PÉCSI TUDOMÁNYEGYETEM
Biológiai Doktori Iskola
Dobrava-Belgrade hantavírusok gyakorisának felmérése Apodemus rágcsálókban molekuláris biológiai és szerológiai módszerek együttes alkalmazásával
PhD értekezés
NÉMETH VIKTÓRIA
PÉCS, 2013
PÉCSI TUDOMÁNYEGYETEM
Biológiai Doktori Iskola
Dobrava-Belgrade hantavírusok gyakorisának felmérése Apodemus rágcsálókban molekuláris biológiai és szerológiai módszerek együttes alkalmazásával PhD értekezés
NÉMETH VIKTÓRIA
Témavezető: Dr. Jakab Ferenc egyetemi docens
Témavezető aláírása
Iskolavezető aláírása
PÉCS, 2013
Tartalomjegyzék Rövidítések jegyzéke ....................................................................................... 3 1. Bevezetés....................................................................................................... 5 2. Irodalmi áttekintés ...................................................................................... 6 2.1. Történeti áttekintés ..................................................................................................... 6 2.2. A hantavírusok általános jellemzői............................................................................. 7 2.3. Hantavírus fertőzés lefolyása rágcsálókban ............................................................... 9 2.4. Hantavírus fertőzés lefolyása emberben ................................................................... 12 2.7. Európában cirkuláló hantavírusok ............................................................................ 15 2.8. Magyarországon cirkuláló hantavírusok .................................................................. 17 2.9. Laboratóriumi diagnózis ........................................................................................... 18 2.9.1. Szerológiai tesztek ............................................................................................. 18 2.9.2. Molekuláris vizsgálatok..................................................................................... 19
3. Célkitűzések ............................................................................................... 20 4. Anyagok és Módszerek ............................................................................. 21 4.1. Vizsgálati minták ...................................................................................................... 21 4.2. Virális RNS kivonása ............................................................................................... 22 4.3 Rekombináns antigén előállítása ............................................................................... 22 4.3.1. Expressziós konstrukció .................................................................................... 22 4.3.1.1. Reverz transzkripció, polimeráz láncreakció.............................................. 22 4.3.1.2. Klónozás és transzformálás ........................................................................ 23 4.3.2. Fehérje expresszió ............................................................................................. 25 4.3.3. Sejtek feltárása, fehérjetisztítás, fehérje renaturálás .......................................... 25 4.4. Western blot vizsgálat .............................................................................................. 26 4.5. ELISA vizsgálat ........................................................................................................ 26 4.6. A vírus molekuláris jellemzése................................................................................. 27 4.6.1. RT-PCR reakció ................................................................................................ 27 4.6.2. Szekvenálási reakció ......................................................................................... 27 4.7. Filogenetikai analízis ................................................................................................ 28
5. Eredmények ............................................................................................... 30 5.1. Rágcsálók vizsgálata................................................................................................. 30 5.1.1. Előzetes kísérletek ............................................................................................. 30 5.1.2. Szekvencia és filogenetikai elemzés ................................................................. 30 5.2. Rekombináns DNS technikák alkalmazása .............................................................. 35 5.2.1 Rekombináns fehérje expresszió ........................................................................ 35 5.2.2. Western blot analízis ......................................................................................... 37 5.2.3. ELISA vizsgálatok specificitása és szenzitivitása ............................................. 38 5.2.4. ELISA vizsgálatok eredményei ......................................................................... 40 5.2.5 A DOBV gyakoriságának megállapítása az rRT-PCR és ELISA vizsgálatok eredményei alapján ...................................................................................................... 41 5.2.6 Kitekintés, módszerünk további felhasználási területei ..................................... 42
6. Eredmények megvitatása.......................................................................... 44 6.1. Filogenetikai elemzés ............................................................................................... 45
1
6.2. Rekombináns fehérjék alkalmazása.......................................................................... 48 6.3. Hantavírus fertőzés prevalenciájának megállapítása ................................................ 49
7. Összefoglalás .............................................................................................. 53 8. Summary .................................................................................................... 55 9. Köszönetnyílvánítás .................................................................................. 57 10. Irodalomjegyzék ...................................................................................... 58 11. Saját publikációk jegyzéke ..................................................................... 73
2
Rövidítések jegyzéke Aa Af Ap As ARDS BSA BSL cRNS CTL DAB EDTA ELISA G HCPS HEPES HFRS HLA HPS ICTV IFA IFN IL IPTG IRF KHF Mx2 MxA NE NK NP NPG NS ORF PBS PCR RIG-I rRT-PCR RT SDS TBS TLR TNF
Apodemus agrarius Apodemus flavicollis Apodemus ponticus Apodemus sylvaticus acute respiratory distress syndrome – akut légzési elégtelenség bovine serum albumin biosafety level – biológiai biztonsági szint Complementary RNA – komplementer RNS citotoxikus T-sejt diaminobenzidin etilén-diamin-tetraecetsav enzyme linked immunosorbent assay glikoprotein hantavirus cardiopulmonary syndrome – hantavírus kardiopulmonális szindróma 4-(2-hidroxietil)-1-piperazin-etánszulfonsav hemorrhagic fever with renal syndrome – vérzéses lázzal járó veseszindróma human leukocyte antigen – humán leukocyta antigén hantavirus pulmonary syndrome – hantavírus pulmonális szindróma International Committee on Taxonomy of Viruses – Nemzetközi Vírus Taxonómiai Bizottság immunfluorescence assay – immunfluoreszcens technika interferon interleukin izopropil-β-tio-galaktozid interferon-regulatory factor korean hemorrhagic fever – koreai hemorrhágiás láz Myxovirus (influenza virus) resistance 2 (mouse) myxoprotein A nephropathia epidemica természetes ölősejt nukleokapszidprotein nukleoprotein gén non structural protein open reading frame – nyílt leolvasási keret phosphate buffered saline - foszfát puffer fiziológiás sóval polymerase chain reaction – polimeráz láncreakció retinoic acid-inducible gene 1 Real time RT-PCR reverz transzkripció sodium-dodecyl-sulfate – nátrium-dodecil-szulfát tris buffered salin – tris puffer fiziológiás sóval toll-like receptor – toll-szerű receptor tumor nekrózis faktor 3
reguláló T-sejt tris-(hidroxy-metil)-amino-metán virális RNS World Health Organization – Egészségügyi Világszervezet 5-bromo-4-kloro-indolil-β-D-galaktopiranozid
Treg Tris vRNS WHO X-gal Vírusok ANDV DOBV HTNV NVAV PHV PUUV SAAV SANGV SEOV SNV SWSV TULV
Andes vírus Dobrava-Belgrade vírus Hantaan vírus Nova vírus Prospect Hill vírus Puumala vírus Saaremaa vírus Sangassou vírus Seol vírus Sin Nombre vírus Seewis vírus Tula vírus
Dolgozatomban a betegségek megjelölésére a nemzetközi publikációkban elfogadott angol nevezéktan rövidítéseit használom.
4
1. Bevezetés Napjainban a fertőző betegségek egyre jelentősebb térhódítása figyelhető meg szerte a világon. A kórokozók nagymértékű terjedésének hátterében számos faktort leírtak már, amelyek közül csak egy, a már sokat emlegetett és okolt globális felmelegedés. A tények azt bizonyítják, hogy az emberi civilizáció terjedésével, a modern kor technológiai találmányai és az életminőség javítása érdekében bevezetett vívmányok előnyei sokszor számos veszélyt is rejthetnek magukban. Gondoljunk csak a korlátlan utazási lehetőségekre, ahol egy jól szervezett utazás eredményeként akár 72 óra alatt körberepülhetjük a földgolyót. Csak 2010 szeptemberében, Európa legforgalmasabb repülőterének számító londoni Heathrow-t 6,2 millióan vették igénybe. Az emberi mozgás ilyen mértékű felgyorsulása a fertőző betegségek számára határtalan, emberi erővel szinte megállíthatatlan lehetőségeket biztosítanak újabb- és újabb járványok kialakulására. Természetesen a globális utazás mellet számos tényező vezethet a fertőző betegségek térhódításához, mint például az étkezési szokások megváltozása, a föld lakosságának nagyarányú növekedése, a növekvő urbanizáció és az ezzel járó erdőirtások, területfoglalások. Az „Új és újra támadó fertőzések” (Emerging and Re-emerging Diseases) fogalmát már 1992-ben létrehozta a Világ Egészségügyi Szervezete (WHO). Az elmúlt egy évtizedben is számos ijesztő példát produkált a természet, melyek mindegyike kimeríti az „Újonnan támadó fertőző betegségek” fogalmát. Gondoljunk csak a 2002-es SARS Coronavírus járványra, amely kilenc hónap alatt (2002 novembere és 2003 júliusa között) 37 országon söpört végig, több mint 8000 megbetegedést és közel 800 halálesetet okozva. Néhány évvel ezelőtt, a 2009-ben megjelent négyszeres reasszortáns H1N1 influenza vírus tartotta félelemben a világot. Nem véletlenül, hiszen a járvány 2010 májusára 214 országban megjelent, több mint 18 ezer halálesetet hagyva maga után. Sajnos az újonnan megjelenő fertőző betegségek jelentős része állati eredetű, úgynevezett zoonótikus betegség lehet. Hazánkban is számos virális zoonózis ismert, mint például a Nyugat-nílusi láz vírusa, a kullancsok által terjesztett vírusos agyvelő- és agyhártyagyulladás vírusa, vagy a rágcsálók által terjesztett hantavírusok is. Jelen disszertációban, a hazánkban előforduló fertőző
betegségek
egyik
legveszélyesebb
képviselőjével,
a
Dobrava-Belgrade
hantavírussal végzett szerológiai, molekuláris biológiai és molekuláris filogenetikai vizsgálataink részletes eredményeit mutatom be.
5
2. Irodalmi áttekintés 2.1. Történeti áttekintés A 20. század közepén figyelt fel a világ egy különös fertőző betegségre, ahol az akkor még ismeretlen kórokozó elsősorban a vese parenchyma sejtjeit támadta meg, olykor súlyos vérzéses (hemorrhágiás) tüneteket okozva. A koreai háborúban (1951-1953) több ezer amerikai és koreai katonát érintő járvány tört ki. A kórképet, melynek megfelelő tüneteket Kínában már a 10. században is leírtak, koreai hemorrhágiás láznak (KHF) nevezték el. A kórokozó felfedezése több mint két évtizedet váratott magára, azt azonban sejtették, hogy a terjesztésében rágcsálók játszanak fontos szerepet (Lee, 1982). Ho Wang Lee és munkatársai 1976-ban immunfluorescencia (IFA) segítségével pirók erdeiegér (Apodemus agrarius) tüdőszövetéből mutattak ki specifikus antigént, miután az állatot egy KFH-ban szenvedő beteg savójával immunizálták (Lee és mtsai, 1976). A vírust 1978-ban sikerült izolálni egy, az Észak- és Dél-Korea határán található Hantaan folyó közelében fogott A. agrariusból, és a folyó után Hantaan vírusnak (HTNV) nevezték el (Lee és mtsai., 1978). Ezt követően, 1981-ben tudták szaporítani a HTNV-t human alveoláris epithél sejteken (French és mtsai., 1981), majd patkányokból (Rattus norvegicus, Rattus rattus) izoláltak egy másik vírust, mely a Seoul vírus (SEOV) nevet kapta Dél-Korea fővárosa után (Lee és mtsai., 1982). A WHO 1983-ban fogadta el Gajdusek által a kórképre korábban bevezetett HFRS (hemorrhagic fever with renal syndrome, vérzéses lázzal járó veseszindróma) elnevezést (Gajdusek, 1962). Európában HFRS-szerű betegséget még a 20. század első felében svéd orvosok jegyeztek fel, melyet
később
a megfigyelt veseérintettség miatt
nephropathia
epidemica-nak (NE) neveztek el (Myhrman, 1951). A betegséget okozó ágenst a finnországi Puumala falu közelében fogott vöröshátú erdeipocok (Myodes glareolus) tüdejéből azonosították, így a kórokozó a falu neve után a Puumala vírus (PUUV) nevet kapta (Brummer-Korvenkontio és mtsai., 1980). Az Európában legsúlyosabb kórképet okozó vírust 1992-ben mutatták ki Szlovéniában sárganyakú erdeiegérből (Apodemus flavicollis), illetve az akkori Jugoszláviában egy HFRS-ben szenvedő beteg mintájából. Az új kórokozót a hantavírusok addigi nomenklatúrájának megfelelően a kimutatásának helyei alapján Dobrava-Belgrade vírusnak (DOBV) keresztelték el (Avsic-Zupanc és mtsai., 1992, Gligic és mtsai., 1992).
6
Amerikában az első hantavírust, a Prospect Hill vírust (PHV), közönséges réti pocokból (Microtus pennsylvanicus) izolálták (Lee és mtsai., 1985), majd ezt követően számos vírust sikerült kimutatni több rágcsáló fajból. Az első humán megbetegedést csak 1993-ban regisztrálták az USA délnyugati részén, a Four Corners régióban található indiánrezervátumban. A kórképet hantavírus pulmonalis szindrómának (HPS) nevezték el. A vírust rövid időn belül sikerült azonosítani a járvány helyén fogott szarvasegérből (Peromyscus maniculatus). Kezdetben a kórokozót a Novajo rezervátum közelében lévő Muerto kanyonról nevezték el, azonban az indiánok tiltakozására (mivel a megbetegedést lakhelyükkel azonosították) átnevezték a vírust, mely a Sin Nombre (SNV; jelentése névtelen) nevet kapta (Childs és mtsai., 1994, Nichol és mtsai., 1993). A földrajzi elterjedésük alapján tehát két nagy csoportját különíthetjük el a hantavírusoknak. Egyik az Eurázsiában található óvilági vagy Old World hantavírusok, melyek emberben a HFRS-t okozzák. Fő képviselője Ázsiában a HTNV vírus, míg Európában a DOBV és a PUUV. A másik nagy csoport a HPS-t, újabb nevén hantavírus kardiopulmonáris szindrómát (HCPS) okozó újvilági vagy New World hantavírusok, melynek egyik legjelentősebb tagja a SNV. Szerológiai tanulmányokra alapozva feltételezték a vírus jelenlétét Afrikában is (Saluzzo és mtsai. 1985, Gonzalez és mtsai., 1989, Botros és mtsai., 2004), majd sikerült rágcsálóból (Hylomyscus simus) izolálni a kórokozót (Sangassou vírus, SANGV) (Klempa és mtsai., 2006), mely genetikailag az európai DOBV-hoz áll közel (Klempa és mtsai., 2012a). 2.2. A hantavírusok általános jellemzői A
hantavírusok
Dalrymple, 1983),
a
melynek
Bunyaviridae tagjai
családba
növényeket
tartoznak
(Tospovirus
(Schmaljohn
genus)
és
és
állatokat
(Orthobunyavirus, Hantavirus, Nairovirus és Phlebovirus genus) egyaránt fertőzhetnek. A családban egyedül a hantavírusok átvitele történik ízeltlábú vektor nélkül (Schmaljohn és Nichol, 2007). A hantavírusok 80-120 nm átmérőjű, gömb alakú kórokozók. Három szegmensből álló, negatív egyszálú, kb. 12 kilobázis (kb) hosszúságú genommal rendelkeznek, amely négy fehérjét kódol (Shmaljohn és mtsai, 1986) (1. ábra): Az 1,7-2,0 kb hosszúságú S szegmens kódolja a nukleokapszidproteint (NP) (Schmaljohn és mtsai., 1985). Fertőzött sejtekben az RNS függő RNS polimeráz csak a
7
kapsziddal fedett virális RNS-t ismeri fel, azaz a kapszid jelenléte elengedhetetlen a transzkripció és a replikáció folyamataihoz (Kolakofsky és Hacker, 1991). Az M szegmens (3,6-3,7 kb) kódolja a kettős lipidmembránba ágyazódó GN és GC glikoproteineket (régebbi elnevezéssel G1 és G2 protein), melyeket egy ORF (open reading frame; nyílt leolvasási keret) kódol (Schmaljohn és mtsai., 1987). A transzláció során poliprotein prekurzor termelődik, amit a gazdasejt proteázai hasítanak ketté az endoplazmatikus retikulumban. Feladatuk egyrészt, hogy a célsejt receptoraihoz kapcsolódjanak, másrészt a virion összeépülésének helyét jelölik ki a sejten belül. Az L szegmens (6,5 kb) kódolja az RNS függő RNS polimerázt, melyet multifunkcionális enzimnek is tekinthetünk, hiszen a transzkripció és a replikáció irányításához szükség van endonukleáz, transzkriptáz, replikáz és RNS helikáz aktivitásra (Plyusnin és mtsai, 1996) egyaránt. A hantavírusok szaporodása a célsejtek citoplazmájában, a perinukleáris régióban a következőképpen történik (Schmaljohn és Nichol, 2007): A transzkirpió és a replikáció is a „prime és realign” stratégiát követi. Az RNS szintézis mindkét folyamat során a 3’ végen a harmadik bázisnál kezdődik, majd néhány nukleotid beépülése után a keletkező új szál újra illeszkedik kettő nukleotidot hátracsúszva. Először a negatív szálú virális RNS (vRNS) íródik át mRNS-sé, ami a virionba csomagolt polimeráz és a három virális templát kölcsönhatásával megy végbe. Az ehhez szükséges oligonukleotidok a gazdasejt mRNS-ének 5’ végének (metilált 5’ cap) hasításából származnak. Az N és L mRNS a citoplazma szabad riboszómáin transzlálódik, az M mRNS transzlációja az endoplazmatikus retikulumban történik, ahol a GN és GC heterodimert formál, majd glikozilációja a Golgi komplexbe jutva befejeződik. A transzkripcióval ellentétben a replikációhoz nincs szükség oligonukleotidra. A folyamatban az RNS polimeráz templátként a vRNS-t használja a komplementer RNS (cRNS) elkészítéséhez, melynek hosszúsága megegyezik a vRNS hosszával. A virion összeépülése a Golgi membránján történik, ahonnan leválva vezikulába csomagolva transzportálódik a membrán felé, majd exocitóziassal jut ki a gazdasejtből. Az újvilági, valamint a PUUV és Tula vírusoknál (TULV) megfigyelhető, hogy az S szegmensről keletkező mRNS-nek két átfedő ORF-je van, melyek az NP-n kívül egy nem strukturális proteint (NS) kódolnak, ami az interferon válaszban játszik szerepet (Jääskelainen és mtsai, 2007, Jääskelainen és mtsai, 2008).
