9A8 m g
rTB.yOL 33,No _t.2tt0t ?ROC.
8l
anggotatubuh Proteinyangterkaitdenganteratogenisitas mencitSwissWebsterakibatperlakuandenganasam (MAA) metoksiasetat AcengRuyani, SriSudarwati, LienA. Sutasurya, SonyH. Sumarsono DepartemenBiologi, lnstitutTeknologiBandung,Jl. GaneshaNo.10,LabtekXl, Bandung 40132
Sari Telahditeliti proteinyang terkait denganteratogenesis anggotatubuh mencit SwissWebsterakibat perlakuandenganMAA. Mencit umur kebuntingan I I hari diberi perlakuan dosis tunggal MAA l0 mmol/kg berat badan secarcgavage, sedangkankelompok kontrol hanyadiberi pelarut akuabidessteril. Mencit bunting dibunuh secaradislokasileher 4 jam setelahperlakuandenganMAA. Tunas anggotatubuhdepandiisolasidari kelompokkontrol dan perlakuanlalu dihomogenisasi. Ekstrakkasarkemudiandifraksinasidengan amonium sulfat dan masing-masingfraksi dianalisis dengan teknik l-D dan 2-D SDS-PAGE. Elektroforegraml-D dan 2-D menunjukkanbahwapadakelompokperlakuanfraksi proteinamoniumsulfat 20-40 % (F-lD, dapatdideteksiprotein 31,0-36,5kDa sertabercakprotein 35,1 kDa, pI 6,2 yang tidak terdapatpadakontrol. Padakelompokperlakuanfraksi protein amoniumsulfat4060% (F-lll), dapatdideteksiprotein 66,3-97,4kDa se(a bercakprotein8 I,7 kDa, pl 7,3 yang tidak terdapatpadakontrol.Sedangkan padakelompok kontrol F-llI, protein 36,5-55,4kDa sertabercakprotein 41,6 kDa, pI 6,4 terdeteksi,tetapi tidak terdeteksipada kelompokperlakuan.Dari penelitianini dapatdisimpulkanbahwapadatunasanggotatubuh depanmencit,perlakuandenganMAA menginduksiekspresidua protein (35,I kDa, pl 6,2 dan81,7 kDa, pl 7,3) dan menghambatekspresisatuprotein(41,6 kDa, pl 6,4). Kata kunci: embrio mencit,perkembangananggota tubuh, asammetoksiasetat,profl protein.
Abstract Proteins which are linked with Swiss Webster mouse limb teratogenesis as the effects of methoxyacetic acid (MAA) treatment The analysisof proteins,which are linked with limb teratogenesis as the effectsof MAA treatedin Swiss Webstermousehas been investigated. A singledoseof MAA l0 mmol,/kgbody weight was given by gavageon gestationday I I , whereasthe control group wereadministeredsterilizeddistilled water. Pregnantmice were sacrificedby cervical dislocationat 4 hours after MAA treatrnent. The forelimb buds were isolated from both control and treatedgroup embryos and were then homogenized.The crude extractswere thenfractionatedwith ammoniumsulfateand eachfractionwas analyzedby 1-D and 2-D SDS-PACE techniquesrespectively.The l-D and 2-D electrophoregrams revealedthat in the treatedgroup of protein fraction20-40% ammoniumsulfate(F-II), a proteinof 31.0-36.5kDa and a protein spot 35.1 kDa, pl 6.2 could be detected,which was not found in the control. In the treatedgroup of proteinfraction 40-60% ammoniumsulfate(F-lll) a proteinof 66.3-97.4 kDa and a protein spot 81.7 kDa, pl 7.3 could be detected which was not found in the control,whereasin the controlgroup a proteinof 36.5-55.4kDa, which is a protein spot41.6 and pl 6.4, wasdetectedbut not detectedin the treatedgroup.It could be concludedfrom this experimentthat in the mouseforelimbbuds,MAA treatmentinducethe protein expressionof two proteins(35.I kDa, pl 6.2 and 8l .7 kDa, 7.3) and inhibit the expressionof one protein (41.6,pl 6.4). Keywords:mouseembryo, limb development,methoryaceticacid, protein projile.
