ROSSZINDULATÚ TÁMASZTÓSZÖVETI

ROSSZINDULATÚ TÁMASZTÓSZÖVETI

Dr. Pápai Zsuzsanna

Témavezetõ: Dr. Kopper László egyetemi tanár Programvezetõ: Dr. Jeney András egyetemi tanár

Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Pathologiai Tudományok Doktori Iskolája Onkológiai Program

Budapest 2002

2

TARTALOMJEGYZÉK

1. ÖSSZEFOGLALÁS - Angol

3. oldal

ÖSSZEFOGLALÁS – Magyar

4. oldal

2. BEVEZETÉS

5. oldal

3. CÉLKITÛZÉSEK

7. oldal

4. VIZSGÁLÓMÓDSZEREK

9. oldal

5. HAGYOMÁNYOS PROGNOSZTIKAI FAKTOROK VIZSGÁLATA OSTEOSARCOMÁBAN

13. oldal

6. ÚJABB PROGNOSZTIKAI FAKTOROK VIZSGÁLATA OSTEOSARCOMÁBAN

40. oldal

7. ÚJ GYÓGYSZERKOMBINÁCIÓ ALKALMAZÁSÁNAK VIZSGÁLATA ELÕREHALADOTT LÁGYRÉSZSARCOMÁBAN

58. oldal

8. LEGFONTOSABB ÚJ MEGÁLLAPÍTÁSOK, ALKALMAZHATÓSÁGUK A GYAKORLATBAN

71. oldal

9. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

75. oldal

10. IRODALOMJEGYZÉK

76. oldal

3

1. SUMMARY Musculosceletal tumors make out 2-3% of the malignant neoplasms. The past decades have brought essential changes in the diagnosis and treatment of sarcomas. Our aim is the analysis of prognostic factors known from the literature on our patient material having osteosarcoma and to search for methods, which could give further information on the prognosis helping to plan the treatment of these tumors. Apart from the conventional clinical, radiological and histological evaluation, we examined the p53 and mdm2 expression as well as the p53 and mdm2 expression in the biopsy material and the sample removed at the operation, using immunohistochemistry and molecular hybridization. Furthermore, the proliferative activity by Ki-67 MIB method, was measured. Results were evaluated by the middle- and long-term follow-up examination and analyzed by statistic methods. We did not find the age and sex of the patients of significant prognostic value, nor the pathological fracture or the radiographic appearance of the tumor. On the contrary, a tumor volume under 60cm3, the wide or radical surgery, the highly distal location, a cartilagineous ground substance under 20% and a tumor necrosis above 90% after the preoperative chemotherapy are all positive prognostic factors. The last three factors proved to be significant in the multivariate statistical analysis and determinate survival. The increased expression its further application of the p53 protein may also be a prognostic factor, is recommend in addition to the recently applied prognostic factors. The life expectancy of patients with advanced soft tissue sarcoma is rather bad in spite of the radical surgical methods and the radiotherapy. Successful medication is limited. In a retrospective study we examined the efficiency of a new, drug combination, the VIP protocol (Vepesid, Ifosfamid, Cisplatin) at patients with advanced soft tissue sarcoma. Our results show that the efficiency of this newly introduced treatment exceeds the efficiency of the treatments applied so far in Hungary in this patient group. The side-effects of the treatment were acceptable. We consider the VIP combination a routinely applicable protocol in the treatment of patients with advanced soft tissue sarcoma.

4

1. ÖSSZEFOGLALÁS

A támasztószöveti daganatok az összes malignus tumor 2-3%-át képezik. Az elmúlt évtizedekben lényeges változás következett be a sarcomák diagnosztikájában, kezelésében. Célunk az irodalomból ismert prognosztikai faktorok elemzése osteosarcomás beteganyagunkon, valamint olyan módszerek keresése volt, melyek további információkat adhatnak a prognózisra, segítséget nyújtva e daganatok kezelésének megtervezésében. Munkánk során a konvencionális klinikai, radiológiai, szövettani értékelésen túl vizsgáltuk a biopsziás anyagból, valamint a mûtét során eltávolított szöveti mintából a p53, mdm2 expressziót, valamint a p53 gén amplifikációt molekuláris hibridizációval, illetve mértük a proliferációs aktivitást Ki-67 MIB módszerrel. Eredményeinket betegeink közép- és hosszútávú utánkövetési vizsgálatával értékeltük, statisztikai módszerekkel elemeztük. Nem találtuk szignifikánsan prognosztikai értékûnek a betegek életkorát, nemét, a patológiás törést, a tumor röntgenmegjelenését. Ezekkel szemben megállapíthatjuk, hogy pozitív prognosztikai faktor a 60cm3-nél kisebb tumorvolumen, a széles vagy radikális sebészi kimetszés, az erõsen distális lokalizáció, a 20%-nál kisebb porcarány a tumoron belül és a 90% feletti tumornecrosis a praeoperativ kemoterápiát követõen. Ez utóbbi három tényezõ a többváltozós statisztikai analízis során is szignifikánsnak és a túlélés szempontjából maghatározónak bizonyult. Elmondhatjuk, hogy a p53 fehérje fokozott expressziója, újabb prognosztikus faktor lehet, gyakorlati alkalmazását javasoljuk az egyéb korábban alkalmazott prognosztikai faktorok

Az elõrehaladott lágyrészsarcomában szenvedõ betegek életkilátása a kellõ radikalitású mûtéti eljárások, valamint a sugárkezelések ellenére meglehetõsen rossz. Sikeres gyógyszeres kezelése csak korlátozottan lehetséges. Retrospektiv vizsgálat formájában nagyszámú, elõrehaladott lágyrészsarcomában szenvedõ betegeken egy eddig ebben a betegcsoportban még nem alkalmazott új gyógyszerkombináció, a VIP séma (Vepesid, Ifosfamid, Cisplatin) hatékonyságát vizsgáltuk. Eredményeink szerint az általunk bevezetett kezelés hatékonysága meghaladja a Magyarországon e betegcsoportban alkalmazott kombinációk hatásosságát. A kezelés következtében kialakult mellékhatások elfogadhatóak voltak. A VIP kombinációt elõrehaladott lágyrészsarcomás betegeknél rutinszerûen alkalmazható kezelési formának véljük.

5

2. BEVEZETÉS

A malignus támasztószöveti daganatok az összes malignus tumor mindössze 2-3%-kát képezik. Bár elõfordulásuk aránylag ritka, a sajátos diagnosztikai és kezelési eljárások, a magas kezelési költség, az osteosarcomában szenvedõ betegek átlagéletkora (20 év) teszi mégis indokolttá, hogy ezzel a daganatcsoporttal foglalkozzunk. Nem törekedtünk minden csontdaganat értékelésére, munkánk elsõsorban a leggyakrabban elõforduló centrális, nagy malignitású osteosarcomára korlátozódott. Az elmúlt évtizedekben lényeges változás következett be az osteosarcomák diagnózisában, kezelésében, valamint a túlélési eredményekben. A kemoterápia fejlõdésével, a neoadjuváns- és adjuváns kezelésekkel (1, 4, 11, 124, 125, 126) az ötéves túlélés 60-85%ra emelkedett a korábban csak sebészi beavatkozással elért 15-20%-ról. Elõtérbe kerültek a végtagmegõrzõ mûtétek is. A javuló eredményekkel párhuzamosan egyre több közlemény foglalkozik a prognosztikai faktorok szerepével (8, 32, 56, 61, 68, 87, 109, 119, 129). Retrospektiv munkánk során a konvencionális klinikai, radiológiai, szövettani értékelésen túl, a biopsziás, valamint a mûtét során eltávolított szöveti mintán vizsgáltuk a p53, valamint az mdm2 gén expresszióját, a p53 génben a heterozigótaság elvesztését, és a Ki-67 proliferációs antigén jelenlétét. Munkánk során annak a lehetõségét kutattuk, hogy milyen módszerek jelenthetnek számunkra segítséget a mindennapos klinikai gyakorlatban az osteosarcomák várható biológiai viselkedésének, terápiás válaszkészségének, azaz prognózisának megítélésében, és ezen keresztül az optimális kezelési módok kiválasztásában. A lágyrészdaganatok rendkívül heterogén szövettani altípusú, biológiai viselkedésû daganatok, melyek malignitási fokának meghatározása sarkalatos pontja a kezelési terv felállításának. A lágyrészsarcomák diagnosztikájában, illetve kezelésében az elmúlt 10 év során jelentõs változás észlelhetõ. Míg korábban ezen daganatok kezelése kizárólag csak sebészi volt, addig az elmúlt évek során a daganat elsõdleges eltávolítása mellett jelentõsen emelkedett a radio- és a kemoterápia szerepe is (39, 67). A megoszló vélemények ellenére a magas malignitású, rossz prognózisú tumorok esetében kialakulóban van a neoadjuváns (40, 58, 164), illetve adjuváns (53, 54, 151, 152) kezelési formák bevezetése. A magas malignitású tumorok jelentõs részében a diagnózist követõ két éven belül hematogén szórás alakul ki, ezért számtalan próbálkozás lát napvilágot a gyógyszeres kezeléssel kapcsolatban (101, 107, 133, 138, 156). Az elõrehaladott lágyrészsarcomában szenvedõ betegek 6

életkilátása a kellõ radikalitású mûtéti eljárások, valamint a gyógyszeres-, illetve sugárkezelések ellenére .5 év, ötéves túlélése pedig 10% (99, 138).

kombinációk kialakítására, melyek a legkevesebb szövõdménnyel járnak, megfelelõ terápiás hatás mellett. E megfigyelések vezettek arra, hogy a kezelés hatékonyságának növelése céljából korábban e betegcsoportban még nem alkalmazott gyógyszeres kombinációt alakítottunk ki: az ún. VIP sémát - Vepesid (122, 148), Ifosfamid (52, 107 (147). A kombinációt arra alapoztuk, hogy ezen vegyületek monoterápiában használva is hatásosak, s így együtt alkalmazva jobb terápiás eredményt reméltünk. Vizsgáltuk e gyógyszerekre adott válaszadási arányt, s a fellépõ mellékhatásokat. Célunk volt egy hatékonyabb, kevesebb mellékhatással járó gyógyszeres kombináció bevezetése.

7

3. CÉLKITÛZÉSEK

3.1. Osteosarcoma

Retrospektív klinikai vizsgálat keretében 1986. januártól – 1999. júniusig a Semmelweis Egyetem Ortopédiai Klinika Csonttumor Regiszterében nyilvántartott osteosarcomás beteganyag adatait a következõ szempontok alapján értékeltük ki.

3

3.1.1.1. Vizsgált paraméterek: -

a betegek életkora, neme, a daganat röntgenmegjelenési formája, lokalizációja, mérete, szövettani alcsoportja, a stádiuma, a daganat kemoterápia iránti érzékenysége, a prae- és postoperativ kemoterápia szerepe, az ép mûtéti szél jelentõsége, a mûtét típusának (amputáció, vagy végtagmegtartó) szerepe;

3.1.1.2.Vizsgált kérdések: -

a fent vizsgált tényezõk közül melyek tekinthetõk prognosztikai faktornak a túlélés függvényében;

-

a kemoterápia alkalmazása befolyásolja-e a túlélést: a prae + postoperativ, valamint a csak

postoperativ

kemoterápia

eredményének

összehasonlítása

a

túlélés

-

befolyásolja-e a helyi kiújulások megjelenését, illetve az össztúlélést a mûtét típusa

-

külön-külön, vagy együttesen van-e jelentõsége a fent vizsgált tényezõknek a betegség prognózisában;

3.1.2. A p53, valamint az mdm2 génexpresszió, mint lehetséges prognosztikai tényezõ vizsgálata -

kimutatható-e p53, valamint mdm2 expresszió a biopsziás, illetve a mûtéti mintában;

-

észlelhetõ-e összefüggés a p53, illetve az mdm2 expresszió, valamint ezen tumorok kemoterápia iránti érzékenysége között; 8

-

van-e összefüggés az osteosarcomák (kemoterápia elõtti) biopsziás anyagában észlelt p53, illetve mdm2 expresszió és a túlélés között.

3.1.3. A p53 gén heterozigozitás vesztésének (LOH) vizsgálata, mint lehetséges prognosztikai faktor -

kimutatható-e összefüggés a p53 gén allélvesztése és a tumor prognózisa között.

3.1.4. A tumor proliferációs aktivitásának, mint lehetséges prognosztikai tényezõnek a vizsgálata - változik-e a Ki –67 proliferációs index a biopsziás anyagban; - nyújthat-e segítséget a tumor kimenetelének elõrejelzésében a proliferációs aktivitás ismerete a többi prognosztikai faktor mellett;

3.2. Lágyrészsarcomák

Az elõrehaladott lágyrészsarcomák sikeres kezelése napjainkban is csak korlátozottan lehetséges. Jelen munkánkban egy korábban ebben a betegségben még nem alkalmazott három vegyûletbõl álló gyógyszerkombináció hatékonyságát vizsgáltuk, elõrehaladott lágyrészsarcomában szenvedõ betegeken. Az alkalmazott kombináció: VIP séma (Vepesid, Ifosfamid, Cisplatin).

Vizsgált kérdések: -

a fenti kombináció hatékonynak bizonyul-e elõrehaladott lágyrészsarcomában;

-

milyen mértékû mellékhatások alakulnak ki;

-

növelhetõ-e az össz-, illetve a betegségmentes túlélési idõ az adott kombináció alkalmazásával;

9

4. VIZSGÁLÓMÓDSZEREK

Retrospektiv tanulmány keretében biopsziával igazolt, kezeletlen, nagy malignitású, centrális osteosarcomában szenvedõ betegek klinikai vizsgálatát végeztük el, melyet a betegek biopsziás,

illetve

mûtéti

szövettani

mintáin

végzett

immunhisztokémiai,

valamint

molekulárbiológiai vizsgálatokkal egészítettünk ki.

4.1.1. Valamennyi betegnél feltárásos sebészi biopsziával történt a diagnózis

4.1.2. A stádium megállapítása, valamint a terápiás terv meghatározása céljából az alábbi vizsgálatokat végeztük el: kétírányú csontröntgen, mellkasröntgen, a tumoros régió CT, illetve MRI vizsgálata, csontscan, hasi UH;

4.1.3. Laboratóriumi vizsgálatokat, valamint képalkotó eljárásokat végeztünk a kezelés és a betegség ellenõrzése során; -

a vizsgálat kezdetekor: laboratóriumi vizsgálat (teljes vérkép, vese-, májfunkciós értékek, ionok meghatározása), mellkasröntgen, az adott tumoros régió kétirányú

-

neoadjuvans kezelés során: laboratóriumi vizsgálat (minden kemoterápiás ciklus elõtt);

-

a kuratív mûtét elõtt: mellkasröntgen, mellkas CT, az adott tumoros régió CT, illetve MRI vizsgálata, csontscan;

-

adjuváns kezelés során: laboratóriumi vizsgálat (minden kemoterápiás ciklus elõtt).

4.1.4. A klinikai dokumentáció, valamint a mûtéti leírások értékelését statisztikai módszerekkel végeztük; A statisztikai elemzéshez standard teszteket alkalmaztunk. Egyváltozós túlélési analízisekhez a Kaplan-Meier- féle (78) túlélési görbét, a Fisher egzakt tesztet, a t-tesztet és a Mann-Whitney próbát használtuk. A Kaplan-Meier túlélési táblázatok görbéi közötti szignifikanciát Cox-Mantel teszttel számoltuk. A prognosztikai faktorok többváltozós túlélési

10

analíziseihez Cox-féle (28) proporcionális regressziós hazard modellt, illetve a diszkriminancia

4.1.5. Immunhisztokémiai eljárással a gének (p53, mdm2) fehérjetermékeinek meghatározása a biopsziás anyagból, valamint a mûtét során eltávolított tumorból; A p53, valamint mdm2 fehérje expressziójában bekövetkezett változásokat határoztuk meg antihumán (DO 7 DAKO-clone, HK 090-5K Bio-Genex) monoklonális antitestet alkalmazva. A p53 expressziót decalcinált, paraffinba ágyazott szövetmintákon végeztük, ami speciális metodikát igényelt. A decalcinált szövetekhez antigénfeltáró oldatra volt szükség. Ezt követõen 2.5 percre 750W mikrohullámba helyeztük a metszeteket, majd néhány perces várakozás után peroxidáz blokkolás következett. A p53 monoklonális antitesttel (DAKOclone-DO-7) nedves kamrában 2 órán át inkubáltunk, melyet pufferos mosás követett. Újabb inkubálást végeztünk 20 percen át a másodlagos antitesttel (biotinylated anti-mouse antibody, Amersham) szobahõmérsékleten, majd ismételten pufferos mosás következett. Ezután 20 percen át inkubáltuk peroxidázzal jelzett streptavidin-biotinnal, majd desztilláltvíz + Naacetátos (0.1 M) mosás után a reakciót chromogennel hívtuk elõ (AEC, aethyl-carboxol). A magfestéshez Mayer-féle haematoxylint használtunk. Pozitív kontrollnak p53 pozitív fibromyxosarcomat használtunk. Az értékelést fénymikroszkóppal végeztük.

Az immunreakciókat a következõképpen értékeltük: +++, a tumorsejteknek több mint 40%-a pozitív; ++, a tumorsejteknek 5-40%-a pozitív; +, a tumorsejteknek kevesebb, mint 5%-a pozitív; -, a tumorsejtek negatívak (legalább 500 sejtet vizsgáltunk).

4.1.6. A proliferációs aktivitás meghatározása paraffinos metszeteken Ki-67 immunhisztokémiai vizsgálatával; A Ki-67 antigénexpresszió vizsgálatát decalcinált, paraffinba ágyazott szövetmintákon végeztük. A metszeteket deparaffinálást és endogén peroxidázgátlást követõen fél órára „de Cl” antigénfeltáró oldatba tettük, majd 100%-os, illetve 70%-os methanolban mosás következett. A metszeteket ezután kuktában, túlnyomáson, „hot start” eljárással 30 percig forraltuk. Kihûlés után pufferes öblítés történt, majd immunhisztokémiai reakciót végeztünk a primer antitesttel (inkubálás 37 oC-on, 1 órán át). Újabb pufferos mosás, majd inkubálás 11

következett a másodlagos antitesttel. Az enzimaktivitás elõhívása, és a magfestés a p53-nál leírtak szerint történt. Valamennyi megfestõdött sejtmagot, tekintet nélkül a festõdés intenzitására, pozitívnak értékeltünk. A proliferációs aktivitást a Ki-67 pozitív sejtek százalékos arányában adtuk meg. Minden esetben legalább 500 sejtet értékeltünk. A Ki-67 a sejtciklusban lévõ sejteket jelöli. Ha a sejt kilép a sejtciklusból, akkor a Ki-67 gyorsan lebomlik, ezért a nem proliferáló sejt negatív. 4.1.7. A p53 delécióinak kimutatása polimeráz láncreakcióval; Vérbõl és tumorszövetbõl izoláltuk a DNS-t. A 17-es kromoszómát érintõ allélvesztések meghatározására, négy a kromoszóma rövid karján lévõ, a TP53 régiót és a hosszú karon lévõ BRCA 1 régiót lefedõ markert használtunk (TP53CA, THRA1, D17S855, D17S579). Ezek mindegyike dinukleotidismétlõdésû polimorfizmust mutatott. Az allélvesztést (LOH) a normális és a tumoros szövet allélmintázatának egybevetésével határoztuk meg, autoradiográfiás módszerrel, lézer denzitométer felhasználásával, az adott beteg tumorából és vérébõl izolált DNS-ek összehasonlításával. A specifikus DNS-részek amplifikációját polimeráz láncreakcióval (PCR) végeztük. A PCR reakciókat Perkin-Elmer Cetus DNA µl reakciótérfogatban végeztük, standard pufferek felhasználásával. A mikrosatellita markerek priméreit T4 polinukleotid kináz B enzimmel

32

P-

ATP izotóp beépítésével radioaktívan jelöltük. A PCR termékeket 2% agaróz gélen futtattuk és etidiumbromid festéssel tettük láthatóvá. Azokat az eseteket minõsítettük heterozigóták elvesztéseként, ahol a tumormintában a két allél intenzitásának aránya több mint 50%-al eltért a vérmintából származó DNS amplifikálásával kapott intenzitásaránytól.

4.2. Lágyrészsarcoma

A prospektív klinikai tanulmányba, melyet 1990. január és 1999. június között végeztünk

szövettanilag

igazolt,

inoperábilis,

metasztatikus

vagy

helyileg

kiújult

lágyrészsarcomában szenvedõ betegeket választottunk be.

4.2.1. A stádium meghatározását a következõ módszerekkel végeztük: mellkasröntgen, mellkas CT, hasi UH, csontscan, a tumoros régió CT, illetve

12

MRI vizsgálata;

4.2.2. Minden kezelési ciklus elõtt laboratóriumi vizsgálatok vese-, májfunkciós-, ionvizsgálatok, teljes vérkép, valamint EKG történtek;

4.2.3. A gyógyszeres kezelés: 28 naponta 5 napig VIP (Vepesid, Ifosfamid, Cisplatin) séma szerinti kezelések a progresszióig, maximum hat alkalommal;

4.2.4. A kezelésre adott választ kéthavonta értékeltük az adott régió CT, illetve

4.2.5. A klinikai dokumentáció értékelése;

4.2.6. Betegkövetés - mûtét után betegeinket (csont-, illetve lágyrészsarcomában) 10 éven át követjük. Átlagos követési idõ: 54 hónap (12-120 hó). Az 1.- 2. évben 3 havonta, a 3. évben félévente, ezt követõen évente a tumor felismerésekor alkalmazott módszerekkel történik a beteg ellenõrzése (l.d. 4.1.2. részt).

