Sejtmembránra ható vegyszerek hatásmódjának vizsgálata
SZABÓ ZSÓFIA
Témavezető: Dr. Blaskó Katalin Készült: Semmelweis Egyetem Biofizikai és Sugárbiológiai Intézetében
SEMMELWEIS EGYETEM DOKTORI ISKOLA Elméleti Orvostudományok Program: I/3. Ionizáló és nemionizáló sugárzások biológiai hatásai 2003.
1. 1.1. 1.1.1.
BEVEZETÉS A sejtmembrán
6 6
A sejtmembránok szerkezete
6
1.1.1.1.
Membránlipidek
7
1.1.1.2.
Membránfehérjék
8
1.1.2.
A sejtmembrán funkciói
9
1.1.3.
Modellmembránok
1.2.
11
A sejtmembránra ható vegyületek
12
1.2.1.
Pórusképző vegyületek a természetben
12
1.2.2.
Terápiás célra használt pórusképző vegyületek
13
1.3. 1.3.1.
Gombás fertőzések és gyógyításuk
15
A Gombás fertőzések jelentősége
15
1.3.1.1.
A gombás fertőzések és kórokozóik
15
1.3.1.2.
A szervezet védekezési mechanizmusai
16
1.3.1.3.
Hajlamosító tényezők
16
1.3.2. 1.4.
A humán terápiában alkalmazott gomba elleni szerek A ciklusos lipodepszipeptidek
17 19
1.4.1.
A ciklusos lipodepszipeptidek szerkezete
20
1.4.2.
A ciklusos lipodepszipeptidek biológiai hatásai
21
1.5.
Elektronspin rezonancia spektroszkópia
23
2.
CÉLKITŰZÉSEK
24
3.
ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK
26
3.1.
Anyagok
26
3.1.1.
Anyagok humán vörösvértesten mért iontranszporthoz
26
3.1.2.
Anyagok ESR spektroszkópiai vizsgálatokhoz
26
3.1.3.
Ciklikus lipodepszipeptidek
27
3.2.
Módszerek
27
3.2.1.
Hemolízis meghatározása
27
3.2.2.
Iontranszport mérés humán vörösvértesten
27
3.2.2.1.
86
+
3.2.2.2.
Hemoglobin transzport
29
3.2.2.3.
Permeabilitási együttható
29
Rb passzív transzport
27
2
3.2.3.
Kinetikai modell a transzportfolyamatok leírására
29
3.2.4.
ESR spektroszkópiai vizsgálatok
31
1.1.1.1.
Spinjelölt zsírsavszármazékok alkalmazása membránok vizsgálatára
31
3.2.4.2.
Permeabilitás vizsgálata ESR-spektroszkópiai módszerrel
32
3.2.4.3.
Kisméretű unilamelláris liposzóma preparálása és kezelése CLP-kel
33
3.2.4.4.
Multilamelláris liposzóma preparálása és kezelése CLP-kel
34
3.2.4.5.
Mérés ESR spektroszkóppal
34
3.2.4.6.
ESR spektrumok kiértékelése
35
3.2.4.7.
ESR spektrumszimuláció
36
3.2.5.
Dinamikus fényszórásmérés
4. 4.1.
37
EREDMÉNYEK A Syringopeptin22A humán vörösvértest membránra kifejtett hatásai
38 38
4.1.1.
Hemolizáló hatás
38
4.1.2.
Az ionpermeabilitást növelő hatás
39
4.2.
Syringotoxin hatása humán vörösvértest membránra
41
4.2.1.
Hemolizáló hatás
41
4.2.2.
A permeabilitást növelő hatás
41
4.2.2.1.
86
Rb+-transzport
4.2.2.2.
Hemoglobin transzport
41 42
4.2.3.
A hőmérséklet szerepe a syringotoxin permeabilitást növelő hatásában
43
4.2.4.
Kinetikai modell
46
4.2.5.
A syringotoxin pórusra jellemző paraméterek
47
4.3.
Ciklusos lipodepszipeptidek hatása liposzóma membránra, ESR spektroszkópiai vizsgálatok
4.3.1.
48
Ciklusos lipodepszipeptidek hatása telített foszfolipidből készült liposzómákon
48
4.3.2.
A CLP-k koncentrációjának szerepe a fluiditásra kifejtett hatásban
50
4.3.3.
CLP-k membránfluiditásra kifejtett hatása a hőmérséklet függvényében
51
4.3.4.
Ciklusos lipodepszipeptidek hatása telítetlen kötést tartalmazó foszfolipidekből készült liposzómán
58
4.3.5.
Syringopeptin22A hatása koleszterin tartalmú liposzómán
59
4.3.6.
Syringopeptin22A hatása multilamelláris liposzómán (MLV)
60
4.3.7.
Pórusképződés vizsgálata liposzómán
61
4.3.8.
A syringopeptin22A hatása a membránlipidek rendezettségére és rotációs dinamikájára
4.3.8.1.
62
A rendparaméter változása SP22A hatására
3
62
4.3.8.2. 4.4.
Rotációs korrelációs idő
64
Ciklusos lipodepszipeptidek hatása liposzóma membránra; dinamikus fényszórásmérés
5. 5.1.
65 MEGBESZÉLÉS
67
A membránösszetétel inhomogenitása, változatossága mint védelmi mechanizmus
67
5.2.
A CLP-k szerkezeti variabilitása mint hatásos támadó eszköz
76
5.3.
Változatosság — hatóanyagtervezés
77
6.
KÖVETKEZTETÉSEK
78
7.
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS
82
8.
IRODALOMJEGYZÉK
83
9.
SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE
93
10.
ÖSSZEFOGLALÓ
96
11.
SUMMARY
97
4
Rövidítések BLM CLP DMPC DOPC DOPE DOPS DPPC EC ESR Hgb HXD IC LUV MLV MOPS NLLS OD PBS SL-12 SL-16 SL-5 SL-7 SP SP22A SP22B SP25A SP25B SRE SR ST SUV UH vvt
sík bimolekuláris lipidmembrán ciklusos lipodepszipeptid dimirisztoil-L-α-foszatidilkolin dioleoil- foszatidilkolin dioleoil-foszfatidil-etanolamin dioleoil-foszfatidil -serine dipalmitoil-L-α- foszatidilkolin extracelluláris tér elektronspin rezonancia spektroszkópia hemoglobin 4-(N,N-dimetil-N-hexadecil)ammónium-2,2’,6,6’-tetrametilpiperidin-1-oxyljodid intracelluláris tér nagy unilamelláris liposzóma (large unilamellar vesicles) multilamelláris liposzóma (multilamellar vesicles) 3-(N-morpholino)-propánszulfonsav nemlineáris regressziós módszer/program (nonlinear least-squares method/program) optikai denzitás foszfáttal pufferelt izotóniás sóoldat (phosphate buffered saline) 12-doxyl-sztearinsav spinjelölő 16-doxyl-sztearinsav spinjelölő 5-doxyl-sztearinsav spinjelölő 7-doxyl-sztearinsav spinjelölő syringopeptinek syringopeptin22A syringopeptin22B syringopeptin25A syringopeptin25B syringomycin E syringomycinek syringotoxin kis unilamelláris liposzóma (small unilamellar vesicles) ultrahang vörösvértest
5
1. BEVEZETÉS
1.1.
A sejtmembrán A sejtek nélkülözhetetlen építőköve a sejtmembrán, ami egyrészt biztosítja a
sejtek önállóságát, a környezettől való szerkezeti elhatárolódást, másrészt szerepet játszik a sejtfunkciók jelentős részében is (pl.: energiatermelés, sejtek közötti kommunikáció). A sejtmembrán a szerkezeti elhatárolás mellett megakadályozza az ionok
és
molekulák
szabad
(korlátlan)
diffúzióját,
ugyanakkor
speciális
transzportfolyamatok révén biztosítja a szükséges anyagok felvételét, illetve eltávolítását. Ezáltal a membrán aktívan részt vesz az intracelluláris tér sajátos összetételének kialakításában, ami a sejt működéséhez szükséges, és biztosítja az anyagcserét [1-4]. 1.1.1.
A sejtmembránok szerkezete A biológiai membránok szerkezeti alapját a lipid kettős réteg képezi, ebbe
ágyazódnak bele, illetve ehhez kapcsolódnak a membránfehérjék. Lipid Mielin Vörösvértest membrán Máj plazmamembrán Retinapálca külső szegmentum Mitokondrium külső membrán Mitokondrium belső membrán Agy szinaptikus vezikulum Ehrlich-ascites tumorsejt membrán Bakteriális membránok
75
Fehérje 25 51
49 40 41 45
60 59 55 78
22 59
41 30 30
70 70
1.1. ábra. Lipid-fehérje arány a különböző sejtmembránokban
A biológiai membránokról alkotott mai elképzelések egyetértenek abban, hogy a struktúrák lipid kettős réteget tartalmaznak (vastagsága: 4,5-5,5 nm), valamint mindkét oldalon egy-egy fehérje réteget (vastagsága: 2,5-3,5 nm). A lipid-fehérje arány általában közel azonos, de széles határok között mozoghat a speciális funkcióknak megfelelően [1-4]. Néhány adatot tüntettünk föl az 1.1. ábrán (szerkesztve az [5] adatai alapján).
6
1.1.1.1.
Membránlipidek
A lipid kettős réteget amfifil szerkezetű lipid molekulák alakítják ki, amelyek két részből állnak, egy poláros fejcsoportból és egy apoláros farokrészből. A lipidek úgy helyezkednek el, hogy a poláros fejcsoportjaik néznek kifelé, az extacelluláris-, illetve az intracelluláris tér felé, az apoláros farok részek pedig a membrán belseje felé fordulnak. A membrán kettős rétegének kialakításában résztvevő három nagy lipidcsoport a glicerofoszfolipidek, a szfingofoszfolipidek és a glikoszfingolipidek [6, 7]. A biológiai membránok jelentős mennyiségben tartalmaznak koleszterint is (1.2. ábra). A biológiai membránok kettős funkciójának, a stabilitásnak és a funkcionális dinamizmusnak az ellátását az egymással másodlagos kötéssel kapcsolódó, nagy számú lipid- és fehérje molekula biztosítja. Így a biológiai membránoknál, az adott biológiai rendszer szokásos „működési hőmérsékletén”, a lipid-kettős rétegben az egyes lipidek nagyfokú
mozgékonysággal
rendelkeznek,
mivel
közöttük
nem-kovalens
kölcsönhatások működnek. A foszfolipid molekulák saját tengelyük körül foroghatnak, a molekulák pedig a membrán egyik rétegében elmozdulhatnak, ez utóbbit nevezzük laterális diffúziónak. Előfordul a foszfolipidek flip-flop mozgása is; ez a kettős rétegen keresztül történő (transz-membrán) mozgás, mely ritkább és lassabb folyamat az előzőeknél, hiszen ekkor a poláros molekularészeknek a membrán apoláros részén át kell hatolniuk, és ez nagyobb energiát igényel. Ezek a mozgások eredményezik a membrán fluiditását, ami működésüknek elengedhetetlen feltétele [7, 8]. A membránokban a lipidek mozgékonysága függ a hőmérséklettől és a membrán összetételétől. Testhőmérsékleten a sejtmembránok általában fluid állapotban vannak. Ha a hőmérséklet a fázisátalakulási hőmérséklet alá csökken, a membrán merev, un. gél állapotba kerül, ilyenkor a lipidek mozgása csökken. A fluiditás-növekedés a permeabilitás növekedését vonja maga után. A zsírsavlánc régió egy adott hőmérséklet felett jelentős strukturális átalakulást mutat, a rendezettség csökken. A zsírsavláncok orientációja csökken, nő a mozgási szabadság és a zsírsavláncok közötti távolság is 0,048 nm-ről 0,053-0,060 nm-re nő, növekszik a kettős réteg felszíne, térfogata és a foszfolipidek laterális diffúziós sebessége is [9]. Hasonló változásokat a membrán kémiai összetételében való eltérések is előidézhetnek. A foszfolipidekben a telítetlen zsírsavak jelenléte fokozza a fluiditást. Míg a transz kettős kötés nem okoz jelentős 7
változást, a telített kötésekhez képest, addig a cisz kettős kötések kifejezett eltérést okoznak
a
zsírsavlánc
elhajlása
miatt.
E
kötések
csökkentik
a
tényleges
lánchosszúságot, növelik a molekula szélességét, megakadályozzák az oldalláncok közötti túl szoros kapcsolat létrejöttét. Ezzel szemben a nagy mennyiségű telített zsírsav a membránokban a fluiditást, következésképpen a permeabilitást is csökkenti. A koleszterin jelentősen megváltoztatja a foszfolipid kettős réteg dinamikai sajátosságait, "kompaktabbá" teszi a sejtmembránt, csökkenti a foszfolipidek laterális diffúzióját, és általában a membránfluiditást. A koleszterin csökkenti a foszfolipid alkotók átlagos molekuláris területét, tehát kondenzáló hatással rendelkezik. Ez a jelenség a koleszterin és a foszfolipid molekula közötti van der Waals erőknek köszönhető, amik közelebb hozzák a kölcsönhatásban résztvevő membránalkotókat. A koleszterin ezen felül csökkenti a modellmembránoknak a hidrofil molekulákra vonatkozó permeabilitását. A lipidek elhelyezkedése a membránban aszimmetrikus 1.2. ábra. Pl. a vörösvértestben a lipid kettős réteg külső oldalán található a foszfatidilkolin és a szfingomielin nagy része, valamint a glikolipidek döntő többsége, ezzel szemben a foszfatidiletanolamin nagy többsége a membrán belső részében helyezkedik el hasonlóan a foszfatidilszerinhez. A koleszterin eloszlása a két részben közel azonos [5].
EC-tér Koleszterin (23%)
Szfingomielin (18%) PE (18%)
glikolipid (3%) PC (17%)
egyéb (18%)
PS (7%)
IC-tér 1.2. ábra. A vvt membránlipidjeinek inhomogén elrendeződése (az ábra a [5, 10] alapján készült)
1.1.1.2.
Membránfehérjék
A membránok fontos összetevői a membránfehérjék. Singer és Nicolson [11] folyékony mozaik modellje (1.3. ábra) szerint a lipid kettős rétegbe különböző mértékben beágyazódnak a fehérje molekulák. A membrán külső vagy belső felszínén, 8
abba többé-kevésbé belemerülve helyezkednek el az un. perifériás membránfehérjék. A membránfehérjék másik csoportját alkotják az integráns fehérjék, amelyek áthatolnak (akár többször is) a lipid kettős rétegen. A fehérjemolekulák a sejtmembrán működésében
alapvető
szerepet
játszanak.
Specifikus
transzportrendszerek
kialakításával szabályozzák az anyagmozgásokat, részt vesznek a sejtek közötti kapcsolatok kialakításában,
hozzájárulnak
a sejtműködés szabályozásához. A
membránfehérjék funkciójukból eredő változatos orientációja a hozzájárul a membránok
aszimmetriájához.
Működésüket
a
membránlipidek
aszimmetrikus
eloszlása is befolyásolja, valószínű, hogy ez működésüknek feltétele és esetleg szabályozó módja, hiszen optimális működésük meghatározott lipidkörnyezetet igényel.
1.3. ábra. A folyékony-mozaik membrán-modell (az ábrát a www.tulan.edu./~biochem/faculty/facfigs/fluidmosaic.htm file-ból szerkesztettem be)
1.1.2.
A sejtmembrán funkciói A sejtmembrán funkciói közül a legfontosabbak a következők: a) Anyagtranszport a sejtmembránon keresztül b) Sejtek közötti kapcsolatok kialakítása és a sejtalak szabályozása c) A hormonok és az idegi hatások közvetítése receptorokon keresztül d) Membránpotenciál kialakítása és információtovábbítás Doktori munkámhoz ezek közül a sejtmembránon keresztül történő transzport
kapcsolódik szorosan, ezért a többi membránfunkció ismertetésétől jelen munkámban eltekintek. A legtöbb anyag átjutása a biológiai membránokon erősen korlátozott, de a sejt számára szükséges anyagok felvétele és leadása biztosított. A membránok barrier tulajdonsága a lipid kettős réteg korlátozott permeabilitásának köszönhető. A 9
membránon, poláros anyagok nem, vagy csak nagyon kis mennyiségben képesek átjutni. Átjutnak viszont passzív diffúzióval a gázok és az apoláros, töltés nélküli anyagok. Valószínűleg az időről időre keletkező membránréseken passzív diffúzióval (illetve újabb elképzelések szerint az aquaporinok segítségével) átjut még a víz, illetve más kisméretű poláros molekula is. A legtöbb anyag membránon való átjutását integráns fehérjék, un. transzporterek biztosítják. Az integráns fehérjék által létrehozott transzport
egyik
fajtája
a
facilitált
diffúzió:
ilyenkor
a
transzport
a
koncentrációgrádiensnek megfelelően történik. A folyamat legfeljebb addig tarthat, amíg egyensúly alakul ki a membrán két oldalán, így ez a folyamat akkumulációhoz nem vezethet. Facilitált diffúziót valósít meg, pl. a vörösvértestekben a Glut-1 glükóz transzporter, amin keresztül a glükóz transzport 50000-szer gyorsabb, mint a glükóz passzív diffúziója a membránon keresztül. A vörösvértestek membránjában található a klorid-bikarbonát cseretranszporter is: klorid és bikarbonát antiportját végzi a koncentrációviszonyok által meghatározott irányban, ezáltal valósul meg a széndioxid szállítás a vvs-ben. A sejtek működéséhez létfontosságú számos olyan transzport, amelynek segítségével az elektrokémiai-grádienssel szemben mozognak az anyagok. A legtöbb ilyen transzport közvetlenül kapcsolt ATP hasításhoz, ami fedezi az energiaigényt, ezt nevezzük aktív transzportnak, amihez különböző enzimek, transzporterek működése társul: ilyen a sejtek Na+- és K+-ion koncentrációját meghatározó Na+/K+-ATP-áz, vagy a Ca2+ szint fenntartásáért felelős Ca2+-ATP-áz. Vannak olyan transzporterek, amelyek működésénél az ATP hidrolízis nem közvetlenül része a folyamatnak. Ilyenkor az aktív transzport energiaigényét az fedezi, hogy egy másik anyag egyidejűleg, az elektrokémiai-grádiensnek megfelelően transzportálódik. E folyamatoknál, amelyeket másodlagos aktív transzportnak nevezünk, általában a Na+-ion egyidejű transzportja történik. Az ioncsatornákat általában membránfehérjék alakítják ki, rajtuk keresztül egy hidrofil csatornán át ionok áramlása lehetséges. A csatornát ezen integráns membránfehérjék konformációváltozása nyitja ill. zárja. Az ioncsatornák egyik csoportját a feszültségtől függő működésű csatornák, a másikat pedig a receptorként működő ioncsatornák alkotják.
10
1.1.3.
Modellmembránok A sejtmembránok szerkezetének és funkciójának tanulmányozására az egyik
leggyakrabban alkalmazott modell az emberi vörösvértest. A vörösvértest egészséges önkéntes véradók véréből centrifugálással nagy mennyiségben nyerhető, hűtve tárolható, ezért alkalmazása nem igényli költséges sejttenyésztő laboratórium fenntartását. Másik előnye, hogy sejtmaggal és más intracelluláris organellummal nem rendelkezik, így megfelelő eljárás után centrifugálással olyan frakció különíthető el, amelyik csak plazmamembránt (ghost) tartalmaz [6, 12].
1.4. ábra. Unilamelláris liposzóma sematikus rajza
A sejtmembránok összetétele meglehetősen változatos és bonyolult. Ezért működésük megismerése sokszor hatékonyabb akkor, ha egyszerűbb mesterséges membránnal modellezzük őket. A sejtmembránok lipid kettős rétegét alkotó lipidek vizes fázisban spontán különböző lipid-víz rendszereket hoznak létre. Az elrendeződés egyrészt függ a lipid fajtájától, a lipid-víz aránytól, valamint az alkalmazott eljárás módjától. A leggyakrabban alkalmazott mesterséges modellmembránok a liposzómák és a sík bimolekuláris lipidmembránok (BLM) [5, 13]. A lipid kettős réteggel körülvett vezikulák, a liposzómák, kitűnően alkalmazhatók a kutatásban a membránok szerkezetének
vizsgálatára,
a
membránra-ható
vegyszerek
hatásmódjának
tanulmányozására, vagy transzportfolyamatok megfigyelésére. A liposzómáknak több csoportja létezik, amik közül a sejtmembránok modellezésére kis unilammelláris(SUV), nagy unilammelláris- (LUV) és multilamelláris liposzómát (MLV) használnak. A liposzómák egy (SUV, LUV), vagy több (MLV) lipid kettős rétegből állnak, ami kisebb-nagyobb vizes térfogatot vesz körbe [14]. A SUV-ok 30-100 nm, a LUV-ok 1001000 nm átmérővel rendelkeznek, az MLV mérete szintén változó, átmérőjük legalább
11
100 nm, de a mm-es nagyságot is elérhetik. A liposzómák lipidösszetétele (bizonyos megszorításokkal) tág határok között szabadon változtatható, ezért kitűnően alkalmasak arra, hogy a membrán lipid molekulái és a membránra ható vegyszerek közötti kölcsönhatásokat akár molekuláris szinten tanulmányozzuk a segítségükkel. 1.2.
A sejtmembránra ható vegyületek A sejtmembránnak a sejt életében meghatározó szerepe van; így a membránra
ható vegyületek, melyek megváltoztatják a sejtmembrán szerkezetét és/vagy funkcióját, alapvetően befolyásolhatják a sejt működését. A különböző hatások közül az alábbiakban a pórusképzők hatásaival foglalkozom. 1.2.1.
Pórusképző vegyületek a természetben Az egysejtűktől az emlősökig gyakran fordulnak elő az élővilágban olyan
molekulák, melyek a sejtmembránon pórust hoznak létre, ezáltal megváltoztatják a membránon keresztül folyó transzportot, felborítják a sejt normális működését, és a sejt pusztulásához vezethetnek. A membrán permeabilitását fokozó anyagok általánosan alkalmazott eszközök az élőlények védekező rendszerében (host defense system) [1518]. Ezek az anyagok a támadó kórokozók membránját károsítják, ezzel védve a gazdaszervezetet. Ugyanakkor egyes mikroorganizmusok méreganyagai is gyakran pórusképző molekulák, amik a megtámadott gazdaszervezetet károsítják [19-25]. A pórusképző molekulák szerkezete meglehetősen változatos, de általánosan jellemző rájuk, hogy amfifil szerkezetűek és egy, vagy több pozitív töltéssel rendelkeznek [1519, 26-29]. Hatékonyságukat és hatásspektrumukat mind a molekulák szerkezete, mind a célmembrán lipidösszetétele befolyásolja. Az élőlények védekező rendszerében szerepet játszó pórusképző peptideken végzett kiterjedt kutatások rávilágítottak arra a tényre,
hogy
a
kívánt
hatás
eléréséhez
megfelelően
pozícionált
kationos
molekularészekre van szükség [15, 16, 18]. Pl. seminalplasminnal és annak származékaival végzett kísérletek szerint a pozitív töltéssel rendelkező részek megfelelő elhelyezkedése meghatározó volt a hatás kialakulása szempontjából, és az antimikróbás hatás javult a nettó pozitív töltés emelkedésével [30, 31]. Egy, a halakra jellemző toxin, a pardaxin esetében azt tapasztalták, hogy ha a fehérje N-terminális végére egy pozitív töltés került, akkor nőtt az antibakteriális hatás, viszont csökkent a toxin által kiváltott hemolízis [32]. Egy másik pórusképző molekulával, a méhek mérgéből származó 12
melittinnel, valamint a marhából származó seminalplasminnal végzett tanulmányok szerint a hidrofób momentum is szerepet játszik a hatás kialakulásában [18, 33]. 1.2.2.
Terápiás célra használt pórusképző vegyületek A természetben előforduló pórusképző mérgek közül többet a terápiában is
használnak antimikróbás hatásuk miatt. Pl. a primicin (Ebrimicin) egy pozitív töltéssel rendelkező laktongyűrűből álló hatékony antibiotikum. Modell membránon és emberi vörösvértesten végzett vezetőképesség, ill. iontranszport mérések szerint a primicin dimer aggregátumokból álló csatornát hoz létre [34, 35]. A gramicidin A ─ bár alkalmazása a gyakorlatban nem terjedt el ─ az egyik legtöbbet vizsgált antibiotikus hatású póruképző molekula. Hasonlóan a primicinhez a membránon dimer formában képez csatornát [35, 36, 37].
