BioSMART Volume 1, Nomor 1 Halaman: 15-21
ISSN: 1411-321X April 1999
Pengaruh Radiasi Sinar Gamma Terhadap Pertumbuhan Eksplan Tebu (Saccharum officinarum L.) Varietas M 442-51 (BZ 148) SOLICHATUN Jurusan Biologi FMIPA UNS Surakarta ABSTRAK The objectives of this experiment were to observe the effect of gamma radiation, the effect of explant transfer to fresh medium, and the effect of kinetin addition to the medium on callus formation ability. The explant was of the young leave of sugar cane Saccharum officinarum L. Var. M 442-51 (BZ 148), which is still in the circle form and grows at the young bud. The medium used was a modification of Murashige-Skoog medium, with or without addition of kinetin (0.5 mg/l) which is combined with 6 mg/l 2,4-D on each medium. Gamma radiation was done using a dosage of 20 Gay. Some of radiated explant were transferred into fresh medium. The composition was the same as the first medium and some of them were remained in the previous medium. The control groups were not radiated. In general, gamma radiation reduced callus production and time initiation. Transfer of mediated explant to the fresh medium decreased the ability of callus formation. Kinetin addition was also reduced the percentage of callus formation, but increased the level of cell proliferation. Key words: gamma radiation, explant, sugar cane, variety M 442-51 (BZ 144).
PENDAHULUAN Tanaman tebu (Saccharum officinarum L.) merupakan tanaman pokok penghasil gula. Produktivitas tanaman ini dipengaruhi iklim, jenis tanah, pengairan, jarak tanam dan varietas. Salah satu masalah utama budidaya tebu adalah tingginya kompetisi gulma, terutama ketika tumbuhan masih muda. Gulma merupakan pesaing untuk mendapatkan air, zat hara, sinar matahari dan ruang tumbuh. Di samping itu dapat menjadi sarang hama dan penyakit serta dapat menghasilkan senyawa sekunder yang bersifat racun. Herbisida merupakan salah satu alternatif untuk mengendalikan gulma, karena penggunaannya sederhana dan efektif. Namun senyawa ini juga dapat mematikan tanaman muda. Untuk itu perlu ditemukan tanaman tebu yang tahan terhadap herbisida. Penemuan varietas baru dapat dilakukan melalui seleksi. Dasar pemuliaan tanaman adalah adanya kera-gaman genetik pada sel. Keragaman ini dapat dinaikkan dengan induksi radiasi energi tinggi sehingga terjadi mutasi sel (Novak, 1973). Meskipun metode ini sering menimbulkan tanaman baru yang steril, kemampuan regenerasi dan daya hidupnya rendah. Sterilitas dan rendahnya daya hidup sel disebabkan dosis radiasi yang kurang tepat. Sedang rendahnya kemampuan regenerasi disebabkan tingginya frekuensi subkultur (Gao dkk., 1991; Mac Donald dkk., 1991). Menurut Handro (1981) dan Novak (1991) kultur yang telah diradiasi harus segera dipindah ke medium segar, namun sebaliknya menurut Thrope (1982) subkultur dapat menurunkan kemampuan regenerasi.
Botani Tanaman Tebu Klasifikasi tanaman tebu (Benson, 1957) adalah: Filum : Angiospermae Sub Filum : Monocotyledoneae Divisi : Glumiflorae Ordo : Graminales Familia : Gramineae Sub Familia : Panicoideae Tribe : Andropogoneae Sub Tribe : Saccharine Genus : Saccharum Spesies : Saccharum officinarum L. Tebu varietas M442-51 (BZ 148) merupakan hasil persilangan antara varietas B 37172 dengan M 21340 yang diintroduksi dari Mauritius. Batang tebu varietas M 442-51 (BZ 148) berbentuk silindris penampang lintang bulat, lapisan lilin tipis, teras berlubang kecil. Pelepah daun tanpa bulu, bila ada membentuk jalur sempit yang tidak sampai ke ujung pelepah. Upih pendek sampai sedang, tegak. Tepi sayap mata tunas rata, tanpa rambut jambul dan pita. Produktifitas di lahan sawah sekitar 100-140 ton per hektar, sedang di lahan kering 40-96,6 ton per hektar. Keunggulan varietas ini antara lain mampu menyesuaikan diri terhadap berbagai tipe iklim, jenis lahan dan tanah, tahan terhadap hama penggerek batang dan pucuk, serta tahan terhadap penyakit mosaik, pokahbung dan blendok (Anonim, 1982). Kultur Jaringan Tebu Kultur in vitro tebu pertama kali dilakukan tahun 1961 oleh Nickell (Liu, 1981). Teknik ini memiliki potensi besar dalam pengembangan dan perbaikan genetik tanaman. Kultur jaringan dapat digunakan © 1999 Jurusan Biologi FMIPA UNS Surakarta
16
BioSMART Vol. 1, No. 1, April 1999, hal. 15-21
untuk menghasilkan tanaman yang seragam dan secara genetik identik dengan tanaman induk (George dan Sherrington, 1984). Penelitian kultur jaringan tebu bertujuan antara lain untuk mengamati keragaman genetik kultur sel dan tanaman hasil regenerasinya, menemukan tanaman yang tahan penyakit, memperoleh tanaman dengan kandungan gula tinggi, mengamati organogenesis dan embryogenesis pada kultur tebu (Heinz dkk., 1977). Perbanyakan tanaman dengan kultur jaringan sangat tergantung medium yang digunakan. Medium kultur umumnya tersusun atas beberapa komponen, meliputi hara makro, mikro, vitamin, asam amino, gula, senyawa kompleks dan zat pengatur tumbuh (Gunawan, 1988). Medium terbaik yang digunakan untuk diferensiasi kalus tebu dan perkembangan anakan adalah medium Murashige-Skoog (1962) atau modifikasi dengan penam-bahan senyawa kompleks seperti air kelapa, ekstrak ragi, sari tomat dan ekstrak malt (Heinz dkk., 1977). Dalam medium yang diberi auksin, penambahan air kelapa membuat pertumbuhan kalus lebih baik (Gunawan, 1988). Auksin berperan dalam pemanjangan sel dan diferensiasi akar, sedangkan sitokinin berperan dalam pembelahan sel dan diferensiasi tunas adventif (Krishnamoorthy, 1983). Sitokinin yang biasa digunakan adalah kinetin (Bhojwani dan Razdan, 1983).
