Prognostické a prediktivní markery - část II prof. MUDr. Ondřej Topolčan, CSc. Centrální laboratoř pro imunoanalýzu, FN a LF UK Plzeň
Témata přednášky Molekulární biologie DNA a nádory Parametry molekulární biologie Využití v diagnostice Využití při volbě a monitoraci léčby Prognostické a prediktivní markery CRC
DNA 1869 - deoxyribonukleová kyselina byla popsána švýcarským lékařem Friedrichem Miescherem (Phoebus Levene rozpoznal, že DNA se skládá z cukrů, fosfátů a bází) neznámý význam 1943 - první důkaz o roli DNA v přenosu genetické informace přinesl A Mac Leod a Mc Carty
DNA 1953 - odhalení její trojrozměrné struktury Správný dvojšroubnicový model - J. D Wotston a F. Cirk - pozdější laureáti Nobelovy ceny. 1957 - předložil Crick sérii pravidel, které se označují jako centrální dogma molekulární biologie popisují vztahy mezi DNA, RNA a proteiny 1958 - popsán způsob replikace DNA v buňkách 1960 - rozluštění tzv. genetického kódu
Geny jsou na chromozomech • Theodor Heinrich Boveri (1862 –1915) německý biolog • Walter Stanborough Sutton (1877 - 1916) americký genetik a lékař Boveriho-Suttonova chromozómová teorie - Říká též, že chromozomy jsou lineární struktury s geny, které se nacházejí na specifických místech zvaných lokusy - Chromozomy, které jsou obsaženy ve všech dělících se buňkách a předávají se z jedné generace na druhou, nesou genetickou informaci
Geny jsou na chromozomech
• Thomas Hunt Morgan (1866 – 1945) americký genetik Jeden z nejvýznamnějších genetiků historie • Prokázal, že geny jsou umístěny na chromozómech a na základě tohoto poznatku zformuloval Morganovy zákony dědičnosti • Zjistil, existenci pohlavně podmíněnost genů
• 1933 Nobelova cena za fyziologii a medicínu (první za práci v oboru genetiky)
DNA nese genetickou informaci
• Oswald Theodore Avery (1877– 1955) americký lékař a vědec • Jeden z prvních molekulárních biologů a věnoval se i imunologii • 1944: Averyho-MacLeodovův-McCartyho experiment - důkaz, že genetickým materiálem je DNA • Původně se věřilo, že genetickou informaci nesou proteiny .
GEN Gen je úsek DNA se specifickou funkcí, který je schopen utvářet při dělení buňky svoje vlastní přesné kopie, které se přenáší do dalších generací Starší definice - gen je úsek DNA kódující bílkovinu. Jednotlivé geny se na DNA mohou překrývat.
GEN Geny rozlišujeme na geny strukturní a regulační. Exony jsou funkční úseky genu, které jsou přepisovány do mRNA a dále přepisovány při proteosynthese. Introny jsou ty úseky, jejichž funkce dosud nebyla zcela objasněna, a které nejsou využívány pro tvorbu bílkovin Jednoduché geny - obsahují pouze exony Složené geny - obsahují exony i introny
Centralní dogma molekulární biologie Crick 1957-58)
DNA
RNA
REPLIKACE TRANSKRIPCE TRANSLACE
Protein
Fenotyp
REVERZNÍ TRANSKRIPCE
Exprese genetické informace – kroky vedoucí k syntéza proteinu (nebo RNA) podle informace v DNA
DNA
replikace
DNA
transkripce
RNA
translace
enzymy
proteiny
stavební složky organel a struktur buňky
Každý gen má specifickou sekvenci nukleotidů. Tato sekvence určuje stavbu RNA, popř. proteinu, které jsou daným genem kódovány.
