PLGA mikrorészecskékbe ágyazott trombin-kapcsolt peptid (TP508) a csontképződést elősegítő hatása végtaghosszabbítás során

A Department of Orthopaedic Surgery, General Hospital of Chinese People’s Liberation Army, Beijing, Kína1, a Semmelweis Egyetem, Ortopédiai Klinika2, a Department of Orthopaedic Surgery, Queen’s University Belfast3 és a Research and Development, OrthoLogic Corp, Tempe, Arizona, USA4 közleménye

A lokálisan beadott, PPF/PLGA mikrorészecskékbe ágyazott trombin-kapcsolt peptid (TP508) a csontképződést elősegítő hatása végtaghosszabbítás során Korai eredmények

DR. YAN WANG1, DR. SZŐKE GYÖRGY2, DR. DOMOS GYULA2, DR. CHAO WAN3, DR. JAMES T. RYABY4, DR. GANG LI3 Érkezett: 2009. november 5.

ÖSSZEFOGLALÁS Korábbi kísérleteink során végtaghosszabbításos állatmodellen igazoltuk, hogy a TP508 thrombin-kapcsolt peptidnek a hosszabbítási területre történő beadása fokozza a csontképződést. Jelen vizsgálattal a TP508 peptid lassú felszabadulását biztosító formájának alkalmazásakor tapasztalható csontosodást vizsgáltuk. Kísérleteinkben nyulak bal tibiáján unilateralis külső rögzítő segítségével hat napon át, napi 1,4 mm-es sebességgel végeztünk végtaghoszszabbítást. Az 1. csoportban fiziológiás sóoldatban oldott TP508-at (300 µg/0.3 ml, n=6), a 2. csoportban dextrán géllel kevert, PPF/PLGA [�� poli(propilén-fumarát)/poly(lactát-co-glikolsav)��] mikrorészecskékbe ágyazott TP508-at (300 µg, n=5), míg a 3. csoportban dextrán gélt (300 µl, n=6) injektáltuk a hosszabbítási résbe a végtaghosszabbítás befejezése után. Az állatok ezt követően két héttel kerültek leölésre. A végtaghosszabbítást követően egy, illetve két héttel készített röntgenfelvételeken az 1. és 2. csoportban szignifikánsan nagyobb mértékű csontosodást tapasztaltunk, mint a 3. csoportban. A 2. héten készített mikro–CT-vizsgálat eredményei szerint a legintenzívebb csontképződés a 2. csoportban zajlott, és ugyanebben a csoportban remodellációt is észleltünk. A hosszabbított terület átlagos volumetriás csontsűrűség (vBMD) értéke szignifikánsan magasabb volt a TP508 peptiddel kezelt csoportokban, mint a kontrollcsoportban (p<0,05). A szövettani vizsgálatok megerősítették a képalkotó vizsgálatok eredményeit. Vizsgálatunk során igazoltuk, hogy a TP508 egyszeri kis adagjának (300 µg) a hosszabbítás végén történő injektálása szignifikánsan fokozta a csontos konszolidációt nyulak végtaghosszabbítása során. Úgy tűnik továbbá, hogy a PPF/PLGA mikrorészecskékbe ágyazott TP508 beadása jobb minőségű csontképződéshez vezet, mint a fiziológiás sóoldatban oldott hatóanyagé, azonban további, nagyobb esetszámú vizsgálatok szükségesek eredményeink megerősítésére, illetve annak vizsgálatára, vajon a PPF/PLGA mikrorészecskék alkalmazhatók-e hordozóanyagként a csontképződés fokozását célzó eljárások során. Kulcsszavak: Állatkísérlet; Csontregeneráció – Gyógyszerhatás; Osteogenesis – Gyógyszerhatás; Osteogenesis, distractio; Peptid – Farmakológia; Thrombin – Farmakológia; Y. Wang, Gy. Szőke, Gy.�� Domos, C. Wan, J. T. Ryaby, G. Li: Enhancing bone creation with locally administered thrombin-bound peptid (TP508) embedded into PPF/PLGA microparticles during limb lenghtening. Early results We have previously demonstrated that injections of the thrombin-related peptide, TP508, into the lengthening gap have significantly enhanced bone consolidation in a rabbit model of distraction osteogenesis. This study was performed to further test the effect of a single TP508 injection in slow release preparation on bone formation during distraction osteogenesis. Rabbits had left tibiae lengthened unilateral lengthener at rate of 1.4 mm/day for 6 days. TP508 was injected as follows: Group 1, TP508 in saline; Group 2, in PPF/PLGA [poly(propylene fumarate)/poly(D,Llacticco-glycolic acid)] microparticles; and Group 3, dextran gel only. All animals were killed 2 weeks after lengthening. On radiographies, more bone was formed in the two TP508-treated groups at first and second week postlengthening than that of the control Group 3. Microcomputed tomography (micro–CT) at 2 weeks indicated that the most advanced bone formation and remodelling was seen in Group 2. The mean volumetric BMD of the regenerates was Magyar Traumatológia  Ortopédia  Kézsebészet  Plasztikai Sebészet  2011. 54. 1.