1.5. ábra. A gramicidin A dimerje által képzett csatorna felülnézete. A kép Epand et al. [38] munkájából szerkesztett kép
Ge és mtsai [39] ESR spektroszkópiai és spektrum szimulációs eredményei alátámasztották, hogy a gramicidin A aggregálódik DPPC-ből készült lipid kettős rétegben akkor, ha a gramicidin/DPPC molaris arány nagyobb, mint 1/15. Vizsgálataik a gramicidin A és a membránlipidek közötti kölcsönhatásokat molekuláris szinten világították meg. Megállapították, hogy a gramicidin aggregációjakor a közelében lévő membránrész szerkezete pillanatszerűen megváltozik, a lipidek mozgékonysága 13
nagymértékben csökken. Azt tapasztalták, hogy a szénhidrogén lánc végén spinjelölt lipidek nagy negatív rendparaméterrel voltak jellemezhetők, ami arra utal, hogy a lipidláncok végei jelentősen meghajoltak. Ezt azzal magyarázták, hogy valószínüleg a gramicidin A csatornák és a lipidek hidrofób részei nem illeszkednek jól egymáshoz, un. hidrofób mismatch-hatás mutatkozik. Feltehetőleg a pontatlan illeszkedés és a gramicidin A dehidráló hatása együttesen eredményezik a szerkezet megváltozását (HIIfázis kialakulása) [39]. Blaskó és mtsai [40] emberi vörösvértest membránon nyert transzport kinetikai eredményei
alapján
a
gramicidin
A
csatornák
rendelkeznek. A gramicidin A-val kezelt membrán
86
meghatározott
élettartammal
Rb+-ra vonatkozó megnövekedett
permeabilitása 30 oC-on 90 perc után lecsökkent, amiből a csatornák inaktiválódására következtettek [41]. 30 oC-on a
86
Rb+-ra vonatkozó megnövekedett permeabilitás
rövidebb idő alatt csökkent, mint 20
o
C-on, ezzel szemben 6
o
C-on állandó
permeabilitást tapasztaltak, ami arra utal, hogy a pórusok inaktivációja a hőmérséklettől függő folyamat [41]. Normál, csökkentett és megnövelt koleszterin tartalmú vörösvértest membránon Schagina és mtsai [42] azt tapasztalták, hogy abban az esetben, ha a membrán koleszterin tartalma 30%-kal nagyobb volt a normál vörösvértesténél, akkor a permeabilitás csökkenése hamarabb következett be. A csökkentett koleszterin tartalmú vörösvértesten a permeabilitás a mérés ideje alatt nem változott. A fentiek alapján az inaktiváció sebessége a koleszterin tartalom emelésével növekedett, amiből arra következtettek, hogy a pórusok inaktivációjában a gramicidin A és a koleszterin közötti kölcsönhatásoknak kulcsszerepe van [42]. Ezt a következtetést különböző lipidösszetételű modell membránon nyert eredmények is alátámasztották. Dioleilfoszfatidilkolinból és valamilyen szterolból (koleszterin, vagy ergoszterin, vagy szitoszterin, vagy 7-dehidro-koleszterin) készült BLM-n nyert eredmények szerint a gramicidin A csatornák akkor inaktiválódtak, ha a membrán olyan szterolt tartalmazott, amelynek B gyűrűjén mindkét kettős kötés jelen volt. Ez arra utal, hogy a pórusok inaktivációjához a gramicidin és koleszterin B gyűrűjének második kettős kötése közötti kölcsönhatásra van szükség [42]. A Streptomyces nodosus által termelt amphotericin B ugyancsak sokat vizsgált pórusképző molekula [43]. Az amphotericin B a membrán szterol komponenséhez kötődik, és több molekulából álló komplex kialakításával képezi a csatornát [44-48].
14
Jelentős antibakteriális hatással rendelkezik, de főként gombaölő hatását használják ki a szisztémás (invazív) gombás fertőzések kezelésére (2.1.2. fejezet) [45, 49]. 1.3.
Gombás fertőzések és gyógyításuk
1.3.1.
A Gombás fertőzések jelentősége
1.3.1.1.
A gombás fertőzések és kórokozóik
Az emberi gombafertőzések között megkülönböztetünk felületi-, subcutan- és mély (szisztémás, vagy invazív) mycosisokat. Szisztémás jellegű megbetegedés ugyan, de sokszor külön tárgyalják, az un. opportunista mycosisokat. Kórokozóik egészséges embereket általában nem betegítenek meg, a fertőzéshez valamilyen további tényező szükséges. Ezek alapján a gombás fertőzések kórokozói két nagy csoportra oszthatók. Az első a föltétlen patogének csoportja, amelyek általában ép szövetben, szervben ill. szervezetben okoznak mycosist, szemben a második csoportba sorolható un. fakultatív patogénekkel. A fakultatív patogének jellemzően csak gyengült, vagy hiányos immun-, ill. hormonműködés esetén okoznak megbetegedést, amit opportunista mycosisnak is nevezünk. A föltétlen patogének által okozott mycosisok A felületi mycosisok kórokozói (pl.: Epidermophyton-, Trichophytonés Microsporum fajok) az elszarusodott felületi szöveteket támadják meg (bőr, haj, köröm). A subcutan mycosisokat okozó gombák (pl.: Sporothrix schenkii, Phialophora verrucosa, Phialophora pedrosi, Cladosporium carrionii, és Madurella fajok) a talajban élő fajok, a subcutisba kell jutniuk eredményes fertőzés létrehozásához. A szisztémás mycosisok kórokozói általában a talajban szaprofita életmódot folytató gombák, ezek spóráinak belégzése vezet a fertőzéshez. Az első elváltozások ezért általában a tüdőben keletkeznek, gyakran spontán gyógyuló tüdőgyulladás formájában. Krónikus forma ritkán alakul ki, ilyenkor a fertőzés direkt módon,
15
vagy a véráram útján terjedhet, és bármelyik szerv fertőződhet. Ezek a fertőzések emberről emberre általában nem terjednek. Szisztémás mycosist okozhat, pl. a Coccoidioides immitis, a Histoplasma
capsulatum,
a
Blastomyces
dermatitidis,
és
a
Paracoccidioides brasiliensis [50]. A f a k u l t a t í v p a t o g é n e k által okozott szisztémás mycosisok kórokozói a természetben igen elterjedt szaprofiták, pl. a különböző Candida és Aspergillus fajok, a Cryptococcus neoformans és a Zygommyceták [50]. 1.3.1.2.
A szervezet védekezési mechanizmusai
Az emberi szervezet gombák ellen való védekezésében szerepet játszanak mind aspecifikus, mind specifikus védelmi mechanizmusok. Az aspecifikus védekezési rendszerben az első védelmi vonal a bőr. A bőr épsége mellett a normál flóra is szerepet játszik a gombák visszaszorításában. Mivel a szisztémás mycosisok fő behatolási kapuja a tüdő, ezért az ellenük való védekezésben fontos a légúti hámszövetek csillóinak a szerepe és az alveoláris makrofágok működése. A vérben az aspecifikus védekezés tényezői között ki kell emelni a fagocitózist. A védekezésben szerepe van a komplementrendszernek, a parenchymás szervek (máj, lép), a nyirokcsomók és a csontvelő makrofágjainak és még sok egyéb tényezőnek. A specifikus védekezésben nagyobb szerepet tulajdonítanak a celluláris mechanizmusoknak, mint a humorális válaszoknak. 1.3.1.3.
Hajlamosító tényezők
Bizonyos hajlamosító tényezők hatására a gombás fertőzések (elsősorban az opportunista
mycosisok)
valószínűsége
jelentősen
megemelkedik.
Hajlamosító
betegségek a veleszületett-, ill. szerzett immunhiányos állapotok (pl.: AIDS, neutropenia), a tumorok (főleg az előrehaladott szolid tumorok ill. leukemiák), a diabetes mellitus, a krónikus alkoholizmus és kábítószer-élvezet. Mesterségesen előidézett hajlamosító tényező a kortikoszteroidok és a szélesspektrumú antibiotikumok hosszan tartó adagolása, a citosztatikus kezelés, a sugárkezelés, az égési sérülések és a katéterezés.
16
1.3.2.
A humán terápiában alkalmazott gomba elleni szerek A
gombafertőzések
elleni
küzdelmet
nehezíti,
hogy
eukaryota
gazdaszervezetben (emberi) kell a szintén eukaryota gombák ellen szelektíven ható szereket alkalmazni, amire kevesebb lehetőség nyílik, mint a prokaryota baktériumok estében. A humán terápiában alkalmazott gomba elleni szerek hatásmódjukat tekintve négy nagy csoportra oszthatók: Sejtmembrán-funkciót gátlók: megváltoztatják a membrán permeabilitását, ilyenek pl. a polién makrolidok Sejtmembrán-szintézist gátlók: az ergoszterol bioszintézisét gátolják, pl.: azolok, morfolinok, allylaminiok, thiocarbamátok Nukleinsav-szintézist gátló: flucytosin mitózist gátló: griseofulvin [45].
Sejtmembrán-funkciót gátló szerek: polién makrolidok A polién makrolidok közé tartozik a szisztémás fertőzésben alkalmazott heptaén az amphotericin B, ami a sejtmembránon pórust hoz létre, ezáltal a membrán permeabilitása megnő, a sejt homeosztázisa felborul, és ez a sejt irreverzibilis károsodását vonja maga után. Az amphotericin B a gomba membránjában jelenlévő ergoszterolhoz kötődik, ám a kötődés nem teljesen szelektív, ezért némiképpen kötődik az emberi sejtmembrán koleszterinjéhez is, ami hozzájárul az Amphotericin B súlyos mellékhatásaihoz. Igen gyakori a magas láz (40oC) és a fejfájás. Gyakoriak az emésztőszervi mellékhatások, így a hányinger, hányás. Maradandó szövődményként jelentkezhet veseártalom. Felléphet heveny májártalom és csontvelő-károsodás. A szert ma már liposzómába zárt formában és lipid-komplexként is alkalmazzák, így a rendkívül erőteljes mellékhatások csökkenthetők [51-53]. Lokális kezelésre alkalmazott makrolid a nystatin. Hasonlóan az amphotericin Bhez megváltoztatja a membrán permeabilitását, zavart okoz a transzportban. Erősen toxikus, ezért parenterálisan nem alkalmazzák. Helyi kezelésre használt makrolid gombaölő a candicidin [54, 55] és a szem gombás megbetegedéseiben alkalmazott natamycin [56]. Sejtmembrán szintézisét gátló szerek: 17
Azolok: A helyi és a szisztémás gombás fertőzések gyógyításában egyaránt alkalmazzák az imidazol származékokat. Az imidazol származékok szintetikus vegyületek, melyek a gombák ergoszterol bioszintézisét gátolják. Megváltozik a gombamembrán szerkezete, a sejt anyagtranszportja és több membránhoz kötött enzim működése. Magyarországon lokális kezelésre használják a clotrimazolt (Canesten), a miconazolt (Daktarin, Mycosolon), és az econazolt (Pevaryl) a bőr és a hüvely gombás fertőzéseiben. Szintén helyileg alkalmazzák a széles hatásspektrumú és rövidebb kezelési időt igénylő bifonazolt (Mycospor). Szisztémás fertőzésben is alkalmazott imidazol származék a ketokonazol (Nizoral), aminek erős mellékhatásai lehetnek; így hányás, hasi fájdalom, idegrendszeri tünetek és a szteroid anyagcsere zavara. Szisztémás gombás fertőzések kezelésére jól bevált szerek a triazolok: a fluconazol (Diflucan) és az itroconazol (Orungal). Hatásmódjuk, hasonlóan az imidazol származékokéhoz, az ergoszterol bioszintézis gátlása. Allylaminok: A terbinafin a squalen-epoxidáz enzim gátlásán keresztül akadályozza az ergoszterin-szintézist. A szert szisztémás fertőzésekben alkalmazzák. Morfolinok: Az amolorfin (Loceril) a C17 reduktáz és a C7-C8 izomeráz gátlása révén szintén az ergoszterol szintézist gátolja. Carbamátok:
Lokális
kezelésre
használják
a
tolnaftátot
(Digifungin,
Chinofungin). Nukleinsav szintézisét gátló szer: Szisztémás
fertőzések
kezelésére
alkalmazzák
a
flucytosint,
ami
a
gombasejtekben fluoruracillá, majd fluor-dezoxi-uridilsavvá alakul és gátolja timidilát szintetázt. A szelektív hatás annak köszönhető, hogy az emlőssejtekben kevés fluorcitozin (flucytosin) alakul át fluoruracillá. Gyakran együtt alkalmazzák amphotericin B-vel, így csökkenthető az amphotericin B dózisa. A flucytosin is okozhat mellékhatásokat, melyek közül legfontosabb a csontvelő depresszió. Mitózist gátló szer: A benzofurán származék griseofulvin (Grizeofulvin) fungisztatikus hatással rendelkezik. Az osztódás során a mikrotubulusokhoz kapcsolódik, ami az osztódási
18
orsók töréséhez vezet. A hatóanyag zöme a körömben, és a hajban halmozódik fel, a testnedvekben és a szövetekben, kis koncentrációban van jelen. Egyéb lokális gombás fertőzések kezelésére alkalmazott szerek Helyi kezelésre használják a ciclopirox olamint (Batrafen), a haloprogint és az undecilénsav sóit (Lubex, Zincundan) [45]. Újabb gombaellenes szerek Gombás fertőzések helyi kezelésére használják a ciclopirox olaminhoz hasonló fungicid hatású szintetikus rilopirox-ot. Szintén helyileg alkalmazzák a két újabb imidazol származékot, a lanoconazolt és az eberconazolt. [57] Szisztémás fertőzésekben is alkalmazott újabb triazol származék a voriconazol, mely hatékonynak bizonyult a komoly problémát jelentő, sokszor a legtöbb gombaölő hatóanyagra már rezisztens aspergillosisok kezelésében is.[58] Az allylaminokhoz hasonló hatásmóddal rendelkező butenafint sikerrel alkalmazzák gombás fertőzések helyi kezelésére [57]. A glucaszintetázt gátló vegyületek, mint pl. a cilofungin, gomba ellenes hatása már in vitro és állatkísérleten is bizonyított [59.] Új lehetőséget jelentenek a gombás fertőzések elleni küzdelemben a kifejlesztés alatt álló kitin szintézist gátlók, mint pl. a nikkomycin [60]. Napjainkban egyre több beteg rendelkezik a szisztémás gombás fertőzésekre hajlamosító tényezők valamelyikével, ami maga után vonja ezek előfordulásának rohamos növekedését. A hatékony gyógyszerek száma viszonylag kevés, a mellékhatások súlyossága és gyakorisága viszont jelentős. Az egyre szélesebb körben alkalmazott gyógyszeres kezelés következményeként pedig egyre nő a forgalomban lévő hatóanyagokra rezisztens patogén gombák előfordulása. Mindezek alapján újabb gombaölő szerek kifejlesztése szükséges humán terápiás célra. 1.4.
A ciklusos lipodepszipeptidek Egy újabb pórusképző vegyület család a Pseudomonas syringae pv. syringae
által termelt ciklusos lipodepszipeptidek (CLP-k). A baktériumtörzs számos növényi betegségért tehető felelőssé [61- 66]. Toxinjai, a ciklusos lipodepszipeptidek azonban 19
növénykárosító hatásaik mellett jelentős gombaölő és baktérium ellenes hatással is rendelkeznek [65, 67-74], ami elsősorban a gombaellenes terápia számára teszi őket ígéretes
vegyületekké.
A
ciklusos
lipodepszipeptidek
tagjai
különböző
hatásspektrummal és hatáserősséggel rendelkeznek, amit eltérő szerkezetükkel lehet magyarázni. 1.4.1.
A ciklusos lipodepszipeptidek szerkezete A CLP-k szerkezetük szerint két nagy csoportra oszthatók, a syringomycineket
[26-28], a syringotoxint [75], a syringostatinokat [28] és a pseuodomycineket [76] tömörítő nonapeptidek, valamint a syringopeptinek családjára [77]. Mindkét csoportra igaz, hogy a toxin-molekulák egy poláros fejcsoportból és egy apoláris farok részből
Syringomycin E Ser CH3
(CH2)8
CH(OH)
CH2
CO
Dab+
Dab+ Arg+
Ser (4-Cl)Thr
Phe
(3-OH)Asp- Dhb
Syringotoxin
CH3 (CH2)10
CH(OH)
Dab+ CH2
CO
Gly
Hse Orn+
Ser (4-Cl)Thr
Thr
(3-OH)Asp- Dhb Syringopeptin-22A
Ser T hr
CH3
(CH2)6
CH(OH)
CH2
CO
A la
T y r Dab Dab+
1.6. ábra. Az általam vizsgált CLPk sematikus szerkezete
20
A la Val
+
állnak; de az apoláris egység mérete és a poláros rész töltése különböző. A nonapeptidek kilenc aminosavból álló poláros lakton gyűrűjéhez egy hidroxizsírsavlánc kapcsolódik. Az általunk vizsgált syringomycin E (1.6. ábra) három pozitív és egy negatív töltést tartalmazó lakton gyűrűjéhez egy 3-hidroxi-dodekánsav szénhidrogén lánc kapcsolódik. A syringotoxin szénhidrogén lánca két szén atommal hosszabb, fejcsoportja pedig eggyel kevesebb pozitív töltéssel rendelkezik, mint az SRE (1.6. ábra). A syringopeptinek esetében a fejcsoportot egy kisebb, csak nyolc aminosavból álló lakton gyűrű képezi, amit azonban egy nagy, jobbára apoláris aminosavból álló 14-17 tagú egység köt össze a hidroxi-zsírsavlánccal. A harmadik, általunk vizsgált CLP, a syringopeptin22A (1.6. ábra) nyolc aminosavból álló gyűrűje két pozitív töltést tartalmaz, amit egy 14 aminosavból álló apoláris jellegű egység köt össze a 3-hidroxi-dekánsav szénhidrogén lánccal. 1.4.2.
A ciklusos lipodepszipeptidek biológiai hatásai A CLP-k támadáspontja a sejtmembrán, hatásukra a membrán több funkciója,
úgy mint az iontranszport, a H+-ATP-áz aktivitás, a fehérjefoszforiláció megváltozik [65, 78]. Valószínűleg a CLP-k összes biológiai hatása arra vezethető vissza, hogy a membránon csatornát hoznak létre, amin keresztül az ionok többé-kevésbé szabadon áramolnak az extarcelluláris és az intracelluláris tér között [20, 22, 23]. Vörösvértesten és modell membránon az általunk vizsgált mindhárom CLP ioncsatornát hoz létre [20-24, 79-83], ám biológiai hatásaik különbözőek. A növénykárosító hatásért elsősorban a syringopeptineket teszik felelőssé, az SRE és az ST ebből a szempontból kevésbé hatékonynak bizonyult [61, 62]. Ugyanakkor az antimikróbás hatás hátterében valószínűleg inkább a syringomycinek állnak [61, 68]. A CLP-k hatástalannak bizonyultak a vizsgált Gram negatív baktériumokra nézve, míg a Gram pozitív baktériumok változó érzékenységet mutattak a SP-kkel szemben [61]. Minden vizsgált CLP gátolta a gombák növekedését, de a különböző gombafajok érzékenysége eltérő a különböző CLP származékokkal szemben [61, 68]. A kialakuló hatást a membrán lipidösszetétele, különösen szterol- és szfingolipid tartalma jelentősen befolyásolja [70, 84-86]. A membránlipidek szerepét a CLP-k hatásában modell membránon is igazolták. Dalla Serra és mtsai [23] megvizsgálták a CLP-k membrán-permeabilitást növelő hatását liposzómákon, és azt tapasztalták, hogy a permeabilitást növelő aktivitás függ a 21
liposzóma lipidösszetételétől. Az SRE és az ST szterol-mentes liposzómán csak enyhe, ezzel szemben a SP teljes permeabilitás növekedést okozott tiszta foszfatidilkolin liposzómán is [23]. Feigin és mtsai [79] BLM-en nyert eredményei szintén igazolták a szterolok szerepét az SRE pórusképző aktivitásában. Megállapították, hogy a koleszterin csökkenti az SRE csatornaképző aktivitását. Megállapították továbbá, hogy az SRE kétféle pórust hoz létre, nagyot és kicsit, és a nagy csatorna hat kis csatornából álló oligomer. A csatornák sugara 1 nm-nek adódott [21, 79, 87]. A ciklusos lipodepszipeptidek lízist idéztek elő vörösvértesten és dohány protoplaszton [22, 23, 61, 64, 68]. A lízis valószínűleg a szabad ionáramlás következtében kialakuló kolloid ozmotikus mechanizmus eredménye [22]. A CLP-nek a sejtek lízisét okozó hatására vonatkozóan az irodalmi adatok ellentmondásosak, ami feltehetően néhány, ma még nem pontosan ismert tényező következménye. Hutchinson és mtsai [22] dohány protoplaszton végzett vizsgálatai szerint a syringomycinek és a syringopeptinek egyforma hatáserősséggel rendelkeznek, ezzel szemben Iacobellis és mtsai [64] szerint a SP aktivitása a többszöröse a SR-ének. Dalla Serra és mtsai [23] összehasonlították a CLP-k hemolizáló hatását humán és nyúl vörös vértesten, az SRE-t találták a leghatékonyabbnak, a ST-t kevésbé aktívnak és a SP bizonyult a leggyengébbnek. Hutchinson és mtsai [22] megfigyelései szerint a SP lizáló képessége csak 85%-a volt a syringomycinének ló vörösvértesten. Ezzel szemben Lavermicocca és mtsai [61] arról számoltak be, hogy birka vvt-n a SP hemolizáló hatása a legerősebb, ennél gyengébb az SRE-é és a leggyengébb a ST aktivitása. Ez utóbbit Sorensen és mtsai [68] eredményei is alátámasztják. A ciklusos lipodepszipeptidek csatornaképző tulajdonságára vonatkozó további információk, ─ mint pl. a csatornaképzés hatékonysága, a csatornák élettartama ─, nyerhetők
vörösvértesten
végzett
transzport-kinetikai
vizsgálatokkal.
A
munkacsoportunk által korábban vizsgált SRE a transzport-kinetikai eredmények alapján pórust hozott létre vörösvértest membránon. Az SRE pórusképző aktivitása növekedett, amikor a membrán koleszterin tartalmát csökkent [80]. Az SRE pórusok 37 o
C-on és 20 oC-on inaktiválódtak, ám 8 oC-on stabilnak bizonyultak vörösvértest
membránon [81]. 37 oC-on 15 perc után, 20 oC-on 40 perc után inaktiválódtak az SRE csatornák [81]. BLM-en nyert eredmények is igazolták az SRE illetve az ST pórusok hőmérséklettől függő inaktivációját [81, 83], viszont az SP22A pórusok nem inaktiválódtak sem vvt-n, sem BLM-en [82]. Az SP22A és az ST ─ hasonlóan az SRE22
hez ─ kétféle csatornát hozott létre BLM-en, nagyot és kicsit [82, 83]. A nagy csatornák 5-6 kis csatornából álló oligomerek, melyek egyszerre nyílnak, ill. záródnak [82, 83]. Az antimikróbás terápia alapja a szelektív toxicitás: az alkalmazott gyógyszernek a kórokozót a gazdaszervezet károsítása nélkül kell elpusztítania. Erre a gombás fertőzések esetében még kevesebb lehetőség van, mint a baktérium fertőzések esetében, hiszen eukariota szervezeten belül kell a szintén eukariota gombákat elpusztítani, vagy legalább a szaporodásukat megakadályozni. A szelektív toxicitás érdekében szükség van arra, hogy a CLP-k és a sejtmembrán közötti molekuláris kölcsönhatásokat feltérképezzük. Ezáltal lehetőség nyílhat a humán terápia számára legmegfelelőbb CLP származék kiválasztására, illetve hasznos információt nyerhetünk a racionális hatóanyag tervezés számára. A CLP-k és a membránlipidek közötti molekuláris kölcsönhatások jól vizsgálhatók elektron spin rezonancia spektroszkópiai (ESR) módszerrel.
1.5.
Elektronspin rezonancia spektroszkópia Az elektronspin rezonancia spektroszkópia (ESR) olyan molekulák és azok
környezetének
vizsgálatára
alkalmas,
amelyek
párosítatlan
elektronspinnel
rendelkeznek. Ilyen természetes anyagok, pl. a sejtekben különböző okokból keletkező szabadgyökök, de léteznek szintetikusan előállított, un. spinjelölő molekulák is. A ma leggyakrabban alkalmazott spinjelölők általában egy nitroxid szabadgyököt (NO.), tartalmaznak, amit a jelölő másik alkalmas csoportjai térbelileg úgy takarnak, hogy csökkentsék a redox reakciók esélyét. Ezáltal az amúgy igen reaktív, és ezért rövid élettartamú szabadgyök reakcióképessége csökken, és így alkalmassá válik arra, hogy ESR módszerrel információt szerezhessünk a spinjelölő mozgási állapotáról és környezetének tulajdonságairól. A sejt- ill. modell membránba (liposzóma) spinjelölt zsirsavat juttatva vizsgálható a membrán fluiditása —azaz a lipidek mozgási és forgási szabadsága, irányítottságuk—, valamint a jelölő környezetének polaritása és mindezek változása a membrán lipidösszetételének és pl. a hozzáadott hatóanyag minőségének függvényében [88 - 8].
23
2. CÉLKITŰZÉSEK A Pseudomonas syringae pv. Syringae növényi kórokozó baktérium által termelt pórusképző toxinok a ciklusos lipodepszipeptidek (CLP-k). A CLP-k növénykárosító hatásaik mellett jelentős gombaölő és baktérium ellenes hatással is rendelkeznek [65, 67-74], ami elsősorban a gombaellenes terápia számára teszi őket ígéretes vegyületekké. A ciklusos lipodepszipeptidek tagjai különböző hatásspektrummal és hatáserősséggel rendelkeznek, amit eltérő szerkezetükkel lehet magyarázni. A szelektív toxicitás elérése érdekében szükséges a szerkezet és a funkció közötti kapcsolatok megismerése, a különböző
származékok
hatásainak
összehasonlító
vizsgálata.
A
legtöbbet
tanulmányozott CLP a syringomycin E (SRE). Munkacsoportunk korábbi eredményei szerint az SRE pórusokat hoz létre humán vörösvértesten (vvt) membránban, és a vvt-k egy részét hemolizálta. A több monomerből felépülő SRE csatornák 37 oC-on és 20 oCon időben inaktiválódtak, viszont 8 oC-on, a vvt membránlipidjeinek fő-fázisátalakulási hőmérséklete alatt, inaktiváció nem volt tapasztalható. A CLP-k szerkezete és hatása közötti összefüggések megismerése érdekében két másik CLP származék, a syringopeptin22A (SP22A) és a syringotoxin (ST) hatásait vizsgáltuk. Munkánk során célul tűztük ki: I.1.
a syringopeptin22A (SP22A) és a syringotoxin (ST) vörösvértest membránjára gyakorolt permeabilizáló hatásának tanulmányozását;
I.2.
a permeabilitás növekedés hőmérséklettől és koncentrációtól való függésének vizsgálatát;
I.3.
a pórusok inaktivációjának transzportkinetikai modell segítségével történő leírását;
I.4.
a CLP-k pórusképző tulajdonságainak
vizsgálatát,
különös
tekintettel a pórusok inaktivációjára, oligomerizációjára; A CLP-k molekuláris hatásmechanizmusának közelebbi megismerése érdekében liposzóma rendszereken tanulmányozni kívántuk: II.1.
a telített foszfolipideket tartalmazó kis unilamelláris (SUV) és multilamelláris (MLV) liposzómákon a CLP-k membránfluiditásra gyakorolt hatását;
24
II.2.
hogy milyen molekuláris dinamikai paraméterek változásai feleltethetők meg a membránfluditás változásának;
II.3.
a különböző CLP-k hatásait a szerkezeti hasonlóság és eltérés következményeként SUV rendszereken, valamint a hőmérséklet szerepét a CLP-k hatásában;
II.4.
hogy a membránlipidek zsírsavláncában jelenlévő telítetlen kötések, ill. a membrán koleszterin tartalma mennyiben módosítják a CLP-k liposzómákkal való kölcsönhatását;
II.5.
hogy CLP-k által kiváltott irreverzibilis fluiditás változás a lipid kettősréteg milyen strukturális változásának feleltethető meg.
