Rekombináns Géntechnológia

2. Rekombináns Géntechnológia

Rekombináns Géntechnológia Tartalom: 1. Biotechnológia, géntechnológia, társadalom 2. Genetikai rekombináció 3. Génbevitel tenyésztett sejtekbe 4. Genetikailag módosított szervezetek (GMO-k) 4a. Transzgénikus állatok az alapkutatásban 4b. Knock-out állatok 4c. In vivo RNS interferencia 4d. Genetikailag Módosított Szervezetek a gazdaságban – máshol tárgyalt 4e. Genetikailag módosított mikroorganizmusok 4f. Rövid GMO történelem 5. Rekombináns fehérjék 6. Antitest technológia 7. Antibiotikumok

1. Társadalmi Bizalmatlanság DIA 1 Géntechnológia – Világveszedelem No.1 A modern biológia vívmányaival szemben rendszerint nagyfokú a társadalmi szintű ellenérzés szinte minden területen. A hollywoodi filmekben a gén manipulátor tudós rendszerint gonosz, és minimum a teljes emberiség kiirtásán fáradozik. Továbbá, a géntechnológia produktumait szembeállítják a „természetes” termékekkel, mondván, hogy az előbbiek géneket tartalmaznak, s ezért károsak az egészségre. A vita színvonalát jelzi ez utóbbi megállapítás. Érdekes módon, a géntechnológiával szembeni társadalmi bizalmatlanság magvát maguk a kutatók vetették el a múlt század hetvenes éveiben. Megjegyzés: Az előadás anyagában több helyen kritizálom a környezetvédő mozgalmak, véleményem szerint, - gyakran teljesen alaptalan hisztériakeltését a géntechnológia termékeivel szemben. Mivel, a téma megosztja a társadalmat, ezeket a kijelentéseket magánvéleménynek tekintsék (bár meg vagyok győződve az igazáról), s nem várom el, hogy a hallgatók is azonosuljanak vele; ilyen jellegű kérdések nem fognak szerepelni a számonkéréseken. DIA 2 Moratórium, majd Asilomari konferencia A molekuláris klónozási technikák kidolgozását követően a kutatók nagy elánnal álltak neki a különféle forrásból származó DNS-ek plazmidokba való klónozásának. Paul Berg egy kisméretű genommal rendelkező majom vírus, az SV40 (simian virus) plazmidba való klónozásán dolgozott, amikor kételyei merültek fel a protokoll veszélytelenségét illetően. Mivel az SV40 vírus tumort okoz, a molekuláris klónozásban használt E. coli rokonai pedig az ember bélcsatornájában élnek, Berg úgy vélte, hogy fennáll a veszélye, hogy fertőző tumor indukáló baktériumokat állítunk elő. Egy másik aktuális probléma az inzulin génjének E. coli plazmidjába való beültetése volt. Itt a veszélyt abban látták, hogy a baktérium által bevitt inzulin gén túltermelődik, ami ezáltal letális inzulin sokkot idézhet elő az emberben. Ezért Berg javaslatára moratóriumot (szüneteltetést) hirdettek a genetikai beavatkozások minden formájára. Az 1975-ben összehívott Asilomari konferencia volt hivatott annak eldöntésére, hogy mi legyen az újdonsült, nagy lehetőségekkel kecsegtető DNS rekombináción alapuló technológiák sorsa. Ezen a konferencián fektették le azt az alapelvet, hogy amíg nem derül ki valamiről, hogy veszélyes, addig azt úgy kell tekinteni, hogy nem az, viszont, a maximális biztonsági feltételek betartásával kell végezni az ilyen jellegű kísérleteket. Az alapokat az USA Egészségügyi Hivatala (NIH, National Institute of Health) fektette le, megszabván a laboratóriumokban való munka és a laboratóriumok biztonságának pontos kritériumait. Az egyik ilyen biztonsági tényező az volt, hogy csak olyan E. coli törzseket lehetett használni, amelyeket genetikai módszerekkel alkalmatlanná tettek a „természetben” való életre (csak a laboratóriumban voltak fenntarthatóak). A médiában nagy visszhangot váltott ki az a tény, hogy maguk a kutatók voltak bizonytalanok a technikák veszélytelenségét illetően, természetesen, úgy tálalva a dolgot, hogy a kutatók veszélyesnek gondolják azokat. DIA 3 Jelen aggodalmak Vita alakult ki az egyes technológiákról, ill. a génmanipuláció egészét illetően. Sokan attól tartanak, hogy a molekuláris biológusok különféle új fertőző betegségeket szabadítanak az emberiségre. Korábban többen úgy vélték, hogy az AIDS-et is a kutatók szabadították az emberiségre, az a híresztelés kapott ugyanis szárnyra, hogy a HIV a járványos gyermekbénulás (poliomielitis) vakcinálásával terjedt el. A vakcina vírust ugyanis majom sejtekben tenyésztik, amelyekben ott lehet a HIV. Ez a feltételezés azonban tévesnek bizonyult. Továbbá, sokaknak, különböző okok miatt, az nem tetszik, hogy megváltoztatjuk az evolúció természetes menetét, ill. beavatkozunk a Teremtő munkájába. Egy másik ellenérv a genetikailag módosított szervezetekkel szemben az, hogy ezek kiszorítják a természetes fajtákat, s így monokultúrák alakulnak ki. A genetikailag módosított haszonnövények és állatok (GMO-k) kapcsán az merült fel, hogy ezek egészségtelenek, s tk. Európában alig forgalmaznak ilyen „termékeket”. Lehet, hogy a politikusok is elhiszik a sületlenségeket, az azonban bizonyos, hogy az amerikai áruk elleni védekezés (protekcionizmus) hatékony formája arra hivatkozni, hogy nem bizonyított a GMO-k egészségre való ártalmatlansága. Egy másik érv az, hogy a GMO-k elterjedhetnek, s kiszorítják a természetes” fajokat az ökoszisztémából. Az USA-ban a génmódosított növények vetési területe mellé hagyományos haszonnövényeket kell ültetni.

