PEMANFAATAN HEWAN KELINCI UNTUK PEMBUATAN ANTISERUM MONOSPESIFIK K99 UNTUK DIAGNOSIS KOLIBASILOSIS PADA ANAK SAPI DI LABORATORIUM Djaenuri dan Nina Kumiasih Balai Penelitian Veteriner Bogor
PENDAHULUAN Galur Escherichia coli penyebab diare pada anak-anak sapi dan babi serta pada manusia mempunyai 2 faktor virulensi . Salah satu faktor tersebut dinamakan pilus (kata jamak dari pili) . Pili ini merupakan tonjolan atau appendages dari dinding sel bakteri berupa "benang halus protein", sexing disebut juga antigen fimbriae . Antigen ini sebagai alat bagi organisme tersebut untuk menempel pada permukaan mukose usus (Alstad dkk., 1981) . Faktor virulensi yang lain ialah enterotoksin tahan panas atau heat-stable toksin . E .coli yang mempunyai antigen perlekatan K99 dan bersifat enterotoksigenik merupakan penyebab utama diare neonatal pada anak sapi atau kolibasillosis neonatal (Orskov dkk., 1975) . Pada kesempatan ini dikemukakan teknik pembuatan antiserum monospesifik K99 pada kelinci untuk deteksi antigen pili dari isolat E.coli dari anak sapi penderita diare . PEMBUATAN ANTIGEN PILI Dalam pembuatan antiserum spesifik K99 diperlukan isolat acuan E . coli yang sudah diketahui serotypenya, sebagai contoh E. coli Compton K12K99 (IMVS 998), didapat dari Institute of Medical and Veterinary Science (IMVS), Adelaide Australia . Antigen pili K99 dapat diproduksi secara in-vitro dibawah kondisi laboratorium . E . coli ditumbuhkan pada media agar Mac Conkey, diinkubasikan pada suhu 37°C . Setelah inkubasi dipilih koloni yang halus dan diinokulasikan pada media agar Minca + Iso Vitalex (Minca + Is) dan diinkubasikan pada suhu 37 °C selama satu malam (Guinee dkk., 1976) . Kultur tersebut diperbanyak dengan cara menginokulasikannya pada media agar Minca + Is yang disiapkan dalam cawan petri dan diinkubasikan seperti sebelumnya . Sel bakteri yang tumbuh pada agar dibilas dengan larutan garam NaCI phisiologis 0,85 % yang mengandung formalin 0,1 % . Suspensi sel kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 3500 rpm pada suhu 4 ° C selama 30 menit . Endapan sel dicuci dengan larutan garam NaCI phisiologis sebanyak 179
Lokakarya Fungsional Non Penelili
2 kali . Sel diperoleh kembali dengan cara sentrifugasi dan dibuat suspensi sel dalam larutan garam NaCI phisiologis dengan kepekatan sel setara dengan tabung kekeruhan Mac Farland nomer 10, dibuat sebanyak 20 ml . Suspensi sel diuji sterilitasnya dengan cara meneteskan suspensi sel pada media agar darah dan diinkubasikan pada suhu 37 ° C selama satu malam . Bila tidak terdapat pertumbuhan maka suspensi sel yang diuji steril . Selanjutnya suspensi sel tersebut disimpan pada suhu 4 ° C sampai saat diperlukan untuk diinokulasikan pada kelinci . PENYUNTIKAN PADA KELINCI Suspensi antigan yang sudah dipersiapkan disuntikan pada kelinci secara subkutan dengan dosis 0,2 ml, empat had kemudian disuntik lagi dengan dosis 0,5 ml, selanjutnya kelinci disuntik secara intra vena (vena kuping bagian tepi) dengan dosis 0,25 ml, 0,5 ml, 1,0 ml dan 2,0 ml pada interval empat hari . Satu minggu setelah disuntik terakhir, darah kelinci diambil, serum dipisahkan dan disimpan pada suhu -20°C sampai perlakuan berikutnya . PEMBUATAN ANTISERUM MONOSPESIFIK K99 Untuk menghilangkan antibodi yang tidak diinginkan (bukan antibodi K99), serum kelinci yang diperoleh diabsorbsi dengan antigen dari galur E. coli K99 yang homolog (IMVS 998) ditumbuhkan pada media nutrien agar kemudian diinkubasikan pada suhu 18 ° C selama 3 had (Sjoka, 1965) . Media agar nutrien dalam botol Roux diinokulasi dengan galur E. coli yang homolog dan diinkubasikan pada suhu 18°C selama 3 had . Setelah inkubasi sel bakteri dibilas dengan larutan garam NaCI phisiologis yang mengandung formalin 0,1%, disimpan dalam lemari es satu malam . Suspensi sel tersebut disentrifugasi dengan kecepatan 3500 rpm pada suhu 4 °C selama 30 menit . Endapan sel ditambah 10 ml antiserum yang sudah dibuat sebelumnya . Kemudian dikocok dengan alat pengocok (vortex) beberapa saat, diinkubasikan pada suhu 37° C selama satu jam, dilanjutkan pada suhu 4 ° C selama satu malam . Keesokan harinya disentrifugasi seperti sebelumnya . Supernatan yang jernih (antiserum) dipisahkan secara aseptik dan disimpan dalam botol-botol steril . Serum diuji dengan serotype E.coli yang homolog dan yang heterolog yang ditumbuhkan pada media agar Minca + Is pada suhu inkubasi 18 ° C dan 37°C . Apabila serum masih mengaglutinasi suspensi sel yang ditumbuhkan pada suhu 18 ° C, proses absorbsinya diulang, sampai tidak terjadi aglutinasi dengan sel tersebut, tetapi menunjukkan reaksi aglutinasi dengan sel yang diinkubasikan pada suhu 37 ° C .
