PENGARUH PENAMBAHAN BAKTERI Azospirillum brasilense DALAM KULTUR CAMPURAN TERHADAP PERTUMBUHAN Chlorella vulgaris Andri Ary Al Asy’ari1,Anondho Wijanarko2 dan Herman Suryadi3 1
Teknik Kimia, Fakultas Teknik, Universitas Indonesia, Depok 16424, Indonesia 2 Riset Grup Teknik bioproses, Departemen Teknik Kimia, Fakultas Teknik, Universitas Indonesia, Depok 16424, Indonesia 3 Riset Grup Kimia Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Indonesia, Depok 16424, Indonesia E-mail:
[email protected]
Abstrak Permasalahan utama yang banyak dihadapi dalam penelitian dengan tujuan mengkaji potensi mikroalga adalah sulitnya mendapatkan densitas mikroalga dalam jumlah yang besar. Salah satu penyebabnya adalah faktor nutrien dalam media. Bakteri pemfiksasi nitrogen A. Brasilense dapat diaplikasikan dalam kultivasi Chlorella vulgaris dalam kultur campuran. Penggunaan bakteri pemfiksasi nitrogen untuk peningkatan pertumbuhan pada tanaman tingkat tinggi merupakan hal yang sering dilakukan. Pada penelitian ini, digunakan media BG-11 dan M-838 untuk C. vulgaris dan A. brasilense yang dikultivasi dalam tabung L berukuran 10 mL selama 5 hari dengan OD awal 0,2. Dari penelitian ini didapatkan hasil bahwa dengan perbandingan NC. vulgaris : NA.brasilense 1:1 memberikan hasil yang paling optimal untuk menunjang pertumbuhan C. vulgaris dengan nilai laju petumbuhan spesifik (µ) sebesar 0,088 per hari.
Abstract The main problems encountered in many studies with the aim of assessing the potential of microalgae is difficult to get the density of microalgae in large numbers. One reason is the factor of nutrient in media. Nitrogen-fixing bacterium A. brasilense can be applied in the cultivation of Chlorella vulgaris in a mixed culture. The use of nitrogen-fixing bacteria for growth promotion in higher plants is often performed. In this research, use of BG-11 and M-838 media for C. vulgaris and A.brasilense were cultivated in a 10 mL L-tube for 5 days with initial OD 0,2. From this research showed that the ratio of NC. vulgaris : NA.brasilense 1:1 gives the most optimal result to support the growth of C. vulgaris with a spesific value around growth rate (µ)0,088 per day. Key words : Chlorella vulgaris, Azospirillum brasilense, nitrogen-fixing, mixed culture
1. Pendahuluan Kegiatan eksplorasi terhadap manfaat mikroalga sudah banyak dilakukan untuk berbagai macam tujuan penelitian, diantaranya penentuan kandungan logam berat dan pencemar di perairan laut, studi tentang kandungan kimia, energi terbarukan, dan mitigasi gas karbondioksida (Chisti, 2007). Salah satu jenis mikroalga yang sering digunakan untuk berbagai tujuan tersebut adalah Chlorella sp., salah satu jenis alga hijau.
al. (2003), biomassa hasil panen dari kultivasi mikroalga hanya berkisar 0,1% berdasarkan berat keringnya. Hal ini membuat proses pemisahan biomassa mikroalga terhadap mediumnya menjadi sulit dan mahal. Untuk memenuhi sumber nitrogen yang merupakan unsur penting dalam peningkatan pertumbuhan Chorella sp. selain dari tambahan langsung kedalam media, dapat dilakukan dengan alternatif menambahkan jenis bakteri yang dapat memfiksasi nitrogen kedalam kultur media Chlorella sp., sehingga bisa mengurangi penambahan unsur N ke dalam media. Penggunaan bakteri untuk peningkatan pertumbuhan pada tanaman tingkat tinggi
Permasalahan utama yang banyak dihadapi dalam penelitian dengan tujuan mengkaji potensi mikroalga tersebut adalah sulitnya mendapatkan densitas mikroalga dalam jumlah yang besar. Menurut Rocha et
1 Pengaruh penambahan..., Andi Ary Al Asy;Ari, FT UI, 2013.
merupakan hal yang sering dilakukan (Bashan dan Holguin, 1998).
medium awal, tetapi stok yang mengandung unsur N tidak dimasukkan.