8
1. ábra. A hantavírus-genom szerkezete S= S (small) szegment, M= M (medium) szegment, L= L (large) szegmens (Klempa 2004).
Mindhárom RNS szegmensnek nem kódoló konszenzus 3’ vége van, míg az 5’ végeken
ezekkel
komplementer
szekvenciák
találhatók.
Ezek
hozzák
létre
bázispárosodással a nem kovalensen zárt cirkuláris RNS-eket (Hewlett és mtsai., 1977). Az NP, az RNS szegmensek és az RNS polimeráz molekulák közösen alkotják a ribonukleoprotein komplexeket (Goldsmith és mtsai., 1995, Obijeski és mtsai., 1976), melyeket lipid kettősréteg vesz körül, amibe a GN és GC glikoproteinek ágyazódnak be heterodimert alkotva. A vírus érzékeny a hőhatással (30 perc, 60ºC), detergensekkel és 70%-os etonollal szemben. Szobahőmérsékleten a sejtkultúrából származó kórokozó 5-11 napig, 4ºC-on 18 napig marad fertőzőképes, míg rágcsálók testváladékaiban ez legalább 12-15 nap is lehet. A
vírus
megőrzi
fertőzőképességét
egy
órás,
56ºC-os
szárítás
után
is
(Kallio és mtsai., 2006). 2.3. Hantavírus fertőzés lefolyása rágcsálókban A hantavírusok fő terjesztői a Rodentia renden belül a Muridae családból a Murinae alcsalád, valamint a Cricetidae családból az Arvicolinae és Sigmodontinae alcsalád képviselői. Az utóbbi évtizedben a Soricomorpha rendbe tartozó cickány-félék (Soricidae) (Klempa és mtsai., 2007, Song és mtsai., 2007a, Song és mtsai., 2007b, Arai és mtsai., 2007, Kang és mtsai., 2009a) és vakond-félék (Talpidae) (Arai és mtsai., 2008, Kang és mtsai., 2009b, Kang és mtsai., 2011) családjának tagjaiban is sikerült kimutatni 9
hantavírusokat. A legújabb felfedezést azonban a denevérek (Chiroptera rend) terjesztette hantavírusok képezik (Sumibcay és mtsai., 2012, Weiss és mtsai., 2012) (2. ábra). Az állatokkal való kapcsolat évmilliókra nyúlhat vissza, ami koevolúcióra utalhat. A gazdaspecifitáson túl előfordulhat átfertőződés, ha a rágcsálók elterjedési területei átfednek egymással (Schlegel és mtsai., 2009, Zou és mtsai., 2008, Weidmann és mtsai., 2005).
2. ábra. A hantavírusok részleges (414 nukleotid) L szegmensén alapuló, maximumlikelihood filogenetikai fa. Cickányok, denevér és vakond-félék által terjesztett vírusok: ALTV: Altai vírus, ARRV: Ash River, ARTV: Artybash, ASAV: Asama, AZGV: Azagny, CBNV: Cao Bang, JMSV: Jemez Springs, KKMV: Kenkeme, MGBV: Magboi, MJNV: Imjin, NVAV: Nova, OXBV: Oxbow, RPLV: Camp Rimpley, SWSV: Seewis, TGNV: Tanganya, TPMV: Thottapalayam. Rágcsálók által terjesztett vírusok: ANDV: Andes, CHOV: Choclo, DOBV: Dobrava-Belgrade, HTNV: Hantaan, LNV: Laguna Negra, MAPV: Maporal, PUUV: Puumala, RIOMV: Rio Mamore, SANGV: Sangassou, SEOV: Seoul, SERV: Serang, SNV: Sin Nombre, SOOV: Soochong, TULV: Tula, VALV: Vladivostok (Weiss és mtsai., 2012)
A vírus az állat vizeletében, székletében és nyálában egyaránt megtalálható, ezek vaporizációjával, és harapással terjed a rágcsálók között, illetve így kerülhet az ember
10
szervezetébe is (Glass és mtsai., 1988, Kariwa és mtsai., 1998, Hutchinson és mtsai., 2000, Hinson és mtsai., 2004). Mivel az állatokat nem betegíti meg a vírus, azok tünetmentesen hónapokig, akár életük végéig is üríthetik a kórokozót (Bernstein és mtsai., 1999). A rágcsálókban a fertőzés lefolyása a következő: a kezdeti akut fázis illetve a virémia után a vírus a célszervekben (tüdő, vesék, lép, béltraktus, nyálmirigyek) nagymértékben szaporodik, majd a replikáció jelentős mértékben lecsökken, viszont folyamatos marad, annak ellenére, hogy a vírus ellenes antitestek ekkor már nagy mennyiségben jelen vannak az állat szervezetében (3. ábra).
3. ábra. Hantavírus fertőzés lefolyása a rágcsálókban az antitest válasz és a vírus titer tükrében. Piros görbe: virémia, zöld vonal: vírus a nyálban, kék: vírus a tüdőben, fekete: anti-hantavírus IgG (Easterbrook és Klein 2008).
A vírus vertikálisan nem terjed a rágcsálók között (Taruishi és mtsai, 2008). Életük első heteiben az anyai antitestek révén kapnak védettséget a fertőzéssel szemben, ami vagy in utero vagy a szoptatás idején kerül a szervezetbe (Zhang és mtsai., 1988, Dohmae és mtsai., 1993, Dohmae és Nishimune, 1998, Bernstein és mtsai., 1999). A megbetegedések száma értelemszerűen nagymértékben függ a rágcsálók számától. Mérsékelt éghajlaton ezt főleg a táplálék mennyisége és a hőmérséklet befolyásolja (Clement és mtsai., 2009).
11
Hasonlóan más zoonózisokhoz, a hantavírusok is perzisztensen fertőzik a természetes gazdáikat (Meyer és Schmaljohn, 2000), amit bizonyos immunfolyamatok tesznek lehetővé. Neutralizáló antitestek és a T-sejtek védik a rágcsálókat a halálos fertőzéstől. Míg akut fázisban a CD8+ sejtek magas számban vannak jelen, addig a perzisztens fázisban lecsökken a mennyiségük. A fertőzés perzisztálásának ez az egyik kulcs tényezője (Araki és mtsai., 2004). A perzisztáló szakaszban ezen kívül emelkedik a regulátor T-sejt (CD4+CD25+FoxP3+Treg) és a TNF-β szint (Easterbrook és mtsai., 2007, Schountz és mtsai., 2007). A Treg gátolja a proinflammatorikus és az effektor T-sejt választ a fertőzés helyén (Belkaid, 2007). Laboratóriumi kísérletekben és a természetes populáció vizsgálatakor is kimutatták, hogy a hímek fogékonyabbak a fertőzésre, mint a nőstény állatok (Bernstein és mtsai., 1999, Klein és mtsai., 2001). A különböző nemi hormonok adhatnak magyarázatot erre a különbségre (Klein és mtsai., 2002). Kontrollcsoportokkal összehasonlítva, az ivarszervek eltávolításakor a nőstény patkányoknál magasabb SEOV RNS szintet mutattak ki a tüdőben, a hímeknél viszont csökkenést tapasztaltak (Hannah és mtsai., 2008). Másrészt a viselkedésbeli különbség is lehet a dimorfizmus oka (Hinson és mtsai., 2004, Klein és mtsai., 2004). A veleszületett immunitásban is mutatkozik különbség a hímek és nőstények között. A nőstények tüdejében a mintázatfelismerő receptorok (TLR-7, RIG-I, IRF-7), antivirális (Mx2, INF-α/β) és proinflammatorikus faktorok (TNF-α, IL-1) nagyobb mennyiségben szintetizálódnak, mint a hím rágcsálóknál (Hannah és mtsai., 2008, Easterbrook és Klein, 2008). A virális RNS, illetve a virális antigének legnagyobb mennyiségben az állat tüdőszövetéből mutathatóak ki. 2.4. Hantavírus fertőzés lefolyása emberben A vírus számára az ember zsákutcát jelent, habár Argentínában az Andes vírus (ANDV) esetében már leírtak emberről emberre történő fertőzést (Padula és mtsai., 1998) is, míg Finnországban egy anya fertőzhette meg csecsemőjét anyatejes táplálás útján (Brummer-Korvenkontio és mtsai., 1999). Legújabb kutatás eredményeként kimutatták, hogy a vírus vertikálisan nem terjed méhen belül anyából a magzatba (Hofmann és mtsai., 2012). Meg kell említeni még, hogy néhány vírus, például a TULV fertőz ugyan embereket, azonban humán megbetegedéssel nem hozható egyértelműen összefüggésbe (Schultze és mtsai., 2002, Vapalathi és mtsai, 1996).
12
A hantavírusok három kórképet okozhatnak: HFRS, NE, HCPS. HFRS esetében a betegség lefolyása változatos lehet. Előfordulhat tünetmentes fertőzés, de sok esetben végződik halállal a megbetegedés. A legsúlyosabb tüneteket a HTNV és DOBV fertőzések esetében írtak le. A halálozás elérheti a 5-10%-ot is. Az átlagosan 9-14 napos inkubációs időszak után, a súlyos HFRS lefolyása öt stádiumra bontható: 1. fázis: lázas fázis, melyben elsősorban influenza szerű tüneteket mutat a beteg: hirtelen magas láz, fejfájás, izomfájdalom, valamint hasi és deréktáji fájdalom jelentkezik. Hányinger, hányás, hasmenés is előfordulhat. 2. fázis: hypotensiv (alacsony vérnyomás) stádium, ami proteinuriával (fehérjevizelés) társul, valamint a látászavar és a kettőslátás is gyakori. Ennek a fázisnak az időtartama igen változó lehet, néhány órától egészen napokig is elhúzódhat. 3. fázis: a vizelet mennyisége csökken (oliguria) vagy teljesen elapad (anuria) és ekkor jelentkeznek a hemorrhagiás manifesztációk. Conjunctivalis vérzés, lágyszájpadi petechiák (pontszerű vérzések) szinte mindig megfigyelhetők. Az arc és a felső mellkasfél kipirulása jellegzetes, ezt követően a hirtelen vérnyomásesés, a pulzusszaporulat életveszélyes állapotot okoz. A kialakult veseelégtelenség miatt az esetek egy részében hemodialízist kell alkalmazni a beteg életének megmentése érdekében. A veseelégtelenség következtében az addigi hypotensio hirtelen hypertoniába (magas vérnyomás) vált. Ritkán akut légzési elégtelenség (ARDS), agyoedema, encephalopathia, tüdőoedema komplikálhatja a kórképet. 4. fázis: a vesefunkció normalizálódása miatt erre a szakaszra bő vizeletürítés (poliuria) jellemző. 5. fázis: a lábadozás (reconvalenscens) szakasza, ami hetekig, akár hónapokig is eltarthat. A legtöbb NE fertőzés lefolyása enyhe, viszont néhány esetben kórházi kezelésre is szükség lehet. A fent említett öt szakasz általában nem különíthető el élesen a kórlefolyás alatt. Előfordulhat a tüdő és az idegrendszer érintettsége is (Alexeyev és Morozov, 1995, Linderholm és mtsai., 1992, Linderholm és mtsai., 1997) A HCPS esetében, a kezdeti általános, influenzára emlékeztető tünetek után jelentkeznek a légúti szimptómák (Duchin és mtsai., 1994, Moolenaar és mtsai., 1995, Mertz és mtsai., 2006, Peters és mtsai., 1999, Zaki és mtsai., 1995). Enyhe köhögés a kezdeti szakasz utolsó napján kezdődik. Szapora pulzus, szapora légzés, alacsony vérnyomás lép fel, valamint a tüdők felett szörcszörej hallatszik. Ezt követően igen 13
gyorsan, tüdőoedema alakul ki. A kapillárispermeabilitás hirtelen fokozódik, ami valószínűleg nem kimondottan a vírus sejtkárosító hatásának következménye, hanem sokkal inkább immunmediált folyamat. Amennyiben a beteg túléli a tüdőoedemát, a légúti tünetek rendkívül gyorsan megszűnnek, amivel egy időben poliuria indul meg, ami az egyik közös tünet a HFRS-sel (Zaki és mtsai., 1995, Duchin és mtsai., 1994, Nolte és mtsai., 1995). Májnecrosis és vesekárosodás komplikálhatja a kórképet, valamint veseelégtelenség is előfordul, de sohasem olyan súlyos, mint a HFRS-nél. A halálozási arány a 20-50%-ot is elérheti. A fertőzés kezelése csak tüneti, Európában a megelőzésre az egyetlen hatásos mód, a rágcsálókkal való kontaktus kerülése. Kínában és Koreában formalinnal inaktivált HTNV oltóanyagot (Hantavax®) használnak 1990 óta, amit Európában az akkori jugoszláv hadsereg is alkalmazott a délszláv háborúban. Kínában ezen kívül bivalens HTNV és SEOV vakcinát fejlesztettek. Ezen oltóanyagok hatásosságát azonban megkérdőjelezik (Park és mtsai., 2004). Legújabb eredményeket e téren az M szegmensen alapuló HTNV és PUUV DNS vakcinák (Boudreau és mtsai., 2012), valamint az úgynevezett SHP vakcina (SEOV, HTNV és PUUV kombinált DNS vakcina) szolgáltatja (Zhao és mtsai., 2012). A vírus pathogenezisének vizsgálatát nehezíti, hogy a betegség folyamatának tanulmányozásához
nincs
megfelelő
állatmodell.