I
Pendahuluan
Embriotoksisitasdan teratogenisitasMAA pada mencit telah dipelajari oleh beberapapeneliti (Rasjad e/ a/., l99l; Sudarwatiet al., 1993; Darmanto et al., 1994; Sudarwati et al., 1995). Hasil penelitian tersebut menunjukkan bahwa perlakuan dengan MAA terbukti paling banyak memunculkan kelainan anggota rubuh apabiladiberikanpada umur kebuntingan(uk) I I hari. MenurutSuriptoet al. (1996),MAA yang diberikanpada mencit Swiss Webster (SW) uk I I hari dapat memunculkan95,5 Vo abnormalitasanggotatubuh yang
terutama disebabkanoleh kematian sel yang intensif pada bagian mesodermkeping anggota.Selainitu apical ectodermal ridge (AER) berperan juga, karena terjadi perubahandegeneratifstruktur AER dan penyusutannya lebih cepat pada kelompok perlakuan dibandingkan dengankontrol (Sudarwatiet al.,1995). Perlakuan dengan MAA menyebabkan penurunan sintesis RNA dan kemudian menghambatproliferasi serta diferensiasisel pada embrio mencit yang sedang berkembang (Mebus dan Welsch, 1989). Penurunan sintesisRNA atau protein pada sel tertentudapat pula
PROC.rrB, VOL.33,NO.3,2001
82
meningkatkanapoptosis(Ellis et al., l99l; Umansky, 1996).Ku et al. (1995) danLi et al. (1997)membuktikan bahwa perlakuan dengan MAA pada testis tikus menyebabkan peningkatanion kalsium intraseluler,yang selanjutnya akan mengaktilkan enzim endonuklease untuk memotong DNA menjadi beberapa fragmen dengan rentangan 180-200 pasangan basa. Telah diketahuibahwafragmentasiDNA adalahperistiwaawal sebelumterjadi kematiansel secaraapoptotik (Quainie et al., 1995; Milligan dan Schwarts,1996; Evan dan Littlewood.1998). Apoptosisdapatpula diinduksi olehslressprotein. Stress proteinadalahproteinsitoplasmaatauinti yang muncul ketikaorganismeberadadi bawahpengaruhhipertermia, beberapalogam berat, atau teratogen tertenfu. ,S/reJ.t protein dapatdibagi ke dalamtiga kategoriberatmolekul (BM), yaitu(a) 20-30kDa; (b) 66-15kDa: dan(c) 80-90 kDa (Subjeckdan Shyy, 1986).Dypbukt et al. (1994) melaporkanbahwa kehadiran s/res.sprotein oksidatif merupakansuafucontohkondisi awal sebelumterjadinya kematian sel secara apoptotik. Lebih lanjut telah diketahuibahwaperlakuandenganMAA secarain vitro dan in vivo pada sel Sertoli tikus menyebabkan peningkatan ckspresi s//.e.r.rprotein oksidatif dan penurunanekspresi fosfodiesterase (PDE; Syed dan Hecht, 1998). Namun demikian, mekanismeproses kematiansel pada bagianmesodermtunasanggotayang dipengaruhi MAA masihbelumdiketahui. Perlakuan dengan MAA dapat menurunkan berat anggotafubuh embrio yang disertaidenganmenurunnya kandungantotal DNA dan protein (Martgrita, 1998). tlasil penelitianini diperkuatoleh Ruyani et al. (2001) yang menyatakanbahwa dosis runggal MAA l0 mmol/kg beratbadan(bb) yang diberikan secaragavage pada uk I I hari, 4 jam setelahperlakuanmenurunkan kandungantotal protein dan mengubah profil protein pada tunasanggotafubuh depanmencit. Karenaprotein adalahproduk fungsionalgen, maka perbedaanprofil protein yang nyata antara kelompok kontrol dan perlakuandapatdiartikansebagairesponsekspresigen terhadapperlakuandenganMAA. Atas dasaritu, padapenelitianini dilakukanisolasidan permumianprotein tunas anggotatubuh depan sebagai usahaawal untuk memahamipengaruhMAA terhadap mekanisme molekuler perken.rbangananggota fubuh menclt. 2
Bahan dan cara kerja
l.l
H e w a np e r c o b a a n
Mencit SW digunakan sebagai hewan percobaan. Pengembangbiakanhewan dilakukan dalam ruangan oC dan kelembabanrelatif 83 %. dengansuhu 23-27 Pakandan air diberikan secaraad libitum. Mencit betina umur dewasa seksual (i0-12 minggu), dikawinkan l:1. Sumbat denganmencitjantandenganperbandingan vagina yang terdeteksi keesokan harinya ditetapkan sebagai uk 0 hari (Sudarwatiet al.,1995).
