2014.11.12.
BEVEZETŐ
Áttekintő 1. Multigénes markerek 1. Módszerek 2. Indikáció:
Tumorprogresszió és előrejelzése Dr. Győrffy Balázs
Ismeretlen eredetű tumor Emlőrák 3. Problémák 2. Bioinformatika Közös gének génlistákban Egy gén Transzkripció szabályozása Meta-analízisek
BEVEZETŐ
Előnyök Multigénes folyamat – több gén egyszerre!
Multigénes markerek
3 patológus által adott tumor grade: 50%-os egyezés „unbiased screening” = meglévő tudás nem befolyásolja
BEVEZETŐ
Módszerek #1/3 - technológia IHC
FISH
RT-PCR
Microarray
RNA-seq
Minta
FFPE
FFPE
FFPE/ fagyasztott
Fagyasztott
Fagyasztott
Morfológia alapú
Igen
Igen
Nem
Nem
Nem
Kicsi
Kicsi
Közepes
Nagy (exonszinten)
Exonszinten
S
S
Q
Q
Q
Egyszerű
Egyszerű
Komplex
Nagyon komplex
Ultra komplex
Kicsi
Kicsi
Közepes
Nagy
?
Gének száma Szemi (S)-/ (Q)kvantitatív Statisztika FDR ráta
BEVEZETŐ
Módszerek #2/3 - felhasználás IHC
FISH
RT-PCR
ER/PGR-státusz meghatározása
Igen*
Nem
Igen
Microarray Igen
HER-2 státusz
Igen*
Igen*
Igen
Igen
KEMO válasz
Nem
Nem
Igen*
Igen*
Kezelés toxicitás meghatározása
Nem
Nem
Nem
Nem
*klinikai alkalmazásban
FFPE: formalin fixed paraffin embedded FDR: false discovery rate
1
2014.11.12.
BEVEZETŐ
CUP
Módszerek #3/3 - alkalmazás IHC
FISH
RT-PCR
Microarray
Mikrodisszekció
Nem
Nem
Igen
Igen
Igen
Több útvonal vizsgálata
Nem
Nem
Közepes
Igen
Igen
Standardizálás
RNA-seq
Rossz*
Alacsony
Közepes**
Magas
?
Automata rendszerek
Közepes
Közepes
Magas
Magas
Kizárólag
Költség
Alacsony (100-400 $)
Alacsony
Magas
Magas
(300-600$)
(3500$+)
(3500$+)
TUMOR EREDET
Extrém (8,00030,000$+)
*Eredménytelen ”scoring” technikák **RNS izolálás, különböző kontrollgének
CUP
CUP
NCCN
Ismeretlen eredetű tumor Carcinoma of Unknown Primary = CUP
fizikai
CUP
kórtörténet
váratlan helyen több helyen egyszerre morfológiailag gyengén differenciált
labor
NCCN útmutató:
képalkotók
http://www.nccn.org/professionals/physician_gls/PDF/occult.pdf
CUP
Ismeretlen eredetű tumor
CUP
Bloom et al, Am J Pathol, 2004
Útmutatókkal CUP 20-25%-a azonosítható (Hillen, PMJ, 2000)
Első multi-tumor osztályozó vizsgálat
Összesített előfordulás: daganatok 5%-a Medián túlélés 3-6 hónap
2 platform
Ø megfelelő kezelés / OEP Ø fizet Egyéb technológiák?
32k cDNA microarray, 78 tumor, 8 tumortípus Affymetrix HU6800 és U95A array, 463 tumor, 21 tumortípus
ANN, 85% pontosság
2
2014.11.12.
CUP
Toothill et al, Cancer Res, 2005
CUP
Ma et al. Arch Pathol Lab Med, 2006 RT-PCR, 92 gén
Fejlesztés: Microarray, 10.500 próba 229 primer és áttét-minta 14 tumortípus 89%-os pontosság 79 gén, RT-PCR
Fejlesztés: microarray: 22.000 gén 466 fagyasztott (76% primer / 24% áttét) 39 tumotípus, KNN algoritmus 84% pontosság
(teszt: 13 beteg)
Teszt: 112 FFPE minta (70% primer / 30% áttét) 82% pontosság
Osztályonkénti top 10 gén HK
CUP
CUP
Pathwork
van Laar et al, Int J Cancer, 2009
#1/3
1550 probe set / 15 szöveti típus TOO (Tissue of Origin) vs. CUP
Fejlesztés 643 tumor (497 fagyasztott, 146 FFPE) 22k microarray alapján 495 gén (KNN) CUPPrint
1.
Teszt:
Fejlesztés: 2.039 minta
2. Diszkrimináció validálás: 547 minta (Monzon, JCO, 2009)
229 tumor (Toothill minták) 94% pontosság
3. Reprodukálhatóság validálás: 60 mintán 4 laborban (Dumur, JMD, 2008)
CUP
Pathwork
#2/3
CUP
Pathwork
#3/3
• 15 „similarity score” • Skála: 0-100
könnyen diagnosztizálható IHC rendelkezésre áll
3
2014.11.12.