Beberapa mikroba yang bersifat nonpatogenik dan nonsimbiotik yang efektif menambat nitrogen dari udara dapat hidup dalam berbagai ekosistem di alam. Sebagian bakteri tersebut dapat diisolasi dari daerah perakaran tanaman hortikultura. Salah satu jenis bakteri yang dapat memfiksasi nitrogen adalah Azospirillum sp., bakteri ini hidup bebas dalam tanah di sekitar akar dan permukaan akar tanaman dan mampu menyediakan unsur N dan P bagi pertumbuhan tanaman (Widawati, 2011).
2.3.3 Perangkaian Peralatan. Merangkai reaktor dengan pipa gelas, tutup semi permeabel, selang silikon & filter, lakukan sterilisasi dengan autoklaf, menyambungkan dengan flowmeter dan kompresor & sediakan lampu halogen.
Mengingat komersialisasi pemanfaatan mikroalga selalu berkaitan dengan tingkat efisiensi, efektivitas, dan nilai ekonomi proses produksinya, maka penelitian yang berkaitan dengan penggunaan bakteri pemfiksasi nitrogen dalam kultur campuran mikroalga dalam skala laboratorium perlu dilakukan. Dalam penelitian ini jenis bakteri yang digunakan adalah Azospirillum brasilense dan jenis mikroalganya adalah Chlorella vulgaris, kedua organisme tersebut akan ditumbuhkan dalam kultur campuran. Dengan adanya penelitian ini diharapkan dapat dilihat pengaruhnya terhadap tingkat pertumbuhan mikroalga Chlorella vulgaris.
2.3.5 Pre-culture Mikroalga. Mencampurkan kultur murni bakteri dengan M-838 steril, masukkan 1 mL kedalam medium agar, inkubasi pada 28 oC selama 20 jam dalam inkubator. Mengambil sejumlah koloni bakteri kedalam 50 ml M-838 100 mL, tutup tabung dengan tutup semi permeabel & simpan selama 5 hari dala suhu ruang.
2.3.4 Pre-culture Mikroalga. Mencampurkan 2,5 mL kultur murni C. vulgaris & 250 mL BG-11, alirkan udara 250 mL/menit & penerangan minimum, lakukan sampai didapat stok yang banyak.
2.4 Pembiakan Kultur Campuran Mikroalga dan Bakteri. Mencampurkan mikroalga dan bakteri masingmasing dalam BG-11 modifikasi dan M-838 modifikasi, masukkan 10 mL kultur mikroalga dan bakteri masingmasing ke dalam 5 tabung L & tutup dengan penutup semi permeabel. Buat variasi perbandingan volume mikroalga : bakteri 1:1; 2:1: 1:2, serta kontrol mikroalga dan bakteri masing-masing dalam 5 L-tube untuk dianalisis selama 5 hari.
2. Metode Penelitian 2.1 Bahan Penelitian. Bahan baku yang digunakan dalam penelitian ini adalah starter Chlorella vulgaris NIES-227, Starter Azospirillum brasilense NBRC 102289, Medium BG-11, M-838, BG-11 termodifikasi dan M-838 termodifikasi, gas asetilen dan etilen standar.
2.5 Tahap Pengujian. Pengujian yang akan dilakukan adalah Acetylene Reduction Assay (ARA), Optical Density (OD) dan perhitungan jumlah sel dengan Haemositometer
2.2 Alat yang Digunakan. alat yang digunakan adalah fototobioreaktor transparan berbentuk huruf L kapasitas 10 ml dengan penutup yang terbuat dari sponge, fotobioreaktor transparan berbentuk tabung reaksi dengan kapasitas 80 ml serta erlemeyer kapasitas 250 ml dan 500 ml yang masing-masing dilengkapi dengan aliran input udara, kompressor, flowmeter, lampu Philip Hallogen 20W, selang silikon, autoklaf, spektrofotometer, dan GC-TCD.