1,2 Bahan,dosis,dan pengumpulansampel MAA (CH3OCH2COOH)dalam bentuk cair dengan kemurnian95 % (Wako Pure ChemicalIndustries,Ltd.) yang diencerkandenganakuabidessteril diberikansecara gavage dengandosis l0 mmol/kg bb pada uk I I hari. Sedangkanmencitkelompokkontrol hanyadiberi pelarut (Sudarwatiet al., 1995). Mencit buntingdibunuhsecaradislokasileherempatjam setefahperlakuandengan MAA (Ruyani et al., 2001). Tunas anggota tubuh depan diisolasi, dimasukkanke dalamtabungEppendorf,dan disimpanpadasuhu-80 oC hinggaakandigunakan. 1.3 Fraksinasiprotein Tunas anggota tubuh depan kelompok kontrol dan perlakuandihomogenasipada suhu 4 oC. Bufer natrium fosfat 40 mM pH 8 ditambahkan ke dalam sampel sebanyak tiga kali volume sampel, kemudian disentrifugasipada 6.000 rpm, suhu 4 oC, selama 20 menit. Ke dalam supernatan ditambahkan amonium sulfat hingga mencapaikonsentrasi20 o/o.Larutan diinkubasi padasuhu4 oC selama30 menit, kemudiandisentrifugasi pada 12.000rpm, suhu4 oC,selama20 menit.Endapan yang dihasilkandisebutsebagaifraksi protein amonium sulfat 0-20 % (F-l), sementarake dalam supematan ditambahkan amonium sulfat hingga mencapai konsentrasi40 o/o.Tahapanitu kemudiandiulangdengan carayang samauntuk amoniumsulfat 60, 80, dan 100% (Bollag dan Edelstein,l99l) sehinggadihasilkanlima fraksiprotein,yaitu:F-I; F-II; F-lll; F-lV; danF-V. Masing-masingfraksi protein tunasanggotatubuh depan dilarutkandalam natrium fosfat 40 mM pH 8, didialisis menggunakan membran selulosa (Klotz, 1990), kemudiandisimpanpada suhu -20'C sebagaisampel untuk elektroforesissatu-dan dua-dimensi. 1.4 Elektroforesissatu- dan dua-dimensi Lima fraksi protein tunas anggota tubuh depan dari kelompokkontrol dan perlakuandianalisismenggunakan teknik one-dimensional sodium dodecyl sulfatepolyacrylamidegel electophores,s (l-D SDS-PAGE) dengan sistem bufer Laemmli (1970, dalam Gestern, 1996).Sampelprotein kontrol dan perlakuan,masingmasingsebanyakl5 ;rg, dimasukkanke dalamsumurgel poliakrilamida I5 %o. Protein dalam gel kemudian dideteksidenganpewarna CoomassieBrilliant Blue R250 (CBB R-250;Menil, 1990).Proteindengankisaran BM 6-200kDa digunakansebagaistandar. Fraksi protein yang menunjukkanperbedaanpenampakan profil protein yang nyata antara kelompok kontrol dan perlakuan dianalisis lebih lanjut menggunakan teknik two-dimensional (2-D) SDS-PAGE. Sampel protein kontrol dan perlakuanmasing-masingsebanyak 75 pg (Sartoet al., 1999)dielektroforesissesuaidengan cara kerja yang telah baku (BioRad). Separasiprotein
PROC.ITB. vOL. 33.NO. 3,2001
83
pada dimensi pertama berdasarkan point of isoelectrofocusing(pI) menggunakandua macamamfolit OH 3,5-10dan pH 5-7). Sedangkanpadadimensikedua, protein dipisahkanberdasarkanBM menggunakanSDSPAGE (Dunbar et al., 1990; Gestern, 1996). Gel hasil elektroforesisdimensi pertama diinkubasi dalam bufer SDS selamal5 menit, kemudian dielektroforesisulang dengancaradiletakkandi atasgel keping poliakrilamida l0 atau l2o/o,dan protein dalam gel kemudiandideteksi denganpewarna CBB R-250 (Menil, 1990). Protein dengankisaranBM 6.5-66.0kDa atau BM 6.5-205kDa digunakansebagaistandar.