znak
Gen
DNA
RNA
protein
Soubor veškeré genetické informace v buňce (resp. v organismu) = genom Lidský genom: cca 20-25 tis. genů
mimojaderný genom mitochondrie (u rostlin také plastidy)
jádro (nucleus)
jaderný genom
(obsahuje většinu genetické informace)
Všechna nádorová onemocnění jsou způsobena abnormalitami
v sekvenci DNA Během života je DNA v lidských buňkách vystavena účinku mutagenům a také chybám při replikaci, které způsobují změny v sekvenci DNA buňky
Náhodně může jedna z těchto somatických mutací změnit funkci genů spjatých s kontrolou buněčné proliferace, diferenciace a apoptózy Pokud jedinec zdědí mutaci v jedné alele kritických genů od rodičů, nastává nádorové onemocnění dříve a s větší pravděpodobností
Genetické změny, způsobující expresi pozměněných proteinů, proteinů v jiném množství, nebo těch, které se již na tomto stupni ontogeneze neexprimují, mohou vest k vzniku nádorového onemocnění Imunoanalýza měří proteiny Molekulární biologie zejména DNA, RNA
Dominantní mutace protoonkogenů Změny ve struktuře genu → syntéza abnormálního genového produktu (onkoproteinu) ● bodové mutace, delece ● genové translokace – vznik zkrácených nebo fúzních genů s abnormální funkcí
Změny ovlivňující regulaci genové exprese → nepřiměřená produkce strukturně nezměněné formy normálního proteinu podporující růst ● inzerce retrovirů se silnými retrovirovými promotory ● genové amplifikace – abnormální transkripci
Recesivní mutace antionkogenů Dvouzásahová
teorie →
pro vývoj nádoru je nutná ztráta funkce obou alel příslušného tumor supresorového genu ztráta heterozygozity
Mikro RNA miRNA regulují až jednu třetinu lidských genů. Geny regulované pomocí miRNA jsou nejen součástí procesu onkogeneze, podílejí se také na nádorové invazivitě, diseminaci nebo lékové rezistenci Malé (24nt) a stabilní molekuly - časný záchyt - predikce léčby - Prognóza onemocnění
Mikro RNA miRNA regulují až jednu třetinu lidských genů. Geny regulované pomocí miRNA jsou nejen součástí procesu onkogeneze, podílejí se také na nádorové invazivitě, diseminaci nebo lékové rezistenci Malé (24nt) a stabilní molekuly - časný záchyt - predikce léčby - Prognóza onemocnění
Techniky molekulární genetiky používané k diagnostice Metody přímé diagnostiky SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism )
DGGE (Denaturing Gradient Gel Electroforesis)
PTT (Protein Truncation Test)
sekvenování ds DNA
Metody nepřímé diagnostiky
PCR (Polymerase Chain Reaction)
PCR RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphismus)
Prognostické faktory kolorektální karcinom Ondřej Topolčan
Základní statistické pojmy •
Senzitivita –
–
•
Specificita – –
•
pravděpodobnost, s jakou má pacient bez diagnostikované choroby negativní výsledek % správně pozitivních výsledků pravděpodobnost, že pacient s pozitivním výsledkem má hledanou chorobu % správně negativních výsledků
Cut - off –
diskrimainční hladina mezi pozitivními a negativními hodnotami při dané specificitě
Praha 10. května 2007
Revmatologický ústav
Kolorektální karcinom
Strategie léčby CRC podle TNM I → operace II → operace (v případě Nx následuje chemoterapie) III → operace + vždy chemoterapie IV → resekce, nebo indukční terapie a pak resekce, nebo pouze paliativní léčba
Klinické otázky Předoperační hodnoty • Skrining ano • Primární diagnostika nádoru ne • Agresivita nádoru ano/ne • Generalizace ano Pooperační hodnoty • Efekt chirurgické léčby ano • Korekce histologického nálezu ano • Volba adjuvantní terapii ano
Kolorekctální karcinom a sensitivita nádorových markerů předoperační hodnoty (at 95% specificity)
Folow up • • • •
Remise Stady state Relaps Metastázy
ano ano ano ano
Senzitivita nádorových markerů při 95 % specificitě
Senzitivita %
Nádory GIT bez projevů generalizace (n=180)
(n=85)
Revmatologický ústav
(n=80)
(n=15)
Praha 10. května 2007
Senzitivita nádorových markerů při 95 % specificitě
Senzitivita %
Nádory GIT s projevy generalizace (n=200)
(n=60) Revmatologický ústav
(n=116)
(n=24) Praha 10. května 2007
Před a pooperační median TK 100 Předoper.