13

5. HAGYOMÁNYOS PROGNOSZTIKAI FAKTOROK VIZSGÁLATA OSTEOSARCOMÁBAN

5.1.1. Bevezetés, klasszifikáció, epidemiológiai adatok

A csontok primer malignus daganatai a tumorok kb. 0.5-1%-át képezik. Viszonylagos ritkaságukat mutatja, hogy a leggyakoribb rosszindulatú csontdaganat, az osteosarcoma éves .5/egymilló lakos. Magyarországon évente 15-20 új osteosarcoma esetet ismernek fel. Férfi-nõ arány 2:1. Csontdaganatok bármely életkorban elõfordulhatnak, de a 60%-uk az elsõ két évtizedben keletkezik, az elõfordulás csúcsa a serdülõkorra esik, így a gyermekkori és fiatal felnõttkori összes daganatos megbetegedés 8%-át képviseli (35), 50 év körül ismételt kiugrás észlelhetõ, mely azonban lényegesen alacsonyabb a serdülõkorinál. Az osteosarcoma progressziója során elsõsorban a környezõ szövetek felé terjed (pericapsularis, direct articularis), valamint haematogén úton metasztatizál, leggyakrabban a tüdõbe. Rendkívül rossz prognózist jelent az úgynevezett skip metastasis (ugráló áttét) megjelenése, mely ugyanabban a csontban lép fel, ahol a primer tumor, de ott discontinualisan terjed. Egyéb malignus tumorokhoz képest ritkábban ad

áttétet a regionális

nyirokcsomókba (35, 36, 92). Az osteosarcoma a csontrendszeren, illetve adott csonton belül is praedilekciós helyeken

legtöbb

alakulhat

a

hosszú

ki.

Leggyakoribb

csöves

csontok

metaphysisében keletkezik, és áthatolhat az epiphysisekbe, a növekedési porcon keresztül. Az extrasceletalis elhelyezkedések ritkák, de ezek között leggyakoribb elõfordulási hely a retroperitoneum, a mediastinum és az emlõ (82).

1. ábra 14

5

Az osteosarcoma keletkezésének oka ismeretlen, de számos hajlamosító tényezõt ismerünk, amelyek bizonyítják genetikai, és környezeti hatások

genetikai

tényezõk különösen gyermekeknél fontosak, például a retinoblastomás betegek 40%-ának örökletes praediszpozíciója van más rosszindulatú megbetegedésekre. Ha ezeknél a betegeknél a 13q14 kromoszómahelyen mutáció jön létre, akkor az osteosarcoma keletkezésének a kockázata 500-szor nagyobb, mint a normál populációban (55, 69). Magasabb kockázati tényezõ szerepel a veleszületetten p53 hiányt mutató Li-Fraumeni szindrómában (145). A genetikai tényezõk között szerepel a nem (férfiaknál gyakoribb), a fiatal életkor (a szokásosnál sokkal aktívabb csontnövekedés, pl. pubertás). való hosszantartó kontamináció, ionizáló sugárzás, radioterápia (retinoblastoma vagy Wilms tumor miatt kezelt gyerekekben) második primer tumorként alakulhat ki osteosarcoma (35, 136). A fentiek alapján az osteosarcomákat két csoportba osztják: primer és secunder. A primer osteosarcomák rejtett csontbetegség vagy ismert carcinogén behatás nélkül keletkeznek. A szekunder osteosarcomák már meglévõ csontbetegségekbõl alakulhat ki, pl. Paget-kórból, többszörös örökletes exostosisból, csontinfarctusból, polyostoticus fibrosus displasiából,

vagy

pedig

ismert

carcinogén

behatások,

pl.

csontbesugárzások

5.1.3. Patológia

Az osteosarcoma a leggyakoribb malignus csonttumor, az összes rosszindulatú csontdaganat 30%-a. Megjelenésre az osteosarcoma szürkésfehér tumortömeg, amely gyakran tartalmaz vérzéses és cisztikus területeket. Sok esetben áttör a cortexen és a periosteumon, mire diagnózisra kerül. Feltételezik, hogy az osteosarcoma olyan mesenchymalis õssejtbõl származik, amely fibrosus szövetté, porc-, és csontszövetté képes differenciálódni, ezeket a szöveteket osteosarcomában - ha különbözõ mértékben is - gyakran meg lehet találni. Igy az uralkodó tumorszövet

jellegétõl

függõen

megkülönböztethetõ 15

osteoblastos,

fibroblastos,

chondroblastos, teleangiectasias, óriássejtes, kissejtes altípus. Bár a tu-moros szövetféleségek aránya tág határok között váltakozik, elõfordulhat, hogy pl. a tumoros porcszövet a tumor több mint 90-95%-át is kiteszi. Alapvetõen mindegyik mesenchymalis tumor, melyeknek közös jellemzõje, hogy osteoid matrixot, tumoros csontot kell termelniük. A tumoros osteoid kimutatása az osteosarcoma diagnózis feltétele, ennek alapján különíthetõ el a csontban szintén elõforduló, de ritkább chondrosarcomától, malignus fibrosus histiocytomától, fibrosarcomától. A mesenchymális sejtek gyakran erõsen anaplasticusak, atipikus mitózisokkal, hyperkromáziát mutatnak, és gyakran képeznek óriássejteket (9, 29, 35, 36). Az egyes alcsoportok között vannak ugyan különbségek, de valamennyi malignus. Ritkán multifokalis is lehet (azaz egyidejûleg több csontban fordul elõ). Megkülönböztetünk még parossealis, valamint periostealis formákat is, aszerint, hogy a periosteumból vagy a parostealis szövetbõl erednek (102). Kevésbé malignusak, idõsebb korban jelentkeznek és prognózisuk is jobb, mint a klasszikus centrális formáké. Az osteosarcomák részletes felosztását mutatja be az 1. táblázat.

16

A. Szövettan szerint

B. Aetiologia szerint

1. Intramedullaris osteosarcoma

Elsõdleges

Másodlagos

1/a Conventionális, nagy malignitású centrális

- familiáris

- postirradiációs

- Osteoblastos

(Li-Fraumeni)

- Paget kór talaján

- Chondroblastos

- retinoblastoma

- Fibroblastos

(13q,14 mutáció) - fibrosus dysplasia,

- Malignus-fibrosus histiocytomaszerû

kialakuló

- csontinfarktus

- Osteoblastomaszerû

- óriássejtes csonttumor

- Kissejtes

talaján kialakuló

- Teleangiectasias - Óriássejtes 1/b Jól differenciált (low-grade intraossealis) C. Lokalizáció szerint 2. Parossealis (juxtacorticalis) - Jól differenciált

- centrális, intramedulláris

- Dedifferenciált

- intrakortikális - csont felszínén növekvõ

3. Periostealis

- multifokális

1. táblázat: Osteosarcoma felosztása (Bone Tumors: H.D. Dorfman, B.Czerniak 1998, módosított)

17

5.1.4. Klinikai tünetek és diagnosztikai vizsgálatok

A betegek túlnyomó többsége az érintett végtagon érzett fájdalommal, érzékenységgel és duzzadással jelentkezik, és anamnézisében általában több hónapig tartó, eredménytelen reumatikus kezelés szerepel. A több hónapja fennálló fájdalomhoz - fõként az agresszív, gyorsan progrediáló formáknál - az érintett terület fokozatosan növekvõ, meleg tapintatú duzzanata csatlakozik. A közeli izületben mozgáskorlá-tozottság is lehet. A tumor gyors növekedése a végtag körfogatának növekedéséhez vagy hirtelen töréshez vezethet, amely a folyamat elsõ tünete is lehet. Utóbbi fõleg a distalis femurvégben észlelhetõ (a patológiás törések gyakorisága 1%). Fizikális vizsgálatnál tömött terime tapintható, ami az alatta lévõ csonthoz rögzített. A felette lévõ bõr gyakran melegebb a tumor vaszkularizációja miatt. A szomszédos ízületben reaktív synovitis alakulhat ki, de a mozgás normális (92). Különbözõ képalkotó technikák segítik az osteosarcoma diagnózisát. A panaszok alapján elvégzett kétirányú röntgenfelvétel az esetek jelentõs részében felkelti az osteosarcoma gyanúját. A metaphysisbõl eredõ tumor rendszerint korán áttöri a corticalist. A tumor és a környezõ ép szövetközti határ elmosódott. A csont normális trabecularis szerkezetét a tumor területén elvesztette. A lágyrészekbe terjedõ, a corticalist áttörõ formáknál szokványos periostealis reakciónak számít a spiculum képzõdés és a Codmann háromszög. A csontdefektus, illetve a tumor lehet lytikus, sugáráteresztõ, ha az osteosarcoma kevés tumoros csontot termel és dominál a csont- lebontás (22%). Ilyen röntgenképet adnak típusosan a fibroblastos és teleangiectatikus formák. Ha az osteosarcoma nagymennyiségû tumoros csontot termel, akkor sclerotikus formákról beszélünk, amely jellemzõen sugárfogó röntgenképet mutat (32%). Leggyakrabban azonban, a nagyobb lyticus gócos felritkulások mellett scleroticus területek is jelen vannak, a tumor vegyes röntgenmegjelenésû (46%) (9, 98, 131, 143). A daganat kiterjedésének megállapítására, a skip metasztázisok észlelésére (31, 93), illetve a megfelelõ mûtéti beavatkozás megtervezéséhez elengedhetetlen az érintett régió CT, és/vagy MRI vizsgálatának elvégzése (31, 72, 121, 130). A multifokális tumor kizárása céljából csontscan elvégzése is ajánlatos. A betegek 10-20%-a tüdõáttétekkel jelentkezik, amelyek mellkasröntgennel, illetve CT-vel igazolhatók. Természetesen az anamnézis felvétele, 18

fizikális-, valamint laborvizsgálatok is a kivizsgálás részét képezik. Egyes szerzõk az alkalikus foszfatáz értéknek prognosztikai jelentõséget tulajdonítanak, mivel ismételt emelkedése recídivára, áttét jelenlétére utalhat (3). Az emelkedett érték azonban nem diagnosztikus értékû, mivel jelentkezik más csontbetegségekben is. A végleges diagnózist a daganat biopsziája igazolja (35, 99).

5 Az osteosarcomák döntõ többsége magas malignitású, kezeletlenül a betegek 100%ában 1 éven belül halálhoz vezet. A betegség kezelésében az elmúlt 30 évben igen nagy fejlõdés észlelhetõ: - 1970–es években kizárólag sebészi kezelést alkalmaztak (radikális amputációt, exarticulatiót) az osteosarcomat kemoterápiarezisztens tumornak beavatkozással 10-20%-os ötéves túlélést tudtak biztosítani (43, 49, 75). - 1970–es évek vége felé a kemoterápia hatásosságát elõször monoterápia bizonyította nagydózisú methothrexat, doxorubicin; (51, 74), majd a kombinált kezelést kezdték alkalmazni (125, 126). A domináló ablativ sebészet mellett egyes esetekben végtagmegtartó mûtéteket is megkíséreltek. A kemoterápia bevezetésével az ötéves túlélés 40-70-%-ra emelkedett. - 1980- as évek második felétõl alkalmazták rutinszerûen a prae-, és posztoperaív kombinált kemoterápiát. (123, 124, 128, 169). Az egyik ilyen nemzetközileg elfogadott általunk is használt – kezelési séma a COSS (Cooperative Osteosarcoma Studie) protokoll (11, 167, 168,). Az esetek 50-60-%-ában végeztek végtagmegtartó mûtéteket, jelentõsen fejlõdtek a rekonstrukciós sebészeti eljárások (protézis, homograft), így az ötéves túlélést 6075 %-ra sikerült emelni. - A multicentrikus osteosarcoma munkacsoportok létrejötte, az kemoterápiás protokollok kidolgozása, a képalkotó eljárások fejlõdése (CT, MRI), és a fejlesztése az eredményeket tovább javította, így a ’90-s évek elejére a is sikerült elérni (1, 2, 10, 37, 91, 127, 140). Az idõben felismert esetek 80-85%-ában nyílik lehetõség végtagmegtartó mûtétek elvégzésére, s egyre nagyobb számban kerül sor metasztazektómiára is (23, 77).

A jelenleg elfogadott kezelési terv: 19

biopszia

neoadjuváns kemoterápia

mûtét (végtagmegtartó/amputáció)

adjuváns kemoterápia

5.2.1. Beteganyag és módszer

A sajátos diagnosztikai és kezelési eljárások, a magas kezelési költségek indokolják, hogy a csontdaganatos betegeket centrumokban lássák el. A Semmelweis Egyetem Ortopédiai Klinikáján 1970. óta mûködik a Csonttumor Regiszter, amelyben 262 osteosarcomás, 185 chondrosarcomás, 103 Ewing sarcomás, 97 óriássejtes csonttumoros, 1251 benignus csonttumoros, 351 áttéti csonttumoros, illetve 761 tumorszerû csontelváltozásos beteg klinikai, radiológiai szövettani anyagát tartják nyilván. Átlagosan évi 10-14 új osteosarcomás beteg komplex ellátására kerül sor. A biopszia és a definitív mûtét a SE Ortopédiai Klinikán, a kemoterápia a SE II. sz. Gyermekgyógyászati Klinika Onkológiai Részlegén, valamint az Országos Onkológiai Intézet Kemoterápiás

A csontdaganatok ritkasága miatt különösen fontos a mûtéti ellátást, illetve a gyógyszeres kezelést végzõ intézetek közti, valamint a nemzetközi együttmûködés, és a tumorregiszter anyagának rendszeres értékelése. 1986. januártól – 1999. júniusáig 121 végtagi, nagymalignitású, centrális osteosarcomás beteg került ellátásra a fent említett intézetekben. Jelen munkánkban e 121 osteosarcomás beteg kezelési eredményein keresztül értékeljük az egyes prognosztikai tényezõk szerepét. Az értékelésbõl kizártunk 25 beteget az alábbi okok miatt: 12 beteg az utánkövetés számára elveszett, vagy más intézetben folytatták a kezelést. Õt esetben a betegek általános állapota, a tumor kiterjedt volta miatt eltekintettünk a kezeléstõl, három beteg pedig nem egyezett bele a kemoterápiába. Négy beteg a kemoterápia szövõdményeiben (infekció, nagydózisú Methotrexat intolerancia), egy pedig egyéb betegségben hunyt el. A fennmaradó 96 beteget három csoportba soroltuk. I. csoportba kerültek azok (75 beteg), akik a protokoll (COSS) szigorú betartásával kapták a kemoterápiát: 9 hetes neoadjuváns kemoterápia, a 10. héten mûtét, a mûtétet követõen további 14 hét adjuváns kemoterápia. A kezelési ciklusok elõtt rendszeresen labor, 20

illetve EKG vizsgálatokat végeztünk. A mûtét elõtt ismételt kivizsgálás történt esetleges metasztázis kizárása céljából. Mind a neoadjuváns, valamint adjuváns kezelés Ifoszfamid, Cisplatin, Adriamycin és nagydózisú Methotrexat kombinált adásával történt a protokoll által meghatározott sorrendben. Az Ifosfamid adásakor, illetve 4 és 8 óra múlva Mesna (mercaptoetanolsulfidnatrium) kezelésben részesülnek a betegek, a gyógyszer hólyagkárosító mellékhatásának (haemorrhagias cystitist okozhat) kivédése céljából. A nagydózisú MTX alkalmazása esetén a gyógyszer beadását követõen 24h múlva 6 óránként Leucovorin (15 mg/m2) adása szükséges a gyógyszer lebontása céljából, a MTX szérumszintjének normalizálódásáig, emiatt a MTX

A tumor stádiumbeosztása Enneking módszere szerint történt (42), mely figyelembe veszi a tumor diffenrenciáltsági fokát (G), a lokalizációt (T) és a metasztázist (M) (2. táblázat). Eszerint nagy malignitású intracompartmentalis II/ felismeréskor metasztatizáló III. stádiumú osteosarcomákat különítettünk el. Az I. csoportban 75 betegbõl 15 II/A, míg 60 beteg II/B csoportba tartozott.

G1: alacsony fok

T1: intracompartmentalis

M0: nincs metasztázis

G2: magas fok

T2: extracompartmentalis

M1: van metasztázis

Stage IA:

G1, T1, M0

Stage IB:

G1, T2, M0

Stage IIA:

G2, T1, M0

Stage IIB:

G2, T2, M0

Stage IIIA:

G1/G2, T1, M1

Stage IIIB:

G1/G2, T2, M1

G: differenciáltsági fok

T: elhelyezkedés

M: metasztázis

Stádiumbeosztás (Enneking szerint)

A II. csoportba azokat a betegeket soroltuk, (9 beteg), akiknél már a diagnózis megállapításánál multiplex tüdõ metasztázis volt jelen. A daganat stádiuma szerint az összes beteg III/B stádiumú volt. A III. csoportba soroltuk azon betegeket (12 beteg), akiknél valamilyen oknál fogva (pszichés tényezõ, kooperálókészség hiánya, interkurrens megbetegedés, kemoterápia intolerancia, stb.) a kemoterápia nem protokoll szerint, csak késéssel, suboptimális vagy inkomplett formában történt. Nyolc beteg II/B, míg négy beteg III/B stádiumú volt.

21

A betegek általános állapotának meghatározására a WHO skálát használtuk (0:normális aktivitásra

képes,

panaszmentes,

1:önellátásra

alkalmas,

enyhe

betegségtünetek,

2:mozgáskorlátozott, de a nap kevesebb, mint 50%mozgáskorlátozott, a nap több mint 50%-át ágyban tölti, 4:100%-ig ágyban fekvõ). E skála szerint 64 beteg (67%) 0, míg 32 beteg (33%) 1-es fokozatú volt. A betegek teljes kórtörténete rendelkezésre állt, ennek alapján határoztuk meg a tünetek jelentkezésétõl a diagnózis felállításáig eltelt idõt (anamnézis idõ). A stádium meghatározására a 4.1.2. részben leírt módszereket használtuk. A feltárásos biopsziát követõ szövettani vizsgálat alapján felállított diagnózis idõpontja jelentette az utánkövetés kezdetét, végét pedig a beteg halála, illetve az utolsó kontrollvizsgálat idõpontja (2000.06.). Átlagos utánkövetési idõ: 54 hónap (minimum 12 hónap, maximum 120 hó). Számítottuk az átlagos túlélési idõt, a tumormentes és az összes ötéves túlélést. A tumor méretét kétirányú röntgenfelvételek, illetve CT vagy MRI alapján a három dimenzióban mért legnagyobb méret jelentette, térfogatát a fenti méretek felhasználásával az ellipszoid formula alapján számítottuk ki (abszolút magasság x abszolút szélesség x abszolút .52). Mint említettük, radiomorfológiailag litikus, szklerotikus és kevertsejtes megjelenésû formákat különböztettünk meg. A szövettani vizsgálattal a domináló sejttípus szerint (szemiquantitativ értékelés alapján minimum 60-80%) osteoblastos, chondroblastos, fibroblastos, teleangiectatikus, kissejtes és kevert formákat különböztettünk meg. Különválasztottuk azokat az eseteket, ahol a metaplasiás porcszövet aránya a daganatban meghaladta a 20%-ot (9). A praeoperativ kemoterápia hatását, a tumor szövettani regressziójának mértékét az irodalomból ismertetett szemikvantitativ módszerekkel vizsgáltuk (71, 113, 124, 132). Ezek nagyjából megegyeznek abban, hogy kemoterápia érzékenynek minõsítik a tumort, ha a praeoperativ kemoterápiát követõen a tumorban a nekrózis aránya 90% vagy annál nagyobb, tehát a túlélõ tumorsejtek csak kisebb gócokban, elszórtan, összeségükben 10% alatti mennyiségben fordulnak elõ. Túl részletesnek tartjuk Salzer-Kuntschik és mtsai (132) 6 skálás beosztását, 1-1 túlélõ tumorsejt fellelése egy 300-600 cm3 volumenû tumorban kétséges. Gyakorlati szempontból alakítottuk ki Picci és mtsai (113) értékeléséhez hasonló

22

A preoperatív gyógyszeres kezelés eredményességének mértéke alapján - a jobb értékelhetõség, nagyobb betegszám miatt - a betegeket három csoportba soroltuk: preoperatív kemoterápiára jól reagáló tumorok (szöveti necrosis 90% fölött, túlélõ sejtek 10% alatt), mérsékelten reagáló tumorok (túlélõ tumorsejtek 10-50% között), és kemoterápiára nem reagáló tumorok (túlélõ tumorsejtek 50% felett). A sebészi beavatkozás alapján két csoportba osztottuk a betegeket: végtagmegtartó, ill. csonkoló (amputációs és rotációs plasztika) mûtéten estek át. A sebészi radikalitás meghatározásánál Enneking beosztás (42) kritériumait használtuk, de a statisztikai analízisre alkalmatlan kis betegszám miatt összevontan értékeltük a radikális és széles (66 beteg), illetve marginális és intralézionális (9 beteg) csoportokat.

5.2.2. Statisztikai módszerek

A statisztikai elemzéshez standard teszteket alkalmaztunk. Részletes leírását lásd a 4.1.4. pontban.

5.2.3. Eredmények

Az általunk vizsgált prognosztikai faktorok és a túlélés összefüggése (egyváltozós

I. csoport: Ebbe a csoportba 75 nagy malignitású, metasztázismentes, centrális osteosarcomában szenvedõ beteg került. Átlagéletkoruk 17.4 év (szélsõ értékek: 8 évestõl 55 éves korig), a nemek megoszlása alapján 35 nõ, 40 férfi. A daganat elhelyezkedése szerint: distális femur (30 eset), proximális tibia (21 eset), proximális humerus (10 eset), distális tibia (6 eset), proximális femur (3 eset), distális humerus (2 eset), calcaneus, proximális fibula, distális radius (1-1 eset). A tumor mindössze 15 esetben (20%) nem törte át a corticalist és maradt rekeszen belüli (II/A stádium), míg a többi 60 (80%) már beterjedt a lágyrészekbe (II/B).

Anamnézisidõ

23

változott (átlag 3.3 hónap). Anyagunkban nem találtunk statisztikai összefüggést az anamnézis idõ hossza és a túlélés között.

Kor A 75 beteg átlagéletkora 17.4 év. Életkor szerint betegeinket 3 csoportba osztottuk. Az elsõbe (0-13 év) 21 beteg, a másodikba (14-29 év) 47 beteg, a harmadikba (30 év, illetve e felett) 7 beteg került. Vizsgáltuk az életkor és a túlélés közötti összefüggést. Az elsõ valamint a második csoportba került betegek esetén a két görbe lefutása szinte azonos volt (2. ábra p=0.75), ezért a továbbiakban statisztikai értékelés szempontjából a betegeket harminc év alatti, illetve feletti csoportokra bontottuk. A két csoportban megközelítõen azonos arányban történt végtagmegtartó mûtét és amputáció, a betegek intenzív kemoterápiában részesültek. A különbözõ életkorú betegek életkilátásai - amennyiben a teljes, protokoll szerinti kemoterápiában részesülnek - megegyeznek. A két csoport túlélése között nem találtunk szignifikáns különbséget (3. ábra p=0.85).

