PŘÍRODOPIS, BIOLOGIE

PŘÍRODOPIS, BIOLOGIE

TROJLÍSTEK - PODPORA VÝUKY

PŘÍRODOPISU, BIOLOGIE, FYZIKY A CHEMIE ŽÁKŮ VE VĚKU 11 AŽ 15 LET reg. č.: CZ.1.07/1.1.00/26.0044

PROJEKT JE REALIZOVÁN V RÁMCI OPERAČNÍHO PROGRAMU VZDĚLÁVÁNÍ PRO KONKURENCESCHOPNOST A SPOLUFINANCOVÁN Z PROSTŘEDKŮ EVROPSKÉHO SOCIÁLNÍHO FONDU A STÁTNÍHO ROZPOČTU ČR

Obsah

1 Základy optiky ___________________________________________________________ 3 1.1

Optické soustavy _____________________________________________________________ 3

1.1.1 1.1.2

1.2

Optické členy pracují na základě zákonů lomu a odrazu paprsků _____________________________ 3 Lom paprsků ______________________________________________________________________ 5

Zobrazování čočkou a rozptylkou ________________________________________________ 6

1.2.1 1.2.2 1.2.3

Čočka ____________________________________________________________________________ 6 Rozptylka _________________________________________________________________________ 9 Vady optických členů________________________________________________________________ 9

1.3

Lupa ______________________________________________________________________ 10

1.4

Mikroskop _________________________________________________________________ 11

1.4.1 1.4.2 1.4.3

Jak vzniká v mikroskopu obraz _______________________________________________________ 15 Neobvyklé způsoby mikroskopování __________________________________________________ 19 Mikrofotografie ___________________________________________________________________ 20

2 Terénní odběry mikroorganismů ___________________________________________ 26 2.1

Pomůcky ke sběru ___________________________________________________________ 26

2.2

Měření v terénu ____________________________________________________________ 27

2.3

Záznamy o sběru a vzorcích ___________________________________________________ 27

3 Laboratoř______________________________________________________________ 28 3.1

Preparační nástroje a pomůcky ________________________________________________ 28

3.2

Zdroj pokusných organismů ___________________________________________________ 30

3.3

Kultivace __________________________________________________________________ 32

3.3.1 3.3.2 3.3.3

3.4

Metody preparace __________________________________________________________ 34

3.4.1

3.5

Fixovaný materiál, cytologie _________________________________________________________ 34

Studium na živých organismech ________________________________________________ 34

3.5.1 3.5.2 3.5.3

3.6

Okenní kultivace, krátkodobá kultura pro orientační pohled _______________________________ 32 Kultivace na pevných půdách, růst kolonií, výběr kolonií, převod do sbírky ___________________ 32 Experimentální kultivace, jak nasadit pokus, jak zajistit stálou teplotu a intenzitu světla _________ 32

Stanovení životního cyklu ___________________________________________________________ 34 Určení generační doby a růstové křivky ________________________________________________ 35 Studium pohybu __________________________________________________________________ 35

Živná media ________________________________________________________________ 35

3.6.1 3.6.2

Jednoduchá živná media s půdním odvarem ____________________________________________ 35 Jednoduchá plně definovaná kultivační media __________________________________________ 37

4 Závěr _________________________________________________________________ 39

TROJLÍSTEK – podpora výuky přírodopisu, biologie, fyziky a chemie žáků ve věku 11 až 15 let, reg. č. CZ.1.07/1.1.00/26.0044

1

Příručka pro biologii Příručka vznikla na základě projektu „Trojlístek – podpora výuky přírodopisu, biologie, fyziky a chemie žáků ve věku 11 až 15 let“. Je zaměřena na zvládnutí základů optické mikroskopie a technik studia mikroorganismů získaných z lokálních zdrojů (řas, sinic, kvasinek, probiotických organismů). Naše publikace je metodický doplněk k laboratorní výuce. V první části představuje základy optických soustav a základy mikroskopie. Ve druhé se věnuje práci v laboratoři a popisuje základní techniky experimentální biologie. Nezapomíná ani na improvizace, které je nutno v minimálních pracovních podmínkách učinit. Doufáme, že příručka pro biologii bude platnou pomůckou pro učitele a žákům poodhalí krásu a tajemno mikroskopie.


2

1

Základy optiky

Optické pomůcky a přístroje se ve studiu biologie využívají v terénu i při práci v laboratoři. Je jich celá řada od nejjednodušší lupy až ke složitému přístroji - mikroskopu. Ačkoliv se to na první pohled nemusí zdát, lupa i mikroskop mají společné optické členy. Pracují totiž na základě zákonů lomu a odrazu paprsků v prostředí o různých optických vlastnostech. Kdo se specializuje na mikroskopickou biologii, musí tyto zákony velmi důkladně znát. Stejně tak by měl vědět, jak ošetřovat světelný mikroskop, jak ho správně seřídit, a poznat jeho rozlišovací meze.

1.1

Optické soustavy

Mikroskop je složité zařízení, které obsahuje několik optických soustav. Optická soustava je složena alespoň ze dvou optických členů, například spojné čočky a zrcadla. Právě na ty se v této části zaměříme. 1.1.1

Optické členy pracují na základě zákonů lomu a odrazu paprsků

Odraz paprsků známe například ze zrcadla. U rovinného zrcadla je odraz úplný. To znamená, že všechny paprsky přicházející na plochu zrcadla se odrážejí ve stejném úhlu, v jakém na něj dopadly. Známe ale i polopropustná zrcadla. U těch je na základní skleněné desce napařena slabá odrazná vrstva, od které se část dopadajících paprsků odrazí a část prochází. O tom, v jakém poměru jsou odražené a procházející paprsky, rozhoduje hustota napařené vrstvičky. Základní schéma variant odrazu je uvedeno na obrázku 01 a obrázku 02.

zrcadlo

propustné zrcadlo

propustný hranol

Obrázek 01: Odraz paprsků - jak se paprsky odrážejí a jsou propouštěny optickými soustavami. TROJLÍSTEK – podpora výuky přírodopisu, biologie, fyziky a chemie žáků ve věku 11 až 15 let, reg. č. CZ.1.07/1.1.00/26.0044

3

Paprsek dopadající na zrcadlo v úhlu 45° je odrážen ve stejném úhlu 45°, takže dohromady 90°, což nám v konkrétním případě umožňuje vidět „za roh“. Totéž platí i o složeném optickém hranolu. Prakticky se tohoto jevu využívá například při vytyčování pravých úhlů v terénu.

ZDROJ SVĚTLA výstup 3. hranolu

2. hranol optická osa 1. hranol

výstup 1. hranolu

3. hranol

výstup 2. hranolu

Obrázek 02: Odrazy a propustnosti možné v optických hranolech. V mikroskopové technice je někdy užíváno zrcadlo při tak zvaném kritickém způsobu osvětlení, tedy když není možné použití světelného zdroje. Hranoly jsou užívány zejména v binokulárním tubusu, popřípadě jako pomocný optický člen při fotografování.


4

1.1.2

Lom paprsků

Lom paprsků známe například z pohledu do vody, v níž je částečně ponořen pokusný objekt. Zkuste to. Uvidíte, že se bude zdát kratší, než skutečně je. Lom paprsků je závislý na optické hustotě prostředí, kterým paprsek prochází. Optická hustota udává množství absorbovaného světla pohlceného v měřeném vzorku. Vzduch má optickou hustotu jedna, voda ji má vyšší. Při průchodu z prostředí opticky řidšího do prostředí opticky hustějšího se paprsky lámou v úhlu, který je závislý na optické hustotě nového prostředí. Schéma je na dalším obrázku 03. Lomu paprsků se běžně využívá v mikroskopii, kdy pomocí imersní (ponořené) optiky zvyšujeme rozlišovací schopnost optického systému. Bílý paprsek, který je složen z barev celého spektra, se lomí tak, že se rozkládá na jednotlivé barevné složky. Dopadá-li paprsek bílého světla z hustšího prostředí do řidšího, po lomu se rozkládá. Nejméně se odchyluje od původního směru paprsek červený, nejvíce modrý.

MEZNÍ ÚHEL

ÚPLNÝ ODRAZ Sklo

Vzduch

LOM Sklo

Vzduch

Obrázek 03: Lom paprsků – jak se světlo láme při průchodu z opticky hustějšího prostředí do prostředí opticky řidšího.