ALAPKÖVETELMÉNY

21. Előadás

Boldogkői Zsolt ©

1


2. Genetikai rekombináció DIA 4 Genetikai rekombináció A plazmidokba (vagy egyes, kis genommal rendelkező vírusokba)

restrikciós enzimek (RE) és DNS ligázok alkalmazásával építhetünk be idegen géneket. A nagyobb genommal rendelkező fajok DNS-ébe történő idegen gének bevitelére ez a technika azonban nem alkalmas. Ennek oka az, hogy a genomiális DNS-ben nagyszámú RE felismerő hely található, s így egy adott RE rengeteg darabra vágná azt szét. A nagy genommal rendelkező élőlényekbe genetikai rekombinációval viszünk idegen DNS-eket (az idegen DNS-t azonban itt is restrikciós enzimekkel, vagy PCR-el állítjuk elő!). Ha az idegen DNS véletlenszerűen épül be a genomi DNS-be, akkor illegitim („nem legális”, véletlenszerű) rekombinációról, ha pedig homológ szekvenciák kicserélődése révén, akkor homológ rekombinációról beszélünk. A hely-specifikus rekombinációnál az idegen gén beépülésének helyét specifikus szekvenciák jelzik. DIA 5 Az illegitim rekombináció során a bevitt transzgén rendszerint több kópiában, egymás közelében, tandem orientációban épül be a genomba. E technika problémája az, hogy nem tudjuk irányítani a beépülést, s ezért az idegen gén véletlenszerűen integrálódik a cél-genomba. Gondot okozhat, ha az idegen gén a gazdasejt egy fontos génjébe épül be, s ezáltal inaktiválja azt, vagy ha az idegen gén heterokromatin régióba épül be, s ezért az nem lesz képes kifejeződni. Az ábra felső részén a gyűrű alakú plazmidból csak egy rövid részt ábrázoltunk, ezért lineáris. Az alsó ábrán a „kromoszóma” névvel jelzett DNS szakasz a genomiális DNS-t jelzi. Az idegen DNS-t különféle technikákkal vihetjük be a sejtekbe (ld. lenn). DIA 6 A homológ rekombináción alapuló technológia során első lépésként izoláljuk a genomon elhelyezkedő cél-szekvenciát (ahová be akarjuk építeni az idegen gént), majd ezt beépítjük egy plazmidba. Ezt követően, a bevinni kívánt gént ebbe a klónozott szekvenciába építjük be. Az így előállított klónozott DNS-t be kell juttatnunk a sejtbe, ahol a homológ szekvenciák felismerik egymást, s megtörténik a rekombináció, melynek eredménye az idegen gén gazda DNS-be való integrációja lesz. Ellentétben az illegitim rekombinációval (amely véletlenszerű DNS beépüléssel jár), ezzel a technikával célzottan (meghatározott helyre) építhetünk be idegen géneket, ill. üthetjük ki a gazdaszervezet egy meghatározott génjét. Nincs DIA A hely-specifikus rekombináció esetén a DNS-ben lévő néhány specifikus szekvencia jelöli meg az idegen szekvenciák beépülési helyét. Ilyen pl. a T2 fág Cre/loxP rendszere, ahol a Cre rekombináz enzim két loxP szekvencia közé képes bármilyenidegen DNS-t beépíteni, vagy onnan kivágni. Ezt a technikát alkalmazzák a molekuláris genetikában is (más alkalommal lesz róla szó). Az antitest gének átrendeződését végző RAG enzimek is helyspecifikus rekombinációt alkalmaznak (a rekombinációs szignálokat ismerik fel). Az antitest gének osztályváltó rekombinációja is ezen a mechanizmuson alapul: az AID enzim a váltó szekvenciákat ismeri fel.

3. Génbevitel tenyésztett sejtekbe DIA 7 Tenyésztett sejttípusok Különféle típusú sejtek tenyészthetők in vitro (tenyésztő edényben). (1) Egy normál testi sejt (pl. egy fibroblaszt sejt) in vitro is ugyannyit osztódik, mint a testben. Ezeket sejteket nevezzük primer (elsődleges) sejttenyészeteknek. Primer tenyészetet előállíthatunk posztmitotikus állapotú sejtekből (neuron és szívizomsejtek) is; ezek in vitro sem osztódnak. (2) A tumoros sejtvonalak (ezeket általában tumorokból nyerik) korlátlan ideig képesek osztódni, a tenyésztő edényben egymás hegyén-hátán helyezkednek el. (3) Az ún. halhatatlan (immortalizált) sejtvonalak is képesek korlátlanul osztódni, de - a tumor sejtekkel ellentétben - ezek a sejtek megtartják a sejttípusra jellemző tulajdonságaikat, s tenyésztő edényben egy sejtrétegű kultúrát alkotnak. DIA 8 Génbeviteli technikák - tenyésztett sejtekbe Tenyésztett sejtekbe fizikai/kémiai (transzfekció) vagy vírus-alapú (infekció) módszerekkel vihetünk be idegen géneket. A leggyakoribb nemvirális metodikák a liposzómán alapulnak. A liposzómák foszfolipid kettős rétegű gömb alakú „szerkezetek”, amelyek, DNS mellett, különféle drogokat is szállíthatnak (vízben és zsírban oldódóakat is). A liposzómák a sejt membránjával összeolvadva juttatják be a szállított anyagokat (pl. DNS-t) a sejtbe. Egyéb transzfekciós technikák a kalcium foszfáttal, elektroporációval és a génpuskával történő génbevitel. A vírus-alapú génbevitel pedig főként a genomba nem integrálódó adenovírusokon és adeno-asszociált vírusokon (AAV), ill. a genomba beépülő retrovírusokon alapul. A retrovírusok esetén a vírus egyes szerkezeti elemeit kódoló géneket a szaporításra használt sejtekbe építik (transzformáns sejtek), s ezeket a sejteket olyan vírusokkal fertőzik, amelyek genomjában hiányoznak ezek a gének. A transzformáns