Laboratóriumi
egerek,
szíriai
aranyhörcsög (Mesocricetus auratus), közönséges makákó (Macaca fascicularis) vagy közönséges csimpánz (Pan troglodytes) fertőzésével ugyan folynak kísérletek, azonban ezek az állatok nem alkalmasak a betegség általános vizsgálatára (Hooper és mtsai., 2001, Milazzo és mtsai., 2002). Az in vivo kísérletek mellett különböző sejtkultúrákat is használnak a pathogenezis in vitro tanulmányozására. A kapilláris permeabilitás fokozódása és a trombocitopénia jellemző mindhárom kórképre. A vírus fő támadáspontját a vaszkuláris endothelsejtek képezik a vesékben, lépben és tüdőben. Ezen kívül dendritikus sejteket és makrofágokat is fertőznek. A felszíni glikoproteinek segítségével a gazdasejt sejtfelszíni receptoraihoz kötődve klatrin-függő endocitózissal jutnak be a citoplazmába (Jin és mtsai., 2002). Pathogén vírusok a sejt β3 integrinjeihez, míg a nem pathogének a β1 integrinekhez kapcsolódnak (Gavrilovskaya és mtsai., 1998). Az eltérő pathomechanizmus egyik magyarázata ez is lehet. A β 1 receptorral szemben, a β3 integrinen keresztül az interferon válasz, ezáltal bizonyos antivirális fehérjék (MxA, IFN-α, IFN-β) termelése és a természetes ölősejtek (NK) aktiválása késleltetve indul el (Geimonen és mtsai., 2002, Kraus és mtsai., 2004, Spiropoulou és mtsai., 2007), így a pathogén vírusok könnyen és gyorsan szaporodhatnak. 14
Hantavírus fertőzéskor a citokinek és kemokinek (IFN-γ, TNF-α, IL-1α, IL-1β, IL-2 és IL-6) olyan nagy mennyiségben termelődnek, hogy tovább növelik az endothel permeabilitását (Linderholm és mtsai., 1996, Sadeghi és mtsai., 2011). A komplement rendszer alternatív és klasszikus útvonala is aktiválódik. PUUV fertőzéskor kimutatták, hogy megemelkedik a szolubilis C5b-9 membránkárosító komplex mennyisége, és a C4d/C4 arány a súlyosabb NE esetében jelentősen magasabb, mint a betegség enyhe lefolyásakor (Paakkala és mtsai., 2000). Ennek megfelelően a hemorrhágiás tünetek kialakulásáért a vírus direkt sejtkárosító hatása, valamint a vírusfertőzés indukálta immunreakciók együttesen tehetők felelőssé. A humorális immunválasz során az NP és a glikoproteinek ellen az immunglobulinok (Ig)
valamennyi
típusa
termelődik
(Lundkvist és
mtsai.,
1993).
A
celluláris
immunválaszban a legnagyobb mennyiségben a citotoxikus CD8+ T-sejtek (CTL) vannak jelen, amik a vírusfertőzött sejtek eltávolítását végzik, ezzel tovább fokozva a permeabilitást (Hayasaka és mtsai., 2007, Terajima és mtsai., 2007). Bizonyos HLA haplotípussal rendelkező személyek fogékonyabbak a fertőzésre. A HLA B8-DRB1*03 allélokat hordozóknál jelentősen nagyobb esély van a súlyos NE kialakulására (Mäkelä és mtsai., 2002, Mustonen és mtsai., 2004). A HLA-B*3501 komoly tünetekkel hozható összefüggésbe mind az SNV (Kilpatrick és mtsai., 2004), mind a DOBV fertőzés esetén (Korva és mtsai., 2011). Viszont a HLA-B*27 (Mustonen és mtsai., 1998) és HLA-DRB1*03 (Korva és mtsai., 2011) allél esetében enyhe lefolyást mutat a PUUV fertőzés. 2.7. Európában cirkuláló hantavírusok Európában a DOBV, PUUV, Saaremaa (SAAV), TULV és SEOV van jelen. Évente több ezer hantavírus okozta megbetegedést regisztrálnak a kontinensen (Heyman és mtsai., 2011,). A SEOV főként Ázsiában jellemző, azonban hordozói, a R. rattus és R. norvegicus, kozmopoliták, így feltételezhető, hogy Ázsián kívül is fellelhetők. Európában eddig SEOV okozta megbetegedést nem jelentettek, azonban Portugáliában sikerült SEOV elleni antitesteket kimutatni patkányokból (Filipe és mtsai., 1991), valamint Franciaországban és Belgiumban vándorpatkányból mutattak ki virális RNS-t (Heyman és mtsai., 2004, Heyman és mtsai., 2009a). A TULV-t először 1994-ben mutatták ki Oroszországban mezei pocokból (Microtus arvalis) és Microtus rossiaemeridionalisból (Plyusnin és mtsai., 1994). Ezt követően 15
Dél-Európát kivéve számos országban sikerült izolálni a kórokozót, főleg mezei pocokból (Bowen és mtsai., 1997, Heyman és mtsai., 2002, Reusken és mtsai., 2008, Sibold és mtsai., 1999, Song és mtsai., 2004). A vírus terjesztői közé tartozik még a csalitjáró pocok (Microtus agrestris) és a közönséges földipocok (Microtus subterraneus) is (Korva és mtsai., 2009, Scharninghausen és mtsai., 2002, Song és mtsai., 2002). Jelenleg nincs tudomásunk humán megbetegedésről, szerológiai tesztekkel azonban már mutattak ki humán mintákban specifikus antitesteket TULV ellen (Klempa és mtsai., 2003b, Mertens és mtsai., 2011). Európában a legelterjedtebb és a legtöbb humán fertőzést okozó hantavírus a PUUV, köszönhetően annak, hogy hordozója, a vöröshátú erdeipocok Európa nagy részén megtalálható. Különösen Oroszországban és Finnországban magas a regisztrált esetek száma, 1996 és 2007 között csak Finnországban 9599 ember betegedett meg PUUV fertőzés következtében (Makary és mtsai., 2010), így itt a teljes lakosságra nézve a vírus szeroplevalenciája az 5%-ot is eléri (Heyman és mtsai., 2009b). A vírusnak több leszármazási vonala van, ami tükrözi a rágcsáló posztglaciális vándorlásait. Ezek alapján megkülönböztetünk közép-európai, Alpok-adriai, dán, dél-skandináv, észak-skandináv, finn, orosz és lett vonalat (Escutenaire és mtsai., 2001, Heiske és mtsai., 1999, Lundkvist és mtsai., 1998, Plyusnina és mtsai., 2006, Razzauti és mtsai., 2009, Razzauti és mtsai., 2012, Sironen és mtsai., 2001). Évekkel ezelőtt kezdődött kutatók között a DOBV taxonómiáját érintő vita (Clement és mtsai., 2003, Plyusnin és mtsai., 2006a, Sjölander és mtsai., 2002). Az Észtországhoz tartozó Saaremaa szigeten pirók erdeiegérből (Apodemus agrarius) mutattak ki egy Dobrava vírushoz genetikailag nagyon hasonló kórokozót, a SAAV-t (Plyusnin és mtsai, 1997, Nemirov és mtsai., 1999). Kezdetben ezt a vírust a DOBV egy genetikai variánsának tekintették. A későbbiekben a Nemzetközi Vírus Taxonómiai Bizottság (ICTV) a SAAV-t a hantavírusok külön szubtípusának nyilvánította. Kutatók egy része feltételezi azonban, hogy nem minden A. agrarius által terjesztett és Közép-Európában detektált vírus SAAV. Szerintük a DOBV három leszármazási vonallal rendelkezik a hordozó rágcsálófajtól függően (4. ábra): Európa-szerte az A. flavicollis a természetes gazdája a vírusnak (DOBV-Af), Kelet-, és Közép-Euróbában az A. agrarius (DOBV-Aa), míg a Kaukázus területén az Apodemus ponticus hordozza a kórokozót (DOBV-Ap) (Klempa és mtsai., 2008). DOBV-Af okozta fertőzések Dél-Európában, különösen a Balkánon dominálnak. Oroszországban a DOBV-Aa fertőzés a jellemző (Klempa és mtsai., 2008, Dzagurova és mtsai., 2009). 16
B
A
C
4. ábra. A Dobrava-Belgrade hantavírust terjesztő rágcsálók és elterjedési területeik: (A) Apodemus flavicollis, (B) Apodemus agrarius, (C) Apodemus ponticus
2.8. Magyarországon cirkuláló hantavírusok Hazánkban jellemzően a DOBV és PUUV szerotípusok cirkulálnak, és okoznak humán megbetegedéseket. Első alkalommal Scharninghausen és munkatársai izoláltak hantavírus RNS-t Magyarországon. Taszár mellett, a NATO által használt területen fogtak be rágcsálókat, és kettő A. agrariusból sikerült kimutatni a kórokozót, ami genetikailag a DOBV-hez ált közel (Scharninghausen és mtsai., 1999). Az első átfogó vizsgálatban 1992 és 2000 között mintegy 20 különböző emlős fajt teszteltek szerológiai és molekuláris módszerekkel. A minták 7,25%-a tartalmazott anti-hantavírus antitesteket, és a virális nukleinsav vizsgálata is PUUV és DOBV genotípusok jelenlétét igazolta (Ferenczi és mtsai., 2003, Ferenczi és mtsai., 2005). Plyusnina és munkatársai szerológiai és
17
molekuláris vizsgálatokkal alátámasztva 2009-ben írták le a PUUV, DOBV és SAAV együttes jelenlétét hazánkban (Plyusnina és mtsai., 2009). A TULV-t először 2008-ban detektálták az országban. A dél-nyugati határnál befogott 46 M. arvalis között 17 állatban volt jelen a vírus. A részleges szekvencián alapuló filogenetikai analízis alapján a magyar törzsek Nyugat-Szlovákiában és Csehországban talált vírusokkal képeztek egy csoportot (Jakab és mtsai., 2008). Zala megyében, Nova község közeléből származó közönséges vakondból (Talpa europea) mutattak ki új, meglehetősen divergens hantavírust. A kórokozó természetesen a felfedezés helyéről kapta a Nova vírus (NVAV) nevet (Kang és mtsai., 2009a). Kang és munkatársai erdei cickány (Sorex araneus) máj szövetéből RT-PCR segítségével mutattak ki Seewis hantavírus (SWSV) RNS-t. A tanulmányban, 1982-ben Finnországban, és 1997-ben, 1999-ben és 2000-ben Magyarországon, Zala és Győr-Moson-Sopron megyében gyűjtött állatokat vizsgáltak. A filogenetikai analízist követően világossá vált, hogy az azonos csoportba tartozás ellenére, a különböző földrajzi területről származó vírusok jelentős genetikai különbségeket mutatnak (Kang és mtsai., 2009b). Az állatok monitorozása mellett párhuzamosan klinikai vizsgálatok is folynak hazánkban. Az első hivatalos dokumentum a betegségről 1971-ből származik, azonban a HFRS diagnosztizálásán kívül egyéb információt nem említenek a szerzők (Trencséni és Keleti, 1971). Faludi és Ferenczi közölték az első szerológiai adatokat a fertőzéssel kapcsolatban. Agglutinációs teszttel, IFAT és ELISA módszerrel 55 betegnél mutatták ki a vírus elleni antitesteket 1987 és 1993 között (Faludi és Ferenczi, 1995). Majd ezt követően egy átfogó tanulmány keretein belül több mint kétezer 20 évnél idősebb, az ország különböző részein élő állampolgár esett át szerológiai vizsgálaton, és 10%-uk mutatott szeropozitivitást (Ferenczi és mtsai., 2003, Ferenczi és mtsai., 2005). 2.9. Laboratóriumi diagnózis 2.9.1. Szerológiai tesztek A vírusfertőzés folyamán, elsősorban a nukleokapszid protein és a glikoproteinek váltanak ki specifikus antitest-termelést a rágcsálók, illetve a betegek szervezetében. A szerológiai tesztek során elsősorban a vírussal szemben termelődött IgM és/vagy IgG antitesteket mutatjuk ki. A legáltalánosabb szerológiai vizsgálati módszer az ELISA és az IFA. Az ELISA vizsgálatok hátránya, hogy kevés cég gyárt, illetve forgalmaz specifikus hantavírus tesztet, és a jelenleg kereskedelmi forgalomban is kapható ELISA kitek egyrészt
18
igen drágák, másrészt állatok vizsgálatára nem alkalmasak. A rekombináns DNS technológia következtében ezek a tesztek rekombináns antigénekre épülnek. A hantavírusok esetében ez általában a rekombináns nukleokapszid proteint jelenti. Több organizmusban sikerült már előállítani ilyen fehérjéket, így baktériumban, élesztőben, rovar sejtekben baculovírus rendszer segítségével (Okumura és mtsai., 2007) és növényekben (Kehm és mtsai., 2001). Nagy előnyük, hogy ezen tesztek elvégzéséhez nem szükséges magas biztonsági szintű laboratórium (BSL-3, BSL-4) megléte. Hátrány viszont, hogy a szerotípusok meghatározása ezekkel a módszerekkel nem minden esetben lehetséges, mivel a nukleokapszid protein N terminálisán található típusazonos epitópok ellen termelt antitestek különböző mértékben keresztreakciót mutatnak a szerotípusok között
(Lindkvist
és
mtsai.,
2007).
A
hantavírus
kutatással
foglalkozó
kutatócsoportok/innovatív cégek igyekeznek olyan antigéneket előállítani, melyek nem hordozzák ezeket az epitópokat, ezáltal próbálják csökkenteni a keresztreagálás mértékét. A szerotípusok elkülönítésére a neutralizációs antitestek kimutatását és mérését lehetővé tevő neutralizációs tesztek a legalkalmasabbak. A vizsgálatokat azonban csak 3-as biztonsági szintű (BSL-3) laboratóriumban lehet elvégezni. 2.9.2. Molekuláris vizsgálatok A virális RNS kimutatása RT-PCR módszerrel végezhető vérből, szérumból. Mivel a hantavírusok igen rövid ideig és relatív alacsony vírustiterrel okoznak virémiát a vírus molekuláris kimutatása csak rövid ideig, főleg a betegség korai szakaszában valósulhat meg. Általában mire a specifikus tünetek megjelennek a kórokozó már nem vagy csak igen nehezen mutatható ki a beteg vérmintájából. Állatok esetében leggyakrabban a tüdőszövetből történik a vírus kimutatása.
19
3. Célkitűzések 1. DOBV rekombináns kapszid antigén előállítása Escherichia coli expressziós rendszer alkalmazásával, 2. új, rekombináns antigén alalpú ELISA teszt kifejlesztése, ami mind a kutatási, mind a diagnosztikai vizsgálatokhoz egyaránt alkalmazható, 3. a hazánkban, illetve a szomszédos Horvátország határmenti, északi területein cirkuláló,
rágcsálók
által
terjesztett
hantavírus
törzsek
előfordulásának,
gyakoriságának felmérése, 4. új hantavírus törzsek keresése, 5. szeroepidemiológiai vizsgálatok elvégzése egy általunk előállított rekombináns antigén segítségével, 6. filogenetikai valamint molekuláris szekvencia analízissel a kimutatott vírustörzsek molekuláris
szintű jellemzése, fontosabb leszármazási
és/vagy rokonsági
kapcsolatok felderítése.
20
4. Anyagok és Módszerek 4.1. Vizsgálati minták Kutatásaink során a Dobrava-Belgrade hantavírust hordozó két rágcsálófajt, a sárganyakú erdeiegeret (Apodemus flavicollis, Af) és a pirók erdeiegeret (Apodemus agrarius, Aa) vizsgáltuk. A kisemlősöket 2005 és 2007 között a PTE TTK Biológiai Intézet, Állatökológia Tanszék munkatársai gyűjtötték öt dél-dunántúli (Pécs-Árpádtető, Gyékényes, Görcsöny, Gyód, Sármellék) és kettő horvátországi (Beli Manastir, Gola) területen (5. ábra). Vizsgálataink alapját a csapdázások során természetesen elhullott rágcsálók képezték. Kísérleteinkben a rágcsálók tüdőszövetében szaporodó vírusokat kerestük, így természetesen a vizsgálataink tárgyát képező kisemlősök boncolása elengedhetetlen volt. A megfelelő biztonsági és sterilitási feltételek betartása mellett a boncolás folyamán kiemeltük az állatok tüdejét, más kísérletekhez a máját, veséjét, agyvelejét és amennyiben lehetséges volt a lépét is. A mintákat feldolgozásig -80°C-on tároltuk. Munkánkban ezen kívül felhasználtunk humán vérsavó mintákat, melyek kórházban ápolt betegektől származtak.