5

1.2

Zobrazování čočkou a rozptylkou

Čočka je optický člen s kladnou optickou mohutností, naopak rozptylka má optickou mohutnost zápornou. Optická mohutnost je veličina ukazující zakřivení čočky. Rozptylce se lidově říká také zmenšovací sklíčko a jako optický člen má mnoho funkcí při korekcích optických vad. Nás však budou více zajímat čočky. 1.2.1

Čočka

Na počátku všeho je osa, tedy optická osa. Můžeme si ji představit jako paprsek běžící z nekonečna do nekonečna. Kdyby běžela jen tak, neměla by valného smyslu. Takových přímek může být nekonečně mnoho a velmi chaotických. Jiná situace nastane, když umístíme do prostoru čočku. Ta totiž ihned určí, kudy má optická osa běžet a umístí ji do svého optického středu (obrázek 04). Jakmile kolem běžící paprsky uvidí, že se vyskytlo něco, co jim dává řád, po průchodu čočkou se seřadí podle zajímavých pravidel.

a

b

F

f

O

f´

F´ c

Obrázek 04: Průchod paprsků spojnou čočkou. Paprsek „a“, rovnoběžný s optickou osou, se láme do ohniska. Paprsek „b“, procházející optickým středem, pokračuje nezměněným směrem. Paprsek „c“, procházející ohniskem, pokračuje po průchodu spojnou čočkou rovnoběžně s optickou osou. TROJLÍSTEK – podpora výuky přírodopisu, biologie, fyziky a chemie žáků ve věku 11 až 15 let, reg. č. CZ.1.07/1.1.00/26.0044

6

Nás teď zajímají paprsky, které jdou rovnoběžně s optickou osou, tedy kolmé na rovinu optického členu – v tzv. optické rovině. Ty se po průchodu čočkou soustřeďují do ohniska (obr. 05), ležícího na optické ose označeného písmenem F. Jistě namítnete, že v tom případě musí existovat ještě jedno ohnisko pro paprsky letící opačným směrem. Máte pravdu. Druhé ohnisko také existuje a označujeme je písmenem F‘. Vzdálenost mezi optickým středem čočky a ohniskem je nazvána „ohnisková vzdálenost“ a značíme ji symbolem f, pro opačný směr opět s apostrofem f‘. Jestli ohnisko skutečně existuje, se můžete jednoduše přesvědčit. Jakoukoli spojnou čočku postavte plochou ke slunci a tam, kde je ohnisko, uvidíte zářivý bod. Promítnete-li ohnisko na ruku, popálí Vás. Tímto způsobem se v Řecku tradičně zapaluje olympijský oheň. Jak je to s paprsky, které neběží rovnoběžně s osou, ale přesto čočkou projdou? Z hlediska zobrazení nás zajímají paprsky, které procházejí ohniskem. Ty po průchodu čočkou změní směr a dále jdou rovnoběžně s optickou osou (také obrázek 05). Paprsky, které projdou středem optického členu, se nezmění a pokračují dále svým původním směrem (také obrázek 05). Něco jsme se dozvěděli o třech základních směrech průchodu paprsků (tzv. konstrukčních paprsků), které budeme potřebovat pro vysvětlení, jak se zobrazí předmět. Věnujme se tedy zobrazování předmětu spojnou čočkou. Tu si pro zjednodušení nějak označíme v průmětu optické roviny. Pro náš výklad potřebujeme definovat ještě dvojnásobnou ohniskovou vzdálenost (2F, resp. 2F‘) a určit si rovinu předmětovou a obrazovou. Tím si určíme směr paprsků, aby nás to nemýlilo (viz obr. 05). Předmět si označíme jako tradičně šipkou, ale může to být třeba slon, anebo bacil. Teď se ještě podíváme na obrázek 05, kdy je předmět umístěn v dvojnásobné ohniskové vzdálenosti. Jak vidíte, jeho skutečný obraz existuje v obrazové rovině také ve dvojnásobné ohniskové vzdálenosti. Je skutečný, převrácený a má stejnou velikost jako zobrazovaný předmět.

PŘED MĚT

Obrazová rovina f´

2F

Předmětová rovina

F

f

O

F´

2F ´

OBRAZ

Obrázek 05: Konstrukční paprsky – jak je předmět zobrazován spojnou čočkou.


7

Obrázek 06 ukazuje předmět za dvojnásobnou ohniskovou vzdáleností (směrem k nekonečnu). Jeho obraz existuje v obrazové rovině mezi dvojnásobnou ohniskovou vzdáleností a ohniskovou vzdáleností. Je skutečný, převrácený a zmenšený (to je případ běžné fotografie, kdy tento skutečný, převrácený a zmenšený obraz zachytíme na film nebo čip). PŘEDMĚT

Obrazová rovina

f´ 2F

F

f

F´

2F´

O

Předmětová rovina

OBRAZ

Obrázek 6: Jak je předmět obrazově zmenšen (případ fotografie krajiny). Obrázek 07 znázorňuje stejnou situaci, je-li předmět mezi dvojnásobnou ohniskovou vzdáleností a ohniskovou vzdáleností. Obraz předmětu je v tomto případě v obrazové rovině za dvojnásobnou ohniskovou vzdáleností směrem k nekonečnu. Obraz je skutečný, převrácený a zvětšený. To je pro změnu případ makrofotografie, kdy tento skutečný, převrácený a zvětšený obraz zachytíme na film nebo čip. A je to i případ mikroskopie, kdy tento skutečný, převrácený a zvětšený obraz pozorujeme okulárem jako lupou.

2f

f´ F´ 2F

F Předmětová rovina

f

Obrazová 2F´ rovina

O

2f´

Obrázek 07: Jak je předmět obrazově zvětšen (případ makrofotografie).


8

1.2.2

Rozptylka

Zobrazování rozptylkou není pro nás jako uživatele tak důležité. Přesto si je ukážeme, abychom si alespoň zopakovali to, co zde již bylo řečeno o zobrazování čočkou. Obrázek 08 schematicky ukazuje zobrazení rozptylkou. Nyní je na vás, abyste si je zdůvodnili.

f

F

optická osa

Obrázek 08: Čočka rozptylná.

1.2.3

Vady optických členů

Vady optických členů jsou pro zobrazování velmi důležité. Teorií optických vad a jejich odstraňováním se zabývá věda zvaná optika. Výklad optických vad a jejich odstranění je velmi rozsáhlý a odchyloval by se od tématu této příručky. Zájemce odkážeme na specializovanou literaturu.


9

1.3

Lupa

Lupa – tak se nazývá nejjednodušší, tolik potřebný, optický nástroj pro biologa. Můžete namítnout, že lupa je také spojná čočka a musí tedy zobrazovat stejně. To je sice pravda, rozdíl je ale v tom, že pozorovaný předmět je umístěn mezi ohniskovou vzdáleností a optickou rovinou spojné čočky, které teď říkáme lupa. V tomto uspořádání se reálný obraz nevytvoří. Obraz vznikne v naší mysli. Představa zobrazování lupou (tedy představa o vytvoření neskutečného, zvětšeného a nepřevráceného obrazu) je schematicky uvedena na obrázku 09. Lupa je tedy ono „zvětšovací sklo“, které umožní pozorovat předměty velikosti špendlíkové hlavičky, anebo nám zvětší písmenka, která jsou tak malá, že je bez lupy nepřečteme. Existují například knižní miniatury, které se prodávají i s příslušnou lupou. Je to ale i případ mikroskopu, kdy skutečný, převrácený a zvětšený obraz pozorujeme okulárem (což je vlastně lupa). V naší mysli ho pozorujeme jako neskutečný, přímý a zvětšený odraz.

zdánlivý obraz POZOROVATEL

předmět

O F

f´

F´

f

Obrázek 09: Zobrazení lupou – předmět je umístěn do prostoru ohniskové vzdálenosti.


10

1.4

Mikroskop

Se znalostí zobrazování spojné čočky v obou variantách, tedy i lupy, a se znalostí lomu a odrazu si nyní můžeme rozebrat i chod paprsků v mikroskopu. Nejprve jeho hlavní prvky. Jak jsou umístěny, ukazuje obrázek mikroskopu s popisem (obr. 10).

Obrázek 10: Kde najít jednotlivé části mikroskopu – kritické osvětlení.


