NEMI KÜLÖNBSÉGEK ÉS GENETIKAI FAKTOROK SZEREPE A VESE ISZKÉMIÁS/REPERFÚZIÓS KÁROSODÁSÁBAN Dr. Fekete Andrea Doktori (PhD) értekezés Budapest, 2003 Témavezeto: Prof. Reusz György és Dr. Szabó Attila Készült a Semmelweis Egyetem Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola „Krónikus betegségek gyermekkori prevenciója“ címu PhD programjának keretében Programvezeto: Prof. Tulassay Tivadar
Opponensek: Prof. Balla József Dr. Langer Róbert
Szigorlati bizottság: Prof. Fekete György Dr. Szabó László Dr. Wagner László
1
TARTALOMJEGYZÉK 1. ÖSSZEFOGLALÁS
4
2. SUMMARY
5
3. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE
6
4. BEVEZETÉS
8
5. ELMÉLETI ÁTTEKINTÉS 5.1. Az iszkémiás/reperfúziós (I/R) károsodás okozta akut veseelégtelenség (ARF) 5.1.1. Az ARF definíciója, kóroki tényezoi, klinikai képe 5.1.2. Az I/R károsodás okozta ARF patomechanizmusa 5.1.3. Nemi különbségek az I/R károsodásban
10 11 11
5.2. 5.2.1. 5.2.2. 5.3.1.
A Na+/K+ ATPáz (NKA) szerepe az I/R károsodás okozta ARF során A NKA biokémiai jellemzoi, muködése A NKA muködésének változása renális I/R károsodás során Nemi hormonok hatása a NKA muködésére
12 13 17
5.3. 5.3.1. 5.3.2. 5.3.3.
A hosokk protein (HSP) 72 szerepe a renális I/R károsodásban A HSPk jellemzoi, feladatuk, szabályozásuk A HSP72 és a renális I/R károsodás Nemi hormonok és a HSP72
19 21 23
5.4.
A HSP70 család genetikai polimorfizmusai
24
6. CÉLKITUZÉSEK
26
7. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 7.1. In vivo vese I/R patkánymodell, vizsgálati csoportok 7.2. Hemodinamikai vizsgálatok 7.3. Hisztológiai vizsgálatok 7.4. Szérum kreatinin, karbamid nitrogén (BUN), nátrium és kálium mérése 7.5. RT-PCR vizsgálatok 7.6. Western blotting 7.7. Enzimaktivitás mérés kapcsolt reakcióval 7.8. PCR-RFLP vizsgálatok 7.9. Statisztikai kiértékelés
27 29 30 30 31 33 35 36 37
8. EREDMÉNYEK 8.1. Nemi különbségek a vese érzékenységében renális I/R károsodást követoen 8.1.1. Hím és nostény ivarérett, ivaréretlen, kasztrált és hormonszubsztitúcióban részesült állatok túlélésének vizsgálata 8.1.2. Hím és nostény ivarérett állatok hemodinamikai paramétereinek változása 8.1.3. Hím és nostény ivarérett állatok veséinek hisztológiai analízise 8.2.
Nemi különbségek a szérum kreatinin, BUN, nátrium és kálium értékekben renális I/R károsodást követoen
8.3 Nemi különbségek a NKA muködésében renális I/R károsodást követoen 8.3.1. Nemi különbségek a hisztológiai károsodásban 8.3.2. Nemi különbségek a NKA ? ? ?és ß1 alegységének mRNS expressziójában
2
39 39 41 43 45
47 49
8.3.3. Nemi különbségek a NKA ? ? ? alegységének fehérje expressziójában és lokalizációjában 8.3.4. Nemi különbségek a NKA ??? alegységének fehérje expressziójában és lokalizációjában 8.3.5. Nemi különbségek a NKA enzimaktivitásában 8.4. Nemi különbségek a HSP72 expressziójában renális I/R károsodást követoen 8.4.1. Nemi különbségek a HSP72 mRNS expressziójában 8.4.2. Nemi különbségek a HSP72 fehérje expressziójában A HSP70 genetikai polimorfizmusok szerepe ARF-ben szenvedo kis súlyú (VLBW) koraszülöttekben 8.5.1. A HSP72 A(1267)G és HSP73 G(190)C polimorfizmusok gyakorisága VLBW koraszülöttekben 8.5.2. Koraszülöttségre hajlamosító rizikófaktorok és a HSP70 polimorfizmusok összefüggései
51 54 56 58 59
8.5.
9. EREDMÉNYEK MEGBESZÉLÉSE, KÖVETKEZTETÉSEK 9.1. Nemi különbségek a túlélésben és a vese érzékenységében renális I/R károsodást követoen 9.2. Nemi különbségek a NKA muködésében renális I/R károsodást követoen 9.3. Nemi különbségek a HSP72 expressziójában renális I/R károsodást követoen 9.4. A HSP70 genetikai polimorfizmusok szerepe akut veseelégtelenségben
61 62
64 66 70 72
10. EREDMÉNYEK ÖSSZEFOGLALÁSA
74
11. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS
76
12. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK BIBLIOGRÁFIAI ADATAI
77
13. IRODALOMJEGYZÉK
79
3
1. ÖSSZEFOGLALÁS Nemi különbségek és genetikai faktorok szerepe a vese iszkémiás/reperfúziós károsodásában Dr. Fekete Andrea Témavezeto: Prof. Dr. Reusz György és Dr. Szabó Attila Semmelweis Egyetem Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola, Budapest, 2003 A vese iszkémiás/reperfúziós (I/R) károsodása miatt kialakuló akut veseelégtelenség (ARF) számos klinikai kórkép gyakori szövodménye. Vizsgálataink célja állatkísérletes és humán vizsgálatok segítségével olyan új patomechanizmusok és genetikai háttér feltérképezése, mely segítséget nyújthat az ARF progressziójának elorejelzésében és a hatékony kezelés megtervezésében. Jól ismert, hogy nemi különbség mutatható ki az agy, a szív, vagy a bél iszkémiás érzékenységében, míg a nem és a nemi hormonok szerepe a vese I/R károsodásában mindeddig tisztázatlan volt. Vizsgálataink során igazoltuk, hogy hím állatokban a renális iszkémiát súlyosabb vesekárosodás és nagyobb mortalitás követi. Az I/R károsodást kíséro változások során a proximális tubulus sejtek elvesztik polaritásukat, ami párhuzamosan a hipoxia okozta ATP deplécióval, a Na+/K+ ATPáz (NKA) csökkent muködését eredményezi. A folyamat következtében a sejtekben intracelluláris ödéma alakul ki, ami tovább rontja a szöveti oxigenizációt. Kísérleteink során kimutattuk, hogy I/R károsodást követoen nostényekben a NKA expressziója, lokalizációja és az enzim aktivitása nem változik, míg hímekben jelentos csökkenés, valamint az enzim transzlokálódása tapasztalható. Az I/R károsodás során hímekben a NKA eredeti helyérol a citoszólba kerül ki, ezzel károsodik az enzim muködése. Elozetes vizsgálatok szerint a ho sokk fehérje 72 (HSP72) segít a sejtmembrán integrációjának megorzése révén az ionpumpa funkciójának fenntartásában. Kimutattuk, hogy nostény állatokban az iszkémiát követoen nagyobb mértéku és gyorsabb HSP72 expresszió figyelheto meg, ami hozzájárulhat a NKA muködésének stabilizálásához. Eredményeink azt bizonyítják, hogy a nostény állatok kevésbé érzékenyek a renális I/R károsodással szemben, renális hemodinamikájuk és a vese szöveti szerkezete kevésbé károsodik, mint hímek esetében, továbbá felvetik, hogy a hímek és nostények iszkémiás ARFjének kezelése a jövoben más-más stratégiát igényel. A hormonális és környezeti hatások mellett a vesebetegségek kialakulásában különbözo genetikai polimorfizmusok szerepe is feltételezheto. Humán vizsgálataink során igazoltuk, hogy a csökkent HSP72 mRNS szinttel járó (1267)GG homozigócia koraszülöttekben a hipoxiás károsodással szembeni csökkent védekezoképességgel jár, és más rizikófaktoroktól függetlenül hajlamosít ARF kialakulására. Kimutattuk továbbá, hogy a GG homozigócia gyakrabban fordul elo koraszülöttekben, mint az egészséges populációban, ami a HSP72 genetikai polimorfizmusok szerepét valószínusíti más hipoxiás károsodások során is.
4
2. SUMMARY The role of gender differences and genetic factors in renal ischemia/reperfusion injury Dr. Andrea Fekete Tutor: Prof. Dr. György Reusz and Dr. Attila Szabó Semmelweis University PhD School, Budapest, 2003 Renal ischemia/reperfusion (IR) injury is a well-known feature of several clinically relevant diseases. It remains a leading cause of acute renal failure (ARF) and despite recent progress in treatment the associated mortality still remains over 50-70%. The aim of our study was to reveal unknown pathomechanisms and genetic background that could be helpful in determining the prognosis of ARF and in the invention of new therapeutic strategies, through animal experiments and human observations. While gender disparity in the susceptibility to ischemia exists in several organs (heart, brain, intestine), there is less known about sexual differences in postischemic kidneys. In our experiments we showed that renal I/R injury is associated with significantly higher mortality rates and worse renal hemodynamic parameters in male rats than in females. Due to I/R injury proximal tubular cells loose their polarity, ATP depletion occurs and these phenomenons lead to the inhibition of renal Na+/K+ ATPase (NKA). This results in impaired ion homeostasis and intracellular edema, which further aggravate renal tissue oxigenisation. We showed that NKA?? 1 subunit mRNA and protein expression and enzyme activity do not change in female rats, while in males all these parameters significantly decrease, which could be additional factors of the worse renal recovery seen after postischemic ARF. In males renal ischemia is associated with a time-dependent redistribution of NKA from the basolateral into the apical membrane of the proximal tubular cells, which causes a temporary inactivation of NKA. Heat stress protein 72 (HSP72) through limiting membrane injury helps to preserve physiological function of NKA. We found that females have higher mRNA and protein levels of HSP72, which might help membrane-reintegration and thereby might ameliorate NKA stabilization, while in males due to lower HSP72 levels this phenomenon is not so relevant. Summarizing our animal experiments, we can conclude that following I/R injury female rats have better survival rates, more stable renal function and renal structure representing lower renal susceptibility, than males. This raises the question whether ischemic renal diseases in men and women futurely need to be differently treated. Besides hormonal factors, genetic polymorphisms were also suggested to influence the production of HSP70s. Our results indicate that the risk of ARF is increased in pre-term neonates carrying HSP72 (1267) GG genetic variation independently of the presence of other risk factors. However, HSP72 (1267) GG genotype, which is associated with low HSP72 inducibility, is also more prevalent in pre-term population than in healthy controls, which could raise further questions about the clinical relevance of HSP polymorphisms in hypoxic diseases.
5
3. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE
ADP – adenozin-difoszfát ARF - akut veseelégtelenség ATP - adenozin-trifoszfát BSA – bovine serum albumine BUN- karbamid nitrogén cDNS – komplementer dezoxiribonukleinsav CN- szérum kreatinin CO - verotérfogatot dNTP – dezoxi- nukleozid-trifoszfát EBV- Epstein-Barr vírus ECL - felerosített kemolumineszcencia (enhanced chemoluminescence) ESRD – végállapotú veseelégtelenség GAPDH - glicerin-aldehid-3 foszfát-dehidrogenáz GFR- glomeruláris filtrációs ráta H–hím HR – szívfrekvencia HSP- ho sokk fehérje I/R- iszkémia/reperfúzió Ig – immunglobulin IRDS – infant respiratorikus disztressz szindróma MAP - artériás középnyomás MHC - fo hisztokompatibilitási komplex MRNS - messenger (hírvivo) ribonukleinsav N - nostény NADH – nikotin-amid-dehidrogenáz NCBI - National Center for Biotechnology Information NEC - nekrotizáló enterocolitis NKA - Na+/K + ATPáz NO – nitrogén- monoxid
6
PBS - foszfát puffer (phosphate buffer salinated) PDA – patent ductus arteriosus PEL – pellet PMSF - fenil- metil-szulfonil fluorid RBF- renális véráramlás RFLP - restrikciós fragment hossz polimorfizmus RT-PCR - reverz transzkriptáz polimeráz láncreakció RVR - renális vaszkuláris rezisztencia SDS - nátrium-dodecil szulfát SLE - szisztémás lupus erythrematosus SUP – szupernatáns TNF - tumor nekrózis faktor TOT- total tissue homogenate (teljes szövethomogenizátum) TRIS-HCl - trisz-(hidroxi- metil)-amino- metán hidroklorid TVR - teljes érellenállás VLBW – very low birth weight (igen kis születési súly)
7
4. BEVEZETÉS
Az
intenzív
betegellátásban
bekövetkezett
fejlodés
ellenére
az
akut
veseelégtelenség (ARF) kialakulása továbbra is komoly klinikai problémát jelent. A betegség mortalitása az utóbbi évtizedekben számottevoen nem csökkent, jelenleg is eléri az 50-70%-ot [92, 87] és kezelése mindmáig nem megoldott. Az ARF legfontosabb és leggyakoribb oka az iszkémiás/reperfúziós (I/R) károsodás [44], mely elsosorban nagy mutétek, szisztémás hipotenzióval járó állapotok (égés, hipovolémia, újraélesztés, stb.) kapcsán alakul ki, illetve a vesetranszplantáció elkerülhetetlen velejárója [91]. Az utóbbi évek kutatásai igazolták, hogy az iszkémiás vesekárosodás az egyik leglényegesebb rizikófaktora a krónikus allograft nefropátia kialakulásának is [100]. Hasonlóan az iszkémiás akut veseelégtelenséghez, a krónikus allograft nefropátia kezelésében sem értek el számottevo eredményt. Jól ismert tény, hogy nemi különbség mutatható ki számos vesebetegség (végállapotú
veseelégtelenség,
IgA
nefropátia,
membranózus
nefropátia,
stb.)
kialakulásában és progressziójában [83]. Ismert továbbá, hogy számos szerv hipoxiás károsodása során, így miokardiális ischémiában [61], a splanchnikus területet ért iszkémiás inzultus kimenetelében [86], illetve agyi iszkémiás károsodásban [84] szintén észlelhetok nemi különbségek. Munkacsoportunk korábbi eredményei szerint a transzplantált vese hosszú távú muködésében is kimutathatók nemi különbségek, melyek hátterében genetikai és hormonális tényezok feltételezhetok [57]. Jelen értekezés témája szorosan kapcsolódik a fenti, eddig minden részletében kevéssé tanulmányozott, illetve feltárt hipotézisekhez. Az irodalmi adatokból kiindulva munkánk elso részében tisztázni kívántuk, hogy a vese I/R károsodását követoen is kimutatható-e nemi különbség? Vizsgálataink második részének célja a megfigyelt nemi különbség hátterében álló patofiziológiai folyamatok pontosabb megismerése volt. Az értekezés tárgyalja a renális I/R károsodás patofiziológiáját, kitér a NKA és a HSP72 muködésének változásaira - kiemelve a nemi hormonok szerepét -, végül érinti a HSP70 genetikai polimorfizmusok jelentoségét az iszkémiás akut vesekárosodás folyamatában.
8
5. ELMÉLETI ÁTTEKINTÉS
5.1.
Az I/R károsodás okozta akut veseelégtelenség
5.1.1. Az ARF definíciója, kóroki tényezoi
Az ARF az intenzív osztályon gondozott betegek egynegyedénél eloforduló, nagy mortalitással járó kórkép. Kezelése a korszeru terápiás lehetoségek ellenére napjainkban is komoly gondot jelent, kimenetelét a veseelégtelenséghez társuló egyéb megbetegedések nagyban befolyásolják [92]. Az ARF diagnosztikai kritériumait illetoen nincs egyértelmu megállapodás a nefrológusok között, ami jelentosen megnehezíti a kezelésre irányuló szakmai irányelvek kidolgozását. Széles körben elfogadott definíció a glomeruláris filtrációs ráta (GFR) tartós csökkenése, melyet oligo-anuria és azotémia kísér. A szérum kreatinin (CN) és karbamid nitrogén (BUN) emelkedése is kórjelzo, bár egyes kórképekben (pl. súlyos fertozések, heveny izomkárosodás, stb.) értékük növekszik a vese érintettsége nélkül is [60]. Az ARF kialakulásában a vesét közvetlenül érinto károsodások pl. akut glomerulonefritisz, vaszkulitisz, renális vaszkuláris megbetegedések és egyéb vesetüdo szindrómák, illetve extrarenális okok, mint pl. szepszis, kardiális dekompenzáció, megnövekedett intraabdominális nyomás egyaránt szerepet játszhatnak [14]. Klinikailag az ARF három fo típusa különítheto el: a pre-, intra és posztrenális veseelégtelenség. Az intrarenális ARF körébe tartoznak a primer renális vaszkuláris, glomeruláris vagy intersticiális, illetve az intrinsic károsodásra visszavezetheto okok. Az intrinsic károsodás, melyet egyes szerzok akut tubuláris nekrózis névvel illetnek, iszkémiás vagy toxikus eredetu lehet [41, 71]. A jól definiált kóroki tényezok ellenére az intenzív osztályon ARF-ben szenvedo betegek zöménél a betegség multifaktoriális eredetu.
9
5.1.2. Az I/R károsodás okozta ARF patomechanizmusa
Az ARF leggyakoribb és legsúlyosabb oka az elégtelen vesevéráramlás (RBF) miatt kialakuló hipoxiás károsodás. A csökkent RBF hátterében renális okok, mint az artéria renális sztenózisa vagy elzáródása, illetve szisztémás okok (szisztémás hipotenzió, hipovolémia, mutét, stb.) egyaránt állhatnak. Fiziológiás körülmények között a perctérfogat 20- 25%-a a vesébe áramlik, nagyobb része a kortexbe, kisebb része a medullába. A medulla külso részében mért oxigénnyomás a vese többi részénél jelentosen alacsonyabb, így ez a régió élettani körülmények között is hipoxiás [15]. Figyelembe véve, hogy az oxigén- és energiaigényes transzportfolyamatok jelentos része a medullában zajlik, értheto, hogy miért olyan érzékeny ez a terület az RBF relatíve kisfokú változásaira is. Az ARF során a hipoxia intrarenális hemodinamikai változásokhoz, illetve a tubulussejtek iszkémiás és toxikus károsodásához vezet. Ezek a tényezok együttesen intrarenális vazokonstrikciót, a glomeruláris filtrációs nyomás csökkenését, tubuláris obstrukciót és intersticiális aspecifikus gyulladást okozva, a GFR gyors és nagymértéku csökkenését eredményezik (1. ábra).
Proximális tubulusok károsodása
Ischémia 1.