1 80
Lokakarya Fungsiona! Non Pen&iiti
PEMBUATAN REAGEN STAPHYLOCOCCAL KOAGLUTINASI Bakteri Staphylococcus aureus Cowan I dipakai untuk pembuatan reagen koaglutinasi, galur tersebut diperoleh dari IMVS yang disimpan di unit kultur koleksi Balai Penelitian Veteriner, Bogor, dalam bentuk kering beku . Setelah diaktifkan dalam media cair trypticase soy broth (TSB), diinkubasikan pada suhu 37°C selama satu malam, kemudian diinokulasikan lagi pada media agar trypticase soy (TSA), yang disiapkan dalam botol Roux, diinkubasikan pada suhu 37°C selama satu malam . Pembuatan suspensi sel staphylococcus untuk reagen koaglutinasi mengikuti cara prosedur yang ditulis oleh Honda dkk, 1983, dengan modifikasi yang disesuaikan dengan kondisi laboratorium (Supar,1986) . Setelah inkubasi satu malam, kedalam biakan bakteri dalam botol Roux tersebut ditambahkan larutan PBS sebanyak 25 ml, didiamkan se ;lama 5-7 menit, kemudian sel bakteri dipanen (dapat dipercepat dengan memakai bola-bola gelas steril) . Suspensi sel disentrifugasi pada kecepatan 3000 rpm pada suhu 4 °C selama 10 - 15 menit . Endapan suspensi dicuci dengan larutan PBS sebanyak tiga kali dengan cara disentrifugasi seperti sebelumnya . Endapan disuspensikan dengan larutan PBS yang mengandung formalin 0,5%, didiamkan pada suhu kamar selama tiga jam sambil setiap kali dikocok dengan hati-hati . Sel dicuci tiga kali seperti sebelumnya . Endapan sel disuspensikan dalam larutan PBS, sehingga konsentrasi sel terakhir 10 % (volume sel/volume PBS) . Sampai pada tahap ini sel dapat disimpan pada suhu 4°C sampai perlakuan berikutnya . Suspensi sel dipanaskan dalam penangas air pada suhu 80 ° C selama satu jam kemudian didinginkan, dan disentrifugasi pada kecepatan 3000 rpm . Endapan sel dilarutkan dalam larutan PBS sehingga konsentrasi sel terakhir 10 % . Satu tetes larutan sodium azide 10% ditambahkan kedalam setiap 2 ml suspensi sel staphylococcus dan disimpan pada suhu 4 ° C . Tahap berikutnya suspensi sel staphylococcus direaksikan dengan antiserum monospesifik yang telah disiapkan sebelumnya . Sebanyak 0,9 ml suspensi sel staphylococcus (Protein A) 10 % ditambah 0,1 ml antiserum monospesifik K99 yang dihasilkan dari proses absorbsi, kocok perlahan-lahan dan biarkan dalam suhu kamar 28 ° C selama tiga jam, setiap setengah jam dikocok perlahan-lahan . Reagen koaglutinasi ini sebelum dipakai terlebih dahulu diuji sensifitasnya terhadap suspensi pili dari galur E. coli yang sudah diketahui serotypenya . Reagen koaglutinasi yang sudah siap dipakai ini dapat disimpan dilemari es, tahan sampai beberapa bulan . Sedangkan antiserum monospesifik dapat disimpan dalam freezer pada suhu -20°C . Uji sensitifitas seperti proses absorbsi terhadap galur yang homolog dan heterolog yang ditumbuhkan pada suhu 18°C dan 37°C (Tabel 1) .