ALAPKÖVETELMÉNY

21. Előadás

Boldogkői Zsolt ©

2


3

sejtekben fertőzőképes vírusok keletkeznek, mivel minden fehérje komponensük előállítódik (részben a sejtek, részben a vírus genom által kódoltak), de, a hiányzó gének miatt, az így nyert vírussal való újabb fertőzés nem okoz citotoxicitást normális sejtekben. A primer sejttenyészetekbe való fizikai/kémiai alapú génbevitel nem hatékony, ezért itt főként vírusokat alkalmaznak. DIA 9 Idegen gén sejtekbe való bevitele – transzgén A szemléletesség kedvéért vegyünk egy olyan transzgént, melynek fehérje terméke kékre festi a transzformált sejteket (pl. lacZ gén által kódolt βgalaktozidáz X-Gal szubsztrát jelenlétében). Az ábrán látható, hogy a génbevitel csak bizonyos hatékonysággal megy végbe, azaz, nem miden sejt transzformálódik. Sejtkultúrában ez az arány halhatatlan sejtvonalaknál, akár 50% is lehet, primer sejteknél, kb. 1%, ha fizikai/kémiai módszereket alkalmazunk; a virális génbevitel azonban akár 100%-os hatékonyságot is eredményezhet. DIA 10 Idegen gén – átmeneti kifejeződés Ha egy idegen gént (a megfelelő transzkripció-szabályozó szekvenciákkal felszerelve) bejuttatunk egy sejtbe, akkor a leggyakrabban az történik, hogy az idegen DNS bekerül a sejtmagba, de nem integrálódik a gazda genomjába. Ilyenkor az idegen gén általában csak átmenetileg (tranziensen) fejeződik ki. Ennek egyik oka az, hogy a sejt nem kedveli az idegen szekvenciákat, s rövid idő elteltével eliminálja azokat, ezért előbb utóbb eltűnik a mRNS és a fehérjetermék is. A génexpresszió viszonylag gyors eltűnésének másik oka az, hogy a sejtosztódások miatt az idegen gén kihígul, az ugyanis nem sokszorozódik együtt a sejttel. DIA 11 Idegen gén – stabil kifejeződés Ha az idegen gén beépül a gazda DNS-ébe, onnantól kezdve a sejt sajátjaként fogadja el, s a gén kifejeződése stabil (hosszú-távú) lesz. Ennek feltétele az, hogy a transzgén a gazda genom egy permisszív megengedő; ellentéte a represszív (gátló) szakaszába épüljön. Represszív genomiális környezet pl. a heterokromatin régió, ami erősen metilált DNS és hiszton szinten is (pl. a kromoszóma végek és centromer környéki részek).

4. Idegen gének átmeneti kifejeződése állati sejtekben DIA 12 Idegen gén bevitele adeno-asszociált vírus (AAV) vektorral Az AAV egy egyszálú DNS-t tartalmazó parvovírus, amelytől korábban azt gondolták, hogy beépül a gazdagenomba, de kiderült, hogy nem. Az AAV DNS-ébe épített idegen gén emiatt átmenetileg fejeződik ki, osztódó sejtekből kihígul. Az AAV a posztmitotikus sejtekbe (idegsejtek, szívizomsejtek) való génbevitel legfontosabb vektorává vált az utóbbi években. A vírus előnye, hogy nagy hatékonysággal képes fertőzni a célsejteket, s nem okoz citotoxicitást azokban (a retrovírusokhoz való hasonló logikai elv miatt – bizonyos vírus géneket a transzformáns sejtek DNS-e tartalmaz, míg a vírus ezek nélkül nem képes replikálódni). Hátránya az, hogy kisméretű idegen géneket képes befogadni a genomjába. Sokféle módszer létezik az idegen gének beépítésére (rekombináns vírusok készítésére). Leggyakrabban egy segítő (helper) vírust alkalmaznak a szaporodáshoz (adenovírus vagy herpeszvírus), ill. az AAV bizonyos génjeit külön juttatják be a sejtbe (transzfekció), esetleg a sejtek DNS-ébe építik ezeket előzőleg, s így a képződő vírus csak a minimális virális DNS-t és az idegen gént tartalmazza.

5. Idegen gének stabil kifejeződése állati sejtekben DIA 13 Genetikailag módosított szervezetek (GMO: genetically modified organisms) egy vagy több, más fajból származó, idegen gént tartalmaznak. A genetikailag módosított szervezeteket csoportosíthatjuk aszerint, hogy milyen célból állítjuk elő őket. Eszerint megkülönböztethetünk (1) alapkutatás céljából, ill. (2) gazdasági haszonnyerés végett előállított élőlényeket. A laikus közvélemény ez utóbbi csoportra használja a GMO kifejezést, mivel nem ismeri az első kategóriát. A genetikailag módosított élőlényeket csoportosíthatjuk rendszertani hovatartozásuk szerint is. Ez alapján beszélhetünk genetikailag módosított mikroorganizmusokról, növényekről, állatokról, ill. emberről. A genetikai módosítás során (a) bevihetünk idegen géneket; ez tk. horizontális géntranszfer, melynek eredményeként transzgénikus élőlényeket kapunk, vagy (b) kiüthetjük a gazdaszervezet egy vagy több génjét (knock-out élőlények). DIA 14 A transzgénikus élőlények olyan állatok, amelyek genomjába egy vagy több idegen gént ültetünk abból a célból, hogy kifejeződjenek az állat minden sejtjében, vagy csak bizonyos sejttípusokban. Az idegen gén minden sejtben jelen van, de nem feltétlenül minden sejtben fejeződik ki. A transzgénikus állatokat használhatjuk (1) modellként a beültetett gén funkciójának a gén sejtre vagy akár az egész szervezetre kifejtett hatásának vizsgálatára, melynek jelentősége az alap- és/vagy az alkalmazott (pl. orvosi) kutatásban van; (2) gazdasági haszonállatokként (vagy haszonnövényekként); ill. (3) a jövőben génterápiára.