5. ábra A rágcsálók gyűjtési helyszínei: (1) Gyód; (2) Görcsöny; (3) Pécs-Árpádtető; (4) Gyékényes; (5) Sármellék; (6) Beli Manastir; (7) Gola
21
4.2. Virális RNS kivonása Az állatok tüdőszövetében felszaporodó vírusok örökítő anyagának (RNS) tisztítása TRIzol® (Invitrogen) módszerrel történt a gyártó utasításai alapján. A tüdőből 500 ml PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1,46 mM KH2PO4, pH 7,4) hozzáadásával szuszpenziót készítettünk. Centrifugálás után (10 perc, 4°C, 14 000 X g) a felülúszóból 100 μl mintát adtunk 500 μl TRIzol® reagenshez, majd a mintákat rövid keverés után szobahőmérsékleten 10 percig inkubáltuk. Minden mintához 100 μl kloroform (Sigma) reagenst adtunk, majd rövid keverés után ismét szobahőmérsékleten inkubáltuk 10 percig. A 15 perces centrifugálást (4°C, 16 000 X g) követően, a felső fázisból 450 μl-t mértünk 400 μl izopropanolhoz a virális RNS kicsapásához. A mintákat 1 órára -20°C-ra helyeztük. Az inkubálási idő letelte után, ismét 15 percig centrifugáltuk (4°C, 16 000 X g), és a kicsapódott nukleinsavat 300 μl, 70%-os alkohollal mostuk (4°C, 14 000 X g), amit szárítás és 35 μl nukleázmentes vízben (Promega) történő visszaoldás követett. A mintákat a felhasználásukig -80°C-on tároltuk. 4.3 Rekombináns antigén előállítása 4.3.1. Expressziós konstrukció 4.3.1.1. Reverz transzkripció, polimeráz láncreakció A rekombináns fehérjék előállításához A. flavicollis-ból izolált nukleinsavat használtunk. A teljes és a csonka nukleokapszid gén sokszorozásához használt primereket az 1. táblázat tartalmazza. A reverz transzkripció (RT) mindkettő szekvencia esetében a 5’ oligonukleotidokkal történt. Az összemért RT reakció-keverékben (25 μl) a reagensek koncentrációja a következő volt: 1x AMV puffer (10 mM Tris, 50 mM KCl, 3 mM MgCl2, pH 8,3), 0,4 mM dNTP mix (Promega), 2U AMV-RT (Promega), 4U nukleáz inhibitor (Promega), 0,05 μM dithiothreitol, 50 pmol primer. E keverékből mintánként 20 μl-t, az RNS mintából 5-5 μl-t használtunk. A reverz transzkripció 42°C-on 60 perc alatt ment végbe. A polimeráz láncreakcióhoz (PCR) összemért reakciókeverékben (50 μl) a reagensek koncentrációja a következő volt: 1x GoTaq® Flexi Buffer, 4 mM MgCl 2, 0,8 mM dNTP mix, 50 pmol 5’ primer, 50 pmol 3’ primer 1,25U GoTaq® polimeráz (Promega), 5 µl cDNS. Az amplifikációs programban a kezdő denaturáció 95°C-on 5 perc alatt játszódott le, amit 40 ciklusból álló láncreakció következett. A primerek kapcsolódása
22
55°C-on 45 másodperc alatt történt, majd az ezt követő extenzió 72°C-on egy percig tartott.
1. táblázat. A rekombináns antigén előállításához használt primerek. A restrikciós hasító helyek szekvenciái aláhúzottan láthatók.
Primer szekvencia 5’-3’
Primer
rNP50 gén rNP50-DOBVF CGGCTAGCATTGCACARTCAATYCAGRG
rNP gén
Hasítóhely NheI
rNP50-DOBVR CGCTCGAGCTAAAGYTTAAGCGGCTC
XhoI
DOBV_S_F
NdeI
CGCATATGATGGCAACACTAGAGGAAC
rNP50-DOBVR CGCTCGAGCTAAAGYTTAAGCGGCTC
XhoI
4.3.1.2. Klónozás és transzformálás A könnyebb kezelhetőség miatt a PCR terméket közvetlenül TA-klónozó rendszerbe (pGEM-T Vector System; Promega) jutattuk be, majd a fragmentet pET28a(+) (Novagen) expressziós vektorba klónoztuk. Ennek érdekében a tisztított vektorokból 2-2 μg-ot használtunk fel a kettős emésztéshez. A teljes gént 2 U mennyiségű NdeI és XhoI, a csonka szekvenciát NheI és XhoI restrikciós endonukleázok (New England Biolabs) és a megfelelő enzimpuffer (20 mM Tris-acetát, 50 mM K-acetát, 10 mM Mg-acetát, 1 mM DTT, pH 7,9) jelenlétében 2 óráig 37ºC-on inkubáltuk. A keletkezett termékeket agaróz gélelektroforézissel választottuk el és a gélből tisztítottuk (QIAquick Gel Extraction Kit, Qiagen). A restrikciós emésztést a ligálási reakció követte. A ligálási elegyet 50 ng vektor, 30 ng fragment DNS, enzim kompatibilis ligáz puffer (30 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP, pH 7,8) és 1 U T4 DNS ligáz (Promega) alkotta. A reakció 15°C-on, 18 órán keresztül zajlott. A ligálási reakció eredményeként keletkezett pET28a(+)–DOBV rNP illetve rNP50 plazmid konstrukciót (6. ábra, A és B) első lépésben E. coli DH5α (Promega) kompetens sejtekbe transzformáltuk. Egy transzformáláshoz 50 μl sejtet (106 transzformáns/μg plazmid) használtunk fel. A kompetens sejtek -80°C-ról történő felolvasztását 0ºC körüli hőmérsékleten (jégen) végeztük el, majd a teljes felolvadás után a sejt szuszpenzióhoz 5 μl plazmid konstrukciót adtunk. Az ezt követő 0ºC-on (jég) végzett 20 perces inkubálást egy 50 másodperces 42°C-os hőkezelés követett, majd a mintákat azonnal ismét 0ºC-os hőmérsékletre hűtöttük vissza. A 3 perces inkubálás után 400 μl LB (Sigma) tápfolyadékot 23
adtunk az oldathoz, és 1 órán keresztül 37°C-on inkubáltuk. A sejteket 30 μg/ml kanamycint
(Sigma)
1,0
mM
IPTG-t
(Sigma)
és
0,004%
X-Gal
oldatot
(Promega; 2% törzsoldat, dimetil-formamidban oldva) tartalmazó táptalajra szélesztettük, és egy éjszakán át 37°C-on növesztettük. A transzformálás hatékonyságának megállapítása érdekében, a hagyományos kék-fehér kolónia szelekció módszerét alkalmaztuk (Inoue és mtsai., 1990). A pozitív (fehér) klónokat, 3 ml, 30 μg/ml kanamycint tartalmazó LB tápfolyadékban folyamatos rázatás mellett (200 rpm) növesztettük 37°C-on 12-15 órán keresztül, majd a felszaporodott E. coli sejtekből plazmid izolálást végeztünk (Wizard® Plus SV Miniprep Kit, Promega) a gyártó utasításai szerint. A tisztított vektort ezután expressziós E. coli törzsbe, BL21 Rosetta (DE)pLysS (Novagen) kompetens sejtekbe transzformáltuk az előzőekben leírtakkal megegyezően.
rNP
A
T7 t XhoI
B
6xHis T7 p
1290 nt
NdeI
rNP50 T7 t
6xHis
1143 nt
XhoI
T7 p NheI
pET28a+
6. ábra. Vektor konstrukciók: pET28a(+)–DOBV rNP (A), pET28a(+)–DOBV rNP50 (B).
24
4.3.2. Fehérje expresszió A rekombináns plazmidot tartalmazó BL21 Rosetta sejteket 37°C-on, folyamatos rázatás mellett (200 rpm) LB tápfolyadékban növesztettük 30 µg/ml kanamycin és 35 µg/ml chloramphenicol jelenlétében. A logaritmikus fázis (OD600 0,8-1,0) elérésekor a sejtek indukcióját 1,0 mM IPTG hozzáadásával indítottuk. Az indukció 15°C-on 20 órán keresztül történt, majd a sejteket ülepítettük (4°C, 3000 X g, 20 perc) és felhasználásig a sejtpelletet -20 °C-on tároltuk. 4.3.3. Sejtek feltárása, fehérjetisztítás, fehérje renaturálás A fehérje expressziót követően a sejtpelletet Bacterial Protein Extraction Reagent® (B-PER; Thermo Scientific) segítségével oldottuk fel a gyártó utasításai alapján. Röviden, egy gramm nedves tömeghez 4 ml B-PER reagenst, 8 µl lizozim enzimet (50 mg/ml) és 8 µl DNase I enzimet (2500 U/ml) adtunk. A szuszpendálást követően az elegyet szobahőmérsékleten 20 percet inkubáltuk, majd ezt követően centrifugáltuk (30 perc, 20 000 X g, 4°C), hogy az oldatban maradt fehérjéket elválasszuk a zárványtestet (inclusion body) alakító proteinektől. A zárványtesteket képző proteinek feltárásához denaturáló lízis puffert (6 M guanidine-HCl, 0,1 M NaH2PO4, 0,01 M Tris HCl, pH 8) alkalmaztunk. A lízátumból az esetleges sejttörmeléket centrifugálással távolítottuk el (1 perc, 10000 X g). A rekombináns fehérjék tisztítása a sejtek feltárásához hasonlóan denaturáló körülmények között zajlott HIS Select® HF Nickel Affinity Gel (Sigma Aldrich) oszlop segítségével. A fehérje felkötése a gyantára 4°C-on történt, a lízátumot többször átfolyatva az oszlopon. Az eluálást csökkenő pH-jú denaturáló oldatsorozattal végeztük (8 M Urea, 0,1 M NaH2PO4, 0,01 M Tris) pH 8,0 és 4,0 között mindig pH 0,5 értékkel csökkentve. A fehérjetisztítás után mind az átfolyót, mind az elúciós frakciókat SDS-poliakrilamid gélelektroforézis alkalmazásával (Mini-PROTEAN® TGX; Bio-Rad) választottuk el, és Comassie blue (Brillant Blue R, Sigma) segítségével tettük láthatóvá. A fehérjék renaturálását dialízissel végeztünk el (dialízis membrán: 12,4 kDa; Sigma). A folyamat során fokozatosan csökkentettük a fehérjét tartalmazó oldat urea koncentrációját a dializáló puffer (6 M urea, 20 mM Hepes, pH 7,9; 300 mM KCl, 5 mM MgCl2, 10% glicerol, 0,5 mM PMSF) hígításával.
25
A fehérjék pontos méretét, tisztaságát és koncentrációját Protein LabChip® Kit segítségével Agilent 2100 Bioanalyzer készülék (Agilent Technologies) használatával állapítottuk meg a gyártó utasításai szerint. 4.4. Western blot vizsgálat A fehérjemintákat gélelektroforézis alkalmazásásval, 10%-os SDS-poliakrilamid gélen választottuk el és elektroblottolással nitrocellulóz membránra (BioRad) juttattuk át. Az transzferálás Semi-Dry Transfer készülékkel (BioRad), 120 mA áramerősségen, 25 percig történt. A nem specifikus kötések blokkolását 30 percen át 5% tejport (Bio-Rad) tartalmazó TBS pufferben (50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,5) végeztük. Az antitesteket minden esetben 0,1% BSA-t tartalmazó TBS-T pufferben (0,05% Tween-20, TBS) hígítottuk. Elsődleges antitestként 1:1000 hígításban Penta-His monoklonális antitestet (Qiagen), illetve 1:50 hígításban anti-DOBV IgG pozitív poliklonális antitestet tartalmazó humán vérsavót használtunk. Az egy órás inkubálás után a membránokat háromszor 10 percig mostuk TBS-T pufferben. Másodlagos antitestként tormaperoxidázzal (HRP) konjugált kecske anti-egér IgG (1:1000, Dako), illetve poliklonális anti-human IgG antitestet (1:2000, Dako) alkalmaztunk. Az ismételt háromszori 10 perces mosást követően a reakciót kromogén oldat, DAB-NiCl2 (3, 3’-diaminobenzidine; Sigma), és H2O2 segítségével tettük láthatóvá. 4.5. ELISA vizsgálat Kísérleteink során elpusztult állatokat használtunk, ezért nem volt lehetőségünk vérvételre. A szerológiai tesztekben az állatok boncolása után a tüdőből származó vért alkalmaztuk. A mintavétel Prof. Heikki Henttonen és munkatársai által a szívből származó vér vételére kidolgozott metodika alapján történt. A rágcsálók vérmintáit DOBV elleni antitestekre standard indirekt ELISA módszerrel vizsgáltuk rNP50 antigén segítségével. A kísérletben a 96 lyukú microtiter lemezeket (Maxisorp Nunc-Immuno Plate, Nunc) rNP50 antigénnel érzékenyítettük (50 ng/lyuk), melynek hígítását karbonát-bikarbonát pufferrel (40 mM Na2CO3, 60 mM NaHCO3, pH 9,6) végeztük. Az érzékenyítés 37°C-on, 2 órán keresztül történt. A háromszori PBS mosást követően a nem specifikus kötőhelyek blokkolására 5% BSA/PBS oldatot használtunk. Az egy órás 37°C-on történő inkubálás után a lemezeket ötször mostuk PBS-T-vel (0,5% Tween-20, PBS). Ezt követően 1:100 26
hígításban 100-100 µl rágcsálósavót adtunk minden lyukhoz, és egy órán keresztül 37°C-on inkubáltuk, melyet ismételt mosás követett. Tormaperoxidázzal konjugált kecske anti-egér IgG antitestet (1:5000, Dako) használtunk másodlagos antitestként. Az antitestek hígításához minden esetben 1% BSA-t tartalmazó PBS-T-t alkalmaztunk. Ötszöri mosást követően 100 µl 3,3’,5,5’-tertrametilbenzidin szubsztrátot (TMB; BD Biosciences) adtunk a lyukakhoz és 20 percig szobahőmérsékleten, sötétben inkubáltuk. Az enzimreakciót 2 M H2SO4 hozzáadásával állítottuk le, és az eredményeket microplate spektrofotométerrel (Thermo Electron Corporation) 450 nm hullámhosszon mértük. A humán vérsavókkal végzett ELISA vizsgálatok kisebb változtatással az előzőekben leírtakkal megegyezően zajlottak. Az antigén esetében 50 ng/lyuk mennyiséggel érzékenyítettük a lemezeket. A vérsavókat 1:200 hígításban használtuk. 4.6. A vírus molekuláris jellemzése 4.6.1. RT-PCR reakció A molekuláris jellemzéshez az S szegmens kódoló régiójának amplifikálását Qiagen OneStep RT-PCR Kit segítségével, DOBV_S_F (5’-ATG GCA ACA CTA GAG GAA CTC-3’) és DOBV_S_R (5’-CTA AAG CTT AAG CGG CTC CT-3’) oligonukleotidok felhasználásával végeztük el. Primerek tervezéséhez az adatbázisban (NCBI GenBank) található, a környező országokban kimutatott vírusok S szegmensének szekvenciáit használtuk fel. A reakció-keverékben (25 μl) a reagensek koncentrációja a következő volt: 5x OneStep RT-PCR puffer, dNTP mix (400 μM), 50 pmol 5’ primer, 50 pmol 3’ primer, OneStep RT-PCR enzim mix, 4U nukleáz inhibitor (RNase, Promega), 5 μl templát RNS. A program első lépése a reverz transzkripció, amely 50°C-on 30 perc alatt játszódott le. Ezt követte a kezdő enzim aktiváció, ami 95°C-on 15 percig zajlott. Ezután a 40 ciklusból álló polimeráz láncreakció következett. A primerek kapcsolódása 50°C-on 1 percig történt, majd az ezt követő extenzió 72°C-on szintén 1 percig tartott. 4.6.2. Szekvenálási reakció A vizsgált vírusok teljes nukleokapszid génjének szekvenálásához, az S szegmensen kódolt gén ORF régióját három szakaszra osztottuk. Az alkalmazott oligonukleotid primereket (2. táblázat) úgy terveztük meg, hogy a szekvenált szakaszok egymással 30-50 pázispár átfedésben helyezkedjenek el, ami nagyban segítette a
27
későbbiekben a teljes gén szekvenciájának összeillesztését. A szekvenálandó szakaszok sokszorozásához, nested-PCR módszert alkalmaztunk, ahol a kiindulási templát DNS-t, a OneStep RT-PCR-ből kapott termékek szolgáltatták. A reakciók után a specifikus termékeket Wizard® SV Gel és PCR Clean-Up (Promega) kit segítségével tisztítottuk ki agaróz gélből a gyártó utasításai alapján.