25
3. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK
3.1.
Anyagok
3.1.1.
Anyagok humán vörösvértesten mért iontranszporthoz Vörösvértesten végzett iontranszport vizsgálatainkhoz egészséges donortól
származó, Na-citrát alvadásgátóval kezelt és felhasználás előtt legfeljebb négy napig tárolt humán vért használtunk. A vér mosásához, a hematokrit (H) beállításához és a CLP törzsoldatok hígításához mesterséges szérumot használtunk, aminek összetétele (mmol/l): 3.2 KCl, 138 NaCl, 1 CaCl2, 1 MgCl2, 27 glükóz, pH = 6,8-ra 3-(Nmorpholino)-propánszulfonsavval (MOPS) állítva. Iontranszport méréshez radioaktív nyomjelzőként 86Rb+ izotópot használtunk (genergia: 1,078 MeV). A rubídium ion a fiziológiás szempontból fontosabb kálium ion analógjának tekinthető. A
hemoglobin
(Hgb)
cianomethemoglobin
formájában
történő
spektrofotometriás méréséhez Quicklyser II reagenst és Cellpack puffer oldatot használtunk (Symex, Toa Medical Electronics). A Quicklyser II reagens összetétele (mmol/l): KCN: 846, Nitroprusszid-Na: 1,7; a Cellpack puffer oldat összetétele pedig (mmol/l): NaCl:109, Na-tetraborát: 1, Bórsav: 16, K2-EDTA 0,5. 3.1.2.
Anyagok ESR spektroszkópiai vizsgálatokhoz Liposzómák készítéséhez szintetikus dipalmitoil-foszfatidilkolint (DPPC),
dimirisztoil-foszfatidilkolint (DMPC), dioleil-foszfatidilkolint (DOPC), valamint L-atojáslecitint és koleszterint használtunk, melyeket a Sigma Chemical Co-tól szerezünk be, a vegyületek tisztasága legalább 99%-os volt. Liposzóma preparálásához foszfáttal pufferelt (pH = 7,4) izotóniás sóoldatot (PBS) használtunk. Az oldatot tablettából (Oxoid LTD, Hampshire, England) készítettük. Spinjelölőként 5-doxyl-, 7-doxyl-, és 12-doxyl-sztearinsav (ICN Biomedicals Inc Ohio), valamint 16-doxyl-sztearinsav (Sigma Chem. Co) és 4-(N,N-dimetil-N26
hexadecil)ammónium-2,2’,6,6’-tetrametilpiperidin-1-oxyl-jodid (Molecular Probes Inc., OR, USA) jelölőt használtunk. A lipidek oldásához analitikai tisztaságú etanolt, metanolt és kloroformot (Reanal, Magyarország) alkalmaztunk. 3.1.3.
Ciklikus lipodepszipeptidek A tisztított [90] ciklikus lipodepszipeptidek Dr. Jon Y. Takemoto professzortól
(Department of Biology, Utah State University, Logan, UT, USA) származnak. A CLPket –18 oC-on tároltuk, 10-3 mmol/l-es sósavban oldva törzsoldatokat készítettünk belőlük, melyek koncentrációja SRE esetén 2 mg/ml, SP22A és ST esetén 1 mg/ml volt. 3.2.
Módszerek
3.2.1.
Hemolízis meghatározása A CLP hozzáadása előtt (Ao) és meghatározott inkubációs idők után vett
vérminták vörösvértest koncentrációját (A), hematokrit értékét (Ho és H), a sejtek térfogatát (Vo és V) 16 paraméteres hematológiai automatával (COBAS MICROS OT 18, Roche, Franciaország) határoztuk meg. A vvt szuszpenzió paramétereit, így vvtszámát, hematokritját, vvt méreteloszlását és Hgb tartalmát, valamint a lízis mértékét a hematológiai automata segítségével határoztuk meg. A lízis mértékét a hatóanyag hozzáadása előtt és után mért vvt szám különbségéből számoltuk ki és %-os értékben adtuk meg. 3.2.2.
Iontranszport mérés humán vörösvértesten
3.2.2.1.
86
Rb+ passzív transzport
Adott mennyiségű vért 37 oC-on 1,5 órán keresztül 86Rb+-mal inkubáltuk (0,250,5 MBq/ml vér). Az inkubálás során a 86Rb+ aktív transzport révén a vvt intracelluláris (IC) terébe jutott. Centrifugálás és a felülúszó eltávolítása után az EC térben maradt 86
Rb+ eltávolítása érdekében a vörösvértesteket háromszor mostuk mesterséges
szérumoldatban, majd ugyanebbe az oldatba szuszpendáltuk a vörösvértesteket, hogy a hematokrit (H) 0,4-0,5 legyen. A mosást az EC térben maradt
27
86
Rb+ kontamináció
eltávolítása mellett az is indokolta, hogy elkerüljük a CLP-k és a szérumfehérjék közötti esetleges kölcsönhatásokat. A megfelelően gyors és hatékony keverés érdekében a CLP törzsoldat adott mennyiségét (100-1000 ml) felhígítottuk mesterséges szérumoldattal (5-6 ml) oldattal és az így nyert oldatot gondosan összekevertük a vér adott mennyiségével (12-16 ml). Ezután a hematokrit érték 0,3-0,4 volt. A hatóanyag koncentráció ST esetében 2x1061.3´107 molekula/vvt (39.4-256.3 mg/ml vvt), SP22A estében pedig 4x105-1´108 molekula/vvt (17-4300 mg/ml vvt) volt. A CLP-vel kezelt vér-szuszpenziót óvatos keverés közben adott hőmérsékleten, o
37 C, 20 oC, vagy 8 oC-on inkubáltuk. A szuszpenzióból adott időközönként mintát vettünk és a vvt-ket centrifugálással elkülönítettük az EC folyadéktól. A felülúszó aktivitását szcintillációs számláló (Gamma Művek, Magyarország) segítségével határoztuk meg. A felülúszó aktivitása arányos a vörösvértestekből az EC térbe transzportálódott 86Rb+ mennyiséggel, így mérése alkalmas a transzport jellemzésére. A t idő alatt kiáramlott
86
Rb+ mennyiséget (Nt) a szuszpenzió teljes
86
Rb+
tartalmának százalékában fejeztük ki [(1 ml vér EC terének aktivitása)/(1 ml vér aktivitása)´100]. A kiáramlás az izotópkoncentráció kiegyenlítődésének irányába megy végbe, egyensúly esetén az extracelluláris
86
Rb+ százalékos mennyiségét N∞-nek
jelöljük. H hematokrit esetén az extracelluláris tér térfogata 1-H, az intracellurális tér víztérfogata pedig 0,68´H; ugyanis a vörösvértest térfogatának ~ 32%-át a hemoglobin térfogata teszi ki. Egyensúlyi ioneloszlásnál az extracelluláris és intracelluláris
86
Rb+
86
Rb+
koncentráció megegyezik: cEC= cIC, így N ¥ / 100 1 - N ¥ / 100 = . 1- H 0.68 H
A fenti egyenlet átrendezése után N∞ az: N¥ =
1- H ´ 100 1 - 0.32 H
képlet segítségével számolható. A t = 0 időben kontamináció és lízis következtében az EC térben lévő százalékos mennyiségét No-lal jelöltük [40].
28
3.2.2.2.
Hemoglobin transzport
A vörösvértestekből kiáramlott hemoglobin mennyiségének meghatározásához a mintákat lecentrifugáltuk és a felülúszó hemoglobin koncentrációját hematológiai automata segítségével meghatároztuk. A 1,3 mmol/l-nél kisebb Hgb koncentrációk mérését az automata érzékenysége nem tette lehetővé, ezért az ennél kisebb koncentrációk meghatározásához az automata mérési eljárásával analóg módszert alkalmaztunk. A felülúszóból vett mintát Sysmex Microcellcounter F-800 (Japán) félautomata által használt Cellpack oldattal hígítottuk, majd a Hgb-t a félautomata Quicksilver II reagens oldatának 2-3 cseppjével cián-methemoglobinná alakítottuk. Az oldatok cián-methemoglobin koncentrációval arányos optikai denzitását 545 nm-nél spektrofotometriai
módszerrel
mértük
(Perkin-Elmer-Lamda
UV-VIS
spektrofotométer). A minták Hgb koncentrációját a COBAS MICROS OT hematológiai automata standard művér szuszpenzió segítségével készített kalibrációs egyenesről olvastuk le. 3.2.2.3.
Permeabilitási együttható
A permeabilitási együtthatót a (pórusoknak megfelelő)
86
Rb+ transzport
sebességi állandójából (kp) számoltuk [91] p=
k pVICVEC
S (VIC + VEC )
összefüggés segítségével, ahol VEC: 1 ml vvt szuszpenzió EC térfogata, VIC: 1 ml szuszpenzióban a sejtek IC víztérfogata (VIC= A´0,68´V, ahol A az 1 ml szuszpenzióban lévő sejtek száma, V pedig egy vvt átlagos térfogata) S: a membrán felülete (A´ egy vvt átlagos felülete: 1,37´10-6 cm2 [92]).
3.2.3.
Kinetikai modell a transzportfolyamatok leírására A CLP-k hatására bekövetkező
86
Rb+-efflux adatainak kiértékelésére kinetikai
modellt dolgoztunk ki. A modellben figyelembe vettük, hogy a transzport két úton 29
valósul meg, egyrészt a CLP csatornákon, másrészt a csatornamentes (módosítatlan) membránfelületen keresztül. Mivel a 86Rb+-transzport a CLP pórusokon és a kezeletlen membránfelületen keresztül is passzív diffúzióval valósul meg, ezért mindkét folyamatot elsőrendű kinetika írja le. Ebből következően a vvt membránon történő teljes 86
Rb+ kiáramlás elsőrendű kompetitív kinetikával írható le, melyet a kp és knm sebességi
állandókkal jellemezhetünk. kp a pórusokon keresztül történő, knm pedig a módosítatlan membránfelületen keresztül folyó transzport sebességi állandója. A modellben végtelenül gyors csatornaképződést tételeztünk fel. (Ezt a feltevésünket alátámasztotta az a kísérleti eredmény, hogy az első mérési pontig (2 perc), biztosan befejeződött a CLP csatornák képződése, mivel a 8 oC hőmérsékleten mért transzport-adatokra féllogaritmikus ábrázolásban egyenest tudtunk illeszteni, azaz a transzportot egyetlen elsőrendű kinetikájú folyamattal jellemezhettük.) 8
o
C hőmérsékleten a további
pórusképződés kizárható, ennek alapján feltételezzük, hogy magasabb hőmérsékleteken is elhanyagolható az inkubáció folyamán a további pórusképződés. Feltételeztük, hogy az inaktivációs folyamat elsőrendű kinetikát követ, amit a kinact sebességi állandóval vagy az abból számolt átlagos pórus élettartammal, tinact = 1/kinact jellemezhetünk. Feltételeztük továbbá, hogy a csatornák inaktivációja után, az azoknak megfelelő membránrész a kezeletlen membránnal azonos permeabilitású lesz. Ezt az elképzelést alátámasztja az a tapasztalat, hogy hosszú mérési idő után (t >> tinact) a 20- és 37 oC-on a kezelt vvt-ken mért transzportgörbék meredeksége hasonló a kontrolléhoz (4.5. ábra). A pórusok és a kezeletlen membrán hozzájárulását a teljes effluxhoz két hatáskeresztmetszettel (xp és xnm) jellemeztük, ahol xp a pórusokoz tartozó, xnm pedig a kezeletlen membránhoz tartozó hatáskeresztmetszet. xp és xnm összege minden pillanatban 1 (egy). Feltételeztük, hogy a t = 0 pillanatban keletkezett csatornák aránya, amit xpo-lal jelölünk, az inaktiváció következtében, t = ∞-nél, xp∞-re csökken. A fentiek alapján xp és xnm hatáskeresztmetszetek időbeli változása a következőképpen írható le: x p = x p¥ + ( x po - x p¥ ) × exp( - kinact × t )
és
(1)
xnm=1-xp. A vvt-k intracelluláris terében lévő 86Rb+ mennyisége t időpillanatban NIC(t). A
86
Rb+ efflux sebességére (dNIC(t)/dt) felírható, hogy:
30
dN IC ( t ) dt
µ - x p k p N IC ( t ) - xnm knm N IC ( t )
(2)
ahol az arányosság jobb oldalának első része a sejtekből az EC térbe a pórusokon keresztül folyó transzportot, második része pedig a kezeletlen membránon keresztül történő transzportot írja le. Az EC tér felé történő igaz, hogy dNt/dt=-dNICt/dt, ahol Nt a
86
86
Rb+ fluxus sebességére
Rb+ mennyisége az extracelluláris térben.
Mindezek alapján az (1)-es és (2)-es egyenlet segítségével Nt-t ki tudjuk fejezni: ì [1-exp(-kinact t)]ùü é Nt = No + (N¥ - No ) × í1- exp(- (knm + (k p - knm )× xp¥ )× t)× expê- (k p - knm )× (x po - x p¥ )× úý kinact ë ûþ î
(3)
A fenti egyenlet nem szeparábilis xp- és xnm-re, azaz nem bontható fel két olyan független megoldásra, amelyek leírnák külön a pórusokon és külön a kezeletlen membránon keresztül történő transzportot. A (3)-as egyenlet megoldására nemlineáris regressziót alkalmaztunk. A modell segítségével kiszámoltuk a mérési adatokhoz illeszkedő görbék paramétereit, így meghatároztuk a kp és knm sebességi állandókat, az xp és xnm értékeket, valamint a kinakt inaktivációs sebességi állandót. A kísérleti adatokhoz a görbéket a modell alapján, Excel-táblázatkezelőben Visual Basic makró segítségével illesztettük. Az „Eredmények”-ben a kísérleti pontokhoz rajzolt görbék az illesztések eredményei. 3.2.4.
ESR spektroszkópiai vizsgálatok
3.2.4.1.
Spinjelölt zsírsavszármazékok alkalmazása membránok vizsgálatára
A nitroxid szabadgyökök felfedezése után viszonylag hamar, a spinjelölt zsírsavszármazékok
a
biológiai-
és
modell
membránokra
vonatkozó
ESR
spektroszkópiai vizsgálatok egyik fontos monitor-molekulájává váltak [88]. A 3.1. ábrán a doxyl-csoportot tartalmazó sztearinsav szerkezetét mutatom be. A
spin-jelölt
alkalmazzák
a
sztearinsav
különböző
ESR
mellett,
a
palmitoil-sztearoil-foszfatidil-kolint
spektroszkópiai
vizsgálatokban
a
membrán
fluiditásának-, permeabilitásának- és polaritásának tanulmányozására. A 3.1. ábrán látható doxyl-csoportot tartalmazó zsírsavszármazékok használata a legelterjedtebb a 31
doxyl-csoport CH 3 CH
3
2p-pálya zsírsav-lánc
O
N C
CH3
(CH2)m
O
(CH2)n
COOH
3.1. ábra. A spinjelölt zsírsav sematikus szerkezete
membránrendszerek ESR spektroszkópiájában. A szénhidrogénlánc teljes hossza (m+n+2), legtöbbször megfelel a sztearinsavnak. A doxyl-csoport poziciójának változtatásával lehetőség van a membrán teljes keresztmetszetében a molekuláris változások tanulmányozására. Az általánosan használt spinjelölt zsírsavak közül az 5doxyl-, a 7-doxyl-, a 12-doxyl- és a 16-doxyl-sztearinsav kapható kereskedelemben is. A sorozat tagjai közül a doxyl-csoport az 5-doxyl-sztearinsavban van a hidrofil fejcsoporthoz a legközelebb. Az úgynevezett fejcsoporton jelölt nitroxid-származékok esetében a nitroxid-csoport poláros karakterű, pl. ammónium-származék, s így segítségükkel a membrán legkülső régióját tanulmányozhatjuk. Munkámban a 4-(N,Ndimetil-N-hexadecil)ammónium-2,2’,6,6’-tetrametilpiperidin-1-oxyl-jodid
(HXD)-t
használtam.
Spinjelölt zsírsav
3.8. ábra. Spinjelölt membrán sematikus rajza
3.2.4.2.
Permeabilitás vizsgálata ESR-spektroszkópiai módszerrel
ESR módszer segítségével lehetőség nyílik bizonyos molekulák membránon keresztül folyó transzportjának tanulmányozására is, és ezen keresztül csatornák kimutatására [93, 94]. Az egyik leggyakrabban alkalmazott módszer az aszkorbinsavval 32
történő redukció megfigyelése [95, 8]. Az aszkorbinsav jó redukálószer lévén képes redukálni a nitroxid gyököt, feltéve, hogy az aszkorbinsav számára hozzáférhető helyen található. A redukció során megszűnik az a párosítatlan paramágneses elektron, aminek a jelét ESR spektroszkópiai úton detektálni tudjuk. Az ESR jel amplitudójának csökkenéséből következtetni lehet a redukció mértékére. A membránon keresztül végbemenő diffúzió nyomon követhető ESR spektroszkópiai módszerrel, pl. HXD jelölő segítségével. Ebben az esetben a spinjelölő molekula egyik része a membránba ágyazódik, azonban a gyököt tartalmazó része a vizes fázisba kerül, így a szintén vizes fázisban jelenlévő aszkorbinsav redukálni képes, ami az ESR jel eltűnéséhez vezet. Az ESR jel amplitudójának időbeli változása a redukció kinetikájával arányos. A HXD jelölő a membrán külső és belső felébe egyaránt beépül. Az aszkorbinsavas kezelést követően a membrán külső részében lévő spinjelölő pillanatszerűen redukálódik, a belső felében lévő jelölőmolekulák viszont addig érintetlenek, amíg az aszkorbinsav át nem jut a membránon. Az aszkorbinsav membránon keresztüli diffúziójával csökken az ESR jel amplitudója, így az amplitudó időbeli változása megfelel az aszkorbinsav transzportgörbéjének. 3.2.4.3.
Kisméretű unilamelláris liposzóma preparálása és kezelése CLP-kel
Különböző lipid-összetételű kisméretű unilamelláris liposzómákat (SUV, átmérő: 20-80 mm) készítettünk. A megfelelő lipid, ill. lipidkeverék 10 mg-ját kerekített aljú ~4 ml-es üvegcsébe mértük. A lipidet szerves oldószerben oldottuk és hozzáadtunk az adott spin jelölő etanolos, ill. kloroformos törzsoldatából annyit, hogy a lipid/jelölő mól aránya maximálisan 100/2 legyen. A lipideket oldékonyságuknak megfelelően etanolban, kloroformban, vagy kloroform/metanol 9/1 térfogatarányú elegyében oldottuk. Folytonos forgatás közben nitrogén gázáram alatt elpárologtattuk a szerves oldószert, vékony, egyenletes lipidfilmet alakítva ki az üvegcse falán. A lipidfilmet 30 percig vákuum alatt tartottuk, majd egy éjszakára ekszikkátorba helyeztük, hogy az oldószer maradványát eltávolítsuk. Ezt követően a filmet 50ml PBS oldattal hidráltuk, majd 50 oC-os vízfürdőn, illetve az adott lipid fő fázisátalakulási hőmérséklete fölött, apránként összesen 1 ml PBS-ben felszedtük a lipidfilmet, kémcső rázatóval (vortex) elősegítve a lipid leválását a falról. Ezután a lipiddiszperziót UH készülékkel (Sonyprep
33
150 MSE) kétszer 10 percig besugároztuk (frekvencia: 20 kHz, hullámamplitúdó: 8 mm), hogy kisméretű unilamelláris liposzómákat kapjunk. A CLP törzsoldat adott mennyiségét (1- 14ml) 50 ml liposzómához adtuk, a membrán lipid/CLP mól arány 50/1-200/1 volt. A liposzómát pipettával, többszöri felszívás-kifúvás segítségével a hatóanyag törzsoldatával gondosan összekevertük. A SUV-okat szobahőn, 0 oC-on, vagy 37 oC-on kezeltük a CLP-kel, és a mintákat kezelés hőmérsékletén tartottuk az ESR spektroszkópba való helyezésükig. A CLP-k hőmérséklettől függő hatásának vizsgálatára két eljárást, a hideg protokollt, valamint a meleg protokollt alkalmaztuk. A hideg protokoll esetében a liposzóma mintát 0 oC-on kezeltük az adott toxinnal, majd a hőmérsékletet lépésenként emeltük és regisztráltuk az ESR spektrumokat. Az elő-fáziátalakulási hőmérséklet közelében a melegítést befejeztük és a mintát egy lépésben visszahűtöttük 2 oC-ra, majd újra lépésenként felmelegítettük a fő-fáziátalakulási hőmérséklet fölé. A meleg protokoll esetében a kezelést 37 oC-on végeztük, a mérést a fő-fázisátalakulási hőmérséklett fölötti hőmérsékleten kezdtük, majd erről a hőmérsékletről a mintát lépésekben 2 oC-ig hűtöttük és közben fölvettük az ESR spektrumokat. Ezután a mintát lépésenként újra felmelegítettük és a spektrumokat regisztráltuk. 3.2.4.4.
Multilamelláris liposzóma preparálása és kezelése CLP-kel
Multilamelláris liposzómát (MLV) rázatásos módszerrel állítottunk elő. A lipidfilm készítése a SUV preparálással megegyező módon történt, azonban a hidrálást és az oldószerben való diszpergálást összesen 50 ml PBS-sel végeztük. A lipiddiszperziót 50 oC-os vízfürdőn rázógéppel 20 percig rázattuk, majd a diszperzió 10 ml-ét 15 ml CLP törzsoldattal kevertük össze, és 25 oC-on 20 percig rázattuk. 3.2.4.5.
Mérés ESR spektroszkóppal
A minta 20 ml-ét kvarc kapillárisba tettük, és egy speciális mintatartó segítségével az ESR spektroszkóp mérő üregében centráltuk. A minta hőmérsékletének mérésére és szabályozására egy ultravékony termoelemet használtunk, amit közvetlenül a mintába helyeztünk, a rezonátor közepétől mintegy 15 mm-re. A minta hőmérsékletét egy
speciális,
zárt
rendszerű,
nitrogén
átáramoltatással
hőmérsékletszabályozóval változtattuk 2 oC-tól 50 oC-ig, 0,1 oC pontossággal. 34
működő
Az ESR spektrumokat egy Bruker-EMX-6 on-line , X-sávú (9-10 GHz) spektrométerrel regisztráltuk. Az alkalmazott spinjelölőtől és hőmérséklettől függően a modulációs frekvencia 100 kHz, a modulációs amplitúdó 0,3-2,0 Gauss (G) volt. 5-20 mW mikrohullámú teljesítmény mellett, 100 G-os ablakban, 5 perces felvételi idő (81 ms/pont) és maximálisan 5,12 ms-os időállandót alkalmazva 1024, vagy 2048 pontban vettük fel a spektrumot az adott hőmérsékleten. A CLP csatornák kimutatására irányuló kinetikai méréseknél a liposzóma mintákhoz jeges vízfürdőn aszkorbinsav vizes oldatát adtuk, úgy, hogy annak végkoncentrációja 10 mmol/l legyen. Az ESR spektrum középső csúcsának amplitudóját „time-sweep” üzemmódban folyamatosan regisztráltuk 31
o
C-on.
Paraméterek: modulációs amplitúdó 2,5 G; konverziós idő: 163ms/pont; időállandó: 10,24 ms; mikrohullámú teljesítmény: 20 mW.
3.2.4.6.
ESR spektrumok kiértékelése
A membránfluiditás jellemzésére három paramétert használtunk: a 2Amax külső csatolási állandót, valamint az „f” és a „k” paramétert. 5-doxyl-, 7-doxyl-sztearinsav jelölők esetén, ill. 12-doxyl-szteraninsavnál 2 oC – 25 oC hőmérséklet-tartományban a 2Amax külső csatolási állandót használtuk (3.1. ábra). A 2Amax külső csatolási állandó az ábrán látható spektrum két legtávolabbi csúcsa közötti távolság. 25 oC hőmérséklet fölött 12-doxyl-sztearinsav jelölő esetén a 2Amax csatolási állandó az ESR spektrumról nem volt leolvasható, ilyenkor a membrán fluiditását az SL-12 esetén az f paraméterrel (f =
H -1 ) jellemeztük, ahol H-1 a magasterű csúcs, H0 pedig a középső csúcs. 16H0
doxyl-sztearinsav esetén az alacsonyterű csúcs (h+1) és a középső csúcs (ho) amplitudóinak hányadosával, a „k” paraméterrel ( k = fluiditását (3.9. ábra).
35
H +1 ) jellemeztük a membrán H0
B
2Amax
A
h+1
ho
h-1
3.9. ábra. A.) A külső csatolási állandó definiciója; B.) Spektrumkiértékeléshez használt adatok 12-doxyl- és 16-doxyl-sztearinsav jelölőt használva
3.2.4.7.
