Pfiíruãka QIAamp DSP Virus Kit

1050717_CS

16.04.2008

8:57 Uhr

Seite 1

Listopad 2007

Pfiíruãka QIAamp® DSP Virus Kit

Σ

50

Verze 1 IVD Souprava QIAamp DSP Virus Kit je generický systém, který využívá technologii QIAamp pro izolaci a purifikaci virových nukleových kyselin ze vzorků lidské plazmy nebo lidského séra pro in vitro diagnostické účely.

Pouze pro in vitro diagnostické účely.

REF

60704

H B

1050717CS

11/2007

QIAGEN GmbH, D-40724 Hilden, Tel: +49-2103-29-0 R1

MAT

1050717CS

Sample & Assay Technologies

1050717_CS

16.04.2008

8:58 Uhr

Seite 2

Ochranné známky: QIAGEN®, QIAamp®, QIAvac, MinElute™ (QIAGEN Group); AMPLICOR HBV MONITOR®, AMPLICOR HCV MONITOR®, AMPLICOR HIV-1 MONITOR® (Roche Molecular Systems, Inc.); artus™, RealArt™ (artus GmbH); COBAS® (Roche Diagnostics Systems, Inc.); Eppendorf® (Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH). Registrované názvy, ochranné známky, atd. používané v tomto dokumentu, dokonce ani pokud nejsou jako takové označeny, nelze považovat za nechráněné právními předpisy. Technika PCR je chráněna U.S. Patenty 4,683,195 a 4,683,202 a ekvivelntními zahraničními patenty ve vlastnictví firmy Hoffmann-La Roche AG. © 2004 QIAGEN, všechna práva vyhrazena.

1050717_CS

16.04.2008

8:58 Uhr

Seite 3

Obsah SloÏení soupravy

4

Symboly

5

Uchovávání

6

¤ízení jakosti

6

Zam˘‰lené pouÏití

6

Omezení pro pouÏití produktu

7

Bezpeãnostní informace

7

Úvod

9

Princip a popis metody

9

Vybavení a reagencie, které má zajistit uÏivatel.

14

DÛleÏité poznámky

15

Důležité body před zahájením

15

Příprava RNA

15

Uchovávání vzorků

16

Příprava reagencií a pufrů

16

Eluce virových nukleových kyselin

19

Výtěžek a kvalita virových nukleových kyselin

19

Nastavení vakuového systému QIAvac 24 Plus

19

Protokol Izolace a purifikace virov˘ch nukleov˘ch kyselin z plazmy a séra Distributofii firmy QIAGEN

Příručka QIAamp DSP Virus Kit

22 27

11/2007

3

1050717_CS

16.04.2008

8:58 Uhr

Seite 4

SloÏení soupravy Pfiíruãka QIAamp® DSP Virus Kit Katalogové ãíslo

60704

Poãet stanovení

50 MinElute™

COL QIAamp MinElute Kolonky QIAamp s promývacími zkumavkami (WT) (2 ml)

50

EXT

Nástavce kolonky (3 ml)

COL

EXT

50

ET

Eluční zkumavky (1,5 ml)

ELU

TUBE

50

VC

VAC Vakuové konektory (VacConnectors)

CON

50

LT

Lyzační zkumavky (2 ml)

WT

Promývací zkumavky (2 ml)

AL

Lyzační pufr*

AW1

LYS

TUBE

50

WASH

TUBE

50

LYS

BUF

33 ml

Promývací pufr 1* (koncentrát)

WASH

BUF

1 CON

BUF

2 CON

19 ml

AW2

Promývací pufr 2 (koncentrát)

WASH

AVE

Eluční pufr† (purpurový uzávěr)

ELU

BUF

PS

Roztok pro ředění proteáz†

QPROT

SOLV

4,4 ml

CAR

RNA

310 g

†

Nosičová RNA

Nosičová RNA (červený uzávěr)

QP

QIAGEN Proteáza ®

CD Příručka

†

QPROT H

B

H B

13 ml 4 x 2 ml

1 lahvička 1 1

* Obsahuje guanidin hydrochlorid. Není kompatibilní s dezinfekčními přípravky obsahujícími bělící prostředky. Bližší informace: viz strana 7. †

Obsahuje azid sodný jako konzervační látku.

†

Rozpouštěcí objem 4,4 ml.

4

Příručka QIAamp DSP Virus Kit 11/2007

1050717_CS

16.04.2008

8:58 Uhr

Seite 5

Symboly Σ

Souprava obsahuje reagencie pro přípravu 50 vzorků

50

Viz informace v příručce

i

Použít do (datum exspirace) IVD

Prostředky zdravotnické techniky pro in vitro diagnostiku

REF

Katalogové číslo

LOT

Číslo šarže

MAT

Číslo materiálu Komponenty

COMP

Objem

VOL

Teplotní meze Oprávněný výrobce Při doručení

i

Důležitá poznámka Po provedení daného kroku protokolu s tímto označením si vyměňte rukavice 8°C 2°C

?

Otevřít při převzetí; uchovávejte kolonky QIAamp MinElute při 2–8°C Zapište datum přidání ethanolu do lahve