27

significantly higher in the TP508 treated groups compared to the control group (p<0.05). Histological evaluations supported the radiographic and the micro–CT results. In conclusion, we have demonstrated that a single injection of small amount of TP508 (300 mg) at the end of lengthening phases has significantly enhanced bone consolidation process in a rabbit model of distraction osteogenesis. The delivery of TP508 in PPF/PLGA microparticles appears to lead to a better quality bone formation over the saline delivery, further examinations are needed to confirm if PPF/ PLGA microparticles may be desirable drug delivery form in augmenting bone formation. Keywords:

Animals; Bone regeneration – Drug effects; Osteogenesis – Drug effects; Osteogenesis, distraction; Peptide fragments – Pharmacology; Thrombin – Pharmacology;

BEVEZETÉS A trombin a szövetsérülések helyén a kezdeti stádiumban megjelenve serkenti a fibrinalvadék-képződést és a trombociták aktivációját. Ismert, hogy a trombin sokféle sejttípussal lép kölcsönhatásba a szövetgyógyulás során mind a korai, mind pedig a késői stádiumban (2, 16, 18, 25). Amikor a véralvadék feloldódik, a trombin fragmentumok több sejt specifikus receptorát aktiválva beindítják a gyógyulási folyamatot (23, 27). A TP508 trombin-kapcsolt peptid egy 23 aminosavból álló szintetikus peptid, amely a humán protrombin egyik receptorkötő helyét tartalmazza. A TP508 a trombin hatásait utánozva felgyorsítja a sebgyógyulási folyamat kezdetét azáltal, hogy kölcsönhatásba lép a nem proteolítikusan aktiválódó receptorokkal, és anélkül, hogy befolyásolná a trombin véralvadási aktivitását (25, 27). Ezen kívül a TP508 peptidről azt is kimutatták, hogy elősegíti a lágyszövetek, a porc és a törések gyógyulási folyamatait is (19, 21, 22, 24, 28). A callus distractio módszerével történő csontképződést a klinikai gyakorlatban széleskörűen alkalmazzák csontdefektusok, végtagdeformitások és álízületek kezelésében (7, 8, 15, 17). A módszer során általában hosszú idő szükséges a csontos konszolidáció eléréséhez, így a csontképződési folyamat serkentése gyakorlati szempontból igen előnyös lenne. Korábban több növekedési faktorról (például BMP–2 és BMP–7) kimutatták, hogy fokozza a csontos konszolidációt a callus distractio során (13, 20), mi pedig korábban nyulakon végzett kísérleteink során igazoltuk, hogy a TP508 peptidnek a hosszabbítási területbe történő ismételt injektálása (30–300 µg) szignifikánsan növeli a csontosodás mértékét. Jelen kísérletünkben egy továbbfejlesztett gyógyszerbeviteli eljárással a TP508 peptideket polipropilén-fumarát alapú (PPF) polilaktát-co-glikolsav (PLGA) összetételű, a peptidek lassú felszabadulását biztosító mikrorészecskékbe ágyaztuk (5, 6), és azt vizsgáltuk, hogy ezen anyag egyszeri injekciója fokozza-e a csontos konszolidációt a callus distractio során. ANYAG ÉS MÓDSZER Állatkísérletes modell és kísérleti csoportok Kísérletünket az Állatkísérletekről szóló 1986-os brit törvényben foglalt irányelveknek megfelelően végeztük, amely során 22 felnőtt új-zélandi fehér nyúl lábszárán végeztünk végtaghosszabbítást (az állatok átlagéletkora 24 hónap, átlagos testtömege 2,7 kg volt). Az állatokon műtétet végeztünk, amely során hosszabbítható fixateur externe-t helyeztünk a nyulak tibiájába, majd a tibia diaphysisén osteotomiát végeztünk a korábban leírt módszerünk szerint (9, 12). A posztoperatív 7. naptól kezdődően napi egyszeri alkalommal, 1,4 mm/nap sebességgel 6 napon át tartó végtaghosszabbítást végeztünk. A 22 állat közül öt leölésére a kísérlet befejezése előtt került sor részben a csontfuratok közeli törések (n=3), részben pedig lágyrészszövődmények miatt (n=2), ezeket az állatokat a kísérleti csoportokból kizártuk. A maradék 28

Magyar Traumatológia  Ortopédia  Kézsebészet  Plasztikai Sebészet  2011. 54. 1.