ESR spektrumszimuláció
Az ESR spektrumok szimulációját J. H. Freed és csoportja által kifejlesztett NLLS (nonlinear least-squares) programmal végeztük [96-99]. A program segítségével meghatározhatók a rotációs tenzor komponensei és az irányító pontenciál együtthatói. A spektrumszimulációk során azt az általánosan elfogadott megszorítást alkalmaztuk, hogy a spinjelölt sztearinsav rotációja két mennyiséggel írható le: a párhuzamos (Rpll) és
e20
Rpll
e22
Rprp
3.10. ábra. A forgási tenzor és az irányítási potenciál-tagok
36
a merőleges rotációs diffúziós állandó (Rprp) segítségével (3.2. ábra). Előzetes szimulációk tapasztalatai alapján megállapítottuk, hogy a mért és a szimulált spektrum között jó egyezés érhető el, ha az irányító potenciál-függvény sorának az első ( e 02 ), és ha szükséges a második ( e 22 ) tagját vesszük figyelembe (3.10. ábra). Ebben az esetben a fluiditás jellemzésére két paraméter alkalmazható, az S20 és az S22 rendparaméterek, amik az e 02 , ill. az e 22 együtthatók alapján számolhatók. Szemléletesen a két rendparaméter jelentése a következő: az S20 megmutatja a molekuláknak a membrán normál-vektorához viszonyított rendezettségét. (A membrán normálvektora a membrán minden pontjában merőleges a membrán felületére.) Az S22 paraméter azt írja le, hogy mekkora a fő irányítottsági tengelyre merőleges síkban a forgási szimmetriától való eltérés. A szimulációknál használt mágneses paramétereket az irodalomban található korábbi szimulációs munkáknak [96, 99] megfelelően választottuk. Ezek mind az SL-5, mind az SL-7 esetében következők voltak: gxx = 2.0090, gyy = 2.0061, gzz = 2.0026 and Axx = 6.34 G, Ayy = 5.81, Azz = 33.1 G. 3.2.5.
Dinamikus fényszórásmérés A kis unilamelláris liposzómák méreteloszlását dinamikus fényszórás méréssel
(DLS) határoztuk meg ALV Goniométer segítségével. A fényszórásmérő sugárforrása 632,8 nm-en 10 mW teljesítménnyel működő Spectrophysics 124B He-Ne lézer volt. A liposzóma mintákat a méréshez PBS-sel hígítottuk 2-10-szeresére.
37
4. EREDMÉNYEK Munkacsoportunk korábban megvizsgálta a syringomycin E pórusképző tulajdonságait humán vörösvértest membránon, különböző hőmérsékleteken [80, 81]. Annak érdekében, hogy megismerjük a két másik CLP származék, SP22A és az ST pórusképző tulajdonságait és információt szerezzünk a CLP-k szerkezete és funkciója közötti összefüggésekről, megvizsgáltuk az SP22A és az SRE vvt membránra gyakorolt hatását transzport kinetikai módszerrel. 4.1.
A Syringopeptin22A humán vörösvértest membránra kifejtett hatásai
4.1.1.
Hemolizáló hatás Humán vörösvértesten az SP22A a vörösvértestek (vvt) egy részének
hemolízisét okozta 2´106 molekula/sejt koncentráció fölött. A 4.1. ábrán a 37 oC-on, 2x107 molekula/sejt koncentrációban alkalmazott SP22A által okozott hemolízis időbeli változását mutatom be. A hemolízis mértéke 10-15 percig növekedett, ezután állandó értéken maradt. Az ábrán feltüntetett adatok két független kísérlet átlageredményei. Az SP22A hatására a vörösvértestek átlagos térfogata is megnőtt, 92±1 fl-ről 117±1 fl-re.
hemolízis %
24 22 20 18 16 14 12 10 8 6 4 0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
t(min)
4.1. ábra. Vvt hemolízis kinetikája SP22A hatására
38
4.1.2.
Az ionpermeabilitást növelő hatás Bár az SP22A hemolizáló hatása csak 2´106 molekula/sejt koncentráció felett
volt megfigyelhető, az SP22A membrán-permeabilitást növelő hatása már ennél alacsonyabb koncentrációnál is megjelent (4.2. ábra). A vörösvértestekből az extracelluláris (EC) térbe áramlott
86
Rb+ mennyiségét (Nt%) ábrázoltuk az idő
függvényben különböző hatóanyag koncentráció mellett. A kontroll, módosítatlan vvtből (d. görbe) a 86Rb+ kis sebességű, passzív diffúziót mutatott. A toxin hozzáadása után jelentősen megnőtt a vörösvértestekből kiáramló
86
Rb+ nyomjelző mennyisége (a. - c.
görbék). A transzport görbék az extracelluláris (EC) és intracelluláris (IC) tér közötti egyensúlyi
86
Rb+ koncentrációnak megfelelő érték (N¥) felé tartottak. 1,1´106
molekula/sejt koncentrációnál a kiáramlott nyomjelző mennyisége 20 perc után gyakorlatilag elérte, 7,2´105 molekula/sejt koncentrációnál a mérési időn belül megközelítette az egyensúlyi 86Rb+ eloszlásnak megfelelő értéket.
Nt (%) a
N¥
b
60
40
c
20
d 0 0
20
40
60
80
100
120
140
t(min) 4.2. ábra. 86Rb+ kiáramlás SP22A hatására vvt-ből. Az SP22A-t t = 0 időben adtuk a vérhez, a kísérletet 37 oC-on végeztük. Az alkalmazott SP22A koncentráció (molekula/sejt): a.) 1,1´106; b.) 7,2´105; c.) 4´105 és d.) 0 volt
39
86
A
Rb+ efflux értékeket féllogaritmikus koordináta rendszerben ábrázolva
látható, hogy a transzport-adatokra egyenes illeszthető, ami megfelel a radioaktív jelölő
-ln(1-Nt/N¥)
szabad diffúzióját jellemző elsőrendű kinetikának (4.3. ábra).
3
2
1
0
40
80
120
min
4.3. ábra. A 4.2. ábra mérési adatai féllogaritmikus ábrázolásmódban
A 4.1. táblázatban foglaltam össze a
86
Rb+ transzport sebességi állandóit, (kp),
amik a 4.3. ábra egyeneseire meghatározott meredekségeknek felelnek meg. A kp sebességi állandó segítségével meghatároztuk a vvt membrán
86
Rb+-ra vonatkozó
permeabilitási állandót (p) (4.1. táblázat) [91].
4.1. Táblázat. A 86Rb+ transzport sebességi állandói és a permeabilitási állandók SP22A koncentráció
kp [1/min]
p [cm/s]
1,1´106
0,1216
6,77´10-8
7,5´105
0,0319
2,0´10-8
4,0´105
0,0042
2,13´10-9
(molekula/sejt)
Kooperatív folyamatok esetén a Hill-féle ábrázolás [100] lehetőséget nyújt a folyamatban résztvevő alegységek számának meghatározására is. A permeabilitási állandónak a koncentráció függvényében való Hill-féle ábrázolása egyenest adott, aminek meredeksége 37 oC-on 3,44; a nem 37 oC-on végzett kísérletek is figyelembe véve a Hill-együttható értékére 3±1 adódott. Ez azt mutatja, hogy a permeabilitás a 40
koncentrációnak mintegy harmadik hatványával arányos, ami arra utal, hogy az SP22A által
indukált
csatorna-képződés
oligomerizációs
folyamat,
és
egy
csatorna
felépítésében 2-4 monomer vesz részt (4.4. ábra). lg pRb -6.5
-7.0
-7.5
-8.0
-8.5
-9.0 5.6
5.8
6.0
6.2
6.4
lg c
4.4. ábra. A vvt membrán 86Rb+-ra vonatkozó permeabilitási állandójának függése az alkalmazott koncentrációtól 37 oC-on
4.2.
Syringotoxin hatása humán vörösvértest membránra
4.2.1.
Hemolizáló hatás A syringotoxin emberi vörösvértestre gyakorolt hemolizáló hatását 2´106-
1,3´107 molekula/vvt koncentráció tartományban vizsgáltuk 8 oC, 20 oC, és 37 oC-on. A vizsgált koncentráció tartományban a syringotoxin kismértékű, 6% alatti hemolízist okozott. 4.2.2.
A permeabilitást növelő hatás
4.2.2.1.
86
Rb+-transzport
6´106 molekula-ST/vvt koncentráció fölött a vvt-k koncentrációtól függő mértékben megnövekedett permeabilitást mutattak 86Rb+-ra és hemoglobinra nézve (4.5. és 4.6. ábra). A
86
Rb+ nyomjelző kiáramlásának sebessége jelentősen, az alkalmazott
toxin koncentrációtól függő mértékben nőtt az ST hozzáadása után. Jóllehet a 41
86
Rb+
kiáramlás a kontroll vvt-hez képest kezdetben rendkívül gyors volt, 10-20 perccel később a transzport látszólagos telítésbe ment jóval az extracelluláris és intracelluláris tér közötti, egyensúlyi 86Rb+ eloszlásnak megfelelő érték (N¥) elérése előtt.
Nt% 80
N¥
60
a b
40
20 c 0 0
20
40
60
80
100
120
140
160 min
4.5. ábra. Syringotoxin hatása 86Rb+-effluxra humán vörösvértesten 20 oC hőmérsékleten. A vvt szuszpenzióhoz t = 0 időben adtuk a syringotoxint. Az ST koncentráció (molekula/sejt): a.) 1´107; b.) 7,2´106; és c.) 0
4.2.2.2.
Hemoglobin transzport
Vörösvértesten végzett kísérleteink során a syringotoxin hatására hemoglobin (Hgb) kiáramlást is tapasztaltunk (4.6. ábra), ahogy az várható volt. Korábban az SRE és az SP22A pórusok sugara is kb 1 nm-nek adódott [87], a három molekula hasonlósága alapján feltételezzük, hogy az ST csatornák sugara is kb 1 nm, amin kereztül a hemoglobin monomer formában képes kijutni az extracelluláris térbe [83]. A ST hozzáadása után az extracelluláris tér Hgb-tartalma gyorsan emelkedett, majd — hasonlóan a
86
Rb+ transzporthoz — messze az EC- és intracelluláris tér közötti
egyensúlyi Hgb eloszlásnak megfelelő értéktől (100%), a transzport látszólagos telítést ért el. 42
a
Hgb% 30
b 20
10
0
0
20
40
60
80
100
120
140
160 min
4.6. ábra. Syringotoxin hatása a hemoglobin transzportra humán vörösvértesten. A vvt szuszpenzióhoz t=0 időben adtuk a syringotoxint. Az ST koncentráció (molekula/sejt): a.) 1´107; b.) 7,2´106 volt; a hőmérséklet 20 oC volt
4.2.3.
A hőmérséklet szerepe a syringotoxin permeabilitást növelő hatásában A syringotoxin által kiváltott
hőmérsékleteken
vizsgáltuk.
86
Rb+- és hemoglobin-transzportot különböző
Méréseinket
testhőmérsékleten
(37
o
C-on),
szobahőmérsékleten (20 oC-on), valamint 8 oC-on végeztük. Ez utóbbi hőmérséklet a vvt membrán főbb lipid komponenseinek fázisátalakulási hőmérséklete alatt van. Eredményeinket a 4.7. és 4.8. ábra mutatjuk be. ST hatására 37 oC-on a 86Rb+ transzport hasonló kinetikát mutatott, mint 20 oC-on, azaz a kezdeti nagy kiáramlási sebesség távol az egyensúlyi izotópeloszlás értékétől (N∞) lecsökkent a módosítatlan vvt membránon keresztüli
86
Rb+ transzportot jellemző értékre. Feltűnő, hogy az efflux mértéke a
transzport mérés egész időtartama alatt 37 oC-on kisebb volt, mint 20 oC-on, annak ellenére, hogy az alkalmazott toxin koncentráció az első esetben nagyobb volt (4.8. ábra). Ezzel szemben 8 oC-on a transzport görbe már 60 perccel a toxin hozzáadása után megközelítette az egyensúlyi izotópeloszlásnak megfelelő értéket. A hemoglobin 43
kiáramlás 20 oC- és 37 oC-on hasonló jellegű transzport-kinetikai görbét eredményezett (4.8. ábra), mint a 20 oC, ill. 37 oC-on mért 86Rb+ efflux. 8 oC-on a Hgb transzport mérés első 20 percében a kiáramlott Hgb értéke 4% alatt volt, ami kevesebb, mint a mért hemolízis alapján elvárt extracelluláris Hgb értéke. Ezt a megfigyelést a Hgb vvt membránhoz való adszorpciójának tulajdonítottuk. (Ezért a 4.8. ábrán látható 8 oC-os transzport adatokhoz nem a modellel illesztettük a görbét.)
Nt% 80
N¥
o
8C 60
20oC 37oC
40 20
kontroll 0 0
20
40
60
80
100
120
140
min
4.7. ábra. Syringotoxin által kiváltott 86Rb+ efflux. A ST koncentráció a 8 oC-on végzett mérés esetén 1,28´107, a 20 oC-osnál 1´107, a 37 oC-osnál pedig 1,27´107 molekula/sejt;a kontroll vvt-k 86Rb+ kiáramlására vonatkozó görbét 37 oC-on mértük
A fenti eredmények azt sugallták, hogy az ST csatornák, hasonlóan a munkacsoport által korábban vizsgált SRE-hez, 20 oC-és 37 oC-on inaktiválódtak, 8 oCon azonban, a membrán fő lipidkomponenseinek fáziátalakulási hőmérséklete alatt nem inaktiválódtak. A transzport adatokat féllogaritmikus ábrázolásmódban is feltüntettük (4.9. ábra), az ábrából látható, hogy a 8 oC-os mérési adatokra jó közelítéssel egyenes illeszthető, ami a passzív diffúziót leíró, elsőrendű kinetikának felel meg. Ezzel szemben a 20 oC és 37 oC-ra vonatkozó transzport adatokra nem illeszthető egyetlen
44
egyenes, ami arra utalhat, hogy a ST pórusok inaktiválódtak. Az inaktiváció sebessége 37 oC-on nyilvávalóan nagyobb, mint 20 oC-on.
Hgb% 35
o
20 C
30 25 o
20
37 C
15 o
8C
10 5 0 0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100 110
min
4.8. ábra. Syringotoxin által kiváltott Hgb efflux vörösvértesten különböző hőmérsékleteken. ST koncentrációk: 8 oC-on 1,28´107; 20 oC -on 1´107; 37 oC-on 1,27´107 molekula/sejt
8 oC
-ln(1-Nt/N¥)
2
20 oC
1 37 oC
kontroll 0 0
40
80
120
4.9. ábra. A 4.7. ábra adatai féllogaritmikus ábrázolásmódban
45
min
4.2.4.
Kinetikai modell A
86
Rb+-transzport leírására kinetikai modellt dolgoztunk ki, amivel a CLP
pórusokon keresztül történő efflux és a csatornák inaktivációjának paraméterei meghatározhatóak. A továbbiakban csak az ST pórusokon keresztül folyó kiáramlással foglalkozom, mivel az SP22A csatornák nem inaktiválódtak, s így a
86
Rb+ efflux
sebességi állandóját ebben az esetben a mért transzport görbék segítségével is meg tudtuk határozni. Az előzőekben egy-egy tipikus transzport mérés adatait mutattuk be egy-egy hőmérsékleten. A modell segítségével kiszámoltuk a mérési adatokhoz illeszkedő görbék paramétereit. Így meghatároztuk a kp sebességi állandót, ami az ST esetében a transzport adatokból nem volt leolvasható a rendkívül gyors inaktiváció miatt, szemben az SP22Aés a korábban vizsgált SRE pórusok esetén mért transzporttal. Meghatároztuk a knm sebességi állandót (5,9´10-4 ± 3,8´10-4) , ami jó egyezést mutatott a kontroll vörösvértesteknél mérhető transzport sebességi állandóval. A modell segítségével meghatároztuk továbbá az xpo és xp∞ hatáskeresztmetszetek értékeit, valamint a kinakt inaktivációs sebességi állandót (4.2. táblázat).
4.2. Táblázat. A modelből számolt paraméterek T[oC]
ST koncentráció [molekula/vvt]
kp [min-1]
xpo
xp∞
kinakt [min-1]
8
5,80E+06
0,00052
1,000
0,032
0,001
6,50E+06
0,0053
0,841
0,170
0,005
8,80E+06
0,0161
0,994
0,010
0,016
1,00E+07
0,0025
0,892
0,892
0,002
1,28E+07
0,0359
1,000
1,000
0,036
6,91E+06
0,069
0,993
0,042
0,069
7,16E+06
0,058
0,898
0,018
0,053
8,73E+06
0,366
0,995
0,005
0,364
9,98E+06
0,426
0,999
0,001
0,426
5,77E+06
0,157
0,759
0,001
0,119
9,06E+06
0,306
0,997
0,003
0,305
9,37E+06
0,213
0,997
0,001
0,212
1,19E+07
0,520
1,000
0,003
0,520
1,27E+07
0,388
0,999
0,006
0,388
20
37
46
4.2.5.
A syringotoxin pórusra jellemző paraméterek Az inaktivációs konstansból (kinakt) meghatároztuk a pórusok átlagos élettartamát
(tinakt), ami 37 oC-on igen rövid, 2 percnél rövidebb volt, 20 oC-on viszont ennél hosszabb volt. 8 oC-on pedig a mérési időnél hosszabb átlagos pórusélettartamot számoltunk. A kp sebességi állandóból pedig a pórusoknak megfelelő,
86
Rb+-ra
vonatkozó permeabilitási állandót (pp) (4.3. táblázat). A knm sebességi állandóból (5,9´10-4 ± 3,8´10-4) kiszámoltuk módosítatlan membránra jellemző pnm permeábilitási állandót (3,42´10-10 ± 2,2´10-10 cm/s), ami jó egyezést mutatott az irodalomból a K+-ra ismert permeábilitási együtthatóval (2,8´10-10 cm/s) [106].
4.3. Táblázat. Az ST pórusok permeabilitása és átlagos élettartama T[oC]
ST koncentráció
tinact [min]
pp[cm/s]
5,80E+06
297
3,17E-10
6,50E+06
268
2,84E-09
8,80E+06
79,5
8,73E-09
1,00E+07
∞
1,51E-09
1,28E+07
∞
2,22E-08
6,91E+06
4,1
3,77E-08
7,16E+06
10,4
3,08E-08
8,73E+06
2,3
1,99E-07
9,98E+06
2,0
2,17E-07
5,77E+06
1,7
8,52E-08
9,06E+06
1,7
1,64E-07
9,37E+06
1,9
1,28E-07
1,19E+07
1,1
3,30E-07
1,27E+07
1,4
2,45E-07
[molekula/vvt] 8
20
37
A permeabilitási állandó, pontosabban annak logaritmusa függ a hatóanyag koncentrációjától, amiből az ST oligomerizációjára következtettünk. A permeabilitási állandó koncentráció-függésének Hill-féle reprezentációja [100] megadja az egyetlen csatorna kialakításában résztvevő monomerek számát. A különböző hőmérsékleteken
47
mért eredményeink egybevetése alapján a ST pórusok mintegy 2-6 (4,2±1,8) alegységből állnak. 4.3.
Ciklusos lipodepszipeptidek hatása liposzóma membránra, ESR spektroszkópiai vizsgálatok
4.3.1.
Ciklusos lipodepszipeptidek hatása telített foszfolipidből készült liposzómákon A CLP-k membránra gyakorolt hatását különböző lipidösszetételű liposzómán
elektronspin rezonancia (ESR) spektroszkópiai módszerrel vizsgáltuk. A CLPk és a membrán lipidek kölcsönhatását a lipid kettősréteg különböző mélységeiben spinjelölők segítségével monitoroztuk. A 4.10. ábrán tipikus kontroll és SP22A-val kezelt DPPCSUV liposzómák ESR spektrumai láthatók. A liposzómákat 5-doxyl- (SL-5), 7-doxyl(SL-7), 12-doxyl- (SL-12), vagy 16-doxyl- (SL-16) sztearinsavval jelöltük. Az ábrán a felső spektrumok a kontroll liposzómákra, az alsók pedig az SP22A-val kezelt liposzómákra vonatkoznak. Az SP22A/lipid arány az ábrán mindegyik esetben 1/200 volt. A mintákat a DPPC előfázisátalakulási hőmérséklete fölé (32-35 oC) melegítettük, majd a spektrumokat az előfázisátalakulási hőmérséklet alá visszahűtve regisztráltuk: a.) 23 oC, b.) és c.) 25 oC, valamint d.) 27 oC. Az ábrán látható, hogy a membránlipidek mozgékonyságára jellemző 2Amax csatolási állandó mind a fejcsoport közelében (SL-5), mind a szénhidrogénlánc középső részén (SL-7 és SL-12) megnőtt. Az SP22A kezelést követően az a.) esetben 5, a b.) esetben 6, a c.) esetben 5,2 Gauss értékkel nagyobb csatolási állandót mértünk, mint a kontroll mintánál, ami arra utal, hogy az SP22A hatására a membrán rigidebbé válik. Azokban az esetekben, mikor a 2Amax csatolási állandó az ESR spektrumról nem volt leolvasható, a membrán fluiditását az SL-12 esetén az f paraméterrel ( f = (k =
H -1 ), az SL-16 jelölő esetén pedig a k paraméterrel H0
H +1 ) jellemeztük. Mindkét paraméter értéke lecsökkent, a c.) esetben az f értéke H0
0,018-ról –0,037-re, a d.) esetben a k értéke 0,31-ről 0,28-ra változott az SP22A kezelést következtében.
48
Méréseink azt mutatták, hogy a CLP-k csökkentették a lipidek mozgékonyságát a membránnak az általunk vizsgált mindhárom mélységében: a.) a fejcsoport közelében,
b.) a zsírsavlánc közepén, valamint c.) a végén. 2Amax
SL-5
a
SL-7
b
*
SL-12
c h-1 ho
H
SL-16
d h+1
ho
4.10. ábra. Kontroll és SP22A-val kezelt DPPC liposzómák ESR spektrumai különböző spinjelölők alkalmazása esetén. A felső illetve az alsó spektrumok a kontroll, illetve a kezelt liposzómák spektrumai.
49
A spektrumokon egyéb, nem parametrizált változások is megfigyelhetők. Az SL5 és SL-12-vel jelölt és toxinnal kezelt mintáknál, a középső csúcstól jobbra lévő csúcs amplitúdójának csökkenése (4.10. ábra dupla nyíllal jelölt amplitúdó) szintén a membrán rigidebbé válására utal. A kezelés hatására a spektrumokon egy mobilis komponens jele figyelhető meg, amit az ábrán csillaggal jelöltünk (4.10. ábra). A mobilis komponens (izotróp) csatolási állandója megegyezett a jelölők fiziológiás sóoldatban mért csatolási állandójával. Spektrumlevonás segítségével megállapítottuk, hogy a mobilis komponens nem több mint ~2-3%. A liposzómák ESR spektrumai hasonló változáson mentek keresztül SRE és ST hatására is, mint az előzőekben bemutatott SP22A-val kezelt minták esetében, jóllehet a ST-nal kezelt liposzómák esetében a változás mértéke kisebb volt. Vizsgálataink alapján mind a három vizsgált CLP, az SP22A, az SRE és az ST is csökkentette a tisztán telített zsírsavláncot tartalmazó foszfolipidekből készített liposzómák membrán fluiditását. 4.3.2.
A CLP-k koncentrációjának szerepe a fluiditásra kifejtett hatásban
D2Amax [G]
5
SRE SL-5 SRE SL-12
4
SPA SL-5
3
2
1
0
1/200
3/200
1/50
1/40
CLP/lipid
4.11. ábra. Az SP22A és az SRE koncentrációjának hatása a membrán fluiditására
A CLP-k már kis toxin-lipid arány mellett (SRE: 1/80, SP22A: 1/200) is jelentősen csökkentették a DPPC-ből, vagy DMPC-ből készült liposzómák fluiditását. A CLP-k fluiditásra kifejtett hatását 1/40 — 1/800 (2,5 — 0,125 mól-százalék) CLP/lipid 50
tartományban vizsgáltuk. Mind az SP22A, mind az SRE, már 1/400 CLP/lipid aránynál is szignifikáns csökkenést okozott. SL-5 jelölővel mérve, 1/400 CLP/lipid aránynál az SP22A és az SRE hatásában nincs szignifikáns különbség, szemben a vörösvértesten tapasztalt eredményekkel, amik azt mutatták, hogy az SP22A hatása erősebb, mint az SRE-é. 0,5 mol-százalék fölött, — összhangban a transzport-mérésekkel — az SP22A fluiditás-csökkentő hatása nagyobb volt, mint az SRE-é. (A 2Amax paraméter változása az utóbbi esetben 1,62 G volt az SP22A hatására, és 1,21 G az SRE hatására. Ugyanez a különbség 1 mol-százalék toxin koncentrációnál 1,7 G volt az SRE esetében és 5,02 G volt az SP22A esetében.) A vizsgált CLP-k közül az ST bizonyult a leggyengébbnek. Példaként említjük, hogy a legnagyobb CLP/lipid arány (1/40) esetén az ST-vel kezelt és a kontroll liposzómák fluiditása között 23 oC-on csupán 1,6 G különbséget mértünk. A 4.11. ábrán az 1/200 toxin/lipid koncentráció értéknél feltüntettük a szórást. Az összes további kísérleteknél a kontroll és a kezelt liposzómák esetében felvett spektrumok 2Amax csatolási állandóinak különbsége az ábrán is feltűntetett, 0,3 Gauss értékű szórást mutatta. Ezért a további ábrákon a szórást nem jelzem. 4.3.3.
CLP-k membránfluiditásra kifejtett hatása a hőmérséklet függvényében
Az SP22A-kezelés hatása. A 4.12. és a 4.13. ábrán a hőmérséklet változásának a CLP-k és lipidek közötti molekuláris kölcsönhatásokra kifejtett hatása látható. A kölcsönhatást a 2Amax csatolási állandóval jellemeztük. A DPPC liposzómához a megfelelő CLP-t 0 oC-on adtuk, majd a hőmérsékletet fokozatosan emeltük (1. fűtési kör). A 4.12. ábrán az SP22A-val kezelt DPPC liposzómák 2Amax csatolási állandóját ábrázoltuk a hőmérséklet függvényében. A toxin koncentráció 1/200 SP22A molekula/lipid molekula volt. Ezt a koncentrációt humán vörösvértesten a transzport vizsgálatoknál is alkalmaztuk. A kezelést követően a 2 oC-on mért csatolási állandó a kontrollhoz képest 1 Gauss értékkel nőtt, majd a hőmérséklet emelésével a különbség 27 oC-nál mintegy 2 G-ra emelkedett. Ez jelentős változásnak tekinthető, összevetve azzal, hogy 0,5 G eltérést már szignifikáns különbségként lehet értékelni. A csatolási állandó növekedése arra enged következtetni, hogy a membrán a kontroll liposzómához képest jóval rigidebbé válik. 28 oC-on a fluiditás hirtelen változása figyelhető meg: a 2Amax paraméter ugrásszerűen 3G-t növekedett, és 29 oC-on már rendkívül nagy, 5G volt a különbség a kontroll és a kezelt liposzóma csatolási állandói között. A 51
hőmérséklet további növelésekor a kontroll és a kezelt minták külső csatolási állandói közötti különbség fokozatosan csökkent.