ALAPKÖVETELMÉNY

21. Előadás

Boldogkői Zsolt ©


4

DIA 15 Génbevitel élő egyedekbe Az élő egyedekbe való génbevitelt osztályozhatjuk aszerint, hogy a transzgént az egyed összes sejtje tartalmazza-e vagy csak bizonyos sejtjei. Az előbbi esetben csíravonal génbevitelről beszélünk, az utóbbi esetben pedig szomatikus génbevitelről. Ha a génbevitel terápiás célú, akkor csíravonal- vagy szomatikus génterápiáról beszélünk. (1) Csíravonal sejtekbe történő génbevitel esetén használhatunk természetes csíravonalból származó sejteket (leggyakrabban zigótát), vagy pluripotens embrionális őssejteket, amelyeket a hólyagcsíra belső sejttömegébe juttatva, élő egyedet produkálhatunk. Egy idegen gént bevihetünk a zigótába mikroinjekcióval, a még össze-nem-olvadt hím pronukleuszába oltva a DNS-t (nem tudjuk miért, de csak így épül be illegitim rekombinációval a transzgén a genomba). Tenyésztett zigótába genetikailag módosított (avirulenssé tett) retrovírussal is bevihetünk idegen géneket. Az embrionális őssejt alapú technikával az általunk kiválasztott DNS szakaszokba célzottan (homológ rekombinációval) is bevihetünk idegen géneket, ill. a funkcióját vesztett géneket kicserélhetjük normálisokra, vagy a normálist kiütjük (knock-out technológiával). (2) Testi (szomatikus) sejtekbe való génbevitelt rendszerint felnőtt egyedekben alkalmazunk. Ezzel a megközelítéssel bizonyos testi sejtekbe szeretnénk transzgéneket bevinni különböző céllal (pl. génterápia). Jelenleg a felnőtt egyedekbe való génbevitelre a vírus vektorok a leghatékonyabbak, a fizikai/kémiai módszerek nem igazán működnek. A génbevitel történhet közvetlenül, tehát az idegen DNS-t hordozó vírus vektort vagy liposzómát beoltjuk az adott szövetbe; vagy először őssejtekbe juttatjuk be a transzgént, s ezt követően a transzformált sejteket ültetjük be a szervezetbe. Az őssejtekbe fizikai/kémia módszerekkel, vagy retrovírus vektorokkal vihetünk be idegen DNS szekvenciákat. In vivo alkalmazásnál a liposzómákat gyakran ellátják védő réteggel (így a szervezetben stabilan megmaradnak), ill., a membránba illeszthetőek különféle homing peptidek, melyek az egyes sejttípusokba való bejutáshoz szükségesek (pl. homing peptid lehet egy adott receptor ligandja, amely felismeri az ilyen receptorokat kifejező sejttípusokat). Ez a technika a tumor terápiában tűnik ígéretesnek. DIA 16 Transzgénikus állatok: idegen gén bevitele zigótába pronukleáris mikroinjekcióval Egy élőlény genomjába rendszerint azért viszünk idegen géneket, hogy azok kifejeződjenek, ezért ezeket szabályozó szekvenciákkal látjuk el (promóter, enhanszer, stb.). A pároztatás időzítésével olyan zigótákat izolálhatunk, amelyekben a hímivarsejt sejtmagja még nem olvadt össze a petesejt magjával (ilyenkor pronukleuszokról, azaz elő-magvakról beszélünk). Az idegen DNS-t az izolált zigótának a hím pronukleuszába ültetjük. Közben hormonkezeléssel és steril hímmel (ondóvezetéket elkötjük) való kopulációval előkészítünk egy másik nőstényt, melynek méhébe beültetjük a kezelt zigótákat. Az utódokat megvizsgáljuk (a farkukból nyert DNS-ből, PCR analízissel), hogy tartalmazzák-e a beültetett gént, s ha igen akkor ők a transzgénikus alapítók, melyeket beltenyésztéssel szaporítunk. DIA 17 Transzgénikus állatok: idegen gén bevitele retrovírus vektorral A protokoll hasonló a fentiekhez, csak nem mikroinjektáljuk a zigótát, hanem olyan retrovírussal fertőzzük meg, amelyet előzőleg replikációra képtelenné tettünk, s beépítettük a genomjába a bevinni kívánt transzgént. A retrovírusok RNS-e első lépésben reverz transzkripcióval DNS-é alakul, amely kétszálúvá válik, majd a transzgénekkel együtt beépül a gazdagenomba. DIA 18 Transzgénikus állatok: idegen gén bevitele – Embrionális őssejtekbe Az előzőekhez hasonlóan, a szemléletesség kedvéért, egy kék színt eredményező gént viszünk be tenyésztett embrionális őssejtekbe (embrionic stem cells; ES cells). Ezt követően a létrejött transzformáns sejteket beültetjük egy hólyagcsíra belső sejt tömegébe (nem lehet az eredeti sejtek mindegyikét kicserélni, csak néhány transzformáns sejtet injektálhatunk a hólyagcsírába), majd a kevert sejteket tartalmazó hólyagcsírát beültetjük egy a vemhességre előkészített egér méhébe. Az utódok között lesznek olyanok, amelyikek csíravonal sejtjeibe is beépül a „kék” gén. Ezen állat utódainak a fele (mivel rendszerint csak egy kromoszómába épül be a „kék gén”) minden sejtjében hordozni fogja az idegen gént. DIA 19 Embrionális őssejtekbe való génbevitel A folyamat részleteiben a következőképpen zajlik. (1) A donor szülők