Vazokonstrikció Endotelin Renin-angiotenzin NO-prosztaciklin
Tubuláris obstrukció
Intratubuláris nyomásnövekedés
GFR csökkenés 1. ábra. Az ARF patofiziológiai folyamatai
10
Tubuláris visszaáramlás
RBF csökkenés
Intersticiális gyulladás
Az iszkémiás periódusban a mitokondriális funkciók irreverzibilis károsodása és az RBF csökkenése következtében a sejtek ATP raktárai kimerülnek, ez az ATP igényes folyamatok csökkenéséhez illetve leállásához (membrántranszport folyamatok, protein szintézis, lipogenezis) vezet. Az ATP szint csökkenéssel párhuzamosan no az intracelluláris Ca2+ koncentráció. A transzportfolyamatok gátlása Na+ retenciót és következményes vízbeáramlást okoz, ami az endotélsejtek duzzadását eredményezi. Az intracelluláris tér megnövekedett víztartalma és az endotélsejtek duzzadása lokális hemokoncentrációhoz, fokozott viszkozitáshoz és a hemodinamikai viszonyok megváltozásához vezet. A kapilláriskeringést tovább rontja a vér sejtes elemeinek acidózis okozta csökkent rugalmassága. Ezek a változások együttesen akár a kapillárisáramlás megszunését is okozhatják [89]. Az iszkémia okozta szöveti károsodás mértéke függ az iszkémiás periódus hosszától és az azt követo reperfúziótól. A reperfúzió ugyan elengedhetetlen az iszkémiás szövetek túlélése szempontjából, paradox módon mégis súlyosbítja a szöveti károsodást,
ugyanis
a
reperfúzió
során
keletkezo
reaktív
oxigéngyökök
lipidperoxidációt, DNS-degradációt illetve a poliszacharid-depolimerizáció növekedését okozzák. A kezdeti iszkémiás károsodást tehát, a reperfúzió okozta károsodás követi [100]. Míg az iszkémiás periódus foként a kapillárisok vérátáramlását csökkenti, addig a reperfúziós károsodás során elsosorban az endotél sérülése dominál. A sérülés miatt felszabaduló lokális vazokonstriktor ágensek (pl. endotelin), illetve a leukociták aktivációja és a posztkapilláris venulák endotéljéhez való kitapadása az endotél integritásának megszunéséhez és a plazma makromolekuláinak extravazációjához vezet [62]. A reaktív oxigéngyökök aktiválják a leukocitákat (neutrofil granulocitákat) és a trombocitákat. Az oxigéngyökök keletkezéséért elsosorban a xantin-oxidáz enzim teheto felelossé. Az enzim a hipoxantint oxigén segítségével xantinná alakítja, miközben reaktív oxigéngyökök keletkeznek. Az iszkémia hatására az enzim indukálódik, emellett szubsztrátja, az ADP-degradáció végterméke, a hipoxantin is felszaporodik. A reperfúzió során fellépo „oxigéndömping” hatására az enzim muködése megindul, a molekuláris oxigénbol reaktív oxigéngyökök képzodnek. Olyan enzimrol van tehát szó, melynek egyik szubsztrátját (hipoxantin) az iszkémia, a másikat
11
(O 2 ) pedig a reperfúzió szolgáltatja [58]. Az aktivált leukociták további oxidánsokat és mediátorokat szabadítanak fel (platelet activating factor, citokinek, hisztamin). Az I/R károsodás által aktivált oxigéngyökök, leukociták, trombociták és a felszabaduló mediátorok circulus vitiosust alkotnak, tovább csökkentve az endotél integritását és fokozva az interstíciális ödémát és gyulladást (2.ábra). Iszkémia
Hipoxia
ATP
pH
Na+/K + transzp
A sejtek rugalmassága
Folyadék áramlik a sejtekbe
A sejtek megduzzadnak
Hipoxantin
Hemokoncentráció
A kapillárisok perfúziója Leukociták
O2
Xantin-oxidáz Reaktív oxigéngyökök
Xantin
Vazoaktív mediátorok
Lipidperoxidáció
Hipoxia
Reperfúzió Szöveti károsodás
2. ábra. Az I/R károsodás patomechanizmusa
12
Mikrovaszkuláris permeabilitás Interstíciális ödéma Szöveti nyomás
5.1.3. Nemi különbségek a vesebetegségek progressziójában és az I/R károsodásban
Mind humán megfigyelések, mind állatkísérletes vizsgálatok kimutatták, hogy a legtöbb
vesebetegség
elofordulási
gyakoriságában
és
progressziójában
nemi
különbségek figyelhetok meg. Ennek hátterében egyrészt a vese struktúrájában és funkciójában fellelheto nemi különbségek állhatnak, másrészt a nemi hormonok bizonyítottan befolyásolják egyes vesebetegségek patogenezisét. A végállapotú vesebetegség (ESRD) prevalenciája férfiaknál magasabb, mint nok esetében [93]. Ez a tendencia fokozottan érvényes a glomerulo nefritiszek és hipertenzív glomeruloszklerózis által okozott ESRD-re. Náluk csaknem háromszor gyakoribb a membranózus nefropátia, IgA- nefropátia, valamint a lipoidnefrózis (minimal changeglomerulonefritisz) elofordulása is [83]. Nokben a legtöbb vesebetegség progressziója lassabb, mint férfiakban; kimutatták, hogy a krónikus vesebetegségek, a membranózus nefropátia, az IgA nefropátia, valamint a policisztás vesebetegség nok esetében lassabban vezet ESRD kialakulásához [30]. Állatkísérletes eredmények szerint, hím patkányokban a korral spontán proteinuria és glomeruloszklerózis alakul ki, míg nostény állatoknál, ösztrogénnel kezelt és kasztrált hímeknél ezek az eltérések nem jelentkeznek [27]. Bizonyított továbbá, hogy a legtöbb élettani és patofiziológiai folyamat a két nemben eltéro módon zajlik le. Ismert, hogy a noi nem számos, iszkémiás károsodásnak kitett szerv esetében protektív hatású, amiért elsosorban az ösztradiol felelos. Miokardiális I/R modellekben, ? –ösztradiol adása a miokardiális hemodinamikai paraméterek javulását és az arritmiák elofordulásának csökkenését eredményezi [29]. Ösztradiol adása splanchnikus [86] és cerebrális [84] iszkémia esetében is csökkenti a mortalitást és az iszkémiás károsodást. Mindezek ellenére iszkémiás eredetu ARF kialakulásával és progressziójával kapcsolatos kísérleteket többségében csak hím állatokon végeztek, a nem és a nemi hormonok szerepét a vese I/R károsodásában mindeddig nem vizsgálták.
13
5.2.
A NKA szerepe az I/R károsodás okozta ARF során
5.2.1. A NKA biokémia jellemzoi, muködése élettani körülmények között
A vese I/R károsodása során az ATP szint csökkenése az energiaigényes NKA enzim muködését is nagymértékben befolyásolja. A NKA fiziológiás körülmények között szinte minden humán sejtben jelen van, központi szerepet játszik a szervezet víz és elektrolit homeosztázisának fenntartásában. Az enzim egy ? ?(112 kDa), ß (53 kDa) és ??????kDa)?alegységbol áll; az ? ? alegység felelos a NKA katalitikus aktivitásáért, a ß biztosítja az ? alegységek stabilizációját és membrán integrációját, míg a vesében expresszálódó ??alegység szerepe egyelore nem tisztázott [45]. Az alegységeknek számos izoformáját különítették el, melyek elofordulása, aránya szervenként és szövetenként változó. A vesében elsodlegesen ? ? ?és ß1 alegység izoformák fordul elo [90]. Az
enzim
aktivitása
és
mennyisége
szövetenként
eltéro,
legnagyobb
mennyiségben az agyban és a vesében van jelen. A NKA aktív transzportja a vesében a sejtek energiafelhasználásának 50-70%-át teszi ki [72]. Muködése során egy molekula ATP hidrolízisével két K+-ot transzportál az extracelluláris térbol az intracelluláris térbe, miközben három Na+-ot juttat ki a sejtbol. A sejtmembrán két oldala között így kialakult elektrokémiai potenciálgrádiens biztosítja a sejtmembránon keresztül zajló, másodlagosan aktív transzportfolyamatok (pl. Na+/Ca2+ antiport, Na+/glükóz kotranszport stb.) számára az energiát. Az enzim ezért alapvetoen befolyásolja a szervezet folyadéktereinek összetételét és a sejtek térfogatát. A vese proximális tubulusának epitélsejtjeiben egyirányú transzportfolyamatok (víz, ionok és makromolekulák) zajlanak a vér és glomeruláris filtrátum között. A tubulussejteken az apikális oldal tekint a vizeletelvezeto rendszer lumene felé, míg a bazális membrán a belso rész (vér) felé. A két membrán fizikokémiai szerkezete, transzport
tulajdonságai
alapvetoen
különböznek.
Az
újonnan
szintetizált
membránalkotórészek és citoszkeletális struktúrák - melyek barrierként szolgálnak az apikális és bazális membrán között - eltéro eloszlást mutatnak a membrán két oldalán. A NKA a membrán bazális oldalán található, így tudja biztosítani a Na+ intracelluláris
14
térbol történo kielégíto reabszorpcióját [54]. Ez a polaritás szükséges a tubuláris transzport megfelelo muködéséhez.
5.2.2. A NKA muködésének változása a renális I/R károsodás során
A renális iszkémia hatására bekövetkezo folyamatok közül szinte elsoként, a proximális tubulussejtek vesztik el polaritásukat. Ennek következtében a NKA molekulák elszakadnak az aktin-alapú citoszkeletonról és egy részük eredeti bazálmembránhoz kötött helyérol a citoszólba, illetve az apikális membránra kerül át [101]. A glomerotubuláris feedback mechanizmus miatt csökken a GFR és károsodik a Na+ és víz visszaszívás illetve számos ko-transzporter molekula (K +, glükóz, P3+) intracelluláris koncentrációja. Ezt a jelenséget renális I/R károsodást követoen mind kísérletes, mind klinikai körülmények között megfigyelték (3. ábra). Az iszkémia hatására nemcsak a NKA molekulák kihelyezodése következik be, de változik a NKA alegységek mRNS és fehérje szintézise is. A változás mértéke szövetenként eltéro és nagymértékben függ az iszkémiás periódus hosszától. Vesében 30-60 perces iszkémiát követoen hím patkányokban az ? ? ?és ß1 mRNS szint jelentos csökkenését mutatta ki több munkacsoport [94, 36, 39], de a folyamat hátterében álló molekuláris szintu változások legnagyobb részt ismeretlenek. A reperfúzió periódusa alatt, az mRNS szint lassú folyamatos növekedéssel néhány nap alatt eléri a kiindulási értéket. Az mRNS szint változásaival párhuzamosan változik a NKA alegységek protein expressziója. Coux és mtsai kimutatták, hogy renális iszkémiát követoen jelentos mértékben lecsökken a NKA ? ? ?és ß1 alegységek fehérje expressziója és a pumpa aktivitása [17]. Az aktivitás csökkenése magyarázható egyrészt a csökkent proteinszintézissel, másrészt a NKA redisztribúciójával. Triton X-100 extrakcióval Aufricht és mtsai a veseszövet homogenizátumot egy Triton – inszolubilis (citoszkeletális struktúrát reprezentáló) és egy Triton – szolubilis frakcióra (egyéb sejtalkotók) különítették el [4]. Kimutatták, hogy renális iszkémiás inzultust követoen az inszolubilis frakcióban lecsökken, míg a szolubilis frakcióban megno a NKA ? ? ?és ß1 alegységek fehérje mnnyisége. A reperfúzió során folyamatosan visszaáll a NKA fiziológiás eloszlása, ami a fehérjeszintekben is
15
tükrözodik. Ezek az eredmények tovább erosítik a NKA redisztribúció jelentoségét a posztiszkémiás vesekárosodás során [9]. Habár a nem és a nemi hormonok befolyásolják a NKA muködését, a fenti kísérletek mindegyikét hím állatokon végezték, nostények esetében nincs adat az enzim I/R károsodást követo változásairól. A.
Apikális
Bazális Vér
Lumen Na+
H+ ADP + Pi
glükóz, Pi, aminosavak
Na +
Na + K+
Na+
ATP
Ischémia
B. Na+
Reperfúzió
H+ ADP + Pi
glükóz, Pi, aminosavak
Na +
Na +
ADP + Pi
K+
Na+ Na + K
ATP
+
ATP
3. ábra. Az I/R NKA megoszlására és Na+ transzportra gyakorolt hatása. Fiziológiás körülmények (A): Na+ az elektrokémiai grádiense mentén az apikális membránon keresztül kerül be a sejtbe, majd a bazolaterális membránon elhelyezkedo NKA pumpálja ki. Iszkémiát követoen (B): NKA kihelyezodik az apikális membránra is, ezáltal visszapumpálja a lumenbe a Na+-ot csökkentve a Na+ reabszorpció hatékonyságát és növelve a tubuláris Na+ exkréciót.
16
5.2.3. Nemi hormonok hat ása a NKA muködésére
A nem és a nemi hormonok NKA-ra gyakorolt hatásairól ellentmondásos adatok állnak rendelkezésre. A nemi hormonok eltéroen befolyásolják a NKA enzim expresszióját és aktivitását az egyes fajokban és szövetekben. In vitro körülmények között, egér izolált szívizomsejtjein kimutatták, hogy 17-ß ösztradiol kezelés csökkenti a NKA enzim aktivitást. A folyamatban az ösztrogén receptor-2 közvetlen szerepét feltételezik, mivel a receptor blokkoló tamoxifen hatására az aktivitásnövekedés elmarad [88]. Ezzel ellentétben humán vörösvértesten és limfocita sejtkultúrákban több, független munkacsoport a 17-ß ösztradiol kezelés serkento hatását írta le [28, 7]. Az in vivo modellekben nyert eredmények hasonlóan ellentmondásosak. Míg egér hippocampusában a 17-ß ösztradiol semmilyen hatást nem gyakorolt a pumpa muködésére [10], addig könnymirigyben a szintetikus ösztrogén, a dietil-stilbösztrol a NKA aktivitásának kifejezett csökkenését eredményezte [5]. Az ösztrogén a NKA aktivitás gátlását váltotta ki patkány ductus efferensében is [43]. Ezzel szemben Ziegelhoffer és mtsai 17-ß ösztradiol adását követoen a NKA pumpa
aktivitásának
növekedését
figyelték
meg
patkány
szívizomsejteiben.
Feltételezéseik szerint az ösztradiol az enzimben részleges konformációváltozást indukál, ezáltal megno a K+ köto helyek affinitása és erosödik az egyes kötohelyek közötti kapcsolat. Az aktivitásnövekedés csak in vivo körülmények között, integrált szívizomsejteken észlelheto. Ez arra enged következtetni, hogy nem kizárólag közvetlen hatásról van szó, hanem az ösztrogén adagolását követoen valamilyen, még ismeretlen mediátor szabadul fel a miocitákból és ez vezet a pumpafunkció növekedéséhez [104]. A tesztoszteron hatásairól jóval kevesebb adat áll rendelkezésre. Egyes vizsgálatok kimutatták, hogy egér agyának preoptikus részében fokozódik az enzim aktivitása tesztoszteron kezelést követoen [27]. A NKA aktivitásának növekedését észlelték patkány agy, illetve máj szövethomogenizátumok vizsgálata során is [82, 25]. Más kísérletek azonban tesztoszteron kezelést követoen nem találtak változást patkány submandibuláris mirigyének pumpafunkciójában [38]. Habár a NKA muködése a vesében kiemelt fontosságú és az enzim muködése élettani körülmények között az agyszövet mellett a vesében a legaktívabb, a nem és a
17
nemi hormonok hatását a veseszövetben szinte alig vizsgálták. Quintas és mtsai szerint nostény patkányokban fizioló giás körülmények között is magasabb a NKA ? ? ?alegységének mRNS expressziója, valamint az enzim aktivitása, mint hímekben [69]. Más munkacsoport azonban nem talált különbséget a vese NKA aktivitásában sem élettani körülmények, sem tesztoszeron ill. ösztrogé n kezelést követoen [74].
18
5.3.
A HSP72 szerepe a renális I/R károsodásban
5.3.1. A HSPk jellemzoi, feladatuk, szabályozásuk
Az I/R károsodás során a felszabaduló reaktív oxigéngyökök hatására a citoszkeletont alkotó fehérjék, illetve a legtöbb membrán- és transzportfehérje denaturálódik. A tönkrement fehérjék aggregátumokat képeznek, eliminálásuk nehéz. A sejtmembrán károsodása miatt a membrán-kapcsolt transzportfolyamatok, így a NKA muködése is zavart szenved. Az iszkémiás inzultust követoen, a károsodott proteinek struktúrájának helyreállítása illetve eliminálása tehát kulcsfontosságú a szövetek túlélése szempontjából. Ezekben a helyreállító folyamatokban a HSPk központi szerepet töltenek be. A HSPk, molekukáris chaperonok vagy más néven dajkafehérjék élettani és kóros állapotban egyaránt jelen vannak a sejtekben. Más fehérjék instabil alakjaihoz kötve, azokat rögzítve, megszabják az adott fehérje további sejten belüli sorsát [32]. Fiziológiás körülmények között részt vesznek a fehérjék szintézisében, transzportjában, valamint szerepük van a lebontott fehérjék eliminációjában is [24]. A dajkafehérjék rendkívül konzervatív struktúrák, a bakteriális és humán HSPk génszekvenciája szinte teljesen megegyezik [59]. Muködésüket passzív és aktív hatásokra oszthatjuk. A passzív chaperon hatás lényege a hidrofób aminosavakban gazdag polipeptidláncok nagy affinitású kötése, mely meggátolja a denaturált fehérjék aggregációját. Passzív hatása mindegyik dajkafehérjének van [6]. Az aktív chaperon hatás ezzel szemben mindig energiaigényes folyamat: vagy ATP hidrolízise (HSP60, HSP70, HSP110) vagy a redoxpotenciál (diszulfid hidak reverzibilis redukciója) terhére történik. Az aktív chaperon hatás segít az újonnan szintetizálódó
fehérjék
harmadlagos
térszerkezetének
kialakításában,
illetve
denaturálódott fehérjék esetében, a szerkezet helyreállításában. Hozzájárul a fehérje oligomerek összeszereléséhez és az endoplazmás retikulumba juttatásához, valamint részt vesz a károsodott proteinek lízisében, illetve zárványokba zárásában [33]. A dajkafehérjék nagy része stresszfehérje. Ezek a szervezetet ért károsító ágens hatására rendkívül gyorsan expresszálódnak és szintézisük fokozódik. Ezáltal a sejt
19
képessé válik muködésének helyreállítására, vagy - akár az ismétlodo károsító inger ellenére –muködésének fenntartására. A dajkafehérjék csoportosítása és elnevezése molekulatömegük alapján történik (1. táblázat). A továbbiakban a 70 kDa tömegu HSP70 stresszfehérje család tulajdonságait ismertetem részletesebben.
Család
Muködés
Speciális szerep
Kisméretu Cpn10, GimC, HSP25, aggregáció gátlás
apoptózis, neurodegeneráció HSP70 segéd, ATPáz aktivátor aktin, tubulin, apoptózis immortalizáció, apoptózis, immunitás jelátvitel, immunitás daganatképzés termotolerancia, konformációs betegségek
HSP40 HSP60 HSP70 HSP90 HSP100
Képviselok
HSP27, krisztalloidok HSP40, Hdj1, Hdj2, aggregáció gátlás Hsj 1a, Hsj 1b Cpn 60, TCP-1 harmadlagos térszerkezet segítése HSP72, HSP73, aggregáció gátlás, HSP70-hom, Grp78 fehérjeszintézis, transzport, lízis HSP90c, HSP90i, aggregáció gátlás, Grp94, Grp96 szerkezet stabilizálás HSP101/102, HSP104, aggregátumok HSP110, Grp170 szétszedése, proteolízis
Irodalom Arrigo [3] Hartl [33] Shirmer [85] Schnaider [76]
Csermely [23] Soti [86]
1. táblázat. A dajkafehérjék családjai, legfontosabb funkcióik (Soti Cs, PhD értekezése alapján, 2002)
A HSP70 család tagjai élettani körülmények között szerepet játszanak a frissen szintetizálódott fehérjék térszerkezetének kialakításában, a részlegesen károsodott vagy hibás fehérjék átstruktúrálódásában és a denaturálódott proteinek degradációjában. Kötodnek a citoszkeletális struktúrákhoz és ezáltal részt vesznek egyes fehérjék membránon keresztüli transzlokációjában [33]. Ezek a folyamatok mind ATP igényesek, a HSP70 azonban önmagában gyenge ATPáz aktivitással rendelkezik. Ezért a szubsztrátok kötéséhez szükséges energiát kofaktorok (pl. HSP40) biztosítják [42]. A HSP70 ATP-kötohelye a fehérje N-terminálisán találha tó és nagymértékben hasonlít az aktin illetve a glikolízisben résztvevo enzimek ATP-kötohelyéhez. A peptidköto régió a C-terminálison foglal helyet. A fehérjecsalád tagjai rendkívül változatos csoportot alkotnak. A citoszólban és a sejtmagban kimutatható egy állandóan jelenlevo konstitutív forma a HSP73 és egy stressz-indukált forma a HSP72. A mitokondriumban és az endoplazmatikus retikulumban fordul elo a HSP70-hom és a Grp78. A HSP73 és a HSP70-hom
20
aminosavsorrendje 90%-ban megegyezik, tulajdonságaik, funkcióik nagymértékben hasonlóak [52]. A HSP73 a vese minden részében kimutatható, közel azonos mennyiségben expresszálódik a kortikális és medulláris részen. Elsosorban fiziológiás körülmények között felelos a megfelelo fehérjetranszportért és degradációért (2. táblázat) A
HSP72,
az
indukálható
forma
a
sejtet
ért
károsító
hatást
(homérsékletemelkedés, hipoxia, hiperoxia, gyulladás, fertozés, toxikus károsodás) követoen termelodik. A vesében a HSP72 mRNS szintje a kortikopapilláris tengely mentén fokozatosan emelkedik. Fiziológiás körülmények között elhanyagolható mennyiségu HSP72 mRNS és fehérje expresszálódik a vese kortexben, közepes mennyiséget tartalmaz a külso medulla és a legmagasabb a HSP72 szintje a belso medullában. Elozetes adatok szerint a medullában mért magas HSP72 expresszió összefügg a koncentráló vesében mért magas ozmolalitás értékekkel [77].