Elérve a 33 oC hőmérsékletet, a mintát egyetlen lépésben 2 oC-ra hűtöttük vissza, majd fokozatosan újramelegítettük. A második fűtési szakaszt a c.) görbe mutatja. Itt már 28 oC alatt is jóval nagyobb, 3-5G volt a kontroll és kezelt liposzómák közötti különbség, majd a görbe 29 oC-tól belesimult az első fűtési kör görbéjébe. Mindezekből arra lehet következtetni, hogy az első körben 28-29 oC-nál irreverzibilis szerkezetváltozás következett be, vagyis a teljes rigidizáló hatás eléréséhez 28 oC fölé kell emelni a minta hőmérsékletét, azután viszont a liposzóma visszahűtésével nem áll vissza a membrán korábbi állapota.
A fő fázisátalakulási hőmérséklethez (42,5 oC) közeledve, a hőmérséklet további emelésére az SP22A-nak a membrán fluiditására gyakorolt hatása fokozatosan eltűnik, a fő fázisátalakulási hőmérséklet (42,5 oC) fölött a kontroll és az SP22A-val kezelt liposzómák között már nem volt szignifikáns különbség.
Eredményeink szerint a 2Amax csatolási állandó hirtelen változási hőmérséklete (28-29 oC) nem függ sem a hőmérsékletváltozás sebességétől, sem az alkalmazott toxin és lipid koncentrációtól. Előkísérleteink során azt tapasztaltuk, hogy az SP22A-val 0 oCon kezelt minta állapota, akár egy éjszakán át tartó, 4 oC-os inkubálás során sem változik. 24 óra állás után felvéve a csatolási állandó hőmérséklet-függését, a csatolási állandók értékét azonosnak találtuk, mint a frissen kezelt liposzómák esetében. Megjegyezzük, hogy a kontroll liposzóma 2Amax értékei nem függnek sem a hőmérsékletváltozás irányától, sem annak sebességétől, hiszterézist nem tapasztaltunk.
52
Kontroll DPPC DPPC+SP22A 1. fűtési kör 62
DPPC+SP22A 2. fűtési kör
c
2Amax [Gauss]
60
58
56
a
b
54
52
50
48 0
10
20
30
40
50
T[oC]
4.12. ábra. SP22A hatása DPPC liposzóma spektrumának 2Amax csatolási állandójára
Az SRE-kezelés hatása. A 4.13. ábra mutatja az SRE-vel kezelt DPPC liposzómák 2Amax csatolási állandójának változását a hőmérséklet függvényében. A kezelést 0 oC-on végeztük, ezt követően, az SP22A-val való kezeléshez hasonlóan, a külső csatolási állandó növekedése mutatható ki a kontrollhoz képest. A különbség kb. 2-2,5 G volt, hasonlóan, mint az SP22A-val kezelt liposzómáknál. Az SP22A esetében tapasztalt újabb hirtelen fluiditáscsökkenéssel ellentétben, SRE-kezelést alkalmazva a különbség nem nőtt tovább. Az előfázisátalakulási hőmérséklet (kb. 35 oC) felett a különbség a kontroll és a SRE-vel kezelt liposzóma között fokozatosan eltűnik. Az SP22A-hoz képest, e hőmérséklet fölött a felfűtési ciklusban (1. fűtési kör) további hirtelen fluiditáscsökkenést nem tapasztaltunk, azonban a minta visszahűtése után a kontroll és az SRE-vel kezelt liposzóma fluiditásának különbsége 2 oC-on pl. csaknem kétszeresére nővekedett az eredetihez képest. A második fűtési szakaszban (2. fűtési kör) 3-4 G volt a különbség a kontroll és a kezelt minták csatolási állandói között. SREkezelést követően a második fűtési körben, az első fűtési körhöz képest, csak akkor mértünk nagyobb felhasadást (2Amax csatolási állandót), ha a mintát a hűtés előtt legalább 36 oC fölé melegítettük. Ennek hiányában nem volt eltérés a két fűtési ciklus eredményei között. Az eredmények azt jelzik, hogy SRE hatására is rigidebbé vált a membrán, a membránlipidek mozgékonysága csökken; a fő fázisátalakulási hőmérséklet 53
fölött azonban a membránfluiditásban sem a SRE, sem az SP22A kezelést követően nem volt kimutatható különbség. 64
Kontroll DPPC
2Amax [Gauss]
60
DPPC+ SRE 1. fűtési kör DPPC+ SRE 2. fűtési kör
56
52
48 0
10
20
30
40
T[oC]
4.13. ábra. Syringomycin hatása DPPC liposzóma 2Amax csatolási állandójára
Az ST-kezelés hatása. Hasonlóan az SRE-hez és az SP22A-hoz, a syringotoxin hatására is csökkent a membránfluiditás. ST hatására a 2Amax paraméter hőmérséklettől függő változása hasonló volt az SRE kezelésnél tapasztaltakhoz, bár azonos hatás eléréséhez nagyobb toxin koncentráció volt szükséges. A magas hőmérsékleten való kezelés hatása Eredményeink azt mutatják, hogy a CLP-knek a membrán fluiditására gyakorolt hatása erősen függ a hőmérséklettől. Megvizsgáltuk a CLP-k hatását a tisztán telített zsírsavláncú lipidből készült liposzómákon úgy is, hogy a toxinnal való kezelést a meleg protokoll szerint végeztük. Az SP22A-kezelésre vonatkozó eredményeket a 4.14. ábrán mutatjuk be. A liposzómhoz 45oC-on, a fő fázisátalakulási hőmérséklet fölött adtuk az SP22A-t, majd lépésenként lehűtöttük, és közben regisztráltuk az ESR spektrumokat. Tapasztalataink szerint az előfázisátalakulási hőmérséklet fölött a külső csatolási állandó értéke jóval kisebb volt annál az értéknél, mint ami az SP22A hatására jött létre hideg protokoll után (pl. 35oC-on 51,08 G az 53,37 G helyett). A minta 54
fokozatos hűtésével a különbség a kontroll és a kezelt minta között egyre növekedett. A teljes merevítő (rigidizáló) hatás csak akkor alakul ki, amikor a minta hőmérséklete az előfázisátalakulási hőmérséklet alá csökken. A hűtés után a mintát újra felmelegítettük és az ekkor mért spektrumok 2Amax paramétere már jóval nagyobb volt, (pl. 35oC-on 53,37 G) mint a 2oC-ra való hűtés előtt (35oC-on 51,08 G). Ebből az a következtetés vonható le, hogy az SP22A által okozott teljes rigidizáló hatás eléréséhez, nem csak egy adott érték (28-29oC) fölé kell emelni a hőmérsékletet, hanem a mintát megfelelő hőmérséklet alá is kell hűteni. Az SRE hatását is megvizsgáltuk úgy, hogy a liposzómákat a meleg protokoll szerint kezeltük. A nyert eredményeket mutatja a 4.15. ábra, ami hasonló az SP22Akezelés eredményeihez. Az első mérési sorozatban, amikor a minta hőmérsékletét 45oCról fokozatosan csökkentettük, a külső csatolási állandó értéke még kisebb volt mint az SRE hatására elérhető maximum. A membrán tehát még fluidabb volt, mint a második mérési körben, amikor a mintát újra felmelegítettük a 2oC-ra való hűtés után. Tehát, hasonlóan az SP22A-nál tapasztaltakkal, az SRE-nek a membrán fluiditására kifejtett hatása függ a hőmérséklettől, és a teljes hatás kialakulásához a meleg protokolt követően, a liposzómát az előfázisátalakulási hőmérséklet alá kell hűteni.
kontroll DPPC SP22A-DPPC
62 2Amax [G]
SP22A hűtés után
58
54
50 0
10
20
30
40
T [oC]
4.14. ábra. Syringopeptin hatása 45 oC-os hőkezelés után DPPC liposzómán
55
62
2Amax [G]
DPPC kontroll SRE DPPC SRE hűtés után
58
54
50
0
10
20
30
40
T [oC]
4.15. ábra. SRE hatása 45 oC-os hőkezelés után DPPC liposzómán
A CLPk kölcsönhatása DMPC-vel A CLP-knek a liposzóma membránjára gyakorolt hatását megvizsgáltuk egy másik, a DPPC-hez hasonlóan kizárólag telített zsírsavláncot tartalmazó foszfolipidből, DMPC-ből készült liposzómán is. A 2Amax külső csatolási állandó változását megvizsgáltuk mind a hideg protokoll, mind a meleg protokoll szerint készített mintákon. A hideg protokoll szerint a DMPC liposzómákon mért eredményeinket ábrázoltuk a 4.16. ábrán. A 2 oC-on történő inkubálás után a 2Amax paraméter értéke a kontrollhoz képest enyhén megnövekedett mind az SP22A, mind az SRE esetén, ami arra utalt, hogy a két toxin hatására a membrán rigidebbé vált. A hőmérsékletet fokozatosan emelve azt tapasztaltuk, hogy az SP22A esetén 13 oC-nál, illetve az SRE esetén 17 oC-nál a csatolási állandó értéke ugrásszerűen megnőtt. A kontroll és a kezelt liposzómák csatolási állandói között a különbség mintegy 3 G volt, ami akkor sem tűnt el, ha a mintát visszahűtöttük. Mindezekből arra következtettünk, hogy — hasonlóan a DPPC-hez — a DMPC előfázisátalakulási hőmérséklete közelében a membránban irreverzibilis szerkezetváltozás zajlik le, s a DMPC esetén is az SRE magasabb hőmérsékleten váltja ki az irreverzibilis változást, mint az SP22A.
56
A meleg protokoll szerinti inkubálás hatását DMPC mintán csak SP22A-kezelés mellett vizsgáltuk. Méréseinkben azt tapasztaltuk, hogy az előfázisátalakulási hőmérséklet fölött az SP22A nem okozott változást a membrán fluiditásában, azonban a mintát 14 oC alá hűtve a csatolási állandó értéke jelentősen megemelkedett: 11 oC-nál már 2,5 G különbség volt mérhető a kontroll és a kezelt minta spektrumai között (4.17. ábra). Ezek alapján az SP22A — hasonlóan a DPPC liposzómához — csak akkor tudja kifejteni a membránt rigidizáló maximális hatását, ha a hőmérsékletet az előfázisátalakulási hőmérséklet alá csökkentjük. DMPC kontroll DMPC+SP22A DMPC+SRE
2Amax [G]
62
58
54
50 0
5
10
15
20
30 T [oC]
25
4.16. ábra. A csatolási állandó változása a hőmérséklet függvényében DMPC-liposzómán SP22A és SRE hatására hideg protokoll szerinti kezelés után DMPC kontroll DMPC+SP22A
2Amax [G]
62
58
54
50 0
5
10
15
20
25
30 T[oC]
4.17. ábra. A csatolási állandó változása a hőmérséklet függvényében DMPC-liposzómán SP22A hatására meleg protokoll szerinti kezelés után
57
4.3.4.
Ciklusos lipodepszipeptidek hatása telítetlen kötést tartalmazó foszfolipidekből készült liposzómán A CLP-k membrán-fluiditásra gyakorolt hatását megvizsgáltuk DOPC-t
tartalmazó liposzómán. A DOPC két telítetlen kötéssel rendelkezik, egy-egy telítetlen kötéssel a két oleoil-zsírsavlánc 9-10 pozíciójú szénatomjai között. A kettős kötés hatására a telített zsírsavláncú homológokhoz képest a membrán rendezetlenebbé, s azonos hőmérsékleten fluidabbá válik. A DOPC-DPPC keverék liposzómában különböző koncentrációban: 5%-, 15%- és 30%-ban alkalmaztuk a DOPC-t. Az SP22A által kiváltott fluiditást csökkentő hatást a kontroll és a kezelt minták 2Amax paramétereinek relativ különbségével, D2Amax/max(D2Amax), jellemeztük, amit a 4.18. ábra mutat. A relatív különbségek képzésekor a vonatkoztatási tényező a tapasztalt maximális különbség volt. Az ábrázolt mérési eredmények a hideg protokoll szerint végzett mérések eredményei. Tiszta DPPC liposzómán (0% DOPC), mint már tárgyaltuk, rigidizáló hatás jelentkezett: az SP22A csökkentette a membránfluiditást, a 2Amax csatolási állandó 1-2 G-szal megnőtt, majd ez a különbség 28-29 oC-nál ugrásszerűen még tovább növekedett. 5% DOPC tartalomnál az SP22A hasonló módon változtatta meg a fluiditást, mint tiszta DPPC liposzómán, azonban a 2Amax paraméter hirtelen növekedése 10 oC-kal alacsonyabb hőmérsékletre, 19-20 oC-ra tolódott el. 15% DOPC tartalmú liposzómánál a külső csatolási állandó értéke 1,5-2 G-t nőtt az SP22A hatására, azonban a további ugrásszerű növekedése ebben az esetben elmaradt. Ezek alapján az SP22A merevebbé teszi a 15% DOPC-t tartalmazó membránt is, de a maximális változás még a felét sem éri el annak az értéknek, amit az SP22A tiszta DPPC liposzómán okozott. 30% DOPC tartalmú liposzómán az SP22A alig változtatta meg a fluiditást, a maximális különbség a kontroll és a kezelt minták között 0,58 G, ami a kimutathatóság határán van. A fentiekből azt a következtetést vontuk le, hogy a telítetlen kötés jelenléte a zsírsavláncokban — a DOPC koncentrációjától függően — megváltoztatja az SP22A fluiditást csökkentő hatását: 5% DOPC tartalomnál a hirtelen fluiditás csökkenés bekövetkezik, csupán alacsonyabb hőmérsékletre tolódik, nagyobb DOPC tartalomnál pedig, az SP22A hatására a kettőskötést tartalmazó lipid koncentrációjától függő mértékben csökken a fluiditás nagysága. Eredményeink szerint, az SRE hatása szintén csökkent 5%-nál nagyobb DOPC tartalmú liposzómán. (Megjegyzés: Nem végeztünk részletes méréseket, de a rendelkezésre álló méréseink azt mutatták, hogy a tojáslecitinből készült liposzómán a ciklusos lipodepszipeptidek ESR spektroszkópiai
58
módszerrel detektálható hatást nem váltottak ki. Mivel a lecitin különböző zsírsavláncú foszfatidilkolin lipidek keveréke, és nagy arányban tartalmaz telítetlen zsírsavláncú lipideket, feltételeztük, hogy a CLP-k hatástalansága más hatások mellett a kettőskötések jelenlétének is köszönhető.)
0.9
0%
D2Amax/max(D2Amax)
5% 15% 0.7
30% DOPC
0.5
0.3
0.1
0
10
20
30
40
T[oC]
4.18. ábra. A csatolási állandó relatív változása az SP22A hatására különböző DOPC koncentrációkat tartalmazó liposzómákon
4.3.5.
Syringopeptin22A hatása koleszterin tartalmú liposzómán Az
SP22A
membránra
gyakorolt
hatását
DPPC—koleszterin
keverék
liposzómán is vizsgáltuk. A liposzómák 0%-, 15%-, 30%, vagy 40% koncentrációban tartalmaztak koleszterint. A mérési eredményeket a 4.19. ábrán foglaltuk össze. Az ábrán a 2Amax paraméter változásának a kontroll DPPC esetében mért legnagyobb változáshoz viszonyított értékét tüntettük fel a hőmérséklet függvényében. SP22A hatására a legnagyobb változást 29 oC hőmérsékletnél a tisztán DPPC-ből készült liposzómán tapasztaltuk, erre normáltuk a különböző koleszeterin-tartalmú liposzómák esetében a különböző hőmérsékleteken mért csatolási állandók változását. 15% koleszterint tartalmazó liposzómán az SP22A hatására nőtt a 2Amax, ám a nem kezelt és az SP22A-val kezelt koleszterintartalmú minta maximális csatolási állandóinak különbsége 0,9 G-szal kisebb volt, mint a tiszta DPPC liposzóma esetében. 30% koleszterin tartalomnál az SP22A-val kezelt és a nem kezelt minták közötti különbség még tovább csökkent, mintegy 2 G-szal kevesebb volt, mint a koleszterinmentes esetben mért különbség. 40% koleszterin koncentrációnál azt tapasztaltuk, hogy az SP22A 59
membrán-fluiditást csökkentő hatása majdnem teljesen eltűnik: a kontroll és a kezelt minták közötti különbség — 0,5-0,6 G — a kimutathatóság határán volt. Mindebből látható, hogy a koleszterin a liposzómáknak az SP22A-hatással szembeni érzékenységét koncentrációjától függő mértékben lecsökkentette. Meg kell azonban jegyeznünk, hogy a koleszterint tartalmazó liposzómák fluiditása eleve kisebb volt, mint a tiszta DPPC liposzómáké, azaz a koleszterin önmagában is csökkentette a membrán fluiditását. A membrán rigiditása a koleszterin tartalomtól függött: 40% koleszterinnél a fluiditás alig volt kisebb, mint az SP22A-val kezelt tiszta DPPC liposzómáé.
1.0
0%
D2Amax/max(D2Amax)
15% 30% 0.8
40%
koleszterin
0.6
0.4
0.2
0.0 0
10
20
30
40
T[oC]
4.19. ábra. A csatolási állandó relatív változása az SP22A hatására különböző koleszterin koncentrációk mellett
4.3.6.
Syringopeptin22A hatása multilamelláris liposzómán (MLV) Tapasztalataink szerint az SP22A, a leghatásosabb CLP, teljes hatását a DPPC-
ből illetve DMPC-ből készült kis unilamelláris liposzómán az előfázisátalakulási hőmérséklet közelében tudta csak kifejteni (l. 4.3.1. szakasz). A koleszterin a liposzómák fluiditását csökkentette, ami hozzájárulhatott ahhoz, hogy az SP22A hatása kisebbnek bizonyult a koleszterint tartalmazó membránon. Mindezek alapján feltehető, hogy a membrán fluiditásának szerepe van a CLP-k hatásának kialakulásában. Az MLV több, szorosan illeszkedő foszfolipid kettősrétegből áll, emiatt e liposzómák fluiditása a 60
kis egyrétegű liposzómákénál az előfázisátalakulási hőmérséklet alatt jóval kisebb. Az uni- és multilamelláris liposzómák viselkedésének egybevetését mutatja a 4.20. ábra, ami a kontrol és az SP22A-val kezelt esetekben hasonlítja össze a hömérséklet függvényében a fluiditást jellemző csatolási állandók változását. Az ábra a és b görbéi megfelelnek a 4.12. ábra a és c görbéinek; ehhez hasonlítjuk a kezelt és kezeletlen MLV c, ill. D görbéit. Az SP22A hatására a 2Amax paraméter kevésbé nőtt az MLV esetén, mint a kis unilamelláris liposzómáknál (l. 4.3.1. szakasz). A teljes hőmérséklet tartományban, a kontroll és az SP22A-val kezelt MLV-k csatolási állandói között mindössze kb 0,5-1 G különbéget tapasztaltunk, ami jóval kisebb, mint a kis unilamelláris liposzómáknál mért 1-5 G eltérés. Ez arra utal, hogy a membránfluiditás valóban befolyásolja az SP22A által kiváltott változtást. Figyelemre méltó jelenség, hogy kb. 31 oC feletti hőmérsékleteken az SP22A-val kezelt SUV és a kontroll MLV minták
csatolási
állandói
közelítőleg
megegyeznek,
ami
hasonló
szerkezet
kialakulásának lehet a jele. 64
2Amax [Gauss]
kontroll MLV 62
MLV+SP22A kontroll SUV
60
SUV+SP22A; 2. fűtési kör
58 56 54 52 50 48 0
10
20
30
40
50
T[oC]
4.20. ábra. A 2Amax csatolási állandó változása a hőmérséklet függvényében SP22A hatására multilamelláris- (MLV) és kis unilamelláris (SUV) liposzómán
4.3.7.
Pórusképződés vizsgálata liposzómán Az ESR módszer lehetőséget nyújt a CLP pórusok jelenlétének vizsgálatára
liposzóma membránon (l. 2.2.4.2 szakasz). A kis unilamelláris liposzómákat HXD 61
spinjelölővel jelöltük meg és az ESR-jel amplitudójának változásán keresztül követtük az aszkorbinsav diffúzióját a membránon keresztül. Az ESR spektrum középső csúcsának amplitudóját a kezdeti maximumra normalizáltuk, az így nyert adatok féllogaritmikus ábrázolásban láthatók a 4.21. ábrán. Az ábrán megfigyelhető, hogy az SP22A-val kezelt minta esetében az jelamplitúdó erőteljesebben csökken, mint a kontroll liposzómánál. Ez arra utal, hogy az SP22A-val kezelt membrán permeabilitása a kontrollhoz képest megnőtt, ami a többi ESR-méréseinkkel együtt alátámasztja azt az
ln(Irel)
elképzelést, hogy a CLP-k hatására a liposzóma-membránban pórusok jöttek létre. DPPC+ SP22A
0.00
DPPC kontroll -0.05
-0.10
-0.15
-0.20
-0.25 0
200
400
600
800
1000
1200 t(s)
4.21. ábra. Aszkorbinsav transzport kinetikája a külső térből a liposzómákba
4.3.8.
A syringopeptin22A hatása a membránlipidek rendezettségére és rotációs dinamikájára
4.3.8.1.
A rendparaméter változása SP22A hatására
Annak érdekében, hogy a molekuláris kölcsönhatásokban bekövetkező változásokat pontosabban tudjuk jellemezni, számítógépes spektrumszimulációkat végeztünk. A szimulációkhoz az 5-doxyl- és a 7-doxyl-sztearinsavval jelölt liposzómák spektrumait választottuk. A spektrumszimulációk alapján meghatároztuk a hőmérséklet 62
függvényében az S20 rendparaméter, valamint a rotációs diffúziós tenzor merőleges komponensének változását mind kontroll-, mind az SP22A-val kezelt DPPC-SUV mintákra nézve. A 4.22. és a 4.23. ábrák mutatják a két spinjelölő esetére meghatározott S20 rendparamétereket.
S20 rendparaméter
kontroll DPPC
SL-5
0.9
DPPC+ SP22A; 1. fűtési kör DPPC+ SP22A ; 2. fűtési kör
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3 0
10
20
30
40
T[oC]
4.22. ábra. DPPC-SUV liposzóma rendparaméterének változása a hőmérséklet függvényében SL-5 jelölő esetén
SL-7
S20 rendparaméter
0.7 kontroll DPPC 0.6
DPPC+ SP22A
0.5
0.4
0.3 0
10
20
30
40
T[oC]
4.23. ábra. DPPC-SUV liposzóma rendparaméterének változása a hőmérséklet függvényében SL-7 jelölő esetén
63
Mindkét jelölő esetén a szimulált spektrumok alapján az S20 rendparaméter kisebb volt a kontroll-, mint az SP22A-val kezelt liposzómáknál. E megállapítás viszonylag széles hőmérséklet tartományban igaz: 2 oC-tól egészen a fő-fázisátalakulási hőmérsékletig. Az ábrákból leolvasható, hogy 29 oC-on az S20 paraméter hirtelen megnőtt az SP22A-val kezelt minta esetében, ami megfelel a külső csatolási állandó alapján állított fluiditás csökkenésnek. Eredményeink azt mutatják, hogy a fluiditás csökkenése az S20 rendparaméter növekedésének, azaz az e20 irányítópotenciál-tag növekedésének felel meg. Ez azt jelenti, hogy a fő fázisátalakulási hőmérséklet alatt megnőtt a lipidmolekulák irányítottsága, vagyis csökkent az a térszög, amiben a molekuláris fluktuáció következtében mozgást végezhetnek. A fő fázisátalakulási hőmérséklet fölött nem volt szignifikáns különbség a kontroll és a kezelt minták esetében számolt S20 rendparaméterek között, hasonlóan a 2Amax paraméterhez.
4.3.8.2.
Rotációs korrelációs idő
A jelen munkámban bemutatott ESR spektrum-szimulációk az un MOMDmodellen alapulnak. Ez a modell a lipid molekulák mikroszkópikus rendezettségét tételezi fel, a makroszkópikus rendezetlenség mellett [96, 97]. SL-5 8.0
log(Rprp)
7.8 7.6 7.4 control DPPC 7.2
DPPC+SP22A; 1.fűtési kör DPPC+SP22A; 2. fűtési kör
7.0 6.8 0
10
20
30
40
T[oC]
4.24. ábra. A rotációs diffúziós tenzor merőleges komponensének változása a hőmérséklet függvényében
A lipid molekulák tehát, a térszög adott tartományára korlátozottan, végeznek rotációs diffúziót; ezt vesszük figyelembe az irányítási potenciállal. Ugyanakkor a 64
lipidek hossztengelye, az un. irányító-tengely (alignment axis), a térben véletlenszerűen helyezkedik el. A spektrum-szimulációk alapján az irányítási potenciál mellett a rotációs korrelációs idő is meghatározható. A vizsgált hőmérséklet-tartományban a lipidmolekulák esetében a diffúziós tenzor merőleg komponense határozza meg leginkább a spektrum alakját. A 4.24. ábra, a DPPC-ből készült kontroll- és SP22A-val kezelt SUV esetében az Rprp paraméter változását mutatja a hőmérséklet függvényében. Az ábrán látható pontok az SL-5 spinjelölővel mért spektrumokhoz illesztett, szimulált spektrumok Rprp értékei. A merőleges rotációs diffúziós tenzor, Rprp, értékei a kontroll esetében nagyobbak voltak, mint az SP22A-val kezelt liposzómánál, ami arra utal, hogy a lipidek rotációs diffúziója a toxin hatására lassúbbá vált. A fluiditás ugrásszerű változása ezek alapján nem csak a fluktuáció térszögének a csökkenésében, azaz a térbeli kényszer növekedésében jelentkezik, hanem a rotációs korrelációs idő is megnő: az Rprp értéke 29 oC-nál hirtelen lecsökken. Az a jelenség, hogy az első és a második fűtési körben mért adatok 29 oC felett megegyeznek, újabb bizonyítéka annak, hogy az itt bekövetkező változás irreverzibilis. 4.4.