17 nyulat véletlenszerűen három csoportra osztottuk, mindegyik csoportba legalább öt állat került. Mindhárom csoportban a hosszabbítási periódus végén TP508 peptidet vagy kontrollanyagot juttattunk a hosszabbítási területre röntgenvezérelt perkután injekció segítségével. Az 1. csoport állatainak (n=6) 300 µl fiziológiás sóoldatban oldott 300 µg TP508 peptidet, a 2. csoportnak (n=5) 300 µl dextrán gélbe kevert, 300 µg TP508 peptidet tartalmazó PPF/ PLGA mikrorészecskéket, míg a 3. csoport állatainak (n=6) 300 µl dextrán gélt adtunk. A beadás során először a hosszabbítási terület középvonalába injektáltunk 100 µl anyagot, majd ettől 3 mm-rel distalis és proximalis irányba további 100–100 µl-t. A kísérlet teljes ideje alatt az állatok operált végtagjukat terhelhették és szabadon táplálkozhattak. Az állatok leölésére két héttel a hosszabbítás végét követően került sor. Közvetlenül a leölés után a hosszabbított területet a distal és proximal felé szomszédos 5–5 mm-es csontrészlettel együtt eltávolítottuk, melyet a további vizsgálatok elvégzése érdekében 95%-os etanolban fixáltunk. A TP508-at tartalmazó PPF/PLGA mikrorészecskék előkészítése A részletes előkészítési technikát már korábban leírtuk (5, 6). Röviden összefoglalva, a polilaktát-co-glikolsav (PLGA) (Medisorb; Alkermes, Cincinatti, OH, USA) mikrorészecskékbe ágyazott TP508 peptidet (Orthologic Inc, Phoenix, Arizona, USA) dupla emulziós és oldószeres kinyeréses technikával készítettük el, amely során 0,066g TP508/1g mikrorészecske töltetű, gömb alakú mikrorészecskéket kaptunk. A polipropilén-fumarát (PPF) összetételű vivőanyag elkészítése céljából a PPF-et CH2Cl2 jelenlétében polipropilén-fumarát-diakriláttal (PPF–DA) elegyítettük (a PPF:PPF–DA dupla kötési aránya 1:2 volt) és egy éjszakán át szobahőmérsékleten kevertük a két viszkózus oldat teljes elkeveredésének biztosítása érdekében. A PLGA mikrorészecskék és a PPF vivőanyag keverékét (0,09 g mikrorészecske/1 g polimer) addig kevertük, amíg a két anyag eloszlása homogén lett. Az eljárás végén a TP508 peptidet tartalmazó PLGA mikrorészecskék a PPF polimer vivőanyag komponensén belül helyezkedtek el. Minden lépést steril körülmények között végeztünk. A kész hordozóanyagot, az elkészítést követően további 12 órás UV expozíciónak tettük ki, és a felhasználásig –20oC-on tároltuk. Képalkotó vizsgálatok A sebészi beavatkozás napján, a hosszabbítás befejezésekor, továbbá ezt követően egy illetve két héttel az operált végtagokról röntgenfelvételeket készítettünk nagy felbontású digitális röntgen segítségével (Faxitron MX20, DC–2 opcióval, Faxitron X–ray Corporation, Illinois, USA). Az expozíciót 32 KV-tal 10 ms alatt, nagyítás nélkül végeztük. A hosszabbított terület és az újonnan képződött csont területének százalékos arányát független megfigyelők által pontoztattuk, és ez alapján kategorizáltuk (I. táblázat). A hosszabbított területet akkor tekintettük átépültnek, amikor annak keresztmetszete több mint 75%-ban csontosodott. A két megfigyelő pontértékeit mindegyik röntgensorozat esetében átlagoltuk, az átlagos pontértékeket mindegyik csoportra vonatkoztatva kiszámoltuk és összehasonlítottuk. Perifériás kvantitatív CT (pQCT) Az újonnan képződött csont sűrűségének megállapítása céljából a kivett csontmintákat Stratec XCT 960M (Norland Medical Systems, Fort Atkinson, USA) készülékkel, az 5.10-es szoftververzió (Norland Stratec Medizintechinik GmbH, Birkenfiled, Németország) segítségével vizsgáltuk. A vizsgálatot megelőzően a pQCT kalibrációját a megszokott módon hydroxiapatit sorozattal végeztük. Ezután a mintákat a tartóba helyeztük, és az előnézeti képen Magyar Traumatológia  Ortopédia  Kézsebészet  Plasztikai Sebészet  2011. 54. 1.

29

meghatároztuk a hosszabbított terület közepét. Három szeletet vizsgáltunk, a centrális szeletet, illetve egyet-egyet ettől 2 mm-re proximalisan illetve distalisan. A teljes volumetriás csontsűrűség meghatározása érdekében mindhárom szeletet analizáltuk a gyártó által biztosított XMICE v1.3 programmal. Az összes vizsgált minta értékelése alapján a sugárgyengülési küszöböt 1300-nak választottuk, ezáltal a lágyrészekben mért értékek nem befolyásolták az értékelést. A csontszövetet a lágyrészektől 275 mg/cm3 küszöbérték alapján különítettük el. Az összes vizsgált minta esetében a három szeletben mért értékek alapján kiszámoltuk és összehasonlítottuk az átlagos volumetriás csontsűrűség értékeket (vBMD). I. táblázat Az utolsó röntgenfelvételek középértékei Csoport

Középértékek

A teljes átépülést mutató állatok száma

1. TP508 300 µg fiziológiás sóban

3,25*

4/6

2. TP508 300 µg PPF/PLGA mikropartikulumokban

3,71*

4/5

3. Dextrán

2,60

2/6

Pontrendszer: 1. A hosszabbított terület kevesebb, mint 25%-a csontosodott 2. A hosszabbított terület 25 és 50% között csontosodott 3. A hosszabbított terület 50 és 75% között csontosodott 4. 75%-nál több csontosodott *p < 0,05, a 3-as csoporttal összehasonlítva