11

Stativ – dříve se říkalo noha mikroskopu, ale můj učitel říkával: „Pokud má mikroskop nohu, pak pouze proto, aby tě kopl, že mu ubližuješ“. A měl pravdu. Hlavní mechanickou částí mikroskopu je stativ. Je to ono „železo“, na němž jsou vázány všechny ostatní části, ať již optické nebo mechanické. Světelný zdroj – zajišťuje dobré osvětlení zorného pole mikroskopu, tedy té části preparátu, kterou právě zkoumáme. Může být pevně spojen se stativem mikroskopu, může být odnímatelný a znovu pevně nastavitelný ve stejné poloze, anebo u starších a starých typů nespojený pevně s mechanikou mikroskopu. V posledním případě je nutno světlo před prací nastavit a seřídit podle toho, co nám příslušný zdroj, např. slunce, dovolí. Součástí mechaniky světelného zdroje bývá tzv. polní clona. Ta vymezuje optimální svazek paprsků Stativ

přicházejících ke kondenzoru (viz níže). Všechny nadbytečné paprsky odstraňuje, protože by svými odrazy dělaly obraz méně kvalitní.

Zrcadlo – zajišťuje odraz světelného zdroje (např. vlákna žárovky) k další optické soustavě, kterou je obvykle kondenzor (viz níže). Pochopitelně v mikroskopu může být zrcadel více. Obvykle jsou ve formě hranolů, polopropustných hranolů, polopropustných destiček - to záleží na výbavě mikroskopu. Protože se zabýváme pouze základy, mějme za zrcadlo pouze to, co nám vede cestu paprsků od světelného zdroje ke kondenzoru. Není-li světelný zdroj pevně spojen s mechanikou mikroskopu, pak zrcadlo vidíme obvykle jako kulaté a otáčivé v obou potřebných rovinách. Otáčení je nutné, hledáme-li vhodné světlo z cizího světelného zdroje. (Pochopitelně nemusíme hledat jenom světelný zdroj. Velmi brzy jsme ve škole dokázali „seřídit“ mikroskop tak, že jsme pozorovali, jak pracují naše spolužačky (spolužáci)). Kondenzor – je velmi důležitou optickou částí a říká se, že je tvůrcem dobrého obrazu s optimálním osvětlením a rozlišením. Jeho úkolem je promítnout obraz světelného zdroje do roviny preparátu a to v patřičné síle a bez zbytečných paprsků. Součástí kondenzoru bývá i aperturní clona, o které se zmíníme později. Existuje celá řada kondenzorů. Dělí se podle užití. My se pravidelně setkáváme s kondenzorem pro procházející světlo, Kondenzor

někdy s kondenzorem pro fázový kontrast. To je již specielní zobrazování, pro nás však důležité, neboť nám umožňuje pozorovat organismy za živa, bez nutného barvení. Vidět řasy za


12

živa, sledovat jejich životní projevy a zaznamenávat změny během jejich životního cyklu, to je na laboratorní práci algologa to nekrásnější. Tím nechci podceňovat barvící techniky, ke kterým se také dostaneme. Stolek – Stolek mikroskopu je ta část, na kterou klademe objekt ve formě preparátu. Musí zajistit rovinu a kolmost vzhledem k optické ose mikroskopu. To je jeho hlavní úkol. Tak byl také v minulosti chápán. Preparát byl držen svorkami a pohyb preparátem zajišťovaly ruce pozorovatele. Později přišly křížové stolky, které umožňují jemný pohyb preparátu ve směru podélném i příčném. A tak je známe dodnes. Preparát – tak a teď budete v rozpacích. Copak je preparát optickým členem mikroskopu? Vidíte a je! Jen s tím rozdílem, že jeho Stolek

optickou kvalitu určujeme sami svou šikovností při jeho přípravě. U

ostatních optických členů nastavil optickou kvalitu někdo již při výrobě. Jak udělat kvalitní preparát si povíme v dalších kapitolách. Objektiv – má výhradní postavení. Čím je kvalitnější, tím je naše pozorování přesnější. Musíme brát v úvahu, že jeho kvalita se musí shodovat s kvalitou ostatních optických systémů mikroskopu. Vždyť

Objektiv

nač by nám byl kvalitní objektiv bez kvalitního kondenzoru nebo s chybně nastaveným osvětlením? A to nemluvím o kvalitně zhotoveném preparátu, co nejtenčím a bez zbytečných přebytků zalévacího media, s čistým podložním i krycím sklem. Okulár – je vlastně optický výstup mikroskopu, pomocí okulárů pozorujeme předmět na preparátu. Okulár

Tubus – je vzdálenost mezi objektivem a okulárem. U mikroskopu monokulárního je to

Tubus

jen trubka a pozorujeme pouze jedním okem. TROJLÍSTEK – podpora výuky přírodopisu, biologie, fyziky a chemie žáků ve věku 11 až 15 let, reg. č. CZ.1.07/1.1.00/26.0044

13

Tubus u binokulárního mikroskopu je dán hranolovým systémem, který paprsky dělí do dvou okulárů. My potom pozorujeme oběma očima. Existuje ještě mikroskop trinokulární, kde je třetí výstup určen pro kameru.

Obrázek 10a: Kde najít jednotlivé části mikroskopu – osvětlení dle Köhlera.


14

1.4.1

Jak vzniká v mikroskopu obraz

V předchozím textu jsme si vysvětlili úlohu optických členů pro konstrukci obrazu na základě pravidel geometrické optiky. To nám postačí pro pochopení vzniku obrazu v mikroskopu a k tomu, abychom uměli mikroskop dobře seřídit. Schéma chodu konstrukčních paprsků je na obr. 11. okulár

objektiv předmět F´

F´ok O

F

POZORUJEME

Fok

POZOROVATEL

skutečný obrácený zvětšený obraz f´

zdánlivý obrácený zvětšený obraz

Obrázek 11: Zobrazení mikroskopem – jak pozorujeme obraz předmětu okulárem mikroskopu.

1.4.1.1. Zvětšení mikroskopu S pojmem rozlišovací schopnost a pojmem celkové zvětšení mikroskopu se setkáme velmi často. Je všeobecným omylem, že kvalita mikroskopu se pozná podle celkového zvětšení. To se určí snadno. Hodnota zvětšení uvedená na objektivu se vynásobí hodnotou zvětšení okuláru, popřípadě dalším faktorem uvedeným na binokulárním tubusu, a máme zvětšení daného optického páru. To nám ovšem nic neřekne o tom, jaké nejmenší detaily můžeme ještě rozlišit a jaké detaily už nerozlišíme. Z předchozího můžeme vyvodit, že velká zvětšení vyžadují, aby okulár i objektiv měly krátké ohniskové vzdálenosti.


15

1.4.1.2. Rozlišovací schopnost Rozlišovací schopnost závisí na rozlišovací schopnosti objektivu. Tu si můžeme přečíst na každém objektivu. Je to číslo uvedené pod zvětšením objektivu. Kvalitu mikroskopu (použitého zvětšení) charakterizuje tzv. rozlišovací mez. To je nejmenší vzdálenost dvou bodů, které ještě od sebe při pozorování rozlišíme. Na maličkých částicích mikroskopového preparátu se totiž světlo ohýbá, a tak se bod nezobrazuje jako bod, ale jako světelný kroužek. Z teorie ohybu vyvodil pan Abbe, že vzdálenost d mezi dvěma rozlišitelnými body je závislá na délce vlny záření, které dopadá na preparát kolmo a vyvodil vztah: d = vlnová délka / A, kde A je tzv. numerická apertura, daná dalším vztahem A= n * sin u, kde n je relativní index lomu prostředí mezi preparátem a objektivem, u je úhel mezi osou objektivu a krajním paprskem, který vystupuje z preparátu a je ještě zachycen objektivem. Z toho je zřejmé, že mikroskop rozliší blízké body tím lépe, čím užíváme kratší vlnové délky a čím větší je numerická apertura vyjadřující světelnou účinnost objektivu. To vysvětluje, proč se pro velká zvětšení klade mezi preparát a přední čočku objektivu kapalina o větším indexu lomu světla – tzv. olejová imerze.


16

1.4.1.3. Dobré osvětlení a jeho nastavení Princip chodu paprsků v mikroskopu je uveden na obrázku 11. Ten ukazuje, že zrakem (pomocí okuláru) pozorujeme obrázek zdánlivý, obrácený a zvětšený. Plyne to z minulých zobrazení, kdy vlastně pozorujeme obraz skutečný, převrácený a zvětšený lupou, jejímž výsledkem je obraz zvětšený a zdánlivě přímý.