pengkerdilan dan resistensi terhadap herbisida (Heinz dkk., 1977). Secara genetik sinar gamma dapat menyebabkan aberasi kromosom, seperti putusnya rantai DNA, putusnya kromoson dan translokasi gen (Djojosoebagio, 1988). Penggunaan radiasi sinar gamma pada tanaman tebu ditujukan untuk memperoleh varietas baru yang resisten terhadap penyakit dan memiliki sifat-sifat unggul. Heinz dkk. (1977) menyatakan bahwa radiasi sinar gamma dapat menghasilkan varietas baru yang resisten terhadap serangan Helminthosporium seccari. Jans-Orn dkk. (1991) menambahkan bahwa radiasi sinar gamma dengan dosis 5-40 Gay dapat meningkatkan prosentase tanaman tebu yang tidak berbunga pada musim panen, sehingga kadar gulanya lebih tinggi. Soesilawati (1993) melaporkan bahwa toleransi kultur kalus tebu varietas M 442-51 terhadap herbisida glifosfat meningkat dengan perlakuan radiasi sinar gamma pada dosis 20 - 30 Gay.
]
Alat dan Bahan Bahan yang menjadi sumber eksplan adalah tanaman tebu (Saccharum officinarum L.) varietas M 442-51 (BZ 148) yang ditanam dalam polibag di rumah kaca. Eksplan yang digunakan berupa daun muda yang masih menggulung dan tumbuh dari tunas muda. Bahan-bahan kimia untuk pembuatan medium sesuai dengan komposisi medium dasar MurashigeSkoog (1962) dengan modifikasi. Untuk sterilisasi eksplan digunakan alkohol 96%, Dithane M-45 dan agrimisin. Peralatan yang digunakan meliputi: botol kultur, cawan petri, gelas piala, gelas ukur, labu elenmeyer, pipet volumetrik, kertas aluminium, pisau diseksi, pinset, timbangan analitik, pH-meter, hot plate, pengaduk magnetik, otoklaf, oven, kotak transfer (laminar air flow cabinet), lampu spiritus dan irradiator gamma cell 200.
Radiasi Sinar Gamma Induksi mutasi secara in vitro pada biji atau bagian vegetatif tanaman dapat dilakukan dengan mutagen fisik dan kimia (Negrutiu, 1990). Mutagen fisik berupa radiasi pengion dari isotop radioaktif, sedangkan mutagen kimia berupa senyawa-senyawa kimia yang dapat menginduksi mutasi. Radiasi pengion terdiri dari radiasi partikel dan elektromagnetik. Radiasi partikel meliputi proton, elektron, neutron, sinar alfa dan beta. Sedangkan radiasi elektromagnetik meliputi sinar gamma, sinar X dan sinar ultraviolet (Handro, 1981). Mutagen yang sering diguna-kan adalah sinar gamma dan sinar X (Wattimena, 1992). Sinar gamma merupakan foton atau gelombang elektromagnetik berenergi tinggi (Mev) dengan panjang gelombang pendek. Foton diserap melalui ionisasi, dimana sebagian atau seluruh energi foton ditransfer ke bahan sehingga elektron terlempar keluar. Hal ini dimungkinkan jika energi foton lebih besar dari pada energi atom bahan (Djojosoebagio, 1988). Daya tembus sinar gamma sangat besar. Sumber yang biasa digunakan adalah isotop radioaktif Cobal-60 (60Co) dan Caesium-137 (137 Cs) (Negrutiu, 1990). Radiasi dapat mempengaruhi organisme secara morfologi atau genetik. Perubahan morfologi pada tebu yang diradiasi dengan sinar gamma antara lain berupa perubahan permukaan dan ukuran batang,
BAHAN DAN METODE Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Fisiologi Tumbuhan Jurusan Biologi FMIPA IPB Bogor. Radiasi sinar gamma dilaksanakan di Pusat Aplikasi Isotop dan Radiasi (PAIR) BATAN Jakarta.