2. táblázat. A szekvenálás során alkalmazott primerek.
Primer
Szekvencia 5’-3’
DOBV_S_F
ATG GCA ACA CTA GAG GAA CTC
S1R
TCA AAA GAG CTG TCA TCC T
S2F
AGA GGG AGA CAA ACT ACT A
S2R
TGG AGA ACA GCA AAG AAT G
S3F
ATA GAC TCA CCA TCA TCA A
DOBV_S_R
CTA AAG CTT AAG CGG CTC CT
Primerek lokalizációja 1-496 nt 430-1007 nt 895-1290 nt
A szekvenáláshoz szükséges PCR esetében az összemért reakció-keverék (10 µl) a következő reagenseket tartalmazta: Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit v1.1 (2 µl), 10 pmol 5’ vagy 3’ primer, 40 ng nukleinsav. Az amplifikációs programban a kezdő denaturáció 96°C-on 1 perc alatt játszódott le, ezt 25 amplifikációs ciklus követte, melyben a denaturáció 96°C-on 20 másodperc alatt, a primerek kapcsolódása 50°C-on 5 másodperc alatt ment végbe, majd az elongáció 60°C-on 4 percig tartott. A reakciót követően a mintákhoz 40 µl nukleáz mentes vizet (Promega) adtunk, majd a szekvenálandó termék kicsapása 0,1 térfogat 3 M nátrium-acetát oldattal (pH 7,0) és 2 térfogat abszolút alkohollal történt. A minták centrifugálása (30 perc, 16 000 X g) után, a kicsapódott termékeket 70%-os alkohollal mostuk, majd a pelletet 50°C-on 3 percig szárítottuk. A nukleinsav visszaoldásához 20 µl formamidot (Hi-Di) használtunk. A szekvenálást automata ABI Prism 310 DNS szekvenáló készülékkel (Applied Biosystems) végeztük. 4.7. Filogenetikai analízis Az elkészült szekvenciák szerkesztését a GeneDoc v2.7 programmal végeztük (Nicholas és mtsai., 1997), majd a nukleotid illesztéseket a ClustalX v2.0 felhasználásával készítettük el (Larkin és mtasi., 2007). A filogenetikai fát a MEGA v5.0 programmal
28
(Tamura és mtsai, 2011), Maximum Likelihood módszer, General Time Reversible szubsztitúciós modell (invariábilis pozíciókkal és gamma eloszlással, GTR+I+G) segítségével rajzoltuk meg. A szimulációhoz használt ismétlések száma (bootstrap) 1000 volt. Az analízis pontosabb értékelhetősége érdekében szimulációs vizsgálatainkban egy külső csoportot (outgroup) is használtunk. Az elemzésekhez felhasznált szekvenciák adatait a 3. táblázat tartalmazza.
3. táblázat. A filogenetikai elemzéshez felhasznált DOBV törzsek (NCBI GeneBank).
Vírus törzs Slo/Af-BER DOBV/Ano-Poroia/13Af/99 DOBV/Ano-Poroia/Afl9/1999 East Slovakia/400Af/98 Kurkino/53Aa/98 Kurkino/44Aa/98 East Slovakia-856-Aa East Slovakia-862-Aa Esl/29Aa/01 SK/Aa Esl/34Aa/01 Esl/81Aa/01 Aa1854/Lipetsk-02 GER/07/293/Aa GER/07/607/Af GER/07/424/Aa GER/07/1064/Aa GER/05/239/Aa GER/05/477/Af GER/08/118/Aa GER/08/131/Af OMSK/172_Ap_ag/05 OMSK/189_Ap_ag/05 OMSK/180_Ap_ag/05 GRW/Aa DOB/Saaremaa/160V Saar/90Aa/97 Saaremaa/Lolland/Aa1403/2000 SAAV/Croatia/Aa12/2003 Ap-1/Goryachiy Klyuch-2000 Ap1584/Sochi-01 Ap/Sochi/hu Ap/Sochi/43 Ap/Sochi/79
Rövidítés Slo/Af AP/13Af AP/19Af Esl/400Af Kur/53Aa Kur/44Aa Esl/856Aa Esl/862Aa Esl/29Aa SK/Aa Esl/34Aa Esl/81Aa Aa1854/Lipetsk GER/07/293/Aa GER/07/607/Af GER/07/424/Aa GER/07/1064/Aa GER/05/239/Aa GER/05/477/Af GER/08/118/Aa GER/08/131/Af Omsk/172Aa Omsk/189Aa Omsk/180Aa GRW/Aa Saa/160V Saa/90Aa Saa/Lolland Saa/Croatia Ap-1/Goryachiy Ap1584/Sochi Ap/Sochi/hu Ap/Sochi/43 Ap/Sochi/79
Referencia Kirsanovs et al. 1995 Nemirov et al. 2003 Nemirov et al. 2003 Klempa et al. 2003a Plyusnin et al. 1999 Plyusnin et al. 1999 Sibold et al. 2001 Sibold et al. 2001 Klempa et al. 2004b Klempa et al. 2004b Klempa et al. 2004b Klempa et al. 2004b Klempa et al. 2008 Schlegel et al. 2009 Schlegel et al. 2009 Schlegel et al. 2009 Schlegel et al. 2009 Schlegel et al. 2009 Schlegel et al. 2009 Schlegel et al. 2009 Schlegel et al. 2009 Garanina et al. 2009 Garanina et al. 2009 Garanina et al. 2009 Popugaeva et al.2012 Nemirov et al. 1999 Nemirov et al. 1999 Nemirov et al. 2004 Plyusnin et al. 2011 n.a. Klempa et al. 2008 Dzagurova et al. 2012 Dzagurova et al. 2012 Dzagurova et al. 2012
Hivatkozási szám GU904029.1 AJ410619.1 AJ410615.1 AY168576.1 AJ131673.1 AJ131672.1 AJ269549.1 AJ269550.1 AY533118.2 AY961615.1 AY961618.1 AY533120.2 EU188452.1 GQ205401.1 GQ205402.1 GQ205403.1 GQ205404.1 GQ205405.1 GQ205406.1 GQ205407.1 GQ205408.1 EU562989.1 EU562990.1 EU562991.1 JQ026204.1 AJ009773.1 AJ009775.1 AJ616854.1 FN813291.1 AF442622.1 EU188449.1 JF920150.1 JF920151.1 JF920152.1
29
5. Eredmények 5.1. Rágcsálók vizsgálata 5.1.1. Előzetes kísérletek Kutatócsoportunk
2009-ben indított
kísérletsorozata elsősorban a
DOBV
hantavírusok molekuláris vizsgálatára, genetikai variabilitásának feltérképezésére irányult. Jelen disszertációban bemutatott további molekuláris biológiai illetve immunológiai, epidemiológiai kísérletek is – előzetes eredményeink felhasználásával – a vírusok részletesebb molekuláris elemzésére, gyakoriságuk megállapítására és a hazai fertőző betegségek sorában betöltött szerepére irányultak. A kutatásunk alapját az a természetes úton elpusztult 125 Apodemus egyed képezte, melyet a PTE TTK Állatökológiai Tanszékének munkatársai gyűjtöttek 2005 és 2007 között. A 125 vizsgált erdeiegér közül 58 Apodemus flavicollis (Af), 67 pedig Apodemus agrarius (Aa) volt. A rágcsálók egyrészt a Pécshez közeli Árpádtetőről, Görcsönyből, Gyódról, valamint Gyékényesről és Sármellékről származtak, másrészt a horvátországi Gola és Beli Manastir közeli erdőkben kerültek befogásra. A 125 állat többsége, 83 egyed (31 Af és 52 Aa) magyarországi gyűjtési területekről származott, míg Horvátországban 42 erdei egeret sikerült fogni, melyből 27 Af, míg 15 Aa volt. A rágcsálók boncolását követően a tüdőszövetből történt a virális nukleinsav izolálása. A vírus jelenlétének igazolása RT-PCR módszerrel, újonnan tervezett, a nukleokapszid génre specifikus primerekkel történt, amelyek a genom 433 bázispár nagyságú szakaszát sokszorozták. A 125 mintából tíz esetében sikerült virális nukleinsavat kimutatnunk, melyből hét Af-ból (7/58, 12%), három Aa-ból (3/67, 4,5%) származott. További vizsgálatainkat az előzőkben ismertetett 125 rágcsálóval végeztük. 5.1.2. Szekvencia és filogenetikai elemzés A tíz pozitív mintából, nyolc esetben tudtuk a teljes S szegmens ORF régióját (36-1325 nukleotid, 1290 bázispár) sokszorozni, amely a 429 aminosav hosszúságú nukleokapszid proteint kódolja. Két minta esetén csak részleges, 433 bázispár hosszúságú nukleinsav szekvencia állt rendelkezésünkre, mivel ezeknél a mintáknál nem volt elegendő mennyiségű tüdőszövet a vizsgálatok folytatásához. Az elemzésben a kimutatott törzsek szekvenciáit vetettük össze az NCBI GeneBank adatbázisában fellelhető összes Aa-ból és
30
Af-ből kimutatott vírus komplett S szegmensének fehérjét kódoló szekvenciájával. Az S szegmens filogenetikai elemzése alapján elmondhatjuk, hogy – várakozásunknak megfelelően – az Aa-ból kimutatott új törzsek a DOBV-Aa, az Af-ből izolált vírusok a DOBV-Af csoporttal képeznek monofiletikus csoportot (7. ábra). Az 58 vizsgált Af-ből hét esetben mutattuk ki a kórokozót. A hét törzsből öt esetben sikerült a teljes nukleoprotein gént (NPG) szekvenálni, így a filogenetikai elemzéshez
ezeket
a
DOB/Gola/235Af/07,
szekvenciákat
használtuk
DOB/Gola/242Af/07,
fel.
Az
öt
törzs
DOB/Gola/291Af/07
közül
a
és
a
DOB/Gola/343Af/07 elnevezésű törzsek horvátországi területről, a magyar határ közelében fekvő Gola község mellől származtak, míg a DOB/Pécs/210Af/07 jelzésű vírust Magyarországon, Pécs közeli gyűjtési területen csapdázott sárganyakú erdeiegérből mutattuk ki. Az egymáshoz földrajzilag közel eső területekről származó vírusok genetikai hasonlósága nagyobb, így a horvát, szlovén (Slo/Af) és magyar törzsek vizsgálatainkban is egyértelműen elkülönülnek egyéb európai, például a görögországi törzsektől (AP/13Af, AP/Af19). A vírus genetikai variabilitását mutatja az is, hogy már a Pécsről gyűjtött, Af által hordozott DOBV genetikai mintázata is eltér a mintegy 90 km távolságban fekvő horvátországi területről származó vírusok genetikai állományától, ezáltal egy külön filogenetikai ágat is alkot.
31
SAAV
Észtország
Szlovákia
Horvátország
Oroszország
DOBV-Aa
Magyarország
Dánia
Oroszország
DOBV-Ap
Németország
Görögország Szlovákia Szlovénia Magyarország
DOBV-Af
Saa/90Aa Saa/160V 99 SK/Aa 63 Esl/34Aa 99 Esl/29Aa 94 Esl/81Aa Esl/856Aa 80 100 Esl/862Aa 84 SAAV/Croatia/Aa12 Sármellék/77Aa 79 Pécs/27Aa 79 99 Pécs/31Aa Omsk/180Aa 99 Omsk/172Aa Omsk/189Aa 99 Aa1854/Lipetsk 99 Kur/44Aa 83 Kur/53Aa Saa/Lolland 99 GER/05/239/Aa 99 GER/05/477/Af 52 GER/07/1064/Aa GER/08/118/Aa 90 GER/07/293/Aa GER/07/607/Af 100 GER/07/424/Aa 79 GER/08/131/Af 97 GRW/Aa 84 Ap1584/Sochi-01 53 Ap/Sochi/hu Ap/Sochi/43 98 Ap/Sochi/79 99 Ap-1/Goryachiy 95 Ano-Poronia/Af19 79 81 Ano-Poronia/13Af Esl/400Af Slo/Af 93 Pécs/210Af Gola/343Af 100 Gola/291Af 67 Gola/242Af 65 Gola/235Af Hantaan
89
Horvátország
0.1
7. ábra. Rágcsálókból izolált DOBV S szegmens kódoló (1290 bp) régiójának nukleotid szekvenciáján alapuló maximum likelihood módszerrel készült filogenetikai elemzés.
32
A filogenetikai összehasonlításon kívül nukleinsav és aminosav szinten is végeztünk szekvencia elemzéseket (4. táblázat). Az aminosav szekvenciát vizsgálva nem találtunk egyik esetben sem nagy eltérést, a vizsgált törzsek 99% fölötti egyezést mutattak minden esetben. Ezzel szemben a nukleotid szekvenciák között már mutatkoztak különbségek. A régióban kimutatott, és így egyértelműen egy csoportot alkotó törzseknél a nukleotid szekvenciák 95,9-96,5%-ban hasonlóak. A részletesebb molekuláris vizsgálat a horvát törzsek között mutatta a legnagyobb, 99% fölötti azonosságot. 4. Táblázat. Az S szegmens nukleotid (1290 bp) és aminosav (429 aminosav) szekvenciájának hasonlósága A. flavicollisból kimutatott vírusok esetében, százalékban kifejezve (n=nukleotid, a=aminosav).
Vírus Törzsek Pécs/210Af Gola/235Af Gola/242Af Gola/291Af Gola/343Af Slo/Af AP/13Af AP/Af19 Esl/400Af
210 n a 95.9 99.7 96.0 100 95.9 100 96.1 99.7 96.5 99.5 95.6 100 95.7 100 94.8 99.7
235 n a 95.9 99.7 99.9 99.7 99.8 99.7 99.3 99.5 96.4 99.3 96.0 99.7 95.8 99.7 94.5 99.5
242 n a 96.0 100 99.9 99.7 99.9 100 99.4 99.7 96.5 99.5 96.1 100 95.8 100 94.6 99.7
291 n a 95.9 100 99.8 99.7 99.9 100 99.5 99.7 96.4 99.5 96.0 100 95.8 100 94.5 99.7
343 n a 96.1 99.7 99.3 99.5 99.4 99.7 99.5 99.7 96.2 99.3 96.0 99.7 95.9 99.7 94.5 99.5
A 67 vizsgált Aa közül három esetben tudtunk DOBV-t kimutatni, majd sikerült az S szegmens ORF régióját sokszoroznunk. Mindhárom mintát sikeresen szekvenáltuk, és elvégeztük a filogenetikai analízist is. A három törzs mindegyikét Magyarországon fogott rágcsálókból mutattuk ki: a DOB/Pécs/27Aa/06 és DOB/Pécs/31Aa/06 jelzésű törzsek Pécsről származtak, míg a DOB/Sármellék/77Aa/06-os törzset hordozó Aa-t Sármelléken fogtuk be. Az adatbázisban a DOBV-Af-fel ellentétben nagy számban elérhető teljes DOBV-Aa S szegmens szekvencia, így ezekkel a törzsekkel komplexebb elemzést sikerült elvégeznünk. A DOBV-Aa csoporton belül külön ágon helyezkednek el a nyugat európai és a kelet-európai törzsek. Utóbbi ágba kapcsolódtak be a Magyarországon kimutatott vírusok is. Ez a földrajzi elkülönülés visszaköszön a szekvenciák összehasonlításakor, hiszen a kelet-európai törzsekkel 91% fölötti nukleotid hasonlóságot tapasztalunk, míg ez az érték a német DOBV-Aa-k esetében 88 és 89% között mozog (5. táblázat). Az aminosav szekvenciák százalékos hasonlósága 99% fölötti értéket mutat, tehát nem láthatunk jelentős eltérést a különböző régiók vírusai között. Az új törzsek egy horvátországi vírussal (Saa/Croatia/Aa12) mutatnak genetikai hasonlóságot, amit SAAV-ként írtak le korábban. Bár az összehasonlításhoz utóbbiból csak részleges, a kódoló régió 978 nukleotid
33
hosszúságú szakasza állt rendelkezésünkre, a nukleotid szekvenciák kevesebb mint 5%ban, az aminosav szekvenciák kevesebb mint 2%-ban térnek el egymástól. A magyarországi két gyűjtési pont között mintegy 130 km távolság található, ami a törzsek között genetikailag is megmutatkozik. A két pécsi (Pécs/27Aa, Pécs/31Aa) vírus esetében közel 1%-os differenciát tapasztalhatunk csupán, melyektől a távolabbi területről kimutatott vírus (Sármellék/77Aa) nukleotid szekvenciája 5%-ban, aminosav szekvenciája 2,4-2,6%-ban eltér .