EtOH

ADD

Přidání

CONT

Obsahuje

LYOPH

Lyofilizováno

RCNS

Rozpusťte v

EtOH

Ethanol

GuHCI

Guanidin hydrochlorid

SUBT

➡

Subtilisin Pokračujte směrem k


11/2007

5

1050717_CS

16.04.2008

8:58 Uhr

Seite 6

Uchovávání Kolonky QIAamp MinElute je nutné po převzetí uchovávat při teplotě 2–8 °C. Všechny pufry mohou být uchovávány při laboratorní teplotě (15–25 °C). Lyofilizovaná nosičová RNA může být uchováván při laboratorní teplotě (15–25 °C). Nosičová RNA se může rozpouštěná pouze v elučním pufru (AVE); rozpuštěná nosičová RNA se musí okamžitě přidat do lyzačního pufru (AL) podle popisu na straně 16. Tento roztok se připravuje čerstvý a při teplotě 2–8 °C je stabilní po dobu 48 hodin. Nespotřebovaná nosičová RNA rozpuštěná v elučním pufru (AVE) má být zamražena v alikvotech při –20 °C. Lyofilizovaná proteáza QIAGEN (QP) může být uchovávána při laboratorní teplotě (15–25 °C) až do data exspirace, aniž by došlo ke snížení její účinnosti. Rozpuštěná proteáza QIAGEN (QP) uchovávaná při teplotě 2–8 °C je stabilní po dobu jednoho roku. Rozpuštěný promývací pufr 1 (AW1) a rozpuštěný promývací pufr 2 (AW2) jsou stabilní po dobu 1 roku, pokud jsou uchovávany při laboratorní teplotě (15–25 °C).

¤ízení jakosti V souladu s certifikovaným systémem řízení jakosti firmy QIAGEN Total Quality Management System je každá šarže soupravy QIAamp DSP Virus Kit podrobena testům předem definovaných parametrů, které zajišťují odpovídající jakost produktů.

Zam˘‰lené pouÏití Souprava QIAamp DSP Virus Kit je generický systém, který využívá technologii QIAamp pro izolaci a purifikaci virových nukleových kyselin ze vzorků lidské plazmy nebo lidského séra pro in vitro diagnostické účely. Veškeré diagnostické výsledky získané pomocí postupu pro přípravu vzorků v souladu s jakoukoliv následnou diagnostickou NAT analýzou musí být interpretovány s přihlédnutím k ostatním klinickým a laboratorním nálezům. Produkt je určen k použití profesionálními pracovníky, např. techniky nebo lékaři školenými v technikách molekulární biologie. Je určen k použití v jakékoliv další následné aplikaci využívající enzymatickou amplifikaci nebo jinou enzymatickou modifikaci DNA nebo RNA, která je následována detekcí nebo amplifikací signálu. Izolované a purifikované virové nukleové kyseliny mohou být použity v kvalitativních (např. screening krevních parametrů) i v kvantitativních (např. monitorování zátěže způsobené viry) diagnostických NAT analýzách. Aby bylo možné minimalizovat odchylky diagnostických výsledků, je produkt určen k použití s interní kontrolou a s pozitivní a negativní kontrolou během procesu přípravy vzorku, amplifikace vzorku a detekce v závislosti na použitém následném testu. Produkt je určen k použití s vakuovým systémem QIAvac 24 Plus nebo s jinýmekvivalentním vakuovým systémem.

6


1050717_CS

16.04.2008

8:58 Uhr

Seite 7

Omezení pro pouÏití produktu Souprava není určena k použití se vzorky krve, tkáně, kostní dřeně nebo s buněčnými kulturami. Souprava není rovněž určena k izolaci nebo purifikaci bakteriálních, fungálních nebo parazitárních nukleových kyselin. Účinnost soupravy při izolaci a purifikaci virových nukleových kyselin z jiných nebuněčných tkáňových tekutin, například z moči nebo cerebrospinální tekutiny (CSF), není stanovena.

Bezpeãnostní informace Při práci s chemikáliemi vždy používejte vhodný laboratorní plášť, rukavice na jedno použití a ochranné brýle. Další informace jsou uvedeny v odpovídajících bezpečnostních listech. Bezpečnostní listy jsou k dispozici online v pohodlném a kompaktním formátu PDF na stránkách www.qiagen.com/ts/msds.asp, kde můžete nalézt, zobrazit a vytisknout příslušný bezpečnostní list pro každou soupravu QIAGEN a pro každou komponentu těchto souprav. POZOR: NEP¤IDÁVEJTE roztoky bûlících prostfiedkÛ nebo kyselin pfiímo do odpadu z pfiípravy vzorku. Lyzační pufr (AL) a promývací pufr 1 (AW1) obsahují guanidin hydrochlorid, který může v kombinaci s bělícími prostředky tvořit vysoce reaktivní látky. V případě rozlití tekutin obsahujících tyto pufry vyčistěte kontaminované místo vhodným laboratorním detergentem a vodou. Pokud rozlitá tekutina obsahuje potenciálně infekční látky, vyčistěte zasaženou oblast nejprve laboratorním detergentem a vodou a poté 1% (vol) roztokem chlornanu sodného. Jestliže jsou lahve s pufrem poškozeny nebo prosakují, použijte při likvidaci těchto lahví rukavice a ochranné brýle, abyste zabránil/a poškození vašeho vlastního zdraví nebo zdraví jiných osob. Firma QIAGEN netestuje tekutý odpad vzniklý použitím metody QIAamp DSP Virus na přítomnost reziduálních infekčních materiálů. Kontaminace odpadní tekutiny reziduálními infekčními materiály je vysoce nepravděpodobná, nelze ji však zcela vyloučit. Tekutý odpad musí být proto považován za infekční a je nutné s ním nakládat a likvidovat jej v souladu s místními bezpečnostními předpisy.