CUP
miRNS
miRNS #2/3
#1/3
DÖNTÉSI FA
Rosenfeld, Nature, 2008
1 2 3 4 5 6 7 8
elágazás Liver Testis Nodeno.12 Nodeno.5 Lymphnode Brain Meninges Thymus(B2) Nodeno.11
9 10 Lung-pleura 11 Sarcoma 12 Nodeno.13 13 Nodeno.14 14 Colon 15 Stomach Nodeno.17 16 17 Breast Nodeno.19 18 19 Thyroid 20 Nodeno.21 21 Lung Endo22 metrium 23 Thymus(B3) hsa-miR-192,hsa-miR-345 hsa-miR-182,hsa-miR-34a,hsa-miR-148b Lung 24 (squamous)
miRNS microarray (600 miRNS) 400 FFPE/fagyasztott, 22 tumortípus 48 miRNS összesített pontosság: 89%
CUP
miRNS 1. elágazás
CUP
miRNS hsa-miR-122a,hsa-miR-200cb hsa-miR-372 hsa-miR-200c,hsa-miR-181a,hsa-miR-205 hsa-miR-146a,hsa-miR-200a,hsa-miR-92a hsa-miR-142-3p,hsa-miR-509 hsa-miR-92b,hsa-miR-9*,hsa-miR-124a hsa-miR-152,hsa-miR-130a hsa-miR-205 hsa-miR-192,hsa-miR-21,hsa-miR210,hsa-miR-34b hsa-miR-194,hsa-miR-382,hsa-miR-210 hsa-miR-187,hsa-miR-29b hsa-miR-145,hsa-miR-194,hsa-miR-205 hsa-miR-21,hsa-let-7e hsa-let-7i,hsa-miR-29a hsa-miR-214,hsa-miR-19b,hsa-let-7i hsa-miR-196a,hsa-miR-363,hsa-miR31,hsa-miR-193a,hsa-miR-210 hsa-miR-27b,hsa-let-7i,hsa-miR-181b hsa-miR-205,hsa-miR-141,hsa-miR193b,hsa-miR-373 hsa-miR-106b,hsa-let-7i,hsa-miR-138 hsa-miR-10b,hsa-miR-375,hsa-miR-99a hsa-miR-205,hsa-miR-152 hsa-miR-345,hsa-miR-29c,hsa-miR-182
CUP
Ismeretlen eredetű tumor összefoglalás
#3/3
CUP: tumorok 5%-a nincs kezelés -> rossz prognózis
12. elágazás
Microarray +/- RT-PCR Pathwork miRNS
EMLŐ
EMLŐ
Emlőrák – akadémiai vizsgálatok EMLŐRÁK ÉS MULTIGÉNES MARKEREK
1.
Alosztályok
2. Prognózis 3. Terápiás válasz előrejelzése
4
2014.11.12.
EMLŐ
EMLŐ
Tesztek #1/3
Emlőrák – termék fejlesztés MammaPrint Prosigna Oncotype DX BLN Assay Theros Breast Cancer Index SM MapQuant DX ARUP Breast Bioclassifier Celera metastatic score eXagen BCtm Invasive Gene Signature Wound Response Indicator Mammostrat
- RT-PCR Assay
Teszt Név Oncotype Dx Theros Breast Cancer Index Breast Bioclassifier Celera Metastatic Score
Cég Elérhető Genomic EU,USA Health Biotheranostics USA
Gének száma 21
Cél
Szövet Technika Ffp Q-RT-PCR
2(5)
Ffp
Q-RT-PCR
ARUP
USA
55
Ffp
RT-PCR
Applera
-
14
Ffp
RT-PCR
Prognózis, tamoxifen kezelést követő kiújuláspredikció PM prognózis,endokrin terápiát követő kiújuláspredikció Prognózis Prognózis, tamoxifen kezelést követő kiújuláspredikció
EMLŐ
Tesztek #2/3
- IHC/FISH Assay
Teszt Név eXagen Mammostrat ProEXTM Br
Cég Elérhető eXagen Diagnostics Applied Genomics TriPath
USA -
Gének száma 3
Tesztek #3/3
- Microarray
Cél
Szövet Technika Ffp FISH
5 5
EMLŐ
IHC IHC
Assay
Teszt Prognózis
Név MammaPrint MapQuant Dx Breast Lymph Node (BLN) Assay Invasive Gene Signature Wound Response Indicator Nouvera Biosciences
PM prognózis Prognózis
ProEXTM Br
5 antitestje: E2F TF p21 Ras asszociált fehérje Src kináz SLPI (secretory leukocyte peptidase inhibitor) Proteasome core subunit beta1
Cél
Cég Agendia Ipsoggen GeneSearch Veridex
Elérhető EU,USA EU UK
Gének száma 70 97 76
-
-
186
F/F
Microarray
Prognózis
-
-
512
F/F
Microarray
Prognózis
Veridex
-
30
-
-
Prognózis, tamoxifen és taxán kezelést követő kiújuláspredikció
Szövet Technika F/F Microarray F/F Microarray F/F Microarray
EMLŐ
Oncotype DX
#1/8
Prognózis 61 éven felül Prognózis Intraoperatív metasztázis kimutatás
EMLŐ
Oncotype DX
#2/8
21 gén RT-PCR ER+ LNKlinikai haszon ER+ betegek adjuváns kemoterápiás kezelésében Távoli áttét (Paik, NEJM, 2004) Túlélés (Habel, BCR, 2006) Kemoterápia hatásossága (Paik, JCO, 2006) ASCO / NCCN útmutatók
Magas penetráció
kemoterápia mindenkinek 100-ból 4-nél használ Kinél fog hatni a kemo? Ki valóban alacsony rizikójú?