Cara Kerja Prosedur penelitian ini meliputi: sterilisasi peralatan, pembuatan medium, sterilisasi eksplan, radiasi eksplan dan pemindahan eksplan ke medium segar. Sterilisasi Peralatan. Botol kultur, cawan petri dan alat-alat gelas dicuci bersih dengan air sabun, lalu disterilisasi dengan otoklaf pada temperatur 121oC, tekanan 151 psi selama satu jam. Akuades steril diperoleh dengan memasukkan akuades ke dalam labu elenmeyer yang dilapisi kertas alumunium, lalu disterilisasi dengan cara di atas.
SOLICHATUN – Radiasi Sinar Gamma pada Tebu
Penanaman Eksplan. Eksplan ditanam dalam medium dengan posisi tegak dan diletakkan dalam ruang kultur pada temperatur 25-27oC, dengan intensitas penyinaran 800-1000 lux selama 16 jam per hari. Perlakuan Radiasi. Setelah kultur berumur 2 minggu dilakukan radiasi sinar gamma dengan sumber radiasi isotop 60Co dalam irradiator gamma cell 220. Dosis yang diberikan sebesar 20 Gay. Pada kontrol tidak dilakukan radiasi. Pemindahan ke Medium Segar. Setelah diradiasi, sebagian kultur segera dipindah ke medium segar dan sebagian lagi dibiarkan tumbuh pada medium semula (tanpa pemindahan).
Komposisi medium segar yang digunakan sama dengan medium awal. Pengamatan dilakukan selama 8 minggu. Parameter yang diamati meliputi: tingkat kontaminasi kultur, penampakan umum, waktu inisiasi kalus, prosentase kultur yang membentuk kalus, tingkat proliferasi kalus dan prosentase pembentukan embryo somatik.
HASIL DAN PEMBAHASAN Sterilisasi Eksplan Sterilisasi eksplan dilakukan dengan beberapa metode, agar diperoleh metode paling baik. Sterilisasi yang baik akan menghasilkan tingkat kontaminasi rendah dan tingkat kesegaran jaringan tinggi, sehingga eksplan mampu tumbuh pada medium kultur. Dari tabel 1 terlihat bahwa sterilisasi dengan agrimison 0,5% (1,5 jam) diikuti Dithane M-45 0,5% (1,5 jam) dan dicelup alkohol 96% lalu dibakar, memberikan hasil paling baik, sehingga metode sterilisasi tersebut digunakan dalam penelitian selanjutnya.
Kesegaran Jaringan
Jenis Kontaminan
Tabel 1. Tingkat kontaminasi, kesegaran jaringan dan jenis kontaminan pada penelitian sterilisasi. Kontami-nasi (%)
Pembuatan Medium. Medium yang digunakan adalah medium Murashige-Skoog dengan modifikasi. Medium dibuat dengan mencampurkan sejumlah larutan baku MS, lalu ditambah sukrosa dan air kelapa serta diaduk hingga homogen, kemudian diencerkan dengan akuades sampai volume satu liter. Air kelapa diperoleh dari kelapa yang berumur sedang, tidak terlalu tua dan tidak terlalu muda. Sebelum digunakan air kelapa disaring dengan kertas saring. Pengaturan pH dilakukan hingga mencapai nilai 5,8 dengan menambah HCl 1N atau NaOH 1N tetes demi tetes. Setelah itu ditambah 8 g/l agar dan diaduk sampai rata. Larutan dipanaskan hingga mendidih di atas hot plate berpengaduk magnetik. Medium diberi perlakuan kinetin 0,5 mg/l dan tanpa kinetin, yang masing-masing dipadukan dengan 6 mg/l 2,4-D. Kinetin diharapkan meningkatkan induksi pembentukan kalus. Masingmasing perlakuan terdiri dari 5 ulangan dan tiap ulangan terdiri dari 5 kultur. Medium dituang ke dalam botol steril, masing-masing sebanyak kurang lebih 20 ml, lalu ditutup kertas aluminium. Kemudian disterilisasi dengan otoklaf pada temperatur 20oC, tekanan 20 psi, selama 20 menit. Medium steril disimpan dalam rak pada temperatur ruang selama 2-3 hari untuk mengetahui ada tidaknya kontaminasi. Sterilisasi Eksplan. Umumnya sterilisasi dilakukan dengan mencelupkan tunas batang tebu ke dalam alkohol 96% lalu dipanaskan dengan api sampai alkoholnya terbakar habis (Hutajulu, 1993; Soesilowati, 1993). Namun prosedur ini tidak mampu menekan tingkat kontaminasi, sehingga dilakukan cara berikut: Tunas muda batang tebu dengan diameter 0,8-1 cm dipotongpotong sepanjang 5-10 cm, lalu direndam dalam air sabun selama 15 menit dan dibilas dengan air mengalir sampai bersih. kemudian disterilisasi dengan cara sebagai berikut: a. Dicelup dalam alkohol 96% selama satu menit dan dibakar sampai alkoholnya habis. b. Direndam