Élettani állapotok
Kóros állapotok
Környezeti hatások
Sejtosztódási ciklus Sejtdifferenciálódás
Fertozések (virális, bakteriális, Homérsékletváltozás (ho- és parazita) hidegsokk) Láz Nehézfémek
Szöveti fejlodés
Gyulladás
Alkohol
Hormonális stimuláció Iszkémia
Antibiotikumok
Növekedési faktorok
Sugárzás
Hipertrófia Oxidatív károsodás Malignitás Autoimmunitás
2. táblázat. A HSPk fokozott expressziójához vezeto állapotok Prohászka és mtsai[68]
5.3.2. HSP72 és az I/R károsodás
Iszkémiás károsodást követoen a legtöbb fehérje szintézise gátlódik, ezzel szemben a HSPk mRNS és fehérje expressziója gyorsan és jelentos mértékben (1525%-kal) megno [95]. A szintetizálódott stresszfehérjék chaperone funkciójuk révén részt vesznek a mitokondriumok károsodásának kivédésében és a sejtszerkezet megorzésében. Irodalmi adatok szerint iszkémia során, ATP hiányában a HSP72 a
21
károsodott proteinek hidrofób felszínéhe z köt és ezáltal mintegy „kivonja a forgalomból” a denaturált fehérjéket. A véráramlás megindulásával az ATP hidrolízise során keletkezo energiát felhasználva, a HSP72 konformációváltozáson megy át és így válik képessé a károsodott proteinek térszerkezetének stabilizálására ill. helyreállítására, valamint a helyreállított fehérjék elengedésére [16]. I/R károsodást követoen számos szervben a HSP72 expresszió növekedésérol számolnak be állatkísérletes és humán vizsgálatok egyaránt. Elozetes kísérletek szerint miokardiális infarktust követoen az emelkedett HSP72 expresszió csökkenti az infarktusos terület kiterjedését [66]. Kimutatták továbbá, hogy a stresszfehérjék nem elsosorban a szívizomsejtekben, hanem a kapilláris endotélben termelodnek, bár pontos hatásmechanizmusuk még nem tisztázott. A szívhez hasonlóan, az agy hipoxiás károsodása során is megfigyelték a HSPk jótékony hatását a károsodott szövetek regenerációjában. Yenari és mtsai vizsgálatai szerint, HSP70-t expresszáló vektorokkal végzett génterápia növeli a neuronsejtek ellenállóképességét és segíti a túlélést cerebrovaszkuláris iszkémiás inzultust követoen [102]. Kimutatták továbbá, hogy a károsodás után az idegsejteknél sokkal ellenállóbb gliasejtek jóval több HSP72-t szintetizálnak, ami még inkább alátámasztja a stresszfehérjék protektív szerepét az I/R károsodás folyamatában [80]. Humán és állatkísérletes vizsgálatok egyaránt igazolták a HSP72 jelentoségét a vese I/R károsodásában is. Vicencio és mtsai újszülött állatok veséjének vizsgálatai során bizonyították, hogy a HSP72 expressziója fokozódik renális iszkémiát követoen, továbbá, ho gy az elégtelen HSP72 szintézis az iszkémiás tolerancia csökkenéséhez és a vesefunkciók romlásához vezet [55]. Aufricht és mtsai kimutatták, hogy a renális iszkémia hatására indukált és expresszált HSP72 fehérjék segítik a citoszkeleton struktúrájának reintegrációját és a tubuláris epithel polaritásának megorzését. Immunhisztokémiai vizsgálatok során igazolták, hogy az expresszált HSP72 lokalizációja megegyezik az iszkémia hatására eredeti helyérol a citoszólba került NKA elhelyezkedésével [4]. Mindezek alapján feltételezheto, hogy a tubuláris rendszerben központi szerepet játszó NKA muködésének helyreállításában a HSP72 kulcsszereppel bír.
22
5.3.3. Nemi hormonok és a HSP72
Bár a HSP72 szerepe egyre több hormonmediált patofiziológiai folyamatban felmerül, a nem és a nemi hormonok HSP72 expressziót befolyásoló hatásait igen kevesen vizsgálták. Ezek a tanulmányok is elsosorban leíró jelleguek, a vesét illetoen nincs rendelkezésre álló adat. Az eddigi, különbözo szöveteken végzett vizsgálatok szerint nostényekben, illetve ösztrogén hatásra a HSP72 expresszió növekedése észlelheto, bár a nemi hormonok feltételezett hatásmechanizmusa továbbra is tisztázatlan. Voss és mtsai hím és nostény állatok szívizomsejtjein végzett kísérletei alapján fiziológiás körülmények között szignifikánsan nagyobb mennyiségu HSP72 fehérje expresszálódik nostényekben, mint hím állatokban. Ovariektómia hatására megszunik a különbség, de ösztrogén pótló kezelés ismét HSP72 expresszió növekedést eredményez [98]. Kimutatták továbbá, hogy hím patkányok esetében ösztrogén és progeszteron hatására megno a HSP72 expressziót indukáló hosokk faktorok termelodése és ezzel párhuzamosan emelkedik a HSP72 fehérje szintje, míg tesztoszteron kezelés nem eredményez változást a fehérjeszintekben [37]. Hasonló ösztrogén mediált hatásról számolnak be patkány uterusának vizsgálata kapcsán is. Ovariektomizált egerekben ß-ösztradiol hatására a HSP72 mRNS expressziója
növekedett.
A
növekedés
hátterében
az
ösztrogén
transzkripcióra/transzlációra kifejtett direkt vagy a ho sokk faktorok indukcióján keresztül megvalósuló közvetett hatása feltételezheto [64].
23
5.4.
A HSP70 fehérjecsalád genetikai polimorfizmusai
A hormonális és környezeti hatások mellett egyes fehérjék expresszióját genetikai polimorfizmusok is nagymértékben befolyásolják. Alapjában véve a HSPk egykét kivételtol eltekintve nem polimorf fehérjék. A HSP90 családban eddig nem írtak le polimorfizmust és mindössze egy tanulmány foglalkozik a HSP60 genetikai variációinak jelentoségével, a hirtelen bölcsohalál kialakulásában [106]. Sokkal többet vizsgálták azonban a HLA-kapcsolt, HSP70 fehérjecsalád genetikai polimorfizmusait. A HSP70-s család három tagját (HSP72, HSP73 és HSP70-hom) kódoló gének a 6-os kromoszóma rövid karján, a 6p21 lokuszon találhatók. Ez a terület felelos a HSP70 fehérjecsalád mellett az MHC II (HLA-DRB1, HLA-DQB1) valamint MHC III régiót alkotó (TNF-a, TNF-ß) fehérjék kódolásáért is. A régió fehérjéinek fontos szerepe van az antigének felismerésében és a T-sejt mediált immunválasz beindításában is. A HSP70 család legfontosabb genetikai polimorfizmusait a 3. táblázat foglalja össze.
gén HSP72
polimorfizmus A1267G
pozíció
funkció
kódoló szakasz G hordozás a HSP72 mRNS szint csökkenésével járhat
HSP73
HSP70-hom
G1538A
promoter régió
G190C
5’ UT régió
A-110C
promoter régió
T2437C
? silent mutáció, szerepe még ismeretlen
szerepe még ismeretlen
peptidköto régió Metionin –Threonin csere, szerepe még ismeretlen
3. táblázat. A humán HSP70 család génpolimorfizmusai
Számos tanulmányban elemezték HSP70 génpolimorfizmusok klinikai relevanciáját. Az eredmények nem egyértelmuek. Favatier és mtsai szerint a HSP73 A-110C promoter polimorfizmusa nem befolyásolja a hosokk transzkripciós faktorok kötodését, sem a HSP70 mRNS szintézisét, illetve akkumulációját EBV-vel transzformált humán sejtvonalakban [22]. Hasonló eredményt kaptak Schröder és mtsai, akik a HSP72 génpolimorfizmus és a mRNS közötti kapcsolatot elemezték, és azt találták, hogy a gén 1267G polimorfizmusa nem befolyásolja ex vivo a HSP72 mRNS expresszióját [78] . Ezzel szemben Pociot és mtsai kísérletei alapján humán perifériás vérben hosokkot követoen alacsonyabb a HSP72 mRNS
24
expressziója az 1267GG genotípusú egyedekben, mint heterozigóta vagy 1267AA típusú társaikban [65]. Bár sem kísérletes, sem klinikai tanulmányok nem támasztották alá egyértelmuen a genetikai polimorfizmusok HSP70 mRNS, illetve fehérje expresszióra kifejtett közvetlen szabályozó szerepét, a HSP70 gének polimorfizmusainak jelentoségét számos immunmediált folyamatban kimutatták. A HSP72 genetikai variációi számos esetben jelentosen befolyásolják egyes kórfolyamatok morbiditását és a kimenetelét. Az 1267G allélt hordozók gyakrabban betegszenek meg asztmában, Basedow-Graves kórban, reumatoid artritiszben valamint SLE-ben [65]. Kimutatták továbbá, hogy az 1267GG genotípust hordozó nok között szignifikánsan nagyobb az emlorák és egyes nogyógyászati daganatok elofordulásának rizikója [50]. Több vizsgálat igazolta az 1267G allél hordozás káros hatását iszkémiás károsodás során is. Akut miokardiális infarktust és agyi hipoxiát követoen jelentos különbség mutatkozott a túlélésben és az iszkémiás terület kiterjedésében az egyes HSP72 genotípusok hordozói között [66]. A HSP72-vel szemben a HSP73, illetve a HSP70-hom polimorfizmusai nem mutattak szignifikáns összefüggést a vizsgált betegségekkel (asztma, cöliákia, spondiloartrorpátia, SLE) [65]. Mindezek alapján azok a terápiás megközelítések, melyek egyéb gének serkentése nélkül, kifejezetten a HSP70 gének indukálását célozzák, a jövoben alapvetoen változtathatják meg egyes immunmediált illetve iszkémiás kórfolyamatok kezelésének kelléktárát.
25
6. CÉLKITUZÉSEK
Kísérleteink során a nem, nemi hormonok illetve a genetikai polimorfizmusok szerepét vizsgáltuk az I/R károsodás következtében létrejövo akut veseelégtelenség (ARF) folyamatában. Legfontosabb kérdéseink a következok voltak: 1.
A nem és a nemi hormonok befolyásolják-e a vese I/R károsodását követoen
az állatok túlélését uninefrektomizált nostény és hím Wistar patkányokban?
2.
Hogyan változnak a túlélési eredmények a vese I/R károsodását követoen
gonadektomizált, hormonszubsztiúcióban részesült illetve ivaréretlen nostény és hím állatok csoportjaiban?
3.
Befolyásolja-e a nem a vese I/R károsodását követoen a renális
hemodinamikai paraméterek változását illetve a vese szöveti károsodásának mértékét?
4.
Van-e nemi különbség a vese I/R károsodását követoen a renális NKA
alegységeinek
mRNS
és
fehérje
expressziójában
illetve
az
ionpumpa
aktivitásában?
5.
Eltéro-e a két nemben a vese I/R károsodását követoen a renális NKA
alegységeinek celluláris megoszlása?
6.
Van-e nemi különbség a a vese I/R károsodását követoen a citoprotektív
hatású HSP72 renális mRNS és fehérje expressziójában?
7.
Befolyásolják-e a HSP70 család genetikai polimorfizmusai igen kis súlyú
koraszülöttekben az ARF kialakulását ?
8.
Van-e összefüggés az ARF-re hajlamosító rizikótényezok elofordulása és a
HSP70 genetikai polimorfizmusok gyakorisága között?
26
7. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK
7.1.
In vivo vese iszkémiás/reperfúziós állatmodell
7.1.1. Kísérleti állatok Kísérleteinket ivarérett (4-5 hónapos), nostény (N) (240 ? 30g), és hím (H) (300 ? 35g) illetve ivaréretlen (35-40 napos) N és H (67 ? 8g) Wistar patkányokon végeztük. A patkányokat állandó, 21°C homérsékleten, 75% páratartalom és 12 óránként váltakozó megvilágítás mellett tartottuk. Az állatok szabadon fogyaszthattak standard rágcsáló tápot és csapvizet. A kísérleteket a Magyar Köztársaság (1998/XXVIII) állatvédelmi törvényei alapján, a Semmelweis Egyetem állatkísérletekkel kapcsolatos irányelveinek megfeleloen végeztük.
7.1.2. Mutéti beavatkozás
A mutéti beavatkozást intraperitoneális nátrium-pentobarbitál (50 mg/ttkg, Nembutal, Abbott Laboratories, Budapest, Magyarország) anesztéziában végeztük. A mutét alatt az állatok rektális homérsékletét 37 ? 0,5°C-on tartottuk. Elokísérleteink során különbözo hosszúságú iszkémiás idoket követoen vizsgáltuk az állatok túlélését és a vese állapotát. Azt találtuk, hogy 50 percnél rövidebb iszkémia nem vezet ARF kialakulásához, míg 55 percnél hosszabb iszkémiás periódust követoen az állatok (elsodlegesen a hímek) nem élik túl a posztiszkémiás idoszakot, shock következtében a beavatkozást követo napon elpusztulnak. Az 50 és 55 perces iszkémia között nem volt szignifikáns eltérés a túlélésben. Mindezek alapján kísérleteink során 50 illetve 55 perces iszkémiás idoket alkalmaztunk. Homérséklet szabályozott operációs padon az anesztéziát követoen medián laparatomiát végeztünk. A bal vesét ellátó artériát és vénát kipreparáltuk, majd kísérleteink
elso
részében
50,
második
részében
55
percre
atraumatikus,
mikrovaszkuláris klippel leszorítottuk (Biemeier, Aesculap, Németország). Az iszkémiás periódus alatt a hasfalat ideiglenesen zártuk. Az iszkémiás ido lejárta elott az
27
ellenoldali jobb vesét eltávolítottuk. A klip felengedése után a mutéti nyílást véglegesen zártuk. Az állatokat a teljes ébredésig figyelemmel kísértük, majd ketreceikbe visszahelyeztük. Kontrollként minden kísérletben uninefrektomizált, áloperált, nem- ischemizált nostény és hím állatok szolgáltak.
7.1.3. Vizsgálati csoportok (4. A, B táblázat)
Kísérleteink elso részében az állatok túlélését az iszkémiás beavatkozást követo egy hétig kísértük figyelemmel. Elokísérleteink alapján a jelen modellben az elso hét után életben maradt állatok között további elhullás nem várható. A nemi hormonok vizsgálatára kísérleteinket megismételtük ivaréretlen, gonadektomizált illetve hormonszubsztitúcióban részesült állatok csoportjain. A gonadektomiát generalizált anesztéziában (50 mg/ttkg, Nembutal, Abbott Laboratories, Budapest, Magyarország) 1 héttel az iszkémiát megelozoen végeztük. Az ováriumok illetve a vesicula seminalis sorvadása igazolta a kasztráció megfelelo kivitelezését. A hormonszubsztitúcióhoz 7 napos elokezelést követoen, a vizsgált periódusban ßösztradiol-3-benzoátot (25 ? g/ttkg/nap, sc.) illetve tesztoszteron-proprionátot (0,5 mg/ttkg/nap, sc.) adagoltunk (Sigma Chemical Co, St. Louis, MO, USA). A megfelelo kezelést a szérum hormonszintek mérésével igazoltuk. A továbbiakban vizsgáltuk az I/R károsodást követo hemodinamikai eltéréseket, illetve az ischemizált bal veseszövetben lezajlott hisztológiai változásokat.
Vizsgálati Csoportok
Nostény
(I. kísérletsorozat)
Hím N
Ivarérett állatok
12
12
Ivaréretlen állatok
12
12
Gonadektomizált állatok
12
12
Tesztoszeronnal kezeltek
9
-
Ösztradiollal kezeltek
-
8
4/A táblázat. Az I/R károsodást követo túlélés, hemodinamikai és hisztológiai változások vizsgálatához használt kísérleti csoportok
28
A veseszövet molekulárbiológiai analíziséhez kísérleteinket megismételtük nostény és hím ivarérett Wistar patkányok csoportjaival. A fenti mutéti beavatkozást követoen az egyes posztiszkémiás idopontokban (2 óra, 16 óra, 24 óra) az állatokat újra elaltattuk, majd kivéreztettük.
Vizsgálati Csoportok
Nostény
Ivarérett állatok (II. kísérletsorozat)
Hím N
Kontroll
6
6
Iszkémia után 2 órával (T2)
6
6
Iszkémia után 2 órával (T16)
6
6
Iszkémia után 2 órával (T24)- csak a
6
6
HSP72 vizsgálatokhoz
4/B táblázat. Az I/R károsodást követo hisztológiai és molekulárbiológiai változások vizsgálatához használt kísérleti csoportok
A vérbol szérumot izoláltunk és további vizsgálatokig -80 °C-on tároltuk. Az eltávolított vesét egyenlo darabokra osztottuk és 4% pufferolt formalinban (pH=7,4) vagy folyékony nitrogénben történo gyorsfagyasztást követoen -80 °C-on tároltuk.
7.2.
Hemodinamikai vizsgálatok
Vizsgálatainkat
inaktinnal
(100mg/ttkg)
(Abbott
Laboratories,
Budapest,
Magyarország) altatott ivarérett nostény (261 ? 12g, n=6) és hím (383 ? 25g, n=6) Wistar patkányokon végeztük. A renális és szisztémás hemodinamikai változások megítélésére az iszkémiás inzultus elott, alatt és után mértük a patkányok artériás középnyomását (MAP), a verotérfogatot (CO), a szívfrekvenciát (HR), a teljes érellenállást (TVR), a renális véráramlást (RBF) valamint a renális vaszkuláris rezisztenciát (RVR). Tracheotomiát követoen, az euvolémia fenntartására a bal oldali véna femoralisba vezetett kanülön keresztül 5% albumin oldatot infundáltunk (10 ml/ttkg a preparálás alatt és 1ml/ttkg utána). A vérnyomást és a szívfrekvenciát a bal artéria femoralisra helyezett CO-100 cardiac output computer (Experimetria, Budapest, Magyarország)
29
segítségével monitoroztuk. A verotérfogatot 0,2 ml steril 15°C-os fiziológiás sóoldat véna jugularisba juttatását követoen, termodilúciós módszerrel határoztuk meg. A vesevéráramlást a bal artéria renalis hilus közeli részére helyezett ultrahangos áramlásméro transzducer segítségével mértük (Transonic Flo wmeter 101, Transonic Systems, NY, USA). A teljes perifériás ellenállást és a renális vaszkuláris rezisztenciát a mért adatokból számoltuk. A sebészi beavatkozásokat 30 perces stabilizációs periódus követte. A szisztémás (MAP, CO és HR) illetve a renális (RBF, RVR) paramétereket 30 perccel az iszkémiás inzultus elott, az iszkémiás ido alatt, valamint az azt követo 60 percben 10 perces idoközönként monitoroztuk. Az állatok hematokrit értékeit a mérések elott és után egyaránt kontrolláltuk.
7.3.
Hisztológiai vizsgálatok
Az eltávolított vesék egy részét formalinban (4%, pH=7,4) fixáltuk, majd paraffinos beágyazást követoen perjódsavas Schiff reakcióval (PAS) és hematoxyllin eosinnal festettük. A fénymikroszkópos kiértékelés a minták kódolása után történt. A glomeruláris és a tubuláris károsodások, illetve a leukocita infiltráció mértékét 0-4-ig terjedo skálán minosítettük a következok szerint: 0- nincs, 1-enyhe (a sejtek <25 %-ban), 2-közepesen súlyos (a sejtek 2550%-ban, 3-súlyos (a sejtek 50-75%-ban), 4-nagyon súlyos (a sejtek >75%-ban).
7.4.
Szérum karbamid (BUN) kreatinin (CN), nátrium és kálium mérése
A kontrollokban, illetve a vizsgált posztiszkémiás idopontokban az aorta abdominalisból vett vérbol, Hitachi-712 automatizált spektrofotométeren fotometriás módszerrel határoztuk meg a BUN, CN, nátrium és kálium értékeket kereskedelmi forgalomban lévo kittek segítségével (Diagnosticum Kft, Budapest, Magyarország).
30
7.5.
RT-PCR vizsgálatok
7.5.1. RNS izolálás
A kontroll, T2, T16 és T24 idopontokban leölt állatokból nyert veseminta egy részét guanidin- isotiocia nát lízispufferbe helyeztük és –80°C-on tároltuk a további molekulárbiológiai feldolgozásig. A szövetminták teljes citoplazmatikus RNS tartalmát a Quiagen protokollja alapján, az RNeasy?
Mini Kit (Quiagen GmbH, Hilden,
Németország) segítségével izoláltuk. A kivont RNS mennyiségét és összetételét spektrofotometriás módszerrel határoztuk meg. Az RNS mintákat felhasználásig -80°C–on tároltuk.
7.5.2. Komplementer DNS (cDNS) szintézis A reverz transzkripció (RT) során minden mintából 1 ? g totál RNS-t konvertáltunk cDNS-é 20 ? l reakció végtérfogatban, 200 U SuperScript II? RNase Hreverz transzkriptáz, 20 U RNaseOUT? inhibitor és 3,75 pg/? l oligo dT12-18 primer hozzáadásával (Gibco/BRL, Eggenstein, Németország). A reakcióelegyet 20°C–on 10 percig, majd 42°C–on 45 percig és végül 99°C-on 5 percig inkubáltuk, majd 4°C-ra lehutöttük és a felhasználásig -20°C–on tároltuk.
7.5.3. Szemikvantitatív PCR reakciók (patkány glicerin-aldehid-foszfát dehidrogenáz (GAPDH), NKA ? 1 és ß1 alegység, HSP72) A szemikvantitatív PCR reakciókat 50 ? l végtérfogatú [10% 10x PCR puffer, 2 mM MgCl2 , 0,2 mM dNTP, 0,4 ? M primer (sense és antisense egyaránt), 1,5 U rekombináns Taq polimeráz (Gibco/BRL, Eggenstein, Németország)] reakcióelegyben végeztük Perkin Elmer Thermo Cycler ® automatában (PE, Model 2400, Norwalk, CT, USA), 2 ? l cDNS templát felhasználásával. A patkány specifikus NKA ? 1 és ß1, illetve HSP72 mRNS szekvenciákat az NCBI (National Center for Biotechnology Information, (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)
31
nukleotid genetikai adatbázisa és Blast szolgáltatása segítségével választottuk ki (Accesion numbers: Gen bank: NKA ? 1: NM 012504, NKA ß1: NM 013113, HSP72: NM 031971). A primerek tervezéséhez a Primer3 (http://www-genome.wi.mit.edu/cgibin/primer/ primer3.cgi) (Steve Rozen, Helen J. Skaletsky (1998) Primer3, Whitehead Institute for Biomedical Research) illetve a DNAStar?
szoftvereket használtuk. A
patkány GAPDH specifikus primereket Strehlau és mtsai-tól vettük át. A PCR-ek során alkalmazott primerek adatait táblá zatban foglaltuk össze (5. táblázat ). A PCR reakciókat a primerekre jellemzo annealing homérsékletek kivételével azonos módon vittük véghez. A kezdeti 5 perces 94 °C-on végzett denaturációt követoen, a templátot 35 cikluson [94 °C, 15 sec (denaturáció), 58 °C (NKA ? 1, ß1), 66o C (HSP72), 55 oC (GAPDH ) 30 sec (annealing), 72 °C 30 sec (extenzió)] keresztül amplifikáltuk, végül egy 7 percig tartó 72 °C-on történo inkubációval fejeztük be a PCR reakciót.
