Jurnal Sangkareang Mataram| 1
ISSN No. 2355-9292
SEROEPIDEMIOLOGY OF AVIAN INFLUNENZA H5N1 SUBTYPE IN BATS AS RESERVOIR THAT WILD LIVE IN LOMBOK ISLAND Oleh : Kholik, Lalu Faesal Fajri Dosen Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Nusa Tenggara Barat
Abstract : Avian Influenza is a zoonotic disease. Bat had been reported as reservoir of Avian Influenza disease. The Purpose of this research is to explain about the Bats as reservoir of Avian Influenza H5N1 subtype Virus that wild live in Lombok Island. Descriptive Cross sectional Study with purposive sampling method was used in this research. The Population Targets in this research are the Four Bat Caves in Lombok (Tanjung Ringgit Bat Cave, Lembah Sempage Bat Cave, Pujut Bat Cave, and Ganggelang Bat Cave). The Bats was cuptured by net trap and sera was collected from Brachialis vein and than examination by Haemaglutination Inhibition Test (HI Test) to known Geometric Mean Titer (GMT) of Avian Influenza H5N1 subtype titer in RSHV Banyumulek. The Result showed 53 antibody positive against Avian Influenza H5N1 subtype Virus among 55 sera of bats was collected (96%) with GMT value is 23.68 - 29.32. This research describe that antibody of Avian Influenza H5N1 subtipe was detected in sera in the bats in Lombok Island with high titer. It is possible false positives when HI testing for their sialic acid residues on serum. serum treatment with Receptor Destroyer Enzyme (RDE) was needed for inactivation of non-specific inhibitors like Non-antibody molecules present in serum that are capable of binding to the influenzavirus HA. Keywords: Avian Influenza (AI), Bats, Lombok Islan PENDAHULUAN Kalelawar sebagai reservoir berbagai virus RNA yang hidup liar di alam di Indonesia dapat berperan dalam distribusi penyakit pada manusia dan hewan.Para peneliti menyatakan bahwa 70% pathogen yang menginfeksi manusia berasal dari hewan (Chan et al., 2013). Kalelawar yang hidup liar di alam baik jenis pemakan buah ataupun jenis pemakan serangga telah dipercaya dapat menjadi reservoir dari berbagai macam virus RNA.Kalelawar merupakan hewan mamalia unik karena kalelawar dapat terbang, bermigrasi, dan apabila terserang penyakit bersifat asimtomatis.Kehidupan kalelawar yang unik tersebut oleh para peneliti dihubungkan dengan penyebaran beberapa jenis virus RNA. Beberapa jenis virus RNA yang telah dijumpai pada kalelawar sebagai reservoir antara lain adalah virus Rabies, virus Lyssa, virus Nipah, virus Menangle, virus Tiomans, virus SARS dan virus Ebola dan virus influenza. Kalelawar sebagai reservoir beberapa virus RNA tersebut terdistribusi secara luas di berbagai negara di dunia termasuk di Indonesia, termasuk di pulau Lombok Nusa Tenggara Barat. Penelitian tentang deteksi virus Avian Influenza subtipe H5N1 pada kalelawar di Indonesia masih minim baik secara serologis maupun molekuler, sampai saat ini seroepidemiologi dari virus Avian Influenza subtipe H5N1 tersebut pada kalelawar sebagai reservoir
http://www.untb.ac.id/Desember-2016/
yang hidup liar di pulau Lombok masih belum bisa dijelaskan. Pulau Lombok yang beriklim tropis, menurut data dari Badan Meteorologi Klimatologi dan Geofisika (BMKG) pada tahun 2015 bertemperatur maksimum berkisar antara 31,4 – 33,1 °C dan minimum berkisar antara 22,2 – 22,8 °C. Temperatur tertinggi terjadi pada bulan Oktober dan terendah pada bulan Januari. Kelembaban ratarata yang relatif tinggi antara 79,80 - 80,90 persen. Iklim tropis tersebut akan mendukung pertumbuhan mikroorganisme termasuk virus yang berhubungan dengan kesehatan manusia. Kasus penyakit Avian influenza subtipe H5N1 pada unggas telah dilaporkan sudah menyebar di Lombok Tengah, Timur dan Kota Mataram dengan 18 kasus unggas yang terinfeksi (Dispet dan Keswan, 2013). Fakta tersebut menyatakan bahwa walaupun timbulnya kasus Avian Influenza subtipe H5N1 pada unggas terbilang kecil, namun kemungkinan untuk menular kemanusia dapat terjadi. Sejarah telah membuktikan akan peran kalelawar sebagai reservoir berbagai virus RNA. Sampai saat ini kalelawar telah dipercaya dapat menjadi reservoir beberapa penyakit baru atau penyakit yang dulu ada kemudian muncul kembali (reemerging deseases).Kasus penyakit Avian Influenza subtipe H5N1 yang terdapat pada kalelawar belum diyakini tentang keberadaan virus Volume 2, No. 4, Desember 2016