5
2014.11.12.
EMLŐ
Oncotype DX
#3/8
Oncotype DX
250 gén 447 betegből -> 21 gén + recurrence score (RS) Proliferáció KI-67 STK15 Survivin Cyclin B1 MYBL2
HER2 GRB7 HER2
CD68
Ösztrogén ER PGR Bcl2 SCUBE2
Invázió Stromelysin 3 Cathepsin L2
#4/8
Klinikai validálás #1 NSABP B-14 vizsgálat (Paik, NEJM, 2004)
GSTM1
BAG1
EMLŐ
Csoport
Normalizálás B-aktin GAPDH RPLPO GUS TFRC
Betegek %-a
10 éves recurrence
Alacsony (RS<18) Nem meghatározható (RS 18-30)
51% 22%
6.8% 14.3%
Magas (RS>30)
27%
30.5% p=0,00001
EMLŐ
Oncotype DX
#5/8
EMLŐ
Oncotype DX
Klinikai validálás #2 Kemoterápia hatékonyság (Paik, JCO, 2006)
Klinikai döntéshozatal (Oratz, J Oncol Parctice, 2007) Oncotype előtti ajánlás (n=68)
RS: alacsony RS: magas
#6/8
KEMO hatása
Csak hormonterápia Hormonterápia + kemoterápia
RS: közepes
Oncotype után megvalósult kezelés (n=68) 68% 32%
51% 49%
betegek 25%-ában változott a kezelés
EMLŐ
Oncotype DX
#7/8
Oncotype DX #8/8
Klinikai döntéshozatal:
HER2 meghatározás (Dabbs és mtsai, JCO 2011. november) RT-PCR vs. IHC+FISH
Vizsgálat
Hely
N
Kezelésben változás
Referencia
Retrospektív
USA
32
25%
Oratz et al, 2007
ODX (?)
ODX (-)
ODX (+)
Retrospektív
USA
85
44%
Asad et al, 2008
IHC/FISH (?)
0
23
0
23
Retrospektív
USA
80
18%
Kamal et al, 2007
IHC/FISH (-)
5
779
0
784
Prospektív
USA
89
32%
Lo et al, 2009
IHC/FISH (+)
12
14
10
36
Összes
17
816
10
843
Költségek: 2.256 USD megtakarítás az elmaradó KEMO miatt (DE: USA árak mellett!)
Összes
ODX nem alkalmas HER2 státusz meghatározására
Microsoft Office Word dokumentum
6
2014.11.12.
EMLŐ
MammaPrint #1/6 Training: van’t Veer, Nature, 2002 117 beteg Agilent Hu25k DNS microarray
EMLŐ
MammaPrint #2/6 Áttét <5 év
Áttét >5 év
Jó / Rossz prognózis: idő távoli áttétig
Teszt: van de Vijver, NEJM, 2002 295 beteg 70 gén 10 éves túlélés
70 gén: sejtciklus, invázió, áttétképzés, érképzés
EMLŐ
MammaPrint #3/6
EMLŐ
MammaPrint #4/6
Nyirokcsomó pozitív és negatív betegeknél is:
Előrejelzés jobb a klinikai és hisztológiai paramétereknél:
EMLŐ
MammaPrint #5/6 Validálás: Buyse, JNCI, 2006 307 beteg, medián utánkövetés 13,6 év klinikai praméterektől független rizikó-előrejelzés: hatás: 20-30%-al kevesebb KEMO
EMLŐ
MammaPrint #6/6 OS
Klinikai döntéshozatal: - Bueno de Mesquita et al, Lancet, 2008 - Prospektív vizsgálat, n=427, Hollandia - Klinikai kezelésben változás: 26% (kemo elhagyása)
7
2014.11.12.
EMLŐ
Emlő – indikációk
Klinikai vizsgálatok Teszt Belépés LN+ betegek Kérdés Bevont betegek Randomizált betegek
TAILORx
MINDACT
Oncotype DX
Mammaprint
LNER+
LNER+/-
Nem
Igen
Ki fog reagálni kemoterápiára?