Gén NKA ? 1 NKA ß1
Annealing Termék ho hossz
Primerek Sense: 5’- aga ttt gag ccg agg cct aac acc -3’
58o C
418 bp
58o C
444 bp
66 o C
327 bp
55o C
496 bp
Antisense: 5’- tcc gcc ctt cac ctc cac cag at -3’ Sense: 5’- gcc ccg cca gga ttg aca c -3’ Antisense: 5’- ctc atc gcg ctt gcc agt g -3’
HSP72
Sense: 5’-cgc cgc tgt cgc tgg gtc tgg ag–3’ Antisense: 5’- ggc ggc cct tgt gtc tgg tga tgg- 3 ’
GAPDH
Sense: 5’- ggt gaa ggt cgg agt caa cg -3’ Antisense: 5’- caa agt tgt cat gga tga cc -3’
5. táblázat. A szemikvantitatív PCR-ek során használt primerek adatai PCR vizsgálatainkat minden esetben kétszer megismételve, pozitív és negatív kontrollok felhasználásával végeztük. A keletkezett terméket ethidium-bromiddal festett 2,5%-os agaróz gélen szeparálva tettük láthatóvá (Invitrogen, Frankfurt, Németország). A termékek várt hosszait 100 bp DNS marker mix (READY-LOAD? , Invitrogen, Frankfurt, Németország) párhuzamos futtatásával kontrolláltuk. A PCR reakciók eredményeit Gel-Pro™ szoftverrel denzitometráltuk és értékeltük.
32
7.6. Western Blot
7.6.1. Minta elokészítés
A Western blot vizsgálatokhoz 100 mg veseszövetet hutött (4°C) lizáló pufferben [10 mM TRIS-HCl (1 M) pH=8,0, 60 mM Hepes, 100 mM NaCl, 0,75 mg/l leupeptin, 1 mM/l EDTA, 1 mM/l EGTA (0,5 M), 0,5 mM PMSF, 0,1 mM dithiotreitol] (Sigma Che mical
Co,
MO,
USA)
Potter
Elvehejm
kézi
homogenizálóval
homogenizáltuk. A teljes szövethomogenizátumból a magfrakciót centrifugáltuk (680 g, 5 min, 4ºC), az így nyert felülúszót (TOT) - 80ºC-on tároltuk.
7.6.2.
Triton X-100 extraktibilitás
Kísérletes körülmények között a NKA iszkémia hatására bekövetkezo kihelyezodése a Triton X-100 extraktibilitással jellemezheto. A detergens hozzáadását követoen egyszeru centrifugálással elválasztható a Triton- inszolubilis citoszkeletális frakció, a sejt Triton-szolubilis egyéb elemeitol. Ez a módszer elfogadott eszköz a posztiszkémiás redisztribúció megítéléséhez [4]. A citoszkeletális (pellet-PEL) és a non-citoszkeletális (szupernatáns-SUP) frakciók elkülönítésére a feljebb leírt extrakciós pufferhez 0,1% Triton X-100-at adtunk. 100 mg veseszövetet homogenizáltunk ebben az oldatban, majd 35 000 x g mellett centrifugáltuk 15 percig, 4ºC-on. A keletkezett Triton- inszolubilus PEL frakciót az extrakciós pufferben reszuszpendáltuk, majd a Triton-szolubilis SUP frakcióval együtt -80ºC-on tároltuk. A minták összfehérje koncentrációját spektrofotometriás módszerrel, Bradford szerint határoztuk meg. A minták fehérjekoncentrációját 1 ? g/? l-re állítottuk be.
33
7.6.3.
Antitestek és kontrollok Primer patkány ellenes anti-NAK ? 1 és ß1 ellenanyagként nyúl poliklonális
ellenanyagot alkalmaztunk (UBI, Lake Placid, N.Y. USA). Az anti-HSP72 poliklonális antitesteket
Dr.
László
Lajos
(ELTE,
Állatszervezettani
tanszék)
bocsátotta
rendelkezésünkre [97]. Másodlagos antitestként a NKA ? 1 és ß1 alegységének detektálásához torma-peroxidázzal konjugált anti- nyúl IgG antitestet (DAKO, Glostrup, Dánia), míg a HSP72 vizsgálatához torma-peroxidázzal konjugált anti-egér IgG antitestet (Sigma Chemical Co, MO, USA) használtunk. Technikai kontrollként az Upstate Biotechnology Western blot pozitív kontrollját (anti-Na,K-ATPase Immunoblotting kit with control, UBI, Lake Placid, N.Y. USA), illetve ismerten NKA ? 1 és ß1, valamint HSP72 pozitív patkány (Wistar) agyszövetet használtunk.
7.6.4. SDS-PAGE
A mintákat 4x minta pufferben (12,5 mM TRIS-HCL, (pH 6,7), 4.0% SDS, 1 mM EDTA, 15% glicerol, 0,01% bromfenolkék) szolubilizáltuk. A mintákból 15-15 ? g összfehérjének megfelelo mennyiséget vittünk fel a 12,5 % SDS-poliakrilamid gélre. Koncentráló gélként 4 %-os SDS-poliakrilamidot használtunk. Mintáink mellett párhuzamosan
molekulasúly
markert
(BenchMarkT M,
Gibco/BRL,
Eggenstein,
Németország) futtattunk. A gélelektroforézist 2 órán keresztül 120 V-on, 20 mA-rel végeztük hutött rendszerben.
7.6.5. Blottolás A fehérjét az SDS-poliakrilamid gélrol nitrocellulóz membránra (Hybond T M ECLT M, AP Biotech, Buckinghamshire, UK) elektroblottoltuk (70 V, 220 mA, 80 perc), TRIS-HCl, glicin és metanol tartalmú standard transzfer pufferben, hutött rendszerben.
34
A fehérjetranszfer sikerességét 1% Ponceau S (Sigma Chemical Co, MO, USA), 25 % ecetsav (Reanal Rt, Budapest, Magyarország) tartalmú festékkeverékkel ellenoriztük.
7.6.6. Immunoblottolás
Az immunoblottoláshoz szükséges ellenanyag koncentrációkat elozetesen dotblot technikával határoztuk meg. A blottmembránt szobahomérsékleten, 1 órán keresztül blokkoló oldatban (5% zsírmentes tejpor, 10% PBS puffer) inkubáltuk. Blokkolás után a membránt mosó oldatban (1% zsírmentes tejpor, 0,1% Tween™20 detergens, 10% PBS puffer) további 1 órán keresztül szobahomérsékleten inkubáltuk az elso specifikus ellenanyaggal (NAK ? 1 1:750, NAK ß1 1:2000, HSP72 1:10000 hígításban). 3 x 10 perc mosást követoen a második, torma-peroxidázzal jelölt ellenanyaggal (1:2000 anti-rabbit IgG illetve 1:5000 anti- mouse IgG hígításban) a membránokat 30 percig inkubáltuk, majd további mosásokkal (3 x 20 perc) távolítottuk el a feleslegben kötött ellenanyagot.
7.6.7. Detektálás
Az immunoreaktív helyek kemolumineszcens szignálját Amersham Pharmacia protokoll szerint ECLplus reagenssel, Hyperfilm ECL™-en filmen (AP Biotech, Buckinghamshire, UK) detektáltuk, majd Gel-Pro™ szoftverrel denzitometráltuk.
7.7. Enzimaktivitás mérése kapcsolt reakcióval
A NKA enzim aktivitását kapcsolt reakcióval TOT fehérjehomogenizátumból határoztuk
meg
Hitachi-712
laboratóriumi
spektrofotométeren.
A
különbözo
csoportokba tartozó mintákat randomizálva mértük le. A készülék 25 ? l mintát mért 200 ? l reakcióelegyhez (100 mM NaCl, 20 mM KCl, 2,5 mM MgCl2 , 0,5 mM EGTA, 50 mM TRIS-HCl (pH 7,4), 1,0 mMl ATP, 1,0 mM foszfoenol-piruvát, 0,16 mM NADH, 5 U/l piruvát-kináz, 12 U/l laktátdehidrogenáz (Sigma Chemical Co., MO, USA). A NKA aktivitás specifikus gátlására
35
300 sec elteltével 5 ? l, 10?mM ouabaint adtunk a reakciótérbe. Az abszorbancia változást 340 nm-en (referencia hullámhossz: 415 nm) monitorizáltuk 40 sec.-ként, 10 percen keresztül. A ouabain bemérése elott, a reakció kezdete utáni 80-280 sec. között a görbe meredeksége az össz-ATPáz aktivitást tükrözi; a két meredekség közötti különbség a NKA aktivitást reprezentálja. Rendszerünkben egy egység ATPáz megfelel 1 mg fehérjetartalmú minta által egy óra alatt lebontott 1 nmol NADH- nak.
7.8.
Restrikciós fragmenthossz polimorfizmus (PCR-RFLP) vizsgálatok
7.8.1. Betegek jellemzése
A HSP72 A(1267)G és HSP73 G(190)C genetikai polimorfizmusok vizsgálatát a Semmelweis Egyetem II. sz. Noi Klinikájának PIC osztályán illetve az I. sz. Gyermekklnikán gondozott, 1500g alatti születési súlyú (VLBW) koraszülöttek fenolketonúria vizsgálat céljára gyujtött szuropapíros vércsepp mintáiból végeztük. A vérmintákat kódoltuk és a genetikai vizsgálatokat végzo személyekhez csak a kódolt, névvel el nem látott minták jutottak. A klinikai adatokat kérdoívek segítségével nyertük (szintén kódolt). A vizsgálatokat a Helsinki deklaráció értelmében, a résztvevok írásos tájékoztatása és beleegyezése után, a Semmelweis Egyetem etikai engedélyével (TUKEB 13/2003) végeztük. Százharminc, 1999. január elseje és június 30-a között született VLBW koraszülöttet (48 fiút és 72 leányt [átlagos gesztációs kor: 29 (24-33) hét; születési súly: 1180 (640–1500) gramm]) vettünk be a vizsgálatba. A betegek klinikai adatait (nem, gesztációs kor, születési súly, kórtörténet) az elso élethónap végéig követtük és az adatokat rendszereztük. Modi és mtsai [53] diagnosztikai kritériumai alapján, 37 VLBW újszülött esetében alakult ki ARF (ARF csoport), a harmadik és nyolcadik életnap között [gesztációs kor: 29 (24-32) hét; születési súly: 1190 (640–1190) gramm], míg 93 betegnél (non-ARF csoport) a vesefunkciók nem károsodtak [gesztációs kor: 29 (25-33) hét; születési súly: 1170 (680–1500) gramm]. Az ARF kialakulására hajlamosító rizikótényezok, mint a súlyos hipotenzió (dobutamin igény >9 ? g/szülsúlykg/min), szepszis, patent ductus arteriosus (PDA), nekrotizáló enterocolitis (NEC) és infant respirációs disztressz szindróma (IRDS) felléptét diagnosztizáltuk.
36
Az ARF-ben szenvedo betegeket, az oliguria megszunéséig furosemiddel (1mg/kg/dózis) és dopaminnal (0,5-2,0 ? g/kg/min) kezelték. Egy gyermek részesült peritoneális dialízisben. Az ARF minden koraszülött esetében 120 órán belül megszunt. A vizsgálatba bevett összes beteg túlélte a tizedik posztnatális napot. Az elso posztnatális hónap során az ARF csoportból öten, a non-ARF csoportból hárman haltak meg szepszis (n=6) vagy intracerebrális vérzés (n=2) miatt. Az ARF egyetlen esetben sem vezetett a beteg halálához. A vizsgálat során egészséges kontroll populációként felhasznált 131 DNS mintát Dr. Tordai Attila (OHII, Budapest) bocsátotta rendelkezésünkre az intézet egészséges véradó DNS-bankjából (nemek eloszlása 50-50 %, átlagéletkor: 58, 5 ± 11,3 év). 7.8.2. DNS izolálás és genotipizálás
Az ötödik postnatalis napon, az orális táplálás megkezdésekor, a rutin vizsgálatok céljára szuropapírra vett vérbol standard fenol-kloroformos extrakcióval genomiális DNS-t vontunk ki [51]. A HSP72 A(1267)G genetikai polimorfizmus detektálásához a DNS mintákat 61ºC annealing homérsékleten (38 ciklus) amplifikáltuk a következo primerekkel: sense 5’acc ctg gag ccc gtg gag aa-3’ és antisense: 5’-cac ccg ccc gcc ccg tag g-3’, majd a keletkezett 189 bp nagyságú terméket Pst I (Sigma Chemical Co, USA) restrikciós endonukleáz enzimmel emésztettük. (5/A ábra) A HSP73 G(190)C genetikai polimorfizmus vizsgálatához sense: 5’-cga cct ggg cac cac cta ctc c-3’ és antisense: 5’-aat cag gcg ctt cgc gtc aaa c-3’ primereket használtunk, 61ºC annealing homérsékleten (38 ciklus). A 196 bp nagyságú DNS terméket BsrBI (Sigma Chemical Co, USA) restrikciós endonukleáz enzimmel hasítottuk. (5/B ábra) A keletkezett termékeket ethidium bromiddal festett 3%-os agaróz gélen, 100 bp DNS marker mix READY-LOAD?
(Invitrogen, Frankfurt, Németország) párhuzamos
futtatásával detektáltuk.
37
7. 9.
Statisztikai analízis Az adatokat átlag ? SEM (átlag szórása) illetve átlagérték ? SD (standard szórás)
értékként adtuk meg. Statisztikailag szignifikánsnak a P<0.05 értéket tekintettük. A statisztikai elemzést a STATISTICA.6 szoftverrel (StatSoft® Inc., USA) végeztük. Az állatkísérletes vizsgálatok során az állatok túlélésének statisztikai elemzéséhez Kaplan-Mayer analízist (Log-rank test) használtunk. A hisztológiai eredményeket Kruskal-Wallis és Dunns féle post-hoc teszttel hasonlítottuk össze. Két csoport összehasonlítására kétmintás t-próbát alkalmaztunk. A különbözo csoportok RT-PCR, Western blot és enzimaktivitás eredményeinek összehasonlításához ANOVA tesztet használtunk Newman-Keul post- hoc teszttel kiegészítve. Klinikai vizsgálataink során a születési súly és a gesztációs kor adatainak elemzését Mann-Whitney U teszttel végeztük, az allél és genotípus frekvenciákat ? 2 teszttel és Fisher exact teszttel illetve bináris logisztikus regresszió analízissel értékeltük. A haplotípus analíziseket, a linkeage-disequilibrium tesztet, és a Hardy-Weinberg egyensúly vizsgálatát ArlequinT M (http://anthropologie.unige.ch/arlequin/ szoftverrel végeztük. A. ra
B. A.
1 1 22
3
4
5
6
7
B.
196 bp 118 bp 78 bp
5. ábra. A HSP72 (A) és HSP73 (B) gének PCR-RFLP analízise A DNS molsúlymarkert a 7 (A) ill. 1 (B) számú oszlop jelzi, az oszlop mellett jelöltük a marker fragmenseinek nagyságát. A hasítási termékhosszakat a bal (A) ill. jobb (B) oldalon ábrázoltuk. A HSP72 esetében a 3, 6 oszlop jelöli a homozigóta vad 1267AA , az 1, 2, 4
38
oszlop a heterozigóta 1267AG, míg az 5 oszlop a homozigóta mutáns1267GG genotípust. A HSP73 gén esetében a 2 oszlop ábrázolja a heterozigóta 190GC genotípust, míg a többi oszlop a homozigóta mutáns 190GG genotípust jelöli.
39
8. EREDMÉNYEK
8. 1.
Nemi különbségek renális I/R károsodást követoen a vese érzékenységében
8.1.1. Hím és nostény ivarérett, ivaréretlen és kasztrált állatok túlélésének vizsgálata
Az uninefrektomizált, ivarérett hím patkányok csoportjában a renális erek 50 percig tartó leszorítása 92%-os mortalitással járó súlyos ARF-hez vezetett. Tizenkét hímbol 11 elpusztult az iszkémiás beavatkozást követo negyedik napig. Nostények esetében ezzel szemben mindössze 3 állat pusztult el, az I/R károsodás mortalitása itt csak 25% volt (6/A. ábra).
6/A ábra. Ivarérett hím (folyamatos vonal, n=12) és nostény (pontozott vonal, n=12) patkányok túlélése 50 perces renális I/R károsodást követoen 100% az adott csoportban az iszkémia elott az állatok száma. (* P <0,05 vs. nostények)
A gonadektomia és az ivaréretlen állapot jelentosen javította a hím állatok túlélését. A beavatkozást követo hetedik napon szignifikáns különbség mutatkozott a kasztrált és az ivaréretlen versus ivarérett állatok esetében (70%, 60% vs. 7%; * P<0,05) (6/B. ábra). Az ivarérett hím állatok ösztradiollal történo kezelése bár szignifikánsan csökkentette az iszkémiás károsodás súlyosságát a kezeletlenekhez képest, mégis ezek az állatok nagy része elpusztult a beavatkozást követo héten.
40
100 90 kasztrált (n=12)
%
80 70
*
60
*
ivaréretlen (n=12)
50 40
ösztradiolkezelt (n=8)
30 20
*
ivarérett (n=12)
10 0 0
1
2
3
4
5
6
7
napok
6/B ábra. A kasztrált hím (szaggatott vonal, n=12), az ivaréretlen hím (apró pontos vonal, n=12) és az ösztradiol kezelt hím (pontozott vonal, n=12) állatok túlélése renális I/R károsodást követoen. A folyamatos vonal jelzi az ivarérett hím állatokat (n=12). 100% az adott csoportban az iszkémia elott az állatok száma. (* P <0,05 vs. ivarérett hím)
Nostények esetében sem az ovariektómia, sem az ivaréretlenség nem módosította szignifikánsan a túlélést (75%, 60% vs. 75%) (6/C ábra), habár az ovariektomizált állatoknál kisfokú csökkenést észleltünk a túlélésben. Érdekes módon az ivarérett nostények tesztoszteron kezelése egyáltalán nem befolyásolta a túlélést az iszkémiás inzultust követoen. Ez alapján feltételezheto, hogy nem a tesztoszteron, hanem más androgén hormon(ok) felelosek az ivaréretlen, kasztrált és ivarérett hím állatok túlélésében észlelt különbségért.
41
100 90
ivarérett (n=12)
80 70
tesztoszteronkezelt (n=12)
%
60 50
ovariektomizált (n=12
40 30
ivaréretlen (n=12)
20 10 0 0
1
2
3
4
5
6
7
napok
6/C ábra. Az ovariektomizált nostény (szaggatott vonal, n=12), az ivaréretlen nostény (apró pontos vonal, n=12) és a tesztoszteron kezelt nostény (pontozott vonal) állatok túlélésé renális I/R károsodást követoen. A folyamatos vonal jelzi az ivarérett nostény állatokat (n=12). 100% az adott csoportban az iszkémia elott az állatok száma (* P <0,05 vs. ivarérett nostények) 8.1.2. Hím és nostény ivarérett állatok hemodinamikai paramétereinek változása renális I/R károsodás elott és a reperfúzió elso 2 órájában Az uninefrektomizált, ivarérett hím és nostény állatoknál az iszkémiát megelozoen és az 50 perces iszkémiás periódus alatt mind a szisztémás (MAP, CO, TPR, HR), mind a renális (RBF, RVR) hemodinamikai paraméterek azonosak voltak. A reperfúziós fázisban a nostény állatok RBF-je gyorsan emelkedni kezdett azonnal visszatért és késobb meghaladta az iszkémia elott mért szintet. Ezzel szemben hímekben már az iszkémia elott is szignifikánsan alacsonyabb RBF értékeket detektáltunk és a leszorítás megszuntetését követoen a vesevéráramlás csak 10 perc elteltével tért vissza az eredeti szintre (7/A ábra). Az RBF értékekben észlelt különbségeket az eltéro renális vazokonstrikció magyarázza; míg a hímekben az RVR jelentosen emelkedett a nyugalmi értékhez képest, addig nostényekben változatlan maradt (7/B. ábra).
42
* * *
* * *
* *
7/A ábra. Ivarérett nostény (szaggatott vonal, n= 6) és hím (folyamatos vonal n=6) állatok vesevéráramlásának (RBF) változása az 50 perces iszkémia elott, alatt és után. (* P <0,05 vs. nostények)
** **
7/B ábra. Ivarérett nostény (szaggatott vonal, n= 6) és hím (folyamatos vonal n=6) állatok renális érellenállásának (RVR) változása az 50 perces iszkémia elott, alatt és után. (* P <0,05 vs. nostények)
43
Az iszkémia után a szisztémás hemodinamikai paraméterekben is nemi különbségek mutatkoztak. A MAP értéke a nostények esetében szignifikánsan magasabb volt (7/C. ábra). Az emelkedést valószínuleg szisztémás vazokonstrikció okozta, mivel a CO és a HR nem különbözött a két csoport között és értékük a megfigyelés alatt nem változott. A kísérlet alatt a hematokrit értékek állandóak maradtak (45% a hímeknél és 44% a nostényeknél).
