Protilátkami modifikované částice pro izolaci zinek vázajících proteinů Ing. Soňa Křížková, Ph.D. 24. 2. 2012 Reg.č.projektu: CZ.1.07/2.3.00/20.0148
Název projektu: Mezinárodní spolupráce v oblasti "in vivo" zobrazovacích technik
• • • •
Paramagnetické částice Protilátky proti těžkým kovům Imunoglobuliny Způsoby imobilizace protilátek na povrch paramagnetických částic • Zinkové proteiny • Imunoseparace Zn-proteinů z bakteriálního lyzátu • Imunoseparace Zn-proteinů z krevní plasmy
...om
...om • • • • • • • • • • • •
Genom Proteom Metallom Peptidom chemoproteom Metabolom Transkriptom miRNom Lipidom Glykom Interaktom Degradom
• …..cca 100 „–omů“
• Soubor molekul s podobnými vlastnostmi v organismu • Biom
...omika • • • • • • • • • • • •
Genomika Proteomika Metallomika Peptidomika chemoproteomika Metabolomika Transkriptomika miRNomika Lipidomika Glykomika Interaktomika Degradomika
• …..cca 100 „–omik“
• • • •
Separační metody Frakcionační metody Detekční metody Bioinformatické metody
Zinkové proteiny • Bioinformatika – 2800 Zn-vazebných proteinů v lidském proteomu (~10 %) • Nejstarší Zn-protein: karbonát anhydrasa (EC 4.2.1.1), objeven v roce 1939 • Skladovací funkce – Albumin. metalothioneiny
• Metaloenzymy – Matrixové metaloproteinasy, Zn-dependentní proteasy, karboxypeptidasa, akonitasa, všechny enzymové třídy
• Transkripční faktory – Zinkové prsty
• Strukturní proteiny • Regulační proteiny – Metalothioneiny
• Signální proteiny • Přenašeče • DNA reparace, replikace, translace Karbonát anhydrasa (EC 4.2.1.1)
Způsob vazby Zn(II) v proteinech • • • • •
Nespecifický, převážně přes Cys, His, Asp. Aktivní místo enzymů Specifické domény (zinkové prsty, C4, C3H, CDH2) Na povrchu × uvnitř proteinu Stálá × přechodná
34
14
61 22
27
7
45
5
1 16
35
42 38
25
37 51
30
61 20
Heavy metal
β-domain
-SH group from cysteine
58 60
α-domain
Protilátky proti těžkým kovům • Hapteny (velikost, orientace) • Komplexy s proteiny (BSA nebo KLH) • Stanovení těžkých kovů (ELISA, biosensory), imunolokalizace těžkých kovů • Slepičí protilátky
Paramagnetické částice • • • • • • • •
Magnetizovatelné Polystyren pokrytý polyurethanem Průměr 1.08 µm Modifikovaný povrch Nemodifikovaný povrch Velikost Tvar porozita Stabilita
~ ~ ~ ~ ~
Struktura imunoglobulinů: Vazebné místo pro antigen H2N H2N
Species
Ig Subclass
Protein A
Protein G
Human
IgG1, IgG2, IgG4 IgG3 IgD IgD Fab ScFv IgG1 IgG2a, IgG2b, IgG3 IgM IgG1 IgG2a IgG2b IgG2c IgG1 IgG2 IgG1 IgG2 IgG1 IgG2 IgG(ab) IgG(c) IgG(T) Total Ig Total Ig Total Ig Total Ig Total Ig Total Ig
+++ + + + +
+++ +++ + -
+ +++ -
++ +++ -
+ +++ + +++ + +++ + +++ + + +++ +++ +++ +++ +++ -
++ +++ + +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ + + + + -
NH2 NH2
HOOC
COOH
Lehký řetězec
Variabilní oblast Konstantní oblast HOOC
COOH
Mouse
Těžký řetězec Rat
Rozdíl mezi savčími a ptačími imunoglobuliny: Goat Sheep Cow / Bovine Horse
Protein G Paramagnetická částice
IgG
Rabbit Dog Cat Pig Guinea pig Chicken
+++: strong binding, ++: medium binding, +: weak binding, -: no binding.