Kinek van jó prognózisa kemoterápia nélkül?
10.500
6700
4.390
1.920
Lezárva
Lezárva
Clinical trials
NCT00310180
NCT00433589
Eredmény (várható)
2017 december
2015 március
Állapot
EMLŐ
ER pozitív Nyirokcsomó • Oncotype Dx negatív • The Theros Breast Cancer Index • MapQuant Dx • Breast Bioclassifier • Celera metastatic score • Mammostrat Nyirokcsomó • Nouvera Biosciences nem releváns
SEER: • ER+ • nyirokcsomó-
ER nem releváns • Mammaprint • Breast Lymph Node BLN Assay • eXagen
• Invasive Gene Signature • Wound response indicator
76,3% 63,5%
EMLŐ
ÁTTEKINTÉS
Emlő összefoglalás Oncotype DX Cég Alapanyag Gének száma
Agendia
FFPE
F/F (FFPE)
21 (RT-PCR)
70 (microarray)
Legfontosabb útvonalak Indikáció
Mammaprint
Genomic Health
Proliferáció, ER, HER-2 LNER+
LNER+/-
Előrejelzés
Prognózis Predikció (CMF)
Prognózis
Kor
Idősebb betegek
Fiatalabb betegek
Folyamatos
Low/High risk
Eredmény Költséghatékonyság FDA ASCO
Igen
igen
Nem hagyta jóvá
Jóváhagyta
Jóváhagyta
Vizsgálat alatt
PROBLÉMÁK
ÁTTEKINTÉS
Vizsgálati variabilitás forrásai
ÁTTEKINTÉS
Gyenge pontok Alacsony statisztikai erő (20 beteg+)
Mintagyűjtés, mintatárolás
3000 beteg kellene stabil mintázat felismeréséhez (Ein-Dor, PNAS, 2006)
Alacsony mintaszám a fontos gének felismerésének gátja
Izolálás, jelölés, RNS amplifikálás Platformok különbözősége Statisztikai módszerek
(Ioannidis, Lancet, 2005)
Hiányzó / csak „házon belüli” validáció Más klinikai paraméterek hatásának mellőzése Poszttranszkripciós hatások: mRNS nem feltétlenül utal működő fehérje jelenlétére
8
2014.11.12.
Előrejelzés nehézségei „The motorcar will never replace horse” – Motor magazin, 1903
Bioinformatika
For computers „there is a world market for maybe five” – IBM vezérigazgató, 1943 „The internet is just a passing fad” - Bill Gates, 1993
GÉNLISTÁK
GÉNLISTÁK
Melanoma Referencia
Év
Talantov et al.
Schaefer et al.
Génlisták: közös gének?
Hoek et al. Segal et al. Schaefer et al.
Gyorffy B, Lage H. A Web-Based Data Warehouse on Gene Expression in Human Malignant Melanoma. J Invest Dermatol. 2007 Feb;127(2):394-9. Gyorffy B, Dietel M, Fekete T, Lage H. A snap shot of microarray-generated gene expression signatures associated with ovarian carcinoma, Int J Gynecol Cancer. 2008 NovDec;18(6):1215-33.
GÉNLISTÁK
Melanoma
#2/2
Leggyakoribb gének HGU133A ID
UniGene ID
Symbol
4
206039_at
Hs.56294
RAB33A
3
202454_s_at
Hs.306251
ERBB3
3
206170_at
Hs.2551
ADRB2
3
206028_s_at
Hs.306178
MERTK
3
208078_s_at
Hs.380991
SNF1LK
3
203723_at
Hs.78877
ITPKB
Gene Title
Gene Ontology
RAB33A, member RAS oncogene family v-erb-b2 erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 3 (avian) adrenergic, beta-2-, receptor, surface
small GTPase mediated signal transduction transmembrane receptor protein tyrosine kinase signaling pathway G-protein coupled receptor protein signaling pathway cell growth and/or maintenance protein amino acid phosphorylation signal transduction
c-mer proto-oncogene tyrosine kinase SNF1-like kinase inositol 1,4,5trisphosphate 3-kinase B
Nambiar et al. de Wit et al. Xu et al. Weeraratna et al.
