2013.02.15.
Fluoreszcencia anizotrópia,
Lumineszcencia
Fluoreszcencia Rezonancia Energiatranszfer
A molekuláknak azt a fényemisszióját, amelyet a valamilyen módon (például fénnyel való besugárzással) gerjesztett molekula a hőmérsékleti sugárzáson kívül kibocsát, gyűjtőnéven lumineszcenciának nevezzük.
és Fluoreszcencia kioltás Biofizika szeminárium Ujfalusi Zoltán
2013. február 12-14. PTE ÁOK Biofizikai Intézet
Síkban polarizált fény
Síkban polarizált fény
Polarizáció
Fluoreszcencia polarizáció 1. Gerjesztés: dipólusvektor jön létre – abszorpciós momentum
y θ
Fotoszelekció: random populációból az elektromos vektorral párhuzamos abszorpciós vektorú molekulák kiválasztása
x
Imax Polarizátor
I
z
max cos2 Malus törvény
(Étienne-Louis Malus)
Párhuzamos állás: Θ = 0°, I = Imax Merőleges állás Θ = 90°, I = 0
Vertikálisan sikpolarizált gerjesztő fény
Csak a megfelelő orientáltságú abszorpciós momentummal rendelkező fluorofórok gerjesztődnek a mintában!
1
2013.02.15.
Fluoreszcencia polarizáció 2. Fluoreszcencia emisszió: polarizált fény – emissziós momentum
Fluoreszcencia polarizáció
horizontális detektor
Polarizációfok: abszorpciós és emissziós momentum különbsége Oka: gerjesztés időtartama (τ) alatti elmozdulás (ns) z
Polarizált fény
Ivh Iv
z
τ
A
E
y
Részben polarizált fény
fény
y
polarizált fény
Rotációs diffúzió
x
x
Abszorpciós momentum
Ivv
Emissziós momentum
Polarizációfok
p
minta
Nicol prizma
I vv GI vh I vv GI vh
Intenzitásvektorok különbsége normálva az eredő intenzitás vektorra Példa:
Az emissziós momentum vektor nem esik egybe a az abszorpciós momentum vektorral a fluorofórok rotációs diffúziós mozgásának következtében!
Fluoreszcencia Anizotrópia Izotróp rendszer: Irányultság szempontjából homogén
Fluoreszcencia Anizotrópia
vertikális detektor
ha Ivv = Ivh → p = 0 ha Ivh = 0 → p = 1
z
E
rendszer.
y
Anizotróp rendszer: olyan rendszer melyben vannak
kitüntetett irányok.
x
Fluoreszcencia anizotrópia: Polarizált fény segítségével az izotróp fluorofór populációt anizotrópá alakítjuk át.
Perrin egyenlet
Jean Baptiste Perrin, Nobel díj, 1926
Stokes-Einstein összefüggés
Rotációs korrelációs idő a molekulák rotációs diffúziós képességéről ad információt!
A vertikális és horizontális síkban mért intenzitások segítségével lehet meghatározni az anizotrópiát!
v
r
I vv GI vh I vv 2GI vh
Intenzitásvektorok különbsége normálva az teljes intenzitásra Különböző fluorofórok anizotrópiája összeadható
Emissziós anizotrópia
Alkalmazás Molekulák rotációs diffúziójának meghatározása Molekulák közti interakciók detektálása Konformácós változások észlelése Membránok fluiditásának meghatározása
Határ anizotrópia r0: határérték anizotrópia („mozdulatlan molekula”, ha r = r0 → φ végtelen) τ: fluoreszcencia élettartam φ: rotációs korrelációs idő („mozgékonyság”)
Rotációs korrelációs idő V: objektum térfogata η: közeg viszkozitása T: abszolút hőmérséklet R: egyetemes gázállandó
Előnyök: alacsony detektálási küszöb (< nM) real-time mérések koncentráció független
2
2013.02.15.