2 | Jurnal Sangkareang Mataram
tersebut pada kalelawar, namun kejadian virus Influenza H17 dan H3N2 telah ditemukan pada kalelawar jenis Sturnira lilium recently dan Nyctalus noctula (Chan et al, 2013). Mengingat bahwa kalelawar mempunyai peranan penting dalam penyebaran penyakit yang berakibat fatal bagi umat manusia, apabila tidak dilakukan penelitian tentang kalelawar sebagai reservoir virus Influenza di Lombok maka antisipasi akan terjadi timbulnya penyakit yang disebabkan oleh virus Avian Influenza yang bersifat zoonosis sehingga akan mengancam jiwa bangsa Indonesia, khususnya kesehatan masyarakat Lombok. Selain Hal tersebut timbulnya kasus Avian Influenza pada hewan atau manusia akan mempengaruhi pandangan masyarakat dunia terhadap Pulau Lombok yang merupakan pusat pariwisata dan peternakan di Indonesia, yang otomatis akan berpengaruh terhadap pendapatan masyarakat Lombok dan devisa Negara. Berdasarkan fakta di negara lain yang menyatakan kalelawar dapat menjadi reservoir penyakit virus Influenza, penelitian tentang kalelawar sebagai reservoir Virus Avian influenza subtipe H5N1 yang hidup liar di pulau Lombok yang bebasis serologis dapat menjadi solusi awal dalam pemetaan penyakit yang berkaitan dengan keselamatan manusia dan hewan MATERI DAN METODE a.
Materi
Jenis penelitian ini adalah epidemiologi deskriptif. Rancangan penelitian ini adalah epidemiologi deskriptif berbasis perhitungan (Descriptive studies based on rates). Epidemiologi deskriptif berbasis perhitungan (Descriptive studies based on rates) adalah studi deskriptif yang bertujuan untuk mengetahui kuantitas penyakit dalam polpulasi melalui pengukuran insidensi, prevalensi, mortalitas dan frekuensi suatu penyakit dalam polpulasi (Stevenson, 2012). Sampel penelitian berupa serum kalelawar yang diambil pada populasi kalelawar di beberapa daerah yang telah ditentukan.Pengambilan sampel menggunakan non probabilitas dengan metode Purposive sampling.Purposive sampling adalah metode pengambilan sampel dengan pertimbangan tertentu. Sampel diambil dengan pertimbangan pengamatan lapangan, penelitian terdahulu tentang kalelawar dan in formasi masyarakat sekitar pulau Lombok terhadap sarang kalelawar pada goa-goa dengan populasi terbanyak. Penentuan tempat pengambilan sampel dapat dideskripsikan sebagai berikut: 1) Goa Kalelawar di Kecamatan Tanjung Ringgit Kabupaten Lombok Timur; 2) Goa Kalelawar di Kecamatan Narmada Kabupaten Volume 2, No. 4, Desember 2016
ISSN No. 2355-9292
Lombok Barat; 3) Goa Kalelawar di Kecamatan Pujut Kabupaten Lombok Tengah; 4) Goa Kalelawar di Kecamatan Gangga Kabupaten Lombok Utara. Besar sampel adalah 96 sampel, dihitung menggunakan rumus infinite population. Bahan- bahan untuk koleksi sampel adalah sebagai berikut: EDTA, Alkohol 70%. Bahan yang digunakan uji Haemeaglutination Inhibition test (HI) dan Haemeaglutination Inhibition test (HI) adalah sebagai berikut: sampel serum, antigen spesifik, alkohol 70%, aquadest steril, Red Blood Cell (RBC) ayam 1%, Phosphat Buffer Saline (PBS), Antigen AI Alat-alat penelitian adalah sebagai berikut : Net trap kit, Tabung darah, cotton bud, cooler box, gunting, kertas label, marker, masker, spuit 1cc dan jarum 26G dan konikel 15 ml, Plate dengan 96 sumuran, Tip biru, Tip kuning, Reservoir, Pipet mikro. Penelitian dilikukan di pulau Lombok yang diasumsikan terdapat virusAvian Influenzasubtype H5N1 pada kalelawar. Pengujian dan Analisis sampeldilaksanakan di Laboratoium UPTD Rumah Sakit Hewan dan Laboratorium Veteriner, Dinas Peternakan dan Kesehatan Hewan Provinsi NTB.Waktu penelitian berdasarkan Jadwal dari DIKTI. Lama penelitian ini sesuai dengan jadwal DIKTI selama 10 bulan. b.