#1/2
Technológia
Gének #
Affymetrix 2005 HGU133A Affymetrix human cancer 2002 G110 Affymetrix 2004 HGU133A Affymetrix 2003 HGU95A Affymetrix 2004 HGU95Av2 Atlas human apoptosis and 2005 cancer array 2005 custom oligos Agilent Human 2004 1 cDNA 2004 SAGE
Ovárium
Minták száma
Viszonyítva
45 primary melanoma
18 benign skin nevi and 7 normal skin 11 non-melanoma cell lines
33 GG-62 cell line 30 9 melanoma cell lines cell lines and 9 tissue samples 6 cell lines
Normal human melanocytes 47 STS patient and 1 CCS/MSP cell line 21 other cell lines
10 melanoma metastases
Normal human melanocytes
IF6 and Mel57 cell lines patient T-cells
Nevus nevocellularis 15 healthy control Tcells 7 different tissues
590 30 92
33 25 9 61
3 melanoma tissues
#1/2
GÉNLISTÁK
Publication
Year
Platform
#a
Validation (# of genes)
Ovarian carcinogenesis Ono et al. (10) Mok et al. (54)
2000 2001
custom, 9121 genes Micromax
103 30
Welsh et al. (55) Tonin et al. (56) Bayani et al. (57) Zhang et al. (58) Donninger et al. (59) Lancaster et al. (60) Santin et al. (61) Zhang et al. (62) Le Page et al. (63) Bignotti et al. (64)
2001 2001 2002 2003 2004 2004 2004 2005 2006 2006
Affymetrix HuGeneFl Affymetrix Hs6000 custom, 1718 genes custom, 512 cancer related genes Affymetrix HGU133A plus 2.0 Affymetrix HuGeneFL Affymetrix HGU95Av2 custom, 512 genes Affymetrix HuGeneFL 6800 Affymetrix HGU133A
18 17 26 30 1150 45 114 39 126 140
Heinzelmann-Schwarz et al.
2006
Affymetrix custom: EosHu03
72
RT-PCR (9) 9 ovarian tumors compared to normal counterparts RT-PCR and IHC (1) 3 ovarian tumor cell lines vs 3 normal ovarian surface epithelial cells (validation on 64 patients and 137 control subjects) RT-PCR (3) 24 malignant and 4 normal tissues Northern blot (5) 4 spontanously immortalized ovarian cancer cell lines vs 1 normal ovarian surface epithelium RT-PCR (3) 17 tumors from 13 patients ovarian carcinomas vs normal ovarian tissues RT-PCR (14) 37 advanced stage papillary serous primary carcinomas RT-PCR (2) 31 serous ovarian cancer samples compared to 3 normal ovarian epithelial samples RT-PCR (2) genes differentiating uterine and ovarian serous papillary carcinomas IHC (1) ovarian carcinomas vs normal ovarian tissues RT-PCR (13) 65 primary cultures of normal ovarian surface epithelial and epithelial ovarian cancer RT-PCR (6) 19 flash-frozen ovarian serous papillary carcinoma vs 15 human ovarian surface epithelium short-term cultures RT-PCR (11) 49 primary ovarian cancers and additional normal ovaries
2006
Affymetrix HGFA chips
54
-
61 ovarian specimens of normal and various cancerous type
2000 2003 2004 2006
custom, 9121 genes custom, 6386 genes custom cDNA array Affymetrix custom: EosHu03
115 66 9 273
RT-PCR (9) RT-PCR (6) RT-PCR (11)
5 serous adenocarcinomas vs 4 mucinous adenocarcinomas 24 endometrioid carcinomas compared to 11 nonendometrioid carcinomas serous, borderline and endometrioid ovarian carcinomas 49 different primary ovarian cancers
Therapy response Sugimura et al. (69) Lamendola et al. (70) Selvanayagam et al. (71) Macleod et al. (72)
2002 2003 2004 2005
45 18 16 108
RT-PCR (4) RT-PCR (14)
the ovarian cancer cell line KF, and its paclitaxel resistant clone treated with paclitaxel paclitaxel resistant sublines compared to parental SKOV-3 line 8 primary ovarian cancer specimens stratified into 2 groups based on their response to cisplatin cisplatin resistant PE01CDDP compared to parent PE01 cell line
Samimi et al. (73) Bild et al. (74)
2005 2006
272 165
-
Cheng et al. (75) Prognosis and progressio Xu et al. (76) Adib et al. (77) De Cecco et al. (78) Lancaster et al. (60) Ouellet et al. (79) Motamed-Khorasani et al. (80) Mougeot et al. (66)
2006
Toyobo arrays Affymetrix HGU95Av2 custom, 10692 genes Clontech Atlas human cancer chip 1.2 Stanford microarrays Affymetrix HGU133A plus 2.0 and HGU95Av2 Stanford microarrays
25
RT-PCR (5)
oxaliplatin sensitive and stably resistant sublines were compared in 5 cell lines recombinant adenovirus-transformed human primary mammary epithelial cell cultures and ovarian cancer samples, beta-catenin and src pathways 6 pairs of cisplatin resistant and sensitive ovarian carcinoma cells lines
2002 2004 2004 2004 2005 2006 2006
BioDoor 4096 array Affymetrix HGU95Av2 custom, 4451 cancer-related genes Affymetrix HuGeneFL Affymetrix HuGeneFL custom, 19200 genes Affymetrix HGFA chips
22 42 30 40 45 17 61
RT-PCR (4) RT-PCR (10) RT-PCR (2) RT-PCR (8) RT-PCR -
Samples investigated
(65)
Mougeot et al. (66) Histology subtypes Ono et al. (10) Moreno-Bueno et al. (67) Zheng et al. (68) Heinzelmann-Schwarz et al. (65)
high and low metastatic tumor tissues and normal ovarian tissues stage III ovarian serous adenocarcinomas vs normal ovarian tissue of the same individuals genes differentiating stages III-IV epithelial ovarian cancer samples 31 serous ovarian cancer samples who either survived less than 2 years or more than 7 years 37 tumors with low malignant potential and invasive tumors genes regulated in response to androgen exposure, effect on progression in 149 patients genes differentiating between early cancer onset and low malignant potential in 27 ovarian cancer samples
9
2014.11.12.