Fotonok és molekulák ütközése
Módszerek összehasonlítása
Fotonok és molekulák ütközése Fény (foton) ütközése a molekulákkal
Polarimetria Abszorpciós fotometria Fluoreszcencia spektroszkópia Fluoreszcencia polarizáció
Fényforrás
Minta
Detektor
Monokromatikus, polarizált fény
Optikailag aktiv
Elforgatás
Monokromatikus fény
Gerjesztődik, abszorbeál
Intenzitáscsökkenés
Monokromatikus fény
Gerjesztődik, abszorbeál, fényt emittál
Emittált fényintenzitás
Monokromatikus, polarizált fény
Gerjesztődik, abszorbeál, fényt emittál
Polarizáció, Anizotrópia
Fluoreszcencia Rezonancia Energiatranszfer
fényszóródás abszorpció Fényelnyelés: -Egy foton energiája -> molekula energiája (E = h/). -Az elnyelt energia átalakul: - Hő - Fluoreszcencia - Foszforeszcencia - Fluoreszcencia kioltás és fluoreszcencia rezonancia energia transzfer
A FRET feltételei
(FRET) - Theodor Förster, 1948 • „A Förster típusú energiatranszfer a gerjesztett állapotban lévő fluoreszkáló molekula (donor), valamint egy megfelelő spektroszkópiás követelményeket kielégítő molekula (akceptor) között dipól-dipól kölcsönhatás révén, sugárzás nélküli energiaátadás formájában jön létre.” • A gerjesztett donor relaxációja az akceptor molekula emissziója révén valósul meg!
• Fluoreszcens donor és akceptor molekula. • A donor és akceptor molekula közötti távolság 2-10 nm! • Átfedés a donor emissziós spektruma és az akceptor abszorpciós spektruma között.
kt~1/R6
E
R
A FRET molekuláris mechanizmusa
Spektrális átfedés kt konst. J( )n4kfR 6κ 2
Hullámhossz
J= átfedési integrál n= közeg törésmutatója R= donor-akceptor távolság κ= orientációs faktor
3
2013.02.15.
Fluoreszcencia Rezonancia Energia Transzfer
Kritikus Förster-távolság Az a távolság melyen a FRET hatásfok a felére csökken (transzferhatásfok 0.5).
kt~1/R6
E
R
FRET hatásfok E
kt= konst. * J(λ) n-4kfR-6κ2
kt = (1/tD) * (R0/R)6
J(λ): átfedési integrál, n: törésmutató (1.33-1.6), kf: a fluoreszcencia emissziójának sebességi állandója, R: a donor és az akceptor molekula közötti távolság, κ: orientációs faktor (2/3)
6 0
6
kt: az energia transzfer sebességi állandója, t D : a donor molekula fluoreszcencia élettartama az akceptor hiányában, R: a donor és az akceptor molekula közötti távolság, R0: Förster távolság a donor és az akceptor molekula között.
Kritikus Förster-távolság
Az energia transzfer hatásfoka E
R0 = 0.211 •
6 0
R R R
[h -4Q0k2J()]1/6
k kt k k k k t
f
k2 (k-négyzet) = orientációs faktor, a donor emissziós vektorának és az akceptor abszorpciós vektorának relatív orientációjáról tudósít •várható érték 0 – 4 között •általában a k2 = 2/3 (gyors mozgások miatti átlagolódás következtében)
E
t
ic
IC
D
t
6 0
R R R 6 0
6
1: „steady-state” mérések E = 1 – (FDA / FD)
FDA : fluoreszcens intenzitás az akceptor jelenlétében FD : fluoreszcens intenzitás az akceptor hiányában
η = a közeg törésmutatója (1.33-1.6) Q0 = a donor kvantumhatásfoka akceptor hiányában
2: időfüggő mérések (fluoreszcencia élettartam) тDA : élettartam az akceptor jelenlétében
J(l) = átfedési integrál
τD : élettartam az akceptor hiányában
E = 1 – (τDA / τD)
Távolságmérés FRET segítségével
Hőmérséklet-függő FRET mérések
(Molekuláris mérőszalag)
FRET hatásfok E
6 0
R R R 6 0
6
Normált f '
2.5
2.0
1.5
1.0 5
10
15
20
25
30
35
[Hőmérséklet] (°C)
4
2013.02.15.