Mikro–CT-vizsgálat A pQCT-vizsgálatot követően minden mintán mikro–CT-vizsgálatot is végeztünk MicroCT–40 rendszerrel (Scano Medical, Bassersdorf, Svájc). Az alkalmazott szoftver adatait korábbi közleményekben (1, 4) ismertették. Röviden összefoglalva, a rendszer tartalmaz egy röntgensugár-forrást, ami egy hengeres mintatartó felé van irányítva. A vizsgálat során, a mintán áthaladt röntgensugarakat egy 1024×256-os felbontású CCD-vel detektálják, amit Compaq/HP Alpha Station rendszer vezérel. A vizsgálatok alkalmával a mintákat a lapos elülső felületükkel lefelé helyeztük a mintatartókba, lehetővé téve azok hosszanti irányú vizsgálatát. A mérési protokoll elkészítése során meghatároztuk a vizsgálat paramétereit: a röntgenforrás energiáját, a minta nagyságát és a kép felbontását. A röntgenforrás feszültségét 55 kV-nak, áramerősségét 72 mA-nek választottuk. A mintamérést közepes felbontással, a hosszabbított terület centrális részét tartalmazó, 2 mm vastagságú szeleten végeztük el. A közepes felbontású vizsgálat kétdimenziós hosszanti metszetekből álló képsorozatot eredményezett. A közepes felbontású szkenneléssel 60 egymást követő szeletet használtunk a hosszabbított terület háromdimenziós rekonstrukciójához. Szövettani vizsgálat A pQCT és a mikro–CT vizsgálatok után a mintákat 48 óráig 10%-os formalinban fixáltuk, ezt követően több mint négy héten keresztül 4ºC-on, 14%-os EDTA-ban (0,1 M TrisHCL pufferoldatban, pH 7,2) dekalcináltuk. A mintákat ezután felszálló alkoholsorba, xylenbe tettük és paraffinba ágyaztuk. Ezt követően hosszanti irányban (koronális síkban) 7 µm-es metszeteket készítettünk, amelyeket hematoxilin-eozinnal, illetve Alcián kékkel és Sirius vörössel festettünk meg. Az Alcián kék és Sirius vörös festést deparaffinálást, rehidrációt, és Weigertféle hematoxylin magfestést követően végeztük Alcián kékkel (0,1%, 1%-os ecetsavban oldva), illetve F3B Sirius vörössel (1%, szaturált pikrinsavban oldva). Az Alcián kék a proteoglikánban gazdag porcszövetet, míg a Sirius vörös az I-es típusú kollagént festette meg. 30


Statisztikai elemzés A pQCT vizsgálattal nyert adatokat a kereskedelmi forgalomban elérhető SPSS (11. verzió, Chicago, Illinois, USA) statisztikai programmal elemeztük. Az egyes kísérleti csoportok adatait a Mann–Whitney U teszttel dolgoztuk fel, az eltéréseket p<0.05 értéknél tekintettük szignifikánsnak. EREDMÉNYEK Általános megfigyelések A hosszabbítást követően egy héttel a bőrmetszés hege az 1. és 2. csoportban minden esetben gyulladásos tünet nélkül gyógyult. Ezzel ellentétben a 3. csoport 6 állata közül kettőben a bőrseb nem gyógyult meg a hosszabbítást követő első hét végére, és ebben a csoportban az állatok felében a seb körül duzzanatot és nyomásérzékenységét is észleltünk, és ezek az állatok nem terhelték operált végtagjaikat. A hosszabbítást követő második hét végére viszont már nem észleltünk számottevő különbséget a sebgyógyulás tekintetében az egyes csoportok között. A hosszabbított terület radiológiai vizsgálata A hosszabbítás átlagos mértéke az összes állat eredményeit értékelve 8,8 ± 0,6 mm volt. A hosszabbítás végén készített röntgenfelvételeken nem észleltünk különbséget az egyes csoportok között (1. ábra), azonban már a hosszabbítást követő 1. hét végén is nagyobb mértékű csontképződést észleltünk a TP508 peptiddel kezelt csoportok állatairól készült röntgenfelvételeken, mint a dextránnal kezelt kontrollcsoportban (1. ábra). A hosszabbítást követő 2. hét elteltével pedig a csontosodás pontértékei szignifikánsan magasabbak voltak a TP508 peptiddel kezelt csoportokban a kontrollcsoportban mért értékekhez képest (I. táblázat, p<0.05, Mann–Whitney U test). A hosszabbítást követően két héttel a corticalis folytonosságának radiológiai jeleit az 1. csoportban hatból négy állaton, a 2. csoportban ötből négy állaton, a 3. csoportban pedig hatból négy állaton figyeltük meg (1. ábra és I. táblázat). Ezen kívül a 3. csoportban nagyobb fokális defektusok jelenlétét igazoló sugáráteresztő területeket észleltünk a hosszabbított területen (1. ábra). 1. ábra Reprezentatív röntgenfelvételek az egyes kísérleti csoportokról a műtét napján (0. nap), a hosszabbítás végén, valamint egy és két héttel a hosszabbítást követően (1. csoport: 300 µg TP508 0,3 ml fiziológiás sóoldatban, 2. csoport: PPF/PLGA mikropartikulumba ágyazott 300 µg TP508 dextrán géllel keverve, 3. csoport: 0,3 ml dextrán gél). Magyar Traumatológia  Ortopédia  Kézsebészet  Plasztikai Sebészet  2011. 54. 1.