Életkor

Összes túlélés %

120 100 80 60 40

<13 év (n=21) 14-29 év (n=47) >30 év (n=7)

20 0 0

20

40

60

80

100

120

140

Idõ (hónap)

2. ábra: Életkor és túlélés összefüggése (p=0.75)

24

160

Életkor

Összes túlélés %

120 100 80 60 < 30 év (n=68) > 30 év (n=7)

40 20 0 0

20

40

60

80

100

120

140

160

Idõ (hónap)

3. ábra: Életkor és túlélés összefüggése (p=0.85)

Nem

Vizsgáltuk, hogy a nemnek van-e szerepe a túlélésben. Egyváltozós statisztikai analízisünk szerint (Kaplan-Meier) a nõbetegek (35 beteg) életkilátásai valamelyest jobbnak bizonyultak a férfiakénál (40 beteg), azonban szignifikáns különbséget nem észleltünk (4. ábra p=0.15). Többváltozás regressziós analizissel (Cox-féle hazard modell) azonban a nem is – bár a legkisebb mértékben - de túlélést befolyásoló prognosztikai faktorként szerepel.

Nem

Összes túlélés %

120 100 80 60 40

nõ (n=35) férfi (n=40)

20 0 0

20

40

60

80

100

120

140

Idõ (hónap)

4. ábra: Nem és a túlélés összefüggése (p=0.15)

25

160

Megjelenés a röntgenfelvételen

esetben szklerotikus, 18 esetben lytikus, míg 43 esetben vegyes megjelenésû osteosarcomat észleltünk. A röntgenmegjelenési forma és a túlélés között semmilyen statisztikai összefüggést

A daganat lokalizációját tekintve eseteinket három csoportba soroltuk. Proximális elhelyezkedésûnek vettük a humerus proximális, femur proximális és diaphysealis (14 eset) megjelenését, míg distálisnak (distal a) a femur distális és tibia, fibula proximális részében kialakulókat (51 eset), és törzstõl távolinak, úgynevezett ”távoli distálisnak” (distal b) a radius distális, tibia, fibula distális és lábtõcsontokon kifejlõdõ (10 eset) osteosarcomákat. Míg a proximális és distális (distal a) csoport túlélése lényegében megegyezett, addig a ” távoli distális” (distal b) csoport túlélése lényegesen jobb volt (5. ábra p=0.03). Míg az elõbbi csoportokban az ötéves túlélés 62-63% volt, addig az un. „távoli distális” lokalizációjú

Lokalizáció 100

Összes túlélés %

90 80 70 60 50 40 proximalis (n=14) distal a (n=51) distal b (n=10)

30 20 10 0 0

20

40

60

80 26 100 Idö (hónap)

120

140

160

5. ábra: Tumor elhelyezkedése és a túlélés közti összefüggés (p=0.03)

A tumor mérete, illetve térfogata

Különbözõ csoportosításokat használva vizsgáltuk az osteosarcomák diagnózisakor mért különbözõ nagyságú, illetve térfogatú daganatok és a túlélés közötti összefüggést. A daganat legnagyobb átmérõjét véve alapul cm-ként növekvõ méretû csoportokat alkottunk, melybe különbözõ átmérõjû, illetve térfogatú daganatok kerültek. Eszerint vizsgáltuk a daganat átmérõjét, valamint a számított térfogatot, mint a túlélést befolyásoló tényezõt. Megállapítottuk, hogy a növekvõ térfogattal egyenes arányban csökkent a túlélõk arányának a száma. Vizsgáltuk a 60 cm3-nél kisebb (12 eset), valamint annál nagyobb (63 eset) térfogatú daganatok és a túlélés közötti összefüggést. Csupán a daganat átmérõjét tekintve nem észleltünk szignifikáns különbséget a túlélést illetõen, azonban a térfogatot vizsgálva a 3

alatti és feletti térfogatú osteosarcomák túlélése között észleltünk

szignifikáns eltérést (6. ábra p=0.061). 60 cm3-nél kisebb térfogatú tumorok esetében (12 beteg) mindegyik beteg tumormentes túlélõ. Többváltozós Cox-regressziós modellnél a térfogat, mint prognosztikai faktor értékelhetõ.

Összes túlélés (%)

Tumor térfogat

<60 cm 3 (n=12) >60 cm 3 (n=63)

.061)

27

Szövettani alcsoportok

A domináló sejtféleség szerint megkülönböztetünk osteoblastos (42 eset), chondroblastos (8 eset), fibroblastos (6 eset), teleangiectaticus (6 eset), kissejtes (3 eset), valamint vegyes (10 eset) formákat, mely utóbbinál nem lehetett egyértelmûen domináns sejtféleséget megállapítani. Az osteoblastos alcsoporttól eltekintve a többi csoportba statisztikai analízisre alkalmatlan számú minta került, ezért ezeket összevonva két csoportot: osteoblastos (42 eset) és összes egyéb (33 eset) alakítottunk ki. A két csoport között nem találtunk szignifikáns túlélést illetõen (7. ábra p=0.32). Más felosztásban azonban szignifikáns különbséget észleltünk a túlélésben akkor, ha a tumor porcszövettartalmát vettük alapul. Azoknál az eseteknél (59 eset), ahol a porcszövet mennyisége 20% alatt maradt az ötéves túlélés 80% felett volt, míg ellenkezõ esetekben (16 eset) ez csupán 50%-nak bizonyult (8. ábra p=0.006).

Összes túlélés (%)

Szövettani alcsoportok

7. ábra: Szövettani alcsoport és a túlélés közti összefüggés (p=0.32)

Szövettani alcsoportok

Összes túlélés %

120 100 80 60 Porcszövet <20% porcszövet <20% (n=59)

40

(n=59) porcszövet >20% (n=16)

20 0 0

20

40

60

28 80

100

Idõ (hónap)

120

140

160

8. ábra: Tumor porcszövettartalma és a túlélés közti összefüggés (p=0.006)

Neoadjuváns kemoterápia

A vizsgálatban résztvevõ betegek közül 54 beteg mind neoadjuváns, illetve adjuváns, 21 beteg pedig csak adjuváns kezelésben részesült. Az utóbbi esetek többsége már felismeréskor nagy, lágyrészeket, idegképleteket infiltráló daganatban szenvedett, így végtagmegõrzés lehetõsége eleve kizárt volt, ezért rögtön amputáció történt. A túlélést tekintve szignifikáns (9. ábra p=0.02) különbség volt a preoperativ kemoterápiában részesült betegek javára, ahol az ötéves túlélés 81% volt szemben a csupán postoperatív kemoterápiában részesültek 58%-ával. E csoportban a túlélési eredményeket fenntartással kell értékelnünk, mivel a betegek etikai okok miatt nem voltak randomizálva, valamint a jobb eredményt befolyásolhatta a tumorméretek eltérõ volta is.

Neoadjuváns kemoterápia

Összes túlélés %

120 100 80 60 40

igen (n=54) nem (n=21)

20 0 0

20

40

60

80

100

Idõ (hónap)

29

120

140

160

9. ábra: A neoadjuváns kemoterápia és a túlélés összefüggése (p=0.02)

Kemoterápia érzékenység

46 betegnél volt lehetõség a preoperativ kemoterápia hátásának, a tumor regresszió mértékének meghatározására. 21 beteg (46%) tartozott a kemoterápiára jól reagálók csoportjába, 14 beteg (30%) a nem regálók, míg 11 beteg (24%) a mérsékelten reagálók közé. Kisebb mértékben, de szignifikánsan különbözött a túlélés, ha a Kaplan-Meier görbe két csoportot tartalmazott: jól reagálók (21 beteg), illetve összevontan a mérsékelten jól és rosszul reagálók (25 beteg) csoportjait (10. ábra, p=0 csoportot külön-külön vizsgáltuk, úgy kitûnt, hogy a jól és a mérsékelten jól reagálok

csoportja majdnem ugyanúgy viselkedett a túlélés függvényében, míg a rosszul reagálók csoportja, szignifikánsan (11. ábra p=0.001) rosszabb túlélést mutatott az elõzõ két csoporténál. Az osteosarcomák kemoterápiával szembeni érzékenysége, mint a prognózist meghatározó faktor elsõ helyre került a többváltozós statisztikai analízisben is (3. táblázat).

10. ábra: A kemoterápia iránti érzékenység és a túlélés összefüggése (p=0.043)

30

Kemoterápia iránti érzékenység

120

Összes túlélés %

100 80 60 Nem érzékeny (n=14) Mérsékelten érz. (n=11) Kemoterápia érz. (n=21)

40 20 0 0

20

40

60

80

100

120

140

160

Idõ (hónap)

11. ábra: A kemoterápia iránti érzékenység és a túlélés összefüggése (p=0.001)

Változók

Regr.

Standard

Koeff./s.e.

p-érték

koeffic.hiba (s.e.) Kemoterápia iránti érzékenység

-2.0105

0.6462

-3.1111

0.0002

Lokalizáció

-1.6278

0.6088

-2.6738

0.0032

Porcos alapállomány mennyisége globalis χ2: p=0.0016

1.6251

0.6903

2.3542

0.0222

3. táblázat: Többváltozós Cox-féle regressziós modell a túlélést befolyásoló tényezõk szempontjából (kemoterápia érzékenység vizsgálatával, n=46)

Sebészi eredmények (sebészi beavatkozás szerint vizsgálva): a) Végtagmegõrzõ mûtét 39 betegnél (52%) történt, míg amputáció 36-nál (48%). Az átlagtúlélés mind a 75 betegre vonatkoztatva 76 hónapnak bizonyult, míg a betegek ötéves átlagos túlélése 73%, ötéves tumormentes túlélése 72% volt. Ugyanez a végtagmegtartó mûtéteknél 73%-nak, illetve 72%-nak, míg az amputált csoportnál 71-71%-nak mutatkozott. Helyi kiújulást 3 esetben (7%) észleltünk a 39 végtagmegõrzõ mûtétet követõen, amputáció 31

után egy alkalommal (2%). Végtagmegtartó mûtétet követõen 8 betegnél (20%) észleltünk tüdõáttétet, míg amputáció után 14 esetben (39%). A tüdõáttétben szenvedõ betegek – 1 betegtõl eltekintve - a mûtét után öt éven belül meghaltak. Egyváltozós statisztikai analízissel nem volt szignifikáns különbség a végtagmegõrzõ mûtétek és az amputáción átesett betegek túlélése között (12. ábra p=0.67 ). b) sebészi szél alapján: radikális tumorresectió vagy marginális/intralesionális beavatkozás; A sebészi beavatkozás 66 betegnél (88%) radikális, vagy szélesen az épben történt, míg 9-nél (12%) marginálisan, illetve intralesionálisan. Ez utóbbiaknál helyi kiújulást 5 esetben (2 amputáció és 3 végtagmegtartást követõen) észleltünk. A radikálisan operált betegek ötéves túlélése 80%-nak bizonyult, míg a marginálisan, illetve intralesionálisan operáltaké csupán 44% volt. Erõsen szignifikáns különbséget mutatott az eltérõ radikalitással operált csoportok túlélése (13. ábra, p=0.017), mely szignifikánsnak bizonyult a Cox-féle regressziós modellben

amputáció (n=36) végtagmegtartó

12. ábra: A végtagmegtartó mûtét, ill. amputáció és a túlélés összefüggése (p=0.67)

32

Sebészi szél

Radikális (n=66) Marginalis (n=9)

13. ábra: Sebészi radikalitás és túlélés összefüggése (radikális/marginális) (p=0.017)

Mûtéti stádium

Az osteosarcoma Enneking beosztás szerinti sebészi stádiumai között meghatározóan nagy különbség van a túlélést illetõen. Míg a II/A(15 beteg) és a II/B (60 beteg) sebészi stádiumok között nem észleltünk szignifikáns különbséget a túlélést illetõen, az ötéves átlagos túlélés 60-75%-os a megfelelõ komplex kezeléssel (14. ábra, p=0.30), addig a III. stádiumban (9 beteg), ahol az osteosarcoma felismerésekor már tüdõáttétek is jelen voltak, jelentõs szignifikáns különbséget tapasztaltunk, itt mindösze 10-20 % (15.ábra, p=0.004).

33

Mûtéti stádium

Összes túlélés %

120 100 80 60 40

II/A (n=15) II/B (n=60)

20 0 0

20

40

60 80 100 Idõ (hónap)

120

140

160

14. ábra: A mûtéti stádium és a túlélés összefüggése (p=0.30)

Mûtéti stádium 120 Összes túlélés %

100 80 60 II/A (n=15) II/B (n=60) III/B (n=9)

40 20 0 0

20

40

60

80

100

120

140

160

Idõ (hónap)

.004) Többváltozós statisztikai analízis

A betegek és módszerben feltüntetett összes változót együttesen is vizsgáltuk többváltozós statisztikai analízis módszereivel (Cox féle regressziós modell). A többváltozós analízist két formában végeztük, tekintettel arra, hogy a neoadjuváns kemoterápia iránti érzékenység vizsgálatát csak 46 betegnél tudtuk elvégezni az I. csoport 75 betege közül. A 46 betegnél a kemoterápia iránti érzékenység bevonásával (3. táblázat), illetve mind a 75 betegnél a kemoterápia iránti érzékenység, mint változó elhagyásával (4. táblázat). A Cox-féle hazard módszerrel a kemoterápiás érzékenység igen erõs, a túlélést jelentõsen befolyásoló 34

tényezõnek bizonyult, ezt követte a tumor lokalizációja, majd porcszövettartalma, melyet a tumor mérete, illetve a betegek neme követ. Ha a kemoterápiás érzékenységet nem vettük figyelembe, akkor a 75 betegre nézve a túlélést leginkább befolyásoló tényezõnek a tumor porcszövettartalma, a lokalizációja és a sebészi radikalitás mértéke bizonyult (4. táblázat). A regresszió validitását a globalis x2-el teszteltük, p=0.0016-nak, illetve p=0.0007-nek adódott, azaz a Cox-regresszió mindkét mintán erõsen szignifikáns összefüggést mutatott a fenti változók és a túlélés között.

Regr.

Standard

Koeff./s.e.

p-érték

koeffic.hiba (s.e.)

Porcos alapállomány mennyisége

1.3690

0.4948

2.7670

0.0080

Lokalizáció

-0.7319

0.3558

-2.0572

0.0371

Sebészi radikalitás

0.9496

0.4908

1.9348

0.0331

globalis χ2: p=0.0007

4. táblázat: Többváltozós Cox-féle regressziós modell a túlélést befolyásoló tényezõk szempontjából (kemoterápia érzékenység, mint változó nélkül, n=75)

II. csoport Kilenc beteg került ebbe a csoportba, akiknél már a diagnózis idején távoli metasztázist

észleltünk.

Mûtétet

követõen

adjuváns

kemoterápiában

részesültek.

Átlagéletkoruk 26.1 év volt. Amputációra került sor 6 esetben, míg 3 betegnél végtagmegtartó mûtétre nyílt lehetõség. Pulmonális metastasectomiat végeztek 3 beteg esetében. A betegek összes túlélési ideje 30 hónap volt, 3 beteg perzisztáló tüdõmetastasisokkal él (3-, 2-, illetve 1 évvel a tumor felismerését követõen). Egy 72 éves nõbeteg esetében észleltük, hogy a diagnózis felállítását követõen 9 évig perzisztáló

35

III. csoport

alkalmazott gyógyszerekkel szembeni túlérzékenység - miatt 12 beteg nem kapott megfelelõ dózisban, illetve idõintervallumban kemoterápiát. A betegek átlagéletkora az I csoport 17.4 évével szemben 28.6 év volt. Az össztúlélési idõ az adott 12 betegnél átlagosan 18 hónap volt. Nyolc beteg meghalt, 4 jelenleg tumormentesen túlélõ (2, illetve 1 évvel a betegség felismerését követõen). A betegek túlélési görbéi a II. és a III. csoportban hasonló lefutást mutatnak, és szignifikánsan rosszabbat az I. csoportnál .0001).

.0001)

5.2.4. Megbeszélés

A prognosztikai faktorok vizsgálatára igazán csak az I. betegcsoport alkalmas, ahova homogén (nem metasztatikus) statisztikailag értékelhetõ esetszám tartozott (75 beteg), és a kezelések a meghatározott kezelési séma szerint történtek. Az I. csoport 5 éves túlélése az amputáción átesett betegeknél (71%), a végtagmegtartó mûtétben részesítetteknél (73%), mely megfelel az irodalomban közölt 55-80%-os értékeknek (37, 109, 110, 118, 128, 171).

36

A betegek életkorát, mint prognosztikai tényezõt vizsgálva is ellentmondóak az irodalmi eredmények. A szerzõk többsége nem észlelt különbséget az egyes korcsoportok eredményei között (35, 37, 99, 109), míg mások 13 év alatti, illetve 30 év feletti (127) betegeknél rosszabb túlélést észleltek. A 30 év feletti betegeket gyakran kizárják az értékelésekbõl részben kemoterápia intolerábilitás, részben a csekély betegszám miatt. Saját eredményeink szerint nincs különbség az egyes korcsoportok túlélése között: a 30 év feletti betegek túlélési esélyei megegyeznek a fiatalabb korcsoportokéval, ha protokoll szerinti kezelésben részesülnek. Idõsebb betegeknél azonban lényegesen gyakrabban tapasztalunk rosszabb kooperációt, kemoterápia intoleranciát, illetve egyéb szövõdményeket, ami miatt a kemoterápiát nem a kezelési terv szerint, hanem késéssel tudtuk biztosítani. Ezeket a betegeket a protokollból kizártuk és a III. csoportba soroltuk. Ennek megfelelõen a csoport átlagéletkora az I. csoport 17.4 évével szemben 28.6 évnek bizonyult. Glasser és mtsai (56), anyagában a nõi nem, míg Petrilli és mtsai (110) szerint a férfi nem bizonyult negatív prognosztikai tényezõnek. Anyagunkban a nõk túlélése valamivel jobb volt, de az eredmény nem tekinthetõ szignifikánsnak (p=0.15). A nemet sok értékeléshez hasonlóan nem tartjuk lényeges prognosztikai faktornak (35, 99). A lokalizáció axialis elhelyezkedést (gerinc, medence, borda) rossz prognózisúnak tartják (11, 56, 60, 63, 80), Bielack (10) szerint a proximalis humerus lokalizáció jobb eredményeket adott, míg Proviser (118) szerint a humerus és femur elhelyezkedés negatív prognosztikai faktor a proximalis tibia, illetve a törzstõl egyre távolibb lokalizációkkal szemben. Anyagunkban az úgynevezett „távoli distális” (csukló-, bokatáji, lábközépcsontból kiinduló) lokalizációjú daganatok prognózisa egy és többváltós analízissel szignifikánsan (p=0.03) jobbnak bizonyult. A megállapítás értékét csökkenti a viszonylag kis esetszám. kevésbé tartották fontos tényezõnek a tumor sebészi stádiumával szemben (56) és felhívták a figyelmet a térfogatmérés pontatlanságára. A COSS munkacsoport (11, 12) vizsgálatai szerint a kétirányú röntgenfelvételek alapján történõ tumorvolumen mérés az ellipszis képlet segítségével jól korrelál a CT vagy MRI alapján történõ komputerizált térfogatméréssel (12, 81, 121). Eredményeik szerint 53 beteg közül csak négy esetben alakult ki metasztázis, akiknél a tumorvolumen 60 cm3 alatt volt, míg a többi esetben 40-60% relapszus következett be. Saját anyagunkban is észleltük a neoadjuváns kemoterápia megkezdése elõtt számított 37

tumortérfogatok növekedésével fordítottan változó túlélési esélyeket, de szignifikáns 3

alatti és feletti csoportoknál észleltünk.