2.5.1 Pengujian ARA (Modifikasi dari Holguin, et al., 1992). Masukkan 1 mL sampel dari kultur campuran kedalam tabung inkubasi 10 mL, tutup dengan penutup silikon, mengambil 10% udara dalam tabung & injeksikan 10% gas asetilen, inkubasi 30 menit, ambil 1 mL sampel gas dalam tabung & injeksikan ke GC. Jumlah etilen yang dihasilkan oleh satu sel ekuivalen dengan jumlah etilen yang dihsilkan per 10 mL kultur per jumlah sel yang ada dalam kultur.
2.3 Tahap Persiapan. Pada tahapan ini dilakukan sterilisasi peralatan, pembuatan medium, perangkaian alat, dan pre-culture alga dan bakteri.
2.5.2 Pengujian OD. Masukkan 3 ml BG-11 modifikasi ke kuvet sebagai blanko dan 3 mL kultur campuran sebagai sampel, mengukurukur pada absorbansi 680 nm & 480 nm.
2.3.1 Sterilisasi Peralatan. mengikuti metode yang telah dilakukan oleh Herdiana (2011). 2.3.2 Pembuatan Medium. A. BG-11, larutan stok 1-6 dilarutkan dalam 100 mL akuades, diambil 5 mL dari semua stok, kecuali stok 4 sebanyak 0,5 mL dimasukkan kedalam erlenmeyer 500 mL, kemudian diautoklaf. B. M-838, mencampurkan semua bahan dalam aquades 500 mL, kemudian autoklaf. C. BG-11 & M-838 modifikasi, cara pembuatan sama dengan
2.5.3 Pengukuran Haemositometer. Mengambil satu tetes sampel dengan pipet, teteskan pada haemositometer & tutup dengan preparat, hitung jumlah sel dengan mikroskop pada pembesaran 100x.
2 Pengaruh penambahan..., Andi Ary Al Asy;Ari, FT UI, 2013.
2.6 Tahap Analisis dan Evaluasi. Hal yang akan di analisa pada penelitian ini adalah pengaruh penambahan bakteri pemfiksasi nitrogen Azospirillum brasilense terhadap pertumbuhan mikroalga Chlorella vulgaris, dan untuk menentukan perbandingan volume mikroalga dan bakteri yang memberikan pengaruh lebih baik terhadap pertumbuhan mikroalga Chlorella vulgaris. Parameter yang dilakukan pengukuran adalah jumlah sel mikroalga dalam kultur campuran. Jumlah sel mirkoalga Chlorella vulgaris yang ditumbuhkan dalam kultur campuran dengan menggunakan Azspirillum brasilense dengan tiga variasi perbandingan volume, dihitung dan dibandingkan. Setelah dilakukan analisis tersebut, maka dapat dievaluasi dan dapat ditentukan perbandingan volume mikroalga dan bakteri mana yang memberikan pengaruh lebih baik terhadap pertumbuhan mikroalga Chlorella vulgaris
3. Hasil dan Pembahasan 3.1. Pengujian Acetylene Reduction Assay (ARA). Pengujian dilakukan secara kualitatif, yaitu untuk membuktikan apakah benar bakteri yang digunakan merupakan bakteri yang dapat memfiksasi nitrogen. Hasil pengujian yang dilakukan adalah sebagai berikut :
Gambar 2. Hasil pengujian kultur murni A. brasilense Dari pengukuran kultur murni A. brasilense didapatkan kromatogram pada Gambar 2 dengan peak etilen yang tidak terlalu tinggi dengan waktu retensi 2,213. Sehingga dari hasil pengujian ARA ini dapat dipastikan bakteri yang digunakan dapat memfiksasi nitrogen, hal ini ditandai dengan dihasilkannya gas etilen setelah dilakukan inkubasi. 3.2. Pengukuran Optical Density (OD). Pada penelitian ini, pengukuran OD mikroalga Chlorella vulgaris dilakukan pada panjang gelombang 680 nm menggunakan spektrofotometer dengan blanko medium BG-11. Pengukuran OD bakteri Azospirillum brasilense dilakukan pada panjang gelombang 480 nm menggunakan spektrofotometer dengan blanko medium M-838. Pengukuran OD pada kultur campuran dapat dilakukan karena kedua kultur murni mikroalga dan bakteri diukur pada panjang gelombang yang relatif jauh, yaitu 680 nm untuk mikroalga dan 480 nm untuk bakteri. Blanko yang digunakan pada pengujian ini adalah medium BG-11 termodifikasi untuk mengukur OD mikroalga dan medium M-838 termodifikasi untuk mengukur OD bakteri pada kultur campuran.