által produkált hólyagcsírát (blasztociszta) izoláljuk, majd (2) embrionális őssejt tenyészetet készítünk a belső sejttömeg sejtjeiből. (3) Az ES sejtekbe egy olyan rekombináns plazmidot viszünk be, amely többek között tartalmazza a bevinni kívánt idegen gént és egy antibiotikum rezisztencia gént. (4) A transzformáns sejteket antibiotikum rezisztenciára szelektáljuk (a nemtranszformáns sejtek elpusztulnak az antibiotikum citotoxikus hatásának következtében). (5) Egy másik szülőpárral (donor-2) egy újabb blasztocisztát hozunk létre, amibe beültetjük a (6) transzformáns sejteket, majd (7) a módosított blasztocisztát befogadó szülő méhébe oltjuk. A befogadó szülő olyan nőstény, amit hormonkezeléssel és steril hímmel való pároztatással alkalmassá tesszük a transzformáns sejteket tartalmazó hólyagcsíra befogadására. (8) A létrejött utódok genetikai mozaikok lesznek, hiszen a transzformáns ES sejtek csak egy bizonyos hányadát tették ki a belső sejttömeg sejtjeinek. (9) Azok az utódok, amelyek a csíravonal sejtjeikben tartalmazzák a transzgént - egy normál egérrel pároztatva- tovább is adják azt az utódaiknak, amelyek így heterozigóták lesznek. (10) A heterozigóta egyedeket beltenyésztéssel (11) homozigótává tehetjük. Megjegyzés: az ES sejt technológiát inkább knock-out állatok előállítására használják, a transzgénikus állatok előállítására egyszerűbb a

ALAPKÖVETELMÉNY

21. Előadás

Boldogkői Zsolt ©

2. Rekombináns Géntechnológia pronukleáris mikroinjekció. Ez a technika alkalmazható irányított génbevitelre is (a fenti protokollal zömében illegitim rekombináció történik), ennek részleteit a knock-out technikánál ismertetjük.

DIA X Csipke Rózsika és Béka Herceg Idegen gének DNS-be való hatékony beépülésére magyar kutatók dolgoztak ki egy

módszert. Első lépésként hal transzpozonokat „élesztettek újra”, azaz korrigálták azokat a hibákat, amelyek miatt a transzpozon nem volt képes ugrálni (Csipke Rózsika, Sleeping Beauty; nagyon ritkák a működőképes transzpozonok az élőlények DNS-ében – az emberben mindegyik inaktív, kivéve a RAG). Ugyanezt megismételték egy béka transzpozonnal (Béka Herceg, Frog Prince). Ezek a rendszerek hatékonyan használhatók idegen gének gazda genomba való bevitelére, egyelőre illegitim rekombinációval. A technika lényege az, hogy a DNS transzpozáz gént kicserélték egy idegen génre, amely így IR (inverted repeat) szekvenciákkal határolt, magát a transzpozáz gént pedig vagy stabilan, vagy tranziensen kifejezik egy más promóterrel abban a sejtben, melynek a DNS-ébe akarják ültetni a transzgént. A gének adott genomi lokuszába való célzott bevitel kidolgozása egy ideális génbeviteli vektorrá tenné a transzpozonokat.

DIA 20 A génkifejeződés szabályozása Ha egy idegen gén egy egyed minden sejtjében jelen van, akkor szabályozni kell a

kifejeződését, hiszen csak bizonyos sejtekben való aktivitás a kívánatos, más sejtekben zavaró, vagy akár toxikus is lehet a működése. (1) Konstitutív (folytonos) gén expresszióról akkor beszélünk, ha az idegen gén állandóan működik. Ennek esetei a következők: a gén kifejeződhet (1a) minden sejtben; (1b) minden hasonló sejttípusban (pl. minden neuronban); (1c) csak bizonyos sejttípusokban (pl. a hippocampus piramis sejtjeiben). Ezek a lehetőségek az idegen géneket szabályozó promóter/enhanszer szekvenciáktól függenek. (2) Léteznek olyan technikák, amik lehetővé teszik, hogy a beépített idegen gének csak akkor működjenek, ha indukáljuk őket (hővel, külső anyagok hozzáadásával, stb.). Az idegen gének bevitele funkciónyerést eredményez. Ha a szervezet saját génjeit inaktiváljuk (knock-out), az funkcióvesztéssel jár. A knock-out technológiával kiütjük egy egyed valamelyik génjét, s így zéró expressziót érünk el. RNS interferenciával a már leíródott mRNS-ek aktivitását blokkolhatjuk (poszt-transzkripciós szabályozás). Ezzel a technikával felnőtt egyedekben is szabályozhatjuk a gének kifejeződését (knock-down technológia), aminek óriási perspektívát jósolnak az orvostudományban. A probléma jelenleg a duplaszálú RNS-ek vagy az azokat kódoló DNS szakaszok specifikusan a célsejtekbe való juttatása.

DIA 21 Sejttípus-specifikus génexpresszió Egy adott transzgén kifejeződése rendszerint csak bizonyos sejttípusokban

kívánatos. A probléma e feladat megoldásában az, hogy az eukarióta gének szabályozó elemei nagyon hosszú DNS szakaszokon szétszórva helyezkednek el, s nem tudjuk, hogy ezek közül melyek fontosak az adott gén egy bizonyos sejtféleségben való, megfelelő szintű, kifejeződéséhez. A problémát az ún. BAC (bacterial artificial chromosome; bakteriális mesterséges kromoszóma) technológiával oldják meg. A BAC olyan baktérium plazmid, amely kis kópiaszámban van jelen a baktérium sejtben, de hatalmas DNS darabok befogadására képes (ilyen pl. az F plazmid is). A BAC-ban a transzgént egy olyan gén helyére építjük be, amely a kívánt sejttípusban kifejeződik, úgy hogy a transzgént az eredeti gén helyére tesszük, meghagyva annak szabályozó szekvenciáit. Mivel a BAC egy nagyon hosszú DNS szekvencia, az idegen gént csak extrém ritkán hasító restrikciós enzimek segítségével lehet beépíteni (ld. DIA 23). Manapság azonban inkább különféle rekombinációs technikákat alkalmaznak erre a feladatra. Az elkészített BAC klónt illegitim rekombinációval visszajuttatják a gazda genomjába. Az idegen gén kifejeződése pontosan olyan lesz, mint aminek a helyére építették a BAC klónban (a genomban az eredeti celluláris gén aktív marad, mivel a genomba való beépülés illegitim rekombinációval történik, tehát, a transzgén más DNS régióba kerül). A sejt-specifikus génexpresszió elérésének másik módja az ES sejtekbe homológ rekombinációval való génbevitel, ami elérhető a fentebb említett BAC klónokkal is, de ettől jóval kisebb DNS szakaszokkal is. Itt a probléma az, hogy az idegen gén az eredeti gén helyére kerül, s így az inaktívvá válik. A géncserén alapuló technikának akkor van jelentősége, ha egy nem működő gént cserélünk ki egy ugyanolyan, de funkcióképes génre. Ez utóbbi génbevitel ugyanolyan technikával történik, mint a knock-out állatok előállítása.