Összefoglalás
Fluoreszcencia kioltás
• FRET távolságok meghatározására alkalmas megfelelő donor akceptor párok esetén. • Molekulák közötti kölcsönhatások tanulmányozása. • Molekulákon belüli szerkezeti változások tanulmányozása.
• A fluorofórok által kibocsátott fény intenzitásának csökkenése olyan molekulák vagy ionok jelenlétében melyek elektronszerkezete megfelelő ahhoz, hogy a gerjesztett állapotban lévő fluorofórral „ütközve” annak gerjesztési energiáját átvegyék, majd azt valamilyen formában disszipálják (például hő). • Versengés a fluoreszcencia kibocsátása és a nem sugárzásos átmenet között csökkent fluoreszcencia emisszió.
Kioltás típusai
Kioltás típusai Statikus : A kioltó és a fluorofór még a gerjesztés előtt egy
komplexet (sötét komplex) alkot, mely komplex nem képes fényt emittálni. A gerjesztett állapotban lévő molekulák száma csökken. - Diffúzió által nem befolyásolt!
Dinamikus : A kioltó és a fluorofór molekulák diffúziós folyamatok
révén egymás közelébe kerülnek, egy ütközési komplexet hoznak létre, majd a gerjesztett fluorofór átadja az energiáját a kioltónak. - Diffúzió által befolyásolt! - Fluoreszcencia élettartamot csökkenti!
- Fluoreszcencia élettartam nem érzékeny rá!
+ Fluorofór
: Kioltó
Fluorofór h*υ Sötét komplex (a gerjesztés előtt jön létre) Gerjesztés
Hogyan dönthető el, hogy milyen típusú kioltásról van szó?
:
+
Nincs emisszió
Kioltó h*υ
Ütközési komplex (a gerjesztés után jön létre)
+ Fluorofór
Kioltó
Gerjesztés
Kioltók típusai • Semleges kioltók: Akrilamid, nitroxidok sztérikus viszonyok monitorozása. • Töltéssel rendelkező kioltók: jodid, cézium, kobalt elektrosztatikus viszonyok monitorozása [a fehérje töltése fontos (Lys, Arg, His, Asp, Glu)].
Dinamikus kioltás
Statikus kioltás
5
2013.02.15.
Stern-Volmer egyenlet (a kioltás mértékének kvantifikálása)
Eredmények értékelése A fluorofórok hozzáférhetőségét tükrözi a Stern-Volmer állandó (KSV). A bimolekuláris sebességi állandó (kq) szintén a kioltás eredményességét, azaz a fluorofórok hozzáférhetőségét tükrözi. kq = 1 x 1010 M-1s-1 diffúzió kontrollált kioltás kq < 1 x 1010 M-1s-1 sztérikus elfedettség kq > 1 x 1010 M-1s-1 kötés kialakulása
Max Volmer (1885-1965)
Otto Stern (1888-1969) Fizikai Nobel díj (1943)
Módosított Stern-Volmer egyenlet (Lehrer-egyenlet)
Stern-Volmer egyenlet
F0 1 K sv [Q] F
A kioltó számára nem egyformán hozzáférhető fluorofórok esetén!
α : a kioltó által hozzáférhető fluorofór aránya
F0 : fluoreszcencia intenzitás a kioltó hiányában F : fluoreszcencia intenzitás
meredekség: 1/(αKSV)
a kioltó jelenlétében Ksv : Stern-Volmer állandó
KSV= 5 M-1 metszéspont: 1/α
[Q] : kioltó koncentrációja
Triptofán fluoreszcenciájának kioltása akrilamiddal
Fluoreszcencia intenzitás
150
100
50
0 350 400 450 500 550 600 650 Hullámhossz (nm)
6