Ciklusos lipodepszipeptidek hatása liposzóma membránra; dinamikus fényszórásmérés A liposzómák méreteloszlását dinamikus fényszórásméréssel megvizsgáltuk
SP22A-val, vagy SRE-vel kezelt, DPPC-ből készült kis unilamelláris liposzóma minták esetében. A méreteloszlásokat a 4.25. ábra mutatja.
0,2 Relatív járulék
Kontroll DPPC DPPC+SP22A
0,1
0,0 10
100
1000
[nm]
4.25. ábra. Az SP22A kezelés hatása DPPC-SUV liposzóma fényszórására. A vízszintes tengelyen a hidrodinamikai rádiuszt ábrázoltam.
65
Az ábrából kitűnik, hogy az SP22A-val kezelt liposzómák méreteloszlása kiszélesedett és a kontrollhoz képest nagy méretű részecskék is megjelentek. Hasonló méreteloszlást mutattak az SRE-vel kezelt liposzómák is, amit a jobb átláthatóság kedvéért nem tüntettem fel az ábrán. A méreteloszlás változása arra utal, hogy az SP22A és az SRE hatására liposzómák aggregációja és/vagy fúziója következett be. Bár részletes méréseket még nem végeztünk, de előzetes adataink alapján keverék DOPC-DPPC liposzóma mintán kisebb volt a turbiditás növekedése az SP22A hatására, mint tiszta DPPC liposzómán.
66
5. MEGBESZÉLÉS
5.1.
A membránösszetétel inhomogenitása, változatossága mint védelmi mechanizmus
Védekezés az ozmotikus sokk ellen Az irodalmi adatok szerint a CLP-k hatásának, a pórusképződésen keresztül az egyensúlyi ioneloszlásban okozott változás az alapja. Ez gyakran ozmotikus sokkot eredményez [20, 22, 23]. Ebben az esetben a bakteriális hatás nem igényli speciális, receptor-szerű struktúra meglétét a célsejten, ily módon hatása sokkal általánosabban, a sejtek különböző típusában hasonló módon kifejeződhet. Ennek látszólag ellent mond az, hogy a különböző CLP-k hatáserőssége változó, attól függően, hogy milyen sejttípust, baktériumot, liposzómát vizsgáltak [23, 79, 80, 85]. Igen érdekes megfigyelés, pl. az, hogy a Gram-negatív és a Gram-pozitív baktériumokon a CLP-k hatása eltérő. Hasonlóan, különböző gombák eltérő érzékenységűek a CLP-kkel szemben [61]. Egyszerű, kézenfekvő magyarázat a különböző membránok esetében tapasztalt, eltérő mértékű hatásra az lehet, hogy a sejtfal felépítése, illetve a sejtmembránok lipid- és fehérje-összetételében levő különbségek kulcsai a „túlélési stratégiának”. Disszertációm „Eredmények” fejezetében részletesen ismertettem a különböző összetételű liposzómákon végzett méréseimet, ami alapján megállapítható, hogy a CLP-k hatása, még az általam vizsgált egyszerű felépítésű liposzóma mellett is jelentősen függ a membrán összetételétől. Milyen „megoldást választhat” az élő szervezet az ozmotikus sokk ellen? Mikor fejlődhet ki az ozmotikus sokk, ami pl. a vörösvértestek esetében hemolízisben jelentkezik? Eredményeink szerint az SP22A 2´106 molekula/sejt koncentráció fölött maximálisan mintegy 25% hemolízist váltott ki; az ST kismértékű, kisebb, mint 6% (1,3±1,8) hemolízist okozott, ami a vizsgált koncentráció-tartományban (2´106-1,3´107 molekula/vvt) nem függött az alkalmazott ST koncentrációtól (l. 4.1., 4.2. szakaszok). Az ozmotikus sokkhoz az ionoknak és a víznek a membránon keresztül történő ellenőrizetlen, szabad diffúziója vezet, amihez a permeabilitás megfelelő időtartamú és
67
mértékű növekedése szükséges. Elmarad az ozmotikus sokk akkor, ha a sejt membránja a permeabilitás-növekedés forrását, a keletkezett pórusokat, képes „kijavítani”.
A pórus-inaktiváció mint javító mechanizmus A membránokon keletkező pórusok olyan dinamikus struktúrák, amik permanensen, vagy csupán időlegesen utat nyitnak különböző molekulák, ionok — a nyugalmi helyzethez képest — megnövekedett áramlásának. A CLP-k esetében a kialakult pórus állhat mind monomerekből, mind oligomerekből. A pórusokon keresztül történő transzport a CLP-k esetén szabad diffúzió révén valósul meg, így a transzport kinetikája elsőrendű. Mérési eredményeink (4.1. és 4.2. szakasz) azonban azt mutatták, hogy ez a közelítés csak az SP22A-ra, illetve az SRE és az ST esetében csak alacsony hőmérsékleten igaz: a kinetikai görbék ui. a pórusok inaktivációjára utalnak. A csatornák inaktivációja, pontosabban a pórusok létrejötte után megnövekedett permeabilitás csökkenése, két módon valósulhat meg. Egyrészt csökkenhet az egyedi csatornák vezetőképessége, másrészt csökkenhet a transzportban részvevő csatornák száma. BLM-en nyert eredmények [81, 82, 83] arra utaltak, hogy az inaktiváció a nyitva lévő pórusok számának csökkenésében nyilvánul meg, mivel az egyes csatornák vezetőképessége nem változott.
Kérdés, hogy az inaktiváció milyen molekuláris szintű jelenséggel köthető össze? ESR mérési eredményeink arra utalnak, hogy a CLP-k membránnal való kölcsönhatása a membrán fluiditásának csökkenését eredményezi, mégpedig a membránt alkotó lipidek szénhidrogénláncának teljes hosszában. A megnövekedett csatolási állandó a lipidek molekuláris mozgásának fokozottabb rendeződését bizonyítja, ami spektrumszimulációink alapján az irányítási potenciál-tag (e20), és ezen keresztül az S20 rendparaméter növekedésével jellemezhető. Emellett a lipidmolekulák rotációs diffúziós tenzora, Rprp, is lecsökkent, ami szintén a lipidmolekuláknak a CLPkel való direkt kölcsönhatását bizonyítja. Ezek az eredményeink alátámasztják azt a korábbi hipotézist [101], hogy az általunk is vizsgált CLP-k a pórusokat a membrán saját lipidjeiből formálják: azaz a lipideknek ebben az esetben aktiv szerepük van a pórusok kialakításában. A pórust alkotó lipidek fluiditásának csökkenése együtt jár a molekuláris fluktuációk csökkenésével, ami lehetővé teszi a kialakult pórusokon
68
keresztül az ionok és egyéb molekulák megnövekedett, szabad diffúzióját. Az inaktivációt a pórusok megszűnésével értelmezhetjük, ami a lipidmolekulák rendezetlen hőmozgásának a következtében lép fel. A molekuláris fluktuációk csökkenése magyarázhatja azt is, hogy az inaktiváció alacsonyabb hőmérsékleten miért igen lassú, vagy egyáltalán nem tapasztalható. Ebben az értelemben beszélhetünk az inaktivációról mint „javító mechanizmusról”, hiszen a CLP-k által kiváltott hibahelyek szűnnek meg inaktivációkor, s így válik lehetővé, hogy a sejt ne szenvedjen ozmotikus sokkot.
Az ionkiáramlást leíró transzport-kinetikai modell Egy másik pórusképző toxinnak, a pardaxinnak a membránra gyakorolt hatására vonatkozó korábbi modell [102] a jelenséget, a vörösvértestek esetében tapasztalt hemolízisből
kiindulva,
és
a
sejtek
teljes
lízisét
föltételezve,
pillanatszerű
anyagáramlásként fogta fel. Mérési eredményeink arra utaltak, hogy az általunk alkalmazott CLP-koncentrációk mellett olyan mértékű lízis nem következik be, ami szükséges lenne ahhoz, hogy az extracelluláris térben megjelenő ionkoncentrációt teljes egészében a lízis következményeként értékeljük. Jelen eredményeink értelmezésére 86
kidolgozott transzport-modellben ezért figyelembe vettük azt, hogy a
Rb+-transzport
két úton valósul meg: a syringotoxin csatornákon-, valamint a kezeletlen membránon keresztül, és figyelembe vettük azt is, hogy a pórusok inaktiválódnak (l. 3.2.2.3. és 4.2.4). A CLP-k által létrehozott pórusok és a nem-módosított membrán-domének transzport tulajdonságai statisztikus jellegű mennyiségek. A kinetikai állandók és a hatáskeresztmetszetek együttesen adják meg az adott időpillanatban a pórusokon, illetve a nem módosult membrán-doméneken keresztül történő átlagos transzportsebességet. Ennek nagyságát a pórusok illetve a nem módosult membrán-domének aktuális felülete és permeabilitása határozza meg. Ilyen értelemben xp illetve xnm az a részarány, ami az adott időppontokban a teljes áramsűrűségből a pórusokra, illetve a nem módosult membrán-doménekre esik.
Membrán-fluiditás és inaktiváció, pórus oligomerizáció A modell segítségével meghatározott inaktivációs állandóból (kinakt) számoltuk a pórusok átlagos élettartamát (tinact) (l. 4.3. táblázat), amit 37 69
o
C-on 2 percnél
rövidebbnek, 20 oC-on két percnél hosszabbnak találtunk. Ez az eredmény értelmezi azt a tapasztalatot, hogy a mérés időtartamán belül a transzport mértéke 37 oC-on kisebb volt, mint 20 oC-on. 37 oC-on az ST csatornák jelentős része már az első mérési pont előtt (2 perc) inaktiválódott, így kevesebb csatorna vett részt a transzportban, mint 20 o
C-on, ahol a csatornák átlagos élettartama meghaladta a két percet. A 37 oC-on tapasztalt gyorsabb inaktiváció alátámasztja azt az elképzelésünket,
hogy a CLP csatornák inaktivációjában a membrán fluiditása, vagyis a lipidek mozgékonysága fontos szerepet játszik. Magasabb hőmérsékleten ui. nagyobb a lipidek fluktuációja, ami miatt a pórus szerkezete hamarabb alakulhat át egy olyan struktúrává, ami már nem működik csatornaként. 8 oC hőmérsékleten olyan kicsi lehet a lipidek mozgékonysága, hogy a mérés teljes ideje alatt fennmarad a pórusként szolgáló struktúra. A modell egyik jelentős eredménye, hogy segítségével meg tudtuk határozni a pórusokon keresztül folyó transzportra vonatkozó sebességi állandót (kp). Ezt, az egyidejűleg fennálló, rendkívül gyors inaktiváció miatt a kísérleti görbékből közvetlenül nem lehetett leolvasni. A kp sebességi állandók alapján kiszámoltuk a membrán STcsatornáinak megfelelő,
86
Rb+-ra vonatkozó permeabilitási állandóját (pp), ezt tüntettük
fel a 4.3. táblázatban. A permeabilitási együtthatónak az ST koncentrációjától való függéséből arra következtettünk, hogy az ST oligomerizálódik. Az egyetlen csatorna képzésében résztvevő ST-monomerek száma 2-6-nak adódott (4,2±1,8). Korábban az SRE és az SP22A estében is oligomerizáció volt megfigyelhető humán vvt-n és BLMen is [81, 82]. A CLP-k oligomerizációját mások is megfigyelték vörövértest- és modell membránon. Dalla Serra és mtsai [23] vörösvértesten végzett vizsgálataik alapján az SRE, az ST, az SP22A és az SP25A pórusok oligomerizációját mutatták ki. Az SP22A hemolizáló hatásából Dalla Serra és mtsai által számolt Hill-koefficiens, ami az oligomerizációra utal, jó egyezést mutatott a mi eredményeinkkel.
A liposzóma összetétele — a CLP-k hatásossága A pórus szerkezete. A sejtmembránok fontos építőelemei a különböző zsírsavláncot
tartalmazó
foszfatidilkolinok
[3,
4,
5].
Munkánk
során
a
sejtmembránokban gyakori, és a liposzóma-készítésben is általánosan használt palmitinsavláncot
tartalmazó
dipalmitoil-foszfatidilkolinból
(DPPC)
készült
liposzómán, valamint a szintén telített zsírsavláncú dimirisztoil-foszfatidilkolin 70
(DMPC) liposzómán tanulmányoztuk a CLP-k hatását. A liposzóma-membránt a zsírsavlánc fejcsoporthoz közeli részétől a lánc végéig különböző mélységekben vizsgáltuk megfelelő spinjelölők alkalmazásával. A lipidek mozgékonysága a CLP-k
hatására a lipidlánc teljes hossza mentén csökkent (l. 4.3. szakasz), ami azt jelzi, hogy a CLP-k a membrán teljes mélységében kifejtik hatásukat. Ez az eredmény alátámasztja a csatornaképződésre vonatkozó feltevéseket, mivel a pórusok az EC és IC tér közötti ionvándorlást teszik lehetővé. Ennek egyik lehetősége, hogy a csatorna átérje a membrán teljes hosszát. Az irodalomban [103] eddig leggyakrabban előforduló pórusképződési mechanizmus szerint a pórust képző vegyület, pl. fehérje, saját maga alakítja ki a csatornát olymódon, hogy összeköttetést létesít az EC és az IC tér között. A membrán lipidjeinek ekkor a transzportban, a csatorna felépítésében nincs szerepük, csupán megfelelő környezetet biztosítanak a csatornát képező molekulák számára annyiban, amennyiben esetleg speciális lipidösszetételű területre, pl. lipid-tutajokra (raftok), korlátozódik a csatorna létrejötte. Ebben az esetben elegendő a környező lipidmolekulák
minimális
lipidmolekulák
akár
perturbációja,
kisszámú,
azaz
kötött-lipidet
a
megváltozott
tartalmazó
tulajdonságú
szolvátburokba
is
rendeződhetnek a csatornaképző molekula körül anélkül, hogy további rétegekben is számottevően megváltoznának a lipidmolekulák dinamikai tulajdonságai. Eredményeink szerint a lipidek aktívan részt vesznek a CLP pórusok kialakításában, így a CLP-k által létesített csatornákban a membrán lipidjeinek az előzőekhez képest meghatározó szerepük van. A csatornaképző vegyületnek itt két féle funkciója lehet: előidézheti a lipidmolekulák csatornákba rendeződését, és/vagy betöltheti a kapuzó-mechanizmus szerepét is. A csatornát alkotó lipidek dinamikai tulajdonságainak ennek megfelelően olyan irányban kell változniuk, hogy a hőmérsékleti
mozgásból
származó
fluktuációjuk
kisebb
legyen,
mint
a
kölcsönhatásmentes esetnek megfelelő átlagos fluktuáció. Megjegyezzük, hogy az ellenkező eset is eredményezhet nagyobb transzportsebességet: hőmérséklet emelése, pl. a termikus mozgás növekedését okozza, ami a membrán egész struktúrájának a fellazuláshoz, a membránok általános permeabilitásának a növekedéséhez vezet. A csatornákat alkotó lipidek megváltozott rendezettsége, az átlagostól eltérő transzlációs és rotációs diffúziójuk tovább stabilizálódhat, ha a csatorna legbelső falát alkotó lipidek mellett további lipidmolekulák is a csatornát felépítő lipidekkel közel azonos tulajdonságokkal rendelkeznek. Ekkor a termikus fluktuációk miatt fellépő 71
csatorna-inaktiváció sebessége csökken, azaz a csatorna élettartama megnő. A lipidcsatorna
kialakulásához
és
stabilizálásához
vezető
kölcsönhatások
akkor
a
leghatásosabbak, ha a rövidtávú kölcsönhatások mellett lehetővé teszik a viszonylag hosszú távú kölcsönhatásokat is. Ilyenek lehetnek pl.: ion-ion vagy ion-dipól kölcsönhatások. Minthogy a CLP-k rendelkeznek töltött csoportokkal, így az amfifil, dipólkarakterrel rendelkező lipidekkel ion-dipól-, vagy a töltéssel rendelkező lipidek esetében ion-ion kölcsönhatásba léphetnek. A CLP-k közül pl. az SP-k, apoláros aminosav származékaik révén további hidrofób kölcsönhatásokon keresztül is stabilizálhatják a kialakuló csatornát.
Hosszútávú (long-range) hatás. Az ESR spektrum, ha csak a monitor csoportok specifikus kötődését/felhalmozódását el nem tudjuk érni, a rendszer egészéről hordoz kiátlagolt jelet. Ettől eltérő spektrum akkor várható, ha pl. két vagy több membrándomén egymástól nagymértékben eltérő tulajdonságokkal rendelkezik. Ebben az esetben lehetséges az egyes doménekre jellemző spektrumok, többé-kevésbé elkülönült megjelenése is. Ez a helyzet pl. a gramicidin A esetében [39], ami maga körül csak a lipidek egy részét rendezi olyan domén-struktúrát kialakítva, amiben a csatorna képzésében résztvevő, illetve a „bulk” lipidek egymástól elkülönülő spektrumokat eredményeznek. A CLP-kkel végzett kísérleteinkben nem figyeltünk meg az előző doménelrendeződésre utaló spektrális változást. A CLP-k hatásának a hatóanyag koncentrációjától való függését vizsgálva a spektrum egészének jelentős változását figyeltük meg, ami arra utal, hogy a membrán lipidek többsége érintett a CLP-k által kiváltott fluiditás csökkenésben. Ez a megállapítás különösen fontos abban az esetben, amikor kisebb (< 1/40) CLP/lipid mólarányú kezelést alkalmaztunk (l. 4.3.4. szakasz). Ebben az esetben is a spektrum egyetlen komponensnek megfelelő, kiátlagolt spektrum sajátosságait mutatja. E tapasztalatok alapján feltételezzük, hogy a CLP-k lipidösszerendező hatása térben hosszú távú (long-range) kölcsönhatás, ami a membrán nagy részére kiterjed, s az elsődleges lipidhéj további lipidmolekulákat hoz hasonló rendezettségű és mobilitású állapotba. A long-range kölcsönhatás hatótávolsága homogén rendszer esetében nagyobb, hiszen ekkor a fizikai tulajdonságok homogenitása jobban biztosított. Ez az elképzelés értelmezi a membrán fluiditásában mért kisebb mértékű változásokat DPPC/DOPC és DPPC/koleszterin keverék 72
liposzómák esetében (l. 4.3.2 és 4.3.3. szakaszok). Megemlítjük, hogy lecitinből készült liposzómán és vörösvértest membránon, a keverék liposzómákhoz hasonlóan kisebb változásokat tapasztaltunk a membrán fluiditásában.
A ponthibák szerepe a CLP hatásban — redőzőtt (ripple) struktúra kialakulása A DPPC liposzómák CLP-kkel való kezelését a hideg protokoll-nak megfelelően végezve, majd a mintákat az elő-fázisátalakulási hőmérséklethez közeli hőmérsékletre melegítve (l. 4.3.1. szakasz) ESR spektrumokon a csatolási állandó jelentős, irreverzibilis megnövekedését mutattuk ki, amit úgy értelmeztünk, hogy a membránlipidek rendezettsége ugrásszerűen megnőtt. Feltételezzük, hogy a lipidek ezen a hőmérsékleten érik el azt a mozgékonyságot, ami lehetővé teszi az irreverzibilis szerkezetváltozást. A változás oka lehet: a.) az SP22A molekulák ezen a hőmérsékleten tudják felvenni a megfelelő, kedvezőbb konformációt és képesek a lipidekkel erősebb kölcsönhatást kialakítani; b.) a membrán olyan szerkezetváltozása, amelynél a lipidmolekulák dinamikai állapota, más szóval a hőmérséklet függvényében változó hibahelyek száma és ezek mozgékonysága játssza a főszerepet és nem az SP22A molekulák konformációjának módosulása. Heimburg és mtsai szerint [104] ponthibaként kezelhető a rendezett, gél állapotú membránban a lipidlánc egy olyan szegmense, amelynek irányítottsága és mozgási szabadsága eltér a környezetétől. A hőmérséklettől függ a hibahelyek száma és mozgékonysága a membránban, valamint a ponthibák vonalhibává való rendeződése. Ez utóbbi jellemzi az elő-fázisátalakulást [104]. Az általunk megfigyelt irreverzibilis változáshoz hasonló jelenségről számoltak be Shulze és munkatársai [105] egy másik csatornaképző molekula, a melittin esetében. Azt tapasztalták, hogy alacsony hőmérsékletről indulva, a melittin és a DMPC liposzóma közötti kölcsönhatás kb. 23 o
C-nál hirtelen megnő, amit a donor és az akceptor közötti energiatranszfer
növekedésében detektáltak. A jelenséget azzal magyarázták, hogy a melittin alacsonyabb hőmérsékletnél a membránfelszínnel párhuzamosan helyezkedik el, a fázisátalakulási hőmérséklet közelében viszont a membrán mélyebb rétegeibe jut [105]. 73
Ez a magyarázat az SP22A esetében nem állná meg a helyét, hiszen 28 oC alatt és SL-16 jelölőt használva még a zsírsavláncok legvégénél is kimutatható a hatása. Az SP22A hatása 28 oC alatt, valamint a 28 oC-nál történő fluiditás csökkenés az összes vizsgált spinjelölővel kimutatható volt (adatokat csak az SL-5 jelölővel mért eredményekről mutatunk be). Ez arra utal, hogy a toxin már a hideg-kezelést követően is, a membrán teljes mélységében kifejti a hatását. A kontroll és a kezelt minta közötti különbség a DPPC liposzóma főfázisátalakulási hőmérséklete (42,5 oC) fölött teljesen eltűnt. Ez a megfigyelés arra utal, hogy a CLP—lipid kölcsönhatásban kialakuló speciális membránszerkezet molekuláris dinamikai tulajdonságai a fő-fázisátalakulási pont fölött nem különböznek a kontroll liposzómában uralkodó dinamikai tulajdonságoktól. Hasonló jellegű változás figyelhető meg pl. a SUV és az MLV, a két eltérő szerkezetű liposzóma lipidmolekuláinak mozgási állapotai között: a fő-fázisátalakulási hőmérséklet fölött ebben az esetben is eltűnik az alacsonyabb hőmérsékleteken mérhető különbség (l. 4.3.5. szakasz). DMPC liposzómán vizsgálva a CLP-k hatásait az előzőkkel összecsengő eredményt kaptunk: az irreverzibilis változás kiváltásához szükséges hőmérséklet a DMPC alacsonyabb előfázisátalakulási hőmérsékletének megfelelően mintegy 13 oC. A hideg protokoll szerint inkubált DPPC és DMPC liposzómán végzett méréseink alapján kimutattuk, hogy a CLP-k hatásának kialakulásában fontos szerepe van a hibahelyek kialakulásának. A meleg protokoll szerint kezelt minták esetében várható volt, hogy már a mérés kezdetén a maximális hatás legyen megfigyelhető, mivel ekkor a CLP-kkel kezelt mintákat a mérés megkezdése előtt a fő-fázisátalakulási hőmérséklet fölött tartottuk (l. 4.3.1. szakasz). Ezzel szemben mind a DPPC-, mind a DMPC liposzómán sem az SP22A, sem az SRE hatására nem alakult ki a teljes fluiditást csökkentő hatás mindaddig, amíg a liposzómát az elő-fáziátalakulási hőmérséklet alá nem hűtöttük. A jelenség magyarázata az lehet, hogy a magas hőmérséklet ugyan lehetővé tenné az irreverzibilis szerkezetváltozást, azonban a membránlipideknek nagyobb a mozgási szabadságuk annál, hogy a CLP molekulákkal kialakuljanak azok a megfelelő hidrofób kölcsönhatások, amik az irreverzibilis változáshoz vezetnek. A membrán-fluiditásnak, valamint a ponthibák koncentrációjának és periódus távolságának a lényeges szerepére utalnak a DPPC/DOPC és a DPPC/koleszterin 74
liposzómákon kapott eredményeink. Mindkét liposzóma esetén csökkent mind a pórusképződést, mind az irreverzibilis szerkezetváltozást kísérő ESR spektrum változása. A DOPC telítetlen kötést tartalmaz mindkét zsírsavláncán, ami a lipidek rendezetlenségét, ezáltal a fluiditást növeli. A koleszterin ellentétes hatású: a membránt kompaktabbá, rigidebbé teszi. A homogén liposzómákétól eltérő fluiditás ugyan megfelelő hőmérsékleten még lehetővé tenné az irreverzibilis változás létrejöttét, azonban a keverék liposzómákban a homogén rendszerhez képest csökkent periodicitás nem teszi lehetővé a ponthibák vonalhibákká való rendeződését, a ripple struktúra kialakulását. SP22A és SRE kezelés hatására a DPPC liposzóma minta turbiditása megnőtt. A CLP-kkel kezelt liposzóma méreteloszlása kiszélesedett és a kontrollnál jóval nagyobb részecskék jelentek meg a mintában. Ebből arra következtettünk, hogy a CLP-k hatására a liposzómák aggregációja és/vagy fúziója következik be, ami élő rendszer esetében sejtfúziót jelenthet, ami megszűnteti a sejtek önállóságát és közrejátszhat a CLP-k toxikus hatásában. Előzetes adataink alapján 20% DOPC-t tartalmazó liposzóma mintán az SP22A hatására a turbiditás növekedése kisebb volt, mint tiszta DPPC liposzóma esetében. Ez alátámasztja azt az ESR spektroszkópiai módszerrel nyert eredményünket, ami szerint a telítetlen kötés jelenléte a zsírsavláncban csökkenti az SP22A hatását. Tapasztalataink és meggondolásaink alapján azt mondhatjuk, hogy az irreverzibilis változás kialakulásához az elő-fázisátalakulási hőmérséklet körüli intervallumra van szükség, ahol a hőmérséklet és a CLP-kel való kölcsönhatás együttes eredményeként a ponthibák száma már elegendően, de nem túlságosan nagy, s lehetőség van a ponthibák vonalhibákká rendeződésére. Az élő sejtek membránjának nagy része fluid állapotban van, azonban a sejtmembrán szerkezete heterogén, különböző összetételű, eltérő fluiditású doméneket tartalmaz. Az egymástól mozgékonyságban is eltérő domének, pl. a lipid-tutajok (raftok) lehetőséget biztosíthatnak kevésbé fluid membránrészek kialakulására, ahol a CLPk létrehozhatják az időben állandóbb, nem inaktiválódó pórusokat. Ezt alátámasztják Hama és mts. eredményei [85], akik feltételezték, hogy a szfingomielintartalmú raftok a CLPk fő támadáspontjai.