lDa
2
Hasil
Sampeltunasanggotatubuh depanuntuk penelitianini berasaldari 65 ekor induk mencit SW uk I I + 4 iam kelompokkontrolmaupunkelompokperlakuan. Hasilanalisisfraksiproteinamoniumsulfat20-40% (FII) tunasanggotatubuhdepandenganteknik l-D SDSPAGE menunjukkanbahwapada kelompokperlakuan ditemukanpita protein dengankisaranberat molekul (BM) 31,0-36,5kDa (Gambarl). dan bila analisisini dilanjutkan dengan 2-D SDS-PAGE didapat bercak proteindenganBM 35,1 kDa dan pI 6,2 (Gambar2) yangtidakterdapatpadakonhol.
S
2m.0
I 16.3 97.{ 66.3 *.55.t *
36.5.
31.0
Gambar1 Hasil 1-D SDS-PAGEproteinekstraktunas anggotatubuh depan mencitSW umur kebuntingan11 hari + 4 jam. Protein dalamgel dideteksidenganpewarnaCBB R-250.Pada kelompokperlakuanF-ll ditemukanpita proteindengankisaranberatmolekul (BM)31,0-36,5kDa yang tidak terdapatpada kontrol.Pada kelompokperlakuanF-lll ditemukanpita proteindengankisaranBM 66,397,4kDa yangtidakterdapatpada kontrol.SedangkanpadakelompokkontrolF-lll ditemukanpita proteindengankisaranBM 36,5-55,4 kDayangtidakterdapatpada perlakuan. K: kontrol;P: perlakuan;S: standar;kDa; kilo Dalton;F-l: fraksiproteinamoniumsulfat0-20%; F-ll: fraksi proteinamoniumsulfat2040%;F-lll:fraksiproteinamoniumsulfat40-60%;-+: pita proteinyangdiperhatikan.
A. Kontrol
B. Perlakuan
4 . 8p l
4 . 8p l
6.2p| 65pl tl
6.2pl65pl
II
,*.
* - 66 kDa
F; ,*
,* .I
?
-
66 kDa
-
3 5 . 1k D a
-
29 kDa
.:* :n: :
- 3 5 . 1k D a - 29 kDa
*g'
Gambar2 Hasil2-D SDS-PAGEproteinfraksiamoniumsulfat20-40% dari tunasanggotatubuhdepan mencitSW umur kebuntingan 11 hari + 4 jam. Protein dalam gel dideteksidengan pewama CBB R-250. Anak panah menunjukkanpada kelompokpedakuan ditemukanbercakproteindenganberatmolekul 35,1 kDa dan pl 6,2 yangtidakterdapatpadakontrol. kDa:kilo Dalton;pl: point of isoelectrofocusing.