dalam larutan agrimisin 0,2% selama 1,5 jam, lalu direndam dalam larutan Dithane M-45 0,2% selama 1,5 jam, yang masing-masing telah ditambah 2 tetes Tween 80. Lalu dibilas akuades steril sebanyak 3-4 kali. c. Sama dengan b, tetapi setelah itu dicelup ke dalam alkohol 96% selama satu menit dan dibakar sampai alkoholnya habis. d. Direndam dalam larutan agrimisin 0,5% selama 1,5 jam, lalu dalam larutan Dithane M-45 0,5% selama 1,5 jam, yang masing-masing telah ditambah 2 tetes Tween 80, lalu dibilas dengan akuades steril sebanyak 3-4 kali. e. Direndam dalam larutan agrimisin 0,5% selama satu jam, lalu dalam larutan Dithane M-45 0,5% selama satu jam, yang masing-masing telah ditambahi 2 tetes Tween 80, lalu dibilas dengan akuades steril sebanyak 3-4 kali. Setelah itu dicelup ke dalam alkohol 96% selama satu menit dan dibakar sampai alkohol habis. Sterilisasi dilakukan dalam kotak transfer yang telah disterilisasi dengan sinar UV selama 2 jam. Eksplan yang ujungnya mengalami klorosis akibat pengaruh larutan pensteril dipotong dan dibuang karena diperkirakan jaringan eksplan tersebut telah mati. Eksplan yang masih segar dipotong-potong sepanjang 0,5-1 cm dengan pisau diseksi steril.
17
A.
Alkohol 96% dibakar
100
-
Bakteri
B.
Agrimisin 0,2% (1,5 jam) Dithane 0,2% (1,5 jam)
100
-
Bakteri
C.
Agrimisin 0,2% (1,5 jam) Dithane 0,2% (1,5 jam) Alkohol 96% dibakar
100
+
Cendawan, Bakteri
D.
Agrimisin 0,5% (1,5 jam) Dithane 0,5% (1,5 jam)
50
-
Cendawan, Bakteri
E.
Agrimisin 0,5% (1,5 jam) Dithane 0,5% (1,5 jam) Alkohol 96% dibakar
33,3
+
Cendawan, Bakteri
No
Perlakuan
Keterangan:
- : kesegaran jaringan kurang + : kesegaran jaringan baik
Kontaminasi bakteri dan cendawan merupakan masalah umum dalam kultur jaringan, keduanya tumbuh dengan cepat dan dapat mematikan eksplan. Kematian eksplan dapat disebabkan persaingan nutrisi dan timbul-nya senyawa racun dari mikroorganisme (Bhojwani dan Razdan, 1983). Kontaminasi berasal dari medium, bahan tanaman, udara dan tubuh pekerja (Gunawan, 1988). Kontaminasi dari medium dapat terjadi karena pencucian botol kultur yang kurang bersih, sterilisasi botol kurang baik atau sterilisasi medium tidak sempurna, sehingga masih ada spora cendawan atau bakteri yang belum mati. Kontaminasi dari jaringan tanaman, umumnya disebab-kan bakteri dan cendawan tumbuh di dalam eksplan, sehingga sangat sulit diatasi. Kontaminan ini sering dicoba diatasi dengan antibiotik, bakterisida atau fungisida sistemik (Gunawan, 1988).
18
BioSMART Vol. 1, No. 1, April 1999, hal. 15-21
Gambar 1
Gambar 2
Gambar 3
Gambar 4 Gambar 1. Kalus yang terbentuk tidak mampu berkembang, karena kultur terkontaminasi bakteri Gambar 2. Kalus yang terbentuk pada kultur tanpa radiasi dengan penambahan kinetin, umur 8 minggu Gambar 3. Kalus yang terbentuk pada kultur yang diradiasi, tanpa pemindahan ke medium segar, dengan penambahan kinetin, umur 8 minggu Gambar 4. Kalus yang terbentuk pada kultur yang diradiasi dan dipindahkan ke medium segar, dengan penambahan kinetin, umur 8 minggu
Agrimisin (bakterisida) dan Dithane (fungisida) yang digunakan dalam penelitan ini dapat menekan prosentase kotaminasi sampai 33,3%, tetapi belum mampu membunuh semua mikroorganisme secara sempurna. Hal ini terlihat dari timbulnya kontaminasi pada minggu keempat (1 bulan setelah tanam). Hal ini diduga karena eksplan sudah terinfeksi patogen sewakti di lapangan, sehingga sulit diatasi oleh bahan pensteril pada permukaan jaringan. Bakteri dan cendawan yang masih bertahan hidup akan
memanfaatkan nutrisi yang tersedia pada medium kultur untuk pertumbuhannya. Akhirnya bakteri dan cendawan tersebut berkembangbiak dan mematikan eksplan. Pengamatan mikroskopis pada medium dan eksplan yang terkontaminasi bakteri, terlihat bakteri berbentuk kapsul dan kokus, keduanya motil. Pengamatan irisan tunas tanaman induk terlihat adanya daerah berwarna kecoklatan dan dari situ berhasil ditemukan bakteri berbentuk kapsul, sedangkan bakteri berbentuk kokus tidak ditemukan.