5. táblázat. Az S szegmens nukleotid (1290 bp) és aminosav (429 aminosav) szekvenciájának hasonlósága A. agrariusból kimutatott vírusok esetében, százalékban kifejezve (n=nukleotid, a=aminosav, a *-gal jelölt törzs esetében részleges szekvencia található az adatbázisban).
27 Vírus törzsek Pécs/27Aa Pécs/31Aa Sármellék/77Aa SK/Aa GRW/Aa Esl/29Aa Esl/34Aa Esl/81Aa Esl856/Aa Esl/862Aa Kur/44aa Kur/53Aa Aa1854/Lipetsk GER/08/118/Aa GER/08/131/Af GER/05/239/Aa GER/07/293/aa GER/07/424/Aa GER/05/477/Af GER/07/607/Af GER/07/1064/Aa Saa/160V Saa/90Aa Saa/Lolland Saa/Croatia/Aa12*
n 98.9 94.9 92.7 89.4 93.0 92.8 92.9 92.6 92.6 91.4 91.5 91.2 88.4 89.4 88.1 88.6 88.2 88.1 88.2 89.1 86.9 87.4 88.9 94.7
31 a 99.3 98.6 99.3 99.0 99.5 99.5 99.5 99.0 99.0 98.1 98.6 98.6 98.3 99.0 98.6 98.6 98.8 98.3 98.8 98.6 96.9 96.9 99.3 98.7
n 98.9 94.6 92.7 89.3 93.0 92.8 92.7 92.4 92.4 91.3 91.3 91.0 88.6 89.3 88.5 88.9 88.4 88.3 88.4 89.2 86.7 87.2 88.9 94.9
77 a 99.3 98.3 99.0 98.9 99.3 99.3 99.3 98.8 98.8 97.9 98.3 98.3 98.1 98.8 98.3 98.3 98.6 98.1 98.6 98.3 96.7 96.7 99.0 98.7
n 94.9 94.6 92.9 88.6 93.0 93.0 92.9 92.3 92.2 91.4 91.7 91.3 88.2 88.6 89.0 88.3 88.1 89.1 88.1 89.6 86.5 87.8 88.9 97.7
a 98.6 98.3 98.8 98.1 99.0 99.0 99.0 98.6 98.6 98.1 98.6 98.6 98.3 98.1 98.6 98.1 98.3 98.3 98.3 98.6 96.5 96.5 98.3 98.4
34
5.2. Rekombináns DNS technikák alkalmazása 5.2.1 Rekombináns fehérje expresszió Munkánkban egyrészt a különböző hantavírus szerotípusok elkülönítésére alkalmas csonka nukleokapszidot (rNP50) eredményező baculovírus rendszert (Araki és mtsai., 2001) vettük alapul, melyet egy bakteriális expressziós rendszerre ültettünk át. Másrészt a teljes nukleokapszid protein (NP) expressziója is megtörtént, szintén ebben a prokarióta rendszerben. A bakteriális expressziós rendszer alkalmazásának egyik oka, hogy ez a legegyszerűbb fehérje termelő rendszer, aminek használata gyors, és szinte minden laboratóriumban adottak a technikai feltételek a kísérletek elvégzéséhez. Másrészt a virális kapszid protein nem esik át poszttranszlációs modifikáción, és így nem volt szükséges a nehezen kivitelezhető eukarióta expressziós rendszert alkalmaznunk. Az expresszió kiindulása mindkét esetben a régióban fogott Af rágcsálóból kimutatott hantavírus RNS volt. Araki és munkatársai (2001) igazolták, hogy a hantavírus nukleokapszid protein N terminálisán elhelyezkedő első 49 aminosav tartalmazza az immunodomináns, típus azonos epitópokat. A különböző szerológiai tesztekben így a hantavírus fertőzések keresztreakciót mutathatnak, aminek következtében nem lehet a fertőző ágens pontos típusát beazonosítani. Az rNP50 rekombináns fehérje alkalmas az egyes szerotípusok elkülönítésére is. A fehérjék termeltetése E. coli BL21 Rosetta törzsben történt pET28a(+) expressziós vektor segítségével. A plazmid genetikai kostrukciójának köszönhetően a képződött rekombináns fehérjék hat darab hisztidinből (6xHis) álló mintázatot kaptak, amely lehetővé tette a túltermeltetett fehérje Ni2+ affinitás kromatográfián történő tisztítását. A bakteriális fehérjeexpresszió egyik hátrányát mi is megtapasztaltuk. Nevezetesen, hogy a nagy mennyiségben termelt, idegen fehérje a sejtekben nem oldott állapotban, hanem zárványokat (zárványtest vagy inclusion body) képezve található meg. Ez azonban számunkra előnyt is jelentett, hiszen ezek a fehérjével telt testek kizárólag az adott rekombináns fehérjét tartalmazták, és a proteint ebben az állapotában a proteázok sem voltak képesek bontani. Mindkét zárványtestet alakító fehérjét kaotróp oldószer (6 M guanidin-HCl) segítségével oldottuk fel. A kapott lizátumot Ni-NTA oszlopon többször átfolyattuk az eredményesebb fehérjekötődés érdekében. Az oszlopra kötődött proteint szintén kaotróp oldószerrel (8 M urea), denaturáló körülmények között tisztítottuk a nem specifikusan kötődött fehérjéktől. A fehérje oszlopról történő leválasztását, csökkenő
35
pH-jú oldatsorozat alkalmazásával végeztük. Az rNP50 először a pH5,0 és pH4,5 frakcióban jelent meg (8. ábra), melyet a későbbiekben denaturált formában használtunk. Az rNP a legnagyobb koncentrációban a pH4,5 és pH4,0 frakciókban tisztítottuk a gyantáról (9. ábra), a proteint dialízis segítségével renaturáltuk, és natív formában alkalmaztuk a kísérletekben. A PAGE vizsgálatok egyértelműen mutatták, hogy várakozásunknak megfelelően hozzávetőlegesen 45-50 kDa méretű, túltermelt fehérjéket kaptunk. Ez teljes mértekben megfelelt az eddigi irodalmi adatoknak is. Az expresszió és a tisztítás optimalizálása után 0,5 mg/ml koncentrációban nyertünk nagy tisztaságú rNP50 és rNP antigént.
kDa
M
pH8
7
6
5,5
5
4,5
4
4
225
150 100 75 50 35 25
15 10
8. ábra. Az rNP50 antigén tisztításának ellenőrzése SDS-PAGE segítségével. M: protein marker (Promega), majd a különböző pH értékekhez tartozó frakciók következnek.
36
kDa
M
pH8
7
6
5,5
5
4,5
4
4
4
225 150 100 75 50 35 25
15 10
9. ábra. Az rNP antigén tisztításának ellenőrzése SDS-PAGE segítségével. M: protein marker (Promega), majd a különböző pH értékekhez tartozó frakciók következnek.
5.2.2. Western blot analízis A rekombináns, virális antigének aktivitását, antigenitását Western blot módszerrel is ellenőriztük. A fehérjék N terminálisán lévő hisztidin (6xHis) motívumra specifikus monoklonális anti-6xHis antitestet (10. ábra, B) és poliklonális anti-DOBV humán IgG antitesteket (10. ábra, A és C) használtunk a kísérletben. Mindkét esetben megfelelő intenzitású jelet kaptunk, ami egyértelműen a fehérje aktív immunológiai állapotára utalt. Habár a poliklonális antitesttel kapott jelintenzitás is egyértelmű specifikus pozitív reakció eredménye, a 6xHis monoklonális antitesttel észlelt reakció a célfehérje jelenlétét minden kétséget kizárólag igazolta. Ilyen mintázat ugyanis a természetben nem fordul elő, így a vizsgálatban kapott jel kizárólag a rekombináns antigén jelenlétét mutatta és nem egyéb, aspecifikus reakció lehetőségét. Negatív kontrollként egészséges, hantavírus fertőzésen át nem esett ember vérsavóját használtuk. A Western blot analízisek eredményei alapján, megkezdhettük ELISA viszgálatunk optimalizálását is.
37
kDa
M
A
B
C
250
150
100 75
50 37
25 20 15 10
10. ábra. Az rNP50 és rNP antigének Western blot analízise. (A) rNP50 vizsgálata antiDOBV antitesttel, (B) és anti-His antitesttel, (C) rNP analízise anti-hantavírus antitesttel, M: protein marker (BioRad).
5.2.3. ELISA vizsgálatok specificitása és szenzitivitása Ahhoz, hogy ELISA tesztjeinket megbízhatóan használjuk rágcsáló illetve humán szérumok vizsgálatához, meg kellett határoznunk annak specifictását és szenzitivitását. Kereskedelmi forgalomban jelenleg két elterjedt ELISA teszt alkalmas DOBV fertőzés kimutatására. A gyakrabban használt és valamelyest olcsóbb kit, amely DOBV, PUUV, HTNV, SEOV és SNV specifikus kimutatását teszi lehetővé (FOCUS Diagnostics Hantavirus IgG and IgM DxSelectTM), valamint a DOBV és HTNV azonosítására alkalmas ELISA teszt (Reagena Dobrava-Hantaan IgG EIA). Mi az utóbbi tesztet választottuk összehasonlító vizsgálatunk alapjául, melynek eredményeként saját rekombináns antigénen alapuló IgG ELISA módszerünk specificitási és szenzitivitási értékeit is megállapítottuk. A vizsgálathoz összesen 50 humán szérum állt rendelkezésünkre. A gyártó utasításait követve elvégeztük a vizsgálatot, melynek eredményeként 8 DOBV pozitív és 42 DOBV negatív mintát határoztunk meg. Utóbbiból 3 savó a teszt által megállapított
38
szürke zónába került. Az rNP50 antigén alapú saját ELISA-val szintén megvizsgáltuk az 50 vérmintát. A nyolc szérumból hét esetben mi is megállapítottuk az anti-DOBV IgG pozitivitást. A 42 negatív savó közül is mindössze egy esetben kaptunk álpozitív eredményt. A specificitás és szenzitivitás értékek meghatározásához kísérleteink eredményeivel
matematikai
számításokat
végeztünk:
a
specificitás
értékének
kiszámításához, a tesztben kapott valódi negatív eredmények számát osztottuk a valódi negatívok és álpozitív minták számának összegével. Míg a szenzitivitást a valódi pozitívok és a valódi pozitívok és álnegatívok összegének százalékos értéke adta meg. Így a specificitást 97,6%-ban, a szenzitivitást 88,8%-ban állapítottuk meg a piacon elérhető Reagena teszttel összehasonlítva. A kísérletet a későbbiekben elvégeztük a natív állapotú rNP antigénnel is, igazolandó, hogy a csonka, denaturált állapotú fehérje antigenitása, specificitása és szenzitivitása nem vész el a denaturálási lépések következtében. Az ELISA kísérlet során visszaköszöntek az előzőekben az rNP50 antigénnel kapottakkal, vagyis az 50 vérmintából 8 esetben kaptunk pozitív eredményt. A továbbiakban, az eredmények megerősítése érdekében mind az 50 minta tesztelését Western blot vizsgálattal is elvégeztük, mind az rNP50, mind pedig az rNP fehérjék alkalmazásával. A fent említett eredményt teljes mértékben megismételtük, vagyis az ELISA és Western Blot vizsgálataink is átfedést mutattak. Kutatócsoportunk egyéb hantavírusokkal folytatott vizsgálatainak részét képezi a hazánkban is előforduló PUUV teljes kapszid fehérjének (PUUV-rNP) a termeltetése szintén E. coli expressziós rendszerben. A DOBV rNP50 alapú ELISA vizsgálataink teljes specificitásának meghatározása érdekében végeztünk keresztreagálási kísérleteket is. Nevezetesen, rNP50 és rNP specificitásának vizsgálatához igazoltan PUUV fertőzött betegek vérszérumait használtuk fel (a mintákat kutatási együttműködés keretében Németoszágból kaptuk – Prof. Dr. Detlev H. Krüger, Charité, Institute of Virology, Berlin) melyeket összehasonlító Western blot vizsgálatokban teszteltük. Westren blot kísérletben az rNP50 nem reagált a PUUV beteg szérumával (11. ábra, A), míg az rNP (11. ábra, B) és természetesen a PUUV-rNP (11. ábra, C) esetében pozitív jeleket kaptunk. A kísérlet is bizonyítja az rNP50 típus specifikus jellegét és így egyértelmű használhatóságát a szerotípusok elkülönítése érdekében.
39
kDa
M
A
B
C
250
150
100 75
50 37
25 20 15 10
11. ábra. Összehasonlító Western blot analízis anti-PUUV antitesttel. (A) rNP50, (B) rNP, (C) PUUV-rNP, M: Marker.
5.2.4. ELISA vizsgálatok eredményei A DOBV fertőzés igazolására a molekuláris vizsgálatok mellett szerológiai vizsgálatokat is elvégeztünk. A korábban rRT-PCR módszerrel vizsgált 125 Apodemus egyed mindegyikénél a DOBV elleni antitestek jelenlétét ELISA kísérletekben határoztuk meg. Bár ritkán, de előfordul, hogy Apodemus rágcsálókat más szerotípusú hantavírus fertőz (pl.: PUUV), így annak érdekében, hogy vizsgálatainkban kizárólag a DOBV ellen termelt antitesteket határozzuk meg, az rNP50 fehérjét választottuk ELISA tesztünk alapjául. ELISA módszerrel összesen 16 Apodemus egyedet találtunk pozitívnak, melyek közül 6 Af,
10 pedig Aa rágcsáló volt. Pozitív állatokra vonatkozó részletes fogási
adatokat a 5.1.1. alpont tárgyalja.