PROC.ITB. vOL. 33.NO.3,200t
84
A. Kontrol
B. Perlakuan 7 . 3p l
61pl I
7 . 8p l
6 . 1p l
tl
7.3 pl
7.8 pl
ll 200 kDa
_ 8 1 . 7k D a
_ 45 kDa
Gambar3 Hasil2-D SDS-PAGEproteinfraksiamoniumsulfat4060 % dari tunasanggotiatubuh depan mencitSW umur kebuntingan 11 hari + 4 jam. Protein dalam gel dideteksidengan pewama CBB R-250.Anak panah menunjukkanpada kelompokperlakuan ditemukanbercakproteindenganberatmolekul(BM)81,7 kDa dan pl 7,3 yangtidakterdapatpadakontrol. kDa:kiloDalton;pl: pointof isoelectrofocusing.
B. Perlakuan
A. Kontrol 6.2 pl 6.4 pl ltl
6.2 pl 6.4 pl tl
7.1 pl
7 . 1p l I
6.6 kDa
.:
, - i*.'
6.6 kDa
u*
-{_. ' ..{... . {*
+
t
4 1 . 6k D a
4 1 . 6k D a 36 kDa
36 kDa
Gambar4 Hasil2-D SDS-PAGEproteinfraksiamoniumsulfat4060 % dari tunasanggotatubuhdepan mencitSW umur kebuntingan 11 hari+ 4 jam. Proteindalamgel dideteksidenganpewarnaCBB R-250.Anak panahmenunjukkanpada kelompokkontrolditemukan bercakproteindenganberatmolekul41,6 kDa dan pl 6,4 yangtidakterdapatpadaperlakuan. kDa:kiloDalton;pl: pointof isoelectrofocusing.
Hasil analisisfraksi protein amonium sulfat 40-60 % (FIII) tunasanggotatubuh depandenganteknik l-D SDSPAGE menunjukkanbahwa pada kelompok perlakuan ditemukanpita protein dengan kisaran BM 66,3-97,4 kDa (Gambarl) dan bila analisisini dilanjutkandengan 2-D SDS-PAGEdidapatbercakprotein denganBM 81,7 kDa dan pI 7,3 (Gambar 3), yang tidak terdapatpada kontrol. Sedangkan pada kelompok konhol F-III ditemukanpita protein dengan kisaran BM 36,5-55,4 kDa (Gambar l) serta bercak protein denganBM 41,6 kDa dan pI 6,4 (Gambar 4) yang tidak terdapatpada perlakuan.
3
Pembahasan
Sifatproteintermodifikasidalamsuatukondisipatologis tertentudapatdipelajaridenganteknik 2-D SDS-PAGE (Sartoet al., 1999).Secarateoritis teknik ini mampu memisahkansekaligusratusanpolipeptidaberdasarkan pI dan BM dari ekstrakkasarprotein (Dunbare/ a/., 1990;Gestern,1996).Namundemikian,agargambaran 2-D lebih mudah bercakproteindalamelektroforegram diamati,ekstrakkasarproteintersebutsebaiknyadibagi menjadibeberapafraksi protein (Bollag dan Edelstein, l99l). TelahdiketahuibahwaperlakuandengantunggalMAA gavagepadauk I I l0 mmoVkgbb yangdiberikansecara kematianselyangintensif harimencitA"/J,menyebabkan
PROC.ITB, VOL.33,NO. -1,200t
padabagianmesodermkeping anggotadepan(Sudarwati et a|.,1995).Padapenelitianini, proteindenganBM 35,1 kDa dan pl 6,2 (Gambar2) didugamuncul sebagaiakibat kematian sel pada mesoderm keping anggota tubuh depansetelahmendapatperlakuandenganMAA. Asumsi ini juga didasarkan pada laporan yang menyatakan bahwa enzim poli (ADP-ribosa)polimerase(BM I 16 kDa) padakematiansel nekrotik akan terpecahmenjadi beberapafragmen peptida dengan BM 50, 40, atau 35 kDa (Shahet al.,1996;Pieperet a\.,1999). Menurut Syed dan Hecht (1998), perlakuandengan MAA secarain vitro dan in vivo menyebabkanekspresi stressprotein oksidatif meningkatpada sel Sertoli tikus. protein memiliki kisaranBM 