SOLICHATUN – Radiasi Sinar Gamma pada Tebu
Tanaman tebu varietas M 442-51 (BZ 148) yang digunakan pada penelitian ini tahan terhadap penyakit mosaik, pokahbung dan blendok (Anonim, 1982). Penyakit mosaik disebabkan virus mosaik tebu, penyakit pokahbung disebabkan cendawan Fusarium moniliforme Sheld., sedang penyakit blendok disebabkan bakteri Bacterium albilinean Ashby (Semangun, 1989). Pada penelitian ini kontaminasi internal oleh bakteri diduga ditularkan lewat alat pemotong stek sewaktu penanaman bibit. Inisiasi Kalus Eksplan umumnya tumbuh pada minggu pertama. Beberapa eksplan memanjang atau membuka gulungan daunnya karena pembesaran sel. Waktu inisiasi kalus bervariasi antara minggu kedua dan ketiga (tabel 2). Tabel 2. Pengaruh pemberian kinetin terhadap waktu inisiasi kalus, jumlah dan prosentase kultur berkalus. Perlakuan
Inisiasi Jumlah Jumlah kultur % Kultur (minggu ke) kultur berkalus berkalus
Tanpa kinetin
2-3
25
9
36
Kinetin
2-3
25
4
19
Kalus muncul pada permukaan jaringan yang terluka, ditandai dengan timbulnya bintik-bintik putih kekuningan atau merah keunguan. Menurut Soesilawati (1993) bintik-bintik kalus yang berwarna merah keunguan akan terdiferensiasi menjadi akar, sedangkan yang berwarna hijau keunguan akan terdiferensiasi menjadi tunas. Pada penelitian ini, kalus yang berwarna hijau keunguan tidak dijumpai sedang kalus yang berwarna merah keunguan tidak terdiferensiasi menjadi akar, karena sebagian besar kultur terkontaminasi bakteri yang berasal dari eksplan. Lamanya waktu inisiasi kalus dipengaruhi kondisi sel eksplan yang dikulturkan. Sel yang segar dan sehat dapat tumbuh dengan baik dan cepat. Perlakuan sterilisasi pada penelitian ini diduga terlalu kuat sehingga selain membunuh mikroorganisme juga membunuh atau memperlambat pertumbuhan sel-sel eksplan. Sehingga banyak eksplan tidak mampu tumbuh, mengering dan mati. Namun apabila sterilisasi diperlemah, kontaminasi eksplan sangat besar. Oleh karena itu faktor tanaman induk sebagai sumber eksplan yang sehat berperan penting untuk keberhasilan kultur. Bahan tanaman sumber eksplan penelitian ini seluruhnya terserang bakteri, sehingga jumlah kultur yang steril dan mampu tumbuh dengan baik sangat sedikit. Pengaruh Pemberian Kinetin Kinetin termasuk dalam kelompok zat pengatur tumbuh sitokinin. Dalam pertumbuhan dan morfogenesis kultur sel, jaringan dan organ, sitokinin berinteraksi dengan zat pengatur tumbuh lain, terutama auksin.