40
5.2.5 A DOBV gyakoriságának megállapítása az rRT-PCR és ELISA vizsgálatok eredményei alapján A 125 kisemlősből 21 (17%) állat (10 Aa és 11 Af) adott pozitív reakciót legalább az egyik módszerrel (rRT-PCR és/vagy ELISA). Öt állat (4%) esetében mindkét módszerrel pozitív eredményt kaptunk, míg öt (4%) rágcsálónál csak molekuláris módszerrel sikerült igazolni a fertőzést. Kizárólag szerológiai tesztünkkel 11 (8,8%) kisemlőst találtunk pozitívnak. 104 állatnál egyik vizsgálat sem mutatta a vírusfertőzés bármely jelét. A következőkben a Magyarországon és Horvátországban fogott egyedeknél kapott eredmények külön kerülnek ismertetésre (6. táblázat). A magyarországi csapdázások során fogott 31 Af egyedből 3 esetben (9,6%) igazolódott valamelyik módszerrel a vírusfertőzés. Kettő hímet találtunk a PCR vizsgálatban pozitívnak (6,45%), melyeket Gyékényes és Pécs közelében csapdáztak. Egy állat (3,2%) esetében sikerült csak specifikus antitesteket detektálni, melyet Sármelléken fogtak be. A hazai állatokkal végzett vizsgálatokban kettős pozitív eredményt nem kaptunk. Az 52 Aa tesztelésekor ezzel szemben három egyed (5,7%) esetében mindkét alkalmazott módszerrel igazoltuk a fertőzést. Kettő Görcsöny, míg egy állat Sármellék környékén került befogásra. Szerológiai tesztben hat állat (11,5%) széruma mutatott IgG pozitív eredményt, melyek a Pécs közeli és a sármelléki vizsgálati területekről származtak. Összesen tehát a 83 tesztelt egyedből 12 (14,5%) volt DOBV-vel fertőzött. Az Észak-Horvátországban fogott 27 Af között találtuk a legtöbb, összesen nyolc DOBV pozitív egyedet (29,6%), melyből három (11,1%) az ELISA tesztben adott specifikus antitest választ, szintén háromnál (11,1%) a rRT-PCR módszerrel detektáltunk virális nukleinsavat, míg két állatnál (7,4%) mindkettő eljárással fertőzést mutattunk ki. Az öt rágcsáló, amelyeknél rRT-PCR módszerrel is sikerült igazolni a fertőzést, Gola mellől származott, míg a specifikus ellenanyaggal rendelkező három kisemlőst Beli Manastir közeli erdőben kerültek az élvefogó csapdákba. Szignifikáns különbséget (p<0,01) találtunk a fertőzött 21 állat nemi eloszlásában is: 13 (62 %) hím és 8 (38 %) nőstény volt a pozitív egyedek között.
41
6. táblázat. A prevalencia megállapítására elvégzett kísérletekben kapott eredmények összefoglaló táblázata.
Magyarország
Horvátország
Af; n= 31
Aa; n= 52
Af; n= 27
Aa; n= 15
rRT-PCR rRT-PCR
rRT-PCR rRT-PCR
rRT-PCR rRT-PCR
rRT-PCR rRT-PCR
+
-
+
-
+
-
+
-
+
0
1
3
6
2
3
0
1
-
2
28
0
43
3
19
0
14
ELISA
5.2.6 Kitekintés, módszerünk további felhasználási területei Bár jelen doktori disszertáció alapját a rágcsálók vizsgálata jelentette, meg kell azonban említeni, hogy rekombináns virális antigén alapú ELISA módszerünk lehetőséget adott
nemcsak
a
rágcsálók
virológiai
vizsgálatára,
hanem
további
humán
kutatási/diagnosztikai vizsgálatok kivitelezésére is. A PTE, Klinikai Központjának (KK) számos intézetével szoros kapcsolatot alakítottunk ki, aminek eredményeként hantavírus fertőzés gyanújával kórházi ápolást igénylő betegek mintáit tudtuk tesztelni. Ezen vizsgálatok eredményeként számos érdekes hantavírus fertőzést igazoltunk. Előzetes szerológiai
vizsgálati
eredményeket
több
esetben
molekuláris
módszerekkel
is
megerősítettük, ami egyértelműen igazolta a hantavírus fertőzés tényét. Így sikerült kimutatnunk első ízben DOBV mimikálta akut vakbélgyulladást. A beteg akut vakbélgyulladás tüneteit produkálta, amit az elsődleges vizsgálatok is alátámasztottak, a műtét azonban nem igazolta a diagnózist. Az operációt követően a páciensnél komoly vesefunkció zavarok jelentkeztek, aminek eredményeként hemodialízis kezelésben részesült. A beteg véréből ezt követően sikerült azonosítani a DOBV-t. Szintén optimalizált ELISA rendszerünk alkalmazásával lehetőség nyílt további szerológiai, terjedés-dinamizmus vizsgálatok elvégzéséhez is. A kísérletek jelenleg is folynak. Ezek a tanulmányok nagyban hozzájárulnak a vírus terjedésének pontosabb megértéséhez és ezzel együtt a potenciális védekezés lehetőségeinek mérlegelését is lehetővé teszik. Ilyen jellegű, kimondottan nagy mintaszámot igénylő vizsgálatok elvégzése a humán minták esetében nehezen kivitelezhető, lévén, hogy a szerológiai tesztek igen drágák. Rágcsálók vizsgálata esetén még az is nehezíti a helyzetet, hogy állatok teszteléséhez jelenleg nem áll rendelkezésre kereskedelmi forgalomban kapható
42
teszt. Rekombináns fehérjénk alalmazása ezeken a területeken is kiemelkedő fontosságú és nagyban hozzájárul nemcsak kutatócsoportunk, de kooperációs parnereink további kísérleteinek tervezéséhez, és sikeres vizsgálatainak kivitelezéséhez.
43
6. Eredmények megvitatása
Az elmúlt néhány évtizedben a hantavírusokkal foglalkozó kutatócsoportok, és ezzel természetszerűen a kutatások száma is jelentősen nőtt szerte a világon. Ezt a tényt nagyon jól igazolja a nemzetközi szakirodalomban megjelent publikációk száma is; míg az 1980-as évek végén 50-60 tudományos közlemény látott napvilágot a témában, ez a szám 2011-re meghaladta az évi 140 publikációt. A HTNV első leírása óta évről évre egyre több hantavírus típust ismerhetünk meg mind Eurázsiában mind Amerikában és most már Afrikában is. A jelenlegi, 2011 óta érvényben lévő, ICTV által jóváhagyott vírus-taxonómiai besorolás 23 törzset regisztrál hivatalosan a Hantavírus genuson belül. Feltételezhetően azonban ez a szám nem hivatalosan lényegesen magasabb, köszönhetően annak is, hogy az utóbbi években rágcsálókon kívül számos cickány fajban, vakondban is kimutatták a kórokozót. Az elmúlt évek egyik legjelentősebb felfedezése a hantavírus kutatásban, a kórokozó jelenlétének igazolása denevérekben is. Ezzel a leírással a vírus-gazda evolúciós kapcsolatokat is újra kell gondolniuk a témában jártas kutatóknak. Hosszú ideig gondolták azt, hogy a hantavírusokat kizárólag rágcsálók terjesztik, amely nézet az elmúlt 5 évben azonban megdőlt. Weiss és munkatársai (2012) eredményei alapján a cickányok, a vakond, és a denevér által terjesztett vírusok egy leszármazási vonalat alkotnak a hantavírusok evolúciójában. Az öko-virológiai kutatásokkal párhuzamosan természetesen egyre többet tudunk meg a vírus pathomechanizmusáról, fertőzési és túlélési mechanizmusáról is, amelyek a fertőzéssel szembeni védekezés lehetőségeiről bővítik ismereteinket. Kutatócsoportunk az elmúlt években számos hantavírus típust kimutatott hazánkban is. Igazolni tudtuk a már ismert típusok, a DOBV (Jakab és mtsai., 2007) és a PUUV (nem publikált) mellett többek között a TULV (Jakab és mtsai., 2008), az SWSV és egyéb cickány (nem publikált) által terjesztett hantavírus genotípust is. Azonban az újonnan felfedezett vírusok jelentős részénél a humán érintettség még nem bizonyított, ezért dolgozatomban a közegészségügyi és járványügyi szempontból is jelentős erdeiegerek által terjesztett DOBV gyakoriságának vizsgálatát és a kimutatott törzsek filogenetikai elemzését végeztem el.
44
6.1. Filogenetikai elemzés Eredményeink a DOBV S szegmensén kódolt nukleokapszid gén filogenetikai elemzésén alapultak. Teljesebb képet csak akkor kapnánk, ha a teljes M szegmens esetében is elvégeznénk a filogenetikai vizsgálatokat, hiszen az ICTV alapelvei szerint a fajmeghatározásnál az M szegmenst is figyelembe kell venni. Számos kutatócsoport ezzel szemben úgy véli, hogy az M szegmenssel végzett elemzések megtévesztőek is lehetnek, hiszen ez a szakasz kódolja a gazdaspecificitást meghatározó glikoproteineket, ami gyorsabban divergál, mint az RNS függő RNS polimerázt vagy a nukleokapszid fehérjét kódoló gének (Plyusnin és mtsai., 2006). Annak ellenére, hogy az NCBI adatbázisában található DOBV nukleokapszid gén szekvenciák száma jelentős (93 szekvencia), a számunkra informatív, a teljes kapszid proteint kódoló szekvenciák száma jóval alatta marad a részleges és a kevésbé összetett elemzést lehetővé tevő szekvenciák számánál. Jelenleg 4 teljes DOBV-Af, 5 DOBV-Ap és 22 DOBV-Aa teljes S szegmens szekvencia található az említett adatbázisban. DOBV-Af esetében egyet Szlovéniában (Kirsanovs és mtsai., 1995), egyet Szlovákiában (Klempa és mtsai., 2003a) és kettőt Görögországban (Nemirov és mtsai., 2003) írtak le. Az általunk leírt 5 DOBV-Af S szegmens szekvencia tehát jelentősen megnöveli az elérhető teljes szekvenciák számát. Valamennyi DOBV-Ap szekvenciát Oroszországban mutatták ki (Klempa és mtsai., 2008, Dzagurova és mtsai., 2012), ami nem meglepő, hiszen a vírust hordozó A. ponticus kelet-európai elterjedési területtel rendelkezik. Habár a DOBV-Ap nem található meg Európa jelentős részén (így hazánkban sem), mégis fontosnak tartottuk elemzésünkben szerepeltetni, annak érdekében, hogy a DOBV evolúcióját érintő problémát jobban szemléltetni tudjuk. Az előbbieknél jelentősen több szekvenciát találhatunk a DOBV-Aa esetében, Dél-Európát kivéve minden régióban leírták már a vírust. A legtöbb vírust (9 törzs) Németországban mutatták ki (Popugaeva és mtsai., 2012, Schlegel és mtsai., 2009), Szlovákiából (Klempa és mtsai., 2004, Sibold és mtsai., 2001) és Oroszországból (Plyusnin és mtsai., 1999, Garanina és mtsai., 2009, Klempa és mtsai., 2008) 6-6 szekvencia ismert, míg Dániából egy teljes S szegmens szekvencia került publikálásra (Nemirov és mtsai., 2004). Bár vizsgálatainkhoz elsősorban a teljes NP gén szekvenciákat igyekeztünk felhasználni, mégis analízisünkhöz egy részleges, 978 nukleotid hosszúságú horvát szekvenciát is csatoltunk. Annak ellenére, hogy az említett minta esetében, mintegy 300 bázispárral rövidebb szakaszt találtunk, mégis fontosnak tartottuk ennek a szekvenciának az analízisét is, hiszen a vírustörzset Kelet-Horvátországban, az 45
általunk vizsgált területektől mintegy 100 km távolságban mutatták ki (Plyusnina és mtsai., 2011). Vizsgálataink eredményeként megállapítottuk, hogy a hazánkban cirkuláló DOBV törzsek, hasonlóan a többi Európában kimutatott vírushoz, a hordózó rágcsálófajoktól függően két egyértelműen szétváló csoportra különülnek el. Eredményeink megerősítik azokat a felvetéseket, melyek a DOBV taxonómiáját érintő vitában jelentkeztek. Plyusnin és munkatársai által 1997-ben első alkalommal izolált SAAV-t A. agrarius rágcsálókból mutatták ki Észtországban, Saaremaa szigeten (Plyusnin és mtsai., 1997). A későbbiekben Európa számos országában mutattak ki kórokozót Aa rágcsálóból, melyek genetikailag azonban jelentősen különböztek a SAAV-tól. Jelenleg, az ICTV kritériumai alapján megkülönböztetünk A. flavicollis által terjesztett DOBV-t és a genuson belül külön fajt jelentő SAAV-t, amit az A. agrarius hordoz. Ezért a kutatók egy része szerint az Aa-ből kimutatott összes vírustörzset SAAV-ként kellene jegyezni, függetlenül attól, hogy az akár jelentős filogenetikai távolságot mutat mind az S, mind pedig az M szegmens alapú analízisekben az észtországi szigeten talált vírussal szemben (Plyusnin és mtsai., 2003, 2006). Ráadásul, Észtország szárazföldi területein elterjedt Aa-ból kimutatott vírus sem képez egy filogenetikai csoportot a szigeten cirkuláló SAAV-val. Ez az elkülönülés akár a terjesztő rágcsálófajt érintő evolúciós különbségekkel is magyarázható: a szigeten élő, földrajzilag tehát izolált egerek két nukleolusz organizáló régióval kevesebbel rendelkeznek, mint a kontinens más részein élő egyedek (Klempa és mtsai., 2012). A helyzetet még tovább árnyalta, hogy Klempa és munkatársai (2008) Kelet-Európában Ap-ból is mutattak ki egy új hantavírus típust, amivel az S szegmenst érintő filogenetikai elemzések során a DOBV-Af monofiletikus testvércsoportot alkotott. Ezt a megfigyelést a mi eredményeink is alátámasztották. Az előbbi tények ismeretében az a korábbi meggyőződés, mely szerint a hantavírusok gazdaspecifikusak, a DOBV esetében is megdőlni látszik. Az európai hantavírusokkal foglakozó kutatók egy része szerint ugyanis a DOBV-t három rágcsálófaj terjeszti: az A. flavicollis, A. agrarius és az A. ponticus. Klempa és munkatársai (2012b) legutóbbi közleményükben javaslatot tettek a DOBV fajon belüli genotípusok megkülönböztetésére. Ennek értelmében a Dobrava-Belgrade fajon (species) belül, Dobrava, Saaremaa, Kurkino és Sochi genotípusok bevezetését szorgalmazzák, az első kimutatási/izolálási helytől függően. Az elmúlt években megjelent tudományos közlemények egy jelentős részében a szerzők részleges adatokra alapozva vonnak le sokszor téves következtetéseket az általuk vizsgált vírustörzs leszármazási, rokonsági kapcsolatairól. Maes és munkatársai (2009) 46
meghatározták az S és M szegmens esetében a törzsfák készítéséhez szükséges minimális szekvencia hosszúságot, ami S szegmens esetében 900 nukleotid (300 aminosav), azaz a teljes nukleokapszid gén 70%-ában határozták meg. Ezzel szemben sokszor ennek az értéknek a töredékével készülnek/készültek filogenetikai elemzések. Plyusnina és munkatársai (2009) által végzett vizsgálatban ennek okán kaphattak olyan eredményeket, melyben az észtországi SAAV és a hazánkban, Szlovákiában valamint Oroszországban talált Aa-ból izolált vírustörzsek közeli rokonságban álltak egymással. Ez az eredmény már a jelentős földrajzi távolság miatt is nehezen magyarázható. Szintén Plyusnina és munkatársai (2011) végezték el azt a munkát, melyben horvátországi Aa-ban talált vírusok szekvenciáit hasonlították össze a szlovák, orosz, dán és észt vírusokkal. Elemzésük mindössze 467 nukleotidon alapszik, holott a publikációban leírt és az adatbázisban is szereplő egyik szekvenciából (FN813291, törzs: SAAV/Croatia/Aa12) rendelkekésre állt a nukleokapszid gént kódoló régió 978 bázis hosszúságú szakasza. Ismerve az adtabázisban fellelhető jelentős számú DOBV-Aa nukleokapszid gén szekvenciák számát, a rövidebb szakasz (467 nt) használatának oka érthetetlen. Az általunk elvégzett filogenetikai vizsgálatból, amely az S szegmens több mint 900 nukletidos lefedettségével készült, egyértelműen kiderül, hogy a fent említett horvátországi Aa-ból kimutatott vírus nem a SAAV csoportjába tartozik, hanem sokkal inkább a DOBV-Aa szekvenciákkal alkot egy filogenetikai ágat. Plyusnina és munkatársai valószínűleg az elemzésükben használt rövidebb szekvencia miatt kaphattak téves eredményeket. A fent említett példa is jól mutatja egyrészt a DOBV körüli nevezéktani, leszármazási kapcsolatok tisztázatlan kérdéseit, másrészt egyértelműen rávilágít arra, hogy a vírustaxonomiai hipotézisek megválaszolásához elengedhetetlen a megfelelő hosszúságú, variábilis génszakasz elemzése. Eddigi szakirodalmi ismereteinkre, illetve saját filogenetikai vizsgálataink eredményeire alapozva, kutatócsoportunk egyértelműen osztozik Klempa és munkatársai 2012-ben publikált tanulmányának következtetésével, miszerint a DOBV speciesen belül meg kell különböztetni a Dobrava, Saaremaa, Kurkino és Sochi genotípusokat. Ennek megfelelően nem támogatjuk azt a nézetet, miszerint a SAAV egy külön fajként szerepeljen a hantavírus genuson belül (Klempa és mtsai., 2012b).