11/2007

7

1050717_CS

16.04.2008

8:58 Uhr

Seite 8

Pro komponenty soupravy QIAamp DSP Virus Kit platí tyto R-věty a S-věty: Lyzaãní pufr (AL) a prom˘vací pufr 1 (AW1)

Obsahuje guanidin hydrochlorid: zdraví škodlivý, dráždivý R-věty a S-věty:* R2236/38, S13-26-36-46 Proteáza QIAGEN (QP)

Obsahuje subtilisin: senzitizující, dráždivý R-věty a S-věty:* R37/38-41-42, S22-24-2636/37/39-46 24hodinová nouzová linka Nouzové lékařské informace je možné získat v anglickém, francouzském a německém jazyce 24 hodin denně na telefonním čísle: Poison Information Center Mainz, Německo Tel: +49-6131-19240

* R22: Zdraví škodlivý při požití; R36/38: Dráždí oči a kůži; R37/38: Dráždí dýchací orgány a kůži; R41: Nebezpečí vážného poškození očí; R42: Může vyvolat senzibilizaci při vdechování; S13: Uchovávejte odděleně od potravin, nápojů a krmiv; S22: Nevdechujte prach; S24: Zamezte styku s kůží; S26: Při zasažení očí okamžitě důkladně vypláchněte vodou a vyhledejte lékařskou pomoc; S36: Používejte vhodný ochranný oděv; S36/37/39: Používejte vhodný ochranný oděv, ochranné rukavice a ochranné brýle nebo obličejový štít; S46: Při požití okamžitě vyhledejte lékařskou pomoc a ukažte tento obal nebo označení.

8


1050717_CS

16.04.2008

8:58 Uhr

Seite 9

Úvod Souprava QIAamp DSP Virus Kit používá dobře zavedenou technologii pro simultánní izolaci a purifikaci virové DNA a RNA. Metoda QIAamp DSP Virus využívá selektivní vazebné vlastnosti membrán na bázi křemíku při použití minimálních elučních objemů 20 µl nebo 60 µl. Lineární rozsah metody QIAamp DSP Virus je stanoven pro HIV RNA a HBV DNA v několika dalších následných diagnostických testech (Tabulka 1, Obrázek 1 a 2). Tabulka 1. Následné diagnostické testy, v nichÏ byl testován lineární rozsah metody QIAamp DSP Virus. Test

Souprava

Real-time RT-PCR pro stanovení HIV RNA

TaqMan® test a COBAS® AMPLICOR HIV-1 MONITOR® Test

Real-time PCR pro stanovení HBV DNA

TaqMan® test COBAS AMPLICOR HBV MONITOR® Test

Lineární rozsah metody QIAamp DSP Virus pfii TaqMan testech

log result IU/ml

8 6 4

y = 1.0042x + 0.0832 R2 = 0.9974

2 0 1

2

3

5 4 6 log input IU/ml

7

8

log result IU/ml

B

A

6 5 4 3 2 1 0

y = 0.9725x + 0.0982 R2 = 0.9984 1

2

3 4 log input IU/ml

5

6

Obrázek 1 Lineární rozsah metody QIAamp DSP Virus při elučním objemu 60 µl je stanoven pomocí testů TaqMan pro A HIV RNA a B HBV DNA.


11/2007

9

1050717_CS

16.04.2008

8:58 Uhr

Seite 10

Lineární rozsah metody QIAamp DSP Virus pfii pouÏití COBAS AMPLICOR B 6 5 4 3 2 1

log result IU/ml

log result IU/ml

A y = 1.0098x + 0.1234 R2 = 0.9982

2

3

4 log input IU/ml

5

4 3 2

y = 0.8839x + 0.1718 R2 = 0.984

1 0 1

2

3 log input IU/ml

4

5

Obrázek 2 Lineární rozsah metody QIAamp DSP Virus při elučním objemu 60 µl je stanoven pomocí testů COBAS AMPLICOR MONITOR pro A HIV RNA a B HBV DNA.

Daný postup je vhodný k použití s plazmou nebo sérem (Obrázek 3); Vzorky plasmy i séra mohou obsahovat buď citran sodný nebo EDTA. Vzorky mohou být buď čerstvé, lyofilizované nebo zamražené, za předpokladu, že nebyly zmraženy a rozmraženy více než jednou. Danou metodu lze použít k izolaci virové DNA nebo RNA z široké řady DNA nebo RNA virů. Metoda je navržena tak, aby zamezila křížové kontaminaci mezi vzorky a umožnila bezpečné zacházení s potenciálně infekčními vzorky. Metoda se výborně hodí pro simultánní zpracování několika vzorků. Virové nukleové kyseliny jsou eluovány v elučním pufru (AVE) a jsou hotové k použití v amplifikačních reakcích nebo k uchovávání při -20 °C.

Princip a popis metody Metoda QIAamp DSP Virus zahrnuje 4 kroky:

■

Lyze virových částic ve vzorku

■

Vázání virových nukleových kyselin v lyzátu k membráně kolonky QIAamp MinElute

■

Promytí membrány

■

Eluce virových nukleových kyselin z membrány

Tato metoda se provádí pomocí kolonky QIAamp MinElute s využitím vakuového systému.

10


1050717_CS

16.04.2008

8:58 Uhr

Seite 11

Objem vzorku Detekční limit (DL) a kvantifikační limit (QL) byl stanoven podle směrnic ICH 2QA a 2QB pro metodu QIAamp DSP Virus (s počátečním objemem vzorku 500 µl a elučními objemy 20 µl a 60 µl) pomocí různých následných diagnostických testů (Tabulka 2 a 3). Tabulka 2. Detekãní limit metody QIAamp DSP Virus Test

Eluãní objem TM

TM

95% cut off

artus RealArt HBV DNA

20 µl

2,31 IU/ml (n=240)

artus RealArt HCV RNA

20 µl

24,31 IU/ml (n=192)

AMPLICOR manual HIV RNA

60 µl

90,92 IU/ml (n=209)

TaqMan HBV DNA

60 µl

4,73 IU/ml (n=192)

Tabulka 2. Kvantifikaãní limit metody QIAamp DSP Virus Test

QL

CV

TaqMan HBV DNA

5,7 IU/ml

< 70% (n=88)

TaqMan HCV RNA

52 IU/ml

< 60% (n=88)

COBAS AMPLICOR HIV RNA

100 IU/ml

< 60% (n=88)

COBAS AMPLICOR HBV DNA

30 IU/ml

< 60% (n=88)

COBAS AMPLICOR HCV RNA

700 IU/ml

< 60% (n=66)

Lyze virov˘ch ãástic Vzorky jsou lyzovány za denaturačních podmínek při zvýšených teplotách. Lyze se provádí v přítomnosti proteázy QIAGEN (QP) a lyzačního pufru (AL), které společně zajišťují inaktivaci RNasis.