A szövettani alcsoportok és a túlélés közötti összefüggés kimutatására is számos próbálkozás történt. A szerzõk többsége nem talált összefüggést (98), jobb prognózisúnak találta a teleangiectasias formát, Petrilli és mtsai (109) pedig az osteoblastos alcsoportot, egyéb szövettani alcsoportokkal szemben. Saját anyagunkban is ez utóbbit észleltük, de az eredmény nem volt szignifikáns (p=0.32). Eseteink 16%-a vegyes szöveti szerkezetet mutatott, tehát egy sejt illetve szövetféleség sem dominálta a szöveti képet, így ez az értékelést feltehetõen befolyásolta. A COSS munkacsoport korábban szoros összefüggést talált a tumor porcszövettartalma és a kemoterápiás érzékenysége között. A 20%-ot meghaladó porcszövetet tartalmazó osteosarcomás betegek szignifikánsan rosszabb túlélést mutatnak (p=0.006). A csonttumor munkacsoportok közül számos (2, 56, 91, 113, 118, 132) foglalkozott a összefüggés kérdésével. Mind egyváltozós, mind többváltozós statisztikai analízisekben erõs prognosztikai faktorként szerepel az osteosarcoma kemoterápiás érzékenysége. A kemoterápia érzékeny esetek ötéves túlélése 91-95% között mozog, a kemoterápia rezisztens daganatoknál ez mindössze 50-60%. A helyi kiújulások aránya is lényegesen magasabb (56, 110, 118). A semiquantitativ szövettani értékeléshez használt beosztási skálák (71, 113, 132) megegyeznek abban, hogy kemoterápia érzékenynek minõsítik a tumort akkor, ha a preoperativ kemoterápiát követõen a szövetnecrosis 90%, vagy annál nagyobb, tehát a túlélõ tumorsejtek csak kisebb gócokban, elszórtan, összeségükben 10% alatti mennyiségben fordulnak elõ. Saját vizsgálatunkban a jól reagáló csoport 90% feletti, a mérsékelten jól reagáló formák 50-90% közötti, a rosszul reagáló esetekben 0-50% közötti tumornecrosist jelent. Szignifikáns különbséget találtunk a jól reagáló és a többi osteosarcomás beteg túlélése .043). Meglepõ volt anyagunkban, hogy a mérsékelten reagáló csoport túlélési görbéje azonban inkább a jól reagáló csoporthoz mutatott hasonló lefutást. A rosszul reagáló formák ötéves túlélése mintegy 40%-nak bizonyult. Végtagmegtartó mûtét akkor javasolható, ha a betegek életkilátásai nem csökkennek az amputációval szemben. Az irodalmi adatokat (137, 139) saját tapasztalataink is alátámasztják, miszerint végtagmegõrzõ mûtéteknél valamelyest fel kell adni a radikalitásból, 38

emiatt minimális mértékben, de emelkedik a helyi recidívák száma (anyagunkban 7% volt az amputációknál tapasztalt 2%-al szemben), azonban lényegesen jobb életminõség érhetõ el, azonos ötéves túlélés mellett, ami ebben a fiatal életkorban lényeges szempont. Helyes indikáció mellett az egyes mûtéti megoldások között a túlélést illetõen nincs statisztikailag szignifikáns különbség (94). Lokalis recidiva recidiva radikális eltávolítása (amputáció) esetén is igen rossz az ötéves túlélés, kb. azonos a felismeréskor már áttétet adó osteosarcomákéval, mely 10-20% (114). Simon és mtsai anyagában (137) 17 helyi recidivában szenvedõ beteg közül 16, Winkler és mtsai (166) 23 betege közül 19 halt meg a recidivák radikális eltávolítása ellenére. Anyagunkban is minden helyi kiújulást mutató beteget (4 eset) elvesztettünk tüdõáttétek miatt. Glasser (56), Springfield (144) Winkler (166), Sluga (139) munkái felhívják a figyelmet a

vizsgálata alapján

a sebészi radikalitás és a helyi kiújulás, illetve az ötéves túlélések közötti szoros összefüggésre (171). Hét marginális, valamint két intralézionális sebészi beavatkozást követõen négy esetben észleltünk lokális recidivát, ezeket a betegeket elvesztettük. Nem meglepõ, hogy a széles + radikális, illetve marginális + intralézionális betegcsoport túlélése között szignifikáns különbség .017). Az osteosarcoma Enneking beosztás szerinti sebészi stádiumai között meghatározóan nagy különbség van a túlélést illetõen. Míg a II/A és a II/B stádiumok között nem észleltünk szignifikáns intra-, akár extracompartmentalisan helyezkedtek el átlagosan 60-75%-os ötéves túlélést lehet elérni megfelelõ komplex kezeléssel,

addig a III. stádiumban, ahol az osteosarcoma

felismerésekor már tüdõáttétek is jelen vannak, ez mindössze 10-20%. Nagyobb statisztikák (23, 63, 96) szerint a diagnózis idején felismert osteosarcomás esetek kb. 10-15%-nál kell pulmonális metasztázissal is számolni. A túlélés ebben a csoportban gyakorlatilag független a primer tumor lokalizációjától, a praeoperativ kemoterápiától vagy az azonnali sebészi beavatkozástól. A fentiek alapján a metasztatikus és nem metasztikus osteosarcomás sorolják és különbözõ protokollokkal kezelik és értékelik. Saját eredményeink is igazolják az irodalmi adatokat: a II. csoport 9 betege közül mindössze 1 élte túl tüdõáttétekkel az öt évet, a többi beteg átlag túlélési ideje 20 hónap volt. Meglepõ eredményeket kaptunk a III. betegcsoport adatainak kiértékelésekor, ahol a 39

kemoterápia alatt és toleranciája a gyógyszerekkel szemben szintén fontos prognosztikai faktor. Alacsonyabb dózisban, késleltetve alkalmazott kemoterápia a polirezisztens tumorsejtpopulációk kialakulásához vezethet. Bár a III. csoportunk esetszáma csekély (12 beteg), de itt nagyobb arányban fordult elõ rezisztencia a kemoterápiával szemben. A fentieket magyarázhatja a betegek magasabb életkora (az átlagéletkor itt 28 évével szemben). A harminc év feletti betegek tapasztalataink alapján nehezebben viselik az agresszív, nagydózisú kemoterápiát, gyakrabban alakulnak ki szövõdmények, így a kezeléseket alkalmanként csak késve kaphatják. A COSS protokollok, illetve egyéb munkacsoportok vizsgálatainak kiértékelése mutatott rá arra, hogy mennyire fontos a kezdeti stádiumtól alkalmazott intenzív, halasztás nélküli, nagydózisú kemoterápia (1, 11, 110, 111, 128, 167, 168, 169). Anyagunkban a III. csoport túlélési görbéje (16. ábra) a nem megfelelõ kemoterápiát követõen éppolyan rossz túlélést mutatott, mint a II. csoport túlélési görbéje. Az ötéves túlélési arány megegyezik a történelmi kontroll csoportok (1970-s évek csak sebészi kezelés; ld. bevezetés) 10-20-%-os ötéves túlélési eredményeivel (43, 49, 75). A fentieket összefoglalva a 65-75%-os tumormentes ötéves túlélési eredmények eléréséhez elengedhetetlenül szükséges a tumor megfelelõ sebészi eltávolítása szélesen vagy radikálisan, és az intenzív, nagydózisú protokoll szerint alkalmazott kemoterápia. Ezek hiányában a helyi kiújulások és a tüdõáttétek kialakulása következtében a túlélési arány visszaesik a felismeréskor már metasztatikus osteosarcomák, illetve a történelmi kontroll csoport 15-20%-os szintjére. Önmagában a harminc év feletti életkor nem tekinthetõ rossz prognosztikai faktornak, de ezen betegeknél rosszabb kooperációra, illetve gyógyszeres kezelést követõen gyakrabban fellépõ szövõdményekre számíthatunk, ami a túlélési esélyeket ronthatja. Vizsgálatunkban egyváltozós statisztikai analízissel sem bizonyult szignifikáns prognosztikai tényezõnek az életkor, az anamnézis idõ, a tumor röntgenmegjelenése, a beteg neme. Pozitív prognosztikai faktor a 60 cm 3-nél kisebb tumortérfogat, a széles vagy radikális sebészi kimetszés, a törzstõl távoli lokalizáció, a 20%- nál kisebb porcarány a tumoron belül és a kemoterápia iránti érzékenység. Ezek a tényezõk a többváltozós statisztikai analízis során is szignifikánsnak bizonyultak. 40

6. ÚJABB PROGNOSZTIKAI FAKTOROK VIZSGÁLATA OSTEOSARCOMÁBAN

6.1. Molekuláris szabályzók vizsgálata

6

Talán a legtöbbet vitatott és vizsgált antiproliferációs, illetve proapoptotikus gén a TP53 (17p13, terméke a p53), melynek hibája (általában pontmutáció és/vagy deléció) fordul elõ leggyakrabban emberi daganatokban (64, 83, 142, 161, 162). A 393 aminosavból álló p53 fehérje képes kötõdni más fehérjékkel (pl. vírusfehérjékkel) és oligomerizálódni saját magával (ami összefügg a transzformációs képességgel). A p53-ban különbözõ domének felelõsek a génátírás aktivációjáért, a szekvenciaspecifikus DNS kötõdésért, az oligomerizációért és a károsodott DNS-hez való kötõdésért. A p53 fehérje szerkezetét és ezen keresztül a mûködését alapvetõen befolyásolja a molekula foszforilációja és defoszforilációja (34). Mivel a p53-hiányos egér normálisan fejlõdik, arra következtettek, hogy a p53 nem elengedhetetlen a normál sejtosztódáshoz, differenciálódáshoz. Az viszont, hogy ezekben az egerekben megnõtt a legkülönbözõbb daganatok iránti érzékenység arra utal, hogy a p53-nak mégis van valamiféle általános védõhatása a tumorképzõdéssel szemben (34). Számos kísérlet alapján bizonyítottnak tekinthetõ hogy a p53 õrködik a sejt genetikai apparátusának épsége felett, ha a sejt károsodik, akkor a p53 expressziója fokozódik, stabilizálódik és meggátolja a proliferációt addig, amíg a károsodást a sejt nem javítja ki. Ha ez nem sikerül, akkor a p53 beindíthatja a programozott sejthalált (apoptosist), megakadályozva így azt, hogy a génhiba az utódsejtekbe kerüljön. A p53 ellenõrzõ funkciójának kiesése következtében a sejt genetikailag instabillá válhat és ez a genetikai hibák felhalmozódásához vezethet (83, 84, 86, 90).

6.1.2. A proliferáció gátlása

A proliferáció gátlásával ismertté vált a p53 a G1-S átmenet ellenõrzõ pontjának egyik kulcsfontosságú eleme. Tetramer szerkezetû transzkripciós faktorként mûködik, igen kis 41

mennyiségben fordul elõ normális sejtekben, azonban a sejtet érõ stressz különbözõ formái aktiválják a p53-at, ez pedig azokat a géneket, amelyek a sejtciklust gátolják vagy az apoptózist indukálják (142, 162). A p53 egyik legfontosabb célpontja a WAF1/Cip1 gén (wild-type p53 activated fragment/Cdk interacting protein), melynek promoterregiójához kötõdve stimulálja a WAF1 gén expresszióját, a p21WAF1 hoz

(proliferating

cell

nuclear

antigen,

37kDa,

DNS-polimerázhoz

kapcsolódó,

sejtciklusfüggõen megjelenõ fehérje) kötõdve gátolja azok mûködését. Gátlódik így a Cdkfüggõ foszforiláció, ami pl. a pRb-t (retinoblasztoma génrõl termelt fehérje) inaktiválná, amely elengedhetetlen ahhoz, hogy a sejt a sejtciklusban továbbhaladjon. Kimutatták, hogy a DNS-t WAF1

DNS károsodáskor a p53 indukcióján keresztül ez a p21WAF1 küszöb megemelkedik, késleltetve a DNS szintézist (41, 70, 89, 160, 161).

6

A p53 normál funkcióját befolyásolhatja/szabályozhatja, pontosabban gátolhatja egy hozzá kapcsolódó fehérje, az mdm2 (12q14-15 murine double minute, 2 Funkcionálisan az mdm2 túltermelõdése (pl. amplifikáció miatt) ugyanolyan inaktiváló hatású lehet, mint a p53 mutációja, vagy a p53 bizonyos virális fehérjékkel való kapcsolata. Tovább bonyolítja a szabályozást, hogy az mdm2 gén expresszióját a p53 indukálni képes, ami egyben a p53 önszabályozásának lehetõségét jelenti (6, 62, 95). Az mdm2 gátló hatását a p53 aktivációs doménjének elfedésével éri el. Az mdm2 és a CDK4 gén együttes amplifikációja additiv vagy szinergikus hatású lehet, talán ezért helyezkednek el egy replikonon. A p53 és mdm2 arány igen szorosan szabályozott egyensúlyként mûködik a sejtproliferáció során. Az mdm2 gén amplifikációját figyelték meg humán sarcomák egyharmadában, fõleg osteosarcomában, liposarcomában, illetve malignus fibrosus hystiocytomában (84, 85, 87, 161).

6.1.3. A p53 és az apoptózis

42

A p53 lehetséges hatása - a proliferáció gátlás - mellett az apoptózis indukálása. (pl. ha a sejt nem képes a génhibákat kijavítani), a funkciózavar egyik megnyilvánulása pedig az apoptózis elmaradása. A p53 és az apoptózis kapcsolatának pontos mechanizmusa ismert, de feltételezik, hogy elsõsorban a proapoptotikus Bax expresszióját fokozza és az antiapoptotikus Bc1-2-t gátolja.

6.1.4. Génhibák és funkcionális zavarok

A p53 funkciózavarának egyik oka nyilván a gén hibája (mutáció, deléció), a másik pedig az, ha a normál p53 fehérjét valami inaktiválja. Inaktiválhatják – az mdm2-n kívül-

A mutációk többsége az 5.-8. exonban a 130-290 kodon között fordult elõ. Ezek között is „forró” pontokat jelentenek (gyakoriságuk miatt) a 175. a 248. és a 273. kodonok (170). Azzal általában mindenki egyetért, hogy a p53 gén hibája hozzájárul emberben a rosszindulatú daganatok keletkezéséhez és/vagy terjedéséhez, arról azonban megoszlanak a vélemények, hogy az egyes tumortípusokat tekintve a daganatok életének korábbi vagy késõbbi szakaszában játszik-e nagyobb szerepet a p53 zavara. Említésre méltó, hogy a p53 mutációjával nemcsak rossz, hanem jóindulatú tumorokban, sõt olyan állapotokban is találkozhatunk, melyeket nem tartunk daganatelõtti állapotnak, pl. prostatahiperplázia. Ez alátámasztja azt az elképzelést, hogy a p53 kóros mûködésének, valamint a normál mûködés hiányának különlegesen fontos szerepét elsõsorban az jelenti, hogy lehetõséget teremt a genetikai instabilitásra, egyéb génkárosodások megjelenésére. A génhibák és a prognózis közötti kapcsolat vizsgálatának alapja a hibás p53 mûködés felismerése. A p53 kóros mûködésére következtethetünk, pl. adott mutáció kimutatásával, vagy a kóros fehérje kimutatásával. Utóbbi vált a legelterjedtebbé, hiszen a mutáció miatt a sejtben a fehérje felhalmozódásának kimutatása elméletileg nem nehéz. Ennek ellenére az egyes közlemények adatai igen gyakran ellentmondásosak. Ennek oka lehet: eltérõ antitestek alkalmazása, a pozitivitás/negativitás és az intracellularis lokalizáció eltérõ értékelése, valamint olyan molekuláris szabálytalanságok, mint a mutáció miatti epitóp elvesztése, vagy éppen az, hogy a mutáció nem jár feltétlenül a fehérje féléletidejének meghosszabbításával (73).

43

Az egyes tumortípusok közül hasonló problémák miatt ellentmondásos a p53 génhiba prognózisban játszott szerepének megítélése. Általában a pozitív hisztokémia egyezik a mutációk jelenlétével, azonban nem mindig. Tüdõrákban, pl. aránylag gyakoriak az intronban bekövetkezõ és a „nonszensz” mutációk, melyeknél az immunreakció természetesen negatív (153). Vastagbélrákban is számos közlemény szólt a p53 felhalmozódás prognosztikai szerepe mellett azonban ellene is. Újabb megfigyelések szerint nemcsak a fehérje felhalmozódás maga, hanem a helye is fontos. Így, pl. vastagbélrákoknál (különösen a bal colonfélbõl és a rectumból kiindulóknál) a p53 citoplazmatikus (nem magi!) felhalmozódása a legfontosabb prognosztikai marker a stádiummal együtt (18). Emlõrákoknál nyirokcsomóáttét nélküli betegeknél 5.-8. exonra vonatkoztak, ami ahhoz az általános vélekedéshez vezetett, hogy a mutációk ezeken a szakaszokon vannak (65, 149). Az újabb vizsgálatok alapján nyilvánvaló, hogy sok p53 mutáció ezen a szakaszon kívül esett, sok a missense pontmutáció, ami stabil, de inaktív fehérjeszintézishez vezet. A p53 fehérje akkumulációja és a p53 génmutációja közti korreláció kb. 80%-os mivel pl. frameshift mutációk nem vezetnek p53 fehérje felszaporodásához (66). Teljes génszakaszt kell vizsgálni, mivel elveszíthetünk olyan információkat, amiknek klinikai jelentõségük lehet (13, 26). Ez magyarázhatja azt a heterogenitást, ami a publikált vizsgálatok eredményeiben mutatkozott. Malignus csonttumorokban is keresték a génhibák és a prognózis közti kapcsolatot (8, 16, 61, 85, 97, 103, 134). Vizsgálták a különbözõ szövettani altípusok és a prognózis, valamint a p53 kóros mûködése és a betegség kemoterápia iránti érzékenysége, valamint prognózisa közti korrelációt (16, 68, 84, 97, 119, 153, 154). A legtöbb tanulmány a p53 expresszió fokozódása és a kemoterápia iránti érzékenység, valamint a túlélés között szignifikáns

44

6.2. Klinikai és patológiai vizsgálat

Retrospektív klinikai vizsgálatot végeztünk 1995. január és 1999. június között, hogy megvizsgáljuk a p53, valamint mdm2 fehérje expresszióját, és a p53 gént illetõen a heterozigótaság elvesztését. Vizsgálatainkat kiegészítettük a Ki-67 proliferációs antigén meghatározásával osteosarcomában szenvedõ betegek biopsziás, ill. mûtéti szövettani anyagán. A vizsgálatokat immunhisztokémiai módszerekkel a Szent János Kórház Pathológiai osztályán és polimeráz láncreakcióval (PCR) az OOI Molekulárbiológiai laboratóriumában végeztük. A vizsgálatok leírását és az értékelés elveit a vizsgálómódszerek rész tárgyalja (4.1.5., 4.1.6., 4.1.7.).

6.2.1. Beteganyag

Az immunhisztokémiai vizsgálatokat 42 biopsziával igazolt, malignus, centrális, kezeletlen osteosarcomás beteg biopsziás, illetve mûtéti preparátumából nyert szövettani mintáin végeztük el. A 42 beteg közül 24 férfi és 18 nõ volt, az átlagéletkor 20 év (15-25 év). A primer tumor lokalizációja csökkenõ gyakorisági sorrendben: distális femur, proximális tibia, proximális humerus, calcaneus és distális tibia (5. táblázat). A szövettan szerinti megoszlást a 6. táblázat mutatja be.

Distális femur

18 (43%)

Proximális tibia

14 (33%)

Proximális humerus

8 (19%)

Calcaneus

1 (2%)

Distalis tibia

1 (2%)

5. táblázat: A primer tumor lokalizációja

45

Szövettani diagnózis

A betegek száma

Osteoblastos

25 (60%)

Kevert sejtes

6 (14%)

Fibroblastos

4 (10%)

Kissejtes

3 (7%)

Teleangiectásiás

2 (5%)

Chondroblastos

2 (5%)

6. táblázat: Szövettani megoszlás

A tumorstádium megállapítása Enneking beosztás szerint történt (részletesen lásd 2. A stádiumú, míg 34 beteg (81%) II/B stádiumú volt. A betegek általános állapota a WHO skála szerint 0-1 (7. táblázat).

0

26 (62%)

1

16 (38%)

7. táblázat

mintáiból tudtuk elvégezni, mivel ehhez a vizsgálathoz friss, fagyasztott tumorszövetre, valamint az adott betegtõl származó vérmintára volt szükség. A 20 beteg közül 5 II/A (25%), míg 15 II/B (75%) stádiumú volt. A II/A stádiumú betegeknél allélvesztést nem észleltünk, így a kiértékelésbe a II/B stádiumú betegek adatait vontuk be. A 15 betegbõl 11 férfi és 4 nõ volt, 10 és 29 éves kor között, az átlagéletkor 17 év volt. A primer tumor elhelyezkedése a gyakoriság sorrendjében: femur (8), tibia (4), humerus (3). Szövettani megoszlás szerint osteoblastost 6, teleangiectaticust 3, kevertsejtes formát 3, míg fibroblastost 2, és chondroblastost 1 esetben észleltünk. sziás mintából a diagnózist felállították, elkezdtük a COSS terápiás protokoll szerinti kemoterápiát (részletes leírását lásd 19. oldal).

46

A praeoperativ kemoterápia hatásosságát, a tumor szövettani regressziójának mértékét ugyancsak az irodalomból ismertetett szemikvantitativ módszerekkel vizsgáltuk (leírását lásd a 21. oldalon). Az általunk kialakított három csoport kemoterápiára jól reagáló (responder), mérsékelten reagáló (intermedier responder), és nem reagáló (non-responder) csoportokba soroltuk a betegeket (részletesen lásd a 21. oldalon).

6.3. Eredmények

6.3.1. A p53 fehérje expresszióváltozásának kimutatása

A p53 fehérje expressziójának változását a kezdeti biopsziák 33%-ában és a mûtéti minták 38%-ában észleltük (8. táblázat).

p53 fehérje expresszió anyag

Mûtéti anyag

-

+

++

+++

-

+

++

+++

IIA

8

0

0

0

7

1

0

0

IIB

20

1

7

6

19

4

5

6

8. táblázat

beteg a diagnózis felállítása után kb. 1.5 éven belül meghalt. Hét esetben észleltünk a biopsziás anyagban ++ p53 pozitivitást a mûtéti resecatumokban öt ++ pozitiv maradt, a másik kettõ + pozitivvá vált a kemoterápiát követõen. A ++ p53 esetek közül 4 esetben alakult ki tüdõmetasztázis és 2 esetben lokális recídiva. Egy negativ biopsziás anyag + pozitivvá vált. A 28 p53 negativ esetbõl 3 betegnél alakult ki pulmonális metasztázis, 5 esetben észleltünk lokális recidívát. A statisztikai analizis szempontjából a p53 pozitiv (+, ++, +++) eseteket összevontuk, ez alapján a biopsziás anyagban a 14 p53 pozitiv eset közül 12 (86%) betegnél 47

alakult ki a daganat progressziója a három éves után követés során (pulmonális metasztázis, illetve lokális recidiva), míg a 28 p53 negativ esetben csak 8 (28%) betegnél. Szignifikáns különbség mutatkozott a daganat progressziója és a p53 expressziója között (p=0.032). Az mdm2 fokozott expresszióját 29 esetben észleltük a biopsziás anyagban ebbõl 28 betegnél a p53 negativnak bizonyult, míg a 14 p53 pozitiv esetben 13 biopsziás mintában észleltünk mdm2 negativitást, azaz a két aktivitás kizárta egymást. Pozitiv p53 reakció (+++) osteosarcomában (17. ábra), pozitiv p53 reakció (++) osteosarcomában (18. ábra). Pozitiv mdm2 reakció (+++) osteosarcomában (19. ábra).

17. ábra: Pozitiv p53 reakció (+++) osteosarcomában 200X-nagyítás

48

18. ábra: Pozitiv p53 reakció (++) osteosarcomában 200X-nagyítás

19. ábra: Pozitív mdm2 reakció (+++) osteosarcomában 200X nagyítás

A következõ táblázat bemutatja a p53, valamint az mdm2 expresszióváltozás mértékét, a Ki67 proliferációs index meghatározását a biopsziás, illetve a mûtéti anyagban, a kemoterápiára való reagálás mértékét, illetve a túlélési idõt a vizsgált 42 esetben (9. táblázat). 49

NR: non-responder (nem reagált), IR: intermediaer responder (közepesen reagált), R: responder (reagált).