Ovárium
#2/2
GÉNLISTÁK
Miért kevés az átfedés?
Ovárium tumorigenezis GeneBank
Repeat
UniGene
Name
Genes identified in more than two studies AB032951 3 Hs.446240 Protein kinase C binding protein 1 3 Hs.445818 Spondin 1, extracellular matrix protein NM_002354 3 Hs.542050 Tumor-associated calcium signal transducer 1 X58288 3 Hs.49774 Protein tyrosine phosphatase, receptor type, M AI885290
Symbol
Gene Ontology
PRKCBP1
DNA binding,cell cycle,regulation of transcription, DNA-dependent cell adhesion,development,extracellular matrix (sensu Metazoa),protein binding integral to membrane,plasma membrane
SPON1 TACSTD1 PTPRM
GÉNLISTÁK
Alacsony mintaszám – variabilitás
hydrolase activity, protein amino acid dephosphorylation,receptor activity,
Nem standardizált a mintagyűjtés
Terápiás válasz
Több microarray platform
GenBank
Repeat
UniGene
Name
Symbol
Gene Ontology
BF210063
4
Hs.458414
Interferon induced transmembrane protein 1 (927)
IFITM1
cell surface receptor linked signal transduction,immune response,integral to membrane,negative regulation of cell proliferation,plasma membrane,receptor signaling protein activity,regulation of cell cycle,response to biotic stimulus
BF680512 NM_002087
3 3
Hs.522584 Hs.514220
Thymosin, beta 4, X-linked Granulin
TMSB4X GRN
NM_003257
3
Hs.510833
Tight junction protein 1 (zona occludens 1)
TJP1
Sok bioinformatikai módszer
cell proliferation,cell-cell signaling,cytokine activity,extracellular region,growth factor activity,positive regulation of cell proliferation,signal transduction intercellular junction assembly,membrane,membrane fraction,protein binding,septate junction,tight junction
KMPLOT
Klinikai használhatóság? EGY GÉN VS.
KMPLOT
Egy gén szerepe
GEO
Áttekintő lekérdezés www.kmplot.com
Minták osztályozása <-> gének osztályozása Prognosztikus gének (ABCB1, TOP2A, ER, HER2, KI-67…) További gének: túlélésre gyakorolt hatás független validálása?
Nyers adat n=16k
KMPLOT
Klinikai adat
Minőség-ellenőrzés és MAS5 normalizálás Platformok kombinálása és második normalizálás
SEER adatok Génexpresszió filterezése és R input
mySQL adatbázis
Valós idejű plottolás R-ben Grafikus visszajelzés (KM-görbe) és szignifikancia
10
2014.11.12.
KMPLOT
KMPLOT
ASCO proliferációs gének és túlélés
www.kmplot.com
MARKER GENE NAME
AFFYMETRIX ID
MKI67
antigen identified by monoclonal antibody Ki-67
CCND1
cyclin D1
CCND2
cyclin D2
CCND3 CCNE1 CCNE2
cyclin D3 cyclin E1 cyclin E2
CDKN1B
cyclin-dependent kinase inhibitor 1B (p27, Kip1)
212020_s_at 212021_s_at 212022_s_at 212023_s_at 208711_s_at 208712_at 200951_s_at 200952_s_at 200953_s_at 201700_at 213523_at 205034_at 211814_s_at 209112_at
0.95 (0.82-1.1) 1 1.13 (0.97-1.31) 1 1.8 (1.5-2.1) 1.14E-12 1.3 (1.1-1.5) 0.0352 1.3 (1.1-1.5) 0.0374 1.07 (0.93-1.25) 1* 1.2 (1.0-1.4) 0.946 0.62 (0.53-0.72) 1.23E-08 0.68 (0.58-0.79) 9.02E-06 0.7 (0.6-0.82) 0.000114 1.2 (1.1-1.4) 0.1518 2.5 (2.1-2.9) <1e-16 1.2 (1.0-1.3) 1 1.3 (1.1-1.5) 0.0132
CDKN1A
cyclin-dependent kinase inhibitor 1A (p21, Cip1) thymidine kinase 1, soluble
202284_s_at
0.68 (0.59-0.79)
1.21E-05
TK1
202338_at
1.2 (1.0-1.4)
0.506
TK2
thymidine kinase 2, mitochondrial
204227_s_at
0.53 (0.45-0.62) 7.26E-15*
204276_at 204277_s_at 201291_s_at 201292_at
0.67 (0.58-0.78) 4.18E-06 0.81 (0.70-0.94) 0.1496 2.3 (2.0-2.7) <1e-16 1.8 (1.6-2.1) 2.05E-13*
TOP2A
topoisomerase (DNA) II alpha 170kDa
TOP2B
topoisomerase (DNA) II beta 180kDa
211987_at
HR
1.7 (1.5-2.0)
KMPLOT
Kaplan-Meier görbék TOP2A
4.4E-11
KMPLOT
KM-plot összefoglalás
Proliferáció / kemorezisztencia markerek:
TK2
RFS P
Cyclin D1
A rendszer lehetővé teszi 22 ezer gén túlélésre gyakorolt hatásának online vizsgálatát emlő/petefészek/nsclc betegekben. Jelölt gének listája: Gyors előrejelzés Minimális bioinformatikai tudás
TRANSZKRIPCIÓ
TRANSZKRIPCIÓ
Gének és szabályozás Mintagyűjtés, normál / kontroll RNS izolálás
Transzkripció szabályozás
DNS-re átírás DNS chipre hibridizálás Bioinformatika (normalizálás, SAM, PAM, clustering) Komplex kiértékelés: • pathway analízis • TRANSZKRIPCIÓ REGULÁCIÓS HÁLÓZATOK
11
2014.11.12.