80-90 kDa (Subjeck Stress dan Shyy, i986) dan dapat dideteksi sekitar 2-4 jam setelahperlakuan(Goering et al., 1993).Atas dasaritu, makaproteindenganBM 81,7 kDa dan pl 7,3 (Gambar 3) yangditemukan4 jam setelahperlakuandenganMAA padapenelitianini, sebagaireaksi terhadapMAA fetus mengsintesisstress protein. Oleh karena itu dalam keadaantidak terdedahterhadapMAA stressprotein ini tidakada. Telahdilaporkanbahwa perlakuandenganMAA secara in vitro dan in vivo menyebabkan ekspresi (PDE) menurun pada sel Sertoli tikus fosfodiesterase (Syeddan Hecht, 1998). Salah satu isoform PDE pada mencitmemiliki BM 40 kDa dan dapatdideteksidengan antibodi PDE4A (Lugnier, 2000; komunikasi pribadi). Proteindengan BM 41,6 kDa dan pl 6,4 (Gambar 4) yang ditemukan pada penelitian ini diduga termasuk PDE.MenurutAharoni et al. (1995),penurunanaktivitas PDE akanmeningkatkanjumlah cAMP intraseluleryang kemudian menginduksi kematian pada sel granulosa. Kemungkinanlain dari proteindenganBM 4l,6 kDa dan pl 6,4 adalah laminin binding protein pa} (LBP-p40). LBP-p40 diketahui memiliki kisaran BM 40-43 kDa (Satoet al.,1996; Sorokinet a\.,2000). Informasicukup rinci tentang protein tersebut telah dilaporkan oleh Kanedaet al. (1998)yang antaralain menyatakanbahwa apoptosispada sel HeLa dapat diinduksi oleh hilangnya LBP-p40. pada mencit Hasil studi teratogenisitas MAA menunjukkanbahwa perlakuan dengan MAA terbukti paling banyak memunculkan kelainan anggota tubuh apabiladiberikanpada uk I I hari (Rasjadet al., l99l; Sudarwati et al., 1993; Darmanto et al., 1994). Abnormalitasanggota rubuh itu terutama disebabkan oleh kematiansel yang intensif pada bagian mesoderm keping anggota (Sudarwati et al., 1995). Hasil studi tersebuttampaksejalandenganpenemuan teratogenisitas tiga protein pada penelitian ini yang diduga ada hubungannya denganproseskematiansel. lnformasi yang didapat dari hasil 2-D SDS-PAGE terbataspadamemperolehBM dan pI dari suatuprotein. Oleh karena iru untuk mendapatkanketeranganyang lebih pasti, maka identifikasi dan karakterisasibagi ketigaproteintersebutsedangdilakukan.
85 4
Kesimpulan
DosistunggalMAA l0 mmol/kgbb yangdiberikan secarugavage pada uk I I hari mencit SW, pada 4 jam setelahperlakuan terjadi ekspresi protein dengan BM 35,1 kDa dan pl 6,2 serta ekspresiprotein denganBM 81,7 kDa dan pl 7,3, namun sebaliknyamenghilangkan ekspresiprotein denganBM 41,6 dan pl 6,4 padatunas anggotatubuh depan. 5
Ucapan terimakasih
Penelitian ini dibiayai oleh Graduate Team Research Grant, University Research for Graduate (URGE) Project Batch III. Penulis mengucapkan terimakasih kepada Dr. Muliawati Sindumarta yang telah banyak memberi saran aspek biokimia, dan Bapak Yayat atas bantuanteknik yang diberikan. 6
Daftar pustaka
1. Aharoni,D., Dantes,A., Oren, M., & Amsterdam, A. (1995), cAMP-mediatedsignalsas determinants , for apoptosis in primary granulosa cells. Exp. Cell Res.,218:271-282. 2.