Gambar 1. Hasil kromatogram gas etilen standar Kromatogram etilen standar ini digunakan sebagai pembanding hasil yang didapatkan dari pengukuran kultur murni bakteri. Waktu retensi gas etilen standar terbaca pada 2,220.
Dari data pengukuran OD dapat dibuat kurva pertumbuhan mikroalga dan bakteri terhadap waktu kultivasi.
3 Pengaruh penambahan..., Andi Ary Al Asy;Ari, FT UI, 2013.
ln Cv : Ab 3:0
Cv : Ab 1:2
Cv : Ab 1:1
Cv : Ab 2:1
µ(t-to)
NCv : Ab (cell/mL)
6
10 5 9 10 5 8 10 5 7 10 6 10
5
5 10
5
4 10
5
3 10
5
2 10
5
0
1
2
3
4
5
t (d)
Gambar 3. Kurva pertumbuhan C. vulgaris
Berdasarkan pada Gambar 3 dapat dilihat bahwa pada setiap variasi perbandingan volume C. vulgaris (Cv) : A. brasilense (Ab), mikroalga C. vulgaris tumbuh dengan baik pada tabung L. Keberadaan bakteri pemfiksasi nitrogen A. brasilense pada kultur campuran tidak menghambat pertumbuhan mikroalga, tetapi membantu meningkatkan pertumbuhan mikroalga.
Gambar 4. Kurva µ Cv versus perbandingan jumlah sel C. vulgaris : A. brasilense Dari Gambar 4 diketahui bahwa nilai laju petumbuhan spesifik (µ) yang optimum adalah pada perbandingan NChV : NAzB 1:1, yaitu sebesar 0,088 per hari. Tingginya laju pertumbuhan spesifik pada perbandingan 1:1 dikarenakan berimbangnya jumlah mikroalga dan bakteri dalam kultur campuran, sehingga suplai dan ketersedian sumber nitrogen menjadi terpenuhi untuk C. vulgaris.
Pertumbuhan mikroalga yang optimum dalam penelitian ini adalah pada perbandingan Cv:Ab 1:1. Dengan keberadaan bakteri pemfiksasi nitrogen, meskipun mikroalga yang digunakan berada dalam medium yang tidak mengandung sumber nitrogen (BG-11 termodifikasi), proses pembentukan klorofil dan fotosintesis masih dapat berlangsung dengan baik. Hal ini dikarenakan selama kultivasi, bakteri A. brasilense memproduksi sumber nitrogen untuk mikroalga.
10
NCv : Ab (cell/mL)
Pada perbandingan mikroalga:bakteri 1:2 dan 2:1, pertumbuhan mikroalga menjadi lebih lambat bila dibandingkan dengan pertumbuhan mikroalga pada perbandingan 1:1. Pada perbandingan 1:2 dan 2:1, Keterbatasan nutrisi menyebabkan pertumbuhan bakteri menjadi terhambat. Hal ini menyebabkan suplai nitrogen untuk mikroalga menjadi terhambat sehingga pertumbuhan mikroalga menjadi terhambat. Untuk mengetahui berapa konstanta laju pertumbuhan spesifik (µ) pada setiap perbandingan kultur campuran C. vulgaris (Cv) : A. brasilense (Ab) maka dapat dibuat persamaan
10
10
9
10
8
10
7
10
6
10
5
0
Cv : Ab 0:3
Cv : Ab 1:1
Cv : Ab 2:1
Cv : Ab 1:2
1
2
3
4
5
t (d)