TRANSZKRIPCIÓ
TRANSZKRIPCIÓ
Transzkripció áttekintése #1
Clustering Hierarchikus
K-means
G É N
génaktivitás
DNS
5’
upstream
3’
promoter
TSS
downstream
RNS polimeráz
intron
exon
3’ intron
mRNS
Fehérje
idő TSS: transcription start site
Hasonlóan regulált gének egy csoportba!
TRANSZKRIPCIÓ
Transzkripció áttekintése #2 TF DNS
TF
Transzkripciós faktorok #1 Gerincesekben kb. 2000 db TFBS: cis-regulációs szakaszok
TSS
5’ TFBS TFBS TFBS TFBS 3’
TRANSZKRIPCIÓ
3’
RNS polimeráz
intron
exon
mRNS
(transcription factor binding site)
1 gén – több TFBS 1 TF – több gén Hossz: 4-10 bázis, „nonspecificity”, mátrix
intron
Fehérje
TF: transcription factor TFBS: transcription factor binding site
TRANSZKRIPCIÓ
TRANSZKRIPCIÓ
Transzkripciós faktor kötőhely
Transzkripciós faktorok #2 AC CO FA SY OS OC
T00207 Copyright (C), Biobase GmbH. E47 BCF-1; E2A; E2A-E47; E2A.E47; E47; IEBP1 (rat). human, Homo sapiens eukaryota; animalia; metazoa; chordata; vertebrata; tetrapoda; mammalia; eutheria; primates SZ 651 AA; 67.3 kDa (cDNA) SQ MNQPQRMAPVGTDKELSDLLDFSMMFPLPVTNGKGRPASLAGAQFGG … SF basic region contacts DNA, HLH domain is the dimerization[18]; SF binds DNA avidly as homodimer, or as heterodimer [8]; … FF part of MEF-1 complex; … IN T00003 AS-C T3; fruit fly, Drosophila melanogaster. IN T01629 Atoh2; mouse, Mus musculus. … BS R04157 AS$TAL1_01; Quality: 2. BS R02139 E2A$CONS; Quality: 1. …
AC XX ID XX DT DT CO XX DE XX SQ XX BF … SO … MM MM
R04157 AS$TAL1_01 18.04.1995 (created); ewi. 13.06.1995 (updated); dbo. Copyright (C), Biobase GmbH. artificial sequence. acctgaaCAGATGgtcggct. T00207 E47; Quality: 2; Species: human, Homo sapiens. 0123 Jurkat. direct gel shift supershift (antibody binding)
12
2014.11.12.
TRANSZKRIPCIÓ
TRANSZKRIPCIÓ
Transzkripció-regulációs hálózatok
Génlisták microarray adatokból
Génlista DNS chipek alapján Promoterek azonositása
EZ-Retrieve web-service: http://siriusb.umdnj.edu:180 80/EZRetrieve/about.jsp
Kötőhelyek azonosítása
MotifScanner http://homes.esat.kuleuven.be/ ~thijs/Work/MotifScanner.html
Felül-reprezentált kötőhelyek
TOUCAN http://homes.esat.kuleuven.be/ ~saerts/software/toucan.php
Multiple testing korrekció REGULÁCIÓS HÁLÓZAT FELÁLLITÁSA
TRANSZKRIPCIÓ
Példa eredmények
META
TFBS pozíciók
Szignifikáns TF-ek TF
n
p
Bonferroni
E47
9
0.001
Yes
EGR3
4
0.02
No
NFY
1
0.03
No
HEN1
4
0.03
No
ISRE
9
0.05
No
Meta-analízis
TF lista
Tímár J, Győrffy B, Rásó E. Gene signature of the metastatic potential of cutaneous melanoma: too much for too little? Clin Exp Metastasis. 2010 Aug;27(6):371-87.