Metode Penelitian
Sampel serum dipreparasi dengan mengambil serum dari tabung darah.Sebelum dilakukan pengujian, serum harus mendapat perlakuan khusus dengan melakukan inaktivasi untuk menghilangkan substansi non spesifik dari sampel serum yang mampu mengaglutinasi eritrosit (WHO, 2002). Serum diinaktivasi pada suhu 560C selama 30 menit sampai 1 jam. Uji hambatan hemaglutinasi (HI) adalah pemeriksaan serologis yang membuktikan pembentukan antibodi spesifik hemaglutinin (HA) dari virus Influenza dalam serum darah. Sampel yang diperiksa adalah serum darah kalelawar. Pada penelitian kali ini pengujian yang digunakan adalah uji hambatan hemaglutinasi dengan menggunakan RBC ayam 1 % dan inaktivasi pada sampel serum yang akan diperiksa. Sebelum pengujian uji hambatan hemaglutinasi (HI), dilakukan retirasi antigen untuk mendapatkan titer 22 HAU.Pada uji ini antigen yang digunakan adalah antigen standart virus virus Influenza subtype H5N1.Prosedur untuk retitrasi antigen empat HA unit adalah pengisian 25 µl PBS ke dalam lubang microplate nomor satu sampai nomor lima, kemudian antigen yang telah diencerkan menjadi empat HA unit dimasukkan pada lubang nomor satu sebanyak 25 µl. http://www.untb.ac.id/Desember-2016/
ISSN No. 2355-9292
Selanjutnya dilakukan pengenceran serial dengan mengambil 25 µl dari lubang nomor sampai lubang nomor empat, sisa 25 µl dibuang. Pada lubang nomor lima digunakan sebagai kontrol negatif. Selanjutnya semua lubang ditambah dengan RBC ayam 1 % sebanyak 25 µl. Setelah itu inkubasi dalam suhu kamar selama 30 menit. Bila pengenceran antigen empat HA tepat, maka pada lubang nomor satu dan dua akan terjadi aglutinasi (OIE, 2005). Prosedur dalam uji HI mikroteknik diawali dengan memasukkan 25 µl PBS kedalam tiap lubang microplate “V”, kecuali lubang pada baris A (A1-A12). Sampel serum yang telah mendapatkan perlakuan dimasukkan kedalam baris A (A1-A12) sebanyak 25 µl, kemudian dibuat pengenceran secara serial dengan cara mengambil 25 µl dari baris A kemudian dituang ke baris B dan dicampur hingga merata, selanjutnya dari baris B diambil 25 µl dan dimasukkan ke baris C, demikian seterusnya sampai lajur H. Sisa 25 µl dibuang. Khusus untuk kolom 11 dan 12, pengenceran hanya dilakukan sampai baris G karena lubang H11 dan H12 digunakan untuk kontrol. Selanjutnya semua lubang microplate diisi dengan antigen standart virus virus Influenza subtype H5N1 22 HAU sebanyak 25 µl, kecuali pada lubang H11 antigen 22 HAU diganti dengan PBS sebanyak 25 µl. Lubang H11 ini tidak ada antigen didalamnya, sehingga eritrosit tidak mengalami aglutinasi. Oleh karena tidak ada aglutinasi yang terjadi maka titik ini digunakan sebagai kontrol positif, sedangkan pada H12 tidak diberi serum, tetapi diberi antigen sehingga eritrosit yang ditambahkan akan mengalami aglutinasi, oleh karena itu lubang ini digunakan sebagai kontrol negatif. Selanjutnya semua lubang diisi dengan eritrosit ayam 1 % sebanyak 25 µl, kemudiandiinkubasi pada suhu ruang selama 30 menit . Langkah terakhir dilakukan penentuan titer HI dari antiserum yang diperiksa (OIE, 2005). Reaksi hambatan hemaglutinasi (HI) akan dinyatakan dengan terjadinya pengendapan eritrosit pada dasar lubang microplate “V” yang terlihat seperti pada kontrol. HASIL PENELITIAN a.