** * * *
7/C ábra. Ivarérett nostény (szaggatott vonal, n= 6) és hím (folyamatos vonal n=6) artériás középnyomásának (MAP) változása az 50 perces iszkémia elott, alatt és után. (* P <0,05 vs. nostények) 8.1.3. Hím és nostény ivarérett állatok veséinek hisztológiai analízise renális I/R károsodás elott és 5 perccel illetve 2 órával az ischémizálás után Az uninefrektomizált kontroll állatokból vett minta normális szöveti struktúrát mutatott hímekben és nostényekben egyaránt. Öt perccel az 50 perces iszkémiát követoen sem alakult ki szignifikáns eltérés a nemek közt (károsodás mértéke: nostények: 0,6 ± 0,4 vs. hímek: 0,4 ± 0,3). Az iszkémia után 2 órával mindkét csoportban hialin lerakódással, magatípiával és tubulussejt vakuolizációval járó enyhe tubuláris károsodás alakult ki, mely hímeknél súlyosabb fokú volt, de az eltérés nem volt szignifikáns. Szignifikáns különbség mutatkozott viszont a leukocita-infiltrációban
44
és a tubulussejt-feloldódásban. Glomeruláris károsodást egyik csoportban sem észleltünk. A részletes hisztológiai értékelést a 6. táblázat mutatja.
Csopo rt
Nem
Leukocitainfiltráció
Magatípia (score)
Tubulussejthiány (score)
Hialinlerakódás
(score)
kontroll 5 perc 2 óra
H N H N H N
0,0? 0,0 0,0? 0,0 0,5? 0,15 0,3? 0,15 0,9? 0,16* 0,5? 0,15 Tubulussejtvakuolizáció
H N H N H N
0,0? 0,0 0,0? 0,0 0,2? 0,05 0,1? 0,01 1,1? 0,4 0,8? 0,26
(score)
0,10? 0,05 0,0? 0,0 0,4? 0,2 0,2? 0,15 1,5? 0,26 1,2? 0,24 Tubulussejthialinizáció
(score)
kontroll 5 perc 2 óra
(score)
0,0? 0,0 0,0? 0,0 0,1? 0,1 0,0? 0,0 0,8? 0,2 0,6? 0,2
0,0? 0,0 0,10? 0,10 0,0? 0,0 0,0? 0,0 0,1? 0,05 0,05? 0,05 0,05? 0,05 0,0? 0,0 0,9? 0,3 0,75? 0,25 0,6? 0,2 0,5? 0,2 Tubulussejt- Tubulussejtfeloldódás leválás (score)
0,0? 0,0 0,0? 0,0 0,0? 0,0 0,0? 0,0 0,8? 0,2* 0,2? 0,1
(score)
0,0? 0,0 0,0? 0,0 0,6? 0,16 0,4? 0,2 1,6? 0,24 1,3? 0,3
6. táblázat. A vesekárosodás mértékének hisztológiai kiértékelése nostény (N) és hím (H) állatokban renális iszkémia elott és után (* P <0,05 vs. nostények).
8.2.
Nemi különbségek a szérum BUN, CN, nátrium és kálium értékekben
renális I/R károsodást követoen A kontroll nostény és hím állatok BUN és szérum CN értékei nem különböztek. Az iszkémiás inzultust 2 órával és 16 órával követoen nostényekben szignifikánsan alacsonyabb BUN és CN értékeket detektáltunk, mint hímekben. (T2: BUN: 7,5 ? 0,7 vs. 10,2 ? 1,0, CN: 85 ? 5 vs, 107 ? 7; P<0,05 ; T16: BUN: 27,2 ? 3,6 vs, 37,2 ? 8,1; CN: 228 ? 7 vs, 276 ? 8; P<0,05), (8/A, B ábra). A kontroll állatokban nem találtunk különbséget a szérum nátrium és kálium értékek között, de a posztiszkémiás idoszakban T2 és T16 idopontokban a szérum kálium szignifikánsan magasabb volt a hímekben, mint a nostényekben (P<0,05) (7. táblázat). A renális erek 55 percre történo leszorítása mindkét nemben ARF kialakulásához vezetett, amit a szérum BUN, CN és kálium értékeinek szignifikáns emelkedése is jelzett (kontroll vs. T2 és T2 vs. T16, P<0,01).
45
A. Szérum BUN (mmol/L)
100.00 80.00 60.00
*
hím (n=6)
40.00 20.00
nostény (n=6)
+§ +§
*§
§
0.00 kontroll
T2
T16
8.A ábra. Ivarérett nostény és hím állatok szérum urea nitrogén (BUN) értékeinek változása renális iszkémia elott (kontroll, n=6) valamint 2 (T2, n=6) és 16 órával (T16, n=6) az iszkémia után. * P <0,05 vs. nostények, + P < 0,05 vs. T2; § P < 0,05 vs. T16
B. *
Szérum CN (mmol/L)
400.0
300.0
nostény (n=6)
200.0
100.0
+§ +§
hím (n=6)
*§
§
0.0 kontroll
T2
T16
8.B ábra. Ivarérett nostény és hím állatok szérum kreatinin (CN) értékeinek változása renális iszkémia elott (kontroll, n=6) valamint 2 (T2, n=6) és 16 órával (T16, n=6) az iszkémia után. * P <0,05 vs. nostények, + P < 0,05 vs. T2; § P < 0,05 vs. T16
46
Csoportok
kontroll
T2
T16
szérum nátrium
szérum kálium
(mmol/L)
(mmol/L)
N
140 ? 4 §
4.1 ? 0.4 +§
H
144 ? 2 §
4.7 ? 0.1 +§
N
138 ? 1§
5.1 ? 0.5
H
141 ? 3 §
5.2 ? 0.6 * §
N
133 ? 3
5.3 ? 0.4
H
134 ? 4
7.0 ? 0.9 *
7. táblázat. Ivarérett nostény (N) és hím (H) állatok szérum nátrium és kálium értékeinek változása a renális iszkémia elott (kontroll, n=6) valamint 2 (T2, n=6) és 16 órával (T16, n=6) az iszkémia után. * P < 0,05 vs.nostények,
+
P < 0,05 vs. T2; § P
< 0,05 vs. T16 8.3.
Nemi különbségek a NKA muködésében renális I/R károsodást követoen
8.3.1. Nemi különbségek a szövettani károsodás mértékében renális I/R károsodás elott és 2 illetve 16 órával az ischémizálás után A posztiszkémiás ARF súlyosságának megítélésére a PAS-sal festett veseminták hisztológiai változásait értékeltük. A szövettani vizsgálat az uninefrektomizált kontroll állatokban, nostényekben és hímekben egyaránt egészséges vese struktúrát mutatott. T2 idopontban nem volt szignifikáns nemi különbség a vizsgált hisztológiai paraméterekben (tubuláris nekrózis: nostény: 1,0 (1-1) vs. hím: 1,0 (1-2); tubulussejt feloldódás: nostény: 1,0 (1-1) vs. hím: 1,0 (1-1), perivaszk uláris leukocita infiltráció: nostény: 1,0 (1-2) vs. hím: 1,0 (1-1)). T16-ban nostényekben a tubuláris nekrózis és a tubulussejt feloldódás mértéke kevésbé volt kifejezett, mint hímekben (tubuláris nekrózis: nostény: 2,5 (2-4) vs. hím: 4,0 (4-4); tubulussejt feloldódás nostény: 3,0 (1-4) vs. hím: 4,0 (4-4); P < 0.05). A perivaszkuláris leukocita infiltrációban nem volt jelentos nemi különbség (T16: nostény: 2,0 (1-2) vs. hím: 2,0 (2-3)).
47
A. N
B. H
C. N
D. H
9. Ábra. Ivarérett nostény (N) és hím (H) állatok posztiszkémiás veséjének szövettani képe. Nostény és hím állatok PAS-sal festett veséjének hisztopatológiai analízise renális iszkémia után 2 (A, B) és 16 órával (C, D).
A renális erek 55 percig tartó leszorítása mindkét nemben a veseszövet szignifikáns károsodását eredményezte, melyet a hisztológiai paraméterek (tubuláris nekrózis, tubulussejt feloldódás, perivaszkuláris leukocita infiltráció) változása is tükröz (kontroll vs. T2, és T2 vs. T16; P < 0,05). Glomeruláris károsodást, intersticiális ödémát, illetve intersticiális limfocita infiltrációt egyik csoport szövetmintáiban sem észleltünk.
48
8.3.2. Nemi különbségek a NKA ? ? ?és ß1 alegységének mRNS expressziójában renális I/R károsodást követoen A NKA ? ? ?és ß1 alegység és a GAPDH mRNS expresszióját RT-PCR technikával határoztuk meg kontroll, illetve az iszkémia után T2 és T16 idopontban leölt nostény és hím állatok veseszövetmintáiban (10. ábra). A NKA ? ? alegységének mRNS expressziójában szignifikáns nemi különbséget észleltünk már a kontroll állatokban is. A kontroll nostényekben az ? ? alegység mRNS expressziója közel kétszerese volt a hímekének (kontroll: nostény vs. hím: P < 0,05). T2 idopontban a különbség még kifejezettebb volt, a nostények NKA ? ? mRNS expressziója háromszorosa volt a hímekben mértnek és a szignifikáns nemi különbség még T16-ban is kimutatható maradt (T2 és T16: nostény vs. hím: P < 0,05). Habár T2 idopontban az ? ?alegység mRNS expressziója mindkét nemben jelentosen csökkent a kontroll állatokhoz képest, nostényekben a csökkenés mértéke fele volt a hímekben észleltnek (nostény vs. hím: P < 0,05; kontroll vs. T2: P < 0,05, nostényben és hímben egyaránt ). Az átmeneti csökkenést követoen T16-ban mindkét nemben az ? ?alegység mRNS szintjének növekedését észleltük (T2 vs. T16 P < 0.05, nostényben és hímben egyaránt) (10/A ábra). A NKA ß1 alegység mRNS expressziójának változása az ? ? ?alegységtol eltéro dinamikát mutatott. A ß1 mRNS expressziója az iszkémiás inzultust követoen folyamatosan csökkent a T16 idopontig és egyik idopontban sem észleltünk szignifikáns nemi különbséget
(kontroll vs. T2: P<0,05; T2 vs. T16: P<0,05, nostényekben és
hímekben egyaránt) (10/B ábra).
49
10. Ábra N
H
N
H
N
H
? 1 alegység
418 bp
ß1 alegység
444 bp
GAPDH
496 bp kontroll
T2
T16
? 1/GAPDH arány
2.00
1.50
A. *+§
nostény (n=6) hím (n=6)
+ *
1.00 * §
0.50
0.00 kontroll
T2
T16
2.00
B.
ß1/GAPDH arány
+§
+§
1.50 nostény (n=6) hím (n=6)
§
1.00 §
0.50 0.00 kontroll
T2
T16
10. ábra. A renális I/R károsodás hatása a NKA ? 1 (A) és ß1 (B) mRNS expresszióra patkány veseszövetében. A NKA ? 1 és ß1 alegységének mRNS expresszióját nostény (N ?) és hím (H ¦ ) állatokban renális iszkémia elott (kontroll,
50
n=6), valamint 2 (T2, n=6) és 16 órával (T16, n =6) az iszkémia után mértük. Felso kép: A NKA ? 1 és ß1alegység illetve a GAPDH RT-PCR analízis reprezentatív képe. Alsó kép: A NKA ? 1, illetve ß1 mRNS GAPDH mRNS-re vontatkoztatott relatív jelintenzitása. Az adatok átlag ? SD értékeket jelölnek.
*
P < 0,05 vs. H;
+
P < 0,05 vs.
T2; § P < 0,05 vs. T16.
8.3.3. Nemi
különbségek
a
NKA
? ? ? alegység fehérje expressziójában és
lokalizációjában renális I/R károsodást követoen Az NKA protein mennyiség I/R károsodás okozta változásának, illetve nemi különbségeinek vizsgálatára Western blot analízist végeztünk. A NKA ? 1, illetve ß1 alegységek protein szintjét TOT veseszövet homogenizátumban határoztuk meg. A celluláris lokalizáció megítélésére a Triton X-100 extrakcióval elválasztott Tritonszolubilis (SUP) és Triton-inszolubilis (PEL) frakciókban mértük az egyes alegységek fehérjeszintjét.
TOT-? 1: A TOT veseszövet homogenizátumban a kontroll csoportok között nem volt nemi különbség NKA ? 1 alegység protein mennyiségében. T2 és T16 idopontban a NKA ? 1 fehérje szintje szignifikánsan magasabb volt nostényekben, mint hímekben (N vs. H: P< 0,05). A két nemben különbözo volt a NKA ? 1 alegység fehérjeszint változás dinamikája a reperfúzió folyamata során. Míg nostényekben a fehérjeszint lényegében változatlan maradt a vizsgált periódusban, addig hímekben, T2 idoponthoz képest, T16ban jelentos csökkenést tapasztaltunk (P< 0,05 vs. T16) (11/A ábra). Triton inszolubilis PEL- ? 1: A PEL frakcióban a TOT homogenizátumhoz hasonló változásokat észleltünk. A kontroll csoportok között nem volt nemi különbség a katalitikus aktivitásért felelos, bazális membránhoz kötött NKA ? 1 alegységének fehérje szintjében, de T2 és T16 idopontokban nostényekben magasabb fehérjeszintet detektáltunk (N vs. H: P < 0,05). A TOT frakcióhoz hasonlóan a NKA ? 1 protein szintje nostényekben nem változott a vizsgált periódus során, míg hímekben szignifikánsan csökkent (T0 vs. T16, P < 0,05) (11/B ábra).
51
Triton szolubilis SUP- ? 1: A SUP frakcióban nem volt nemi különbség a kontroll és a T2 csoportok között. T16-ban azonban a NKA ? 1 alegység protein szintje alacsonyabb volt a nostényekben, mint a hímekben. (N vs. H: P < 0,05). Míg nostényekben a vizsgált periódusban nem változott számottevo mértékben az ? 1 alegység protein szintje, addíg hímeknél T16-ban szignifikáns emelkedést tapasztaltunk, vagyis több fehérje került (inaktív) szolubilis állapotba. (T2 vs. T16; P < 0,05) (11/C ábra).
52
11. Ábra N
H
N
H
N
H
112 kDa
TOT PEL
SUP
kontroll
T2 *
2.00
? 1 TOT relatív denzitás
T16
A.
1.50
§
*
nostény (n=6) hím (n=6)
§ 1.00
0.50
0.00
kontroll control
T2
B.
*
2.00 ? 1 PEL relatív denzitás
T16
§
*
1.50
nostény (n=6) hím (n=6)
1.00
0.50
0.00 kontroll
T2
T16
? 1 SUP relatív denzitás
1.00
C.
nostény (n=6) hím (n=6)
0.50
§
*
0.00 kontroll
T2
53
T16
11. ábra. A renális I/R károsodás hatása a NKA ? 1 alegység fehérje expressziójára és celluláris megoszlására patkány veseszövetében. A NKA ? 1 alegységének expresszióját nostény (N
?) és hím (H ¦ ) patkányok
teljes veseszövet
homogenizátumában (TOT), Triton- inszolubilis pellet (PEL) és Triton-szolubilis szupernatáns (SUP) frakciókban határoztuk meg kontroll állatokban (n=6) illetve 2 óraval (T2, n=6) és 16 órával (T16, n=6) az iszkémiát követoen. Felso kép: A NKA ? 1 alegység Western blot vizsgálat reprezentatív képe a TOT (A), PEL (B) és SUP (C) frakciókban. Alsó kép: A Western blot képeket denzitometriásan belso standardra vonatkoztatva értékeltük. Az adatok átlag ? SD értékeket jelölnek. * P < 0.05 vs. M; § P < 0.05 vs. T16.
8.3.4. Nemi
különbségek
a
NKA
ß?? alegység fehérje expressziójában és
lokalizációjában renális I/R károsodást követoen A NKA ß1 alegység protein expressziója az egyes frakciókban az ? 1-tol eltéroen változott. TOT-ß1: T2 idopontban a NAK ß1 protein szintje a kontroll csoportokhoz képest csökkent, nostényekben és hímekben egyaránt (kontroll vs. T2: P < 0.05). Ezt követoen T16-ban a ß1 alegység fehérje szintje visszatért a kiindulási szintre (P < 0.05 T2 vs. T16, N és H egyaránt). Nemi különbséget a vizsgált idopontok egyikében sem láttunk (12/A ábra). Triton inszolubilis PEL és Triton szolubilis SUP-ß1: A ß1 protein szintjei nem változtak szignifikánsan a vizsgált periódusban, bár tendenciájukat tekintve korreláltak a TOT frakció változásaival. Nemi különbséget nem észleltünk egyik csoportban sem (12/B-C ábra).
54
12. Ábra F
M
F
M
F
M
53 kDa
TOT
PEL
SUP
kontroll
T2
T16 A.
ß1 TOT relatív denzitás
2.00
1.50
1.00
+ +
nostény (n=6)
§
hím (n=6) §
0.50
0.00 kontroll
T2
T16
B.
ß1 PEL relatív denzitás
2.00
1.50 nostény (n=6) hím (n=6) 1.00
0.50
0.00 kontroll
T2
T16
C.
ß1 SUP relatív denzitás
1.00
nostény (n=6) 0.50
hím (n=6)
0.00 kontroll
T2
55
T16
12. ábra. A renális I/R károsodás hatása a NKA ß1 alegység fehérje mennyiségére és celluláris megoszlására patkány veseszövetében. A NKA ß1 alegységének expresszióját nostény (N
?) és hím (H ¦ ) patkányok
teljes veseszövet
homogenizátumában (TOT), Triton- inszolubilis pellet (PEL) és Triton-szolubilis szupernatáns (SUP) frakciókban határoztuk meg kontroll állatokban (n=6) illetve 2 óraval (T2, n=6) és 16 órával (T16, n=6) az iszkémiát követoen. Felso kép: A NKA ß1 alegység Western blot vizsgálat reprezentatív képei a TOT (A), PEL (B) és SUP (C) frakciókban. Alsó kép: A Western blot képeket denzitometriásan belso standardra vonatkoztatva értékeltük. Az adatok átlag ? SD értékeket jelölnek.
*
P < 0,05 vs. M; § P
< 0,05 vs. T16. 8.3.5. Nemi különbségek a NKA enzimaktivitásában A NKA enzimaktivitásának változása követte az ? 1 alegység TOT és PEL frakciókban észlelt fe hérjeszint változásokat. A kontroll csoportok között nem volt nemi különbség az ionpumpa aktivitásában. T2 idopontban nostényekben szignifikánsan nagyobb enzimaktivitást detektáltunk, mint hímekben (N vs. H: 14,9 ? 2,3 vs. 9,15 ? 2,21 U; P < 0,05). Az enzimaktivitásban észlelt nemi különbség T16 idopontban is fennállt (N vs. H: 11,7 ? 4,1 vs. 5,65 ? 2,3 U; P < 0,05). A két nemben eltért az enzimaktivitás változásának dinamikája is: míg nostényekben nem volt szignifikáns változás az ionpumpa aktivitásában, addig hímekben a vizsgált periódus alatt a pumpafunkció folyamatos csökkenését tapasztaltuk (kontroll vs. T2 vs. T16: 15,89 ? 8,0 U vs. 9,15 ? 2,21 U vs. 5,65 ? 3,0; P < 0,05) (13. ábra).
56
13. Ábra 35.0 *§
mmolATP/mgprotein/óra
30.0 25.0
§
§
+
20.0
*
nostény (n=6) hím (n=6)
15.0 10.0 5.0 0.0 kontroll
T2
T16
13. ábra. A renális I/R károsodás hatása a NKA enzimaktivitására patkány teljes veseszövet homogenizátumában. A NKA aktivitást nostény (N ?) és hím (H ¦ ) patkányok TOT veseszövet homogenizátumában határoztuk meg kontroll állatokban (n=6), illetve 2 óraval (T2, n=6) és 16 órával (T16, n=6) az iszkémiát követoen. Az adatok átlag ? SD értékeket jelölnek. * P < 0,05 vs. H; + P < 0,05 vs. T2; § P < 0,05 vs. T16.
57
8.4.
Nemi különbségek a HSP72 expressziójában renális I/R károsodást követoen
8.4.1. Nemi különbségek a HSP72 mRNS expressziójában A HSP72 és a GAPDH mRNS expressziójának arányát kontroll, illetve az iszkémia után T2, T16, és T24 idopontban leölt nostény és hím állatok veseszövetmintáiban vizsgáltuk (14. ábra).