Bollag, D.M. & Edelstein,S.J. (1991), Protein methods.Wiley Liss.New York. pp.79-81.
3.
Darmanto, W., Sudarwati, S. & Sutasurya,L.A. (1994), Effects of methoxyaceticacid on prenatal development of mice.Environ.Med.,38 (l): 25-28.
4.
Dypbukt, J.M., Ankarcrona, M., Burkin, M., Sjoholm,A., Strom, K., Orrenius,S. & Nicotera,P. (1994), Different prooxidant levels stimulate cell growth, activateapoptosis,or producenecrosisin insulin-secreting RINm5F cells.-/. Biol. Chem.,269 305s3-60.
5.
Dunbar,B.S.,Kimura,H. & Timmons,T.M. (1990), Protein analysis using high resulation two dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. Dalam: Guide to protein puriJication. Deutscher, M.P (ed). AcademicPressInc. San Diego. pp. 441459.
6. Ellis, R.E., Yuan, J. & Horvitz, H.R. (1991), Mechanismof functionsof cell death.Ann.Rev.Cell Biol.7: 663-693. 7.
Evan,G. & Littlewood,T. (1998).A matterof life and cell death.Science,281:1317-1322.
8.
Gestern,D.M. (1996), Cel electrophoresisprotein. Dalam: Essential techniques series. D. fuckwood (ed).JohnWiley & Sons.Toronto.pp.l-l I l.
9.
Goering,P.L.,Fisher,B. & Kish, C.L. (1993),Stress protein synthesisinduced in rat liver by cadmium precedeshepatotoxiciry.Toxicol.Appl. Pharmacol., 122: 139-148.
10. Kaneda,Y., Kaneda,Y., Kinoshita,K., Sato,M., Saeki, R.Y., Wataya-Kaneda, M., Tanaka, K.
PROC. ITB,VOL.33,NO.3, 200t
86 (1998),The inductionof apoptosisin HeLa cellsby the lossof LBP-p40. Cell Death Differ.,5: 20-28.
I l . Klotz, I.M. ( 1989),Ligand-proteinbinding affinities. Dalam: Protein function, a practicalapproach.T.E. Creighton(ed).IRL Press.Oxford.pp. 25-35. B.I. 12. Ku, W.W., Wine,R.N., Chae,8.Y., Ghanayem, toxicity of 2& Chapin,R.E. (1995), Spermatocyt methoxyethanol(ME) in rats and guinea pigs: Evidence for the induction of apoptosis.Toxicol. Appl.Pharmacol.,134:100-l10.
1 3 .L i , L . H . , W i n e , R . N . , M i l l e r , D . S . , R e e c e ,J . M . , Smith,M. & Chapin,R.E.(1997),Protection against methoxyaceticacid inducedspermatocyteapoptosis with calcium channel blockers in cultired rat seminiferustubules:possiblemecahnisms.Toxicol. Appl. Pharmacol.,l44: 105- l 19.
1 4 .Martgrita, M.M. (1998), Efek asam metoksiasetat terhadapkandungDNA, protein,sertaprofil protein anggotabadanembrio mencit (Mus musculus)Swiss Webster. Tesis Magister Program Studi Biologi, ProgramPascasarjana ITB. Bandung.
1 5 .Mebus,C.A. & Welsch,F. (1989),The possiblerole of one-carbonmoietiesin 2-methoxyethanoland 2methoxyaceticacid induced developmenttoxicity. Toxicol.Appl. Pharmacol.,99: 98-109.
1 6 .Merril, C.R. (1990),Gel-stainingtechniques.Dalam: Guide to protein purijication. Deutscher,M.P (ed). AcademicPressInc. SanDiego. pp.477-488.
t 7 . Milligan, C.E. &
Schwaftz, L.M. (1996), Programmed cell death during development of animals. In; Cellular aging and cell death. N.J.Holbrook,G.R.Martin & R.A.Lochshin(ed). W i l e yL i s s .N e w Y o r k .p p . l 8 l - 2 0 8 .