11/2007

11

1050717_CS

16.04.2008

8:58 Uhr

Seite 12

Vázání nukleov˘ch kyselin k membránû kolonky QIAamp MinElute Pro optimalizaci vázání virové DNA a RNA k membráně kolonky QIAamp MinElute se nejprve přidá k lyzátům ethanol. Poté se každý lyzát nanese na kolonku QIAamp MinElute a virové nukleové kyseliny jsou adsorbovány na silikagelovou membránu při průchodu lyzátu indukovaném působením podtlaku. Odstranûní reziduálních kontaminant Zatímco virové nukleové kyseliny zůstávají vázány na membránu kolonky QIAamp MinElute, kontaminanty se účinně vymývají nejprve promývacím pufrem 1 (AW1), poté promývacím pufrem 2 (AW2) a poté ethanolem. Eluování ãist˘ch nukleov˘ch kyselin Virové nukleové kyseliny jsou eluovány z membrány kolonky QIAamp MinElute pomocí elučního pufru (AVE). Kolonky QIAamp MinElute umožňují získat eluční objemy 20 µl nebo 60 µl. V závislosti na použitém následném testu může eluát nukleové kyseliny obsahovat až 50 % reakčního objemu bez jakéhokoliv inhibičního účinku.

12


1050717_CS

16.04.2008

8:58 Uhr

Seite 13

Metoda QIAamp DSP Virus Sample

Pfied zahájením si peãlivû proãtûte protokol (strana 22) Do LT přidejte 75 µl QP, 500 µl vzorku a 500 µl AL Míchejte 15 s na vortexu Lyse

Inkubujte 15 min (±1 min) při 56°C (±1°C) Přidejte 600 µl ethanolu Míchejte 15 s na vortexu Inkubujte 5 min (±1 min) při laboratorní teplotě (15–25 °C)

Bind

Přeneste lyzát na kolonku QIAamp MinElute s připojeným nástavcem EXT

Vacuum

Wash (AW1) Remove EXT before vacuum is applied

Přidejte 600 µl rozpuštěného AW1 Odstraňte EXT

Vacuum Wash (AW2) Přidejte 750 µl rozpuštěného AW2 Vacuum Wash (ethanol) Přidejte 750 µl ethanolu Vacuum Dry spin Vložte kolonku QIAamp MinElute do WT Elute

Centrifugujte 1 minutu při 14 000 rpm Vložte kolonku QIAamp MinElute do WT Inkubujte 3 min při 56 °C Vložte kolonku QIAamp MinElute do WT Přidejte 20 µl nebo 60 µl AVE Inkubujte 3 min při laboratorní teplotě (15–25 °C)

Pure viral nucleic acids


Centrifugujte 1 minutu při 14 000 rpm

11/2007

13

1050717_CS

16.04.2008

8:58 Uhr

Seite 14

Vybavení a reagencie, které má zajistit uÏivatel. Při práci s chemikáliemi vždy používejte vhodný laboratorní plášť, rukavice na jedno použití a ochranné brýle. Další informace jsou uvedeny v odpovídajících bezpečnostních listech, které lze získat od dodavatele produktu.

■

Ethanol (96–100%)

■

Pipety* a pipetovací špičky (pro zamezení křížové kontaminace doporučujeme používat pipetovací špičky s aerosolovými bariérami)

■

Rukavice na jedno použití

■

Termoblok* pro lyzi při 56 °C (doporučujeme Eppendorf® Thermomixer comfort s termoblokem pro 2,0 ml mikrozkumavky†)

■

Mikrocentrifuga*

■

Odměrný válec (50 ml)

■

Vortex (třepačka)*

■

QIAvac 24 Plus vakuový systém (QIAvac 24 Plus, kat. č. 19413, QIAvac Connecting System, kat. č. 19419, a vakuová pumpa Vacuum Pump, kat. č. 84020), nebo ekvivalentní standardní laboratorní vakuový systém †

* Pro zajištění správného zpracování vzorků při provádění metody QIAamp DSP Virus doporučujeme použití nástrojů (tj. pipet a zahřívacích bloků) kalibrovaných podle doporučení výrobce. †

Uvedený výčet není úplný a nezahrnuje řadu důležitých materiálů a pomůcek používaných v biologické laboratoři.

†

v prodeji od druhého pololetí roku 2004. Více informací na www.qiagen.com/products/accessories

14


1050717_CS

16.04.2008

8:58 Uhr

Seite 15

DÛleÏité poznámky DÛleÏité body pfied zahájením ■

Po obdržení soupravy zkontrolujte, zda nejsou její komponenty poškozeny. V případě poškození blistrového obalu kontaktujte oddělení technických služeb QIAGEN Technical Services nebo místního distributora. V případě rozlití postupujte podle “bezpečnostních pokynů” (strana 7). Nepoužívejte poškozené komponenty soupravy, použití poškozených komponent by mohlo negativně ovlivnit účinnost soupravy.

■

Používejte vždy vybavení a materiály bez RNázy.

■

Během pracovního postupu uchovávejte ethanol (96–100%) na ledu.

■

Před každým přenosem kapalných materiálů vyměňte pipetovací špičku. Pro zamezení křížové kontaminace doporučujeme použít pipetovací špičky s aerosolovou bariérou.

■

Všechny kroky centrifugace se provádějí při laboratorní teplotě (15–25 °C).

■

Používejte vždy rukavice na jedno použití a pravidelně kontrolujte, zde nedošlo k jejich kontaminaci testovaným vzorkem.

■

Vyhoďte rukavice do odpadu v případě jejich kontaminace a minimálně před každým krokem označeným symbolem rukavic.

■

Pro zamezení křížové kontaminace neotevírejte více zkumavek současně.