19
Auksin yang digunakan dalam penelitian ini adalah 2,4-D. Menurut Gunawan (1988), kinetin (sitokinin) dapat merangsang pembelahan dan diferensiasi sel membentuk tajuk, sedangkan auksin berperan dalam pemanjangan sel dan terlibat dalam morfogenesis membentuk akar (Zaerr dan Mapes, 1985). Dengan adanya kinetin pembesaran dan pemanjangan sel diimbangi dengan pembelahan sel sehingga sel menumpuk membentuk kalus. Setiap bahan tanaman mempunyai kebutuhan yang berbeda akan auksin dan kinetin, baik jumlah maupun jenisnya. Secara umum penambahan 0,5 mg/l kinetin cenderung menurunkan prosentase pembentukan kalus, sebaliknya meningkatkan proliferasi sel (tabel 3). Tabel 3. Pengaruh pemberian kinetin terhadap tingkat proliferasi, penampakan dan warna kalus. Perlakuan
Tingkat proliferasi kalus
Penampakan kalus
Warna kalus
Tanpa kinetin
+++
Segar-padat
Putih kecoklatan
Kinetin
++++
Segar-padat
Putih kecoklatan
Keterangan: +++ : baik ++++ : baik sekali
Menurut Soesilawati (1993) dalam medium yang mengandung 6 mg/l 2,4-D, pertumbuhan kalus tebu dengan kinetin 0,7 mg/l lebih rendah dibandingkan tanpa kinetin, tetapi meningkat lagi pada perlakuan kinetin 1,0 mg/l dan 1,2 mg/l. Sedangkan Hutajulu (1993) mengemukakan bahwa konsentrasi kinetin 0,0-0,5 mg/l yang dipadukan dengan 6 mg/l 2,4-D, dapat merangsang pembentukan kalus tebu sebesar 100%. Rendahnya prosentase pembentukan kalus pada penelitian ini diduga karena sel-sel eksplan yang tidak sehat daya hidupnya menurun. Secara umum auksin konsentrasi tinggi yang dikombinasi dengan kinetin konsentrasi rendah dapat mendorong proliferasi sel dan pembentukan kalus. Kalus yang terbentuk pada semua perlakuan tidak berhasil membentuk embryo somatik. Embryo somatik tidak berasal dari zigot tetapi dari sel somatik tanaman. Frekuensi pembentukan embryo somatik dapat ditingkatkan dengan mengubah konsentrai zat pengatur tumbuh, nitrogen dan bahan tanaman. Secara umum medium MS memadahi untuk mendorong embryogenesis somatik karena kandungan amonium, nitrat dan kalsiumnya cukup tinggi (Evans dkk., 1981). Kombinasi auksin dan kinetin yang tepat dapat menstimulasi embryogenesisi somatik. Ketidakmampuan kalus membentuk embryo somatik dalam penelitian ini diduga kerena sel eksplan tidak sehat sehingga kemampuan tumbuhnya rendah. Hutajulu (1993) dan Soesilawati (1993) melaporkan pemberian kinetin menurunkan pembentukan embryo somatik kultur tebu.
BioSMART Vol. 1, No. 1, April 1999, hal. 15-21
20
Pengaruh Radiasi Sinar Gamma Radiasi sinar gamma dilakukan dengan sumber ion 60Co. Aktifitas isotop 60Co yang digunakan sebesar 365,7826 Currie, dengan laju dosis sebesar 29,81453 Krad tiap jam. Dosis radiasi yang digunakan 20 Gay atau 2 Krad dan diharapkan masih mampu merangsang pembentukan kalus tebu. Menurut Soesilawati (1993) pada radiasi dosis rendah (20-30 Gay), kalus tebu masih dapat hidup. Dosis radiasi yang tepat antara satu jenis tanaman dengan jenis lain berbeda. Pada tabel 4 terlihat bahwa radiasi sinar gamma dengan dosis 20 Gay, menurunkan prosentase kalus yang terbentuk dibandingkan dengan tanpa radiasi (kontrol).
menurunkan jumlah kultur yang mampu membentuk kalus. Meskipun demikian perbedaannya sangat kecil. Dari 50 kultur, dengan perlakuan pemindahan ke medium segar, hanya dua kultur yang mampu membentuk kalus. Sedangkan pada perlakuan tanpa pemindahan, kalus terbentuk pada tiga kultur. Medium kultur yang digunakan sebagian besar terdiri dari air. Dengan adanya radiasi berenergi tinggi, partikel-partikel bermuatan, proton atau elektron, dilepaskan dan ditangkap medium. Peristiwa tersebut menyebabkan terbentuknya senyawa peroksida (H2O2) yang bersifat racun. Handro (1981) dan Novak (1991) menyarankan agar eksplan yang sudah diradiasi segera dipindahkan ke medium segar untuk menghindari senyawa beracun tersebut.
Tabel 4. Pengaruh radiasi sinar gamma terhadap kemampuan pembentukan kalus.
Tabel 6. Pengaruh pemindahan eksplan ke medium segar setelah radiasi, terhadap pembentukan kalus dan tingkat proliferasi kalus.