1 8 .Pieper,A.A., Verma,A., Zhang,J. & Snyder,S.H. (1999),Poly(ADP-ribosa) polymerase,nitric oxide a n dc e l ld e a t h f. t P S , 2 0 : l 7 l - 1 8 1 .
1 9 .Quairrie,L.H., Addey,C.V.P.& Wilde,C.J.(1995), Apoptosis in lactating and involuting mouse mammary tissue demontratedby nick-end DNA lebefling.Cell TissueRes.,28l:413-419.
20. Rasjad,C., Yamashita,K., Datu, A.R. & Yasuda,M. (1991),Pathogenesis of limb malformationin mice inducedby methoxyaceticacid. Hiroshima J. Med. S c i . , 4 0 ( 3 )l 0: l - 1 0 7 .
2 1 .Ruyani, A., Sudarwati, S., Sutasurya, L.A. & Sumarsono,S.H. (2001), Perubahanprofil protein tunasanggotatubuh depan mencit (Mus musculus) akibat perlakuan dengan asam metoksiasetat (MAA). Medika, 27: 363-367.
22. Sarto,C., Frutiger,S.,Cappellano, F., Sanchez, J.C., Doro,G., Catanzaro, F., Hughes,G.J.,Hochsffasser, D..F.& Mocarelli, P. (1999),Modifiedexpression of plasmaglutathioneperoxidaseand manganese superoxidasedismutasein human renal cell carcinoma. Electrophoresrs, 20:3458-3466.
23. Sato,M., Kinoshita,K., Kaneda,Y., Saeki,Y., Iwamatsu, A. & Tanaka,Y. (1996),Analysisof nuclear localizationof laminin binding protein precursorp40 (LBP-p4}). Biochem.Biophys.Res. Commun.,299: 896-901. 24. Shah,G.M., Shah,R.G. & Poireir,G.G. (1999). Different cleavagepaftern for poly(ADP-ribosa) polymerase duringapoptosis andnecrosis in HL-60 cells.Biochem.Biophys. Res.Comm.,229: 838-844.
25.Sorokin,A.V., Mikhailov,A.M., Kachko,A.V., Protopopova, E.V., Konovalova, S.N.,Andrianova, M.E.,Netesov, S.V.,Kornev,A.N. & Loktev,V.B. (2000), Human recombinant laminin-binding protein: isolation, purification, crystalization. (Mosc),65(5):546-53. Biochemistry 26. Subjeck,J. & Shyy, T.T. (1986),Stressprotein of mammalian systems cells.Amer.J. Physiol.,250: t-t7. 27. Sudarwati, T.W.& Yusuf,A,T.(1993), S.,Suryono, Efek "methoxyaceticacid" (MAA) terhadap perkembangan anggota galur mencit(Musmusculu.r) N L J M S . 1 :l l - 1 9 . 28. Sudarwati, S.,Suryono. T.W.& Yusuf.A.T.(1995), Kelainanperkembangan awalanggotadepanmencit (MAA). A/J yang diinduksi asam metoksiasetat JM,S,Suplement H: 60-70. 29. Suripto,Sjamrizal,Surjono,T.W. & Kamal, A. (1996), Pengaruhasam metoksiasetat terhadap kandungan DNA padaanggota badanembriomencit (Musmusculus) SwissWebster.LaporanPenelitian 1996. OPF-ITBNo.I 67609619951 30, Syed,V. & Hecht,N.B. (1998),Rat pachytene down-regulate spermatocytes a polo-likekinaseand up-regulatea thiol-specificantioxidantprotein, whereas sertoli cells down-regulate a phosphodiesterase and up-regulatean oxidative sfressproteinafterexposure to methoxyethanol and methoxyacetic acid. Endocrinologt,139: 35033 5 1L
3 1 .Umansky,S.R.(1996),Apoptosis:molecularand (a review).Mol.Biol.,30: 285cellularmechanisms
29s.