■

Při práci se soupravou nepoužívejte komponenty jiných souprav, pokud nemají stejné číslo šarže.

■

Zamezte mikrobiální kontaminaci reagencií soupravy.

■

Pro zajištění ochrany před potenciálně infekčními materiály doporučujeme pracovat za podmínek laminárního proudění až do lyze vzorků.

■

Tuto soupravu smí používat pouze personál školený v in vitro laboratorních metodách.

■

Metoda obsahuje pokyny pro zpracování jednoho vzorku plazmy nebo séra. Pomocí vakuového systému QIAvac 24 Plus je však možné zpracovávat až 24 vzorků současně.

Pfiíprava RNA Při přípravě virové RNA pracujte rychle během všech manuálních kroků dané metody. Eluční pufr (AVE) obsahuje azid sodný *, antimikrobiální prostředek, který brání růstu organismů produkujících RNázu. Protože však tento pufr neobsahuje žádné chemikálie degradující RNázu, není schopen aktivně inhibovat RNázy zanesené nesprávným zacházením. Při manipulaci s elučním pufrem (AVE) je nutné vynaložit maximální úsilí k zamezení kontaminace RNázami. * Při práci s chemikáliemi vždy používejte vhodný laboratorní plášť, rukavice na jedno použití a ochranné brýle.


11/2007

15

1050717_CS

16.04.2008

8:58 Uhr

Seite 16

Uchovávání vzorkÛ Po odběru a centrifugaci je možné uchovávat plazmu a sérum nejvýše 6 hodin při teplotě 2-8 °C. Pro dlouhodobé skladování se doporučuje zamražení v alikvotech při –20 °C nebo –80 °C. Zmražené vzorky plazmy nebo séra nesmí být rozmraženy více než jednou. Opakované zmrazení a rozmražení vede k denaturaci a precipitaci proteinů a k následnému snížení virových titrů a tím i výtěžku virových nukleových kyselin. Kryoprecipitáty vytvořené během zmrazování a rozmrazování navíc ucpávají membránu kolonky QIAamp MinElute. Pokud jsou patrné kryoprecipitáty, musí být odděleny centrifugací při 6800 x g po dobu 3 minut. Pročištěný supernatant je nutné ihned odsát a zpracovat bez porušení peletu.

Pfiíprava reagencií a pufrÛ Pfiíprava QIAGEN proteázy Přidejte celý obsah lahvičky obsahující 4,4 ml roztoku pro ředění proteáz (PS) do lahvičky s lyofilizovanou QIAGEN proteázou (QP) a pečlivě promíchejte. Je nutné zamezit tvorbě pěny, proto míchejte několikanásobným převrácením lahvičky. Ujistěte se, že je QIAGEN proteáza (QP) zcela rozpuštěná.

i

Nepřidávejte QIAGEN proteázu (QP) přímo do lyzačního pufru (AL)

Pfiidání nosiãové RNA a interní kontroly do lyzaãního pufru Nosičová RNA slouží dvěma cílům. Za prvé: zvyšuje vázání virových nukleových kyselin na membránu kolonky QIAamp MinElute, zvláště pokud vzorek obsahuje malé množství cílových molekul. Za druhé: přidání velkých množství nosičové RNA snižuje možnost degradace virové RNA ve vzácných případech, kdy RNázové molekuly nejsou denaturovány chaotropními solemi a detergenty v lyzačním pufru (AL). Nepřidání nosičové RNA do lyzačního pufru (AL) může vést ke snížení výtěžku virové RNA nebo DNA. Nosičová RNA může být také přítomna v některých reagenciích pro interní kontrolu komerčních diagnostických testů. V těchto případech se prosím podívejte na odpovídající návod k použití od výrobce diagnostického testu. Použití interní kontroly se doporučuje, pokud se souprava QIAamp DSP Virus Kit používá v kombinaci s diagnostickými amplifikačními systémy. Interní kontrola RNA nebo DNA a rozpuštěná nosičová RNA musí být přidány k lyzačnímu pufru (AL) a důkladně promíchány desetinásobným převrácením zkumavky. Nemíchejte na vortexu; zamezíte tím tvorbě pěny. Pro určení optimální koncentrace interní kontroly se řiďte pokyny výrobce. Použití jiné než doporučené koncentrace může vést k nesprávným výsledkům. Při výpočtu správného množství používané interní kontroly vezměte v úvahu počáteční množství vzorku a eluční objem. Mějte na paměti, že souprava QIAamp DSP Virus Kit používá startovací vzorek o velikosti 500 µl.

16


1050717_CS

16.04.2008

8:58 Uhr

Seite 17

Pro přípravu roztoku nosičové RNA přidejte 310 µl elučního pufru (AVE) do zkumavky, která obsahuje 310 µg lyofilizovaného nosiče RNA, získáte tak roztok o koncentaraci 1 µg/µl. Nosič RNA důkladně rozpusťte, rozdělte jej do vhodných alikvotů a uchovávejte při –20°C. Nerozmrazujte alikvoty nosičové RNA více než dvakrát. Nosičové RNA se nerozpouští v lyzačním pufru (AL). Musí být nejdříve rozpuštěna v elučním pufru (AVE) a poté přidána k lyzačnímu pufru (AL). Ujistěte se, že je nosičová RNA úplně rozpuštěna ve správném množství elučního pufru (AVE) dříve, než ji smícháte s lyzačním pufrem (AL).

i

Pro následné testy vždy používejte správnou interní kontrolu. Další informace jsou uvedeny v pokynech výrobce.