Způsoby imobilizace molekul na povrch paramagnetických částic
•
Modifikovaný povrch – Kovalentní imobilizace • • • •
Tosyl Karboxyl Amin Epoxid
– Nekovalentní imobilizace • • • •
• • • •
Avidin/Streptavidin Protein G/protein A His-tag (IMAC) náboj
Nemodifikovaný povrch Velikost Tvar porozita Stabilita
~ ~ ~ ~ ~
Kovalentní imobilizace • Výhody: organická chemie (kovalentní vazba). Buď přes N- nebo Ckonec. Za určitých podmínek možnost recyklace. • Nevýhody: organická chemie (reagencie). Kovalentní vazba. Orientace, interference se stabilizátory, možná denaturace, delší proces. • Epoxyskupina • Karboxylová skupina • Aminoskupina • Tosylová skupina
Nekovalentní imobilizace • Výhody: biochemie/fyzikální chemie. Rychlejší. Více definované. Specifita. Reagencie. • Nevýhody: biochemie/fyzikální chemie. Stabilita. Potřeba určitých struktur/vlastností (doména, biotinylace, histidinová kotva), náboj. • Protein A, G • Avidin, Streptavidin • IMAC (histidinová kotva) • náboj
Imunoseparace bakterií a následná imunoextrakce Zn-proteinů • Staphylococcus aureus kultivovaný v přítomnosti ZnCl2 • Proteiny obsahující Zn(II) jsou spojeny s patogenitou a rezistencí k ATB (MRSA fenotyp) • Schema procesu: A
D
+
B Zn
+
+
others proteins and cell parts
E
C Zn
Zn
F
+
MPs
S. aureus Protein A (S. aureus)
IgG
Zn ultrasound
IgY (gal) anti-Zn-proteins
Zn-protein
Imobilizace slepičích protilátek na povrch částic • • • • • • • •
Přes tosyl-skupinu (sulfonyl ester) Interference s azidem sodným proti bakteriální kontaminaci Odstranění NaN3 (centricon cut off 50 K) 1000 ug ligandu na 25 mg beads Paramagnetická částice Acidifikace na pH = 2.5 15 min Výměna pufru (amicon 50 K) pH = 9.5, (NH4)2SO4, 24 hod 37°C Blokování 0.5 % BSA, Tween-20 14 hod.
IgY
Imobilizace lidských IgG na povrch paramagnetických částic: • Stejný typ, stejný postup • S. aureus má povrchový protein A (antigen), který je schopen vazby (téměř) jakýchkoli imunoglobulinů • Existuje i protein G (Streptococcus) • Využíváno pro imobilizaci protilátek • (Téměř) specifická imunoextrakce (x Streptococcus) • Extrakce z média, příp. směsné kultury, nabohacující kultivace IgG
Paramagnetická částice Povrchový antigen
Protein G
Bakterie
Specifický imunoglobulin
Nespecifický imunoglobulin
Proč lidské imunoglobuliny? •Bakteriální superantigeny. Zn-proteiny •MSCRAMM proteiny (microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules) •Funkce: vazba imunoglobulinů, které dále nejsou rozeznávány složkami imunitního systému. •Obrana proti imunitní odpovědi hostitele (opsonizace, fagocytóza) •Protein A, 56 kDa, Staphylococcus ssp. •Protein G, 65 kDa, Streptococcus ssp. •Protein A/G, 50.5 kDa, rekombinantní fúzní protein. •Protein L, 76 kDa, Peptostreptococcus ssp. Vazebné místo pro antigen H2N H2N
NH2 NH2
HOOC
COOH
Lehký řetězec
Variabilní oblast
Bakterie
Bakterie
Makrofág
Makrofág Fagocytóza:
Opsonizace: Povrchový antigen
Protein G
Receptor pro imunoglobulin
Imunoglobulin
Konstantní oblast HOOC
COOH
Těžký řetězec
Vazebné místo pro protein G nebo makrofág
0,5
1,4
+ 1,2
Beads with captured bacteria
0,4
Absorbance * 102 [AU]
Turbidity (AU)
Control Medium after immunoextraction
0,3
0,2
1,0 0,8 0,6 0,4
Eluate
Beads
0,1 0,2 0.0 0,0
0 0
A
4
8 Cultivation time (h)
12
Anti-chicken/HRP