Génkiütött állatok DIA 22 Knock-out állatok – Nobel Díj A knock-out technológia kidolgozásáért Nobel Díjat adományoztak 2007-ben. Martin Evans az embrionális őssejt technológia, Mario Capecchi és Oliver Smithies pedig a homológ rekombinációs technika kidolgozásáért érdemelték ki a kitüntetést. Homológ rekombinációval nem csak kiüthetünk egy gént, hanem egy hibás gént ki is cserélhetünk egy működőképesre. Mindkét megközelítésnek komoly jelentősége lehet a gyógyításban. DIA 23 Génkiütött (knock-out) állatok előállítása Egy transzgént rendszerint a genom tetszőleges részébe építünk be

illegitim rekombinációval. Ha viszont egy gént ki akarunk ütni, azt csak célzottan tehetjük meg. A génkiütéshez egy homológ rekombináción alapuló kettős szelekciós rendszert használunk. Az első szelekciós lépést a neomicin foszfotranszferáz (neo, a neomicin antibiotikum elleni rezisztencia) nevű gén biztosítja. Ezt a gént kell célzottan bejuttatni egy kiválasztott gén helyére. A feladatot úgy végezzük el, hogy a kiválasztott gént tartalmazó DNS szekvenciát izoláljuk, majd egy plazmidba építjük be, ezt követően pedig a neo gént a kiütni kívánt gén helyére ültetjük be, úgy, hogy a kiütendő gén körüli DNS szekvenciák körül fogják a neo gént (ezek a határoló szekvenciák szolgáltatják a homológiát a homológ rekombinációhoz). Így kapjuk az ún. targeting („célzó”) plazmidot, amely az adott gén kiütésére szolgáló pozitív szelekciós rendszer. Azért pozitív, mert azok a sejtek, amelyek tartalmazzák a neo gént, túlélik a transzfekciót követő antibiotikum kezelést. A probléma azonban az, hogy a gazda genomba való véletlenszerű beépülés (illegitim rekombinációval) jóval nagyobb esélyű (több mint 100x-os), mint a homológ rekombináción alapuló célzott beépülés. Ezért a targeting („célzó”) plazmid tartalmaz még egy negatív szelekciós gént is, ami leggyakrabban a herpesz szimplex vírus timidin kináz génje (tk). A TK enzim az acyclovir nevű anyagot toxikus termékké bontja (az acyclovir nem szubsztrátja a celluláris TK enzimnek). Tehát, a rendszer a következőképpen működik: a fenti targeting plazmidot bevisszük az ES sejtekbe, ahol az, kis gyakorisággal, beépül a genomba. Neomicinnel való szelekcióval kiválogatjuk azokat a sejteket, ahol a beépülés megtörtént. Ezzel a protokollal azonban kétféle genetikailag módosított sejtpopulációt állítunk elő: (1) sok illegitim rekombinációval beépült neo és tk gént tartalmazó ES sejtek, ill. (2) kevés, csak neo-t tartalmazó ES sejtek. Ha ugyanis homológ

ALAPKÖVETELMÉNY

21. Előadás

Boldogkői Zsolt ©

5


6

rekombináció megy végbe, akkor csak a célszekvenciával homológ határoló szekvenciák közötti DNS szakasz (itt neo) épül be a genomba, a tk gén viszont nem. A homológ rekombináció eredménye a gén kiütése lesz, s ez az az ok, amiért a neo+, tk- sejtekre szelektálunk.

DIA 24 Génkiütött (knock-out) állatok előállítása (ES sejtekben való génkiütés) A knock-out állatok előállításának

menete nagyon hasonló a fentebb említett ES sejt-alapú transzgénikus állatok előállításához. A fő különbségek következők: (1) a targeting plazmidban egy negatív szelekciós marker is van, ill. (2) a végeredmény: a transzgenezis funkciónyeréssel, a génkiütés pedig funkcióvesztéssel jár. A fenti protokoll eredményeként az adott gén csak az egyik kromoszómán inaktiválódik, ezért a knock-out állatok előállításához, az egereket beltenyésztéssel kell szaporítani azért, hogy a gén mindkét homológ kromoszómán ki legyen ütve. A knock-out állatokat az alapkutatásban használják, a kiütött gén funkciójának a megállapítására. Az alapkoncepció az, hogy a knock-out állatokban a sérült anatómiai, biokémiai vagy élettani funkciókból következtetni lehet a normális gének funkciójára. A szervezet azonban egy koherens egész rendszert alkot, amely ráadásul egyetlen sejtből alakul ki az embriogenezis folyamán, ezért a hibás génfunkcióból nem lehet mindig a normális funkcióra következtetni.