META
Melanoma
#1/4 Nyers GEO datasetek: melanoma vs. melanoma metasztázis n=3 (zöld)
Melanoma #2/4 Year
Cohort
Platform
Bioinformatics
# probes / genes in published set
GEO
Reference
2004
1 primary tumor 3 in-transit met 28 cutaneous met 35 LND met 2 visceral met 13 primary skin melanoma (mixed histology) 10 met samples of undisclosed origin situ primary melanoma 2 VGP primary melanoma 2 metastatic VGP melanoma 2 LND met 4 skin met
Custom 17.5k cDNA microarray
Log2ratio, unsupervised clustering
42
NA
(Wang et al.)
Overall CV misclassification error using the reported genes 24.2%
Melanoma metastasis misclassification error 5.1%
Research Genetics GF200 arrays
Univariate + multivariate analysis
4
NA
(Becker et al.)
NA
NA
105
NA
(Smith, Hoek, and Becker)
17.2%
13.9%
2004
MAS5 normalizálás
Génlisták n=11 (sárga)
2005
Tükrözés egy Affymetrix platformra (HGU133A) 2005
Affymetrix próbákra vetítés
Ismételten azonosított gének meghatározása (=génlisták heterogenitása)
Génlistákra szűrés
PAM alkalmazása a génlisták validálására (=génlisták értéke)
Datasetek kombinálása (=minden elérhető adatot tartalmazó adatbázis létrehozása)
2005
VSN normalizálás és adatbázis méretét csökkentő szűrés (átlaggén < 1% * max minden gén)
2007
2008
Unsupervised hierarchical clustering a primer és áttétes minták összehasonlítására
META
Áttét-mintázatok
2007
25 primary skin melanomas of radial+vertical growth phase 11 cutaneous mets 7 LND mets 19 primary skin melanoma 22 cutaneous mets
16 primary tumor 16 cutaneous mets 22 LND mets 2 visceral mets 52 melanoma metastases 31 primary melanomas
Affymetrix ANOVA, HGU133 Plus 2.0 Benjamini and Hochberg, SOM
Clontech Atlas human cancer cDNA array 1.2K 20,862 cDNA Research Genetics array
SAM, cluster analysis
33
NA
(Nambiar et al.)
20.9%
0.7%
SAM and hierarchical clustering
2,602 (list not published)
NA
(Haqq et al.)
-
-
308
NA
(Jaeger et al.)
18.1%
0.7%
1667 probes
GSE7553
(Riker et al.)
5.4% (GSE7553 excluded)
3.0% (GSE7553 excluded)
NA
GSE8401
NA
-
-
Affymetrix HGU133A
Random permutation analysis and support vector machines Affymetrix t-test, Pearson HGU133 Plus 2.0 correlation and SAM Affymetrix HGU133A
NA
13
2014.11.12.
META
Melanoma
#3/4
Keresztvalidált valószínűségek: Nambiar: (nagy hatékonyság)
Smith: (alacsony hatékonyság)
META
Melanoma Year
Cohort
Platform
Bioinformatics
2000
4 visceral met 1 LND met 27 cell lines 11 cutaneous mets 30 LND mets 2 visceral mets 83 primary melanoma 29 validation set primary melanoma 45 melanomas in 3 cohorts with different metastatic potential 29 LND mets 10 LND mets (validation)
Custom 8,150 oligo array 17,500 element cDNA microarray Pangenomic 44k oligo microarray
Log ratio, hierarchical cluster SAM, SPC
2006
2006
2006
2008
Post-processing
#4/4
Prognosztikus mintázatok
Affymetrix HGU133A /Plus 2.0
30,888 MWG oligonucleo tide array
Cox multivariable model and stratified logrank test ANOVA and clustering
# probes / genes GEO in published set datasets
Reference
Overall CV misclassificatio n error using the reported genes 22.8%
Melanoma metastasis misclassificati on error
22
NA
(Bittner et al.)
80 probes (70 genes)
NA
(Mandruzzato et 29.3% al.)
18.9%
254 probes
NA
(Winnepenninck 19.5% x et al.)
4.3%
296 probes
GSE4845
(Hoek et al.)
27.6% (GSE4845 excluded)
11.9% (GSE4845 excluded)
NA
(John et al.)
26.1%
11.7%
ANOVA, hclust, 21 PCA
5.1%
Zárszó: klinikai vizsgálatok?!
1. Génlisták Átfedő gének listája Jelátviteli útvonalak (gene ontology) Biomarkerek (egy gén szerepe)
Transzkripció szabályozása 2. Meta-analízis Génlista validálása Nagyobb adatbázison valódi meta
14