50

Szövettan

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29. 30. 31. 32. 33. 34. 35. 36. 37. 38. 39. 40. 41. 42.

Osteoblastos Osteoblastos Kevertsejtes Osteoblastos Osteoblastos Fibroblastos Kevertsejtes Osteoblastos Osteoblastos Chondroblast. Osteoblastos Osteoblastos Osteoblastos Fibroblastos Osteoblastos Osteoblastos Teleangiect. Chondroblast. Fibroblastos Osteoblastos Kevertsejtes Osteoblastos Osteoblastos Osteoblastos Osteoblastos Osteoblastos Kissejtes Osteoblastos Osteoblastos Osteoblastos Osteoblastos Osteoblastos Kevertsejtes Osteoblastos Osteoblastos Osteoblastos Fibroblastos Kevertsejtes Kissejtes Kevertsejtes Teleangiect. Kissejtes

St.

II/B II/B II/B II/B II/B II/B II/B II/A II/B II/B II/B II/B II/B II/A II/A II/B II/B II/B II/B II/A II/B II/B II/B II/B II/B II/B II/B II/A II/B II/B II/B II/A II/B II/A II/B II/B II/A II/B II/B II/B II/B II/B

p53 expressio biopsia mûtét

-++ --+++ +++ ++ ++ ++ ++ +++ +++ ++ +++ ++ + +++ -

-+ -+++ +++ ++ + ++ + ++ ++ +++ +++ ++ +++ + + +++ -

Mdm2 expressio Biopsia mûtét

+++ +++ +++ +++ ++ ++ ++ + ++ +++ ++ ++ +++ +++ +++ +++ ++ ++ ++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ ++ _ ++ ++

++ +++ ++ +++ ++ ++ + ++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ ++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ ++ _ ++ ++

9. táblázat

51

Ki67

Respons

Túlélés (hónap)

n.é. n.é. 25 35-40 35-40 20 20-25 n.é. 10 alatt n.é. n.é. 20-25 n.é. n.é. n.é. n.é. 20 20 15-20 20 10 alatt 20 n.é. n.é. 20 10 n.é. n.é. 20 n.é. 35-40 n.é. 35-40 15-20 n.é. 10 alatt 20-25 n.é. n.é. 25-30 10 alatt 15

R NR NR NR NR IR NR R IR NR IR NR R R R NR IR IR NR R IR NR NR IR IR NR NR R NR NR NR R NR IR NR NR R NR IR NR IR IR

69 27 40 10 12 30 18 59 42 26 41 24 50 56 52 12 48 37 14 61 30 18 16 36 48 12 16 56 14 10 11 64 11 38 13 10 62 15 31 17 45 46

Megjegyzés

(meghalt) (meghalt) (meghalt)

(meghalt)

(meghalt)

(meghalt)

(meghalt) (meghalt)

(meghalt) (meghalt) (meghalt) (meghalt) (meghalt) (meghalt) (meghalt) (meghalt)

6

Pozitív p53 expresszió esetén rövidebb átlagos túlélési idõt észleltünk (10. táblázat). A fenti táblázatból látható, hogy mind a 28 p53 negativ beteg több mint 1 évet élt, és az átlagos túlélési idõ 3.3 év volt. Ez hosszabb, mint a p53 pozitív esetek átlagos túlélési ideje (+++ pozitiv eseteké 12 hónap, a ++ pozitiv eseteké 17 hónap). A p53 pozitiv eseteket összevonva az átlagos túlélési idõ 20 hó szemben a p53 negativ betegek 40 hónapos túlélési mutatójával. Öszefüggés észlelhetõ a p53 expresszió és a túlélés között (p= 0.02).

p53 expresszió a biopsziás

Átlagos túlélési idõ

A betegek száma (n)

anyagban +++

12 hónap (1.0 év)

6

++

17 hónap (1.3 év)

7

+

31 hónap (2.5 év)

1

-

40 hónap (3.3 év)

28

10. táblázat: A p53 expresszió és a túlélés közti összefüggés

6.3.3. Korreláció a p53 expresszió és a kemoterápiás érzékenység között

Az esetek (n=42) megoszlása a különbözõ csoportok között a köve (21) nem reagált, 29% (12) közepesen reagált és 21% (9) reagált. A 14 p53 pozitív beteg közül 13 (93%) nem reagált a kezelésre, és ezek között található az összes erõsen p53 pozitív eset. Ez felveti a p53 fokozott expresszió és a „kemoterápia-rezisztencia” közötti pozitív korrelációt. A 28 p53 negatív beteg közül 20 reagált a kezelésre (71%), míg 8 (28%) nem reagált. Azok a betegek, akiknél fokozott p53 expresszió mutatható ki nem reagálnak a kemoterápiára és az utánkövetés során a túlélési idejük is rövidebbnek bizonyult. A reagálók csoportjában az átlagos túlélési idõ 3.3 év volt. A közepesen reagálók csoportjában egy esetben észleltünk + pozitivitást mind a biopsziás ill.

52

mütététi anyagban, ennek a betegnek az átlagos túlélése is meghaladta az egy évet (p=0.03)

A betegek száma (n)

+++

6 (100%)

nem volt

nem volt

n=6

++

7 (100%)

nem volt

nem volt

n=7

+

Nem volt

1

nem volt

n=1

-

8 (28%)

11 (39%)

9 (32%)

n=28

11. táblázat: A kemoterápiára való reagálás

6.3.4. Az mdm2 expresszió és a kemoterápiára való reagálás közti összefüggés vizsgálata

A biopsziás mintákban 29 esetben észleltünk mdm2 pozitivitást. A statisztikai analízis miatt a +, ++ és +++ pozitív eseteket összevontuk (12. táblázat). Ezek közül 8 (28%) beteg nem reagált a kezelésre, míg 21 (72%) reagált. Az összes mdm2 negatív beteg 13 eset, a kemoterápiára érzéketlen csoportba tartozott.

kemoterápiára való reagálás

negativ

pozitiv

összes eset

)

13

8

21

Reagált (R) + közepesen reag. (IR)

0

21

21

Összes eset

13

29

12. táblázat: mdm2 expresszió változás a biopsziás anyagban 53

42

6.3.5. A Ki 67 proliferációs index meghatározása

A Ki67 a sejtciklusban lévõ sejteket jelöli. Ezzel egyértelmûen mutatja a proliferáló sejtek arányát a szöveten belül. Jelen vizsgálatunkban alkalmazott immunhisztokémiai módszer (dekalcinálási problémák miatt) a csonttumorok esetében nem mutatott megbízható eredményt (jóval gyengébb reakciót észleltünk, mint más daganatoknál), így a minták 43%-ában (18/42) a vizsgálat nem volt értékelhetõ. A hat +++ p53 mintából 4 esetben 35-45%-ban fokozott proliferációs indexet a hét ++ p53 pozitiv esetbõl 4 esetben 20-25% proliferaciós indexet észleltünk a biopsziás anyagban illetve a mûtéti mintákban is, ami arra enged következtetni, hogy a fokozott p53 expressióval összhangban, magasabb proliferációs indexet tapasztaltunk a kemoterápiára nem reagáló, rosszabb prognózisú daganatok esetében. A kevés értékelhetõ esetre való tekintettel (technikai nehézség miatt) statisztikailag szignifikáns következtetéséket levonni nem lehetett. A fenti vizsgálatokkal. A Ki-67 proliferációs aktivitás kimutatása immunhisztokémiai vizsgálattal (20.

54

20. ábra: Osteosarcoma Ki-67 proliferációs aktivitás kimutatása 200x nagyítás

6.3.6. A heterozigótaság elvesztésének vizsgálata A 15 vizsgált tumorból 6 (40%) mutatott allélvesztést a TP53 locusban, 4 (27%) a D17S579-re, 3 (20%) a D17S855-re, 2 (13%) mutatott a THRA 1-re. Minden minta legalább 1 markerre nézve informatív volt. A vizsgált esetek 53%-ában legalább egy locusban észleltünk allélvesztést a 17-es kromoszómán. A vizsgálat során a II/ betegek esetében nem észleltünk allélvesztést, míg a II/B (15/20)

stádiumú betegek

mindegyikénél kimutatható volt allélvesztés (21. ábra).

Tumor

LOH

55

21. ábra: Allélvesztés (LOH) kimutatása osteosarcomában 17-es kromoszómán

6.3.7. Megbeszélés

Mint korábban említettük, a vad típusú p53 nem mutatható ki rövid féléletideje miatt, de a mutáns p53-nak hosszabb a féléletideje, ami lehetõvé teszi immunhisztokémiai kimutatását. Ezért amikor a p53 fokozott expresszióját vizsgáljuk, valójában a vizsgáljuk. Míg a p53 expresszió rendellenességeit számos humán daganatban vizsgálták az osteosarcoma keletkezésében játszott szerepe viszonylag új kutatási terület (87, 97, 119). Kevés adat található a p53 és a gyógyszer rezisztencia összefüggésérõl az osteosarcomára vonatkozóan (8, 68, 154). Mielõtt következtetéseket vonnánk le a jelenlegi adatokból, más vizsgálatok következtetéseit ismertetjük a p53, a sarcomák és a gyógyszerrezisztencia

Genetikai tények határozottan arra utalnak, hogy a p53 gén homozigóta megváltozása fontos esemény az osteosarcoma kifejlõdésében (61, 87). A nem differenciált osteosarcomák c-myc amplifikációt, p53 és RG1 mutációt és autocrin növekedési faktortermelést mutatnak. Ezek közül a p53 hatból öt osteosarcoma sejtvonalban megváltozott (13). Radig és mtsai (119) 54 rezekált osteosarcomából 42-ben (68%) találtak p53 fehérje expressziót. Míg ezek az eredmények nem minden esetben mutattak korrelációt klinikopatológiai tulajdonsággal, a p53 fehérjék festõdési képe korrelált az aggresszív növekedéssel és a metasztázisképzõ potenciállal. A diffúzan festõdõ tumoroknak rosszabb volt a prognózisa, mint a fokálisan festõdõknek. Ezen kívül maximálisan fokozott expressziót találtak az S fázisban lévõ sejtekben, ami azt jelzi, hogy a p53 fehérje sejtmagban való akkumulációja potenciálisan felhasználható prognosztikai tényezõ az osteosarcomában. Wang és mtsai immuncytokémiai technikát alkalmaztak a p53 termék lokalizációjára humán lágyszöveti sarcomákban. Az eredmények azt mutatták, hogy a 66 tumorból 33% (22)

56

mutatott fokozott p53 expressziót. Erõs korrelációt találtak a növekvõ tumorstádium és a fokozott p53 expresszió között (165). Egy másik vizsgálatban az osteocalcin expressziót tanulmányozták vad típusú p53 gént tartalmazó sejtekben, valamint p53 – null vagy mutáns - sejtvonalakban. Osteocalcin expressziót csak az elsõ csoportban észleltek, az utóbbi kettõben nem, ami a p53 alapvetõ szerepét jelzi a differenciációban. A vad típusú p53 gén gátolta a tumor növekedést in vivo, viszont a mutáns p53-at tartalmazó tumorok két-háromszoros méretûre növekedtek azokhoz képest, amelyeknek nem volt p53 expressziója (34). A 17-es kromoszómán, különösen a 17p13 régióban bekövetkezõ allélvesztést az osteosarcomák több mint 75%-ánál észlelték, de nem találtak szignifikáns korrelációt a mutáns p53 expresszió és a kemoterápiára való reagálás között (61). Ez azonban egy egyszerû lehetõséget mutatott az osteosarcomának a reaktív csontlézióktól való megkülönböztetésére, amelyek ugyanis negatívak ebbõl a szempontból (61, 119). A csont – és a lágyszöveti sarcomákban lévõ DNS elváltozások egynegyede missense mutáció. Az ilyen típusú mutációval rendelkezõ összes tumor viszonylag erõs pozitív festõdést adott p53 fehérjére (26). Ezzel szemben egy minta kivételével nem észleltek immunreaktivitást a DNS elváltozások maradék háromnegyed részében (átrendezõdés, frame-shift mutáció, nonsense mutáció és mutáció a splicing helyen). Ez arra utal, hogy ezek a mutációk nem vezettek p53 fehérje expresszióhoz. A megvizsgált 67 osteosarcoma között 19 (28%) mutatott pozitív festõdést. Ezen kívül a p53 gén mutációi fõleg a magas fokozatú tumorokban (grade III) jelentkeztek ebben a vizsgálatban (26). Yoshimichi és mtsai a p53 génmutáció szerepét értékelték az osteosarcoma kifejlõdésében. A Pab240 monoklonális antitestet használták, amely csak a mutáns p53 formát ismeri fel. Az eredmények azt mutatták, hogy a 18 osteosarcoma 67%a Pab240-nel. Intenzív és diffúz pozitív reakciókat észleltek a tumorsejtek több mint 50%ában 6 betegnél (33%). A mutáns p53 fehérje expressziója itt sem korrelált egy klinikopatológiai tényezõvel sem. Ebben a vizsgálatban 17 osteosarcomából 7 reagált a preoperatív kemoterápiára. Azonban a mutáns p53 expressziója nem korrelált a neoadjuváns kemoterápiára való reagálási képességgel. Ezért arra a következtetésre jutottak, hogy az osteosarcoma prognózisa nem volt összefüggésben a p53fehérje expresszióval. Ezen vizsgálatokkal ellentétben azonban, Hornicek és mtsai, valamint Trieb és mtsai összefüggést találtak a p53 expresszió és a gyógyszerérzékenység között (68, 154). 57

A saját adatainkból azt a következtetést vonhatjuk le, hogy eredményeink egyeznek is és nem is a fenti következtetések némelyikével. Fokozott p53 fehérje expressziót észleltünk a kiindulási biopsziák 33%-ában és a preoperatív kemoterápia után 6-9 héttel elvégzett mûtétkor vett minták 38%-ban. A II/B stadiúmú tumorokban észleltünk (++, illetve +++) pozitiv p53 reakciókat, ez összefüggésre utal a stádium és a p53 expresszió intenzitása között, ami megerõsíti Wang és mtsai adatait. A p53 allélvesztés szintén összefüggött a stádiummal, mivel csak a II/B minták mutattak LOH-t. A többi fent említett vizsgálattal ellentétben a p53 pozitív (+++ és ++) expresszió rövidebb átlagos túlélési idõvel járt együtt, mint a p53 negatív eseteké. Továbbá a ++ pozitív eseteknek a túlélési ideje hosszabb volt, mint a +++ pozitív eseteké, és azoknak, akiknek a mintája kevésbé pozitívvá vagy negatívvá vált, még hosszabb lett a túlélési ideje. A csekély betegszám miatt nem lehetett statisztikailag szignifikáns következtetést levonni a + pozitív esetekbõl. Azonban az összes beteg, akinek valamilyen szintû p53 expressziója volt, a diagnózis idõpontjához számított 2.5 éven belül meghalt. Ezért a p53 expresszió jelzés értékû prognosztikai faktor lehet osteosarcomában. Végül az a tény, hogy a p53 pozitív esetek egyike sem reagált a preoperatív kemoterápiára,

felveti,

hogy

direkt

korreláció

lehet

a

p53

expresszió

és

a

gyógyszerrezisztencia között. Ezen kívül a biopsziák 67%-a, amely nem mutatott p53 expressziót, a reagáló vagy a közepesen reagáló kategóriába esett, ami a többséget jelenti. Ez a két csoport szintén valamivel magasabb túlélési idõt mutatott (2.5 és 3.3 év), mint a nem reagáló csoport (1 év). Továbbá, a neoadjuváns kemoterápia alatt megnövekedett p53 expresszió rosszabb prognózissal függött össze. A biopsziás mintában 29 esetben észleltünk mdm2 pozitivitást, ebbõl 21 (73%) reagált a kezelésre, míg ezen minták közül 28 p53 negatív, melybõl 20 (72%) volt kemoterápiaérzékeny daganat. Ezeknek a betegeknek az átlagos túlélési ideje is hosszabb volt. A Ki-67 a sejtciklusban lévõ sejteket jelöli. Ezzel egyértelmûen mutatja a proliferáló sejtek arányát a szöveten belül. Jelen vizsgálatunkban alkalmazott immunhisztokémiai módszer (decalcinálási problémák miatt) a csonttumorok esetében nem mutatott megbízható eredményt. Jóval gyengébb reakciót észleltünk, mint más daganatoknál, így a minták 43%ában a vizsgálat nem volt értékelhetõ. A Ki-67 proliferációs index azonban a bármilyen fokú p53 expressziót követõen 20% felett volt, ami arra enged következtetni, hogy a fokozott p53 expresszióval összhangban magasabb proliferációs indexet tapasztaltunk a kemoterápiára nem reagáló, rosszabb prognózisú daganatok esetében, azonban a kevés betegszámra való 58

tekintettel (decalcinálási nehézség miatt) statisztikailag szignifikáns következtetéséket levonni nem lehetett. A fenti vizsgálatokkal. Összefoglalva, az osteosarcomák erõsen malignus természetének és a gyógyszerrezisztencia gyakori elõfordulásának a fényében elmondhatjuk, hogy elõnyünkre szolgálhat, ha a p53-t, mint prognosztikai faktort alkalmazzuk a gyakorlatban is, a korábban alkalmazott prognosztikai faktorok kiegészitéseként. A p53 fehérje fokozott expressziója, más szavakkal, a mutáns p53 gén termékének a megjelenése ilyen prognosztikus faktor lehet. A magasabb rizikójú betegeknél a neoadjuváns kemoterápia módosítására, illetve a mûtét utáni kezelés változtatására hívja fel a figyelmet a hosszabb betegségmentes, illetve össztúlélés eredményeinek javítása érdekében. Az mdm2, bár a p53 negativ esetekben mdm2 pozitivitást észleltünk, ami funkcionális p53 károsodást eredményez (vagyis a p53 lebontását) mégis úgy találjuk, hogy a p53 vizsgálat mellett, mint prognosztikai faktor nem nyújt több információt a betegség lefolyására vonatkozóan, így rutinszerû klinikai alkalmazásához még további vizsgálatok elvégzése indokolt (62, 95, 104). A Ki-67 mint prognosztikai faktor gyakorlati használatának bizonyításához a csonttumorokban még további vizsgálatok szükségesek (134).

59

7.

ÚJ

GYÓGYSZERKOMBINÁCIÓ

ALKALMAZÁSÁNAK

VIZSGÁLATA

ELÕREHALADOTT LÁGYRÉSZSARCOMÁBAN

7.1.1. Bevezetés

Ennek értelmében mindazon szövet e csoportba tartozik, mely az emberi szervezet mozgásában, illetõleg bizonyos mértékig a különbözõ belsõ szervek védésében, illetve táplálásában vesz részt. E szövetek az emberi szervezet összsúlyának mintegy 50%alkotják, így elvben feltételezhetõ lenne, hogy a lágyrészekbõl kiinduló rosszindulatú daganatok száma meghaladja a hámeredetûekét, valójában azonban a malignus tumorok mindössze 1%-át képviselik. Gyermekkorban azonban gyakoribbak (7%). Prognózisuk rossz: a primer tumor eltávolítása után 30-60 %-ban jelentkezik helyi kiújulás, 40-60 %-ban távoli metasztázis az elsõ öt évben (99). A lágyrészsarcomák etiológiájában genetikai, környezeti – beleértve tényezõ egyaránt szerepel. - genetikai okok: von Recklinghausen-betegség ugyancsak támasztószöveti daganatok elõfordulásával járhat, fõként neurofibrosarcoma alakul ki (76); saját anyagunkban 3 esetben észleltünk Recklinghausen betegség talaján kialakult malignus lágyrésztumort, neurofiborsarcomát. Gardner-tünetegyüttesben fibrosarcoma

szenvedõ

keletkezhet.

betegeknél

Sclerosis

nem

tuberosa

egyszer

(Bourneville

alacsony

malignitású

betegség)

talaján

rhabdomyosarcoma léphet fel (159). - sugárkezelés: a korábban alkalmazott besugárzás és lágyrészsarcoma összefüggése eléggé egyértelmûen bizonyított, annak ellenére, hogy csak ritkán fordulnak elõ. Általában tíz évnél több latenciaidõ telik el a sugárkezelés és a tumor kialakulása között (79, 136). A krónikusan fennálló lymphoedema bilharziasisban vagy emlõrákban, a sugárkezelés talaján, ritkán lágyrészsarcoma (lymphangiosarcoma) alakulhat ki. A különbözõ vegyi anyagok (klórfenolok, fenoxiherbicidek, fakonzerváló anyagok, tetrahydrobenzo-dioxin) néhány esetben ugyancsak a lágyszövet rosszindulatú daganatainak kifejlõdéséhez vezethet (30, 99).

60

7.1.2. Elhelyezkedés

A lokalizációt tekintve a lágyrészsarcomák bárhol elõfordulhatnak, az esetek több mint fele a végtagokon (az alsóvégtagokon 43%, a felsõvégtagon 13%-ban), ezt követi a retroperitoneum 21%-kal, a törzsön 15%-ban, míg a fej-nyaki regióban 7 %, és az emlõben1%-ban észlelhetõ.

7.1.3. Patológia, gyakoriság

A benignus és malignus lágyrészdaganatok aránya 100:1-hez, de az ún. borderline tumorok elõfordulása sem ritka. A carcinomákkal szemben in situ sarcoma nem észlelhetõ, és szinte soha nem fordul elõ benignus tumor malignizálódása, egyetlen kivétel a neurofibromatosis talaján kialakuló neurofibrosarcoma. A sarcomák szövettani típusait a normális alapszövethez való hasonlóságuk alapján határozzák meg. Osztályozásuk a WHO-beosztás alapján célszerû; a teljesség igénye nélkül a leggyakrabban elõforduló lágyrészsarcomák szövettani megoszlása: rhabdomyosarcoma 1520%-ban, malignus fibrosus hystiocytoma 15-20%-ban, fibrosarcoma 15-19%-ban, liposarcoma 14-18%-ban, nem osztályozható sarcoma 15%-ban fordul elõ. Synoviosarcoma 5-10%, leiomyosarcoma 5-10%, malignus schwannoma 4-8%-os gyakorisággal észlelhetõ (30, 99).