N
H
N
H
N
H
N
H
HSP72
327 bp
GAPDH
496 bp kontroll
T2
T16
T24
1.5
HSP72/GAPDH arány
*
*
*+§ x
*
1
nostény (n=6)
x
hím (n=6)
0.5
0 kontroll
T2
T16
T24
14. ábra. A renális I/R károsodás hatása a HSP72 mRNS expressziójára patkány veseszövetében. A HSP72 mRNS expresszióját nostény (N ?) és hím (H ¦ ) állatokban a renális iszkémia elott (kontroll, n=6) valamint 2 (T2, n=6), 16 (T16, n=6) és 24 (T24, n=6) órával az iszkémia után mértük. Felso kép: A HSP72 és a GAPDH RT-PCR eredményének reprezentatív képe. Alsó kép: A HSP72 mRNS GAPDH mRNSre vontatkoztatott relatív jelintenzitása. Az adatok átlag ? SD értékeket jelölnek. * P < 0,05 vs. H; + P < 0,05 vs. T2, § P < 0,05 vs. T16; x P < 0,05 vs. T24
58
A HSP72 mRNS expressziója nostényekben szignifikánsan magasabb volt, mint hímekben már a kontroll csoportokban is (P< 0,05). Ez a nemi különbség az iszkémiát követo reperfúzió alatt is végig megmaradt (P< 0,05). Míg nostényekben az iszkémiát követoen a HSP72 mRNS expresszió szignifikáns mértékben növekedett (kontroll vs. T2: P<0.05), addig hímeknél ez az expresszióváltozás kisebb mértéku volt. Hímekben a HSP72 mRNS szintje csak 24 órával az iszkémia után érte el a kontroll nostényekben mért szintet.
8.4.2. Nemi különbségek a HSP72 fehérje mennyiségében A HSP72 fehérje mennyiségi változása hasonló volt az mRNS expresszióban észlelt vá ltozásokkal (15. ábra). N
H
N
H
N
H
N
H 70 kDa
HSP72 relatív denzitás
2.5
*
*
*
2.0 *+§x
1.5
nostény (n=6)
§x 1.0
hím (n=6)
0.5 0.0 kontroll
T2
T16
T24
15. ábra. A renális I/R károsodás hatása HSP72 fehérje mennyiségére patkány veseszövetében. A HSP72 fehérje mennyiségét nostény (N ?) és hím (H ¦ ) állatokban 55 perces iszkémia elott (kontroll, n=6) 2 (T2, n=6), 16 (T16, n=6) és 24 (T24, n=6) órával az iszkémia után mértük . Felso kép: A HSP72 Western blot vizsgálat reprezentatív képe. Alsó kép: A Western blot képeket denzitometriásan belso standardra
59
vonatkoztatva értékeltük. Az adatok átlag ? SD értékeket jelölnek. * P < 0,05 vs. H; + P < 0,05 vs. T2, § P < 0,05 vs. T16; x P < 0,05 vs. T24.
A HSP72 protein mennyisége szignifikánsan magasabb volt nostényekben, mint hímekben már a kontroll állatokban és a vizsgált (T2, T16, T24) idopontok mindegyikében (P<0.05 N vs. H). Az mRNS-hez hasonlóan az iszkémiás inzultust nostényekben jelentos HSP72 szint emelkedés követte, mely már T2-ben elérte maximumát (P<0.05 vs. kontroll). Hímekben az emelkedés üteme lassabb volt és kisebb mértéku, csak T16-ra érte el a kontroll nostényekben mért kiindulási értéket.
60
8.5.
A HSP70 genetikai polimorfizmusok szerepe ARF-ben szenvedo VLBW koraszülöttekben
8.5.1. A HSP72 A1267G és HSP73 G190C polimorfizmusainak gyakorisága VLBW koraszülöttekben
Az egyes genotípusok eloszlását a 8. táblázat mutatja. A HSP73 G(190)C és a HSP72 A(1267)G allél frekvenciák elofordulása között kapcsoltság nem volt. A HardyWeinberg equilibrium feltétel a HSP73 G(190)C polimorfizmus esetében mindegyik csoportban igaz volt. Ezzel szemben a HSP72 A(1267)G polimorfizmus esetében a feltétel nem teljesült sem az egészséges kontroll populációban, sem a VLBW koraszülöttek között (P <0,001).
HSP 72 A(1267)G
HSP73 G(190)C
Vizsgálati csoportok
N
AA
AG
GG
GG
GC
CC
Egészséges kontrollok
131
25
93
13
3
35
93
(19%)
(71%)
(10%)
(2%)
(27%)
(71%)
130
9*
87
34*
3
37
90
összes VLWB koraszülöttek
(2%)
(28%)
(70%)
ARF-ben szenvedo VLWB
37
*
koraszülöttek Non-ARF VLWB koraszülöttek
93
*
(6%)
(67%)
(27%)
2
19
16 **
0
12
25
(5%)
(51%)
(43%)**
(0%)
(32%)
(68%)
7
68
18
3
22
68
(7%)
(73%)
(19%)
(3%)
(24%)
(73%)
8. táblázat. A HSP 72 A(1267)G és HSP73 G(190)C genetikai polimorfizmusok gyakorisága ARF-ben szenvedo és non ARF-es VLBW koraszülöttekben az egészséges kontroll populációval összehasonlítva. * P <0,05 vs. egészséges kontrollok; **
P < 0,05 vs. non-ARF-es VLBW koraszülöttek
A HSP73 G(190)C allél frekvenciája nem különbözött az ARF-ben szenvedo és a non-ARF-es VLBW koraszülött csoport között. A HSP72 (1267)G allél gyakrabban fordult elo a VLBW csoportban, mint az egészséges kontroll populációban (P = 0,01). A HSP72 (1267)GG genotípus a VLBW
61
koraszülött csoportokban frekventáltabb volt az ARF-ben szenvedo betegekben (OR:3,17, [95% konfidencia intervallum: 1,34-7,45] P<0,01). Az ARF idobeni fennállása egyik HSP72 allél variációval sem függött össze.
8.5.2. Koraszülöttségre hajlamosító rizikófaktorok és a HSP70 polimorfizmusok összefüggései
A HSP73 G(190)C genetikai polimorfizmus egyik genotípus variációja sincs összegfüggésben a koraszülöttségre hajlamosító perinatális komplikációkkal. A HSP72 (1267)GG genotípus és az ARF kialakulása közötti összefüggés más hajlamosító rizikófaktoroktól (szepszis, PDA, NEC, súlyos hipotenzió és IRDS) függetlenül is szignifikáns maradt (P=0,05) (9. táblázat).
Csoport
N
HSP72
HSP72
HSP72
(1267)AA
(1267)AG
(1267)GG
összes VLBW koraszülött
130
9
87
34
ARF
37
2
19
16
ARF kialakulására hajlamosító tényezok Súlyos hipotenzió
39
4
27
8
NEC
43
1
35
7
Korai szepszis
32
2
21
9
IRDS
58
4
33
21*
PDA
46
3
30
13
9. táblázat. Perinatális szövodmények és HSP72 A (1267)G allél frekvenciák VLBW
koraszülöttekben
*
P<0,05
vs.
nem
(1267)AA
genotípusú
VLBW
koraszülöttek
A logisztikus regresszió analízissel kimutattuk, hogy a HSP72 (1267)GG genotípus mellett, a PDA és a korán kialakuló szepszis egymástól függetlenül hajlamosítanak ARF kialakulására (P=0,02, P=0,05, P=0,001)
62
Az ARF mellett, az IRDS kialakulása is gyakoribb volt a HSP72 (1267)GG genotípust hordozó VLBW koraszülöttekben (P<0,05).
63
9. EREDMÉNYEK MEGBESZÉLÉSE, KÖVETKEZTETÉSEK
9.1.
Nemi különbségek a renális I/R károsodást követo túlélésben és a vese
érzékenységében
Mind klinikai, mind állatkísérletes megfigyelések szerint nemi különbség mutatható ki egyes szervek, mint az agy, a szív vagy a bél iszkémiás érzékenységében [61, 86, 84]. Bár jól ismert, hogy nemi különbség van a vese számos élettani és patofiziológiai folyamatában is, az iszkémia okozta ARF kialakulását vizsgáló vizsgálatok nagy részét mégis hím állatokon végezték. Kísérleteink során elsoként muattuk ki, hogy renális iszkémiás károsodás okozta ARF-ben nemi különbség áll fenn az állatok túlélésében és a vese érzékenységében. Vizsgálatainkban megállapítottuk, hogy a hím állatok veséje érzékenyebb a posztiszkémiás károsodással szemben, mint a nostényeké. Az észlelt nemi különbségért elsosorban az androgén hormonok szintézise lehet felelos, mivel az elozetes kasztráció illetve az ivaréretlen állapot jelentosen javította a túlélést és csökkentette a vesekárosodás mértékét. Mindemellett az ivarérett nostények tesztoszeron kezelése nem csökkentette számottevoen a túlélést, ami arra utal, hogy nem a tesztoszteron, hanem más androgén hormonok hatása áll az ivarérett, kasztrált és ivaréretlen állatok között megfigyelt különbségek hátterében. Az észlelt különbséghez az ösztrogének védo szerepe is hozzájárulhat, mivel míg ivarérett hímek ösztradiol kezelése szignifikánsan javította a posztiszkémiás túlélést, addig az ovariektomizált és ivaréretlen nostényeknél a túlélés mérsékelt csökkenését észleltük. A hím állatok túlélését a kasztráció illetve az ivaréretlen állapot nagyobb
mértékben
javította,
mint
az
ösztrogénkezelés.
Mindezek
alapján
feltételezheto, hogy az androgénhormonok mennyiségének csökkenése még kedvezobb hatású a túlélés szempontjából, mint az ösztrogének jelenléte. Feltehetoen az ösztrogén és a tesztoszteron mellett más nemi hormonok, valamint az ösztrogén/androgén arány is szerepet játszik a posztichémiás túlélésben megfigyelt nemi különbségekben. Az ivarérett hím állatokban az iszkémia kifejezett vazokonstrikcióhoz és következményes véráramlás csökkenéshez vezetett. Ezzel szemben nostényekben sem a
64
renális vaszkuláris rezisztencia növekedését, sem a véráramlás csökkenését nem észleltük. Ismert, hogy fiziológiás körülmények között is jelentos különbség mutatható ki hím és nostény állatok között a vese struktúrájában és funkciójában. A hím állatok veséje nagyobb, mint a nostényeké és hímekben magasabb az RBF és a GFR értéke, mint nostényekben [63]. Ezzel szemben az afferens és efferens arteriola ellenállása nostényekben nagyobb, mint hímekben. Kimutatták továbbá, hogy ovariektomizált nostény patkányok androgénkezelése a glomerulus méretének, a glomeruláris ultrafiltrációs koefficiensnek, a GFR- nek és a single nephron GFR-nek az emelkedését okozza, az artériás vérnyomás, valamint a glomerularis kapillárisnyomás növekedése nélkül [11]. A nostény állatoknál tapasztalt emelkedett renális vaszkuláris rezisztencia valószínuleg védi a glomerulusokat a hiperfiltrációs károsodástól azáltal, hogy csökkenti a glomeruláris kapillárisnyomás emelkedéseit. Az iszkémiás inzultust követoen számos vazoaktív mediátor szabadul fel, melyek együttes hatására intrarenális vazokonstrikció és a külso medulla hipoperfúziója jön létre. Elképzelheto, hogy ezek a mediátorok a két nemben különbözo mennyiségben és más- más dinamikát követve expresszálódnak, ezáltal hozzájárulhatnak a nostények és hímek között észlelt eltéro renális és szisztémás hemodinamikai változások magyarázatához. A folyamat pontos patofiziológiájának tisztázása azonban még további vizsgálatokat igényel. Összefoglalva, kísérleteink elso részében kimutattuk, hogy a nem és a nemi hormonok jelentosen befolyásolják az iszkémia okozta vesekárosodást. Iszkémiát követoen hímekben nagymértéku renális vazokonstrikció figyelheto meg, ami az RBF csökkenésén keresztül, tovább súlyosbítja a hipoxiát, és közvetve hozzájárul a hímek fokozottabb posztiszkémiás mortalitásához.
65
9.2.
Nemi különbségek a NKA muködésében renális I/R károsodást követoen
A posztiszkémiás vesekárosodás, az ARF egyik legfontosabb kiváltó oka és az intenzív terápia fejlodése ellenére mortalitása napjainkban is igen magas [41]. Az ARF patofiziológiája rendkívül összetett folyamat, de a NKA - mint a szervezet homeosztázisának fenntartásában kulcsszerepet betölto enzim – károsodása központi szereppel bír az iszkémiás folyamat során. Korábbi vizsgálatok, habár ezeket kizárólag hím állatokon végezték [94, 36, 39, 18] kimutatták, hogy iszkémiát követoen a NKA enzimaktivitása jelentos mértékben lecsökken. A noi nemi hormonok a NKA aktivitásának ismert, szövetspecifikus modulátorai [21, 40], bár renális hatásaikról kevés és igen ellentmondásos adat áll csak rendelkezésre [70, 56]. Az androgének hatásait még kevésbé vizsgálták. Egyes adatok szerint a férfi nemi hormonok serkentik az ionpumpa aktivitását [81], míg mások szerint ezek a hormonok nem befolyásolják az enzim muködését [38, 74]. Kísérleteinkben elsoként mutattuk ki, hogy a NKA enzim alegységeinek mRNS és fehérje expressziója, redisztribúciója illetve az ionpumpa aktivitása szignifikánsan eltér a nostény és hím állatok között. Kísérleteinkben a nostények NKA ? 1 alegységének mRNS expressziója már kontroll állatokban is mintegy kétszerese volt a hímekben mértnek és ez a különbség a vizsgált periódus során mindvégig megmaradt. Két órával az iszkémiát követoen az ? 1 mRNS expressziója mindkét nemben lecsökkent, de hímekben jóval nagyobb mértékben, mint nostényekben. Mindezek az eredmények arra utalnak, hogy a nem és a nemi hormo nok jelentosen befolyásolják a NKA ? 1 alegységének posztiszkémiás mRNS expresszióját. A különbséget magyarázhatja nostények esetében az mRNS csökkent degradációja, illetve megnövekedett transzkripciója vagy stabilizációja. Ez utóbbi magyarázat valószínubb, mivel korábbi vizsgálatok számos gén esetében, iszkémiát követoen az ösztrogének mRNS-t stabilizáló szerepérol számolnak be [73, 75]. Az ösztrogének az mRNS 3’UT régióhoz kötodve megakadályozzák egyes endonukleázok kötodését és ezáltal az mRNS degradációját [2]. Figyelembe véve a NKA ? 1 alegységének 8 órás transzlációs idejét a mért mRNS és fehérje értékek vizsgálatinkban jól korreláltak egymással. A posztiszkémiás periódusban nostényekben minden idopontban szignifikánsan magasabb NKA ? 1
66
protein szinteket mértünk, mint hímekben. Míg hímekben az iszkémiát követoen az ? 1 protein szintje jelentosen lecsökkent, addig nostényekben nem változott számottevoen, ami felveti annak lehetoségét, hogy az iszkémia hatására hímekben károsodik a NKA ? 1 alegységének fehérjeszintézise, de nostényekben nem. Irodalmi adatok alapján ismert, hogy az átmeneti iszkémia a protein szintézis hosszú távú gátlását okozza, egyes transzlációs iniciációs faktorok foszforilálásán keresztül, bár a folyamat pontos mechanizmusa még részleteiben nem tisztázott [48]. Akama és McEwen [1] vizsgálatai szerint az ösztrogének aktiválnak egyes specifikus szignál
transzdukciós
utakat,
melyek
az
iniciációs
faktorok
foszforilálását
megakadályozva, fokozzák a proteinek szintézist. Mindezek alapján feltételezheto, hogy posztiszkémiás
periódusban
nostényekben
az
ösztrogén
fent
leírt
hatásainak
köszönhetoen a NKA ? 1 protein szintézise kevésbé károsodik, míg hímekben jelentos csökkenés tapasztalható. Másrészrol az is elképzelheto, hogy a nostény kontroll állatokban mért magasabb NKA ? 1 mRNS szint az iszkémiát követoen, mintegy a transzlációhoz szükséges mRNS pool-ként szolgál, és ezáltal meggyorsítja a protein szintézisét az I/R károsodás során. Mindkét hipotézis lehetséges, de a folyamat pontos megismerése mé g további vizsgálatokat igényel. A NKA fehérje szint csökkenése (melyet okozhat a szintézis csökkenése és a fokozott lebontás egyaránt) és az ionpumpa aktivitásának gátlása mellett, a NKA átmeneti apikális membránra történo redisztribúciója szintén jól ismert következménye a posztiszkémiás károsodásnak [54]. Számos klinikai jelenség, mint a renális nátriumvesztés vagy a csökkent glomeruláris filtráció magyarázható ezzel az áthelyezodéssel. A NKA redisztribúciójához az enzimnek eloször el kell szakadnia az enzimet a bazális membránhoz kihorgonyzó citoszkeletális struktúráktól, mely „szakadás” a Triton X-100 extraktibilitással jól jellemezheto [54, 4]. Korábbi hím állatokon végzett vizsgálatok eredményeit kiegészítve kísérleteink során mi mindkét nemben kimutattuk, hogy iszkémiát követoen a NKA egy része átkerül a non-citoszkeletális struktúrákat reprezentáló Triton-szolubilis szupernatáns frakcióba. Az áthelyezodött, tehát eredeti fiziológiás helyérol elszakadt NKA fehérje mennyisége azonban nagyban különbözött a nostény és hím állatok között. Míg hímeknél jelentos mennyiségu NKA ? 1 került át a citoszólba az iszkémiás inzultust
67
követoen, addig nostények esetében a fehérjemennyiség nagyobb része eredeti helyén, a bazálmembránhoz kötve maradt. Mindezek alapján feltételezheto, hogy a homogenizátum NKA ? 1 protein szintjében észlelt nemi különbségek elsosorban a citoszkeletális struktúrákat jellemzo pellet különbségeibol adódnak és a két nem közötti eltéro redisztribúcióra utalnak. Eredményeink szerint az enzim aktivitás értékei jól korreláltak a teljes szövethomogenizátum, illetve a pellet frakcióban mért NKA ? 1 protein szintekkel. Eredményeink arra utalnak, hogy az expresszált ? 1 alegységek funkcionálisan aktívak, mivel a NKA ? 1 protein szint növekedése, az ionpumpa aktivitásának emelkedésével együtt járt. A nostényekben mért magasabb ? 1 protein szinttel párhuzamosan, az ionpumpa aktivitása is nagyobbnak bizonyult az iszkémiát követo minden vizsgált idopontban, a nostény csoportban, mint a hímekben. Kajiwara [34] és Coux [17] korábbi hím állatokon végzett vizsgálataihoz hasonlóan, hím állatokban az iszkémiát követoen mi is a NKA aktivitás szignifikáns csökkenését tapasztaltuk, míg kísérleteinkben a nostények ionpumpa aktivitása nem változott számottevoen a vizsgált periódus során. Az ? 1 alegység változásaival ellentétben, a ß1 alegység esetében nem találtunk eltérést a hím és nostény csoportok között sem az alegység mRNS, sem protein expressziójában. A változások dinamikája is különbözik a két alegység esetében, míg az ? 1 mRNS szintje az iszkémiás inzultus után két órával a legalacsonyabb, addig a ß1 alegységé csak 16 óra után éri el minimumát. Bertorello [8] és Pressley [67] korábbi vizsgálataik során kimutatták, hogy az ? 1 és a ß1 alegységek expressziója egymástól függetlenül szabályozott, ami magyarázhatja az egyes alegységek I/R károsodásra adott különbözo reakcióját. A nem és a nemi hormonok szerepe a NKA ? 1 alegység I/R károsodást követo változásaiban sokféle lehet. Korábbi vizsgálatainkkal egybehangzóan jelen kísérletünk során is igazoltuk, hogy I/R károsodást követoen nostényekben kevésbé súlyos a vese strukturális károsodása, mint hímekben. Ez felveti annak lehetoségét, hogy nostényekben az iszkémia eleve enyhébb károsodáshoz vezet, mint hímekben és emiatt maga a NKA is kevésbé sérül. Feltételezheto, hogy nostényekben a vese szöveti struktúrája megtartottabb marad, emiatt kisebb a tubulussejtek polaritásváltozása, ennek következtében a NKA redisztribúciója is kevésbé kifejezett. Mindezek a folyamatok
68
összességükben, amint azt kísérleteinkben is kimutattuk, nostényekben a NKA aktvitásának fennmaradását eredményezik. Mindezek mellett, a nemi hormonok befolyásolják számos, az I/R károsodást követoen expresszálódó citokin és vazoaktív faktor termelodését. Egyesek közülük szerepet játszanak a NKA regulációjában [69]. Korábbi vizsgálatainkban kimutattuk, hogy I/R károsodást követoen hímekben magasabb prepro-endotelin expressziója, mint nostényekben. Mivel az endotelinrol tudott, hogy vesében gátolja a NKA-t, ezért feltételezheto, hogy a hímekben mért magasabb endotelinszintek hozzájárulhatnak a kísérleteinkben észlelt NKA aktivitás csökkenéséhez. Mivel az I/R károsodás patomechanizmusa rendkívül összetett, így számos más faktor és mechanizmus változását, köztük a lip id peroxidáció, membrán fluiditás stb. is figyelembe kell venni a NKA iszkémiás változásainak értékelése során. Összefoglalva, kísérleteink második részében igazoltuk, hogy a NKA muködése nostényekben stabilabb, mint hímekben és nostényekben az enzim védettebb a posztiszkémiás károsodással szemben. Kimutattuk, hogy I/R károsodást követoen nostényekben magasabb a NKA ? 1 alegység mRNS és fehérje expressziója, valamint az ionpumpa aktivitása, mint hímekben. A NKA expressziójában és muködésében észlelt eltérések további fontos adatokkal szolgálnak a posztiszkémiás ARF-ben észlelt nemi különbségek patofiziológiájának tisztázásához.