1 81
Lokakarya Fungsional Non Peneliti Tabel 1 . Sensitivitas dan spesifisitas reagen koaglutinasi K99 terhadap galur acuan dan galur lapangan Escherichia coli enterotoksigenik Reagen Koaglutinasi K99
Reaksi aglutinasi galur E . coli Acuan/ Isolat lapang
Media
Suhu 37°C Suhu 18°C
IMVS 998 (K99)
Minca+Is
+++
B41 (K99F41)
Minca+Is
+++
B117 (K99)
Minca+Is
+++
G7 (K88ab)
Minca+Is
+++
G205 (K88ac)
Minca+Is
B1413 (K99) babi
Minca+Is
TDF IA
Minca+Is
TDF 2910
Minca+Is
BAR 2018
Minca+Is
BAR 2049
Minca+Is
Y1153 (F41) sapi
Minca+Is
R55 (F41) babi
Minca+Is
M987P (987P)
Minca+Is
Keterangan +++
reaksi aglutinasi kuat - : tidak terjadi aglutinasi
Sumber : (Supar, 1990)
PENGGUNAAN ANTISERUM MONOSPESIFIK K99 Antiserum monospesifik dapat digunakan untuk diteksi antigen pill K99 dengan cara aglutinasi cepat . Tiap isolat E. coli yang akan diuji harus ditanam pada media agar Minca + Is miring dan di inkubasikan pada suhu 37°C selama satu malam . Tiap kultur diperiksa secara aglutinasi . Satu ose suspensi sel E . coli yang diambil dari media agar Minca + Is miring yang diemulsikan dengan larutan garam NaCI physiologis pada gelas benda, dicampur dengan satu ose reagen coaglutinasi, kemudian digoyang-goyang selama beberapa detik (30 60 detik) . Bila terjadi reaksi aglutinasi atau terjadi gumpalan-gumpalan halus
1 82
Lokakarya Fungsional Non Peneiti
yang semakin lama semakin banyak dan semakin kasar ini menunjukkan reaksi positif K99, bila tidak ada aglutinasi maka isolat yang diuji negatif K99 . KESIMPULAN DAN SARAN Reagen koaglutinasi K99 memberikan reaksi setelah dilakukan dengan semua E .coli yang mempunyai pili K99 balk galur acuan dari IMVS 998 yang sudah diketahui serotypenya maupun beberapa isolat galur lapangan . Reagen koaglutinasi dapat disimpan dalam lemari es beberapa bulan dan slap dipakai sewaktu-waktu, sedangkan antiserum monospesifik dapat disimpan dalam freezer pada suhu -20 °C dan siap dipakai sewaktu-waktu bila diperlukan . Sebaiknya penyimpanan antiserum monospesifik dikemas dalam botol-botol kecil dengan volume yang kecil sehingga terhindar dari proses pencairan dan pembekuan berulang kali . DAFTAR BACAAN Alstad, A . D ., K . Fischer, J . Kienholls and D . Krogh, 1981 . Evaluation of various methods for the detection of enteropathogenic Escherichia coli in sourcing calves . North Dakota farm Research . 38 : 7 - 9 . Guinee, P . A . M ., J . Veldkam and W . H . Jansen . 1977 . Improved Minca medium for the detection of K99 antigen in calf enterotoxigenic strains of Escherichia coli. Infect. Immun . 15 : 676 - 678 . Honda, T ., R . Samakoses, C . Somchai, Y . Takeda and T . Miwatani . 1983 . Detection by staphylococcal co-agglutination test of heat-labile enterotoxin producing Escherichia coli. J. Clinic. Microbiol. 17 : 592 595 . Orskov, I ., F . Orskov H . W . Smith and W . J . Sojka . 1975 . The establishment of K99 thermolabile Escherichia coli K antigen, previously called Kco possessed by calf K Iamb enteropathogenic strains . Actapathol. Microbiol. Scand. B . 83 : 31 - 36 . Supar . 1986 . Studi tentang Escherichia coli entertoksigenik pada anak sapi dan anak babi . Isolasi dan identifikasi Escherlchia coli K99 dan K88 . Thesis Magister Sains, fakultas Pasca Sarjana . Institute Pertanian Bogor . Supar. 1990 . Enteric colibacilosis in pigs (and calves) in Indonesia . PhD Thesis, James Cook University of North Queensland, Townville, Australia .
1 83