Vypočítejte objem směsi lyzačního pufru (AL)/nosičové RNA potřebný pro danou šarži vzorků tak, že z tabulky 4 (strana 18) zvolíte počet vzorků, které mají být simultánně zpracovány. Objemy jsou kalkulovány podle následujích vzorců: n x 0,55 ml = y ml y ml x 11,2 µl/ml = z µl kde: n = počet vzorků, které mají být simultánně zpracovány y = vypočítaný objem lyzačního pufru (AL) z = objem nosičové RNA/elučního pufru (AVE), který má být přidán k lyzačnímu pufru (AL)


11/2007

17

1050717_CS

16.04.2008

8:58 Uhr

Seite 18

Tabulka 4. Objemy lyzaãního pufru (AL) a nosiãové RNA/eluãního pufru (AVE), které jsou zapotfiebí pro metodu QIAamp DSP Virus âíslo vzorkÛ

Objem AL (ml)

Objem nosiãové RNA/AVE (µl)

âíslo vzorku

Objem AL Objem nosiãové (ml) RNA/AVE (µl)

1

0.55

6.2

13

7.15

80.0

2

1.10

12.3

14

7.70

86.0

3

1.65

18.5

15

8.25

92.4

4

2.20

24.6

16

8.80

98.6

5

2.75

30.8

17

9.35

104.7

6

3.30

37.0

18

9.90

110.9

7

3.85

43.1

19

10.45

117.0

8

4.40

49.3

20

11.00

123.2

9

4.95

55.0

21

11.55

129.4

10

5.50

61.6

22

12.10

135.5

11

6.05

67.8

23

12.65

141.7

12

6.60

73.9

24

13.20

147.8

Pfiíprava prom˘vacího pufru 1 Pomocí odměrného válce přidejte 25 ml ethanolu (96–100%) do lahve obsahující 19 ml koncentrátu promývacího pufru 1 (AW1). Rozpuštěný promývací pufr 1 (AW1) uchovávejte při laboratorní teplotě (15–25 °C).

i

Před zahájením procedury vždy promíchejte rozpuštěný promývací pufr 1 (AW1) několikanásobným převrácením lahve.

Pfiíprava prom˘vacího pufru 2 Pomocí odměrného válce přidejte 30 ml ethanolu (96–100%) do lahve obsahující 13 ml koncentrátu promývacího pufru 2 (AW2). Rozpuštěný promývací pufr 2 (AW2) uchovávejte při laboratorní teplotě (15–25 °C).

i

Před zahájením procedury vždy promíchejte rozpuštěný promývací pufr 2 (AW2) několikanásobným převrácením lahve.

Pfiíprava eluãního pufru Souprava obsahuje čtyři zkumavky elučního pufru (AVE). Dbejte na to, aby nedošlo ke kontaminaci pufru RNázami. Při provádění 4 (nebo menšího počtu) purifikačních procedur pomocí jedné soupravy doporučujeme vyhodit zkumavku s elučním pufrem (AVE) do odpadu na konci každé procedury.

18


1050717_CS

16.04.2008

8:58 Uhr

Seite 19

Eluce virov˘ch nukleov˘ch kyselin Pro následné aplikace, které vyžadují malé startovací objemy (např. některá vyšetření PCR a RT-PCR), může být zvýšena citlivost testu použitím virových nukleových kyselin eluovaných v 20 µl elučního pufru (AVE). Objem virových nukleových kyselin eluovaných z kolonky QIAamp MinElute může být až o 5 µl nižší než objem elučního pufru (AVE) naneseného na kolonku. Například vymývání nukleových kyselin pomocí 60 µl elučního pufru (AVE) vede k eluci přibližně 55 µl, zatímco eluování pomocí 20 µl dává přibližně 15 µl eluátu. Objem získaného eluátu závisí na povaze vzorku. Je-li objem získaného eluátu příliš nízký pro následný test, zvyšte jeho objem přidáním elučního pufru (AVE). Eluované virové nukelové kyseliny se jímají do elučních zkumavek (ET). Pro uchovávání virových nukleových kyselin po dobu do 24 hodin doporučujeme teplotu skladování 2–8 °C.

V˘tûÏek a kvalita virov˘ch nukleov˘ch kyselin Výnosem a kvalitou jsou izolované nukleové kyseliny vhodné pro všechny typy následných detekčních metod používaných v molekulární diagnostice. Diagnostické testy musí být prováděny podle pokynů výrobce.

Nastavení vakuového systému QIAvac 24 Plus Dbejte na správné nastavení nástavce Column Extender (EXT), kolonky QIAamp MinElute, vakuového konektoru (VacConnector VC) a vakuového ventilku (VacValve) (viz Obr. 3).

4

3

2 1

Obrázek 3 Sestavení komponent soupravy QIAamp DSP Virus Kit pro vakuové zpracování vzorků: 1: Vakuový ventilek (VacValve) (dodává se s vakuovým systémem) 2: Vakuový konektor (VacConnector VC)


11/2007

3: Kolonka QIAamp MinElute

4: Nástavec kolonky (Column Extender EXT)

19

1050717_CS

16.04.2008

8:58 Uhr

Seite 20

Doporučujeme označit lyzační zkumavky (LT), eluční zkumavky (ET) a kolonky QIAamp MinElute k použití ve vakuovém systému QIAvac 24 Plus podle schématu na obrázku 4, tímto značením se zamezí záměně vzorků. Obrázek je možné oxeroxovat a označit názvy vzorků.

20

01

02

03

04

05

06

13

14

15

16

17

18


1050717_CS

16.04.2008

8:58 Uhr

Seite 21

Datum: UÏivatel: Pracovní ID ãíslo:

07

08

09

10

11

12

19

20

21

22

23

24

Obrázek 4 Schéma značení pro lyzační zkumavky (LT), eluční zkumavky (ET) a kolonky QIAamp MinElute Columns pro použití ve vakuovém systému QIAvac 24 Plus.


11/2007

21

1050717_CS

16.04.2008

8:58 Uhr

Seite 22

Protokol

Protokol: Izolace a purifikace virov˘ch nukleov˘ch kyselin z plazmy a séra Pro izolaci a purifikaci virových nukleových kyselin z 500 µl plazmy nebo séra ošetřeného EDTA nebo citratem. Co je nutné provést pfied zahájením

■

Vytemperujte vzorky na laboratorní teplotu (15–25 °C) a důkladně je promíchejte.

