
0 (t0)
-
-
74,42
0,998
0,21
10,73
2,37
88,18
0,998
0,44
10,98
2,40
104,90
0,998
0,71
11,86
2,47
120,16
0,998
0,96
12,01
2,49
Rerata
t0
2.52 y = 0,041x + 2,327 R² = 0,921
2.5
ln ƞ sp /c
2.48 2.46 2.44 2.42 2.4 2.38 2.36 0
0.02
0.04
0.06
0.08
Kurva hubungan ln ƞ sp /c dengan konsentrasi kitosan. Persamaan regresi linear: ln ηsp/c
= 0,041 c + 2,327
[]
= exp (2,327) = 10,284
[]
= KMa
10,284
= 3,5 × 10-4 × M0,.76
Mr
= 753390,2922 g mol-1 ≈ 7,53 × 105 g mol-1
0.1 c (% b/v)
18
Lampiran 6 Data penentuan bobot molekul hialuronat Konsentrasi, c, hialuronat (g/mL dalam NaCl 0,2 M)
Waktu alir, t (detik)
0,0000
64,41 64,65
g/mL)
Viskositas spesifik t ηsp = -1
64,83
1.006
0 (t0)
-
-
74,41
1.006
0,15
1476
7,30
83,21
1.006
0,28
1416
7,26
95,95
1.006
0,48
1600
7,38
108,05
1.006
0,66
1666
7,42
123,47
1.006
0,90
1808
7,50
Rerata
t0
65,43 0,0001
73,91 74,73 74,60
0,0002
82,94 83,47 83,84
0,0003
96,20 95,84 95,81
0,0004
108,11 108,11 107,94
0,0005
123,01 123,82 123,58
7.55 y = 568,7x + 7,199 R² = 0,858
7.5
ln ƞ sp /c
7.45 7.4 7.35 7.3 7.25 7.2 0
0.0001
0.0002
0.0003
0.0004
0.0005
0.0006
c (g/mL) Kurva hubungan ln ƞ sp /c dengan konsentrasi hialuronat.
19
Lampiran 6. Lanjutan Persamaan regresi linear: Ln ηsp/c
= 548,7 c + 7,199
[]
= exp (7,199)
[]
= KMa
1255,215
= 0,0228× M0,816
Mr
= 632753,8069 g mol-1 ≈ 6,33 × 105 g mol-1
Lampiran 7 Data viskositas larutan hialuronat
Hialuronat (%)
Viskositas (cps)
0,0
3,50 3,00 3,00 166,20 167,40 167,00 3032,00 3088,00 3056,00 19120,00 18820,00 19060,00
0,5
1,0
1,5
Rerata (cps) 3,17
166,87
3058,67
19000,00
20
Lampiran 8 Hasil uji analisis ragam (Anova) untuk sifat reologi gel kitosan-hialuronat Sumber keragaman
DB
JK
KT
F
P
Hialuronat Glutaraldehida
2 2
0,376 30,18
0,188 15,09
14,25 1144,7
0,000* 0,000*
Interaksi
4
6,587
1,647
124,9
0,000*
Galat
18
0,237
0,013
Total
26
37,38
Hialuronat
2
15,736
0,787
41,13
0,000*
Glutaraldehida
2
5,018
2,509
131,2
0,000*
Interaksi
4
3,426
0,856
44,77
0,000*
Galat
18
0,344
0,019
Total
26
10,36
Hialuronat
2
120211
60105
65,40
0,000*
Glutaraldehida
2
800546
400273
435,5
0,000*
Interaksi
4
929213
232303
252,8
0,000*
Galat
18
16543
919
Total
26
1866512
Hialuronat
2
2,110
1,055
296,4
0,000*
Glutaraldehida
2
0,894
0,447
125,6
0,000*
Interaksi
4
0,668
0,167
46,92
0,000*
Galat
18
0,064
0,004
Total
26
3,737
Hialuronat
2
314,3
157,2
142,0
0,000*
Glutaraldehida
2
127,9
63,94
57,8
0,000*
Interaksi
4
853,4
213,4
192,7
0,000*
Galat
18
19,93
1,107
Total
26
1315,52
Respon Pembengkakan
Pengerutan
Kekuatan
Titik pecah
Ketegaran
Keterangan: DB = derajat bebas JK = jumlah kuadrat KT = kuartil tengah F = nilai uji F ( P *
)
= peluang menerima H0 = berpengaruh nyata pada 0,05
Lampiran 9 Data kekuatan, titik pecah, dan ketegaran gel kitosan- hialuronat Glutaraldehida (% v/v) Ulangan
Hialuronat (%)
1,0
2,0
3,0
Glutaraldehida (% v/v) 1,0 2,0 3,0 Kekuatan Gel (g cm-2)
Glutaraldehida (% v/v) 1,0 2,0 3,0 Titik Pecah (cm)
Glutaraldehida (% v/v) 1,0 2,0 3,0 Ketegaran (g cm-1)
T
L
T
L
T
L
2,345
1,215
9,590
1,100
4,140
0,610
235,4
962,7
415,6
1,215
1,100
0,610
1,930
8,718
6,787
2
2,655
1,245
9,590