31

pQCT-eredmények A II. táblázatban feltüntetett eredmények szerint a hosszabbítást követő 2. hét elteltével a hosszabbított terület volumetriás BMD középértékei szignifikánsan magasabbak voltak a TP508 peptiddel kezelt csoportokban a kontrollcsoporthoz képest (p<0.05). A két TP508 kezelésben részesült csoport átlagos volumetriás BMD értékei között nem észleltünk különbséget (II. táblázat). II. táblázat Az újonnan képződött csont átlagos csontsűrűség értékei (mg/cm3) Csoport

BMD (középérték ±SD; mg/cm3)

p érték

1. TP508 300 µg fiziológiás sóban

495,48 ± 50.94

0,045 (vs. 3. csoport)*

2. TP508 300 µg PPF/PLGA mikropartikulumokban

522,73 ± 41,07

0,026 (vs. 3. csoport)*

3. Dextrán

436,78 ± 36,77

0,55 (1. vs. 2. csoport)

*p<0.05, Mann–Whitney U-test

MikroCT-eredmények A hosszabbított terület mikroCT-vizsgálatai nagyobb mértékű csontképződést ábrázoltak a két TP508 peptid kezelésben részesült csoportban (2. B és 2. D ábrák) a dextránnal kezelt kontrollcsoporthoz képest (2. F ábra). Az újonnan képződött csont a 2. csoportban egyenletes eloszlást mutatott a hosszabbított terület egészén (2. B ábra), és ugyanitt a csontos remodelláció jeleit is észleltük. Az 1. csoportban észlelt csontképződés kisebb mértékű volt, a hoszszabbított területen kisebb fokális defektusok ábrázolódtak (2. D ábra), míg a 3. csoportban gyakrabban észleltünk nagyobb fokális defektusokat és a csontképződés szerény mértékű volt a végtag antero-medialis oldalán (2. F ábra). Szövettani eredmények A hosszabbítást követően két héttel az 1. és 2. csoport állataiban a hosszabbított terület főként fonatos, a distractiós erőkkel párhuzamos irányba rendezett csontszövetből állt, a callus remodelláció jeleit mutatva (3. A, 3. B ábrák). Az 1. csoportban a hosszabbított területen különböző fokú konszolidációt észleltünk, ugyanitt mindegyik állat esetében porcszövetet is találtunk (3. A ábra). A 2. csoportban mindegyik esetben előrehaladott konszolidációt és egyenletesen formálódott kalluszt tapasztaltunk a hosszabbított területen, amelynek közepén kis mennyiségű porcszövetet is észleltünk (3. B ábra), de ennek mennyisége kevesebb volt az 1. csoportban észleltnél. A 3. csoportban a hosszabbított területen az esetek többségében kevert kötőszövetes–porcos és csontos szövetet észleltünk. Még a röntgenfelvételek alapján konszolidáltnak vélt kalluszok területén is gyakran észleltünk kötő- és porcszövetes fokális defektusokat ebben a csoportban (3. C ábra). Az adatokat összehasonlítva, a csontos konszolidáció és remodelláció a 2. csoportban volt a legnagyobb mértékű, ahol 5-ből 4 állatban a hosszabbított terület teljes mértékben, jól szervezett fonatos csontszövettel épült át (2. B ábra). Az 1. és 2. csoportban számos véredényt is észleltünk a kalluszok területén. Bár néhány esetben az 1. és 2. csoportban is észleltünk porcos szigeteket (nagyobb mértékben az 1. csoportban), nagyobb mennyiségű kötőszövetes-porcos szövet jelenlétét csak a 3. csoportban tapasztaltuk. Ezen kívül, gyulladásra utaló jelet az 1. és 2. csoport mintáiban nem észleltünk, gyulladásos sejteket (főleg limfocitákat) csak a 3. csoportban találtunk. 32