17

Praktické nastavení osvětlení a tím celého mikroskopu je poněkud komplikovanější. Rozeznáváme dva druhy osvětlení. Kritické a osvětlení podle Köhlera. Kritické osvětlení zobrazuje obrázek 12. zdroj světla

aperturní clonka preparát objektiv

ZRCADLO

kondenzor Obrázek 12: Kritický způsob osvětlení – aperturní clona kondenzoru slouží zároveň jako polní clona, omezující krajní paprsky.

Osvětlovací systém je složen ze zrcátka, aperturní clony a kondenzoru. Zrcátko poskytuje pomocí odrazu rovnoběžný svazek paprsků, který je omezen aperturní clonou a kondensorem soustředěn do místa předmětu. Někdy je užíváno zrcátko vyduté, působící jako čočka, která soustřeďuje svazek paprsků ke kondenzoru. Nastavení je jednoduché. Na stolek mikroskopu vložíme preparát a pohybem hrubého ostření zaostříme na nějakou strukturu při menším zvětšení. Poté pohybem zrcátka nastavíme maximální osvětlení, které optimalizujeme pohybem kondenzoru. Poté vyjmeme okulár a ze vzdálenosti asi 25 cm pozorujeme zorné pole na zadní čočce objektivu. Pohneme-li aperturní clonou, uvidíme její pohyb do středu zorného pole. Rozevřeme ji tak, aby otevřela alespoň 9/10 zorného pole. Okulár vrátíme a pozorujeme, měníme zvětšení a světlo dále upravujeme. Osvětlení podle Köhlera (obr. 13) je dokonalý způsob, který zajišťuje při dobrém seřízení optimální osvětlení co do kvality i kvantity. Osvětlovací systém je složen ze světelného zdroje (obvykle speciální žárovka), sběrné čočky světelného zdroje, polní clony, aperturní clony a kondenzoru.


18

polní clonka

aperturní clonka preparát objektiv

zdroj světla

sběrná čočka světelného zdroje

obraz zdroje kondenzor světla

Obrázek 13: Köhlerův princip osvětlení.

Nastavení předpokládá několik kroků. Na stolek mikroskopu vložíme preparát a pohybem hrubého ostření zaostříme na nějakou strukturu při menším zvětšení. Pohybem sběrné čočky světelného zdroje promítneme obraz vlákna žárovky do roviny polní clony, přitom si pomáháme průsvitkou. Díváme se do okuláru (POZOR světlo může být příliš silné, je nutno je tlumit šedým filtrem) a posunem kondenzoru zaostříme obraz polní clonky v zorném poli. Je-li její obraz mimo střed zorného pole, provedeme její vycentrování justičními prvky na kondenzoru. Rozevřeme polní clonku tak, aby její okraj právě opustil zorné pole. Vyjmeme okulár a ze vzdálenosti asi 25 cm pozorujeme zorné pole na zadní čočce objektivu. Pohneme-li aperturní clonou, uvidíme její pohyb do středu zorného pole. Rozevřeme ji tak, aby otevřela alespoň 9/10 zorného pole. Okulár vrátíme a pozorujeme. Pro každé zvětšení je nutno tento postup korigovat v případě, že je naší snahou vidět všechny detaily, které nám užitá optika umožňuje svou rozlišovací schopností. Zvláště významné je to při pořizování fotozáznamů. 1.4.2

Neobvyklé způsoby mikroskopování

Optická mikroskopie zaznamenala velký rozvoj, což je dáno rozvojem věd obecně. Pro naše skromné účely zatím postačí popsaná mikroskopie v procházejícím světle, která je pro algologa experimentátora v oblasti fyziologie řas nejdůležitější. Pozorujeme-li živé mikroorganismy, je užitečná TROJLÍSTEK – podpora výuky přírodopisu, biologie, fyziky a chemie žáků ve věku 11 až 15 let, reg. č. CZ.1.07/1.1.00/26.0044

19

technika fázového kontrastu. Ta umožní pozorovat struktury buňky bez obarvení, a to během celého životního cyklu. Vyžaduje zvláštní optiku, kterou nahrazujeme optiku běžně užívanou. Podrobnostmi o této technice se nebudeme zabývat, jsou běžně k nalezení v literatuře. 1.4.3

Mikrofotografie

Dokumentovat pozorované je součástí práce každého výzkumníka. Vedle kreslení, což je velmi důležitá technika, dnes poněkud podceňovaná, je mikrofotografie technikou nejobvyklejší. Schéma toho, jaký obraz pozorujeme (zdánlivý) a jaký obraz fotografujeme (skutečný) je uveden na obr. 14. Jistě si všechna pravidla na tomto obrázku zopakujete a uvědomíte si, co je k pořízení snímku potřeba. Asi si také vyvodíte, že máte-li fotoaparát zaostřen na nekonečno a výstupní pupila okuláru je přibližně stejných rozměrů jako vstupní pupila objektivu fotoaparátu (obvykle jako co největší ohnisková vzdálenost-teleobjektiv), můžeme pořídit snímek, sice nepříliš kvalitní, ale sloužící k hrubé orientaci a předloze pro kresbu.

okulár skutečný obrácený zvětšený obraz

objektiv předmět F´

SNÍMÁME KAMEROU projektiv F´ok

Fok 2F proj 2F´ projektivu

F

zdánlivý obrácený zvětšený obraz

F´projektivu

POZORUJEME OKULÁREM

Obrázek 14: Konstrukce reálného obrazu pro mikrofotografii – co pozorujeme a co fotografujeme. Kvalitní fotografickou dokumentaci ovšem pořídíme pouze tehdy, jestliže jsme si vědomi, že snímáme reálný obraz v reálné vzdálenosti a reálným rozlišením. Dnes je možno pořídit pro fotografii nástavce na běžné digitální fotoaparáty, které zachytí obraz ve výborné kvalitě. Nástavec obvykle obsahuje optickou soustavu, která všechny požadavky na kvalitní záznam rozřeší.


20

Jinou oblastí je pořízení kinematografického záznamu technikou, které se říká mikrokinematografie. Jak název vypovídá, jde o techniku záznamu pohybu. Vědecká kinematografie se vyvíjela paralelně s vývojem technik filmu a její význam tkví zejména v popularizaci výsledků získaných v jiných vědeckých odvětvích. Na druhé straně je faktem, že celá řada buněčných mechanismů, zejména jejich dynamiky a kinetiky, byla objevena právě za pomoci mikrokinematografie. Můžeme se zařadit mezi výzkumníky, kteří budou navazovat na bohatou tradici a skvělé výsledky svých předchůdců? Jednoznačně můžeme konstatovat, že ano. Chce to pouze trpělivost, vůli stále se vzdělávat a sledovat literaturu oboru, který jsme si zvolili. Pochopitelně, že je nutné mít k disposici zařízení, které nám umožní pořizovat kontinuální záznam. Dále popíšeme postup a metodiky potřebné k pořízení časosběrného záznamu růstu mikroorganismů (např. řas, sinic, kvasinek, probiotických kultur).

Pomůcky: (o vlastní laboratorní technice je pojednáno dále) mikroskop vybavený záznamem obrazu (fotoaparát ukládající snímky ve formátu JPG, či TIFF), pořizujeme-li záznam přesahující kapacitu paměťové karty, je třeba propojení s počítačem. kultivační komůrka (je možné sestavit na místě nebo využít hotových konstrukcí) kultivovanou suspenzi řasové kultury (možno i z přírodního, čerstvého sběru) počítač se softwarem skládajícím jednotlivé obrázky do sekvencí.