Perlakuan Radiasi
Jumlah kultur Jumlah kultur berkalus 100 5
Tanpa radiasi (kontrol)
50
13
Kultur berkalus 5
Perlakuan
Waktu inisiasi (minggu ke)
Jumlah kultur
Jumlah kultur berkalus
Tingkat proliferasi
26
Dengan pemindahan
4-7
50
2
+
Tanpa pemindahan
3-5
50
3
+ s/d +++
Pengaruh lain yang dapat diamati adalah lamanya waktu inisiasi kalus dan rendahnya tingkat proliferasi sel kalus pada kultus yang diradiasi (tabel 5). Tabel 5. Pengaruh radisi sinar gamma terhadap waktu inisiasi dan tingkat proliferasi kalus Perlakuan
Waktu inisiasi (minggu ke)
Tingkat proliferasi kalus
Radiasi
3-7
+ s/d +++
Tanpa radiasi
2-3
+++ s/d ++++
Keterangan: + : kurang +++ : baik ++++ : baik sekali
Kemampuan eksplan membentuk kalus dipengaruhi kondisi sel-sel eksplan, medium kultur dan lingkungan. Pemberian radiasi sinar gamma dengan dosis 20 Gay ternyata tidak dapat mendorong pembentukan kalus dan proliferasi sel. Hal ini diduga terjadi karena sel-sel eksplan lemah akibat infeksi patogen dan perlakuan sterilisasi yang terlalu kuat, sehingga daya tumbuhnya menurun. Sebagian besar eksplan yang ditanam menunjukkan gejala mengering dan mati, sedangkan eksplan yang masih hidup mampu membentuk kalus dengan penampakan segar, padat dan berwarna putih sampai putih kecoklatan. Pengaruh Pemindahan Eksplan ke Medium Segar Ekspan yang telah diradiasi, sebagian dipindahkan ke medium segar dan sebagian tetap dibiarkan pada medium semula. Dalam tabel 6 terlihat bahwa pemindahan eksplan ke medium segar cenderung
Keterangan: + : kurang +++ : baik
Dalam penelitian ini pemindahan eksplan ke medium segar cenderung mengurangi kemampuan kultur mem-bentuk kalus. Selain frekuensi pembentukan kalus lebih kecil, tingkat proliferasinya juga lebih rendah. Kalus dari eksplan yang tidak dipindahkan ke medium segar dapat berproliferasi dengan lebih baik. Tumbuhan memiliki enzim katalase di seluruh sel, yang sampai batas tertentu mampu menguraikan hidrogen peroksida menjadi air dan oksigen (Prawiranata dkk., 1981), maka jika dalam medium terbentuk senyawa peroksida akibat radiasi, peroksida yang terserap sel akan diuraikan enzim katalase, sehingga tidak meracuni tanaman. Rusaknya komponen medium karena radiasi (radiolisis) tidak selalu berakibat buruk terhadap pertumbuhan kultur. Degani (1975 dalam Callinawan dan Halos, 1981) berhasil mengisolasi myo-inositol dari medium yang sudah diradiasi sinar gamma dan senyawa tersebut tetap mampu menginduksi pembentukan tunas. Spegel-Roy dan Kochba (1973 dalam Howlan dan Harp, 1977) mengemukana bahwa pembentukan embryo somatik dapat diinduksi oleh radiasi sinar gamma. Radiasi dapat diberikan pada medium saja atau medium dan eksplan. Jika hanya pada eksplan, maka tidak terjadi induksi embryo somatik. Thrope (1982) mengemukakan bahwa subkultur dapat menghilangkan atau mengurangi kemampuan regenerasi sel tanaman. Karena terjadi perubahan tingkat ploidi sel yang biasanya menjadi poliploid dan/atau aneuploid.
SOLICHATUN – Radiasi Sinar Gamma pada Tebu
Perlakuan tanpa pemindaan eksplan ke medium segar akan mengurangi frekuensi subkultur, sehingga diharap-kan daya regenerasi dan tingkat proliferasi sel dapat dipertahankan. Selain itu kalus yang berasal dari eksplan yang tidak dipindahkan ke medium segar dapat diinisiasi lebih cepat, karena tidak mengalami stres. Dalam penelitian ini pemindahan eksplan ke medium segar mengurangi tingkat pembentukan kalus dan proliferasi sel. Untuk itu pemindahan eksplan ke medium segar setelah diradiasi sebaiknya tidak dilakukan. KESIMPULAN Secara umum radiasi sinar gamma 20 Gay menurunkan produksi kalus dan memperlambat waktu inisiasi. Pemindahan ekspan tanaman tebu yang telah diradiasi sinar gamma ke medium segar menurunkan kemampuan pembentukan kalus. Pemberian kinetin 0,5 mg/l yang dipadu dengan 6,0 mg/l 2,4-D menurunkan prosentase pembentukan kalus, meskipun menaikkan tingkat proliferasi sel. DAFTAR PUSTAKA Anonim, 1982, Deskripsi Varietas Tebu Unggul M 442-51 (BZ 148). Pasuruan: Offset BP3G. Benson, L. 1957. Plant Classification. Boston: D.C. Head & Co. Bhojwani, S.S. dan M.K. Razdan. 1983. Plan Tissie Culture: Teory and Practice. Amsterdam: Elsevier Science Publishing Co. Inc. Callinawan, N.M. dan S.C. Halos. 1981. Short Development Callus Production and Root Induction of Narra (Pterocarpus indicus Willd.) as Affected by Culture Medium and Irradiation. Sylvatrop Phillip. For. Res. J. 6 (4): 165-179. Djojosoebagio, S. 1988. Dasar-dasar Radioisotop dan Radiasi dalam Biologi. Bogor: PAU Bioteknologi IPB. Evans, D.A., W.R. Sharp, dan C.E. Flick. 1981. Growth and Behaviour of cell Cultures: Embryogenesis and Organogenesis. Dalam P.A.Thorpe (ed.). Plan Tissue Culture Method and Application in Agriculture. New York: Academic Press. Gao, M.W., X.Y. Cheng dan Z.Q. Liang. 1991. Effect of In Vitro Mutagenesis on the Frequency of Somaclonal Variation in Wheat. Plan Mutation for Crop Improfement. Proceeding of an International Symposium on the Contribution of Plant Mutation Breeding to Crop Improvement, IAEA and FAO, Vienna 18-22 June 1990. Vol. 2. George, E.F. dan P.D. Sherrington. 1984. Plant Propagation by Tissue Culture Handbook and Directory of Commercial Laboratories Basingstocke: Exegetics Ltd. Gunawan. L.W. 1988. Teknik Kultur Jaringan. Bogor: PAU Bioteknologi.