MEGBESZÉLÉS A callus distractio során az új csont képződése a distractiós erőkkel párhuzamosan alakul ki, gyors csontosodást eredményezve (7, 8). Ezt a módszert széleskörűen alkalmazzák a klinikai gyakorlatban számos kihívást jelentő ortopédiai esetben, mint például traumát, gyulladást és tumoreltávolítást követő csonthiányok rekonstrukciója alkalmával (15, 17). Mindazonáltal általában hosszantartó külső rögzítés szükséges az újonnan képződött csont megerősödése érdekében, és gyakran lépnek fel szövődmények is, mint például a hosszabbított területen kialakuló refractura (3, 9, 15, 17). Korábbi vizsgálatok eredményei alapján a hosszabbítás optimális sebessége 0.7 mm/nap-nak bizonyult nyulakban, naponta kétszer történő hosszabbítás mellett (9, 12). Kimutatták továbbá, hogy a magasabb rátával történő (>1.3 mm/nap) hosszabbítás esetén a csontképződés minősége romlik (9, 12, 14). Jelen kísérletünkben – az előző kísérletünkhöz hasonlóan (11) – napi egyszeri, 1,4 mm-es hosszabbítási sebességet választottunk annak érdekében, hogy az elégtelen csontképződés klinikai megjelenését modellezzük. 2. ábra Korábbi kísérletünk során igaHáromdimenziós mikro–CT kép. Bal oldalon a három csoport zoltuk, hogy a callus distractio korai reprezentatív mintáiról két héttel a hosszabbítást követően készült szakaszában a TP508 peptid (300 µg, röntgenfelvételek (A, C, E). Jobb oldalon a megfelelő mintákról készült 3–D mikro–CT ábrák (B, D, F). sóoldatban oldva) napi kétszeri, a hoszszabbított területbe történő injektálása fokozta a csontos konszolidációt (11). Jelen kísérletben is a hosszabbított terület csontsűrűségének szignifikáns növekedését, jobb minőségű csontképződést értünk el már egyetlen, lokálisan adott (sóoldatban vagy PPF/ PLGA mikrorészecskékben bevitt) TP508 peptid injekció segítségével. Bár a hosszabbított terület csontsűrűségében nem volt jelentős különbség a két TP508 peptiddel kezelt csoport között, abban a csoportban, amelyik a PPF/PLGA mikrorészecskékben bevitt hatóanyagot kapta, a csontsűrűség középértékek magasabbak voltak (522,73 ± 41,07 mg/cm3 vs. 495,48 ± 50,94 mg/cm3), illetve a szövettani vizsgálat is előrehaladottabb, egyenletesebb csontosodási képet mutatott, mint a másik TP508 peptiddel kezelt csoportban. A TP508 peptidnek a PPF/ PLGA mikrorészecskékben történő bevitele lehetőséget teremt arra, hogy a hatóanyag egyenMagyar Traumatológia  Ortopédia  Kézsebészet  Plasztikai Sebészet  2011. 54. 1.

33

letesen szabaduljon fel a részecskék lebomlásának folyamán, és ez által folyamatos hatóanyag-ellátást biztosítson a helyi szövetekben. 125I-dal jelölt TP508 peptid felhasználásával történt farmakokinetikai kísérletek (24) azt mutatták, hogy a jelölt peptid radioaktivitásának több mint 90%-a 24 órán belül kiválasztódik in vivo, amennyiben azt sóban oldott állapotban alkalmazzák, így valószínűleg a TP508 peptid közvetlen 3. ábra hatása az alkalmazás első 24 órájá- A három kísérleti csoport reprezentatív mintáinak szövettani metszetei: ban jelenik meg. A PPF/PLGA mik- 1. csoport (A), 2. csoport (B), 3. csoport (C). A nyilak a porcszövetet mutatják, F: fibrosus szövet. Sirius vörös/Alcián kék festés, 15-szörös nagyítás. rorészecskék megakadályozzák a TP508 peptid gyors lebomlását, így a peptid molekulák meg tudják őrizni biológiai aktivitásukat addig, amíg a PPF/PLGA mikrorészecskékből felszabadulnak (5, 6). A jelen kísérletben a PPF/PLGA mikrorészecskébe ágyazott TP508 esetében a beadást követő két hét során folyamatos hatóanyag kiáramlás történt, míg annál a csoportnál, amely a TP508 peptidet sóoldatban kapta, a hatóanyag bioaktivitása rövid életű volt, ami magyarázatul szolgálhat a két csoport között a csontosodásban tapasztalt különbségre. A PPF/PLGA mikrorészecskébe zárt TP508 peptid lassú felszabadulása hasonló lehet a fibrinalvadék lebomlásakor felszabaduló biológiailag aktív trombin kiáramlásához, és ahhoz hasonlóan indíthatja el és irányíthatja más, a lágyrészek és a csontok gyógyulásában szerepet játszó növekedési faktorok és enzimek expresszióját (2, 21, 24, 25, 28). Egy korábbi, patkányokban végzett kísérlet során igazolták, hogy a TP508 peptid mind fiatal, mind pedig idősebb patkányokban fokozza a csontgyógyulást (19). Sebgyógyulási modellekben a TP508 peptid alkalmazása megnövekedett neutrofil akkumulációt és aktivitást eredményezett, emellett pedig fokozott vascularizációt, illetve a mátrix- és a kollagéntermelés fokozódását is eredményezte (2, 24). Egy következő kísérlet bebizonyította, hogy az osteoblast differenciálódásában (Cbfa–1), a mátrixszintézisben (I és II típusú kollagén), illetve az érújdonképződésben résztvevő (VEGF) gének expressziója is fokozódott a TP508 peptiddel kezelt patkányokban a csontgyógyulás folyamatának különböző időpontjaiban; ezen kívül a TP508 peptid jelentősen növelte a korai növekedési faktorok, a gyulladásos választ módosító, és az angiogenesist befolyásoló egyéb gének expresszióját is (28). Ezen kívül a TP508 peptid alkalmazása mellett teljes vastagságú ízületi porcdefektus gyógyulását is leírták (21). Egy további kísérletben bőrmetszéseknél a vérerek mennyiségének szignifikáns növekedését találták TP508 peptiddel történő kezelést követően (2), ráadásul a TP508 által stimulált angiogenesis hasonlónak vagy nagyobb mértékűnek bizonyult, mint az erős angiogenetikus hatással rendelkező VEGF által okozott érújdonképződés. Kimutatták továbbá, hogy a TP508 peptid az angiogenesis korai fázisában és közvetlenül a mikrovascularis endotelsejtekre hatva fokozza az neovascularizációt. Ez a hatás VEGF–függőnek bizonyult, de nem járt a VEGF mRNS szintjének emelkedésével (26, 27). Ezen kívül a TP508 peptidnek kemotaktikus hatása van a humán endothelsejtekre és az osteoblastokra is (10). A kísérletek alapján valószínűsíthető, hogy a TP508 peptid helyileg alkalmazva a lassú felszabadulást biztosító formában is növelheti a sérült szövetek angiogenesisét és neovascularizációját (2, 18, 25, 26, 27). 34