7.1.4. A daganat terjedési irányai, tünetei, diagnózis

A sarcomák a tapintható tumoron túlmenõen az izmok és a fasciák mentén direkt módon terjedhetnek. csontban (synoviosarcoma, malignus paraganglioma, malignus haemangiopericytoma, PNET). A távoli áttétek kialakulása a diagnózis felállítását követõen általában két éven belül várható. Egyéb daganatokhoz képest ritkábban okoz nyirokcsomóáttétet, kivéve a

liposarcoma,

angiosarcoma, fibrosarcoma, malignus epitheloid schwannoma (47). Az egyes sarcomatípusoknak nincs jellemzõ klinikai tünete. A lágyrésztumorok sokáig tünetmentesek. A lokalizációtol függ, hogy a beteg mikor észleli tumorát. Így a 61

testfelülethez közeli daganatok már 0.5 cm-s, az izomállomány mélyén elhelyezkedõk általában néhány cm feletti nagyságban okoznak panaszokat, ha a tumor a környezetére nyomást gyakorol vagy a szomszédos szerveket dislokálja, így fájdalom, végtagduzzanat alakul ki az érintett regióban. A retroperitoneális elhelyezkedés leggyakoribb megnyilvánulási tünete a hasi fájdalom, mely az esetek egy részében inkább csak diszkomfortérzésbõl, majd a betegség elõrehaladottabb stádiumában kifejezett kompressziós fájdalomból áll. Neurológiai tünetegyüttesek kifejlõdése, mely az idegek kompressziójának következménye, a betegek 2030%-ban alakul ki. A mellkasi elhelyezkedésûek dyspnoét, illetve tracheakompressziót is okozhatnak.

diagnosztikus lehetõségei jelentõs mértékben javultak. A korábban alkalmazott angiográfia, ill. csontscan háttérbe szorult, a CT és az MRI vizsgálatok kerültek elõtérbe, melyekkel a daganat lokalizációjáról, terjedésérõl pontosabb információkhoz juthatunk (99, 172). A diagnózis felállításához az alábbi vizsgálatok elvégzése szükséges: anamnaesis, fizikális vizsgálat, képalkotó vizsgálatok a tumor regiójáról (CT, MRI), valamint stádiummeghatározó vizsgálatok a terápiás terv kialakításához (kétirányú mellkas rtg, illetve CT, hasi UH, csontscan). A diagnózis kulcsfontosságú eleme a biopszia, illetve az aspirációs citológia. A kiegészítõ vizsgálatokkal kombinált (citogenetika, immunhisztokémiai vizsgálatok, DNS meghatározás) aspirációs citológia alkalmas arra, hogy a lágyrésztumorok kb. egynegyedében szövettani értékû diagnózist adjon. Kevesebb szövõdménnyel jár, kisebb a tumorsejtszóródás veszélye, mint az incisionális biopsziánál, és hamarabb jutunk diagnózishoz (163). Speciális személyi és tárgyi feltételeket igényel. Tekintettel a sokrétû entitásra, differenciáldiagnosztikai nehézségekre, az esetek többségében a hagyományos biopszia, immunhisztokémia nem nélkülözhetõ.

7 - tumor differenciáltsági foka (grade 1-4) - resectiós vonal - tumor elhelyezkedése, valamint mérete - genetikai jellemzõk: fontosságuk egyre inkább elõtérbe kerül (a sejtmag DNS tartalmának meghatározása, a génexpressziók vizsgálata (22, 99, 116). 62

A fentiek alapján a várható élettartamra következtethetünk, hiszen az I. stádiumban a várható 5 éves túlélés 80%-os a II. stádiumban 70%, a III. stádiumban 45%, míg a IV. stádiumban 10%-os. A stádium és túlélés összefüggéseit jól mutatja az alábbi táblázat (13.

Stádiumbeosztás és túlélés:

Stadium

Grade

TNM

túlélés 2 éves

túlélés 5 éves

I A/B

G1

T1-2N0M0

90 %

80 %

II A/B

G2

T1-2N0M0

80 %

70 %

III A/B

G3-4

T1-2N0M0

65 %

45 %

25 %

10 %

T1-2N1M0

IV

G2-4

T1-2N0-1M1

13. táblázat (Forscher C.A. and Casciato D.A. Manual of Clinical Oncology 4th edition 2000)

63

7.2. Klinikai vizsgálat

7.2.1. A kezelés általános elvei:

A lágyrészsarcomák sikeres kezelése jelenleg még nem eléggé hatékony, lehetõségein múlik. A radikálisan operált betegek átlagos élettartama kb. 4 év lehet, míg az inkomplett operáción átesetteké csak kb. 2 évre tehetõ. A végtagi elhelyezkedésû lágyrészsarcomák kórlefolyása kedvezõbb, mint a retroperitonealis kiindulású daganatoké (46, 116). A stádiumtól, a szövettani malignitási foktól és a daganat lokalizációjától függõen a sebészi beavatkozást neoadjuváns, illetve adjuváns kemoradioterápiával célszerû kiegészíteni (22, 39, 67, 88). A relapszus kezelése hasonló az azonos kiterjedésû primer tumorokéhoz. Sugárkezelés: daganatok sugárkezelésére telekobalt vagy maximum 6 MV fotonenergia alkalmas, a hasüreg irradiálására nagy energiájú fotonbesugárzás javasolt. Preoperativ irradiatió javasolt, ha a daganat nem rezekálható, postoperativ irradiatió javasolható a tumorágyra T2, G2-nél nagyobb, illetve magasabb malignitású tumorok esetén (115, 146).

- neoadjuváns: a mûtét elõtti kezelés eredményességérõl jelenleg megoszlanak a vélemények, egyes irodalmi adatok e kezelési forma biztató eredményességérõl számolnak be; alkalmazhatják intraarteriálisan (141, 164), illetve szisztémásan (40, 58, 117). - adjuváns: ún. kuratív kezelésrõl is megoszlanak a vélemények. A nem kellõ radikalítással operált, G3- 4 szövettani malignitású, T2-nél nagyobb tumorok adjuváns kezelése (intraarteriálisan, vagy szisztémásan) postoperatív irradiátióval együtt alkalmazva javasolható (53, 54, 101, 135, 151). - palliatív kezelés: törekedni kell olyan kezelések kialakítására, melyek a betegek élettartamának minõségi meghosszabbítását eredményezik (133, 156, 157). A szisztémás kemoterápiát palliatív fájdalomcsillapító irradiatióval lehet kiegészíteni.

7.2.2. Gyógyszerhatékonyság lágyrészsarcoma kezelésében 64

Az irodalmi adatok alapján a lágyrészsarcomákkal szemben eddig kevés citosztatikum bizonyult hatásosnak. Az elmúlt húsz év során számos citosztatikumot alkalmaztak ebben a betegségcsoportban. A monoterápiában alkalmazott gyógyszerek közül az Etoposid 13-15%ban (122, 148), Dacarbazin 15-17%-ban (25, 59), míg a Cisplatin 23-25%-ban (24, 147) mutatkozott hatékonynak. A Carboplatin nem bizonyult a Cisplatinnál jobbnak (57), azonban elõrehaladott osteosarcomákban korábban Cisplatinnal elõkezelt betegek esetén kevesebb mellékhatással, jó hatásfokkal alkalmazható. A legtöbbet vizsgált, illetve leghatékonyabbnak bizonyult két citosztatikum a Doxorubicin, melyet monoterápiában alkalmazva (17, 100, 157) a remissziós ráta 25-30%-ra nõtt, valamint az Ifoszfamid, mely 28-30%-ban, bizonyult hatásosnak (21, 52, 105, 107, 149) (14. táblázat). A két leghatásosabbnak bizonyult gyógyszert emelkedõ dózisokban jutatták be az optimális terápiás dózis meghatározása céljából (33, 50, 105, 107, 108). Az utóbbi években az egyéb malignus daganatokban jó terápiás hatást mutató Docetaxel (158), illetve Paclitaxel (5), valamint Topotecan (20) a lágyrészsarcomában a hagyományos citosztatikumoknál kevésbé bizonyult hatékonynak. A liposzómális epirubicin, a Vinorelbine (45), Raltitrexid (14) a Gemcitabin (106) terápiás hatásának igazolására még további klinikai vizsgálatok elvégzése szükséges. Számos kombinációs kezeléssel próbálkoztak az elmúlt évtizedekben (38). Az 1980as években alkalmazták elõször a CYVADIC sémát (Cyclophophamid, Vincristine, Doxorubicin, Dacarbazin), mellyel kb. 30%-os remissziós rátát lehetett elérni (19). Ezt követte a különbözõ dózisokban, valamint idõintervallumokban (rövid néhány órás infúzió, 12 órás, illetve 24 órás infúzió) bejuttatott Doxorubicin + Ifoszfamid kombináció, csontvelõmûködést serkentõ kolóniastimuláló faktorokkal kiegészítve (40, 52, 108, 120, 150). Az elmúlt tíz évben a legnépszerûbb kombináció talán a MAID volt (Methotrexat, Doxorubicin, Ifoszfamid, Dacarbazin), melynek hatékonysága számos tanulmány szerint a 38-40%-ot is elérte (155), (15. táblázat). Kiterjedt kutatás folyik hatékonyabb kemoterápiás kombinációk kidolgozására. A világszerte alkalmazott számos mono-, valamint kombinált kemoterápia ellenére e betegség sikeres kezelése még nem megoldott. Vizsgálatunk során korábban e betegségben még nem alkalmazott gyógyszeres kombinációt alkalmaztunk: VIP sémát (Etoposid, Ifoszfamid, Cisplatin), melyben vizsgáltuk e gyógyszerekre adott válaszadási arányt, s a fellépõ mellékhatásokat. E kombináció tagjai 65

monoterápiában is eredményesek. Hatásmechanizmusukat tekintve az Ifoszfamid - mely monoterápiában az egyik leghatásosabb vegyület - az alkilezõszerek csoportjába tartozik. Randomizált vizsgálattal igazolták, hogy az Ifoszfamid eredményesebb a lágyrészsarcomában, mint e vegyületcsoport leggyakrabban alkalmazott képviselõje a Cyclophosphamid. Az Etoposid a topoizomerázgátló vegyûletek közé tartozik, a Cisplatin pedig a DNS-ben – interkalálás hatására – keresztkötéseket hoz létre. Az azonos támadáspont (DNS), de eltérõ hatásmechanizmus alapján alakítottuk ki e három gyógyszerbõl álló kombinációnkat.

Gyógyszerhatékonyság lágyrészsarcoma kezelésében

laszadási arány (%) PR + CR Doxorubicin

25-30 %

Ifoszfamid

28-30 %

Dacarbazin

15-17 %

Docetaxol

16-17 %

Nitrozourea

3-5 %

PR: parcialis remisszió CR: komplett remisszió

14. táblázat

Gyógyszerkombinációk

Válaszadási arány (%) PR + CR

CYVADIC/CYVADAC

30 %

EORTC

ADM + DTIC

32 %

ECOG

MAID

38 %

SWOG

ADM + Ifoszfamid + GMCSF

40 %

EORTC

EORTC: European Organisation of Resurch and Treatment of Cancer, ECOG: Eastern Cooperative Oncology Group, SWOG: South-West Oncology Group

15. táblázat

66

7.2.3. Beteganyag és módszer

A vizsgálatba, melyet 1990. január –1999. június között végeztünk 134 beteg került. A betegek szövettanilag igazolt, inoperábilis, metasztatikus vagy helyileg kiújult lágyrészsarcomában szenvedtek. A beválasztás elõfeltétele: 75 évnél fiatalabb életkor, mérhetõ elváltozás jelenléte, megfelelõ vese-májfunkciós értékek, valamint kielégítõ hematológiai status volt. 82 nõ (61%), 52 (39%) férfi vett részt a vizsgálatban. A betegek általános állapota a WHO skála szerint (0-2): 87% 0-1 csoport, 13% 2. csoport; az átlagéletkor 42 Valamennyi beteg IV. stádiumban volt. Az elõzetes kemoterápia kizáró okként szerepelt. A betegeket három csoportba soroltuk: 72 beteg (54%) metasztatikus, 38 (28%) helyileg kiújult, 24 (18%) inoperábilis volt. A primer tumor több mint 50%-ban a végtagokon alakult ki, 47 (35%) betegnél retroperitoneális kiindulású volt, míg 16 esetben (12%) a törzs egyéb részein helyezkedett el. Leggyakrabban, az esetek több mint egynegyedében malignus fibrosus hystiocytoma volt a primer daganat szövettana, majd gyakoriságban a fibrosarcoma és a rhabdomyosarcoma következett, míg synoviosarcoma 13%-ban, liposarcoma 12%-ban, és schwannoma 7%-ban fordult elõ. A jobb áttekinthetõség kedvéért a legfontosabb adatokat külön táblázatban foglaltuk össze (16. táblázat).

67

Betegszám (134)

%

Átlagéletkor (év) 42.4 (19-69) Nem Nõ

82

61

Férfi

52

39

Metasztatikus

72

54

Helyileg recidivált

38

28

Inoperábilis

24

18

Stádium IV

134

100

0

55

41

1

61

46

2

18

13

Felsõvégtag

42

32

Alsóvégtag

29

21

Törzs

16

12

Retroperitoneum

47

35

36

27

Általános állapot (ECOG)

Primer tumor elhelyezkedés szerint

Szövettani felosztás Malignus fibrosus hystiocytoma Fibrosarcoma

29

22

Rhabdomyosarcoma

19

14

Synoviosarcoma

18

13

Liposarcoma

16

12

Schwannoma

9

7

Differenciálatlan

7

5

68

A gyógyszereket perifériás vénán keresztül juttattuk be, egymástól független infúziókban, öt egymást követõ napon. Hidrálás céljából a szerek bejuttatása után 1000 ml fiziológiás sóoldat és 250 ml Mannisol infúziót adtunk. Az Ifoszfamid infúziót követõen azonnal, valamint 4 óra, illetve 8 óra múlva a bevitt Ifoszfamid dózisának 20%-ában uroprotektiv Uromitexant (Mesna) alkalmaztunk. A kemoterápiás ciklusokat 28 naponta ismételtük. A részletes kezelési sémát a 17. táblázatban ismertetjük.

Adagolás

Idõpont

Etoposid

100 mg/m2 /nap

1-5 nap

Cisplatin

20 mg/m2 /nap

1-5 nap

Ifosfamid

2000 mg/m2 /nap

1-2 nap

Mesna

400 mg/m2 egyszeri dózis 3x

1-2 nap

17. táblázat: Kezelési séma

A kiindulási vizsgálat a beteg anamnézisének felvételét, fizikális státuszának meghatározását az általános állapot megállapítását, illetve a tumor méretének és elhelyezkedésének (stádium) rögzítését foglalta magába. A kezelési ciklusok elõtt laboratóriumi vizsgálat (teljes vérkép, máj-, vesefunkciós, illetve vizeletvizsgálat), EKG történt. A kezelés 3. és 5. napján ismételt vizeletvizsgálatra, a vérkép ellenõrzésére a ciklust követõ 10. napon került sor. A kezelésre adott választ kéthavonta kiértékeltük, az elváltozás lokalizációja szerint CT, illetve MRI vizsgálat történt. Teljes remissziónak értékeltük (complete remission, CR) az állapotot, ha a betegség valamennyi tünete megszûnt, valamennyi lézió eltûnt, új elváltozás nem jelent meg. Részleges remissziónak neveztük (partial remission, PR): ha a mérhetõ elváltozásokban az átmérõk szorzatának összege, illetve az értékelhetõ elváltozások átmérõje legalább 25%-kal csökkent, és új elváltozás nem mutatkozott. Változatlan státuszról (no change, NC) akkor beszéltünk, ha a tumor nagyságának változása nem érte el a 25%-ot, sem 69

remisszió, sem progresszió nem volt kimutatható, s ha a betegség legalább két kemoterápiás ciklus után változatlan maradt. A progresszió (progressiv dissease, PD) kritériuma: a tumorátmérõ vagy átmérõk szorzatának legalább 25%-os növekedése a kiindulási értékhez viszonyítva, új elváltozás megjelenése, vagy a beteg állapotának gyors romlása, amennyiben az a tumoros betegséggel függ össze. A progresszió idejét a terápia elsõ napjától kezdve számítottuk. A kezelés hatásosságát, illetve a mellékhatást a WHO feltételei szerint értékeltük.

7.2.4. Eredmények

.0 hónap, míg a teljes remisszióba (CR) jutott betegeknél 4,1 hónap volt. Az összremisszió (remission duration: az objektív tumorregresszió észlelésétõl a progresszió kimutatásáig) átlagosan 4.8 (218) hónapig állt fenn. A tanulmány lezárásáig az átlagos túlélési idõ (overall survival: a kezelés kezdetétõl a beteg haláláig tart) 10 hónapnak bizonyult (4-30 hónap). A 18. táblázatban foglaltuk össze a kezelésre adott válaszadási arányt.

Betegszám

CR

PR

SD

PD

Metasztatikus

72 (54%)

8

29

28

9

Helyi recidiva

38 (28%)

4

10

18

5

Inoperabilis

24 (18%)

0

9

10

4

Összes

134 (100%)

56 (42%)

18(13%)

12 (9%)

48 (36%)

CR: teljes remiszió

SD: változatlan státusz

PR: részleges remisszió

PD: progresszió

18. táblázat: Kezelésre adott válaszadási arány

7.2.5. Mellékhatások 70

A Gastrointestinalis mellékhatás (mely az esetek túlnyomó többségében hányinger, hányás volt) a betegek mintegy felében volt tapasztalható, 72 beteg (54%) esetében. WHO 3. fokozatú leukopeniát 36 (27%), míg WHO 4. fokozatút 7 (5%) esetben észleltünk. WHO 3. fokozatú .5%) betegnél tapasztaltunk. Említésre méltó anémiát nem észleltünk, illetve urotoxicitást sem tapasztaltunk. A leggyakoribb mellékhatás az alopécia volt, mely 100%-ban alakult ki. A kezelés mellékhatásaként beteget nem veszítettünk el (lásd 19. táblázat).

Alopecia

100 %

Hányinger, hányás

54%

FVS szám

2.0x10 L

27%

FVS szám

0.5x10 L

5%

THR szám 25-49x10 L

1.5%

19. táblázat: A kezelést követõen fellépõ mellékhatások

7.2.6. Megbeszélés

A rendkívül heterogén szövettani entitású daganatok egységes kezelése jelentõs nehézségekbe ütközik. A kötõszöveti daganatok malignitási fokának, várható biológiai viselkedésének meghatározása sarkalatos pontja a kezelési terv megválasztásának. A patológiai, illetve képalkotó diagnosztikai eljárások fejlõdése ellenére a sebész, a patológus, a klinikai onkológus, valamint sugárterápeuta kollégák lágyrésztumoros betegeiknél gyakran szembesülnek az alábbi kérdésekkel: 1. Benignus vagy malignus a tumor? 2. Ha malignus, akkor alacsony, közepes vagy magas malignitású-e a folyamat? 3. Amennyiben közepes, ún. intermedier malignitású daganatról van szó; mi a valószínûsége a helyi kiújulásnak; a recidivák során a malignus transzformációnak, vagy távoli metasztazisok jelentkezésének intralézionális sebészi eljárásokat, vagy épben történõ

4. Elõrehaladott stádiumú daganatok esetén mennyire agresszív kezelés szükséges? 71

stádiummeghatározása, valamint - ugyanolyan lényeges módon - lehetõség nyílna olyan kezelési protokollok kidolgozására, amelyek biztosítják a helyi kiújulás és a szóródás

Az elõrehaladott lágyrészsarcomában szenvedõ betegek életkilátása a kellõ radikalitású mûtéti eljárások (beleértve a pulmonális metasztazektomiát, illetve a kialakuló lokális recidivák eltávolítását), valamint a kombinált kemo-, és sugárterápiás kezelések ellenére igen rossz (27, 39). Ezen betegek ötéves túlélése 10% körüli. Az áttéttel jelentkezõ betegek várható túlélése átlagosan 1.5 év. E csoportba tartozó betegek szoros obszervációja, a minél kevesebb mellékhatással járó, de mégis effektív terápia kiválasztása lényeges szempont (44, 101). Az eddigi irodalmi adatok alapján

a kezelés hatékonyságának

növelésére vezettük be a VIP kombinációt (Vepesid, Ifosfamid, Cisplatin), ismerve ezen gyógyszerek hatásmechanizmusát s tudva azt, hogy ezek a szerek monoterápiában alkalmazva

Vizsgálatunk eredménye alapján az összremissziós ráta (CR+PR) 45%-nak bizonyult, mely eléri az irodalomban ismeretes legjobb kombinációk hatásfokát (133, 155), s meghaladja a Magyarországon korábban e betegcsoportban alkalmazott szerek hatásosságát. A remisszió 4.6 hónapig állt fenn. Az átlagos túlélési idõ 10 hónapnak bizonyult (4-30). Az általunk alkalmazott kezeléssel az átlagos túlélési idõt meghosszabbítani nem tudtuk, azonban a remisszió idõtartama, ha nem is nevezhetõ hosszúnak, de ebben az idõszakban a kezelésre reagáló betegek életminõsége jelentõsen javult, ami ebben a betegcsoportban nagyon fontos. A betegek által vezetett életminõség kérdõívek szerint azon betegeknél, akiknél remissziót értünk el, általános állapotuk, közérzetük javult, fájdalomcsillapító gyógyszerigényük csökkent. A kezelések következtében fellépõ mellékhatások közepes súlyosságúaknak

Összefoglalva, megállapíthatjuk, hogy e három gyógyszert tartalmazó kombináció elõrehaladott lágyrészsarcomában szenvedõ betegeknél a korábban hazánkban alkalmazott kezeléseknél hatékonyabbnak bizonyult. A kezelés következtében kialakuló mellékhatások elfogadhatóak. A fenti kombinációt e betegcsoportban ilyen nagyszámú beteganyagon még nem vizsgálták. Vizsgálataink eredménye alapján a VIP kombinációt elõrehaladott lágyrészsarcomás betegeknél rutinszerûen alkalmazható kezelési formának véljük.