75
5.2.
A CLP-k szerkezeti variabilitása mint hatásos támadó eszköz A CLP-k hatáserőssége és hatásspektruma eltérő. Míg növénykárosító hatásért
inkább a syringopeptineket teszik felelőssé, addig a gombaölő hatást a syringomycin Enek tulajdonítják [61]. A gombaölő hatástól eltekintve az irodalmi adatok többsége szerint az SP-k mutatják a legerősebb biológiai hatást, ennél kisebb aktivitású az SRE és a leggyengébb az ST. Ezzel összhangban vannak vörösvértesten és liposzómán nyert eredményeink is. Az SP22A permeabilitást növelő hatása volt a legnagyobb a három vizsgált CLP származék közül: már 4´105 molekula/sejt koncentrációnál szignifikánsan növelte a membrán permeabilitását. Munkacsoportunk által korábban vizsgált SRE hasonló mértékű
permeabilitás-növelő
hatásához,
nagyobb
toxin
koncentráció,
2´106
molekula/sejt, volt szükséges [80]. A vegyületek közül az ST bizonyult a leggyengébbnek, ami 6´106 molekula/sejt koncentrációban okozott szignifikás permeábilitás növekedést. Ezzel összhangban, eredményeink alapján az ST gyengébb hemolízáló hatással rendelkezik, mint az SRE [80, 81] és az SP22A. A vizsgált koncentráció tartományban a syringotoxin — 2´106-1,3´107 molekula/vvt koncentráció mellett — kismértékű (1,3±1,8% de max < 6%) hemolízist okozott. Az SP22A és az SRE viszont már 2´106 molekula/vvt koncentrációban is 10% fölötti lízist váltott ki, ami a koncentráció emelésével még tovább nőtt. Transzportkinetikai eredményeink alapján az SP22A és az ST is növelte a vörösvértest membrán-permeabilitását, ami annak a következménye, hogy a toxinok pórusokat hoztak létre a membránon. Ágner és mtsai [81] azt találták, hogy az ST pórusokhoz hasonló inaktivációs tulajdonságokat mutatnak az SRE pórusok is, amelyek szintén inaktiválódtak 20 és 37 oC-on. 8 oC-on a három vizsgált CLP közül egyik sem okozott inaktivációt [81, 82, 83]. Az SP22A pórusok esetén pedig még 37 oC-on sem tudtunk a mérési időn belül inaktivációt kimutatni. Ezek alapján a ST csatornák inaktivációs tulajdonsága közel áll az SRE-hez, ám tőlük az SP22A pórusoké jelentősen eltér. Ez a megfigyelés arra utal, hogy a CLP-k szerkezetének és polaritásának komoly szerepe van az inaktivációban. A toxinok hidrofób része (l. 2.4.1. szakasz) stabilizálja a csatornát a membránban azáltal, hogy a lipidek hidrofób láncaival erősebb kölcsönhatást alakít ki, 76
ami magyarázatul szolgálna arra, hogy a jóval nagyobb hidrofób részt tartalmazó SP22A esetében egyáltalán nem tapasztalható inaktiváció. Az ST, az SRE-hez hasonló mérettel és hidrofób tulajdonsággal rendelkezik, viszont kisebb a töltése; fejcsoportja eggyel kevesebb pozitív töltéssel rendelkezik, mint az SREé. Valószínűleg az ST kisebb töltése vezet az ST-pórusok gyorsabb inaktivációjához, ami a hidrofób kölcsönhatások mellett a dipól-dipól kölcsönhatások fontosságára utal. 5.3.
Változatosság — hatóanyagtervezés Az előző két szakasz gondolatmenete azt a jól ismert tényt példázza, hogy a
természetben
az
élőlények
életképességük-,
életfunkcióik
fenntartásában
a
változatosságnak igen nagy szerepe van. (A biológiai rendszerek fejlődésében az okokozat összefüggés biztosan nem a gondolatmenetünknek megfelelően ment végbe, sőt egyáltalán kétséges az is: van e ok-okozati összefüggés.) A támadás ellen a sejtek, úgy tűnik, akkor tudnak eséllyel védekezni, ha a sejtmembránjuk összetétele heterogén. További lehetőség a heterogenitás mellett a speciális összetétel, bizonyos lipidek, fehérjék és más membrán-alkotók hiánya, vagy éppenséggel megléte. A támadó oldaláról szemlélve akkor lehet hatásos a támadás, ha egy uniform alapstruktúrára építve, megfelelő változatosságú funkciós csoporttal egészül ki a „fegyver”. Eredményeink, meggondolásaink arra utalnak, hogy akkor lehet hatásos, szelektív tulajdonságú antifungális CLP-ket szintetizálni, ha a.) az alapváz, a laktongyűrű, felépítésében résztvevő aminosavak polaritását, töltését b.) a laktongyűrűhöz kapcsolódó aminosavlánc primér szerkezetét, hosszát c.) a kiegészítő szénhidrogénlánc típusát változtatva további információkat tudunk összegyűjteni a szerkezet és a hozzá kapcsolódó funkció összefüggéseiről.
77
6. KÖVETKEZTETÉSEK A CLP-k a gombaölő hatású vegyületek. A terápiában való felhasználhatóság feltétele a szelektív toxicitás, melynek eléréséhez szükséges a szerkezet és a funkció közötti kapcsolatok feltérképezése. A munkacsoportunk korábbi vizsgálataiban kimutatta, hogy syringomycin E (SRE) pórusokat hozott létre humán vörösvértest (vvt) membránban, és a vvt-k egy részét hemolizálta. A több monomerből felépülő SRE csatornák inaktiválódtak 37
o
C-on és 20
o
C-on, viszont 8
o
C-on, a vvt
membránlipidjeinek fő-fázisátalakulási hőmérséklete alatt, nem volt inaktiváció tapasztalható. A CLP-k szerkezete és hatása közötti összefüggések megismerése érdekében megvizsgáltuk két másik CLP származék, az SP22A és az ST hatásait vörösvértest membránon és különböző lipid-összetételű liposzómákon. Eredményeink alapján az alábbi megállapításokat tettük: I.1.
A két CLP, az SP22A és az SRE csak részleges hemolízist okozott. A transzport méréseknél alkalmazott toxin koncentrációknál az SP22A esetében kimutatható lízist nem tapasztaltunk, az ST estében pedig a mért lízis 6% alatt volt. A vörösvértest membrán permeabilitását SP22A, mind az ST növelték. A
86
86
Rb+-ra nézve mind az
Rb+ transzport kinetikai eredmények
alapján megállapítottuk, hogy az SP22A és az ST vvt membránban pórusokat alakít ki, amelynek mérete a
86
Rb+- és a Hgb monomerek
kiáramlását teszi lehetővé. I.2.
A membrán-permeabilitás növekedés mindkét toxin esetében arányos volt az alkalmazott CLP koncentrációval, azonban a két vegyület hatáserőssége különbözött. A három CLP számazék közül, a vvt-n előidézett permeabilitás növelő hatás alapján, a legerősebb pórusképző hatással az SP22A rendelkezik, ennél gyengébb a korábban vizsgált SRE és a leggyengébb az ST. Az ST esetében a megnövekedett permeabilitás jóval az egyensúlyi 86Rb+- ill. Hgb eloszlás elérése előtt visszacsökkent a kontroll minta értékére 20 oC- és 37 oC-on, azonban 8 oC-on nem. Ebből azt a következtetést vontuk le, hogy az ST csatornák inaktiválódnak 20 oC- és 37 oC-on, azonban 8 oC-on a mérés ideje alatt stabilak maradtak. Az SP22A esetében a membrán megnövekedett permeábilitása még 37 oC-on sem csökkent vissza. 78
I.3.
A CLP csatornákon keresztül történő
86
Rb+-efflux leírására transzport
kinetikai modellt dolgoztunk ki. A modell segítségével meghatároztuk az ST pórusok átlagos élettartamát és a 86Rb+-transzport sebességi állandóit. Számításaink szerint az ST csatornák átlagos élettartam 37 oC-on 2 percnél
I.4.
rövidebbnek, 20 oC-on 2 percnél hosszabbnak, 8 oC-on pedig a mérés időtartamánál hosszabbnak adódott. A hőmérséklettől függő inaktivációból megállapítottuk, hogy az inaktiváció sebességét a fluiditás befolyásolja: ha nagyobb a fluiditás, akkor csökken a csatornák átlagos élettartama. Az SP22A még 37 oC-on sem inaktiválódott, ami azt mutatja, hogy jóval stabilabb csatornát hoz létre, mint az ST és a korábban vizsgált SRE. A modell segítségével meghatároztuk a
86
Rb+-transzport sebességi
állandóját az ST pórusokon keresztül (kp). A kp sebességi állandókból kiszámoltuk a pórusok
86
Rb+-ra vonatkozó permeábilitási állandót (pp),
melynek koncentráció függéséből (Hill szerinti ábrázolásban [100]) megállapítottuk, hogy az ST, hasonlóan az SP22A-hoz és a korábban vizsgált SRE-hez, több monomerből álló pórust hoz létre vörösvértesten. A
három
vegyület
pórusképző
aktivitásából
és
eltérő
inaktivációs
tulajdonságaikból arra következtettünk, hogy a nagyobb hidrofób molekularész nagyobb pórusképző aktivitást biztosít az SP22A-nak és stabilizálja a pórust a membránban. A hidofób karakter mellett a toxin töltésének is szerepe van: a két nettó pozitív töltéssel rendekező SRE pórusok élettartama hosszabb, mint az egy nettó pozitív töltésű SRE-é; nagyobb pozitív töltés szintén stabilizálja a csatornát. A CLP-k molekuláris hatásmechanizmusának közelebbi megismerése érdekében különböző lipidösszetételű liposzómákon vizsgáltuk a három CLP származék, az SP22A, az SRE és az ST hatásait. Eredményeink alapján az alábbi következtetéseket vontuk le: II.1.
A telített lipidekből készült SUV liposzómák fluiditása mindhárom CLP származék hatására csökkent. A fluiditást csökkentő hatás a membrán teljes mélységében megfigyelhető volt. Az SP22A és az SRE már igen kis ¾ 1/400 toxin molekula/lipid ¾ koncentrációnális szignifikáns csökkenést okozott a fluiditásban. A fluiditás változásából, valamint a CLP-k hatásának koncentráció-függéséből arra következtettünk, hogy a CLP-k bevonják a lipideket a csatornaképzésbe, velük együtt alakítják ki a pórusokat. 79
Eredményeink alapján az SP22A rendelkezik a legerősebb fluiditás csökkentő hatással, gyengébb az SRE és a leggyengébb az ST. II.2.
Számítógépes
spektrumszimulációval
megállapítottuk, csökkenésnek
hogy
a
megfelelően
CLP-k a
nyert
eredményeink
alapján
hatására
bekövettkezett
fluiditás
mozgási-
forgási
membránlipidek
és
szabadsága kisebb lett, nőtt a rendezettségük. II.3.
Az SRE-vel és az SP22A-val, különböző hőmérsékleteken végzett eredményeink
szerint,
az
elő-fázisátalakulási
hőmérséklet
közelében
irreverzibilis szerkezetváltozás jön létre, amihez az SRE esetében magasabb hőmérséklet volt szükséges. Ez is alátámasztotta a következtetésünket, miszerint a CLP-k hatáserrőségét a hidrofób rész nagysága és a pozitív töltések száma növeli. Az előfázisátalakulási hőmérséklet közelében bekövetkező irreverzibilis szerkezet-változás, és az eredményünk, hogy MLV-n az SP22A hatása jóval gyengébb volt, mint SUV-on, ami azt jelzi, hogy a membrán megfelelően nagy fluiditása növeli a CLP-k hatását. Az SP22A és az SRE teljes hatásának kialakulásához megfelelően alacsony hőmérséklet is szükséges volt, ebből arra következtettünk, hogy a CLP-k teljes hatásának kialakulásához a membránnak megfelelően rigidnek is kell lennie. II.4.
A lipidek telítetlen kötésének a CLP-k hatására gyakorolt befolyását vizsgáltuk különböző arányban DPPC-t és DOPC-t tartalmazó keverék liposzómákon. A kontroll és a CLP-vel kezelt liposzómák között kisebb volt a fluiditás különbség, mint a tiszta DPPC liposzómák esetében. A különbség annál kisebb volt, minnél nagyobb arányban tartalmazott a membrán DOPC-t, ebből arra következtettünk, hogy a kettős kötést tartalmazó DOPC csökkenti a CLP-k hatását. DPPC-koleszterin keverék liposzómákon szintén csökkent az SP22A hatása, a koleszterin koncentrációjától függő mértékben. A DPPC-DOPC és DPPCkoleszterin keverék liposzómákon nyert eredményeink, arra utalnak, hogy a membrán inhomogenitása csökkenti a CLP-k hatását, valamint összhangban az irodalmi adatokkal, valószínüleg a sejtmembrán lipid raftjai biztosítják a megfelelő támadáspontot a CLP-k számára.
II.5.
DPPC-ből készült SUV liposzómán az SP22A által kiváltott irreverzibilis szerkezetváltozást 31 oC-körül tapasztaltuk. 31 oC fölött az SP22A-val kezelt 80
SUV liposzómák fluiditása hozzávetőlegesen megegyezett az MLV liposzómák fluiditásával, amiből azt a következtetést vontuk le, hogy az irreverzibilis változás az MLV-hez hasonló szerkezetet hoz létre. Az MLVhez hasonló rendezettségű szerkezet létrejöhet, pl. a lipid kettőrétegek egymáshoz „tapadásával” aggregáció következményeként, vagy nagy unilamelláris
liposzóma
kialakulásakor,
fúzió,
ill.
koaleszencia
következményeként. A liposzómák méreteloszlását meghatároztuk dinamikus fényszórásméréssel. A fenti eredményekkel összhangban az SP22A és az SRE hatására a DPPC liposzómák méreteloszlása kiszélesedett. A CLP-kel kezelt mintákban a kontollnál jóval nagyobb méretű részecskék jelentek meg, ami arra utal, hogy a CLP-k hatására a liposzómák koaleszkáltak, fúzionáltak és/vagy aggregálódtak. Ez a jelenség élő sejtek esetében a sikeres bakteriális támadást jelentheti: a baktérium ebben az esetben hozzájut a célsejt intracelluláris terének anyagaihoz. Eredményeink alapján az SP22A molekulával sikerült olyan CLP származékot találunk, ami nagy hatáserősségű és a sejtmembránban stabil csatornát hoz létre, ugyanakkor nincs hemolizáló hatása abban a koncentrációban alkalmazva, amikor a permeábilitás már szignifikánsan nő, szemben az SRE-vel és az ST-vel. Sikerült információt szereznünk a CLP-k két fő részegységének, a laktongyűrűnek és a pepdidláncnak a CLP-k hatásában játszott szerepéről, valamint a membrán lipidösszetételének a sejtek védekezésében/ellenállóképességében játszott szerepéről. Eredményeinkkel közelebb jutottunk ahhoz a távlati célhoz, hogy szelektív toxicitású hatóanyagot találjunk a humán terápia számára, ami megfelelően hatékony lenne a gombasejteken, ugyanakkor nem károsítaná az emberi sejteket.
81
7. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Ezúton szeretnék köszönetet mondani mindazoknak, akik segítségemre voltak e dolgozat elkészülésében. Köszönöm Dr. Fidy Juditnak, a Biofizikai és Sugárbiológiai Intézet igazgatójának, hogy lehetővé tette számomra, hogy az Intézetben dolgozhassam. Köszönöm Dr. Rontó Györgyinek, programvezetőmnek mindazt a segítséget és odafigyelést, amivel végigkísérte munkámat, továbbá hasznos tanácsait és példamutató munkaszeretetét. Szeretnék köszönetet mondani témavezetőmnek, Dr. Blaskó Katalinnak, hogy, már gyógyszerészhallgató koromban, felkeltette érdeklődésemet a téma iránt; és a négy éves doktori munkám során bizalommal és felelősséggel viseltetett irántam, továbbá köszönöm mindazt a segítséget és biztatást, amit a doktori munkám során nyújtott, és hogy az Intézetben töltött évek alatt mindig számíthattam a támogatására. Köszönöm Dr. Gróf Pálnak a rengeteg segítséget, ami a doktori munkám szinte minden részletére kiterjedt; a közös munka örömét, a korlátok nélküli gondolkodás és kutatómunka varázsát, ami miatt a gyakran időigényes és fáradságos feladatokat nem éreztem megterhelő munkának, hanem mindig szívesen végeztem. Szeretném megköszönni Dr. Ludmilla Schaginának, és Dr. Ágner Gabriellának segítségüket és hasznos beszélgetéseinket. Köszönettel tartozom Dr. Módos Károlynak a kinetikai modell kidolgozásában és a fényszórásmérésben nyújtott segítségéért. Köszönetem fejezem ki Iszlai Ágnes és Wolfné Szabó Anna asszisztenseknek a transzport mérések kivitelezésében-, és Bányai Gyulánénak a liposzóma preparálásban nyújtott segítségét. Továbbá köszönettel tartozom minden kedves kollégámnak, akik hozzájárultak ahhoz, hogy kellemes környezetben végezzem a munkámat. Köszönöm a szüleimnek, hogy életem során minden erkölcsi és anyagi támogatást megkaptam a tanuláshoz, hogy igyekeztek mindig a lehető legjobb feltételeket biztosítani számomra, ami lehetővé tette doktori munkám elvégzését.
82
8. IRODALOMJEGYZÉK 1 Kórélettan, szerk: Szollár Lajos; Semmelweis Kiadó 1993. 2 Kumar V., Cotran R.S., Robbins S.L., A pathológia alapjai; Semmelweis Kiadó 1994. 3 Orvosi biokémia; szerk: Ádám Veronika, Semmelweis Kiadó 1996. 4 Gárdos György, Szász Ilma, Sarkadi Balázs, Membránok és membránbetegségek; Medicina Könyvkiadó, Budapest, 1983. 5 A biomembránok szerkezete és működése, Szerk: Somogyi János, Akadémiai Kiadó, Budapest, 1989. 6 Fonyó A. Az orvosi élettan tankönyve, Medicina Könyvkiadó, Budapest 1997. 7 Cullis P.R., Fenske D.B., Hope M.J. Biochemistry of lipids, lipoproteins and membranes, 1996, Eds.: Vance D.E. vance J.E., Elsevier, Amsterdam, 134.oldal, Physical properties and functional roles of lipids in membrane 8 Marsh D. Electron Spin Resonance: Spin Labels. In: Molecular Biology Biochemistry and Biophysics Vol. 31.: Membrane Spectroscopy (ed.: Grell E.) pp. 51-142. Springer-Verlag. Berlin Heidelberg New York, 1981. 9 Dr. Pajor László: A sejtmembrán hydrophor regiojának szerkezeti változása és ennek funkcionális jelentősége sejtactivatio valamint reactiv és daganatos sejtproliferáció során, Kandidátusi értekezés, 1990. 10 Alberts B., Bray D., Lewis J., Raff M., Roberts K., Watson J.D., Molecular Biology of the Cell, Garland Publishing Inc, New York, London, 1989. 11 Singer S.J., Nicolson G.L., The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science. (1972) 175(23):720-31. 12 Chalmers R.A. Comparison and potential of hypo-osmotic and iso-osmotic erythrocyte ghosts and carrier erythrocytes as drug and enzyme carriers. Bibl Haematol. (1985) (51):15-24. 13 Montall M., Mueller P., Formation of bimolecular membranes from lipid monolayers and a study of their electrical properties, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69 (1972) 3561-3566. 14 Liposome Technology, szerk: Gregory Gregoriadis, CRC Press, London, 2000. 15 Saberwal G., Nagaraj R., Cell-lytic and antibacterial peptides that act by perturbing the barrier function of membranes: facets of their conformational 83
features, structure-function correlations and membrane-perturbing abilities. Biochim. Biophys. Acta 1197 (1994) 109-131. 16 Maloy W.L., Kari U.P., Structure-activity studies on magainins and other host defense peptides. Biopolymers (Pept. Sci) 37 (1995) 105-122. 17 Matsuzaki K., Magainins as paradigm for the mode of action of pore forming polypeptides. Biochim. Biophys. Acta 1376 (1998) 391-400. 18 Sitaram N., Nagaraj R., Interaction of antimicrobial peptides with biological and model membranes: structural and charge requirements for activity. Biochim. Biophys. Acta 1462 (1999) 29-54. 19 Gilbert R.J., Pore-forming toxins. Cell Mol. Life Sci. 59(5) (2002) 832-844. 20 Hutchinson M.L., Tester M.A., Gross D.C., Role of Biosurfactant and Ion Channel-Forming Activities of Syringomycin in Transmembrane Ion Flux: A Model for the Mechanism of Action in the Plant-Pathogen Interaction. Mol. Plant Microbe Interact 8(4) (1995) 610-620. 21 Feigin A.M., Takemoto J.Y., Wangspa R., Teeter J.H., Brand J.G., Properties of Voltage-gated Ion Channels Formed by Syringomycin E in Planar Lipid Bilayers. Membr Biol 149 (1996) 41-47. 22 Hutchinson M.L., Gross D.C., Lipopeptide Phytotoxins Produced by Pseudomonas syringae pv. syringae: Comparison of the Biosurfactant and Ion Channel-Forming Activities of Syringopeptin and Syringomycin. Mol. Plant Microbe Interact 10(3) (1997) 347-354. 23 Dalla Serra M., Fagiuoli G., Nordera P., Bernhart I., Della Volpe C., Di Giorgio D., Ballio A., Menestrina G., The Interaction of Lipodepsipeptide Toxins from Pseudomonas syringae pv. syringae with Biological and Model Membranes: A Comparison of Syringotoxin, Syringomycin, and Two Syringopeptins. Mol. Plant Microbe Interact 12(5) (1999) 391-400. 24 Dalla Serra M., Bernhart I., Nordera P., Di Giorgio D., Ballio A., Menestrina G., Conductive properties and gating of channels formed by syringopeptin 25A, a bioactive lipodepsipeptide from Pseudomonas syringae pv. syringae, in planar lipid membranes. Mol Plant Microbe Interact 12(5) (1999) 401-409. 25 Menestrina G., Dalla Serra M., Prevost G., Mode of action of beta-barrel poreforming toxins of the staphylococcal alpha-hemolysin family. Toxicon 39(11) (2001) 1661-1672.