Nejobtížnější je zajistit dobré kultivační podmínky během delší doby sledování. V případě některých organismů jsou to přibližně dva dny, během kterých dojde k dělení alespoň jedné buňky coenobia. Obr. 15 ukazuje schematicky několik jednorázových kultivačních komůrek, pomocí nichž můžeme pořídit krátkodobý záznam. Obrázek 15A ukazuje složení visuté kapky. Ta se hodí na pozorování při menším zvětšení. Ke stěnám distanční vložky je možno umístit kapku vody, aby preparát nevysychal. Montovaný preparát na obr 15B umožňuje pozorování při větších zvětšeních. Je-li pečlivě zhotoven, je možno dělat záznam i při imersním objektivu. Obrázek 15C ukazuje schéma Ranvierovy komůrky, která je vhodná pro dlouhodobější pozorování. Je-li těleso komůrky vysoké do dvou milimetrů, je možno použít i objektivy o větším zvětšení. Možností tvorby a konstrukce kultivačních komůrek je celá řada, některé jsou patentově chráněny. To platí zejména o konstrukcích, které umožňují průtok kultivačního media, měření teplot, pH a jiných parametrů, které jsou pro některé výzkumné úlohy nezbytné. Naše práce se však odehrává v prostředí, v němž pozorujeme životní projevy krátkodobě, zaznamenáváme je a obraz vyhodnocujeme pomocí statistických metod. TROJLÍSTEK – podpora výuky přírodopisu, biologie, fyziky a chemie žáků ve věku 11 až 15 let, reg. č. CZ.1.07/1.1.00/26.0044

21

organismy přirostlé na krycím skle

krycí sklo suspenze organismů vazelínové těsnění visutá kapka

montovaný preparát

podložní sklo

A

B

krycí sklo kapka vody vazelína suspenze organismů tělo komůrky

Ranvierova komůrka C

Obrázek 15: Schéma jednoduchých kultivačních komůrek pro krátkodobou kultivaci v mikroskopu a pořízení kinematografického záznamu.


22

Obrázek 15a: Ukázka Ranvierovy komůrky vysoké 10 mm.

Na obrázku 16 vidíte sestavu mikroskopu, kamery a kultivační komůrky, která umožnila výzkum životního cyklu mnoha mikroorganismů. Výsledek je možno vidět v přiloženém časosběrném záznamu.


23

Obrázek 16: Sestava mikroskopu, kamery, kultivační komůrky, eventuelně počítače se softwarem na časové ovládání kamery. Současné kamery umějí použít časosběrný režim bez nutnosti zapojení do počítače.

Správně seřídit mikroskop a udělat kvalitní preparát je základem jakékoli mikroskopické práce. Jak ale správně připravit preparát pro optickou mikroskopii? Schéma je uvedeno na obrázku 17.

objektiv

krycí sklo cca 0,15 mm silné objekt v kapce vody

kondenzor

Obrázek 17: Schéma uložení preparátu na stolek optického mikroskopu Základem je podložní sklíčko. Sklo řádně očistíme a vyleštíme do sucha, neboť na čistotě použitých skel závisí kvalita výsledného obrazu. Na podložní sklo, asi doprostřed, umístíme malou kapku zkoumané buněčné suspense, nebo do kapky vody přeneseme zkoumaný objekt. Opatrně přiklopíme řádně očištěným a vyleštěným krycím sklíčkem a dbáme přitom na to, aby byl preparát bez bublin. Ty by byly vidět jako ostře ohraničené kruhy. Takto udělaný preparát vložíme na stolek mikroskopu, krycím sklem nahoru, směrem k objektivu. Jak jste asi z předchozího zjistili, použití objektivů o vysoké numerické apertuře je vázáno na přestup paprsků v podobném prostředí, tedy na prostředí o podobném indexu lomu, pokud chceme využít TROJLÍSTEK – podpora výuky přírodopisu, biologie, fyziky a chemie žáků ve věku 11 až 15 let, reg. č. CZ.1.07/1.1.00/26.0044

24

rozlišovací schopnosti optiky. Imerzní technikou zvýšíme světelnost objektivu. Tato technika využívá imerzní tekutiny (imerzního oleje, vody přidané na podložní sklíčko), do které se vnoří objektiv optického mikroskopu. Tato technika je možná pouze s imerzním objektivem.

sklo objektivu index lomu 1,25

paprsky, které jsou díky shodnému indexu lomu oleje a skla zachyceny optikou

paprsek, který není optikou zachycen, protože index lomu vzduchu jej láme

optika

přechodové médium olej – index lomu 1,51

olej

vzduch index lomu 1,00 sklo

Obrázek 18: Použití imerzního oleje.


25

2

Terénní odběry mikroorganismů

Sběr přírodního materiálu a jeho dokumentace vyžadují naši pečlivost. Je nutné připravit si všechny pomůcky potřebné ke sběru materiálu a řádně je udržovat. Doporučujeme vytvořit si speciální odběrovou soupravu do terénu, včetně zápisníku a tužky.

2.1

Pomůcky ke sběru

Pomůckou k odběru přírodního materiálu, může být jakýkoli nástroj, kterým oddělíme část vzorku, za účelem jeho pozdějšího podrobného studia. Během sběru vzorků jde vždy o (1) odběr na místě výskytu, (2) přemístění do vzorkovnice a (3) transport do laboratoře. Pokud nepředpokládáme studium živého materiálu a jeho následnou kultivaci, pak vzorek ve vzorkovnici ihned fixujeme (usmrtíme). Typem odběrových pomůcek se zabývá specializovaná literatura, pro naše účely postačí vyjmenovat několik základních. 1. Odběrové lahvičky (vzorkovnice, odběrovka) – pro naše účely jsou vhodné pěti až desetimililitrové skleničky, někdy nazývané lékovky. Jsou skladné a mají obvykle dobře těsnící plastovou zátku. Můžeme ale použít i jiné lahvičky nebo zkumavky. Pro těsné uzavření může posloužit vhodná korková, či gumová zátka. Dbáme na to, aby hrdlo nebylo příliš úzké, abychom do odběrovky snadno vkládali větší části vzorku i delší vlákna. Pokud odebíráme vzorek vody s planktonem, pak je vhodnější asi půllitrová láhev, nejlépe z umělé hmoty, ta je nerozbitná. Opět by měla mít široké hrdlo pro pozdější snadnou manipulaci se vzorkem. 2. Miska na dělení vzorku -

je velmi užitečná, potřebujeme-li si odebraný vzorek rozdělit,

předběžně prohlédnout (třeba lupou) a do odběrovky přemístit jen tu část, která se nám zdá nejlepší. Pro tento účel skvěle vyhovuje petriho miska, ale může to být i jakákoli jiná miska, např. fotografická. 3. Lžička – na škrábání nánosů na kamenech (bentosu). Vhodná je nerezová polévková lžíce, ale poslouží dobře nožík i pinzeta. 4. Pipetka na odběry planktonu – výhodou je nerozbitná pipeta z umělé hmoty, která má zároveň i sací balonek. Pro odběry planktonu postačí menší pěti mililitrová. Pokud nemáme pipetu z plastu, postačí obyčejná skleněná, zakončená sacím balonkem, což může být obyčejný dětský dudlík. 5. Pinzeta – pro odběr stačí hrubší pinzeta asi 15 cm dlouhá, seženeme-li delší, bude snadnější odebrat vzorek z nepřístupných míst. 6. Preparační tyčinky – dobré pro práci v misce, když dělíme vzorek. Je vhodné mít alespoň dvě, dobře poslouží obyčejné špejle, ale preparační jehly jsou lepší. Ty si nakonec můžeme udělat sami.


26

2.2

Měření v terénu

Při odběru vzorku je samozřejmě nutné změřit fyzikální parametry prostředí, ze kterého vzorky odebíráme. Změříme teplotu vody a její kyselost, popíšeme, jde-li o proudící nebo klidnou vodu. Dále změříme teplotu ovzduší a charakterizujeme ozářenost stanoviště. Stačí odhadem – například zastíněno, ozářeno plným sluncem, zarostlé křovinami apod. Poznamenáme také datum a čas odběru. K měření teploty potřebujeme teploměr, s dělením od 0 do 50 °C s přesností na půl stupně. Pokud zkoumáme teplé vody, například termální prameny, je nutný teploměr o vyšším rozsahu. Teplotu ovzduší musíme měřit suchým teploměrem (aby nedošlo ke snížení skutečné hodnoty způsobené odpařováním vody na povrchu teploměru) a ve stínu. K měření kyselosti vody použijeme papírky nebo tekuté indikátory se srovnávací barevnou tabulkou. Dobrý pH metr je pomůcka poměrně nákladná a pro terénní měření, kde jde o hrubé stanovení, není nezbytná. Změřit kyselost vody je však nutným předpokladem, pokud zamýšlíme vzorky dále kultivovat. V takovém případě musíme zajistit shodné pH i v kultivačním mediu.

2.3

Záznamy o sběru a vzorcích

Každá vzorkovnice musí být opatřena štítkem a řádně očíslována. Číslo napsané na vzorku pak souhlasí s číslem, které uvádíme v záznamu. Obvykle číslujeme vzorky z odběrových dní vzestupnou řadou, někdo však používá jednu číselnou řadu třeba pro celý rok. Závisí to na našem rozhodnutí, co se nám bude zdát výhodnější a přehlednější a jak často budeme do terénu chodit. Pro záznam si opatříme zápisník, nejlépe čtverečkovaný. Pro terénní sběry se osvědčil tzv. Učitelský zápisník, který je velmi vhodně členěn pro zápisy i dokumentaci.