21
Handro. W. 1981. Mutagenesis and In Vitro Selection. Dalam T.A.Thrope (ed.). Plant Tissue Culture, Method and Applications in Agriculture. New York: Academik Press. Heinz, D.J., M. Krisnamurthi, L.g. Nickell dan A. Maretzki. 1977. Cell Tissue and Organ Culture in Sugar Improvement. Dalam J. Reinert dan Y.P.S. Bajaj (ed.). Applied and Fundamental Aspects of Plant Cells, Tissue and Organic Culture. Berlin: Springer Verlag. Hutajulu. S. 1993. Peningkatan Toleransi Kalus Embryogenik Tebu Varietas BZ 148 Terhadap Herbisida Glifosfat Melalui Teknik Kultur Jaringan. Laporan Masalah Khusus. Bogor: Jurusan Biologi FMIPA IPB. Howlan, G.P. dan R.W. Harp. 1977. Radiation Biology of Cultures Plant Cell. Dalam J. Reinert dan Y.P.S. Bajaj (ed.). Applied and Fundamental Aspects of Plant Cells, Tissue and Organic Culture. Berlin: Springer Verlag. Jans-Orn, J., S. Chotechen, A. Kornthong, P. Poosri dan K. Janboomi. 1991. Experience in Using Irradiation for The Breeding of Field Crops. Plant Mutation Breeding for Crop Improvement: Proceeding of an International Symposium on the Contribution of Plant Mutation Breeding to Crop Improvement, IAEA and FAO, Vienna 18-22 June 1990. Vol. 2. Krishnamoorthy, H.N. 1983. Growth Subtances, Including Applications in Agriculture. New Delhi: Tata McGraw-Hill. Liu, M.C. 1981. In Vitro Methods Applied to Sugar Cane Improvement. Dalam T.A. Thrope (ed.). Plant Tissue Culture, Method and Applications in Agriculture. New York: Academik Press. Mac Donal, M.V., I. Ahmad, J.D.M. Menten dan D.S. Ingram. 1991. Haploid Culture and In Vitro Mutagenesis (UV light, X-rays and Gamma Rays) of Rapid Cycling Brassica Naplus for Improved Resistance to Disease. Plant Mutation Breeding for Crop Improvement. Proceeding of an International Symposium on the Contribution of Plant Mutation Breeding to Crop Improvement, IAEA and FAO, Vienna 18-22 June 1990. Vol. 2. Murashige, T. dan F. Skoog. 1962. A Revised Medium for Rapid Growth and Bioassays with Tobacco Tissue Cultures. Physiology Plant 15: 473-497. Negrutiu, I. 1990. In Vitro Mutagenesis. Dalam P.J. Dix (ed.). Plant Cell Line Selection. Weinheim: WCH Novak, F.J. 1991. In Vitro Mutation System for Crop Improvement. Plant Mutation Breeding for Crop Improvement: Proceeding of an International Symposium on the Contribution of Plant Mutation Breeding to Crop Improvement, IAEA and FAO, Vienna 18-22 June 1990. Vol. 2. Prawiranata, W., S. Harran dan P. Tjondronegoro. 1981. Dasardasar Fisiologi Tumbuhan. Bogor: Departemen Botani IPB. Semangun, H. 1989. Penyakit-penyakit Tanaman Perkebunan di Indonesia. Yogyakarta: Gadjah Mada University Press. Soesilowati, C. 1993. Penggunaan Radiasi Sinar Gamma dalam Usaha Peningkatan Toleransi Tanaman Tebu (Saccharum officinarum L.) terhadap Herbisida Glifosfat. Laporan Masalah Khusus. Bogor: Jurusan Biologi FMIPA IPB. Thrope, T.A. 1982. Callus Organisation and de novo Formation of Short Root and Embryos In Vitro. Dalam D.T. Tomes, B.E. Ellis, P.M. Harney, K.J. Kasha dan R.L. Petersen (ed). Application of Plant Cell and Tissue Culture to Agriculture and Industry. Canada: University of Guelph. Wattimena, W.A. 1992. Bioteknologi Tanaman. Bogor: PAU Bioteknologi IPB. Zaerr, J.B. dan M.O. Mapes. 1985. Action of Growth Regulators. Dalam J.M. Bonga dan D.J. Durzan (ed.). Tissue Culture in Forestry. Dordrecht: Martinus Nijhoff.