72

8. LEGFONTOSABB ÚJ MEGÁLLAPITÁSOK, ALKALMAZHATÓSÁGUK A GYAKORLATBAN

8.1.1. Osteosarcomás betegeinknél elvégzett prognosztikai faktorok vizsgálata alapján megállapítjuk: 1. Saját eredményeink szerint nincs különbség az egyes korcsoportok túlélése között. A 30 év feletti betegek túlélési esélyei megegyeznek a fiatalabb korcsoportokéval, ha megfelelõ protokoll szerinti kemoterápiában részesülnek

2. Vizsgálatunkban a betegek neme nem mutatott szignifikáns különbséget a túlélés

3. A tumor röntgenmegjelenési formája, valamint a patológiás törés jelenléte a diagnózis idején szintén nem mutatott mutatott összefüggést a túléléssel.

4. Az osteosarcoma lokalizációját, mint prognosztikai tényezõt vizsgálva, anyagunkban a törzstõl távoli (un. distális) elhelyezkedésû tumorok prognózisa egy- és többváltozós analízissel szignifikánsan jobbnak bizonyult.

5. A tumor térfogatát vizsgálva megállapítottuk, hogy a méret növekedésével egyenes arányban csökkent a túlélõ betegek aránya, de statisztikailag szignifikáns eltérést csak a 60 cm3 alatti és feletti csoportoknál tapasztaltunk. Többváltozós Cox-regressziós modellnél a térfogat figyelemfelkeltõ, mint prognosztikai faktor.

6. A szövettani alcsoportok és a túlélés között nem találtunk szignifikáns különbséget, azonban a 20%-ot meghaladó porcszövet jelenléte, mind az egy-mind a többváltozós túlélési analízisben prognosztikai faktorként jelentkezett.

7. Vizsgáltuk a preoperatív kemoterápiára bekövetkezõ tumornecrosis és a túlélés közötti összefüggést, melynek során a nekrózis foka (mint a kemoterápiás érzékenység fokmérõje) mind egyváltozós, illetve többváltozós statisztikai analízisben prognosztikai faktorként szerepel. 73

8. Szignifikáns különbséget találtunk a kezelésre jól reagáló és a többi (kezelésre kevésbé, ill. nem reagáló) osteosarcomás betegek túlélése között.

9. Az osteosarcoma Enneking szerinti sebészi stádiumai között meghatározóan nagy különbség van a túlélést illetõen. Míg a II/A és II/B stádiumok között nem észleltünk szignifikáns

10. A sebészi szél vizsgálata alapján a sebészi radikalitás és a helyi kiújulás, illetve az ötéves túlélés között szintén szoros az összefüggés.

11. Statisztikailag, helyes indikáció mellett a mûtéti megoldások (amputáció versus végtagmegtartó mûtét) és a túlélés között nincs szignifikáns különbség.

12. A lokális recidiva önmagában is meghatározó negatív prognosztikai tényezõnek bizonyult.

13. Vizsgálatunk során csak a II/B stádiumú tumorokban észleltünk immunhisztokémiával pozitiv (++, illetve +++) p53 reakciókat. Ez összefüggésre utal a stádium és a p53

14. Eredményeink alapján összefüggés igazolható a p53 expresszió és a túlélés között. Azoknak a betegeknek, akiknél (+++, ill. ++) pozitiv p53 expressziót találtunk a túlélési idejük rövidebb volt, mint a p53 negatív betegeké. Továbbá, a ++ pozitiv eseteknek a túlélési ideje valamivel hosszabbnak bizonyult, mint a +++ pozitív betegeké.

15. Összefüggés mutatkozott a p53 expresszió, valamint a kemoterápiás érzékenység és a túlélési idõ között. A p53 pozitiv esetek egyike sem reagált a preoperativ kemoterápiára és ezeknek a betegeknek jelentõsen rövidebb volt a túlélési idejük.

74

16. A p53 gén allélvesztésének vizsgálata során szintén azt tapasztaltuk, hogy az allél- vesztést csak a II/B stádiumú minták mutatták, míg a II/A stádiumú daganatokban nem tudtunk LOH-t kimutatni.

17. Vizsgálatainkban összefüggést találtunk az mdm2, illetve p53 expresszió változása között, mivel a p53 negatív esetekben mdm2 pozitivitást észleltünk. Az mdm2 pozitív esetek kemoterápiás érzékenysége, illetve túlélési ideje a p53 negativ esetekkel korrelált, azonban mint prognosztikai faktor jelen vizsgálatunkban a p53nál nem nyújtott több információt a betegség lefolyására vonatkozóan.

18. Vizsgálatunkban a Ki-67 proliferációs index azonban bármilyen fokú p53 expresszió mellett 20% felett volt. A p53 expresszióval összhangban magasabb proliferációs indexet tapasztaltunk a kemoterápiára nem reagáló rosszabb prognózisú daganatok esetében. Ennek alapján feltételezhetjük, hogy összefüggés van a daganat progressziója és a proliferációs index növekedése között, azonban munkánkban a kevés betegszámra való tekintettel (decalcinálási nehézség miatt) statisztikailag szignifikáns következtetéseket levonni nem lehetett.

Elõrehaladott lágyrészsarcoma kezelése során szerzett tapasztalaink alapján megállapithatjuk:

19. A

hatékonyság

növelése

reményében

korábban

még

nem

alkalmazott

új

gyógyszerkombinációt, VIP séma (Vepesid, Ifoszfamid, Cisplatin) vezettünk be, amely hatékonynak bizonyult, a remissziós ráta (CR+PR) magasabb volt, mint korábban e betegcsoportban Magyarországon alkalmazott kombinációk hatékonysága.

20. A kezelések következtében kialakult mellékhatások elfogadhatóak voltak, közepes súlyosságúaknak tekinthetõk.

21. Az általunk alkalmazott kezeléssel az átlagos túlélési idõt meghosszabbítani nem tudtuk, azonban a remisszió alatt a kezelésre reagáló betegek életminõsége jelentõsen javult, ami ebben a betegcsoportban lényeges szempont 75

8

1. Osteosarcomában a betegség várható prognózisának megítélését, s ennek megfelelõ kezelési stratégia megválasztását a hagyományos prognosztikai faktorok ismerete mellett segítik a tanulmányunkban vizsgált immunhisztokémiai ill. molekulárbiológiai vizsgálatok.

2. A prognózis ismeretében a magasabb rizikójú betegek kiválasztása, s neoadjuváns, illetve adjuváns kemoterápia módosítására, a mûtét idõpontjának megváltoztatására, valamint szorosabb obszervatióra hívja fel a figyelmet a hosszabb betegségmentes, valamint össztúlélés eredményeinek javítása érdekében.

3. A VIP kombinációt megfelelõ hatásossága, illetve a kezelések következtében kialakult elfogadható mellékhatások miatt az elõrehaladott lágyrészsarcomában a napi gyakorlatban

76

9. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Értekezésem végén szeretném kifejezni köszönetemet és hálámat mindazoknak, akik az eddig elvezetõ többéves munkámban önzetlen és pótolhatatlan segítséget nyújtottak:

-

programvezetõmnek, Dr. Jeney András egyetemi tanárnak;

-

témavezetõmnek, Dr. Kopper László egyetemi tanárnak a Semmelweis Egyetem I. Pathológiai és Kísérletes Rákkutató Intézet igazgatójának, irányító és támogató figyelmét, aki az értekezés elkészítésénél idõt nem kímélve segítségemre volt;

-

Dr. Szendrõi Miklós egyetemi tanárnak az Ortopédiai Klinika vezetõjének, akivel már több mint egy évtizedes közös klinikai munka is összeköt, és aki Ph számtalan jó tanáccsal, hasznos ötlettel, bátorító ösztönzéssel támogatta;

-

Dr. Eckhardt Sándor egyetemi tanárnak, aki megtanította az onkológia alapjait, s jelen munkámban is számos jó tanáccsal szolgált;

-

Dr. Szántó János egyetemi tanárnak, aki érdeklõdésemet a csont-, és lágyrésztumorok felé irányította;

-

Dr. Bodó Miklós valamint Dr. Oláh Edit egyetemi tánároknak, hogy munkámat laboratóriumukban lehetõvé tették;

-

Dr. Sápi Zoltán egyetemi docensnek, akinek folyamatos és önzetlen segítsége nélkül e munka nem lett volna elvégezhetõ s jelen értekezésben összefoglalható;

-

Dr. Kásler Miklósnak az Országos Onkológiai Intézet fõigazgatójának, és Dr. Láng István osztályvezetõ fõorvosnak, hogy munkámhoz a megfelelõ körülményeket biztosították;

-

köszönet illeti a közleményekben szereplõ minden társszerzõt és közvetlen munkatársaimat;

-

Gál Szabó Istvánné, Polgár Zoltánné, Bányik Lászlóné asszisztenseknek a szövettani

-

köszönettel tartozom Molnár Renátának és Chovanecz Balázsnak a dolgozat számítógépes szerkesztésében nyújtott nélkülözhetetlen segítségükért;

-

végezetül, de nem utolsó sorban köszönettel tartozom szüleimnek és lányomnak, akik mindig, mindenben feltétel nélkül támogattak.

77

10. IRODALOMJEGYZÉK: 1.

Aparacio J., Segura A., Montalar J. et al.: Long-term results after combined modality treatment for non-metastatic osteosarcoma. Med. Oncol. 16:255-260, 1999

2.

Bacci G., Briccoli A., Ferrari S. et al.: Neoadjuvant chemotherapy for osteosarcoma of the extremity: long term results of the Rizzoli’s 4th protocol. Eur. J. Cancer 37:20302039, 2001

3.

Bacci G., Picci P., Ferrari S., Orlandi M., Ruggieri P., Casadei R., Ferraro A., Biagini R., Battistini A.: Prognostic Significance of serum Alkaline phophatase Measurments in Patients with Osteosarcoma treated with Adjuvant or Neoadjuvant chemotherapy. Cancer 71:1224-1229, 1993

4.

Bacci G., Picci P., Ferrari S. et al.: Primary chemotherapy and delayed surgery for non-metastatic teleangiectatic osteosarcoma of the extremities. Results in 28 patients. Eur. J. Cancer 30: 620-626, 1994

5.

Balzerzak SP., Benedetti J., Weiss GR. et al.: A phase II trial of paclitaxel in patients with advanced soft tissue sarcomas. A Soutwest Oncology Group Study. Cancer 76:2248, 1995

6.

Barak Y., Juven T., Haffner R. et al.: Mdm2 expression is induced by wild type p53 activity. EMBO J. 12:461-468, 1993

7.

Benthien J. P., Fuhrmann R., Venbrocks R.: The operative managament of a malignant proximal humerus tumor represented by secondary Paget’s osteosarcoma. J. Cancer Res. Clin. Oncol. 124:270-274, 1998

8.

Bentzen SM.: Prognostic factor studies in oncology: osteosarcoma as a clinical example. Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 49:513-518, 2001

9.

Bertoni F., Bacchini P.: Classification of bone tumors. Eur. J. Radiol. 27 Suppl.1. S74-76, 1998

10.

Bielack S., Flege S., Kotz R. et al.: Is Limb-salvage for Osteosarcoma of the proximal Humerus a „SAFE” Procedure. Sarcoma 6: Suppl. 1, abs. 56. 2002

78

11.

Bielack S., Wulf B., Delling G. et al.: Osteosarcoma of the trunk by multimodal therapy: experience of the Cooperative Osteosarcoma study group (COSS). Med. Pediatr. Oncol. 24:6-12; 1985

12.

Bieling P, Rehan N, Winkler P. et al.: Tumor size and prognosis in aggressively treated osteosarcoma. J. Clin. Oncol. 14:848-858, 1996

13.

Blandino G., Levine A. J., Oren M. et al.: Mutant p53 gain of function: differential effects of different p53 mutants on resistance of cultured cells to chemotherapy. Oncogene 18: 477-485; 1999

14.

Blay JY., Judson I., Rodenhuis S. et al.: A phase II study of raltitrexed (Tomudex) as second or third line treatment for patients with advanced soft tissue sarcomas. Refractory to doxorubicn-containing regimens. Sarcoma 3:56; 1999

15.

BMDP Statistical Sotfware Inc.: BMDP statistical software manual. Los Angeles, CA: University of California, 1988.

16.

Bodey B., Taylor CR., Siegel SE., Kaiser HE.: Immunocytochemical observation of multidrug resistance (MDR) p170 glycoprotein expression in human osteosarcoma cells. The clinical significance of MDR protein overexpression. Anticancer Res. 15: 2461- 2468, 1995

17.

Borden EC., Amato DA., Edmonson JH. et al.: Randomized comparisen of doxorubicin and vindesin to doxorubicin for patients with metastaic soft tissue sarcomas. Cancer 66:862- 868, 1990

18.

Bosari S., Viale G., Bossi P. et al.: Cytoplasmic accumulation of p53 protein: an independent prognostic indicator in colorectal adenocarcinoma. J. Natl. Cancer 86:681-687, 1994

19.

Bramwell V., Rousse J., Stewrad W. et al.: Adjuvant CYVADIC chemotherapy for adult soft tisue sarcoma-reduced local recurrence but no improvement in survival: a study of the EORTC Soft Tissue and Bone Sarcoma Group J. Clin. Oncol. 12:11371142, 1994

20.

Bramwell VH., Eisenhauer EA., Blackstein M. et al.: Phase II study of topotecan (NSC 609699) in patients with recurrent or metastatic soft tissue sarcoma. Ann. Oncol. 6:847, 1995 79

21.

Bramwell VH., Mouridsen HT., Santoro A. et al.: Cyclophophamid versus ifosfamid: a randomized phase II. trial in adult soft tissue sarcomas. EORTC. Soft Tissue and Bone Sarcoma Group Cancer Chemother. Pharmacol. 31:Suppl.2 S180, 1993

22.

Brennen MF.: Staging of soft tissue sarcomas. Ann. Surg. Oncol. 6:8, 1999

23.

Briccoli A., Ferrari S., Picci P. et al.: Surgical treatment of pulmonary metastases of osteosarcoma. Apropos of 206 operated cases. Ann. Chir. 53:207-214, 1999

24.

Budd GT., Metch B., Balzcerzak SP. et al.: High-dose cisplatin for metastaic soft tissue sarcoma. Cancer 65:866, 1990

25.

Buesa JM., Mouridsen HT., van Oosterom AT. et al.: High-dose DTIC in advanced soft tissue sarcomas in the adult. A phase II study of the EORTC Soft Tissue and Bone sarcoma Group. Ann. Oncol. 2:307, 1991

26.

Bullock A. N., Henckel J., Fersht A. R. et al.: Quantitative analysis of residual folding and DNA binding in mutant p53 core doman: definition of mutant states for rescue in cancer therapy. Oncogene 19:1245-1256, 2000

27.

Casson AG., Putnam JB., Natarajan G. et al.: Effifacy of pulmonary metastasectomy for recurrent soft tissue sarcoma. J. Surg. Oncol. 47:1-4, 1991

28.

Cox D.R.: Regression models and life tables J.R. Stat. Soc. 34:187-220, 1972

29.

Dahlin DC: Pathology of osteosarcoma Clin. Orthop. 111:23-32, 1975.

30.

Das Gupta T. K., Chaudhuri P. K.: Tumors of the Soft Tissue, Ed.2. Appleton and Lange. 1998.

31.

Davies R.: Bildgebung beim primaren Osteosarkom (Imaging of primary osteosarcoma). Radiologe 38: 492-501, 1998

32.

Davis A.M., Bell R.S.: Prognostic factors in osteosarcoma: A critical review. J. Clin. Oncol. 12:423-431, 1994

33.

De Pas T, De Braud F., Comandone A. et al.: A twelve day’s prolonged infusion of ifosfamid combined with full dose Adriamycin in advanced soft tissue sarcomas. Proceedings of the American Society of Clinical Oncology p.542a Abstract 2092; Atlanta, Georgia, 1999

80

34.

Donehower LA, Bradley A.:The tumor supressor p53. Acta Biochim. Biophys. 1155:181-205, 1993

35.

Dorfmann H.D., Czerniak B.: Bone Tumors, Mosby 128-252, 1998

36.

Dorfmann H.D., Czerniak B.: Bone Cancers, Cancer 75:203-210, 1995

37.

Duffaud F., Digue L, Baciuchka-Palmaro M. et al.: Osteosarcomas of flat bones in adolescens and adults. Cancer 88:324-328, 2000

38.

Edmonson JH., Ryan LH., Blum RH. et al.: Randomized comparison of doxorubicin alone versus ifosfamid plus doxorubicin or mitomycin, doxorubicin and cisplatin against soft tissue sarcomas. J. Clin. Oncol. 11:1269-1275, 1993

39.

Edmonson JH., Petersen IA., Shives TC. et al.: Chemotherapy, irradiation, and surgery for function-preserving curative therapy of primary extremity soft tissue sarcomas: initial treatment with I-MAP+ GMCSF-preliminary report. Sarcoma 3:60 (abst.), 1999

40.

Eilber F. C. et al.: Pathologic Necrosis as a predictor of Recurrence and Survival after Neoadjuvant Therapy for High-Grade Extremity Soft Tissue Sarcomas. J. Clin. Oncol. 19:3203-3209, 2001

41.

El-Deirey W., Tokino T., Velculescu VE.: WAF1, a potencial mediator of p53 tumor supression. Cell 75: 817-825, 1993

42.

Enneking W.F., Spanier S.S., Goodman M.: Current concepts review: Surgical staging of musculosceletal sarcoma. J. Bone and Joint Surg. 62-A, 1027, 1980

43.

Enneking WF., Shirley PD.: Resection-arthrodesis for malignant and potencially malignant laesions about the knee using an intramedullary rod and local bone graft. J. Bone and Joint Surg. 59:223-226, 1977

44.

Esnaola NF., Rubin BP., Baldini EH., Vasudevan N., Demetri GD., Fletcher CD.: Sing. response to chemotherapy and predictors of survival in adult rhabdomyosarcoma. Ann. Surg. 234(2):215-230, 2001

45.

Fidia P., Demetri PD., Harmon DC. et al.: Navelbine shows activity in previously treated sarcoma patients: phase II. results from MGH/ Dana–Farber/Partners Cancer care Study. Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 17: abs. 1977; 1998

81

46.

Fleming J., Berman R., Cheng S. et al.: Long-therm outcome of patients with American joint Commitee on Cancer Stage II/B extremity soft tissue sarcomas. J. Clin. Oncol. 17:2772-2280, 1999

47.

Fong Y., Coit D., Woodruff J. et al.: Lymph node metastases from soft tissue sarcomas in adults. Analysis of data from a prospectiv database of 1772 sarcoma patients. Ann. Surg. 218:232, 1993

48.

Forscher C.A., Casciato D.A. Sarcomas, Manual of Clinical Oncology 4th edit. Lippincott Williams and Wilkins 349-362, 2000

49.

Francais KC., Worcester JN.: JR. Radical resection for tumors of the shoulder with preservation of a functional extremity. J. Bone and Joint Surg. Am. 44.1423-1430, 1962

50.

Frei E III., Elias A., Wheeler C. et al.: The relationship between high-dose treatment and combination therapy: the concept of summation dose intensity. Clin. Cancer Res. 4:2027-2032, 1998

51.

Friedmann MA., Carter SK.: The therapy of osteogenic sarcoma: current status and thoughts for the future. J. Surg. Oncol. 4:482-490, 1972

52.

Frustaci S., Comandone A., Bearz A. et al.: Efficacy and tolerability of an ifosfamid continuus infusion in soft tissue sarcoma patients. Proc. Am Soc. Clin. Oncol. 17: abs. 1993, 1998

53.

Frustaci S. et al.: Adjuvant Chemotherapy for Adult Soft Tissue Sarcomas of the extremity and Girdles. Results of the Italian Randomized Cooperative Trial. J. Clin. Oncol. 19:1238-1247, 2001

54.

Gherlinzoni SF., De Paoli A., Bunodonna A., Zmerly, Fiss S., Barbieri E. et al.: Maintence of efficacy of adjuvant chemotherapy (CT) in soft tissue sarcoma (STS) of the extremities: update of a randomized trial. Proceedings of the American Society of Clinical Oncology, Atlanta, Gerogia, p.546a abs. 2108, 1999

55.

Gilman PA., Wang N., Fan SF., Reede J., Khan A., Leventhal BG.: Familiar osteosarcoma associated with 13;14 chromosomal rearrangement. Cancer Genet. Cytol. 17:123-132, 1985

82

56.

Glasser D.B., Lane J.M., Huvos AG.: Survival, prognosis and therapeutic response in osteogenic sarcoma. Cancer 69: 698-708, 1982

57.

Goldstein D., Cheuvart B., Trump D., et al. Phase trial of Carboplatin in soft tissue sarcoma. Ann. J. Clin. Oncol. 13:420-430, 1990

58.

Gortzak E., Azzerelli A., Buese J., Bramwell VH., van Coevorden F., van Geel AN., Santoro A., Oosterhuis JW., van Glabbeke M., Kirkpatrick A., Verweij J.: The EORTC Soft Tissue Bone Sarcoma Group and National Cancer Institute of Canada Clinical trials Group/Canadian Sarcoma Group. Eur. J. Cancer 37:1096-1103, 2001

59.

Gottlieb JA., Benjamin RS., Baker LH. et al.: Role of DTIC (NSC-45388) in the chemotherapy of sarcomas. Cancer Treat. Rep. 60:190-195, 1976

60.

Grimer R.J., Carter S.R. Tillman R.M., Spooner T.D. et al.: Osteosarcoma of the pelvis the Journal of Bone and Joint Surgery. 81-B 796-802, 1999

61.

Grundmann E., Ueda Y., Schneider-Stock R., Roessner A.: New aspects of cell biology in osteosarcoma. Pathol. Res. Pract. 191:563-570, 1995

62.

Haines DS, Landers JE, Engle IJ. et al.: Physical and functional interaction between wild-type p53 and mdm2 proteins. Mol. Cell. Biol. 14:1170-1178, 1994

63.

Ham S.J., Schraffordt Koops H., van der Graff W.T.A. et al.: Histological, current and future aspects of osteosarcoma treatment. Ann. Chirurg. Gynecol. 88: 85-101, 1999

64.

Harris CC.: p53 at the crossroads of molecular carcinogenesis and risk assessment. Science 262: 1980-1981, 1993

65.

Hartmann A., Blaszyk H., Kovach J. et al.: The molecular epidemiology of p53 gene mutations in human breast cancer. Trends genet. 13: 27-33, 1997

66.

Hashimoto T. et al.: p53 null mutations undetected by immunohistochemical staining predict a poor outcome with early-stage non-small cell lung carcinomas. Cancer Res. 59: 5572-5577, 1999

67.