in vivo RNS interferencia (géncsendesítés) DIA 25 Nagy erőkkel folyik olyan technikák a kidolgozása, melyek segítségével a sejtek bizonyos génjeinek aktivitását gátolni

tudjuk. Az RNS interferencia (RNSi) jelenleg a legalkalmasabb módszer erre a feladatra, s amely tenyésztett sejtekben és primitívebb állatokban (hengeres féreg és muslica) kitűnően működik. A muslica gének funkciójának legmodernebb vizsgálata a rovar genomjába beépített RNSi-t okozó DNS szekvenciák használata. Az emberben való alkalmazás legnagyobb akadálya az, hogy jelenleg nem tudjuk hatékonyan az RNS interferenciát kiváltó nukleinsavakat a megfelelő sejtekhez irányítani. Az RNSi nem csupán a génműködés tanulmányozására, hanem elvileg gyógyításra is alkalmazható, pl. hibás gének működésének gátlására, a sejtciklus szabályozásában résztvevő gének kifejeződésének csillapítására tumorokban, stb. Az RNSi-t kiváltó nukleinsavak a következők lehetnek: (1) hosszú duplaszálú RNS-ek (ezek emlősökben nem használhatók, mert a sejtek vírustámadásként érzékelik, s apoptózis indítanak be); (2) siRNS-eket; ill. (3) shRNS-eket kifejező DNS-eket. Ez utóbbi ún. kis hajtű (small hairpin) shRNS-eket kódol, melyeket a sejt DICER enzimje siRNS-ekké alakít, s a már ismert lépésekben végbemegy az RNS interferencia, azaz a cél mRNS aktivitásának gátlása az mRNS elbontása révén. Az shRNS-eket kódoló DNS-t bevihetjük fizikai/kémiai módszerekkel (3a) vagy vírus vektorokkal (3b). A lentivírusok (retrovírusokhoz tartoznak) DNS-e beépül a gazda DNS-ébe, míg az adenovírusé nem, s ún. episzómát (nem integrálódó DNS) képez, amely csak rövid ideig fejezi ki az shRNS-t (és minden egyéb idegen gént is). Az RNSi-t kiváltó nukleinsavakat bevihetjük lokálisan vagy szisztémásan (pl. a vérkeringésbe juttatva). A dián részletesen bemutatjuk a különféle beviteli módokat. Az ábrán az shRNS RNSi-t kiváltó folyamatának lépései láthatóak. Az RNSi az ún. P testben megy végbe. A P test sok, a mRNS degradációban résztvevő enzimet tartalmaz.

6. Rekombináns fehérjék DIA 26 Genetikailag módosított baktériumokban sok, a gyógyászatban alkalmazott, rekombináns fehérjét állítanak elő. Néhány példa: Rekombináns fehérjék Inzulin Véralvadás faktorok Növekedési hormonok:

Milyen betegség ellen? diabetes (cukorbetegség) hemofilia (vérzékenység) törpeség

Előny: nem okozhat betegséget (szemben a korábbi, hullákból és sertésekből nyert proteinekkel) Hátrány: a baktériumokban másként érnek a fehérjék (pl. nincs glükoziláció) DIA 27 Baktérium DNS Idegen gének beépíthetők a baktérium genomiális DNS-ébe és a plazmidokba. A plazmidok lehetnek genomba integrálódóak (ilyen pl. az F plazmid), vagy nem integrálódóak. A plazmidok lehetnek nagyméretűek és egyben kis kópiaszámúak (integrálódó és a nem integrálódó plazmidok egyik fajtája) vagy kisméretűek és nagy kópiaszámúak (a nem integrálódó plazmidok másik fajtája). A plazmidba beépített idegen gének elszaporítása maga a klónozás. DIA 28 Az inzulin hatása a glükóz felvételére és metabolizmusára. Első lépésként az inzulin a receptorához kapcsolódik, ami egy aktivációs kaszkádot indít el: glükóz felvétel a glükóz transzportereken keresztül; glikogén szintézis, glükolízis és zsírsavszintézis. További részleteket ld. Főbb jelutak c. előadás. DIA 29 Rekombináns inzulin A fejlett világban a diabetes (cukorbetegség) egyike a vezető halált okozó betegségeknek. Az I-es típusú diabetes a 20-es évek előtt jelentkezik, s oka az, hogy a hasnyálmirigy inzulintermelő sejtjeit megtámadja a saját immunrendszer (autoimmun betegség, az össz-diabetes esetek 9%-a). A II-es típusú diabetes középkorúaknál jelentkezik, különösen túlsúlyos személyeknél (91%), s oka az inzulin receptorok elégtelen működése. Közel 200 millió embert kezelnek inzulinnal a világon. Korábban hullák testéből nyerték az inzulint, ami, amellett, hogy nem volt hatékony módszer, gyakran fertőzéseket is átvitt donorból a páciensbe. Ezt követően, az inzulint sertések és szarvasmarhák pankreászából izolálták. Egy cukorbeteg ellátásához évente 50 sertés hasnyálmirigyét használták. A Hoechst, az egyik legnagyobb

ALAPKÖVETELMÉNY

21. Előadás

Boldogkői Zsolt ©


7

inzulintermelő, évente százezer sertést mészárolt le a pankreászuk kinyerése céljából. Ezért érthető, hogy egy in vitro technológia az inzulin előállításban alapvető jelentőségűnek számított. 1980-ban történt az E. coliban előállított inzulin első önkénteseken való kipróbálása. A rekombináns inzulin előállításának lépései láthatók a 30-as dián. Elsőként az emberi DNS-t restrikciós enzimekkel megvágjuk, majd beépítjük az ugyanazzal az enzimmel megvágott plazmidba DNS ligáz alkalmazásával. Az inzulin gén baktérium promóter irányítása alatt áll. A baktériumokat felszaporítjuk, majd fehérje tisztítási lépések segítségével kinyerjük az inzulint. Manapság már egysejtű gombákban termeltetik az inzulint, s az ipari fermentáció során nyerik ki azt.

DIA 30

A fehérje mérnökség (fehérje „sebészet”; protein engineering) a fehérjék szerkezetének megváltoztatása random (véletlenszerű) vagy irányított mutagenezissel. A fehérje mérnökségben két fő megközelítést alkalmaznak: (1) Irányított Evolúciós megközelítés, ami azon alapul, hogy véletlenszerűen sok mutációt generálunk, majd a kívánt tulajdonságra teszteljük a mutánsokat. Az egyik megjavult sajátságú variánst egy új mutagenezis és tesztelési eljárásnak vetünk alá, s így tovább. Látható, hogy az alapelv hasonlít az evolúció mechanizmusára, innen ered az elnevezés. (2) Az alternatív megközelítés neve Racionális Protein Mérnökség, amely főként egy fehérje (rendszerint enzim) 3D-s szerkezetének ismeretét tételezi fel. A kutatók a Röntgenkrisztallográfiai és NMR adatokat alapján egy számítógépes modellt állítanak fel, s ezen a modellen tervezik meg a lehetséges mutációk hatásait, majd ún. irányított mutagenezissel véghezviszik a legoptimálisabb variációkat, s végül tesztelik, hogy helyes volt-e a modell. Látható, hogy a fenti két módszer nagyon hasonlít a génfunkció kutatásában alkalmazott forward és reverz genetikai megközelítésekre.