anti-chicken/HRP 1:12000
C
Chicken anti-Zn IgY
kDa
Mr
500
125
Anti-mouse/HRP
anti-mouse/HRP 1:4000
Human IgG
500
125 µg/ml BSA
250 150 100 75
50
37
25
B
2 μM
D
Krizkova et al.: Rapid Paramagnetic-Beads-Based Automated Immunoseparation of Zn-Proteins from Staphylococcus aureus with Nanogram Yield, PLOS One, odesláno do redakce
2,0
270
200
130
72
30
3
0.7
kDa
0 (cells*103)
1,5
Turibidity (AU)
Mr
R
L
kDa Mr
250 150 100 75
E
IgY
75
HC 50
Fab
50
37
1,0 37
25
LC
0,5 20
25 20 10
0,0
A
0
2
4
6
8
10
15
12
D
B
Cultivation time (h)
50
37
25 20
34
25
16
9
3.8
0.4
0.1
0 cells*103
100
2,0
Concentration of Zn (µg/ml)
250 150 100 75
Mr
Zn(II) content (µg/mg proteins)
2,5 kDa
10
1,5
1,0
60 40 20 0 L
E
R
E+R
0,5
y = 0,06e0,12x R² = 0,92
0,0
0
C
80
E
5
10
15
20
25
30
35
S. aureus (cell count*103)
Krizkova et al.: Rapid Paramagnetic-Beads-Based Automated Immunoseparation of Zn-Proteins from Staphylococcus aureus with Nanogram Yield, PLOS One, odesláno do redakce
Krevní plasma • • •
Celkem přibližně 300 proteinů, z toho 10 % (možná až 30 %) obsahuje Zn(II) Krevní plasma × krevní sérum Hlavní Zn-vazebné proteiny v krevním séru – – – – – – – – – – –
• • • • • •
albumin α2-makroglobulin transferin ceruloplasmin IgG, IgA, IgM komplement C4 haptoglobin prealbumin c-reaktivní protein α1-antitrypsin α1-9.5S glykoprotein
Nádorová onemocnění Zn status Zánětlivá onemocnění Deprese Imunitní poruchy ……
plasma Fibronektin
Mr
kDa 250 150 100
Transferrin
75
Albumin IgG těžký řetězec
50
37
IgG lehký řetězec
25 20 15
Imunoextrakce Zn-proteinů z krevní plasmy: -Optimalizace -pH elučního roztoku, množství vzorku a částic, čas a teplota extrakce a eluce, eluční pufr -SDS-PAGE extrahovaných proteinů -Stanovení a bilance Zn(II) kDa
Mr
plasma retentát Zn-proteiny
1.
2.
+
Covalent immobilization of antibodies to the beads surface
3.
Analyte binding
5.
4.
150 100 75
50 Removal of the retentate
Elution of the analyte
Removal of the eluate
6.
37 Zn(II) determination L
S
R
E
25
20
Proteins analysis
paramagnetic bead anti-Zn-KLH antibody
Zn proteins
other proteins
magnet
kDa Mr 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0
6.0 7.0
260 150 100 75 50 37
25 20
15
kDa Mr 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 260 150 100 75 50 37
25 20
15
6.0 7.0
A
C
kDa Mr
1
2
3
4
5
6
250
14
Peak height (µA)
12
150 100 75
10 8 6 y = 0,1164x R² = 0,9978
4
50 37 25 20
2 0
15
0
20
40
60
80
100
Zn(II) concentration (nM) B
D 250 150 100 75 50 37
25 20
1
2
3
4
5
18
6
Total Zn(II)
Retentate
Eluate
Retentate + Eluate
16 Zn(II) concentration (µM)
kDa Mr
14 12 10 8 6 4 2
15 0 1
2
3 4 Blood serum sample
5
6
Krizkova et al.: Immunoextraction of zinc proteins from human blood serum using chicken yolk antibodies immobilized onto paramagnetic particles and their electrophoretic analysis, Electrophoresis, 2012, v tisku
Shrnutí: • Rychlý a senzitivní způsob izolace proteinů z biologické matrice • Preparativní • Použitelné pro následnou proteomickou analýzu • Miniaturizace • Automatizace
Děkuji za pozornost!
9 kDa Mr 250 150 100 75 50
Pův
R
118 E
Pův
R
117 E
Pův
R
S E
Pův
R
115 E
Pův
R
116 E
Pův
R
E
37 25 20
15
Tato práce byla financována ze zdrojů: CEITEC CZ.1.05/1.1.00/02.0068, NANOSEMED GA AV KAN208130801, Liga proti rakovině 2012, NanoBioTECell GACR P102/11/1068.