69
9.3.
Nemi különbségek a HSP72 expressziójában renális I/R károsodást
követoen
Az I/R károsodás során a NKA eredeti bazálmembránho z kötött helyérol a citoszólba kerül ki, ezáltal átmenetileg gátlódik az enzim muködése. Korábbi kísérleteinkben kimutattuk, hogy nemi különbség van a NKA posztiszkémiás transzlokációjában, ami együttjár az ionpumpa aktivitásának különbségeivel és így közvetve hozzájárulhat a vese nemek között eltéro posztiszkémiás regenerációjához. Elozetes
vizsgálatok
alátámasztották,
hogy
HSP72
segít
a
sejtmembrán
fehérjeszerkezetének megorzése révén a NKA pumpafunkciójának fenntartásában [4]. Kimutatták továbbá, hogy a denaturálódott proteinek nem csupán szubsztrátjai a HSPknek, de serkentik is a hosokk választ [4]. Mindezek alapján kísérleteinkben azt vizsgáltuk, hogy a NKA expressziójában és muködésében megfigyelt nemi különbségek hátterében nem a HSP72 hímekben és nostényekben különbözo mértéku expressziója áll-e. Elsoként igazoltuk, hogy nemi különbség van a vese posztiszkémiás HSP72 mRNS és fehérje expressziójában. Kimutattuk, hogy már intakt körülmények között is a kontroll nostény állatok HSP72 mRNS és fehérje szintje mintegy másfélszerese a hím állatokénak. Korábbi vizsgálatok alapján ismert, hogy azok a szervek, illetve szövetek, melyek nagyobb mértékben expresszálják a HSP72-t celluláris stresszel szemben ellenállóbbak,
továbbá,
hogy
intakt
szervek/szövetek
megnövekedett
HSP72
expressziója fokozott stresszrezisztenciát jelez [105]. Mindezek alapján feltételezheto, hogy a kontroll nostényekben észlelt magasabb HSP72 mRNS szint az iszkémiás károsodással szembeni nagyobb toleranciára utal. Az iszkémiás inzultus után 2 órával nostényekben a HSP72 mRNS szintje mintegy duplájára nott, míg hímekben jóval kisebb mértéku expresszió növekedést észleltünk. Az iszkémia hatására nostényekben bekövetkezo expresszió növekedés mértéke megegyezett a más kísérletekben etanol, mint a HSP72 specifikus induktorának beadását követo HSP72 szint emelkedésével [42]. Az expresszált HSP72 mRNS mennyiségében észlelt különbség mellett, nemi különbséget észleltünk az expresszió dinamikájában is. Míg nostények esetében már 2 órával az iszkémiás inzultus után a kontrollokhoz képest szignifikánsan magasabb mRNS értékeket detektáltunk, hímek
70
esetében a HSP72 mRNS szintje kevésbé emelkedett maximumát késobb, 16 óra elteltével érte csak el. A HSP72 protein értékek változásai jól korreláltak az mRNS szintekben észlelt eltérésekkel. A HSP72 fehérje mennyisége nostényekben a vizsgált periódus során végig magasabb volt, mint hímekben. Feltételezhetjük tehát, hogy nostényekben az iszkémiás inzultust követoen gyorsabban megkezdodött és nagyobb mennyiségu HSP72 expressziónak köszönhetoen hamarabb indul be a károsodott proteinek helyreállítása, illetve a membránstruktúrák regenerációja. Az iszkémia hatására a NKA a károsodott membránból a citoszólba diszlokálódik és ezáltal károsodik a muködése. Van Vhy és mtsai immunhisztokémiai vizsgálatai szerint a posztiszkémiás szakban a HSP72 lokalizációja és granuláris mintázata megegyezik az iszkémia hatására transzlokálódott NKA molekulák elrendezodésével [95]. Mindezek arra utalnak, hogy a HSP72 chaperone funkciója révén részt vesz a NKA molekulák visszarendezésében és ezáltal az enzim funkciójának helyreállításában, habár a folyamat mechanizmusa részleteiben még tisztázatlan. Elozo kísérletsorozatunkban kimutattuk, hogy az iszkémiás inzultust követoen nostényekben kevésbé károsodik a NKA muködése, mint hímekben. Nostényekben az iszkémiát
követoen
nincs
számottevo
csökkenés
a
NKA
? 1 alegységének
fehérjeexpressziójában illetve az enzimaktivitásban. Az irodalmi adatok és saját eredményeink alapján feltételezheto, hogy a nostényekben eleve magasabb, majd gyorsabban
expresszálódó
HSP72
protektív
károsodásával szemben.
71
hatású
a
NKA
posztiszkémiás
9.4.
A HSP70 genetikai polimorfizmusok szerepe akut veseelégtelenségben Mivel a hormonális és környezeti tényezok mellett a HSP70 fehérjecsalád
expressziójában a genetikai polimorfizmusok szerepe jól ismert, továbbá tudjuk, hogy a HSP72 fontos szereppel bír a posztiszkémiás ARF patofiziológiájában, kísérleteink negyedik részében a HSP73 G(190)C és a HSP72 A(1267)G genetikai polimorfizmusok prevalenciáját vizsgáltuk ARF-ben szenvedo kis súlyú koraszülöttekben. Korábbi vizsgálatok igazolták, hogy a HSP72 fontos szerepet tölt be az éretlen vese iszkémiás toleranciájában. Vincenzio és mtsai pozitív korrelációt írtak le a HSP72 fehérje expressziójának növekedése és a koraszülött állatok renális hipoxiával szembeni védekezoképessége között [96]. Experimentális ARF-ben kimutatták, hogy a renális iszkémia a HSP72 expresszió növekedését indukálta, továbbá, hogy a HSP72 alacsony szintje súlyosbította az iszkémiás károsodást és nehezítette, a proximális tubulusok posztiszkémiás regenerációját [35, 47]. Habár
korábbi
eredmények
igazolták
a
HSP72
és
HSP73
genetikai
polimorfizmusok jelentoségét iszkémiás agy [12], illetve szívbetegségekben[103], a vesét illetoen mindeddig nem történtek ilyen vizsgálatok. Munkánkkal elsoként mutattuk ki, hogy a HSP72 (1267)GG genotípus hordozása összefügg az ARF kialakulásával kis súlyú koraszülöttekben. Ismert, hogy ez a genotípus csökkent HSP72 mRNS expresszióval jár [65]. Mindezek alapján feltételezheto tehát, hogy az (1267)GG genotípust hordozó VLBW koraszülöttekben, a polimorfizmus okozta csökkent HSP72 szint miatt, nagyobb eséllyel fordul elo ARF, mint egyéb genotípus esetében. Irodalmi adatok a HSP70 fe hérjecsalád központi szerepét támasztották alá a magzati élet során, igazolták, hogy a HSPk a teljes fötális érés ideje alatt expresszálódnak és számos housekeeping és embrió-protektív hatással rendelkeznek. Kísérleteink során kimutattuk, hogy az alacsony HSP72 mRNS szinttel járó (1267)GG genotípus gyakrabban fordul elo a VLBW koraszülött populációban, mint az egészséges kontrollokban. Ez felveti annak lehetoségét, hogy a HSP72 (1267)GG genotípus hordozása az ARF mellett, a koraszülöttséggel is összefüggést mutat. Más kísérletek eredményeihez hasonlóan, saját vizsgálatainkban is azt találtuk, hogy a HSP72 genotípusok megoszlása esetében genetikai imbalancia áll fenn. Az egyes genotípusok eloszlási aránya még az egészséges kontroll populációban sem teljesíti a Hardy-Weinberg egyensúlyt, mivel a vártnál kisebb az AA genotípusok
72
elofordulási gyakorisága. Ezek az eredmények megegyeznek számos más korábbi vizsgálat adataival [78, 79, 50]. Mindezek arra utalnak, hogy a HSP72 A(1267)G polimorfizmusának szelekciós szerepe lehet [78], habár a genetikai polimorfizmusok relevanciája ilyen komplex folyamatoknál, mint az ARF vagy a koraszülöttség, nagy körültekintést igényel. Vizsgálatainkban az IRDS-ben
szenvedo
VLBW
koraszülöttek
között
gyakrabban fordult elo a HSP72 (1267)G allél hordozása, mint a többi betegcsoportban. Irodalmi adatok alapján ismert, hogy a HSP72 fehérje fontos szerepet tölt be a fötális tüdo érésében [20]. Mindezek alapján feltételezheto, hogy a VLBW koraszülöttekben a csökkent HSP72 expresszió össze függ a tüdo érési folyamatainak károsodásával és így magyarázza az (1267)GG genotípus gyakrabb elofordulását az IRDS-ben szenvedo koraszülöttek között. Eredményeinket összefoglalva megállapíthatjuk, hogy az ARF elofordulásának rizikója, minden egyéb hajla mosító tényezotol függetlenül szignifikánsan nagyobb a HSP72 (1267)GG genotípusú VLBW koraszülöttek között. A csökkent HSP72 szinttel járó HSP72 (1267)GG genotípus gyakoribb volt a VLBW koraszülöttek között is összehasonlítva a kontroll populációval, ami további kérdéseket vet fel a HSP72 polimorfizmusok szelekciós és biológiai relevanciáját illetoen.
73
10. EREDMÉNYEK ÖSSZEFOGLALÁSA
Röviden összefoglalva vizsgálataink eredményeit, a következoeket állapíthatjuk meg:
1. Elsoként mutattuk ki, hogy renális iszkémiás károsodást követoen a nostény állatok szignifikánsan hosszabb ideig élnek és a vese posztiszkémiás károsodása is jóval enyhébb, mint hím állatokban. A kasztráció és az ivaréretlen állapot jelentosen javítja a hím állatok túlélését, ami a nemi hormonok (androgének) és az ösztrogén/androgén arány posztiszkémiás károsodásban betöltött központi szerepét támasztja alá.
2. Megállapítottuk, hogy renális iszkémiás károsodást követoen hímekben fokozottabb renális vazokontsrikció alakul ki, ami a vesevéráramlás csökkenését okozva a renális mikrocirkuláció további romlásához és így a posztiszkémiás károsodás súlyosbodáshoz vezethet. 3. Kimutattuk, hogy az ischémiában központi szerepet játszó NKA ? 1 alegységek mRNS expressziója mindkét nemben csökken a posztiszkémiás idoszakban. Az mRNS csökkenés azonban csak hím patkányok esetében tükrözodik a fehérje mennyiség és az enzimaktivitás változásaiban. Nostényekben ezzel szemben nem változik számottevoen a NKA ? 1 alegység fehérjeszintje illetve az ionpumpa aktivitása. A NKA nostényekben tehát védettebb a posztiszkémiás károsodással szemben, ami a szervezet homeosztázisának stabilitását segíti elo.
4. Megállapítottuk, hogy iszkémia hatására nostényekben a NKA kisebb mértékben transzlokálódik eredeti bazálmembránhoz kötött helyérol, mint hímeknél. Ez arra utal,
hogy
nostényekben
renális
iszkémiás
károsodást
követoen
több
a
funkcionálisan aktív, a pumpafunkcióban résztvevo NKA molekula, mint hímekben. Hímekben a NKA (feltehetoen a plazmamembrán károsodása következtében) kiszabadul a bazálmembránból és funkcionálisan inaktívvá válik.
74
5. Elsoként mutattuk ki, hogy nostényekben már fiziológiás körülmények között is nagyobb
mennyiségu
HSP72
expresszió
detektálható,
mint
hímekben.
Megállapítottuk, hogy a renális iszkémiás károsodás után nostények esetében nagyobb mértéku HSP72 expresszió figyelheto meg, ami a fokozott chaperonhatás révén nostényekben a denaturálódott proteinek és membránstruktúrák gyorsabb helyreállítását teszi lehetové.
6. Kimuttattuk, hogy a hormonális hatások mellett a HSP72 genetikai polimorfizmusai
is
befolyásolják
az
ARF
kialakulását.
Eredményeinket
összefoglalva megállapíthatjuk, hogy az ARF elofordulásának rizikója, minden egyéb hajlamosító tényezotol függetlenül szignifikánsan nagyobb a HSP72 (1267)GG genotípusú VLBW koraszülöttek között.
7. Kimutattuk, hogy a HSP72 (1267)GG genotípus prevalenciája nagyobb az IRDS-ben szenvedo VLBW koraszülöttek között, ami alátámasztja a HSP72 tüdo intrauterin érési folyamataiban betöltött szerepét.
8. Kimutattuk, hogy a HSP72 (1267)GG genotípus hordozása szignifikánsan megnöveli a koraszülöttség rizikóját is, ami további kérdéseket vet fel a HSP72 polimorfizmusok
szelekciós
és
75
biológiai
relevanciáját
illetoen.
11. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Mindenekelott köszönetemet fejezem ki Tulassay Tivadar professzor úrnak, hogy az általa vezetett PhD program résztvevoje lehettem az I.sz. Gyermekklinika Nefrológiai kutatólaboratóriumában. Hálás vagyok, hogy munkámat a kezdetektol fogva tanácsaival és odafigyelésével segítette. Köszönö m témavezetoimnek Prof. Reusz Györgynek és Dr. Szabó Attilának, hogy szakértelmükkel, kritikus észrevételeikkel mind kísérletes, mind klinikai munkám során támogattak. Köszönöm Dr. Vér Ágota docens asszonynak és Dr. Vásárhelyi Barnának, hogy önzetlen szakmai és emberi segítségükkel a felmerülo nehézségek megoldásában, valamint a tudományos közlemények megírásában mindenkor készséggel segítségemre voltak. Köszönettel Hildebrandtnak, kutatócsoportjának
tartozom hogy
németországi
freiburgi
munkájába
és
mentoromnak
tanulmányutam rengeteg
során
technikai
és
Prof.
Friedhelm
bekapcsolódhattam elméleti
tudással
gazdagodhattam a legmodernebb genetikai kutatások területén. Köszönöm Dr. Vannay Ádámnak, akivel e kísérletek java részét közösen végeztük, a munkák megtervezésében és kivitelezésében nyújtott nélkülözhetetlen segítségét, töretlen kitartását és optimizmusát. Köszönöm Dr. Treszl Andrásnak a statisztikai elemzésekben, Dr. Müller Veronikának az állatkísérletek elsajátításában nyújtott segítségét, valamint köszö nöm Végh Miklósnénak és Bernáth Máriának a kituno technikai asszisztenciát.
Végül köszönettel tartozom az I.sz. Gyermekklinika és a Kutatólabor valamennyi munkatársának, hogy segíto, baráti légkörben végezhettem doktori munkámat.
Hálásan köszönöm családom kitartó biztatását és támogatását.
76
12. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK BIBLIOGRÁFIAI ADATAI
11.1. Az értekezés témájában megjelent közlemények
1.
Szabó J Attila, Müller Veronika, Fekete Andrea, Hamar Péter, Antus Balázs,
Reusz György, Heemann Uwe: Angiotenzin konvertáló enzim gátló enalapril csökkenti a növekedési faktorok mRNS expresszióját a vesetranszplantátum krónikus kilökodése során patkányban Hypertonia és Nephrologia 2001 (IF:0,0)
2.
Müller V, Losonczy G, Vannay Á, Fekete A, Heemann U, Reusz G, Szabo AJ:
Sexual differences in renal ischemia/reperfusion injury: role of endothelin. Kidney Int 62:1364-1371, 2002 (IF: 5,1) 3.
Fekete A, Treszl A, P Tóth-Heyn, Á Vannay, A Tordai, T Tulassay, B
Vásárhelyi: Association between he at shock protein 72 gene polymorphism and acute renal failure in premature neonates. Pediatr Res 54:452-455, 2003 (IF:3,38).
4. Szabó
Fekete A, Vannay Á, Vér Á, Vásárhelyi B, Müller V, Reusz Gy, Tulassay T, AJ:
Gender
differences
in
alterations
of
Na+/K +-ATPase
following
ischemia/reperfusion injury in the rat kidney. J Physiol 2003 közlésre elfogadva (IF:4,65)
11.2. Az értekezés témájában megjelent absztraktok
1.
A. Fekete, Á. Vannay, Á. Vér, I. Kocsis, Gy. Reusz, V. Müller, A. Szabó:
Sexuelle Dimorphismus in ischaemischer Schädigung: die Rolle des Na, K ATPase und Stress Proteine Deutsche Kinderheilk 4 (3) 2001 (IF: 0,241)
2.
A Fekete, Á Vannay, Á Vér, B Vásárhelyi, V Müller, G Reusz, T Tulassay, AJ
Szabó: Gender differences in Na/K ATPase in rats. Ped Nephr 17: C27-C148, 2002 (IF:1,42)
77
3.
A Fekete, Á Vannay, Á Vér, B Vásárhelyi, V Müller, G Reusz, T Tulassay, AJ
Szabó: Gender differences in renal Na/K ATPase in rats following ischemia/reperfusion injury. JASN, 13:755, 2002 (IF:6,337)
4.
Müller V, Losonczy G, Vannay Á, Fekete A, Heemann U, Reusz G, Szabo AJ:
Sexual differences in renal ischemia/reperfusion injury: role of endothelin. JASN 13:756, 2002 (IF:6,337)
5.
Fekete A, Treszl A, A Tordai, T Tulassay, B Vásárhelyi: Association between
heat shock protein 72 gene polymorphism and acute renal failure in premature neonates. Nephrol Dial Transplant 18:607, 2003 (IF:2,57)
6.
Müller V, Losonczy Gy, Heemann U, A Fekete , Vannay Á, Reusz Gy, Tulassay
T, AJ Szabó: The effect of gender and sexual steroids on renal ischemia/reperfusion injury. Nephrol Dial Transplant 18:604, 2003 (IF:2,57)
11.3
Más témában megjelent publikációk
1.
AJ Szabo, T Tulassay, B Melegh, T Szabo, Á Vannay, A Fekete , Zs Süveges,
Gy S Reusz: Hyperhomocysteinemia and MTHFR C677T gene polymorphism in renal transplant patients. Arch Dis Child 85:47-49, 2001 (IF: 2,095)
2.
Birkenhager R, Otto E, Schurmann MJ, Vollmer M, Ruf EM, Fekete A, Omran
H, Feldmann D, Milford DV, Jeck N, Konrad M, Landau D, Knoers NV, Antignac C, Sudbrak R, Kispert A, Hildebrandt F: Mutation of BSND causes Bartter syndrome with sensorineural deafness and kidney failure. Nat Genet 29:310-314, 2001 (IF: 30,8)
3.
Tory K, Horváth E, Süveges Zs, Fekete A, Sallay P, Berta K, Szabó A,
Tulassay T, Reusz Gy. The effect of propranolol on heart rate variability in patients with ESRD: Clin Nephrol 2003 in press (IF:1,341)
78
4.
Vannay Á, Fekete A, Müller V, Strehlau J, Heninger E, Veres T, Reusz Gy,
Tulassay T, Szabó AJ. The effects of histamine and the H2 receptor antagonist ranitidine on ischemia induced acuter renal failure: involvement of IL-6 and vascular endothelial growth factor (VEGF) Kidney Blood Press Res 2003 (közlésre elfogadva, IF:0.968)
79
13. IRODALOMJEGYZÉK
1.
Akama KT, McEwen BS: Estrogen stimulates postsynaptic density-95 rapid protein synthesis via the Akt/protein kinase B pathway. J Neurosci (2003) 23: 2333-2339
2.
Arao Y, Kikuchi A, Ikeda K, Nomoto S, Horiguchi H, Kayama F: A+U-richelement RNA-binding factor 1/heterogeneous nuclear ribonucleoprotein D gene expression is regulated by oestrogen in the rat uterus. Biochem J (2002) 361: 125-132
3.
Arrigo AP, Paul C, Ducasse C, Sauvageot O, Kretz-Remy C: Small stress proteins: modulation of intracellular redox state and protection against oxidative stress. Prog Mol Subcell Biol (2002) 28: 171-184
4.
Aufricht C, Bidmon B, Ruffingshofer D, Regele H, Herkner K, Siegel NJ, Kashgarian M, Van Why SK: Ischemic conditioning prevents Na,K-ATPase dissociation from cytoskeletal cellular fraction after repeat renal ischemia in rats. Pediatr Res (2002) 51: 722-727
5.
Azzarolo AM, Mircheff AK, Kaswan RL, Stanczyk FZ, Gentschein E, Becker L, Nassir B, Warren DW: Androgen support of lacrimal gland function. Endocrine (1997) 6: 39-45
6.
Beck FX, Neuhofer W, Müller E: Molecular chaperones in the kidney: distribution, putative roles and regulation. Am J Physiol (2000) 279: F203-F215
7.
Bellini T, Degani D, Matteuzzi M, Dallocchio F: Effect of 17 beta-estradiol on calcium response to phytohaemagglutinin in human lymphocytes. Biosci Rep (1990) 10: 73-78
8.
Bertorello AM, Ridge KM, Chibalin AV, Katz AI, Sznajder: JI Isoproterenol increases Na+-K+-ATPase activity by membrane insertion of alpha-subunits in lung alveolar cells. Am J Physiol (1999) 276: L20-27
9.
Bidmon B, Endemann M, Mueller T, Arbeiter K, Herkner K, Aufricht C: HSP70 repairs tubule cell structure after renal ischemia. Kidney Int (2000) 58:24002407
80
10.