27

3

Laboratoř

Biologické laboratoře jsou si značně podobné zejména tehdy, nejde-li pouze o poznávání, či určování druhů, ale také o pozorování života a funkce jak populace, tak i jednotlivých buněk. Zabýváme se mikroorganismy, což pro většinu z nás znamená studovat růst a dělení buňky či populace a pohyby cytoplasmy.

Zejména

pak

pohyby

chloroplastů,

lokomoční

pohyby,

pohyby

buněčných

kompartmentů a celou řadu dalších momentů, které nám spolu se soustavnějším studiem blíže osvětlí biologii těchto zajímavých a užitečných organismů.

3.1

Preparační nástroje a pomůcky

Základem úspěšného zvládnutí mikroskopických technik je zvládnutí potřebných kultivačních a preparačních postupů. Podmínkou jsou kvalitní preparační nástroje. Řada z nich je komerčně dostupná. Často si je však vytváříme nebo upravujeme sami. 1. Pasteurova pipeta – je zúžená skleněná trubice o průměru asi 6 mm a délce přibližně 15cm. Ústí trubice je zúženo pravidelně na průměr asi 0,5 mm, jsme však schopni si ústí trubice upravit nad plamenem do žádaného průměru, až vlasového. Pohyb tekutiny v trubici je ovládán savičkou, umístěnou na jejím širším konci. 2. Očkovací

klička

–

pod

tímto

termínem označujeme nástroj, pomocí něhož očkujeme převážně tuhé půdy. Je to vlastně tyčinka zakončená hrotem, s různou tvarovou úpravou. Obvykle se jedná o očko o průměru asi 2 mm, což je ta aktivní část kličky, která musí být odolná zahřívání do ruda. Klička se totiž sterilizuje vypálením. Z toho plyne, že aktivní část je drátek z materiálu, který vydrží časté rozžhavování. Mezi očkovací nářadí zařazujeme i jiné tvary, zhotovené ze skleněných tyčinek průměru asi 2 mm. Ty si vyrábíme podle potřeby sami nad plamenem (postačuje lihový kahan). Obvykle jsou to triangly, nebo tvar podobný hokejce. Sterilizace je u skleněného materiálu jednoduchá – vypálením. 3. Preparační jehly – opět ruční nástroj, dosažitelný komerčně, popřípadě vyrobitelný podle přání na tuhost a pružnost použitého materiálu. S pomocí preparační jehly upravujeme vzorek, rozdělujeme ho, či pouze přeuspořádáme. Obvykle pracujeme se dvěma jehlami, často pod pevnou lupou, či preparačním mikroskopem. TROJLÍSTEK – podpora výuky přírodopisu, biologie, fyziky a chemie žáků ve věku 11 až 15 let, reg. č. CZ.1.07/1.1.00/26.0044

28

4. Hodinová skla – kulatá vydutá skla různého průměru, která slouží většinou k separaci odděleného vzorku nebo ke krátkodobému odložení zajímavého materiálu. 5. Rovná skla (podložní a krycí) – rovná skla mají v praxi široké využití. Je dobré udělat si přípravek na preparaci tak, že mezi dvě tabulová skla o rozměrech přibližně formátu A5 uzavřeme černý a bílý papír a okraje zalepíme páskou. Získáme tak podložku, na které se vzorek dobře prohlíží proti bílému nebo černému pozadí. Rovným

sklem

je

také

podložní

mikroskopové sklo (tloušťka asi 1,5 mm) a krycí preparátové sklo (tloušťka 0,16 mm). Krycí skla se dodávají v různých rozměrech a různých tloušťkách. 6. Chemické, odměrné a kultivační sklo - má různé tvary a různé použití. Je nutno vybírat podle katalogu dodavatelských firem. Patří sem odměrky, kádinky, zkumavky, Petriho misky, pipety… 7. Tlakový hrnec (Papinův hrnec), autokláv - Autoklávování, jako způsob sterilizace, můžeme ve skromných podmínkách domácí laboratoře nahradit tlakovým hrncem. Princip jeho funkce je stejný, je jím sterilizace tlakovou párou. Počínáme si stejně, jako při vaření v tlakovém hrnci, nesmíme zapomenout na podložku, která slouží k umístění sterilizovaného materiálu, a nesmíme zapomenout, že pod touto podložkou musí být vrstva vody, z níž se tvoří pára. 8. Lihový kahan - je důležitá pomůcka v laboratoři široce využitelná. Na jeho plameni opalujeme očkovací nástroje, ústí kultivačních nádob, kultivační zátky. Slouží také na drobné úpravy skleněných nástrojů, zejména trubic, které vytahujeme na žádaný průměr. Nyní je ta pravá doba na to, abychom si připomněli, jak udělat správně preparát pro optickou mikroskopii. Správně seřídit mikroskop a udělat dobrý preparát je základem jakékoli biologické práce. Schéma je uvedeno na obrázku 17. Základem je podložní sklo normalizovaných rozměrů. Sklo řádně očistíme a vyleštíme

do

sucha.

Na

podložní sklo asi doprostřed umístíme

malou

kapku

zkoumané buněčné suspense (nebo

do

přeneseme

kapky jiný

vody objekt).

Opatrně přiklopíme krycí sklo, také

řádně

očištěné

a vyleštěné. Na čistotě skel TROJLÍSTEK – podpora výuky přírodopisu, biologie, fyziky a chemie žáků ve věku 11 až 15 let, reg. č. CZ.1.07/1.1.00/26.0044

29

závisí do značné míry kvalita výsledného obrazu. Dbáme, aby preparát byl bez bublin, ty jsou vidět jako ostře ohraničené kruhy. Takto udělaný preparát vložíme na stolek mikroskopu, krycím sklem směrem k objektivu.

3.2

Zdroj pokusných organismů

1. Přírodní sběr, voda ze stanoviště, krátkodobá kultura. Přírodní sběr je podmíněn měřením a záznamy naměřených hodnot vnějšího prostředí. Pro kultivace, kterým říkáme krátkodobé, se hodí voda ze stanoviště, do které v laboratoři přemístíme odebraný vzorek. Vznikne tak tzv. krátkodobá kultura. Ta se hodí zejména pro první mikroskopování, kdy určíme, zda je přítomen organismus, který hledáme. Misku s krátkodobou kulturou je možné držet přibližně týden. Poněvadž bývá pravidelně umisťována do okna, někdy se jí také říká okenní kultura. 2. Sbírka, jak udělat vlastní sbírku, jak udržovat sbírku, jak namíchat a uvařit půdu, jak udržet sterilitu, co je pasterizace, jak pasážovat, jak očkovat šikmé agary, jak roztírat suspenzi na pevnou agarovou půdu v Petriho misce, jak očkovat tekuté půdy. Rozhodneme-li se, že kulturu uchováme za účelem izolace žádaného mikroorganismu, začínáme vytvářet sbírku. Pro jednoduchost budeme užívat termíny kultura v tekutém médiu a kultura na pevném médiu. Jak namíchat živný roztok je uvedeno v kapitole 3.6, kde jsou popsány dva základní druhy tekutého media. V živném roztoku kultivujeme řasy v Erlenmayerových lahvích, anebo v jiných lahvích, které mají zúžené hrdlo. S úspěchem lze užít například skleněné lahve od kečupu. Tekuté půdy očkujeme buď suspensí kultury pasteurovou pipetou, anebo kusem kolonie,

vybrané

z agarové

plotny

pomocí očkovací kličky, či jehly. K jednomu ze základních a nezbytných pracovních postupů ve sbírce patří zejména řádné mytí skla, sterilizace, pasážování

kultur

a

vedení

dokumentace. Sklo umýváme naložením do vody, když před tím odstraníme pevnou

agarovou

půdu.

Ve

vodě

zbavíme sklo pevných ulpívajících částic pomocí houbiček a kartáčů. Po několikerém vypláchnutí vodovodní vodou promyjeme vodou destilovanou a usušíme. Destilovaná voda se užívá k závěrečnému oplachu kvůli zamezení skvrn po kapkách vodovodní vody.