Hasil Survey Lapangan
Hasil penelitian ini merupakan hasil kemajuan pelaksaaan penelitian sampai bulan November 2016.Hasil survey penentuan titik lokasi pengambilan sampel pada penelitian ini terbagi menjadi 4 titik berbasis goa kalelawar yang tersebar pada 4 Kabupaten di Pulau Lombok., goagoa tersebut antara lain:Goa Kalelawar di Kecamatan Tanjung Ringgit Kabupaten Lombok Timur (8.9610 S, 116,2940 E), Goa Kalelawar di Kecamatan Narmada Kabupaten Lombok Barat http://www.untb.ac.id/Desember-2016/
Jurnal Sangkareang Mataram| 3
(8.53990 S, 116,2770 E), Goa Kalelawar di Kecamatan Pujut Kabupaten Lombok Tengah (8.8870 S, 116,2540 E), Goa Kalelawar di Kecamatan Gangga Kabupaten Lombok Utara (8.3400 S, 116,2200 E). b.
Hasil Koleksi dan Pengujian Sampel
Pengambilan sampel dilakukan melalui vena brachilais dan apabila untuk terminasi melalui intracardiac. Hasil rekapitulasi sementara pengembilan sampel serum dan pengujian sampel serum dapat dilihat pada pada Tabel 4.1 di bawah ini: Tabel 1. Rekapitulasi Hasil Pengambilan Sampel Serum Kalelawar Lokasi Goa Kalelawar di Kecamatan Gangga Goa Kalelawar di Kecamatan Tanjung Ringgit Goa Kalelawar di Kecamatan Pujut Goa Kalelawar Kecamatan Narmada Total
∑ ∑ Positif Titer Antibodi Sampel (%) (GMT) 23
23 (100%)
29.32
26
26 (100%)
27.55
1
1 (100%)
27
5
3 (60%)
23.68
55
53 (96%)
26.887
Tabel diatas menunjukkan bahwa hasil pengujian serum darah kalelawar dengan terhadap metode Hemaglutination Inhibition Test (HI) Mikroteknik pada Virus Avian Influenza Subtipe H5 menunjukkan bahwa seluruh Kelelawar yang terdapat pad empat Goa di Kabupaten Lombok didapatkan tantibodi Virus Avian Influenza dengan data sebagai berikut; Kalelawar Goa Kalelawar di Kecamatan Gangga Kabupaten Lombok Utara sebesar 100% dengan Geometric Mean Titer = 29.32 , Goa Kalelawar di Kecamatan Tanjung Ringgit Kabupaten Lombok Timursebesar 100%dengan Geometric Mean Titer = 27.55 , Goa Kalelawar di Kecamatan Pujut Kabupaten Lombok Tengah sebesar 100%dengan Geometric Mean Titer = 27.55 , dan Goa Kalelawar Lembah Sempage di Kecamatan Narmada Kabupten Lombok Barat sebesar 60% dengan Geometric Mean Titer = 23.68 Morfologi kalelawar pada empat (4) Goa Volume 2, No. 4, Desember 2016
4 | Jurnal Sangkareang Mataram
Kalelawar yang target pengambilan untuk serum pada Tabel 1 diatas dapat dilihat pada Gambar 2 di bawah ini :
a
b Morfologi kalelawar: a) Ukuran Megachiroptera sp, b) Ukuran Microchiroptera sp Gambar diatas menunjukkan bahwa ukuran kalelawar Megachiroptera sp yang merupakan kalelawar pemakan buah mencapai panjang sekitar 43 cm, sedangkan Microchiroptera spyang merupakan kalelawar pemakan serangga mempunyai panjang sekitar 26 cm. PEMBAHASAN Hasil deteksi antibodi virus Avian Influenza subtipe H5N1 pada kalelawar di Pulau Lombok dengan Haemeaglutination Inhibition test (HI) pada empat Goa Kalelawar yaitu antara lain: Goa Kalelawar di Tanjung Ringgit Kabupaten Lombok Timur,Goa Kalelawar di Kecamatan Pujut Kabupaten Lombok Tengah, Goa Kalelawar di Kecamatan Gangga Kabupaten Lombok Utara dan Goa Kalelawar Lembah Sempage di Kecamatan Suranadi Kabupten Lombok Barat menunjukkan 96 % Kalelwar telah didapatkan antibodi Virus Avian Influenza. Hal ini berkorelsi dengan penelitian yang menyatakan bahwa telah terdeteksi antibodi virus Avian