Hohenberger P., Reichradt P., Tilgner J., Kettelhack C., Schlag PM. Results of combined surgery and high-dose chemotherapy+G-CSF metastatic or locally advanced soft tissue sarcomas. Proceedings of the American Society of Clinical Oncology. Atlanta, Georgia p. 542 abs. 2095, 2001 83

68.

Hornicek F.J., Gebhardt M.C., Wolfe M.W., Kharrazi F.D., Tekeshita H., Parekh S.G., Zurakowski D., Mankin H.J.: P. Glycoprotein Levels Predict Poor Outcome in Patients With Osteosarcoma. Clinical Orthopaedics and related Research 373 1117, 2000

69.

Hovig E., Lothe R., Farrants G., Brogger A., Fodstad O., Borresen AL.: Chromosome 13 alterations in osteosarcoma cell lines derived from a patient with previous retinoblastoma, Cancer genet. cytogenet. 57:31-40, 1991

70.

Hunter T.: Breaking the cycle. Cell 75: 839-841, 1993

71.

Huvos AG., Rosen G., Marcove RC.: Primary osteogenic sarcoma: pathologic aspects in 20 patients after treatment with chemotherapy, en block resection, and prosthetic bone replacement. Arch. Pathol. Lab. Med. 101:14-18, 1977

72.

Iwasawa T., Tanaka Y., Aida N. et al.: Microscopic intraosseus extension of osteosarcoma: assesment on dynamic contrast enhanced MRI. Skeletal radiol. 26:214-220, 1997

73.

Jacquemier J., Moles JP., Penault–Llorca F. et al.: p53 immunohistochemical analysis in breast cancer with four monoclonal antibodies: comparison of staining and PCRSSCP results. Br. J. Cancer 69: 846-852, 1994

74.

Jaffe N., Frei E., Traggis D., Weekly high-dose methothrexate-citrovorum factor in osteogenic sarcoma. Presurgical treatment of primary tumor and over pulmonary metastases. Cancer 39:45-49, 1977

75.

Janeck CJ., Melson CL.: En block resection of scholder girdle: technique and indications. Report of a case J. of Bone and Joint Surg. Am. 54:1754-1758, 1972

76.

Jhanwar S., Chen Q Li F. et al.: Cytogenetic analisys of soft tissue sarcomas. Recurrent chromosome abnormalities in malignant peropherial nerve system tumors (MPNST). Cytogenet. 78:138-143, 1994

77.

Kandioler D., Kromer E., Tuchler H. et al: Long-term results after repeated surgical removal of pulmonary metastases. Ann. Thorac. Surg. 65:909-912, 1998

78.

Kaplan E. L., Meier P.: Non parametric estimation for incomplete observation. J. Am Stat. Assoc. 53: 547-481, 1958

84

79.

Karlsson P., Holmberg E., Samuelsson A. et al.: Soft tissue sarcoma after treatment for breast cancer A Swedish population-based study. Eur. J. Cancer 34:2068-2074, 1998

80.

Kawai A., Healey JH., Boland PJ. et al.: Prognostic factors for patients with sarcomas of the pelvic bones. Cancer 82:851-859, 1998

81.

Kawai A., Lin PP., Boland PJ. et al.: Relationship between magnitude of resection, complication, and prosthetic knee recontructions for distal femoral tumors. J. Surg. Oncol. 70:109-115, 1999

82.

Konishi E., Kusuzaki K., Murata H., Tsuchihashi Y., Beabout JW., Unni KK.: Extrasceletal osteosarcoma arising in myositis ossificans. Skeletal Radiol. 30:39-43; 2001

83.

Kopper L., Sebestyén A: p53 (egy molekula, mely „végigsöpört” a daganatkutatáson). 39: 159-164; 1995

84.

Kopper L., Marczek Z., Kovalek G.: Molekularis medicina. Medicina, Budapest, pp. 374; 1997

85.

Ladanyi M., Cha C., Lewis R. et al.: mdm2 gene Amplification in metastatic osteosarcoma. Cancer Res. 53: 16-18; 1993

86.

Lane DP: p53, the guardian of the genome. Nature (Lond), 358: 587-589; 1992

87.

Letson G.D., Muro-Cacho C.A.: Genetic and Molecular Abnormalities in Tumors of the Bone and Soft Tissues. Cancer 3: 239-249; 2001

88.

Levine EA., Trippon M., Das Gupta TK: Praeoperativ multimodality treatment of soft tissue sarcomas. Cancer 71:3685-3690; 1993

89.

Lin D., Shields MT.,Ullrich SJ. et al.: Growth arrest induced by wild-type p53 protein blocks cells prior to or near the restriction point in late G1 phase. Proc. Natl. Acad Sci USA 89, 9210-9214; 1992

90.

Livingstone LR., Ahite A., Sprouse J. et al.: Altered cell cycle arrest and gene amplification potential accompany loss of wild type p53. Cell 70: 923-935; 1992

85

91.

Longhi A., Fabbri N., Donati D. et al.: Neoadjuvant chemotherapy for patients with synchronous multifocal osteosarcoma: results in eleven cases. J. Chemotherapy 13:323-330; 2001

92.

Malawer.M.M., Link.M.P., Donaldson.S.S.: Sarcomas of Bone, Cancer Princeples and Practice of Oncology. W.W. Lippincott; 1891-1930; 2001

93.

Malawer MM., Dunham WF.: Skip metastases in osteosarcoma. Recent experience. J. Surg. Oncol. 22:236-240; 1983

94.

Manfrini M., Giacomini S., Campanacci D. et al.: Upper Limb Reconstruction in Bone Sarcomas of Childhood. Sarcoma A Multi-disciplinary J. suppl.1; 2002

95.

Meltzer PS.: Mdm2 and p53: a Question of Balance. J. Nat. Cancer Institut 86:1265-1266; 1994

96.

Meyers P.A., Heller G., Healey J.H. et al.: Osteogenic sarcoma with clinically detectable metastasis at initial presentation. J. Clin. Oncol. 11:449-453; 1993

97.

Molendini L., Benassi MS., Maganoli G. et al.: Prognostic significance of cyclin expression in human osteosarcoma. Int. J. Oncol. 12:1007-1011; 1998

98.

Murphay MD., Robbin MR., McRae GA., Flemming DJ., Temple HT., Kransdorf MJ.: The Many faces of osteosarcoma. Radiographics 17:1205-1231; 1997

99.

Murray F., Brennan Kaled M., Alektiar Robert G.: Sarcomas of the Soft Tissue and Bone, Cancer Principles and Practice of oncology J.B. Lippincott, Philadelphia. 18411884; 2001

100. Nielsen OS., Dombernowsky P., Mouridsen H. et al.: High-dose epirubucin is not an alternative to standard-dose doxorubicin in the treatment of advanced soft tissue sarcomas. A study of the EORTC. Soft tissue and Sarcoma Group. Br. J. Cancer 78:1634-1639; 1998 101. O’Byrne K., Stewrd WP.: The role of chemotherapy in the treatment of adult soft tissue sarcomas. Oncology (Huntingt) 56:13-23; 1999 102. Okada K., Kubota H., Ebina T., Kobayashi T., Abe E., Sato K.: High-grade surface osteosarcoma of the humerus. Skeletal radiol. 24:531-540; 1995

86

103. Oliner JD., Kinzler KW., Meltzer P. et al.: Amplification of a gene encoding a p53associated protein in human sarcomas. Nature 358: 80-83; 1992 104. Oliner JD., Pietenpol JA., Thiagalingam S. et al.: Oncoprotein mdm2 conceals the activation domain of tumor supressor p53. Nature 362: 857-860; 1993 105. Patel S., Benjamin R.: Ifosfamid in sarcoma. Is it a schedule-dependent drug? Cancer Invest. 14:290-291; 1996. 106. Patel SR., Jenkins J., Papadopoulos NE et al.: Preliminary results of a two-arm phase II trial of gemcitabin in patients with gastrointestinal leiomyosarcomas and other soft tissue sarcomas. Sarcoma 3: abs. 56.; 1999 107. Patel SR., Vadhan-Raj S., Papadopolous N. et al.: High-dose Ifosfamid in bone and soft tissue sarcomas: results of phase II and pilot studies-dose-response and schedule dependence. J. Clin. Oncol. 15:2378-2382; 1997 108. Patel SR., Vadhan-Raj S., Burgess MA. et al.: Results of two consecutive trials of dose intensive chemotherapy with doxorubicin and ifosfamid is highly active in patients with soft tissue sarcomas. Am. J. Clin. Oncol. 21:317-321; 1998 109. Petrilli A.S., Gentil F.C., Epelman S. et al.: Increased Survival, Limb preservation, and prognostic factors for osteosarcoma. Cancer 68: 733-737; 1991 110. Philip T., Blay JY., Brunat-Mentigny M. et al.: Standard, options and recommendations (SOR) for diagnosis, treatment and follow-up of osteosarcoma. Cancer 86:159-176; 1999 111. Philip T., Iliescu C., Demaille MC. et al.: High-dose methothrexate and HELP (Holoxan, eldesine, platinum)-doxorubicin in non-metastatic osteosarcoma of the extremity: a French multicentre pilot study. Ann. Oncol. 10:1065-1071; 1999 112. Piattelli A., Favia G.: Periosteal osteosarcoma of the jaws: report of 2 cases. J. periodontol. 71:325-329; 2000 113. Picci P., Bacci G., Campanacci M. et al.: Histological evaluation of necrosis in osteosarcoma induced by chemotherapy. Regional mapping of viable and non-viable tumor. Cancer 56:1515-1527; 1985

87

114. Picci P., Sangiorgi L., Bahamonde L. et al.: Risk factors for local recurrences after limb-salvage surgery for high-grade osteosarcoma of the extremities. Ann. Oncol. 8:899-903; 1997 115. Pisters P., Harrison L., Leung D. et al.: Long term results of a prospective randimized trial of adjuvant brachytherapy in soft tissue sarcoma. J. Clin. Oncol. 14:859-864; 1996 116. Pisters P., Leung D., Woodruff J. et al.: Analysis of prognostic factors in 1.041 patients with localized soft tissue sarcomas of the extremities. J. Clin. Oncol. 14:1679-1685; 1996 117. Pisters P., Harrison L. et al.: Praeoperative chemotherapy for Stage IIIB extremity soft tissue sarcoma: long term results from a single institution. J. Clin. Oncol. 15:37813786; 1997 118. Provisor A.J., Ettinger L.J., Nachmann J.B. et al.: Treatment of non-neoplastic osteosarcoma of the extremity with preoperative and postoperative chemotherapy: A report from the Children’s cancer group. J. Clin. Oncol. 15:76-84; 1997 119. Radig K., Schneider-Stock R, Haeckel C., Neumann W., Roessner A.: p53 gene mutations in osteosarcomas of low-grade malignancy. Hum. Pathol. 29: 1310-1316; 1998 120. Ray-Coquard I., Biron P., Blay JY: High-dose chemotherapy in soft tissue sarcomas of adults. Cancer 88:858-862; 2002 121. Reddick WE., Wang S., Xiong X. et al.: Dynamic magnetic resonance imaging of regional contrast access as an additional prognostic factor in pediatric osteosarcoma. Cancer 91: 2230-2237; 2001 122. Rose PG., Blessing JA., Soper JT. et al.: Prolonged oral etoposid in leiomyosarcoma of the uterus: a Gynecology Oncology Group Study. Gynecol. Oncol. 63:120-123; 1996 123. Rosen G., Nierenberg A.: Chemotherapy for osteogenic sarcoma: an investigative method, not a recipe. Cancer Treat. Rep. 66:1687-1692; 1982

88

124. Rosen G., Caparros B., Huvos AG. et al.: Praeoperative chemotherapy for osteogenic sarcoma. Selection of postoperative adjuvant chemotherapy based on the response of the primary tumor to praeoperative chemotherapy. Cancer 49:1221-1230; 1982 125. Rosen G., Marcove RC, Caparros B. et al.: Primary osteogenic sarcoma. The rationale for preoperative chemotherapy and delayd surgery. Cancer 43:2163-2177; 1979 126. Rosen G., Murphy ML, Huvos AG. et al.: Chemotherapy, en block resection and prosthetic replacement in the treatment of osteogenic sarcoma. Cancer 37:1-9; 1976 127. Rytting M., Pearson P., Raymond AK. et al.: Osteosarcoma in praeadolescent patients. Clin. Orthop. 39-50.; 2000 128. Saeter G., Alvegard T.A., Elomaa I. et al.: Treatment of osteosarcoma of the extremities with the T 10 protocol, with emphasis on the effects of praeoperative chemotherapy with single-agent high-dose methothrexate: a Scandinavian Sarcoma Group study. J. Clin. Oncol. 9:1766-1775.; 1990 129. Saeter G., Elomaa I., Wahlqvist Y. et al.: Prognostic factors in bone sarcomas. Acta Orthop. Scand. Suppl. 273:156-160; 1997 130. Salai M., Garniek A.: Magnetic resonance Guide (MRT) in Tumour Surgery-Our Preliminary Experience. Sarcoma Suppl. 1.; 2002 131. Salzer Kuntschik M.: ”Pitfalls” und typische Fehlinterpretationen bei Kochentumoren. Aus der Sicht langjahriger Konsiliartatigkeit. (Pitfalls and typical false interpretations in bone tumors. From the viewpoint of long-term consultation) Pathologe 17:1-5; 1996 132. Salzer-Kuntschik M., Delling G., Beron G. et al.: Morphological grades of regression in osteosarcoma after polychemotherapy – study COSS 80. J. Cancer re. Clin. Oncol. (Suppl.) 106, 21-24.; 1983 133. Santoro A., Tursz T., Mouridsen H. et al.: Doxorubicn versus CYVADIC versus doxorubicin pluss ifosfamid in first – line treatment of advanced soft tissues sarcomas. Randomized study of the European Organization for Research and Treatment of Cancer Soft Tisue and Bone Sarcoma Group. J. Clin. Oncol. 13:1537-1542; 1995 134. Scotlandi K., Massioma S. et al.: Clinical Relevance of Ki-67 Expression in Bone Tumors. Cancer 75:3-19; 1995

89

135. Sarcoma Meta-analysis Collaboration. Adjuvant chemotherapy for localised resectable soft-tissue sarcoma of adults: meta-analysis of individual data. Lancet 350:16471650.; 1997 136. Schwarz RE., Burt M.: Radiation-associated malignant tumors of the chest wall. Ann. Surg. Oncol. 3:387-392.; 1996 137. Simon M.A., Ashliman M.A., Thomas N. et al.: Limb-salvage treatment versus amputation for osteosarcoma of the distal end of the femur. J. of Bone and Joint Surg. 68-A: 1331-1337.; 1986 138. Singer S., Rubin B., Fletcher CDM., Baldini E., Demetri GD., Rhabdomyosarcoma (RMS) in adult. Size, location and response to chemotherapy predicts survival. Proceedings of the American Society of Clinical Oncology, Atlanta, Georgia, p.542a, abs. 2095; 1999 139. Sluga M., Windhager R., Lang S., Heinzl H., Bielack S., Kotz R.: Local and systemic control after ablative and limb sparing surgery in patients with osteosarcoma. Clin. Orthop. 120-127.; 1999 140. Souhami RL., Craft AW., van der Eijken JW. et al.: Randomised trial of two regimens of chemotherapy in operable osteosarcoma: a study of the european osteosarcoma Intergroup. Lancet 350:911-917; 1997 141. Soulen MC., Weissmann JR., Sullivan KL. et al.: Intraarterial chemotherapy with limbsparing resection of large soft tissue sarcomas of the extremities. J. Vasc. Interv. Radiol. 3:659-664; 1992 142. Soussi T., Dehouche K., Beraud C.: p53 websize and analysis of p53 gene mutations in human cancer: forging a link between epidemiology and carcinogenesis. Hum. Mutat. 15:105-113; 2000 143. Spina V., Montanari N., Romagnoli R.: Malignant tumors of the osteogenic matrix. Eur. J. Radiol. Suppl. 1. 98:109.; 1998 144. Springfield D.S., Schmidt R., Graham-Pole J. et al.: Surgical treatment for osteosarcoma. J. Bone Joint Surg. 70-A:1124-1130.; 1998

90

145. Srivastava S., Zou ZQ., Pirollo K., Blattner W., Chang EH.: Germline transmission of a mutated p53 gene in a cancer-prone family with Li-Fraumeni syndrome. Nature 348:747-749; 1990 146. Suit H., Spirio I.: Role of radiation in the managament of adult patients with sarcoma of soft tissue. Semin. Surg. Oncol. 10:347-350.; 1994 147. Thigpen JT., Blesing JA., Beecham J. et al.: Phase II trial of cisplatin as first-line chemotherapy in patients with advanced or recurrent uterine sarcomas: A Gynecologic Oncology Group study. J. Clin Oncol. 9:1962-1965.; 1990 148. Thigpen T., Blessing JA., Yordan E. et al.: Phase II trial of etoposide in leiomyosarcomas of the uterus: A Gynecologic Oncology Group Study. Gynec. Oncol. 63:120-124; 1996 149. Thor AD., Moore DH., Edgerton SM. et al.: Accumulation of p53 tumor supressor gene protein: an independent marker of prognosis in breast cancers. J. Natl. Cancer Inst. 84:845-855; 1992 150. Tichler T., Ghodsizade E., Brenner H. et al.: Failure of continuous infusion high-dose ifosfamide as second line treatment for sarcomas: poor response rate and unacceptable renal ans CNS toxicity. Proceedings of the American Society of Clinical Oncology, Atlanta, Georgia, p.544a, abs. 2120; 1999 151. Tieney JF., Mosseri V., Stewart LA. et al.: Adjuvant chemotherapy for soft tisue sarcoma: review and meta-analisys of the published results of randomised clinical trials. Br. J. Cancer 72:469-474.; 1995 152. Tierney JF.: Adjuvant chemotherapy for localised resectable soft-tisue sarcoma of adults: Meta-analysis of individual data. Lancet 350:1647-1654; 1997 153. Tomizawa Y et al.: Correlation between the status of the p53 gene and survival in patients with stage I non-small cell lung carcinoma. Oncogene 18: 1007-1014; 1999 154. Trieb K, Kotz R.: Proteins expresessed in osteosarcoma and serum levels as prognostic factors. Int. J. Biochem Cell Biol. 33:11-17; 2001 155. Vadhan-Raj S., Patel S., Burgess M. et al.: Phase II. trial of Adriamycin (A), Ifosfamid (I), Mesna (M) (Uroprotection), Dacarbazin (D), MAID with (GM-CSF/IL-3 Fusion

91

Protein) or G-CSF in patients with soft tissue sarcoma. Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 15:525, abs.1024; 1996 156. Van Glabbeke M., Donato di Paolo E., Mouridsen H. et al.: Response to anthracyclin – based chemotherapy (ABC) and overall survival of patients (PTS) with lung metastases from soft tissue sarcoma (STS): retrospektiv study of the EORTC Soft Tissue and Sarcoma Group. Proceedings of the American Society of Clinical Oncology, Atlanta, Georgia, p.542a, abs. 2093; 1999 157. Van Glabbeke M., van Oosterom AT., Oosterhuis JW. et al.: Prognostic factors for the outcome of chemotherapy in advanced soft tissue sarcomas: an analysis of 2.185 patients treated with anthracycline containing first-line regimens – an European Organization for Research and Treatment of Cancer Soft tissue and Bone Sarcoma Group. J. Clin. Oncol. 17:150-156.; 1999 158. Van Hoesel QG.,Verweij J., Catimel G. et al.: Phase II study with docetaxel (Taxotere) in advanced soft tissue sarcomas of the adult. EORTC Soft Tissue and Bone Sarcoma Group. Ann. Oncol. 5:539-542; 1994 159. Van Slegtenhorst M., de Hooght R., Hermans C. et al.: Identification of the tuberous sclerosis gene TSCI on chromosome 9q34. Science 277:805-807.; 1997 160. Varley J.M. et al.: Characterization of germline Tp53 splicing mutations and their genetic and functional analysis. Oncogene 20:2647-2654; 1999 161. Vogelstein B., Kinzler K.W.: p53 Function and Disfunction. Cell 70: 523-6, 1992 162. Vousden K.H.: p53 death star. Cell 103, 307-310; 2000 163. Wakely P.E., Kneisl J.S.: Soft tissue Aspiration Cytopathology Diagnostic Accuracy and Limitations. Cancer Cytopathology 90:292-298.; 2000 164. Wanebo HJ., Temple WJ., Popp MB. et al.: Preoperative regional chemotherapy for extremity sarcoma. A tricenter update. Cancer 75:2299-2304; 1995 165. Wang J., Coltrera MD., Gown AM.: Abnormalities of p53 and p110RB tumor suppressor gene expression in human soft tissue tumors: correlations with cell proliferation and tumor grade. Mod. Pathol. 8:837-842; 1995

92

166. Winkler K., Beieling P., Bielack S. et al.: Local control and survival from the Cooperative osteosarcoma Study Group Studies of the German Society of pediatric Oncology and Vienna Bone Tumor Registery. Clin. Orthop. 270: 79-86; 1991 167. Winkler K., Beron G., Delling G. et al.: Neoadjuvant chemotherapy in osteosarcoma: results of a randomized cooperative trial (COSS 82) with salvage chemotherapy based on histological tumor response. J. Clin. Oncol. 6:329-334; 1988 168. Winkler K., Bielack S., Delling G. et al.: Treatment of osteosarcoma: experience of the Cooperative osteosarcoma Study Group (COSS). Cancer Treat. Res. 62:269-277; 1993 169. Winkler K., Beron G., Kotz R. et al.: Neoadjuvant chemotherapy for osteosarcoma. Results of a cooperative German/Austrian study. J. Clin. Oncol. 2:617-620.; 1984 170. Wong K.B. et al.: Hot-spot mutants of p53 core domain evince charasteristic local structural changes. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 96: 8438-8442; 1999 171. Wuismann P., Enneking W.F., Roesner A.: Local growth and the prognosis of osteosarcoma. Internat. Orthopaedics. 16, 55-58.; 1992 172. Wyttenbach R., Vock P., Tschappeller H.: Cross sectional imaging with CT and/or MRI of pediatric chest tumors. Eur. Radiol. 8:1040-1046.; 1998

93