84
26 Segre A., Bachmann R.C. Ballio A., Bossa F., Grgurina I., Iacobellis N.S., Marino G., Pucci P., Simacco M., Takemoto J.Y., The structure of syringomycins A1, E and G. FEBS Lett. 255 (1989) 27-31. 27 Vaillo E., Ballio A., Luisi P.-L., Thomas R.M., The spectroscopic properties of the lipodepsipeptide, syringomycin E. Biopolymers 32 (1992) 1317-1326. 28 Fukuchi N., Isogai A., Nakayma J., Takayama S., Yamasita S., Suyama K., Takemoto J.Y., Suzuki A., Structure and Stereochemistry of Three Phytotoxins, Syringomycin, Syringotoxin and Syringostatin, Produced by Pseudomonas syringae pv. syringae. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 (1992) 1149-1157. 29 Ballio A., Bossa F., Di Giorgio D., Di Nola A., Manetti C., Paci M., Scaloni A., Segre A.L., Solution conformation of the Pseudomonas syringae pv. syringae phytotoxic lipodepsipeptide syringopeptin 25-A. Two-dimensional NMR, distance geometry and molecular dynamics. Eur. J. Biochem 234 (1995) 747758. 30 Sitaram N., Subbalakshmi C., Nagaraj R., Structural and charge requirements for antimicrobial and hemolytic activity in the peptide PKLLETFLSKWIG, corresponding to the hydrophobic region of the antimicrobial protein bovine seminalplasmin. Int. J. Pept. Protein Res. 46 (1995) 166-173. 31 Sitaram N., Chandy M., Pillai V.N.R., Nagaraj R., Change of glutamic acid to lysine in a 13-residue antibacterial and hemolytic peptide results in enhanced antibacterial activity without increase in hemolytic activity. Antimicrob. Agents Chemoter. 36 (1992) 2468-2472. 32 Oren Z., Shai Y., A class of highly potent antibacterial peptides derived from pardaxin, a pore-forming peptide isolated from Moses sole fish Pardachirus marmoratus. Eur. J. Biochem 237(1) (1996) 303-310. 33 Perez-Paya E., Houghten R.A., Blondelle S.E., The role of amphipathicity in the folding, self-association and biological activity of multiple subunit small proteins. J. Biol. Chem 270(3) (1995) 1048-56. 34 Blaskó K, Schagina L.V., Györgyi S., Lev A.A., The mode of action of some antibiotics on red blood cell membranes. Gen Physiol Biophys.,5(6) (1986) 625-36. 35 Sugár I.P., Blaskó K., Györgyi S., Schagina L.V., Malev V.V., Lev A.A., Cooperative binding of primycin and gramicidin on erythrocyte membranes. A
85
cation transport study. Membr Biochem. 8(1) (1989) 1-10. 36 Hladky S.B., Haydon D.A., Ion transfer across lipid membranes in the presence of gramicidin A. I. Studies of the unit conductance channel. Biochim Biophys Acta. 274(2) (1972) 294-312. 37 Tosteson D.C., Effect of macrocyclic compounds on the ionic permeability of artificial and natural membranes. Fed Proc. 27(6) (1968) 1269-77. 38 Epand R.M., Vogel H.J., Diversity of antimicrobial peptides and their mechanisms of action. Biochim Biophys Acta. 1462(1-2) )1999) 11-28. 39 Ge M, Freed J.H., Electron-spin resonance study of aggregation of gramicidin in dipalmitoylphosphatidylcholine bilayers and hydrophobic mismatch. Biophys J. 76(1 Pt 1) (1999) 264-80. 40 Blaskó K., Schagina L.V. Grinfeldt A.E., Lev A.A., The dependence of tracerdetermined permeability coefficients of gramicidin A-treated red blood cell membranes and lipid bilayers on the ionic composition of the media. Bioelectochemistry and Bioenergetics, 19(1988) 127-135. 41 Schagina L.V., Blaskó K., Grinfeldt A.E., Korchev Y.E., Lev A.A., Cholesterol-dependent gramicidin A channel inactivation in red blood cell membranes and lipid bilayer membranes. Biochim Biophys Acta. 978(1) (1989) 145-50. 42 Schagina L.V., Korchev Y.E., Grinfeldt A.E., Lev A.A., Blasto K. Sterol specific inactivation of gramicidin A induced membrane cation permeability. Biochim Biophys Acta. 1109(1) (1992) 91-96. 43 Caffrey P., Lynch S., Flood E., Finnan S., Oliynyk M., Amphotericin biosynthesis in Streptomyces nodosus: deductions from analysis of polyketide synthase and late genes. Chem Biol. 8(7) (2001) 713-23. 44 Abu-Salah K.M., Amphotericin B: an update. Br J Biomed Sci. 53(2) (1996) 122-33. 45 Gyógyszertan, szerk: Fürst Zsuzsanna, Medicina Könyvkiadó, Budapest, 1998. 46 Baginski M., Resat H., Borowski E., Comparative molecular dynamics simulations of amphotericin B-cholesterol/ergosterol membrane channels. Biochim Biophys Acta. 1567(1-2) (2002) 63-78. 47 De Kuriff B., Demel R.A., Polyen antibiotic-sterol interactions in membranes of Acholeplasma Laidlawii cells and lecithin liposomes III. Molecular structure of
86
the polyen antibiotic-cholesterol complexes. Biochim Biophys Acta. 339 (1974), 57-70. 48 van Hoogevest P., de Kruijff B., Effect of amphotericin B on cholesterolcontaining liposomes of egg phosphatidylcholine and didocosenoyl phosphatidylcholine. A refinement of the model for the formation of pores by amphotericin B in membranes. Biochim Biophys Acta. 511(3) (1978) 397-407. 49 Ellis D., Amphotericin B: spectrum and resistance. J Antimicrob Chemother. 49 Suppl 1 (2002) 7-10. 50 Orvosi Mikrobiológia szerkesztette: Gergely Lajos, Semmelweis Kiadó, Budapest, 1999. 51 Arikan S., Lipid-based antifungal agents: a concise overview. Cell Mol Biol Lett. 7(3) (2002) 919-22. 52 Maesaki S., Drug delivery system of anti-fungal and parasitic agents. Curr Pharm Des. 8(6) (2002) 433-40. 53 Lambros M.P., Bourne D.W., Abbas S.A., Johnson D.L., Disposition of aerosolized liposomal amphotericin B. J Pharm Sci. 86(9) (1997) 1066-9. 54 Balin H., Review of candidal vaginitis - use of candicidin in its treatment. Pa Med. 77(12) (1974) 37-9. 55 Kivinen S., Tarkkila T., Laakso L., Laakso K., Short-term topical treatment of vulvovaginal candidiasis with the combination of 5-fluorocytosine and candicidin. Curr Med Res Opin. 6(2) (1979) 88-92. 56 Manzouri B., Vafidis G.C., Wyse R.K., Pharmacotherapy of fungal eye infections. Expert Opin Pharmacother. 2(11) (2001) 1849-57. 57 Rubin A.I., Bagheri B., Scher R.K., Six novel antimycotics. Am J Clin Dermatol. 3(2) (2002) 71-81. 58 Chandrasekar P.H., Manavathu E., Voriconazole: A second-generation triazole. Drugs Today (Barc). 37(2) (2001) 135-148. 59 Khardori N., Nguyen H., Stephens L.C., Kalvakuntla L., Rosenbaum B., Bodey G.P., Comparative efficacies of cilofungin (Ly121019) and amphotericin B against disseminated Candida albicans infection in normal and granulocytopenic mice. Antimicrob Agents Chemother. 37(4) (1993) 729-36. 60 Ruiz-Herrera J., San-Blas G., Chitin synthesis as target for antifungal drugs. Curr Drug Targets Infect Disord 3(1) (2003) 77-91.
87
61 Lavermicocca P., Sante Iacobellis N., Simmaco M., Graniti A., Biological properties and spectrum of activity of Pseudomonas syringae pv. syringae toxins Physiol. Mol. Plant Pathol. 50 (1997) 129-140. 62 Di Giorgio D., Camoni L., Mott K.A., Takemoto J.Y., Ballio A., Syringopeptins, Pseudomonas syringae pv. syringae phytotoxins, resemble syringomycin in closing stomata. Plant Pathol. 45 (1996) 564-571. 63 Carpaneto A., Dalla Serra M., Menestrina G., Fogliano V., Gambale F., The phytotoxic lipodepsipeptide syringopeptin 25A from Pseudomonas syringae pv syringae forms ion channels in sugar beet vacuoles. J Membr Biol. 188(3) (2002) 237-48. 64 Iacobellis N.S., Lavermicocca P., Grgurina I., Simmaco M., Ballio A., Phytotoxic properties of Pseudomonas syringae pv. syringae toxins. Physiol. Mol. Plant Pathol. 40 (1992) 107-116. 65 Reidl H.H., Takemoto J.Y., Mechanism of action of bacterial phytotoxin, syringomycin. Simultaneous measurement of early responses in yeast and maize Biochim Biophys Acta., 898 (1987) 59-69 66 Gross, D.C. and DeVay J.E., Role of Syringomycin in holcus spot of maize and systemic necrosis of cowpea caused by Pseudomonas syringae. Physiol.Plant Pathol. 11 (1977) 1-11. 67 Takemoto J.Y., Zhang L., Taguchi N., Tachikawa T., Miyakawa T., Mechanism of action of the phytotoxin syringomycin: a resistant mutant of Saccharomyces cerevisae reveals an involvement of Ca2+ transport J.Gen.Microbiol., 137 (1991) 653-659. 68 Sorensen K.N., Kim K.H., Takemoto J.Y., In vitro antifungal and fungicidal activities and erythrocyte toxicities of cyclic lipodepsinonapeptides produced by Pseudomonas syringae pv. syringae. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 40 (1996) 2710-2713. 69 Grgurina I., Barca A., Cervigni S., Gallo M., Scaloni A, Pucci P., Relevance of chlorine-substituent for the antifungal activity of syringomycin and syringotoxin, metabolites of the phytopathogenic bacterium Pseudomonas syringae pv syringae. Experientia, 50 (1994) 130-133. 70 Julmanop C.,Takano Y.,Takemoto J.Y., MiyakawaT., Protection by sterols against the cytotoxicity of syringomycin in the yeast Saccharomyces
88
cerevisiaeJ.Gen.Microbiol., 139 (1993) 2323-2327. 71 Zhang L., Takemoto J.Y., Mechanism of action of Pseudomonas syringae phytotoxin, syringomycin. Interaction with the plasma membrane of wild-type and respiratory-deficient strains of Saccharomyces cerevisiae. Biochim Biophys Acta., 861 (1986) 201-204. 72 Sorensen K.N., Wanstrom A.A., Allen S.D., Takemoto J.Y., Efficacy of Syringomycin E in a Murine Modelof Vaginal Candidiasis., J Antibiotics, 51 (1998) 743-749. 73 Sinden S.L., Devay J.E., Backman P.A., Properties of Syringomycin, a wide spectrum antibiotic and phytotoxin produced by Pseudomonas syringae, and its role in the bacterial canker disease of peach trees. Physiol.Plant Pathol. 1 (1971) 199-213. 74 De Lucca, A.J.; Jacks, T.J.; Takemoto, J.Y.; Vinyard, B.; Peter, J.; Navarro, E.; Walsh, T.J.; Fungal Lethality, Binding, and Cytotoxicity of Syringomycin-E., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 43 (1999) 371-373. 75 Ballio A., Bossa F., Collina A., Gallo M., Iacobellis N.S., Paci M., Pucci P., Scaloni A., Segre A., Simacco M., Structure of syringotoxin, a bioactive metabolite of Pseudomonas syringae pv. syringae. FEBS Lett. 269(2) (1990) 377-380. 76 Ballio A., Bossa F., Di Giorgio D., Ferranti P., Paci M., Pucci P., Scaloni A., Segre A., Strobel G.A., Novel bioactive lipodepsipeptides from Pseudomonas syringae: the pseudomycins. FEBS Lett., 355(1) (1994) 96-100. 77 Ballio A., Barra D., Bossa F., Collina A., Grgurina I., Marino G., Moneti G., Paci M., Pucci P., Segre A., Simmaco M., Syringopeptins, new phytotoxic lipodepsipeptides of Pseudomonas syringae pv. syringae. FEBS Lett. 291 (1991) 109-112. 78 Batoko H., de Kerchove-d'Exaerde A., Kinet J.M., Bouharmont J., Gage R.A., Maraite H., Boutry M., Modulation of plant plasma membrane H+-ATPase by phytotoxic lipodepsipeptides produced by the plant pathogen Pseudomonas fuscovaginae. Biochim. Biophys. Acta 1372(2) (1998) 216-226. 79 Feigin, A.M.,Schagina, L.V.,Takemoto ,J.Y., Teeter, J.H. Brand, J.G., The effect of sterols on the sensitivity of membranes to the channel-forming antifungal antibiotic,syringomycin E. Biochim Biophys Acta. 1324 (1997) 102-
89
110. 80 Blaskó K., Schagina L.V., Ágner G., Kaulin Y.A., Takemoto J.Y., Membrane sterol composition modulates the pore forming activity of syringomycin E in human red blood cells. Biochim Biophys Acta. 1373 (1998) 163-169. 81 Ágner G., Kaulin Y.A., Schagina L.V., Takemoto J.Y., Blaskó K., Effect of temperature on the formation and inactivation of syringomycin E pores in human red blood cells and bimolecular lipid membranes. Biochim Biophys Acta 1466(1-2) (2000) 79-86. 82 Ágner G., Kaulin Y.A., Gurnev P.A., Szabó Zs., Schagina L.V., Takemoto J.Y., Blaskó K., Membrane-permeabilizing activities of cyclic lipodepsipeptides, syringopeptin 22A and syringomycin E from Pseudomonas syringae pv. syringae in human red blood cells and in bilayer lipid membranes. Bioelectrochemistry 52(2) (2000) 161-167. 83 Szabó Zs., Gróf P., Schagina L.V., Gurnev P.A., Takemoto J.Y., Mátyus E., Blaskó K., Syringotoxin pore formation and inactivation in human red blood cell and model bilayer lipid membranes. BBA, 1567(1-2) (2002) 143-149. 84 Wangspa R., Takemoto J.Y., Role of ergosterol in growth inhibition of Saccharomyces cerevisiae by Syringomycin E. FEMS Microbiol. Lett. 167 (1998) 215-220. 85 Hama H., Young D.A., Radding J.A., Ma D., Tang J., Stock S.D, Takemoto J.Y., Requirement of sphingolipid a-hydroxylation for fungicidal action of syringomycin E. FEBS Lett 478(1-2) (2000) 26-28. 86 Stock S.D., Hama H., Radding J.A., Young D.A., Takemoto J.Y., Syringomycin E inhibition of Saccharomyces cerevisiae: requirement for biosynthesis of sphingolipids with very-long-chain fatty acids and mannose- and phosphoinositol-containing head groups. Antimicrob. Agents Chemoter. 44(5) (2000) 1174-80. 87 Kaulin Y.A., Schagina L.V., Bezrukov S.M., Malev V.V., Feigin A.M., Takemoto JY, Teeter JH, Brand JG. Cluster organization of ion channels formed by the antibiotic syringomycin E in bilayer lipid membranes. Biophys J. 74(6) (1998) 2918-25. 88 Spin Labeling, Theory and Applications, szerk: L.J. Berliner, Academic Press, New York, San Francisco, London, 1976.
90
89 Structural and Resonance Techniques in Biological Research, szerk: D.L. Rousseau, Academic Press, Orlando, San Diego, New York, London, Toronto, Montreal, Sydney, Tokyo, 1984. 90 Bidwai A.P., Zhang L., Bachmann R.C., Takemoto J.Y., Mechanism of action of Pseudomonas syringae phytotoxin syringomycin. Stimulation of red beef plasma membrane ATPase activity. Plant Physiol. 83 (1987) 39-43. 91 Sten-Knudsen O., Passive transport processes, in: G. Giebish, D.C. Tosteson, H.H. Ussing, (Eds.), Membrane transport in Biology, Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, 1978, 5-114. 92 Engstrom K.G., Mollet B., Meiselman H.J., Optical evaluation of red blood cell geometry using micropipette aspiration, Blood Cells. 18(2) (1992) 241-265. 93 Subczynski W.K., Lomnicka M., Hyde J.S., Permeability of nitric oxide through lipid bilayer membranes. Free Radic Res. 24(5) (1996) 343-9. 94 Todd A.P., Mehlhorn R.J., Macey R.I., Amine spin probe permeability in sonicated liposomes. J Membr Biol. 109(1) (1989) 53-64. 95 Saphier O., Silberstein T., Shames A.I., Likhtenshtein G.I., Maimon E., Mankuta D., Mazor M., Katz M., Meyerstein D., Meyerstein N., The reduction of a nitroxide spin label as a probe of human blood antioxidant properties. Free Radic Res. 37(3) (2003) 301-8. 96 Meirovitch E., Nayeem A., Freed J.H., Analysis of protein-lipid interactions based on model simulations of electron spin resonance spectra. J. Phys. Chem. 88 (1984) 3454-3465. 97 Meirovitch E., Igner D., Igner E., Moro G., Freed J.H., Electron-spin relaxation and ordering in smectic and supercooled nematic liquid crystals. J. Chem. Phys. 77 (1982) 3915-3938. 98 Ge M., Budil D.E., Freed J.H., ESR studies of spin-labeled membranes aligned by isopotential spin-dry ultracentrifugation: lipid-protein interactions. Biophys J. 67 (1994) 2326-2344. 99 Budil D.E., Lee S., Saxena S., Freed J. H., Nonlinear-Least-Squares Analysis of Slow-Motion EPR Spectra in One and Two Dimensions Using a Modified Levenberg–Marquardt Algorithm. J. Magn. Res. 120 (1996) 139-284. 100 Metzler D.E., Biochemistry, Academic Press, New York, 1977. 101 Malev V.V., Schagina L.V., Gurnev P.A., Takemoto J.Y., Nestorovich E.M., 91
Bezrukov S.M., Syringomycin E channel: a lipidic pore stabilized by lipopeptide? Biophys J. 82(4) (2002) 1985-94. 102 Rapaport D., Peled R., Nir S., Shai Y., Reversible surface aggregation in pore formation by pardaxin. Biophys J. 70(6) (1996) 2502-12. 103 Alouf J.E., Molecular features of the cytolytic pore-forming bacterial protein toxins. Folia Microbiol 48(1) (2003) 5-16 104 Heimburg T., A model for the lipid pretransition: coupling of ripple formation with the chain-melting transition. Biophys J. 78 (2000) 1154-1165. 105 Schulze J., Mischeck U., Wigand S., Galla H.J., Incorporation of highly purified melittin into phosphatidylcholine bilayer vesicles. Biochim Biophys Acta. 901(1) (1987) 101-11. 106 Ekman A., Mauninen W., Salminen S. Acta Physiol. Scand. 75 (1969) 333
92
9. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE
Az értekezés témájában megjelent saját közlemények PUBLIKÁCIÓK: Gabriella Ágner, Yuri A. Kaulin, Philip A. Gurnev, Zsófia Szabó, Ludmilla V. Schagina, John Y. Takemoto, Katalin Blaskó Membranepermeabilizing activities of cyclic lipodepsipeptides, syringopeptin 22A and syringomycin E from Pseudomonas syringae pv. syringae in human
red
blood
cells
and
in
bilayer
lipid
membranes.
Bioelectrochemistry 52 (2000) 161-167. Zsófia Szabó, Pál Gróf, Ludmila V. Schagina, Philip A. Gurnev, Jon Y. Takemoto, Edit Mátyus, Katalin Blaskó Syringotoxin pore formation and inactivation in human red blood cell and model bilayer lipid membranes Biochim Biophys Acta. 1567(1): (2002) 143-9.
ELŐADÁSOK: Szabó
Zsófia,
Gróf
Pál,
Budai
Marianna,
Blaskó
Katalin
Csatornaképző ciklikus lipodeszipeptidek kölcsönhatása membránlipidekkel Ph.D. Tudományos Napok Konferencia, Budapest 2002. június 7-8. Szabó
Zsófia,
Budai
Marianna
Csatornaképző
ciklikus
lipodeszipeptidek kölcsönhatása membrán-lipidekkel VI. Clauder Ottó emlékverseny, Budapest 2002. szeptember 26-28.
POSZTEREK: Szabó Zsófia, Gróf Pál, Blaskó Katalin Vörösvértest membrán fluiditás változásának vizsgálata ESR spektroszkópiai módszerrel Tavaszi Szél, Gödöllő, 2000. 04. 14-16.
93
Szabó Zsófia, Gróf Pál, Blaskó Katalin Ciklikus lipodepszipeptidek hatása vörösvértest membrán fluiditásra. ESR vizsgálatok XXX. Membrán-Transzport Konferencia, Sümeg, 2000. 05. 23-26. Zsófia Szabó, Pál Gróf, Katalin Blaskó Cyclic lipodepsipeptides induced fluidity changes in lipid moiety of red blood cells. A spin label study 3rd european Biophysics Congress, Munchen, Germany, 2000. 09. 9-13. Katalin Blaskó, Zsófia Szabó, Ludmilla V. Schagina, John Y. Takemoto Ion channels in human RBC membrane formed by cyclic lipodepsipeptides from Pseudomonas Syringae pv. syringae XIII: Meeting of the European Association for Red Cell Research, Barcelona, Spain, 2001. 03. 31- 04. 03. Szabó Zsófia, Gróf Pál, Blaskó Katalin Ciklikus lipodepszipeptidek hatásainak sejt-és molekuláris szintű vizsgálata XXXI. MembránTranszport Konferencia, Sümeg, 2001. 05. 22-25. Szabó Zsófia, Gróf Pál, Blaskó Katalin Csatornaképző ciklikus lipodepszipeptidek hatásmódjának vizsgálata A Magyar Biofizikai Társaság XX. Kongresszusa, Budapest, 2001. 06. 5-7. Szabó
Zsófia,
Gróf
Pál,
Budai
Marianna,
Blaskó
Katalin
Membráncsatorna képző ciklikus lipodepszipeptidek kölcsönhatása membrán lipidekkel. ESR vizsgálatok XXXII. Membrán-Transzport Konferencia, Sümeg, 2002. 05. 21-24.
Egyéb saját közlemények Budai M, Szabó Z, Szőgyi M, Gróf P. Molecular interactions between DPPC and morphine derivatives: a DSC and EPR study. Int J Pharm. 2003 Jan 2;250(1):239-50. Voszka István, Gróf Pál, Szabó Zsófia, Csík Gabriella Porfirinliposzóma kölcsönhatás vizsgálata ESR módszerrel XXXI. MembránTranszport Konferencia, Sümeg, 2001. 05. 22-25. 94
Gróf Pál, Szabó Zsófia, Rontó Györgyi UV-A sugárzás hatása humán fibroblaszt sejtekre. Spin-label vizsgálat XXXI. Membrán-Transzport Konferencia, Sümeg, 2001. 05. 22-25. Voszka István, Gróf Pál, Szabó Zsófia, Csík Gabriella Porfirin származékok kölcsönhatása DPPC liposzómákkal. Vizsgálatok ESRrel A Magyar Biofizikai Társaság XX. Kongresszusa, Budapest, 2001. 06. 5-7. Gróf P., Szabó Zs., Rontó Györgyi Effect of UV-A radiation on human fibroblast cell. A spin label study 9th ESP Congress, Lillehamer, Norway, 2001. 09 3-8. Gróf Pál, Budai Mariann, Szabó Zsófia, Rontó Györgyi UV-A sugárzás hatása humán fibroblaszt sejtekre. Spin-label vizsgálat XXXII. Membrán-Transzport Konferencia, Sümeg, 2002. 05. 21-24. Voszka István, Budai Mariann, Szabó Zsófia, Csík Gabriella, Gróf Pál Porfirin-származékok kölcsönhatása telítetlen lipidet tartalmazó liposzómákkal XXXII. Membrán-Transzport Konferencia, Sümeg, 2002. 05. 21-24. Budai Mariann, Szabó Zsófia, Gróf Pál Nalidixsav kölcsönhatása dipalmitoil-foszfatidilkolin
membránnal
UV
fény
jelenlétében
XXXII. Membrán-Transzport Konferencia, Sümeg, 2002. 05. 21-24. Budai Marianna, Szabó Zsófia, Gróf Pál Nalidixsav szabadgyök képző hatásának vizsgálata liposzóma modellrendszeren Ph.D. Tudományos Napok Konferencia, Budapest 2002. június 7-8.
95
10. ÖSSZEFOGLALÓ A Pseudomonas syringae pv. syringae által termelt ciklusos lipodepszipeptidek (CLP-k) gombaölő hatású vegyületek. A sejt több funkcióját gátolják, ennek hátterében valószínűleg pórusképző hatásuk áll. A munkacsoportunk által korábban vizsgált syringomycin E (SRE) pórusokat hozott létre humán vörösvértesten (vvt), és a vvt-k egy részét hemolizálta. A szelektív toxicitás eléréséhez szükséges, hogy megismerjük a CLP-k szerkezete és hatása közötti kapcsolatot. Ennek érdekében megvizsgáltuk két másik CLP, a syringopeptin22A (SP22A) és syringotoxin (ST) pórusképző tulajdonságait vvt-n. Transzportkinetikai méréseink alapján az SP22A és az ST is több monomerből álló pórust hozott létre vvt-n. Az ST pórusok 37 oC- és 20 oC-on inaktiválódtak, azonban 8 oC-on stabilak voltak, hasonlóan az SRE-hez. Az SRE és az ST pórusok inaktivációja 37 oC-on gyorsabb volt, mint 20 oC-on. Az SP22A pórusok még 37 oC-on sem inaktiválódtak. Ezen eredmények alapján arra következtettünk, hogy a csatornák stabilitásában a fluiditásnak, valamint a CLP molekulák hidrofób részének mérete és a poláros fejcsoport pozitív töltéseinek száma befolyásolja. A molekuláris szintű kölcsönhatások megismerésére különböző lipidösszetételű liposzómákon
ESR
spektroszkópiai
és
spektrum
szimulációs
módszereket
alkalmaztunk. A CLP-k a membrán teljes mélységében csökkentették a fluditást, csökkent a lipidek mozgási- és forgási szabadsága, nőtt a rendezettségük, ami a CLP-k hatásának koncentrációtól való függésével együtt arra utalt, hogy a CLP-k a lipidekkel együtt alakítják ki a pórusokat. A CLP-k hatását a hőmérséklet függvényében vizsgálva azt tapasztaltuk, hogy a teljes hatás kialakulásához egy megfelelő hőmérséklet intervallum szükséges. Ez az eredmény is igazolja, hogy a CLP-k lipidekkel való kölcsönhatásában a fluiditásnak meghatározó szerepe van. DPPC-DOPC, ill. DPPCkoleszterin keverék liposzómákon a nyert eredményeink alapján arra következtettünk, hogy membrán inhomogenitása csökkenti a CLP-k lipidmembránnal kialakított kölcsönhatását. Dinamikus fényszorásméréssel meghatároztuk a liposzómák méreteloszlását, és azt tapasztaltuk, hogy a CLP-k fúziót és/vagy aggregációt okoznak, aminek szerepe lehet a CLP-k sejtpusztító hatásában.
96
11. SUMMARY The cyclic lipodepsipeptides produced by Pseudomonas syringae pv. syringae possess fungicide properties. They inhibit much of the cell functions, presumably on the basis of their pore-forming activity. The syringomycin E, studied earlier by our research group, formed pores on human red blood cells (RBC), and caused partially also hemolysis. To reach selective toxicity, knowledge of the relationship between the structure and function of the CLPs is required. To fulfill this requirement, the poreforming properties of two other CLPs, the syringopeptin22A (SP22A) and the syringotoxin (ST), were investigated on RBCs. On the basis of our transport kinetic measurements on RBC, the SP22A and the ST formed pores built up from few monomers. ST pores inactivated at 37 oC, and at 20 oC, however, they remained stable at 8 oC, similarly to the SRE. Inactivation of the SRE and ST pores was faster at 37 oC than at 20 oC. SP22A pores did not inactivate even at 37 oC. On the basis of our results, we concluded, that fluidity has a crucial role in the process and the dimension of the hydrofobic part and the number of the positive charges of the polar headgroup influence the stability of the pores. To study the molecular level interactions we applied EPR spectroscopy and spectral simulation methods for liposomes of different composition. CLPs decreased the fluidity at all depths of the membrane, the motional and rotational freedom of the lipid molecules decreased, increased their ordering. These observations in conjunction with the concentration dependence of the CLP’s action suggested that CLPs form pores involving the lipids, too. Investigation of the temperature dependence of the CLPs’ action showed that to get their complete effect a given temperature range is required. It corroborated that the fluidity has a crucial role in the interactions between CLPs and membrane lipids. From the results, obtained with DPPC-DOPC or DPPC-cholesterol liposomes we concluded that the membrane-inhomogenity decreases the effectiveness of the CLPs. Dynamic light scattering measurements were used to determine the sizedistribution of the liposomes. According to our experiences CLPs provoke fusion and/or aggregation, which can have a role in the cell-killing properties of the CLPs.
97