Influaenza subtipe H5N1 pada kalelawar buah yang bersal dari Kalimantan pada tahun 2012 sebesar 30,2 % (Sulistianti, 2014). Hal ini menunjukkan bahwa Kalelawar dapat menjadi reservoir dari virus influenza dengan asimtomatis, sejak ditemukan keberadaan virus tersebut pada kalelawar yellow-shouldered di Guatemala.Dengan gen HA pada virus Influenza telah mengalami perubahan menjadi H17, sementara untuk gen NA masih tidak berbeda dengan gen virus Influenza A pada umumnya (Tong et al, 2011). Hasil analisis Volume 2, No. 4, Desember 2016
ISSN No. 2355-9292
antibody pada penelitian menunjukkan bahwa seluruh Kelelawar yang terdapat pada empat Goa yang menjadi target pengambilan sampel di Kabupaten Lombok Nusa Tenggara Barat (NTB) mengandung titer yang protektif terhadap Virus Avian Influenza dengan variansi Geometric Mean Titer (GMT) antra 23.68 - 29.32. Hal ini berdasarkan penyataanOffice de Epizootis (OIE) dalam OIE Terrestrial Manual yang menyatakan bahwa interpretasi uji serum Avian Influenza menggunakan HI test dinyatakan positif apabila titer antibody avian influenza pada serum sama dengan 16 (24) atau lebih (OIE, 2015), hanya pada sampel dari Goa Kalelawar Lembah Sempage di Kecamatan Narmada Kabupten Lombok Barat yang didapatkan 3 positif dari lima sampel yang di uji dengan nilai Goa Kalelawar Lembah Sempage di Kecamatan Suranadi Kabupten Lombok Barat. Hal ini menunjukkan Kelelawar merupakan hewan mamalia yang dapat menagkap virus avian influenza melalui reseptor α 2,6 glycan dan membentuk antibody. Kalelawar yang mempunyai melalui reseptor α 2,6 glycan tentu akan berpengaruh terhadap penyebaran penyakit Avian Influenza. Hal ini menunjukkan bahwa Kalelawar dapat menjadi reservoir dari virus influenza dengan asimtomatis. Analisis kemungkinan yang paling pokok dari hasil penelitian yang menyatakan 96% kalelawar terdapat antibody Virus Avian Influenza H5N1 dengan nilai Geometric Mean Titer (GMT) yang tinggi yaitu mencapai 29.32, dimungkinkan akibat adanya molekul inhibitor non spesifik yang dapat menghasilkan hasil positif palsu pada uji Hemaglutinasi Inhibition(HI). Serum mamalia dapat mengandung residu asam sialat yang merupakan reseptor virus Avian Influenza sehingga berkompetisi dengan reseptor pada sel darah merah dalam mengikat virus tersebut sehingga sel darah merah tidak teraglutinasi. Hal ini dapat dicegah denagan pemberian Receptor Destroyer Enzyme (RDE) pada serum kalaelawar yang akan di Uji HI, sehingga untuk menginaktivasi molekul inhibitor non spoesifik tersebut sehingga tidak terjadi positif palsu saat pengujian HI (WHO, 2013). Hasil tentang sub ordo Kalelawar pada penelitian ini yang termasuk sub ordo Megachiropteradan sub ordo Microchiroptera, hal ini sesuai dengan penelitian yang menyatakan bahwa ditemukan telah kelelawar sub ordo Megachiropteradan sub ordo Microchiroptera telah menempati gua di Pulau Lombok seperti, Taman Suranadi (Gua Batu Kota), Gua Gale-Gale (Lombok Tengah), Gua Kenculit (Lombok Tengah), Gua Raksasa (Lombok Timur), Gua Pantai Surga (Lombok Timur) dan gua gangga (Lombok Utara) (Fajri dkk., 2014). Hal ini terjadi http://www.untb.ac.id/Desember-2016/
ISSN No. 2355-9292
karena Pulau Lombok beriklim tropis dan kaya akan buah dan serangga sebagai sebagai makanan dari kalelawar tersebut.