1,200
3,970
0,600
266,5
962,7
398,5
1,245
1,200
0,600
2,133
7,992
6,617
3
2,715
1,29
9,885
1,200
4,055
0,770
272,5
992,3
407,1
1,290
1,200
0,770
2,105
8,238
5,266
4,800
1,240
8,225
1,020
2,850
0,500
481,8
825,6
286,1
1,240
1,020
0,500
3,871
8,064
5,700
5,150
1,340
8,940
1,025
3,115
0,685
516,0
897,4
312,7
1,340
1,025
0,685
3,843
8,722
4,547
5,535
1,350
9,410
1,070
2,290
0,625
555,6
944,6
229,9
1,350
1,070
0,625
4,100
8,794
3,664
6,610
0,220
3,220
0,585
2,165
0,335
663,5
323,2
217,3
0,220
0,585
0,335
30,05
5,504
6,463
2
6,664
0,260
3,225
0,600
2,430
0,370
668,9
323,7
243,9
0,260
0,600
0,370
25,63
5,375
6,568
3
6,720
0,270
3,255
0,620
2,706
0,455
674,6
326,7
271,6
0,270
0,620
0,455
24,89
5,250
5,947
1
1
0,0
0,50%
2 3 1
1,00%
T = tinggi kurva tekstur (cm) L = lebar kurva tekstur (cm)
Contoh perhitungan: Hialuronat 0,0%; glutaraldehida 1,0%; ulangan 1 bobot beban penekan ● Nilai kalibrasi = jarak penekan ke gel Nilai kalibrasi
=
97 g 5,02 cm
● Kekuatan gel (g/cm2 ) =
T × nilai kalibrasi Luas bidang penekan
2,345 cm 97 g 2 × 0,1923 cm 5,02 cm Kekuatan gel = 235,4 g/cm2 ● Titik pecah = L Titik peca = 1,215 cm Kekuatan gel (g/cm2 ) =
● Ketegaran (g/cm) =
T L
2,345 cm 1,215 cm Ketegaran (g/cm) = 1,930 g/cm Ketegaran (g/cm ) =
Lampiran 10 Data pembengkakan gel kitosan-hialuronat Glutaraldehida (% v/v) Ulangan
Hialuronat (%)
1,0
2,0
3,0
a
b
c
Rerata
a
b
c
Rerata
a
b
c
Rerata
1,0660 0,9614
3,0346 3,2357
1,9686 2,2743
2,1945
1,1845 1,0872
3,1600 3,1180
1,9755 2,0308
2,0586
1,1295 1,3084
1,6786 1,8610
0,5491 0,5526
0,5542
1,0225
3,3631
2,3406
1,3533
3,5228
2,1695
1,3740
1,9349
0,5609
1,3031
4,9759
3,6728
1,1930
2,8890
1,6960
1,5328
1,4369
-0,0959
1,3608
5,3044
3,9436
1,1930
2,9476
1,7546
1,4667
1,2019
-0,2648
1,3090
5,3253
4,0163
1,0874
3,0374
1,9500
1,3485
1,0058
-0,3427
1,2254
3,8746
2,6492
1,0833
2,3265
1,2432
1,1450
1,8517
0,7067
2
1,0323
3,7117
2,6794
1,0965
2,3528
1,2563
1,1386
1,7788
0,6402
3
1,2451
3,9744
2,7293
1,4347
2,7020
1,2673
1,3916
2,0650
0,6734
1 2
0,0
3 1
0,5
2 3 1
1,0
Keterangan: a = bobot gel awal (g) b = bobot gel setelah direndam dalam bufer (g) c = selisih b – a (g)
3,8776
2,6860
1,8002
1,2556
-0,2345
0,6734
Lampiran 11 Data pengerutan gel kitosan-hialuronat Glutaraldehida (% v/v) Ulangan
Hialuronat (%)
1,0
2,0
3,0
a
b
c
Rerata
a
b
c
Rerata
a
b
c
Rerata
1,5690 1,5818
1,3398 1,1740
0,2292 0,4078
0,3742
1,0163 1,1182
0,2515 0,3149
0,7648 0,8033
0,8220
1,0719 1,3485
0,3422 0,6964
0,7297 0,6521
0,6675
1,6150
1,1295
0,4855
1,5444
0,6465
0,8979
1,4074
0,7866
0,6208
1,7689
2,5483
-0,7794
2,0347
2,0200
0,0147
2,08
1,0065
1,0735
1,7476
2,5050
-0,7574
2,2129
2,1620
0,0509
1,9503
0,2019
1,7484
1,6505
2,3781
-0,7276
2,1097
1,9699
0,1398
2,5366
1,0058
1,5308
2,2968
2,7192
-0,4224
2,2523
2,1979
0,0544
2,1446
1,7768
0,3678
2
2,3828
2,7785
-0,3957
2,1332
2,0301
0,1031
1,9409
1,6257
0,3152
3
1,9435
2,0969
-0,1534
2,1695
2,0596
0,1099
2,2005
1,8548
0,3457
1 2
0,0
3 1
0,5
2 3 1
1,0
Keterangan: a = bobot gel awal (g) b = bobot gel setelah direndam dalam bufer (g) c = selisih a – b (g)
-0,7548
-0,3238
0,0685
0,0891
1,4509
0,3429