7. Antitest technológia DIA 31-36 A mesterségesen előállított antitesteket különféle immunológiai metodikákban használjuk. Idetartoznak az immunhisztokémia, immuncitokémia és az ELISA technikák. Az utóbbi években az ún. rekombináns antitesteket anti-tumor ágenseknek használják az immunterápiára során, de ezek az antitestek potenciálisan génterápiában is használhatók. A specifitásuk és az előállításuk módja alapján háromféle antitestet különböztetünk meg. (1) Poliklonális antitestek Az antitestek előállításának tradicionális módja különféle állatok immunizálása egy adott antigénnel. Az immunizálásos procedúrát többször meg kell ismételni ahhoz, hogy a vérszérumból megfelelő mennyiségű antitestet tudjunk izolálni. A kapott antitestek különféle immunglobulin molekulák keverékéből állnak (különböző B sejt klónokból származnak, innen a név), amelyek az antigén különböző helyeihez (epitópjaihoz) kötődnek. (2) Monoklonális antitestek előállítására szolgáló ún. hibridóma technikát Köhler és Milstein fejlesztette ki, amit a Svéd Tudományos Akadémia Nobel Díjjal jutalmazott. A technika első lépésében egy egeret oltanak be az adott antigénnel. Ismeretes, hogy az antitesteket képző sejtek a csontvelőben keletkeznek, majd innen a lépbe vándorolnak, s a lépből kerülnek ki a vér- és nyirokkeringésbe. Ebben a technikában a limfocitákat nem a vérből, hanem a lépből izolálják. Ekkor még kevert a limfocita populáció. Az izolált limfocitákat (plazmasejt) tumoros plazmasejtekkel (mielóma) sejtekkel olvasztják össze, s ezáltal egy hibrid sejtet (hibridóma, a tumorsejt komponens miatt) állítanak elő. Mivel egy hibridóma egyetlen B sejtből keletkezett (monoklonális), az általa produkált antitestek is csak egyféle epitópot ismernek fel. A legoptimálisabb klónokat az antigénekkel való kapcsolódás erőssége alapján válogatják ki. Egy hibridóma sejt tehát ötvözi a két anyasejt sajátságát: (a) monoklonális antitestet képez és (b) korlátlan ideig szaporítható in vitro, tehát nagymennyiségű antitest nyerhető belőlük. A hibridómák szelekciója két lépésben zajlik: (1) a mielóma sejteket timidin kináz (TK) génben defektes (knock-out) egérből nyerik. Ezek a sejtek nem képesek osztódni ún. HAT táptalajon (a részleteket nem ismertetjük). A normál plazmasejtek nem szaporodnak semmilyen tápfolyadékban. Tehát, HAT tápfolyadékban, csak a hibrid sejtek lesznek képesek szaporodni, mert a fúzióval egy ép TK gént tartalmazó tumor sejtet kapunk. (2) Az osztódó mielóma sejtek azonban két populációból állnak: (a) a kívánt antigént kifejező sejtek, ill. (b) egyéb antigének elleni antitestet kifejező sejtek. Ezen sejtek elkülönítése az antigénhez való kötődéssel végezhető el, pl. ELISA technikával. (3) Rekombináns antitestek a harmadik alternatívát képviseli az antitestek előállításában. Ezeket az antitesteket nem élő

állatokban, hanem baktériumokban vagy bakteriofágokban állítják elő. Leggyakrabban bakteriofágok felszínén fejezik ki az antitestek ún. Fab fragmensét (ld. dia) virális gIII proteinnel fuzionáltatva, melynek az a jelentősége, hogy a Fab fragmensek a fág burkon kívülre kerülnek, s így tesztelhető, hogy működik-e (felismeri-e az antigént) az antitest darab. A rekombináns antitesteket az ún. immunterápia során használják fel. Nem keverendő össze a kiméra antitestekkel, amelyek gyakran egy adott antigén ellen egérben előállított antitestek, melyeknek antigén felismerő szakaszát kivéve, a többi részt, genetikai módszerekkel, kicserélik emberi eredetű szakaszokkal, s így alkalmazható humán gyógyászatban is (pl. Herceptin – mellrák ellenes szer).

ALAPKÖVETELMÉNY

21. Előadás

Boldogkői Zsolt ©


8. Antibiotikumok DIA 37 1928-ban Alexander Fleming kimutatta, hogy Penicillium gomba gátolta a baktériumok növekedését. Ez a felfedezés vezetett a penicillin felfedezéséhez. Néhány évvel később (1932-ben) kimutatták, hogy a sebek kezelése penicillinnel fertőtlenítő hatású. A penicillin ipari méretű alkalmazását egy olyan Penicillin törzs felfedezése tette lehetővé, amely nagy mennyiségben termelte az antibiotikumot (Howard Florey, 1940). A penicillin felfedezését követően, újabb antibiotikumok után kezdték meg a kutatást. A sztreptomicin (a Streptomyces griseus nevű baktérium termeli) lett a következő (1944), melyet számos egyéb antibiotikum követett. Az 1970-es évekre a természetes izolátumok helyét átvették a szintetikus antibiotikumok, amelyek még hatékonyabbak lettek. Ezeket ipari fermentációval állítják elő. Maguk a fermentációhoz használt mikroorganizmusok sem vadtípusúak már, hanem genetikai módosításokkal alakították át őket optimális törzsekké. Az antibiotikumok hatása a baktériumokra és a baktériumok hatása az antibiotikumokra a dián látható.

ALAPKÖVETELMÉNY

21. Előadás

Boldogkői Zsolt ©

8

Rekombináns Géntechnológia

Recommend Documents