Blanco G, Diaz H, Carrer HF, Beauge L: Differentiation of rat hippocampal neurons induced by estrogen in vitro: effects on neuritogenesis and Na, KATPase activity. J Neurosci Res (1990) 27: 47-54
11.
Blantz RC, Peterson OW, Blantz ER, Wilson CB: Sexual differences in glomerular ultrafiltration: Effect of androgen administration in ovariectomized rats. Endocrinology (1988) 122:767-773
12.
Bolla MK, Miller GJ, Yellon DM, Evans A, Luc G, Cambou JP, Arveiler D, Cambien F, Latchman DS, Humphries SE, Day IN: Analysis of the association of a heat shock protein 70-1 gene promoter polymorphism with myocardial infarction and coronary risk traits. Dis Markers (1998) 13:227-235
13.
Brady HR, Brenner BM, Lieberthal V: Acute renal failure. Pathology and pathophysiology of ischemic acute tubule necrosis, in The Kidney (5th ed), edited by Brenner BM, Philadelphia, WB Saunders (1996), pp 1207-1222
14.
Breen D, Bihari D: Acute renal failure as a part of multiple organ failure: The slippery slope of critical illness. Kidney Int (1998) 66: S25-S33
15.
Brezis M, Rosen SN, Epstein FH: The pathophysiological implications of medullary hypoxia. Am J Kid Dis (1989) 13: 253-258
16.
Brown, CR, Martin RL, Hansen WJ, Beckmann RP, Welch BJ: The constitutive and stress inducible forms of hsp-70 exhibits functional similarities and interact with one another in an ATP-dependent fashion. J Cell Biol (1993) 120: 11011112
17.
Coux G, Trumper L Elias MM: Renal function and cortical Na-K-ATPase activity, abundance and distribution after ischemia/reperfusion in rats. Biochim Biophys Acta (2002) 1586: 71-80
18.
Coux G, Trumper L, Elias MM: Cortical Na+, K+ -ATPase activity, abundance, and distribution after in vivo renal ischemia without reperfusion in rats. Nephron (2001) 89:82-89
19.
Csermely P, Schnaider T, Soti C, Prohaszka Z, Nardai G: The 90-kDa molecular chaperone
family:
structure,
function,
and
clinical
comprehensive review. Pharmacol Ther (1998) 79:129-168
81
applications.
A
20.
David JC, Tanguay RM, Grognet JF: Perinatal expression of heat shock proteins HSC 70 and HSP 70 in neural and non-neural tissues of the piglet. Brain Res Dev Brain Res (2001) 128:91-99
21.
Dzurba A, Ziegelhoffer A, Vrbjar N, Styk J, Slezak J: Estradiol modulates the sodium pump in the heart sarcolemma. Mol Cell Biochem (1997) 176: 113-118.
22.
Favatier F, Jacquier-Sarlin MR, Swierczewski E, Polla BS: Polymorphism in the regulatory sequence of the human hsp70-1 gene does not affect heat shock factor binding or heat shock protein synthesis. Cell Mol Life Sci (1999) 56:701-708
23.
Féraille E, Doucet A: Sodium-Potassium-Adenosinetriphosphatase-Dependent Sodium Transport in the Kidney: Hormonal Control Physiol Rev (2001) 81: 345418
24.
Fink AL: Chaperone- mediated protein folding. Physiol Rev (1999) 79: 425-449
25.
Garcia MV, Cabezas JA, Perez-Gonzalez MN: Effects of oestradiol, testosterone and medroxyprogesterone on subcellular fraction marker enzyme activities from rat liver and brain. Comp Biochem Physiol B (1985) 80): 347-354
26.
Gaudio KM, Thulin G, Mann A, Kashga rian M, Siegel NJ: Role of heat stress response in the tolerance of immature renal tubules to anoxia. Am J Physiol (998) 3: 1029-F1036
27.
Gilboa N, Magro AM, Han Y, Rudofsky UH: Contrasting effects of early and late orchiectomy on hypertension and renal disease in Fawn- hooded rats. Life Sci (1987) 41: 1629-1634
28.
Golden GA, Mason RP, Tulenko TN, Zubenko GS, Rubin RT: Rapid and opposite effects of cortisol and estradiol on human erythrocyte Na+, K+-ATPase activity: relationship to steroid intercalation into the cell membrane. Life Sci (1999) 65: 1247-1255
29.
Hale SL, Birnbaum Y, Kloner RA: ? –estradiol, but not ? -estradiol, reduces myocardial necrosis in rabbits after ischemia and reperfusion. Am Heart J (1996) 132: 258-262
30.
Hannedouche T, Chauveau P, Kalou F, Albouze G, Lacour B: Factors affecting progression in advanced chronic renal failure. Clin Nephrol (1993) 39: 312-320
31.
Hartl FU: Molecular chaperones in cellular protein folding. Nature (1996) 381: 571-579
82
32.
Hartl FU, Hayer-Hartl M: Molecular chaperones in the cytosol: from nascent chain to folded protein. Science (2002) 295:1852-1858
33.
Hayes SA, Dice JF: Roles of molecular chaperones in protein degradation. J Cell Biol (1996) 132: 255-258
34.
Kajiwara I, Kawamura K, Hiratsuka Y, Takebayashi S: The influence of oxygen free radical scavengers on the reduction of membrane-bound Na(+)-K(+)ATPase activity induced by ischemia/reperfusion injury in the canine kidney. Nephron (1996) 72: 637-643
35.
Kelly KJ, Baird NR, Greene AL: Induction of stress response proteins and experimental renal ischemia/reperfusion. Kidney Int (2001) 59:1798-1802
36.
Kim YK, Woo JS, Kim YH, Jung JS, Kim BS , Lee SH: Effect of renal ischemia on organic compound transport in rabbit kidney proximal tubule. Pharmacol Toxicol (1995) 77:121-129
37.
Knowlton AA, Sun L: Heat-shock factor-1, steroid hormones, and regulation of heat-shock protein expression in the heart. Am J Physiol (2001) 280: H455H464
38.
Kurihara K, Maruyama S, Hosoi K: Regulation of Na+,K+-ATPase in submandibular glands of hypophysectomized male mice by steroid and thyroid hormones. J Histochem Cytochem (1996) 44: 703-711
39.
Kwon TH, Frokiaer J, Han JS, Knepper A, Nielsen S: Decreased abundance of major Na+ transporters in kidneys of rats with ischemia- induced acute renal failure. Am J Physiol (2000) 278:F925-F939
40.
Labombarda F, Gonzalez SL, Gonzalez DM, Guennoun R, Schumacher M, de Nicola AF: Cellular basis for progesterone neuroprotection in the injured spinal cord. J Neurotrauma (2002) 19: 343-355
41.
Lameire N, Vanholder R: Pathophysiologic features and prevention of human and experimental acute tubular necrosis. J Am Soc Nephrol (2001) 12: S20-S32
42.
Lappas GD, Karl IE, Hotchkiss RS: Effect of ethanol and sodium arsenite on HSP7 formation and on survival in a murine endotoxin model. Shock (1994) 2:34-39
43.
Lee KH, Finnigan-Bunick C, Bahr J, Bunick D: Estrogen regulation of ion transporter messenger RNA levels in mouse efferent ductules are mediated
83
differentially through estrogen receptor (ER) alpha and ER beta. Biol Reprod (2001) 65: 1534-1541 44.
Lieberthal W, Levine JS: Mechanisms of apoptosis and its potential role in renal tubular epithelial cell injury. Am J Physiol (1996) 71: 117-126
45.
Lingrel JB, Van Huysse J, O’Brian W, Jewell- Motz E, Askew R, Schultheis P: Structure-function studies of the Na+/K + ATPase. Kidney Int (1995) S44: 32-39
46.
Luders J, Demand J, Schonfelder S, Frien M, Zimmermann R, Hohfeld J: Cofactor- induced modulation of the functional specificity of the molecular chaperone Hsc70, Biol Chem Hoppe-Seyler (1998) 379: 1217-1226
47.
Luft JC, Dix DJ: HSP 70 expression and function during embryogenesis. Cell Stress Chaperones (1999) 4:162-170
48.
Martin de la Vega C, Burda J, Nemethova M, Quevedo C, Alcazar A, Martin ME, Danielisova V, Fando JL , Salinas M: Possible mechanisms involved in the down-regulation of translation during transient global ischaemia in the rat brain. Biochem J (2001) 357: 819-826
49.
Mayer MP, Bukau B: Molecular chaperones: the busy life of Hsp90. Curr Biol (1999) 9:R322-325
50.
Mestiri S, Bouaouina N, Ahmed SB, Khedhaier A, Jrad BB, Remadi S, Chouchane L: Genetic variation in the tumor necrosis factor-alpha promoter region and in the stress protein hsp70-2: susceptibility and prognostic implications in breast carcinoma. Cancer (2001) 91:672-678
51.
Miller SA, Dykes DD and Polesky HE: A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Res (1988) 44: 628632
52.
Milner CM, Cambell RD: Structure and function of the tree MHX- linked HSP70 genes. Immunogenetics (1990) 32: 242-251
53.
Modi N 1999 Disorders of the kidney and urinary tract. In: Rennie JM, Roberton NR (eds) Textbook of neonatology. Churchill- Livingston, Edinburgh, pp 10091037
54.
Molitoris BA, Nelson WJ: Alterations in the establishment and maintenance of epithelial cell polarity as a basis for disease processes. J Clin Invest (1990) 85: 3-9
84
55.
Mueller T, Bidon B, Pichler P, Arbeiter K, Ruffingshofer D, Van Why SK, Aufricht C: Urinary heat shock protein-72 excretion in clinical and experimental renal ischemia. Pediatr Nephrol (2003) 18:97-99
56.
Mujais SK, Nora NA , Chen Y: Regulation of the renal Na,K pump: role of progesterone. J Am Soc Nephrol (1993) 3:1488-1495
57.
Müller V, Szabo A, Viklicky O, Gaul I, Portl S, Philipp T, Heemann UW: Sex hormones and gender-related differences: their influence on chronic renal allograft rejection. Kidney Int (1999) 55: 2011-2020
58.
Nath KA, Norby SM: Reactive oxygen species and acute renal failure. Am J Med (2000) 109: 655-678
59.
Netzer WJ, Hartl FU: Recombination of protein domains facilitated by cotranslational folding in eukaryotes. Nature (1997) 388: 329-331
60.
Nissenson AR: Acute renal failure: Definition and pathogenesis. Kidney Int (1998) 66: S7-S10
61.
Node K, Kitakaze M, Kosaka H: Amelioration of ischemia- and reperfusioninduced myocardial injury by17? -estradiol. The role of nitric oxide and calciumactivated potassium channels. Circulation (1997) 96: 1953-1963
62.
Okusa MD: The inflammatory cascade in acute ischemic renal failure. Nephron (2002) 90: 133-138u
63.
Oudar O, Elger M, Bankir L, Ganten D, Ganten U, Kriz W: Differences in renal kidney morphology between males, females and testosterone-treated females. Renal Physiol Biochem (1991) 14: 92-102
64.
Papaconstantinou AD, Goering PL, Umbreit TH, Brown KM: Regulation of uterine hsp90alpha, hsp72 and HSF-1 transcription in B6C3F1 mice by betaestradiol and bisphenol A: involvement of the estrogen receptor and protein kinase C. Toxicol Lett (2003) 144: 257-270
65.
Pociot F, Roningen KS, Nerup J: Polymorphic analysis of the human MHClinked heat shock protein 70 (HSP70-2) and HSP70-Hom genes in insulindependent diabetes mellitus (IDDM). Scand J Immunol (1994) 38:491-495
66.
Plumier JC, Currie RW: Heat shock- induced myocardial protection against ischemic injury: a role for Hsp70? Cell Stress Chaperones (1996) 1:13-17
85
67.
Pressley TA: Ion concentration-dependent regulation of Na,K-pump abundance. J Membr Biol (1988) 105: 187-195
68.
Prohaszka Z: Heat shock proteins as chaperones of the immune response. The optimal stress of life. Orv Hetil (2003) 144:1331-1339
69.
Qiuntas LE, Lopez LB, Souccar C, Noel F: Na+/K(+)-ATPase density is sexually dimorphic in the adult rat kidney. Ann N Y Acad Sci (1997) 834: 552-554
70.
Rafestin-Oblin ME, Couette B, Barlet-Bas C, Cheval L, Viger A , Doucet A: Renal action of progesterone and 18-substituted derivatives. Am J Physiol (1991) 260: F828-832
71.
Ronco C, Bellomo R: Prevention of acute renal failure in the critically ill. Nephron Clin Pract (2003) 93: c13-c20
72.
Rose, Valders RJ: Understanding the sodium pump and its relevance to disease. Clin Chem (1994) 39: 1674-1685
73.
Ruohola JK, Valve EM, Karkkainen MJ, Joukov V, Alitalo K , Harkonen PL: Vascular endothelial growth factors are differentially regulated by steroid hormones and antiestrogens in breast cancer cells. Mol Cell Endocrinol (1999) 149: 29-40
74.
Sandhu S, Silbiger SR, Lei J, Neugarten J: Effects of sex hormones on fluid and solute transport in Madin-Darby canine kidney cells. Kidney Int (1997) 51: 15351539
75.
Sasaki R: Pleiotropic functions of erytrhropoietin. Intern Med (2003) 42: 142149
76.
Schnaider T, Soti C, Cheetham ME, Miyata Y, Yahara I, Csermely P: Interaction of the human DnaJ homologue, HSJ1b with the 90 kDa heat shock protein, Hsp90. Life Sci (2000) 67:1455-1465
77.
Schober A, Müller E, Thurau K, Beck FX: Th e response of heat shock proteins 25 and 72 to ischaemia in different kidney zones. Eur J Physiol (1997) 434: 292299
78.
Schroder O, Schulte KM, Ostermann P, Roher HD, Ekkernkamp A, Laun RA: Heat shock protein 70 genotypes HSPA1B and HSPA1L influence cytokine concentrations and interfere with outcome after major injury. Crit Care Med (2003) 31:73-79
86
79.
Schulte CM, Dignass AU, Goebell H, Roher HD, Schulte KM: Genetic factors determine extent of bone loss in inflammatory bowel disease. Gastroenterology (2000) 119:909-920
80.
Sharp SR, Massa SM, Swanson RA: Heat shock protein protection. Trends Neurosci (1999) 22:97-99
81.
Shima S: Effects of androgen treatment on adenylate cyclase system in rat hepatic membranes. Pharmacol Toxicol (1992) 70: 429-433
82.
Sieber FE, Hurn P, Alkayed NJ, Traystman RJ: Gender-based differences in Na+ -K+ adenosine triphosphatase activity occur in the microcirculation of the diabetic rat brain. Anaesthesiology (2001) 94: 372-375
83.
Silbiger SR, Neugarten J: The impact pf gender on the progression of chronic renal disease. Am J Kidney Dis (1995) 25: 515-530
84.
Simpkins JW, Rajakumar G, Zhang YQ, Simpkins CE, Greenwald D, Yu CJ, Bodor N, Day AL: Estrogens may reduce mortality and ischemic damage caused by middle cerebral artery occlusion in the female rat. J Neurosurg (1997) 87: 724-730
85.
Soti C, Vermes A, Haystead TA, Csermely P: Comparative analysis of the ATPbinding sites of Hsp90 by nucleotide affinity cleavage: a distinct nucleotide specificity of the C-terminal ATP-binding site. Eur J Biochem (2003) 270:24212428
86.
Squadrito F, Altavilla D, Squadrito G, Campo GM, Arlotta M, Arcoraci V, Minutoli L, Saitta A, Caputi AP: The involvement of tumor necrosis factor-? in the protective effects of 17ß oestradiol in splanchnic ischaemia-reperfusion injury. Br J Pharmacol (1997) 121: 1782-1788
87.
Star RA: Treatment of acute renal failure. Kidney Int (1998) 54: 1817-1831
88.
Sugishita K, Li F, Su Z, Barry WH: Anti-oxidant effects of estrogen reduce [Ca(2+)](i) during metabolic inhibition. J Mol Cell Cardiol (2003) 35: 331-336
89.
Sutton TA, Molitoris BA: Mechanism of cellular injury in acute renal failure. Seminar Nephrol (1998) 18: 490-497
90.
Sweadner KJ: Isoenzymes of Na+/K + ATPase. Biochim Biophys Acta (1989) 988: 185-220
87
91.
Szabo A, Heemann U: Ischemia/reperfusion and chronic allograft rejection. Transplant Proc (1998) 30: 4281-4284
92.
Thadhani R, Pascual M, Bonventre JV: Acute renal failure. N Eng J Med (1996) 334: 1448-1460
93.
United States Renal Data System: 1993 Annual Data Report. Bethesda, MD, U.S. Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health, 1993, p xvi
94.
Van Why SK, Mann AS, Ardito T, Siegel NJ, Kashgarian M: Expression and molecular regulation of Na-K-ATPase after renal ischemia. Am J Physiol (1994) 270: F75-F85
95.
Van Why SK, Siegel NJ: Heat shock proteins in renal injury and recovery. Curr Opin Nephrol Hypertens (1998) 7:407-412
96.
Vicencio A Bidmon B, Ryu J, Reidy K, Thulin G, Mann A, Gaudio KM, Kashgarian M, Siegel NJ: Developmental expression of HSP-72 and ischemic tolerance of the immature kidney. Pediatr Nephrol (2003) 18: 85–91
97.
Vitai M, Kurucz I, Tombor B, Prechl J, Erdo F, Hegedus E, Nagy Z, , Koranyi L, Laszlo L: Ultrastructural localization of Hsp-72 examined with a new polyclonal antibody raised against the truncated variable domain of the heat shock protein. Cell Stress Chaperones (1999) 4:139-152
98.
Voss MR, Stallone JN, Li M, Cornelussen RN, Knuefermann P, Knowlton AA: Gender differences in the expression of heat shock proteins: the effect of estrogen. Am J Physiol (2003) 285: H687-692
99.
Wang Z, Rabb H, Haq M, Shull GE, Sloeimani M: A possible molecular basis of natriuresis during ischemic-reperfusion injury in the kidney. J Am Soc Nephrol (1998) 9: 605-613
100.
Weight SC, Bell PRF, Nicholson ML: Renal ischemia-reperfusion injury Br J Surg (1996) 83: 162-170
101.
Woroniecki R, Ferdinand JR, Morrow JS, Devarajan P: Dissociation of spectrinankyrin complex as a basis for loss of Na-K-ATPase polarity after ischemia. Am J Physiol (2002) 284: F358-F364
88
102.
Yenari MA, Dumas TC, Sapolsky RM, Steinberg GK: Gene therapy for treatment of cerebral ischemia using defective herpes simplex viral vectors. Ann NY Acad Sci (2001) 939: 340-357
103.
Zee RY, Bates D, Ridker PM: A prospective evaluation of the heat shock protein 70 gene polymorphisms and the risk of stroke. Thromb Haemost (2002) 87:622625
104.
Ziegelhoffer A, Dzurba A, Vrbjar N, Styk J, Slezak J: Estradiol modulates the sodium pump in the heart sarcolemma. Mol Cell Biochem (1997) 176: 113-118
105.
Ziemienowicz A, Zylicz M, Floth C, Hubscher U: Calf thymus Hsc 70 protein protects and reactivates prokaryotic and eukaryotic enzymes. J Biol Chem (1995) 270:15479-5484
106.
Zihim RA, Boyd PA, Ainslie Patrick WJ, Burdon RH: Human heat shock protein gene polymorphisms and sudden infant death syndrome. Arch Dis Child (1996) 75: 451-452
89
13. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE
ADP – adenozin-difoszfát ARF - akut veseelégtelenség ATP - adenozin-trifoszfát BSA – bovine serum albumine BUN- karbamid nitrogén cDNS – komplementer dezoxiribonukleinsav CN- szérum kreatinin CO - verotérfogatot dNTP – dezoxi- nukleozid-trifoszfát EBV- Epstein-Barr vírus ECL - felerosített kemolumineszcencia (enhanced che moluminescence) ESRD – végállapotú veseelégtelenség GAPDH - glicerin-aldehid-3 foszfát-dehidrogenáz GFR- glomeruláris filtrációs ráta H–hím HR – szívfrekvencia HSP- ho sokk fehérje I/R- iszkémia/reperfúzió Ig – immunglobulin IRDS – infant respiratorikus disztressz szindróma MAP - artériás középnyomás MHC - fo hisztokompatibilitási komplex MRNS - messenger (hírvivo) ribonukleinsav N - nostény NADH – nikotin-amid-dehidrogenáz NCBI - National Center for Biotechnology Information NEC - nekrotizáló enterocolitis NKA - Na+/K + ATPáz NO – nitrogén- monoxid PBS - foszfát puffer (phosphate buffer salinated) 90
PDA – patent ductus arteriosus PEL – pellet PMSF - fenil- metil-szulfonil fluorid RBF- renális véráramlás RFLP - restrikciós fragment hossz polimorfizmus RT-PCR - reverz transzkriptáz polimeráz láncreakció RVR - renális vaszkuláris rezisztencia SDS - nátrium-dodecil szulfát SLE - szisztémás lupus erythrematosus SUP – szupernatáns TNF - tumor nekrózis faktor TOT- total tissue homogenate (teljes szövethomogenizátum) TRIS-HCl - trisz-(hidroxi- metil)-amino- metán hidroklorid TVR - teljes érellenállás VLBW – very low birth weight (igen kis születési súly)
91