■

Přidejte nosičovou RNA rozpuštěnou v elučním pufru (AVE) nebo interní kontrolu do lyzačního pufru (AL) podle pokynů na straně 16.

■

Promývací roztok 1 (AW1), Promývací roztok 2 (AW2) a proteáza QIAGEN (QP) musí být připraveny podle pokynů v “důležitých poznámkách” na straně 15.

■

Vytemperujte eluční pufr (AVE) na laboratorní teplotu (15–25 °C) pro použití v kroku 18. Pokud to bude možné, použijte čerstvý eluční pufr (AVE) pro každou proceduru (4 zkumavky jsou součástí soupravy).

■

Nastavte zahřívací blok na teplotu 56 °C pro použití v kroku 4 a 17.

■

Pro zamezení křížové kontaminace vložte vakuový konektor (VacConnector VC) do každého luer adaptéru vakuového systému.

■

Zkontrolujte, zda je prázdná nádoba na odpadní materiály a zda jsou všechny spoje řádně propojeny.

■

Podrobné informace o provozu vakuového systému, zejména informace o údržbě, jsou uvedeny v příručce přiložené k tomuto systému.

Postup 1.

Pomocí pipety naneste 75 µl proteázy QIAGEN (QP) do lyzaãní zkumavky (LT).

i

Před použitím zkontrolujte datum exspirace rozpuštěné proteázy.

2.

Pfiidejte 500 µl plazmy nebo séra do lyzaãní zkumavky (LT).

3.

Pfiidejte 500 µl lyzaãního pufru (AL) (obsahuje 11,2 µg/ml nosiãové RNA) do lyzaãní zkumavky (LT), uzavfiete víãko a míchejte po dobu 15 s na pulsním vortexu. Pro zajištění účinné lyze je nezbytné důkladně promíchat vzorek a lyzační pufr (AL) do homogenního roztoku.

4.

22

i

Lyzační pufr (AL) obsahuje interní kontrolu. Vzhledem k vysoké viskozitě lyzačního pufru (AL) dbejte na přidání správného množství lyzačního pufru (AL) pečlivým odpipetováním nebo použitím vhodné pipety, například vícekrokové pipety Eppendorf nebo ekvivalentního zařízení.

i

Nepřidávejte QIAGEN proteázu (QP) přímo do lyzačního pufru (AL)

Inkubujte 15 min (±1 min) pfii 56°C (±1°C).


1050717_CS

5.

16.04.2008

8:58 Uhr

Seite 23

Centrifugujte lyzaãní zkumavku (LT) po dobu minimálnû 5 sekund pfii maximální rychlosti, tímto krokem se odstraní kapky z vnitfiní strany víãka.

6.

VymûÀte si rukavice a opatrnû otevfiete lyzaãní zkumavku (LT). Pfiidejte do lyzaãní zkumavky (LT) 600 µl ethanolu (96–100%), zavfiete víãko a promíchejte dÛkladnû na pulsním vortexu po dobu minimálnû 15 sekund. Inkubujte po dobu 5 min (±1 min) pfii laboratorní teplotû (15–25 °C).

8.

Centrifugujte lyzaãní zkumavku (LT) po dobu minimálnû 5 sekund pfii maximální rychlosti, tímto krokem se odstraní kapky z vnitfiní strany víãka.

9.

VloÏte kolonku QIAamp MinElute do vakuového konektoru (VacConnector VC) vakuového systému (viz Obrázek 3, strana 19). VloÏte nástavec kolonky (Column Extender EXT) do otevfiené kolonky QIAamp MinElute.

i Ponechte si promývací zkumavku (WT) pro centrifugaci k vysušení kolonky v kroku 16. 10.

VymûÀte si rukavice; otevírejte vÏdy pouze jednu zkumavku.

11. Opatrnû naneste ve‰ker˘ lyzát z kroku 7 na nástavec (EXT) kolonky QIAamp MinElute, dbejte na to, aby nedo‰lo ke zvlhãení okraje. Nedot˘kejte se membrány kolonky QIAamp MinElute pipetovací ‰piãkou. 12. Zapnûte vakuovou pumpu. Po prÛchodu lyzátu pfies kolonku QIAamp MinElute otevfiete ventilek vakuového systému a uvolnûte podtlak. Při souběžném zpracování několika kolonek QIAamp MinElute doporučujeme po průchodu lyzátu uzavřít vakuový ventilek (VacValve) každé kolonky, tímto postupem se sníží doba potřebná k uskutečnění tohoto kroku.

i

Pokud veškerý lyzát neprojde membránou do 15 minut, vyhoďte kolonku QIAamp MinElute Column do odpadu a zopakujte celý postup s použitím nového vzorku.

i

Pro rychlé uvolnění podtlaku se má používat ventilek vakuového systému.

13. Naneste na kolonku QIAamp MinElute 600 µl prom˘vacího pufru 1 (AW1) . Opatrnû sejmûte nástavec Column Extender (EXT) a vyhoìte jej do odpadu, zavfiete ventilek vakuového systému. Po prÛtoku prom˘vacího pufru 1 (AW1) pfies kolonku QIAamp MinElute otevfiete ventilek a uvolnûte podtlak.

i

Pro zamezení křížové kontaminace dbejte na to, abyste při odstraňování nástavců (EXT) nemanipulovali s nástavci nad sousedními kolonkami QIAamp MinElute.

14. Naneste na kolonku QIAamp MinElute 750 µl prom˘vacího pufru 2 (AW2), aniÏ by do‰lo k navlhãení okraje kolonky. Nedot˘kejte se membrány kolonky QIAamp MinElute pipetovací ‰piãkou. Nechte víãko kolonky otevfiené a uzavfiete ventilek vakuového systému. Po prÛtoku prom˘vacího pufru 2 (AW2) pfies kolonku QIAamp MinElute otevfiete ventilek a uvolnûte podtlak.