PENUTUP Berdasarkan hasil penelitian, maka dapat di simpulkan sebagai berikut: 1. Antibodi virus Avian Influenza subtipe H5N1 telah terdeteksi pada Kalelawar sub ordo Megachiroptera dan sub ordo Microchiroptera yang terdapat dalam Goa-goa Kalelawar di Pulau Lombok sebesar 96 % (53 positif dari 55 total sampel yang terkumpul) dengan kadar Geometric Mean Titre (GMT) mempuanyai kadar yang tinggi dan protektif yaitu dengan nilai 23.68 - 29.32 . 2. Kadar antibodi virus Avian Influenza subtipe H5N1 pada kalelawar di Pulau Lombok berdasarkan uji Geometric Mean Titre (GMT) mempuanyai kadar yang tinggi dengan nilai 29.32, dimungkinkan terdapat molekul inhibitor non spesifik sehingga menghasilkan positif palsu pada uji HI yang memerlukan pemberian Receptor Destroyer Enzyme (RDE) untuk menginaktivasi molekul inhibitor non spesifik pada serum kalelawar DAFTAR PUSTAKA BMKG. 2015. Analisis Dan Prakiraan Curah Hujan Provinsi Nusa Tenggara Barat. Buletein edisi Januari Chan, J.F.., To, K.K., Tse1, H., Jin, D and Yuen, K. Interspecies transmission andemergence of novel viruses:lessons from bats and birds. 2013. Trends in Microbiology Reviewes. 21(10): 544 555
Jurnal Sangkareang Mataram| 5
(OIE) Office International des Epizooties 2005. Manual of Diagnosis Test andVaccines for Terestrial Animals. (www.oie.int). [diakses pada 08 April 2010]. Stevenson, M. 2012. An Introduction to Veterinary Epidemiologi. EpiCentre, IVABS. Massey University, Palmerston North, New Zealand Sulistiani, E. 2014. Seroprevalensi Virus Avian Influenza subtype H5 pada Kalelawar di Kalimantan [Skripsi]. Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga Surabaya Tong, S., Zhu,X., Li,Y., Shi,M., Zhang,J., Bourgeois,M., Yang,H., Chen,X., Recuenco,S., Gomez,J., Chen,L.M., Johnson,A., Tao,Y., Dreyfus,C., Yu,W., McBride,R., Carney,P.J., Gilbert,A.T., Chang,J., Gu,Z., Davis,C.T., Paulson,J.C., Stevens,J., Rupprecht,C.E., Holmes,E.C., Wilson,I.A., Donis, R.O. 2013. New World Bats Harbor Diverse Influenza A Viruses. PLOS Pathogens. 10: 1-10. WHO. 2013. Cumulative number of confirmed human cases for avian influenza A(H5N1) reported to WHO, 2003-2013. Geneva, Switzerland WHO. 2013. Laboratory Procedures: Serological detection of avian influenza A(H7N9) virus infections by turkey haemagglutination-inhibition assay. http://www.who.int/entity/influenza/gisrs _laboratory/cnic_serological_diagnosis_h ai_a_h7n9_20131220.pdf
Dispet dan Keswan. 2013. Peta Kasus PHM. www. disnakkeswan.ntbprov.go.id Fajri S, R., Agil A, I., Hadiprayitno G, 2014. Kekayaan Spesies Kelelawar Ordo Chiroptera Di Gua Wilayah Selatan Pulau Lombok, Nusa Tenggara Barat. Program Pascasarjana Magister Pendidikan IPA Universitas Mataram dan Program Studi Pendidikan Biologi FKIP Universitas Mataram OIE., 2015. Avian Influenza, chapter 2.3.4, terestrial manual 2015. http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/ Health_standards/tahm/2.03.04_AI.pdf, diakses tanggal 2 Juni 2015.
http://www.untb.ac.id/Desember-2016/
Volume 2, No. 4, Desember 2016