Gambar 5. Kurva pertumbuhan A. brasilense
4 Pengaruh penambahan..., Andi Ary Al Asy;Ari, FT UI, 2013.
Perbandingan mikroalga dan bakteri pemfiksasi nitrogen yang memberikan hasil optimal adalah pada perbandingan NCv:NAb 1:1 yang disebabkan oleh tersedianya jumlah N yang cukup dan seimbang untuk menunjang pertumbuhan C. vulgaris
Pada Gambar 5 terlihat bahwa pada setiap perbandingan, pertumbuhan bakteri A. brasilense mengalami kenaikan pertumbuhan. Terjadinya penurunan hanya pada perbandingan 0:3 ini kemungkinan disebabkan oleh dominannya jumlah bakteri dalam media, yang otomatis juga akan lebih cepat menghabiskan sumber nutrisi.
Nilai laju petumbuhan spesifik (µ) pada perbandingan NCv:NAb 1:1 sebesar 0,088 per hari, merupakan nilai µ paling tinggi jika dibandingkan dengan rasio 1:2 dan 2:1
A. brasilense lebih cepat tumbuh dalam medium yang mengandung malate dan laktosa sebagai sumber karbon. Dalam kultur campuran, mikroalga melakukan proses fotosintesis dan menghasilkan sumber karbon glukosa dalam jumlah yang kecil. Semakin lama kandungan glukosa dalam kultur campuran semakin meningkat sedangkan kandungan malate dalam kultur campuran menjadi semakin menurun.
Sedangkan nilai laju petumbuhan spesifik (µ) untuk pertumbuhan bakteri adalah pada perbandingan 1:2, yaitu sebesar 0,081 per hari. Hal ini dikarenakan jumlah perbandingan bakteri yang lebih besar dan lebih banyak dibandingkan perbandingan 2:1 dan 1:1
Daftar Referensi [1] Bashan, Y., Levanony. H. 1996. Current status of Azospirillum inoculation technology: Azospirillum as a challenge for agriculture. Can. J. Microbiol. [2] Chisti, Y. 2007. Biodiesel from Microalgae. Biotechnology Advance. [3] Doboreiner, Baldani, and Reis. 1988. Endophytic occurrence of diazotrophic in non-leguminous crops. In: Azospirillum VI and related microorganisms. [4] Herdiana, Cynthia. 2011. Studi Komparasi Teknik Pemecahan Dinding Sel Pada Ekstraksi Lipid Mikroalga Chlorella vulgaris Buitenzorg . Universitas Indonesia. [5] Holguin G., Bashan Y. 1992. Two new nitrogenfixing mangrove trees; their isolation, identification and in vitro interactions with rhizosphere Staphylococcus sp. FEMS Microbiology Ecology. [6] Rocha, L. A. 1994. Microalgae : Field and Market. Copeia 201. [7] Widawati, S. 2011. The role of phosphate solubilizing bacteria and freeliving nitrogen fixing bacteria on the growth and adptation of Gmelina arborea Roxb. Grown on degraded land., J. Environ. Engineering, vol. 7.
Gambar 6. Kurva µ Ab versus perbandingan Nchlorella vulgaris : NAzospirillum brasilense Dari Gambar 6 diketahui nilai laju petumbuhan spesifik (µ) yang optimum ada pada perbandingan NchV : NAzB 1:2, yaitu sebesar 0,081 per hari. Hal ini dikarenakan jumlah perbandingan bakteri yang lebih besar dan lebih banyak dibandingkan perbandingan lainnya. Walaupun pada perbandingan 0:3 mempunyai jumlah bakteri terbanyak, dikarenakan nutrisi dalam media yang tidak dapat mencukupi untuk jumlah bakteri yang banyak pula.
4. Kesimpulan Chlorella vulgaris dapat tumbuh dengan baik walaupun tanpa tambahan unsur N dalam media, sumber N didapat dari Azospirillum brasilense yang dapat memfiksasi nitrogen
5 Pengaruh penambahan..., Andi Ary Al Asy;Ari, FT UI, 2013.