11/2007

23

Protokol

7.

Protokol

1050717_CS

16.04.2008

8:58 Uhr

Seite 24

15. Naneste na kolonku QIAamp MinElute 750 µl ethanolu (96–100%), aniÏ by do‰lo k navlhãení okraje kolonky. Nedot˘kejte se membrány kolonky QIAamp MinElute pipetovací ‰piãkou. Nechte víãko kolonky otevfiené a uzavfiete ventilek vakuového systému. Po prÛtoku ethanolu pfies kolonku QIAamp MinElute otevfiete ventilek a uvolnûte podtlak.

i

K aplikaci ethanolu na kolonku QIAamp MinElute s aerosolovou bariérou.

použijte špičky

16. Uzavfiete víãko kolonky QIAamp MinElute, odstraÀte kolonku z vakuového systému a vyhoìte vakuov˘ konektor (VacConnector VC) do odpadu. VloÏte kolonku QIAamp MinElute Column do prom˘vací zkumavky (WT) uschované z kroku 9 a centrifugujte pfii maximální rychlosti (pfiibliÏnû 20 000 x g, nebo 14 000 rpm) po dobu 1 minuty, pfii centrifugaci dojde k úplnému vysu‰ení mambrány. Vyhoìte prom˘vací zkumaku (WT) obsahující filtrát do odpadu.

i

Vynechání této centrifugace, při niž dochází k vysušení kolonky, může vést k inhibici následného testu.

17. VloÏte kolonku QIAamp MinElute do nové prom˘vací zkumavky (WT) a inkubujte ji s otevfien˘m víãkem pfii 56 °C po dobu 3 minut, bûhem této doby dojde k evaporaci ve‰keré zb˘vající tekutiny. 18. VloÏte kolonku QIAamp MinElute do ãisté eluãní zkumavky (ET) a vyhoìte prom˘vací zkumavku (WT) do odpadu. Opatrnû otevfiete víãko kolonky QIAamp MinElute a naneste 20 µl nebo 60 µl eluãního pufru (AVE) (v závislosti na daném následném testu) na stfied membrány. Zavfiete víãko a inkubujte pfii laboratorní teplotû (15–25 °C) po dobu 3 minut (± 30 s). Centrifugujte pfii maximální rychlosti (pfiibliÏnû 20 000 x g, nebo 14 000 rpm) po dobu 1 minuty, bûhem centrifugace dojde k eluci virov˘ch nukleov˘ch kyselin. i Po provedení tohoto protokolu proveďte údržbu vakuového systému (bližší informace: viz příručka dodávaná s vakuovým systémem).

24


1050717_CS

16.04.2008

8:58 Uhr

Seite 25

Poznámky


11/2007

25

1050717_CS

16.04.2008

8:58 Uhr

Seite 26

Poznámky

26


1050717_CS

16.04.2008

8:58 Uhr

Seite 27

Poznámky


11/2007

27

1050717_CS

16.04.2008

8:58 Uhr

Seite 28

www.qiagen.com Australia ■ Orders 03-9840-9800 ■ Fax 03-9840-9888 ■ Technical 1-800-243-066 Austria ■ Orders 0800/28-10-10 ■ Fax 0800/28-10-19 ■ Technical 0800/28-10-11 Belgium ■ Orders 0800-79612 ■ Fax 0800-79611 ■ Technical 0800-79556 Canada ■ Orders 800-572-9613 ■ Fax 800-713-5951 ■ Technical 800-DNA-PREP (800-362-7737) China ■ Orders 021-51345678 ■ Fax 021-51342500 ■ Technical 021-51345678 Denmark ■ Orders 80-885945 ■ Fax 80-885944 ■ Technical 80-885942 Finland ■ Orders 0800-914416 ■ Fax 0800-914415 ■ Technical 0800-914413 France ■ Orders 01-60-920-926 ■ Fax 01-60-920-925 ■ Technical 01-60-920-930 ■ Offers 01-60-920-928 Germany ■ Orders 02103-29-12000 ■ Fax 02103-29-22000 ■ Technical 02103-29-12400 Hong Kong ■ Orders 800 933 965 ■ Fax 800 930 439 ■ Technical 800 930 425 Ireland ■ Orders 1800-555-049 ■ Fax 1800-555-048 ■ Technical 1800-555-061 Italy ■ Orders 02-33430411 ■ Fax 02-33430426 ■ Technical 800-787980 Japan ■ Telephone 03-5547-0811 ■ Fax 03-5547-0818 ■ Technical 03-5547-0811 Korea (South) ■ Orders 1544 7145 ■ Fax 1544 7146 ■ Technical 1544 7145 Luxembourg ■ Orders 8002-2076 ■ Fax 8002-2073 ■ Technical 8002-2067 The Netherlands ■ Orders 0800-0229592 ■ Fax 0800-0229593 ■ Technical 0800-0229602 Norway ■ Orders 800-18859 ■ Fax 800-18817 ■ Technical 800-18712 Singapore ■ Orders 65-67775366 ■ Fax 65-67785177 ■ Technical 65-67775366 Sweden ■ Orders 020-790282 ■ Fax 020-790582 ■ Technical 020-798328 Switzerland ■ Orders 055-254-22-11 ■ Fax 055-254-22-13 ■ Technical 055-254-22-12 UK ■ Orders 01293-422-911 ■ Fax 01293-422-922 ■ Technical 01293-422-999 USA ■ Orders 800-426-8157 ■ Fax 800-718-2056 ■ Technical 800-DNA-PREP (800-362-7737)

1050717CS 11/2007

Sample & Assay Technologies

Pfiíruãka QIAamp DSP Virus Kit

Recommend Documents