30

Ve sbírce většinou užíváme pevnou agarovou půdu. Tu získáme přídavkem asi 1,5% agaru do tekuté půdy. Agar nutno v půdě rozvařit, aby zkapalněl. Je možné to udělat v tlakovém hrnci. Tekutou půdu s agarem rozléváme za sterilních podmínek do sterilních kultivačních nádob (erlenmayerovy lahve) nebo do zkumavek. Zkumavky klademe po nalití půdy šikmo, aby se po ztuhnutí vytvořila co největší plocha, na níž očkujeme. Zkumavky či jiné nádoby kryjeme vatovou, či tylovou zátkou, pochopitelně sterilní. Teplou (tekutou) agarovou půdou můžeme plnit i Petriho misky, které jsou kryty víkem (agarová plotna). V petriho miskách provádíme obvykle separaci buněk roztěrem. Šikmé agary očkujeme pomocí očkovací kličky, petriho plotny rovněž, anebo pomocí hokejky, či trianglu ze skla. Do suchých lahví, či misek naléváme tekuté půdy, uzavřeme vatovou zátkou a jsme

připraveni

ke

sterilizaci.

Tu

provádíme v autoklávu, dobře poslouží tlakový hrnec. Na kovovou síťku na dně tlakového

hrnce

uložíme

předměty

určené ke sterilizaci, zkontrolujeme, zda je dno tlakového hrnce pokryto vodou, hrnec uzavřeme a vaříme. Postačí cca 20 minut v tlakové páře, aby byly předměty pro naše účely sterilní. Nemáme-li tlakový hrnec, můžeme užít tzv. pasterizaci, což je vaření ve vodní páře při normálním tlaku po dobu cca 20 minut. Toto vaření opakujeme druhý den, kdy předpokládáme, že vyklíčily spory, které následným varem zničíme. Užíváme-li pevných půd, je nutno nalévat je ve sterilním prostředí do sterilních misek, nebo zkumavek. Sterilita v tomto případě není kritická, postačí, není-li v místnosti průvan a pracovní plocha je čistě umytá pomocí aseptika. Na ústech je dobré mít sterilní roušku. Pochopitelně naléváme opatrně pod nadzvednutým víkem petriho misky, kterou ihned přiklopíme. Zkumavky ihned uzavíráme a klademe do šikmé polohy k utuhnutí. Jsou uzavírány zátkou, zhotovujeme si ji z buničité vaty, složením, stočením a fixací přelepením vhodnou páskou, či ovázáním nití. Existují také uzávěry komerční, kovové. Mezi základní dokumentaci sbírky patří přírůstkový seznam (sešit), do kterého zapisujeme manipulace se sbírkovým materiálem, data pasáží (přeočkování buněk do nového kultivačního média), popřípadě datum primární kultivace. Číslování a způsob zápisu volí každý tak, aby mu vyhovoval. Je ovšem nutné, držet se zásady zpětného dohledání původu jakékoli sbírkové kultury. Jeli kultura předána pro další výzkum, je dobré i o tomto učinit zápis.


31

3.3 3.3.1

Kultivace Okenní kultivace, krátkodobá kultura pro orientační pohled

Význam okenní kultivace je krátkodobý, objekty jsou obvykle umístěny ve vodě z naleziště. Provádíme přehled toho, co jsme nasbírali, co hodláme držet i do budoucna a zaznamenáváme poznatky při pozorování. Zde je dobré mít tzv. pracovní deník, který je základní pracovní dokumentací, ke které se budeme často vracet. 3.3.2

Kultivace na pevných půdách, růst kolonií, výběr kolonií, převod do sbírky

Zajímá-li nás nějaký organismus či společenstvo, očkujeme z této základní krátkodobé kultivace příslušný zlomek a přemístíme ho na pevnou nebo tekutou půdu do petriho misky. Pevná půda má své přednosti v následné manipulaci s vhodně narostlou kolonií. Vybranou kolonii vypíchneme z mateřské plotny a přemístíme na dceřinou plotnu, kde ji rozetřeme. Smyslem je izolovat buňky vhodných vlastností a izolovat druhově čisté kolonie. Pokud jsme si jisti, že jsme získali čistou kulturu, převedeme ji na šikmý agar do sbírky. Techniky izolace a separace kultury a zejména techniky klonování jsou velmi rozsáhlé a tvoří jednu ze základních úloh v biotechnologiích. 3.3.3

Experimentální kultivace, jak nasadit pokus, jak zajistit stálou teplotu a intenzitu světla

Podaří-li se izolovat populaci řas nebo sinic, je nutno učinit experimentální kultivaci. Účelem je zjistit optimální kultivační podmínky pro její dobrý růst, případně zjistit, při jakých kultivačních podmínkách se tvoří biologicky aktivní látky.


32

Každý

pokus

je

složen

z pokusných variant a jejich opakování. Varianty slouží ke kvantifikaci

závislosti

mezi

dávkou (například zkoumané látky,

nebo

rozsahem

fyzikálního faktoru) a účinkem (ten

je

počtem

měřen

například

buněk,

optickou

denzitou, obsahem barviv, či hledané

látky,

atd.).

Opakování

slouží

k tomu,

abychom eliminovali případné chyby, či nepravidelnosti. Každý pokus musí obsahovat kontrolu, tedy variantu neovlivněnou. Zkoumáme-li otázku toxicity nějaké látky, je nutno zařadit ještě tzv. kontrolu pozitivní, to je taková, o které víme, že působí toxicky Při kultivačním pokusu je nutno zajistit stálé podmínky prostředí, v případě růstového pokusu s řasami je to hlavně teplota a intenzita světla, ale může to být i stálý přísun oxidu uhličitého, intenzita probublávání, střídání dne a noci, popřípadě stálé osvětlení. Proto byla zkonstruována celá řada kultivačních zařízení, často zcela automatizovaných. Pro naše skromné podmínky, kdy nejde o přesné experimenty, ale spíš o udržení kultury v dobrém růstovém stavu, je dobré postavit si jednoduché zařízení, se zářivkou, která zajistí dobré světlo pro růst. To prozatím stačí. Mikrokultivace, jak zajistit kultivace malého počtu buněk v mikroskopu, jak udělat jednoduchou komůrku pro pozorování buněčných projevů Obr. 15 ukazuje schéma jednoduchých komůrek použitelných pro obrazový záznam projevů buňky. Komůrky jsou vhodné pro krátkodobé pozorování, je nutno, aby součástí prostoru byla vzduchová bublina, odkud řasy čerpají plyny, aby byla zajištěna výživa, což je splněno kultivačním médiem. Bývá problém s nechtěným pohybem buněk, to je obvykle řešeno montáží do polotekutého agaru (tak zvaný softagar o přibližné koncentraci 0,1 až 0,05 %.) Takový agar je zhotoven zpevněním tekutého média, jinak by nebyla zajištěna výživa. Agar je pro plyny prostupný. Uvedené konstrukce komůrek jsou vhodné pro krátkodobé pozorování, obvykle do 50 hodin. Výjimku tvoří komůrka Ranvierova, kde můžeme buňky udržet v dobrém stavu dlouhodobě až 14 dní.


33

3.4 3.4.1

Metody preparace Fixovaný materiál, cytologie

Jistě se nevyhneme studiu řas a sinic ve fixovaném stavu. Rozumí se tím šetrné usmrcení buňky tak, aby následnou preparací mohly být zviditelněny buněčné struktury. Fixované preparáty jsou užitečné i tehdy, děláme-li průzkum druhového složení společenstva. Má to tu výhodu, že fixovaný vzorek nemusíme zpracovávat ihned. Univerzálním fixativem je 2-4% formaldehyd. Máme-li v úmyslu mikroskopování odkládat, je dobré přidat ke sběrovému materiálu ještě několik kapek glycerolu. Fixáží existuje nepřeberné množství a pro různé barvící cytologické metody jsou předepsány i různé fixáže. Pro naše účely postačí Lugolův roztok. Ten obsahuje: Jodid draselný ........................................................... 1,5 g Vody do................................................................... 100 ml Jod............................................................................. 0,3 g Pro řasy je vhodné ředit tento roztok 1:1. Lugolův roztok barví zároveň škrob do modra, bílkoviny jsou barveny žlutě až hnědě. Pokud se hodláme věnovat řasové cytologii systematicky, je nutno studovat literaturu, která se tomuto oboru věnuje.