Gyakorlati szempontból a csontosodást stimuláló peptidek (pl. TP508) használata előnyösebb lehet a proteinek (pl. rhBMP–2) alkalmazásánál, mivel gyakran olcsóbb az előállításuk, rövid, lineáris struktúrájuk miatt kevésbé sérülékenyek és valószínűleg jobban megőrzik bioaktivitásukat a tárolás és a szállítás során (5, 6). A PPF/PLGA mikrorészecskébe ágyazott TP508 peptid in vivo alkalmazásának további előnye, hogy hatékony, fokozatos hatóanyagfelszabadulást biztosít, közvetlenül a defektusba ültethető vagy fecskendezhető, így lokalizált gyógyszer-felszabadulást eredményez és csökkenti a lehetséges szisztémás toxikus hatásokat. Ráadásul a beültetett TP508 peptid felszabadulásának mértéke kontrollálható a PPF/PLGA mikrorészecskék elkészítésének változtatása által, így az az aktuális sebgyógyulási igényeknek megfelelően szabályozható (5, 6). Kísérleteink során igazoltuk, hogy 300 µg TP508 peptid egyszeri, a hosszabbítás végén történő befecskendezése szignifikánsan fokozza a csontos konszolidációt nyulakban, és úgy tűnik, hogy a PPF/PLGA mikrorészecskébe ágyazott TP508 peptid alkalmazása jobb minőségű csontképződést eredményez, mint a sóoldatban bevitt hatóanyagé. Eredményeink megerősítése érdekében további kísérleteket tervezünk, amelyek során nagyobb esetszámú csoportokon vizsgáljuk a TP508 peptid különböző beviteli formáinak, illetve a PPF/PLGA mikrorészecskék hatóanyag nélküli formájának a csontképződésre gyakorolt hatásait, kiegészítve a hosszabbított terület mechanikai tesztelésével valamint részletes hisztomorfometriai analízisével. IRODALOM 1. Bagi C. M., Hanson N., Andresen C., Pero R., Lariviere R., Turner C. H., Laib A.: The use of micro-CT to evaluate cortical bone geometry and strength in nude rats: Correlation with mechanical testing, pQCT and DXA. Bone, 2006. 38. (1): 136-144. 2. Carney D. H., Mann R., Redin W. R., Pernia S. D., Berry D., Heggers J. P., Hayward P. G., Robson M. C., Christie J., Annable C., Fenton J. W. II, Glenn K. C.: Enhancement of incisional wound healing and neovascularization in normal rats by thrombin and synthetic thrombin receptor-activating peptides. J. Clin. Invest. 1992. 89. (5): 1469-1477. 3. Hamanishi C., Kawabata T., Yoshii T., Tanaka S.: Bone mineral density changes in distracted callus stimulated by pulsed direct electrical current. Clin. Orthop. Relat. Res. 1995. 312: 247-252. 4. Hanson N., Bagi C. M.: Alternative approach to assessment of bone quality using micro computed tomography. Bone, 2004. 35. (1): 326-33. 5. Hedberg E. L., Kroese-Deutman H. C., Shih C. K., Crowther R. S., Carney D. H., Mikos A. G., Jansen J. A.: Effect of varied release kinetics of the osteogenic thrombin peptide TP508 from biodegradable, polymeric scaffolds on bone formation in vivo. J. Biomed. Mater. Res. A 2005. 72. (4): 343-353. 6. Hedberg E. L., Tang A., Crowther R. S., Carney D. H., Mikos A. G.: Controlled release of an osteogenic peptide from injectable biodegradable polymeric composites. J. Control. Release. 2002. 84. (3): 137-150. 7. Ilizarov G. A.: The tension-stress effect on the genesis and growth of tissues. Part I. The influence of stability of fixation and soft-tissue preservation. Clin. Orthop. Relat. Res. 1989. 238: 249-281. 8. Ilizarov G. A.: The tension-stress effect on the genesis and growth of tissues: Part II. The influence of the rate and frequency of distraction. Clin. Orthop. Relat. Res. 1989. 239: 263-285. 9. Li G., Bouxsein M. L., Luppen C., Li X. J., Wood M., Seeherman H. J., Wozney J. M., Simpson H.: Bone consolidation is enhanced by rhBMP-2 in a rabbit model of distraction osteogenesis. J. Orthop. Res. 2002. 20. (4): 779-788. 10. Li G., Cui Y., McIlmurray L., Allen W. E., Wang H.: rhBMP-2, rhVEGF(165), rhPTN and thrombinrelated peptide, TP508 induce chemotaxis of human osteoblasts and microvascular endothelial cells. J. Orthop. Res. 2005. 23. (3): 680-685. 11. Li G., Ryaby J. T., Carney D. H., Wang H.: Bone formation is enhanced by thrombin-related peptide TP508 during distraction osteogenesis. J. Orthop. Res. 2005. 23. (1): 196-202. 12. Li G., Simpson A. H., Kenwright J., Triffitt J. T.: Effect of lengthening rate on angiogenesis during distraction osteogenesis. J. Orthop. Res. 1999. 17. (3): 362-367. Magyar Traumatológia  Ortopédia  Kézsebészet  Plasztikai Sebészet  2011. 54. 1.