80
1den 2 den
60
3 den
40
7 den 30 den
20 0 He
Be
C18 -20
C 50
C 787
Před a pooperační median TPS 600 Předoper. 1den 2 den 3 den 7 den 30 den
400
200
0 He
Be
C 18 - 20
C 50
C 787
Před a pooperační median CEA 40 35 30 25
Preoper. 1day 2 day 3 day 7 day 30 day
20 15 10 5 0 He
Be
C 18 - 20
C 50
C 787
AUC 1. soubor Parametr
AUC
AUC
AUC
(jednotka)
0 vs 1
0 vs 2+3
0 vs 4
0.6036
0.8334
0.9982
0.5516
0.8466
0.9813
0.5852
0.6733
0.6065
0.5284
0.6053
0.7435
TPS (IU/l) TPA (IU/l) CEA (ng/ml) CA 19-9 (ng/ml)
• 0 benigní onem. • 1 kolorektální karcinom a karcinom prsu stádium I • 2+3 kolorektální karcinom a karcinom prsu stádium II a III • 4 kolorektální karcinom a karcinom prsu + meta do jater
Benigní
versus Kolorektální karcinom a karcinom prsu + meta do jater
AUC 1. soubor Parametr
AUC
(jednotka)
1+2+3 vs 4
TPS (IU/l)
0.9782
TPA (IU/l)
0.9713
CEA (ng/ml)
0.6665
CA 19-9 (ng/ml)
0.7435
• 0 benigní onem. • 1 kolorektální karcinom a karcinom prsu stádium I • 2+3 kolorektální karcinom a karcinom prsu stádium II a III • 4 kolorektální karcinom a karcinom prsu + meta do jater
Volba léčby • Problematická
Monitorace léčby • Adjuvantní – Thymidkináza
• Chemoterapie – Nádorové markery
Změny hladinTK,
úspěšná adjuvantní CHT
Změny hladinTK, CEA, CA 19- 9 úspěšná adjuvantní CHT CHT Cycle B 1. A 1. B 2. A 2. B 3. A 3.
TK
CEA
CA 19 -9
Median
Min -Max
Median
Min -Max
Median
Min -Max
4 20 6 28 8 35
1-6 8 -25 4 - 10 16- 40 5 -13 16 -45
1.8 1.9 1.5 1.9 1.6 1.1
1- 3 1 -2.5 0.8-2.6 1-3 0.5 -2 0.5 -2
21 19 24 20 16 19
16 -24 18 -36 20 -25 14 -25 12 -20 17 -26
Změny hladinTK, úspěšná paliativní léčba
Změny hladinTK, CEA, CA 19- 9
úspěšná paliativní léčba CEA and CA 19-9 levels Successful palliative therapy Date
CEA
CA 19-9
31. 3. 2003
191
321
2. 4. 2003
245
350
14. 4. 2003
174
202
16. 4. 2003
181
184
28. 4. 2003
169
141
30. 4. 2003
108
181
9. 6. 2003
14
90.2
11. 6. 2003
14
78.8
Example CHANGES IN THYMIDINEKINASE (TK) DURING PALLIATIVE CHEMOTHERAPY
TK (U/l)
Increases of Thymidinkinase (TK) During the Palliative Chemotherapy (6 Cycles)unfavourable prognosis 60 50 40 30 20 10 0 1th Cycle Before
1th Cycle After
2nd Cycle Before
2nd Cycle After
3rd Cycle Before
3rd Cycle After
6th Cycle Before
6th Cycle After
CEA and CA 19-9 Neuspěšná palliativní léčba
Prognóza • DFI, PFI – ano • OS - ano
Predikce • Efektu léčby – Chirurgické ano – Onkologické ano
Screeningová vyšetření kolorektálního karcinomu multitarget assay panel (MTAP) - detekci mutací v buňkách střevní sliznice uvolněných do stolice probandů
Metody molekulární biologie se využívají • • • •
Volba a optimalizaci léčby Monitoraci léčby Predikce efektu léčby Prognóza onemocění
Prediktor účinnosti anti-EGFR moAb : wild type genu KRAS ● K-ras (Kirstein rat sarkoma virus) 12p12.1 Proonkogen K-ras kóduje GTPázu Nejčastěji mutace kodonu 12, 13, 61→ kontinuální aktivace
Prediktor účinnosti anti-EGFR moAb : wild type genu BRAF ● BRAF (RAS-associated factor) - Mutován u 5% kolorektálních karcinomů - V600E - Je známo více než 30 mutací aktivujících BRAF
Cílená léčba – blokace EGFR (produktu onkogenu) EGFR (ErbB-1) receptor epidermálního růstového faktoru - Ligandy pro epidermální růstový faktor: EGF nebo TGFα → aktivují monomerní molekulu → dimer → aktivace intracelulární tyrosin kinazové activity - Patologická aktivita: amplifikací EGFR1 nebo vysokou polyzomií chromozómu 7 → preferenční odpověď na EGFR1 inhibici Blokace: anti-EGFR moAb cetuximabu, panitumumab - lečba pokročileho a metastatickeho kolorektalniho karcinomu Prediktor účinnosti: wild type genu KRAS (vyžadován) wild type genu BRAF (doporučen) znalost přítomnost EGFR receptorů (doporučena) ;
Systémová paliativní chemoterapie Stadium IV (jakekoliv T, jakekoli N, M1) + lokalně pokročile inoperabilni onemocněni – pro 1. linii lze rovnocenně použít cytostatika v intravenózní i perorální formě: 5-FU, irinotekan, kapecitabin, oxaliplatinu (výjimečně raltitrexed) a biologickou léčbu.
Děkuji za pozornost!