3.5 3.5.1

Studium na živých organismech Stanovení životního cyklu

Studium životního cyklu má dva aspekty. První užívá rostoucí kulturu, z níž odebíráme v pravidelných intervalech po dobu několika dnů vzorky, které fixujeme a barvíme, popřípadě ihned mikroskopujeme. Zaznamenáváme morfologické, či cytologické změny, které promítneme na časovou osu. Z té můžeme vyčíst přibližnou generační dobu, pokud užíváme vhodný parametr, například délku, objem, anebo počet jader. Druhý aspekt užívá obrazového záznamu, který je snímán v pravidelných časových intervalech. Složením fotozáznamů vzniká sběrný snímek, na němž je možno zachytit nejenom dělení buněk, ale i morfologické změny a dělení či pohyb organel, tedy parametry spíše fyziologické. Záznam je pořízen na živých buňkách. K tomu ovšem potřebujeme vhodnou kultivační komůrku.


34

3.5.2

Určení generační doby a růstové křivky

Generační doba je doba od dělení buňky po další dělení stejné buňky. Určíme ji nejpřesněji pomocí mikrokinematografického záznamu. Je ovšem možné určit průměrnou generační dobu jako průměrnou dobu zdvojení počtu buněk v rostoucí kultuře. K tomu je zapotřebí počítací komůrka, která může mít mnoho různých konstrukcí. V pravidelných intervalech odebíráme vzorky z rostoucí populace a pomocí počítací komůrky určíme počet buněk na jednotku objemu. Seřadíme-li data do časové řady, získáme růstovou křivku. Stanovení růstové křivky je jedním ze základů biologické práce. Má význam především pro studium růstu populace ovlivněné některou z nepříznivých látek. Růstovou křivku lze konstruovat také z odvozených parametrů, například stanovením optické hustoty. 3.5.3

Studium pohybu

Pohyb je významným fyziologickým parametrem. Je nutno rozlišit pohyby lokomoční, kdy se jedná o přemisťování celého organismu, například buňky, a pohyby, které pozorujeme uvnitř buňky, například pohyby cytoplasmy, pohyby chloroplastů, pohyby bičíků atd. Oba druhy pohybů jsou kvantifikovatelné a ukazují fyziologický stav organismů. Je možno určit rychlost, směr a také tvar výsledné dráhy, stanovit náhodnost, popřípadě účelovost. Pohyby na buněčné úrovni jsou nejpřesněji studovány pomocí sběrné mikrokinematografie, tedy pomocí obrazového záznamu snímaného v pravidelných časových intervalech.

3.6

Živná media

K získání prvních biologických materiálů potřebných ke studiu mikroorganismů můžeme využít tekoucích nebo stojatých vod z lokálních zdrojů. Získaný vzorek prohlédneme pod mikroskopem a můžeme jej separovat (izolovat) k získání primární kultury. Zde se rozhodneme, zda budeme pro účely dalšího studia dále kultivovat, nebo přistoupíme k izolaci zajímavých mikroorganismů. Primární kultura je obvykle přemístěna do vody přinesené ze stanoviště. Nezapomínáme na krytí ústí kultivační nádoby vatovou zátkou, či folií (například hliníkovou). Rozhodneme-li se o další kultivaci, je nutno připravit živné médium, buď pevné, nebo tekuté. V tomto přehledu se soustředíme na několik málo osvědčených postupů, protože smyslem příručky je rychlý úvod do experimentální práce. V literatuře lze pochopitelně nalézt tisíce návodů na specializované živné roztoky. 3.6.1

Jednoduchá živná media s půdním odvarem

Příprava půdního odvaru. Mezi nejjednodušší živná média patří půdní odvar, který připravíme tak, že zahradní zeminu necháme nasáknout vodou. Poté přidáme stejný objem vody. Tuto směs zahříváme a udržujeme asi dvě hodiny tak, aby neprocházela varem. Poté zbylou vodu přelijeme do vyšší kádinky (sklenice) a necháme asi jeden den odstát. Supernatant přefiltrujeme přes vatu, či hrubý filtr, TROJLÍSTEK – podpora výuky přírodopisu, biologie, fyziky a chemie žáků ve věku 11 až 15 let, reg. č. CZ.1.07/1.1.00/26.0044

35

rozlijeme do menších objemů (asi po 50 ml) a sterilizujeme v Papinově hrnci, popřípadě pasterizujeme. Takto připravený sterilní půdní odvar slouží jako přídavek do jednoduchých živných médií, kde do média doplňuje stopové prvky, případně látky, jejichž účinky mikroorganismům prospívají.

Médium L-C: Připravíme roztoky anorganických solí jako 1% roztoky ve vodě. K použití přidáváme dále uvedená množství a doplníme do 1000 ml. KNO3 .................................................................20 ml KH2PO4 ............................................................... 4 ml MgSO4 ................................................................ 3 ml Ca(NO3)2 ............................................................. 3 ml FeCl3 ............................................................... 0,15 ml Půdní odvar .......................................................10 ml Vody do ......................................................... 1000 ml

Máme-li větší spotřebu media, nebo když nemáme přesnější váhy, připravíme si zásobní roztoky tak, abychom k použití přidávali vždy stejný objem. Pochopitelně vše je rozpouštěno ve vodě buď běžně pitné, anebo destilované, ta ovšem nesmí být destilována v mědi nebo jiném přístroji, produkujícím toxicitu.

Zásobní roztok

Roztok k použití

KNO3 ..................................... 200 g/1000 ml .........................................1 ml/litr KH2PO4 ................................... 40 g/1000 ml .........................................1 ml/litr MgSO4 .................................... 30 g/1000 ml .........................................1 ml/litr Ca(NO3)2 ................................. 30 g/1000 ml .........................................1 ml/litr FeCl3 ........................................ 1,5 g/1000 ml + 5 ml HCl ........................1 ml/litr Půdní odvar ......................................................................................... 10 ml/litr


36

3.6.2

Jednoduchá plně definovaná kultivační media

Vyznačují se tím, že neužívají půdního odvaru, tedy nedefinované složky media. Uvádíme pouze jedno, které je možno chápat jako standard pro počáteční kultivace, zejména pro školní účely. Pro receptury jiných médií odkazujeme na literaturu.

Boldovo bazální médium: Je připraveno ze šesti zásobních roztoků makroelementů a čtyř zásobních roztoků mikroelementů (stopových prvků)

Kultivační médium je poměrně jednoduché a vystačíme s ním pro většinu experimentálních kultivací. Pokud budeme srovnávat s jinými medii, je možno užívat Boltovo basální médium jako standard. Makroelementy:

1. NaNO3 ................................................................................. 10 g Vody do .............................................................................. 400 ml 2. CaCl2 . 2H2O ...........................................................................1 g Vody do ............................................................................. 400 ml 3. MgSO4 . 7H2O .........................................................................3 g Vody do ............................................................................. 400 ml 4. K2HPO4 .................................................................................. 3 g Vody do ............................................................................. 400 ml 5. KH2PO4 .................................................................................. 7 g Vody do ............................................................................. 400 ml 6. NaCl .......................................................................................1 g Vody do ............................................................................. 400 ml


37

Mikroelementy: 1. 50 g EDTA a 31 g KOH rozpustit v 1000 ml vody 2. 4,78 g FeSO4 . 7 H2O rozpustit v 1000 ml acidifikované vody – tu připravíme přidáním 1ml H2SO4 do 999 ml vody 3. 11,42 g H3BO3 rozpustit v 1000 ml vody 4. ZnSO4 . 7H2O ................................................................. 8,82 g MnCl2 . 4H2O ................................................................ 1,44 g MoO3 .... ....................................................................... 0,71 g CuSO4 . 5H2O ................................................................ 1,57 g Co(NO3)2 . 6H2O............................................................ 0,49 g

K použití připravíme živný roztok tak, že do 900 ml destilované vody přidáme po 10 ml roztoků makroelementů a po 1 ml roztoků mikroelementů. Doplníme do 1000 ml. Živný roztok se sterilizuje autoklávováním nebo v tlakovém hrnci (Papinův hrnec). Možno sterilizovat filtrací přes filtr porozity 0,22 um.


38

4

Závěr

Doufáme, že vám příručka pomohla při přípravě a sběru biologického materiálu, ke snadnější orientaci při využívání mikroskopových technik a žákům rozšířila teoretické základy o praktické dovednosti. Možná, že v praktických úlohách probudila v žácích zájem o přírodu a přírodní obory. To bychom si přáli, rozvinout v nich chuť po dalším vzdělávání a výrazně pomoci při výběru jejich dalšího profesního směřování.


39

PŘÍRODOPIS, BIOLOGIE

Recommend Documents