35

13. Li G., Simpson A. H., Triffitt J. T.: The role of chondrocytes in intramembranous and endochondral ossification during distraction osteogenesis in the rabbit. Calcif. Tissue. Int. 1999. 64. (4): 310-317. 14. Li G., Virdi A. S., Ashhurst D. E., Simpson A. H., Triffitt J. T.: Tissues formed during distraction osteogenesis in the rabbit are determined by the distraction rate: localization of the cells that express the mRNAs and the distribution of types I and II collagens. Cell. Biol. Int. 2000. 24. (1): 25-33. 15. Moseley C. F.: Leg lengthening. A review of 30 years. Clin. Orthop. Relat. Res. 1989. 247: 38-43. 16. Naldini A., Carraro F., Baldari C. T., Paccani S. R., Bernini C., Keherly M. J., Carney D. H.: The thrombin peptide, TP508, enhances cytokine release and activates signaling events. Peptides, 2004. 25. (11): 1917-1926. 17. Noonan K. J., Leyes M., Forriol F., Canadell J.: Distraction osteogenesis of the lower extremity with use of monolateral external fixation. A study of two hundred and sixty-one femora and tibiae. J. Bone Joint Surg. Am. 1998. 80. (6): 793-806. 18. Norfleet A. M., Bergmann J. S., Carney D. H.: Thrombin peptide, TP508, stimulates angiogenic responses in animal models of dermal wound healing, in chick chorioallantoic membranes, and in cultured human aortic and microvascular endothelial cells. Gen. Pharmacol. 2000. 35. (5): 249-254. 19. Ryaby J. T., Carney D. H., Campbell M.: Acceleration of fresh fracture healing with an injectable thrombin peptide in a rat model. Transactions. ORS. 2000. 25: 877. 20. Sakou T.: Bone morphogenetic proteins: from basic studies to clinical approaches. Bone 1998. 22. (6): 591603. 21. Schwartz Z., Carney D. H., Crowther R. S., Ryaby JT, Boyan BD.: Thrombin peptide (TP508) treatment of rat growth plate cartilage cells promotes proliferation and retention of the chondrocytic phenotype while blocking terminal endochondral differentiation. J. Cell. Physiol. 2005. 202. (2): 336-343. 22. Sheller M. R., Crowther R. S., Kinney J. H., Yang J., Di Jorio S., Breunig T., Carney D. H., Ryaby J. T.: Repair of rabbit segmental defects with the thrombin peptide, TP508. J. Orthop. Res. 2004. 22. (5): 1094-1099. 23. Sower L. E., Payne D. A., Meyers R., Carney D. H.: Thrombin peptide, TP508, induces differential gene expression in fibroblasts through a nonproteolytic activation pathway. Exp. Cell. Res. 1992. 247. (2): 422-431. 24. Stiernberg J., Norfleet A. M., Redin W. R., Warner W. S., Fritz R. R., Carney D. H.: Acceleration of full-thickness wound healing in normal rats by the synthetic thrombin peptide, TP508. Wound Repair. Regen. 2000. 8. (3): 204-215. 25. Stiernberg J., Redin W. R., Warner W. S., Carney D. H.: The role of thrombin and thrombin receptor activating peptide (TRAP-508) in initiation of tissue repair. Thromb. Haemost. 1993. 70. (1): 158-162. 26. Tsopanoglou N. E., Papaconstantinou M. E., Flordellis C. S., Maragoudakis M. E.: On the mode of action of thrombin-induced angiogenesis: thrombin peptide, TP508, mediates effects in endothelial cells via alpha-beta3 integrin. Thromb. Haemost. 2004. 92. (4): 846-857. 27. Vartanian K. B., Chen H. Y., Kennedy J., Beck S. K., Ryaby J. T., Wang H., Hoying J. B.: The non-proteolytically active thrombin peptide TP508 stimulates angiogenic sprouting. J. Cell. Physiol. 2006. 206. (1): 175-180. 28. Wang H, Li X, Tomin E, Doty SB, Lane JM, Carney DH, Ryaby JT.: Thrombin peptide (TP508) promotes fracture repair by up-regulating inflammatory mediators, early growth factors, and increasing angiogenesis. J. Orthop. Res. 2005. 23. (3): 671-679.

Dr. Szőke György SE Ortopédiai Klinika 1113 Budapest, Karolina út 27.

36


PLGA mikrorészecskékbe ágyazott trombin-kapcsolt peptid (TP508) a csontképződést elősegítő hatása végtaghosszabbítás során

Recommend Documents