47
6.2. Rekombináns fehérjék alkalmazása A rekombináns fehérjék sokrétű alkalmazásai lehetővé teszik az egyes laboratóriumok számára, hogy akár saját fejlesztésű szerológiai tesztet (ELISA, Western blot) használjanak vizsgálataikban, melyek akár kutatási, akár diagnosztikai célokra is felhasználhatóak. Annak ellenére, hogy kereskedelmi forgalomban is vásárolhatók a hantavírus fertőzés kimutatására alkalmas tesztek, ezek kutatási célú használata nem megoldható, lévén, hogy elsősorban humán minták vizsgálatára optimalizáltak. Másik jelentős hátrányuk ezeknek a teszteknek, igen magas forgalmazási áruk, ami ezáltal nem teszi lehetővé nagy számú minta szerológiai elemzését. A rekombináns fehérje-expressziós technikák széles spektruma lehetőséget ad a legmegfelelőbb fehérjetermelő rendszer kiválasztására, figyelembe véve a laboratórium lehetőségeit, illetve a kívánt rekombináns protein tulajdonságait. Hantavírusok esetében immunológiailag a nukleokapszid protein és a glikoproteinek aktívak. A két fehérje természete meglehetősen különbözik, hiszen míg a glikoproteinek poszttranszlációs módosuláson esnek át, addig az NP esetében nem történik glikoziláció. Ennek megfelelően vizsgálataink megkezdésekor prokarióta, nevezetesen az E. coli expressziós rendszert választottunk, amely ugyan nem teszi lehetővé a fehérje poszttranszlációs módosítását, (de ez az NP esetében nem is szükséges) optimális esetben azonban nagy mennyiségű, immunológiailag aktív, tiszta fehérje előállítására alkalmas. A hantavírus fertőzések során a nukleokapszid protein indukálja a legnagyobb mértékben a humorális immunválaszt (Kallio-Kokko és mtsai., 2001, Zöller és mtsai., 1989), így a szerológiai metodikákban is előszeretettel használják. Az NP N terminális végén elhelyezkedő lineáris epitópok ellen termelődött antitestek nem típusspecifikusak, így jelentős keresztreakciót mutatnak a hantavírus genus tagjai között különböző szerológiai tesztekben használva (Elgh és mtsai., 1996, Elgh és mtsai., 1998). Ennek megfelelően a különböző hantavírus szerotípusok elkülönítése a teljes NP fehérje alkalmazásával a hagyományos szerológiai tesztekben nehezen megvalósítható (Lundkvist és mtsai., 1997). A legvariánsabb régiók az 50-80 és 230-310 aminosavak között helyezkednek el (Kaukinen és mtsai., 2005), vagyis ezek a régiók specifikusak a különböző hantavírus törzseknél. Ennek érdekében génsebészeti módszerekkel olyan rekombináns fehérjék is előállíthatók, melyek nem tartalmazzák az N terminális szakaszt, viszont hordozzák a variábilis régiókat. Hantavírusok esetében már számos esetben fejlesztettek csonka proteinekkel bíró ELISA teszteket, melyek alkalmasak voltak a 48
különböző szerotípusok elkülönítésére (Koma és mtsai., 2010, Koma és mtsai., 2012, Li és mtsai., 2006, Lü és mtsai., 2011, Maes és mtsai., 2004, Nakamura és mtsai., 2008, Yasuda és mtsai., 2012). Kutatásunk során Araki és munkatársai (2001) munkáját alapul véve olyan rekombináns DOBV nukleokapszidot állítottunk elő, mely nem tartalmazta az amino terminális első 49 aminosav részét (rNP50; 50-429 aminosav). Vizsgálatainkban sikerrel alkalmaztuk csonka rekombináns antigént mind humán, mind pedig állati minták specifikus tesztelésében. PUUV ellen termelődött humán IgG alkalmazásával ismét igazoltuk azt a korábbi megállapítást, miszerint az NP első 49 aminosav része által formált epitópok ellen termelődött antitestek jelentős keresztreakciót mutatnak a különböző típusok között, így a szerotípusok meghatározását nem teszik lehetővé. 6.3. Hantavírus fertőzés prevalenciájának megállapítása Vizsgálatainkban,
a
DOBV
fertőzések
bizonyítására
és
a
vírusfertőzés
gyakoriságának becslésére együttesen alkalmaztunk szerológiai tesztet (ELISA) és molekuláris vizsgálatot (RT-PCR) is. A két metodika egyaránt rendelkezik számos előnnyel és hátránnyal, így a hantavírusokat hordozó rágcsálók vizsgálatánál önállóan vagy egymást kiegészítő eljárásként alkalmazhatjuk őket. Az állatok fertőződését követően a virémiás szakasz gyorsan, körülbelül két hét alatt lezajlik, ami erősen behatárolja a molekuláris technikák alkalmazási lehetőségeit, a vírus vérből történő kimutatását. Ennek megfeleleően a molekuláris kimutatási vizsgálatokra legalkalmasabb a hantavírusok szaporodásának helyet adó tüdőszövet feldolgozása. Ez viszont egyértelműen azt jelenti, hogy kizárólag elpusztult állattal végezhetők el a kísérletek. A vírusfertőzés következtében induló immunfolyamatok vizsgálatával azonban jelentősen bővíthető a metodikák tárháza. Egyes szerológia eljárások, mint például a hagyományos ELISA vizsgálat standard mikrobiológiai laboratóriumokban is minden gond nélkül kivitelezhetők, míg mások (pl. fókusz-redukciós neutralizációs teszt) komoly biztonsági feltételek mellett végezhetők csak el. Kutatásunk során 125 Apodemus egyedet vizsgáltunk. A fertőzés meglétét rRT-PCR módszerrel és saját fejlesztésű, rekombináns nukleokapszid fehérjén alapuló ELISA teszttel igazoltuk, mely vizsgálatokat az összes állat esetében elvégeztük. A két metodikával 17%-os pozitivitást (21/125) tudtunk kimutatni, 5 rágcsáló csak PCR-rel, 11 csak ELISA-val, 5 mindkét eljárással pozitívnak bizonyult. Az eltérés oka, a rágcsálókban 49
megfigyelhető fertőzési folyamat ismeretében jól magyarázható (12. ábra). A vírusgazdában a kórokozó fertőzése három szakaszra osztható. Az első fázisban, a fertőzést követő napokban a vírus gyorsan szaporodik a tüdőben, viszont a vérben jelenlévő vírusok mennyisége ebben a stádiumban sem kiemelkedően jelentős. Feltételezhető tehát, hogy a vírust elsősorban molekuláris biológia technikákkal lehet nagyobb eséllyel kimutatni a fertőzés ezen szakaszában, elsősorban természetesen az állatok tüdőszövetét használva. A kórokozó jelenlétére az immunrendszer válasza valamelyest később indul be, így szerológiai módszerekkel a vírus elleni antitestek kimutatása ekkor nehezebb. Ez lehet az oka annak, hogy öt esetben csak molekulárisan tudtuk igazolni a fertőzést. A következő periódusban, a fertőzést követő 14-16. naptól kezdődően az immunválasz szerepe jelentősen növekszik, a kórokozó mennyisége azonban jelentős csökkenést mutat a tüdőben. Ebben a szakaszban nagy biztonsággal mindkét módszerrel igazolni lehet a fertőzés tényét. A harmadik stádiumban szinte teljesen visszaszorul a kórokozó mennyisége, ezzel párhuzamosan azonban a fertőzéssel szemben fellépő immunológiai folyamatok kiteljesednek. Ennek megfelelően ebben az esetben elsősorban a szerológiai módszerek igazolják a fertőzést. Az állat és a vírus részéről a koevolúció következtében kialakult folyamatok miatt az immunrendszer a kórokozót nem tudja teljesen eliminálni, minimális szinten a szaporodása mindig biztosított. Habár a vírus jelen van a tüdőben, amennyiben nincs lehetőség a vírus szaporítására, még érzékeny izolálási és RT-PCR technikákkal sem járhatunk sikerrel. A DOBV szaporításához minimálisan BSL-3 szintű laboratóriumra van szükség, és a technikai feltételek megléte sem jelent minden esetben sikert, hiszen a hantavírusok nehezen szaporíthatók szövetkultúrákon.
50
RT-PCR pozitív ELISA negatív
RT-PCR pozitív ELISA pozitív
RT-PCR negatív ELISA pozitív
100
75
75
50
50
25
25
0
0 10
0 0 0
Akut
20
30
40
50
60
70
80
90
Antitest válasz
Relatív hantavírus szint
100
100
A fertőzést követő napok
Perzisztáló fázis
12. ábra. Hantavírus fertőzés dinamikája a rágcsálókban. Szaggatott vonal: vírus mennyisége a vérben, fekete vonal: vírus relatív mennyisége a tüdőben, félszaggatott vonal: IgG antitest titer a vérben (Easterbrook és Klein, 2008 alapján).
Általános gyakorlat, hogy a kórokozók gyakoriságának megállapítására először a rágcsálók mintáit szerológiai tesztelésnek vetik alá, majd az igazolt pozitív mintákkal végeznek további PCR vizsgálatokat a fertőzés tényének megerősítésére. Eredményeink egyértelműen rámutattak arra, hogy ezzel a stratégiával a fertőzés korai stádiumában lévő rágcsálók pozitivitása nem kimutatható, ami téves következtetésekhez vezethet, hiszen jelentősen csökkentheti a vírus gyakoriságát. Plyusnina és munkatársai (2009) a fent említett módon vizsgáltak Magyarországon csapdázott rágcsálók mintáit, annak érdekében, hogy megállapítsák a DOBV, SAAV és PUUV prevalenciáját. Eredményeik alapján elmondható, hogy az általuk vizsgált 362 Apodemus sp. 10,5%-a (38/362) lett szerológiai módszerrel pozitív, melyből mindössze kettő esetben sikerült további RT-PCR vizsgálattal kimutatni a virális nukleinsavat. Az eredmények alapján megállapítható, hogy az általuk végzett kísérletben a molekuláris vizsgálatokkal megerősített pozitív minták aránya 0,5% volt, míg ez az értek a mi vizsgálatainkban 16-szor magasabb, 8%-os értéket mutatott. A különbség egyértelműen abból adódik, hogy jelen disszertáció elkészítéséhez szükséges vizsgálatainkban nemcsak az ELISA pozitív mintákat vizsgáltuk, hanem RT-PCR 51
vizsgálatnak vetettük alá a szerológiailag negatívnak bizonyult mintákat is. A környező országokban végzett felmérésekben a kutatócsoportok hasonló eljárásmódot alkalmaztak. Plyusnina és munkatársai (2011) Horvátországban szintén elvégezték az előbb említett kísérleteket. Összesen 332 Apodemus nemzettségbe tartozó egyedet vizsgáltak Western blot módszerrel, és 20 egyednél (2 A. agrarius, 6 A. flavicollis, 12 A. sylvaticus; 6,3%) sikerült azonosítani a nukleokapszid antigént. Amennyiben csak az Aa és Af fertőzöttségét nézzük, akkor 5%-os pozitivitást kaptak (8/159). A 20 állat tüdőszövetét használták további molekuláris vizsgálatra, amellyel megerősítették a 2 Aa fertőződését, a 6 Af-ből azonban csak 4 esetben mutatták ki a virális RNS-t. Avsic-Zupanc és munkatársai még 2000-ben mérte fel Szlovéniában (a DOBV kimutatásának első helyszínén) a vírus gyakoriságát és genetikai variabilitását 260 Apodemus (231 Af, 21 Aa, 8 As) egyedet vizsgálva. Az állatok 20,4%-a mutatott szeropozitivitást IFA és ELISA tesztekben (53/260), melyből 49 Af és 4 Aa volt, közöttük 27 egyed volt RT-PCR pozitív, illetve nested PCR segítségével további 23 rágcsálónál sikerült molekulárisan is igazolni a fertőzést (Avsic-Zupanc és mtsai., 2000).
52
7. Összefoglalás A hantavírusok világszerte előforduló, kisemlősök által terjesztett kórokozók. Jelentős részük a virális zoonózisok közé tartozik, így a fertőzések olykor súlyos humán megbetegedéseket
eredményeznek.
Eurázsiában
és
feltételezhetően
Afrikában
a
veseszindrómával járó hemorrhágiás lázat, míg Amerikában a hantavírus kardiopulmonális szindrómát okozzák. A vírusok állatokkal való kapcsolata évmilliókra visszatekintő koevolúció eredménye. Habár a kórokozó az állatok tüdejében szaporodik a legnagyobb mértékbe, maga a hordozó kisemlős nem betegedik meg a fertőzés során, a kórokozót azonban élete végéig üríti testváladékaikkal. A humán megbetegedések jelentős részében a vírus ezen testváladékok vaporizációjával vagy közvetlen kontaktussal kerül át az emberi szervezetbe. Európában a legnagyobb számban a Puumala vírus (PUUV) és a Dobrava-Belgrade vírus (DOBV) okoz humán megbetegedést, utóbbit három rágcsáló faj is hordozza: Apodemus flavicollis (DOBV-Af), az A. agrarius (DOBV-Aa) és az A. ponticus DOBV-Ap. Az A. agrarius hordozója még a Saaremaa vírusnak is, melyet ezidáig csak az Észtországhoz tartozó Saaremaa szigeten mutattak ki. A hantavírus fertőzések kimutatására számos módszer áll rendelkezésünkre. A molekuláris vizsgálat (RT-PCR) – mely a legmegbízhatóbb és egyben genotípus meghatározásra is alkalmas – mellett a szerológiai vizsgálatok közül a neutralizációs tesztek bizonyultak a legmegfelelőbbnek. Kiváltképp a második eljárás megkívánja a vírus szaporítását, ami azonban csak megfelelő biztonsági laboratóriumokban (minimum BSL-3) végezhető el. Ennek okán több kutatócsoport, valamint a gazdasági életben szerepet vállaló kereskedelmi és kutatás-fejlesztési cég is számos tesztet fejlesztett ki, melyeket rutinszerűen,
különösebb
óvintézkedés
nélkül
alkalmazhatunk
akár
standard
mikrobiológiai laboratóriumokban. A hantavírusok nagymértékű földrajzi elterjedésével párhuzamosan, genetikai variabilitásuk és így antigentiásuk is változó lehet, így e tesztek legnagyobb hátránya, hogy az adott régióban/országban cirkuláló vírustörzseket nem minden esetben képesek teljesen specifikusan kimutatni. Sajnos, a kereskedelemi forgalomban kapható tesztek, melyek akár a diagnosztikában, akár a kutatásban használhatóak lennének, igen költségesek, így rutinszerű alkalmazásuk még a magasabb kutatási költségvetéssel rendelkező országok számára is nehezen megoldható. Munkánk során célunk volt a Dél-Dunántúlon és Észak-Horvátországban gyűjtött Apodemus egyedekből rRT-PCR segítségével kimutatott vírusok molekuláris jellemzése,
53
valamint a vírus tényleges gyakoriságának megállapítása RT-PCR és ELISA módszerek együttes alkalmazásával. Vizsgálatainkban összesen 125 Apodemus egyedet teszteltünk (67 Apodemus agrarius, 58 Apodemus flavicollis). Munkánk első lépéseként, a rágcsálók tüdejéből mutattuk ki a kórokozót, majd a vírus nukleokapszidját kódoló génszakaszt (NPG) sokszoroztuk fel további molekuláris és filogenetikai elemzések céljából. Az előzetes kísérletekben a 125 állatból 10 esetében sikerült kimutatni a DOBV nukleinsavat, melyek közül 8 mintából tudtuk a teljes NPG-t amplifikálni. A filogenetikai elemzés elvégzése során a kimutatott vírustörzsek a várakozásoknak megfelelően a DOBV-Af és DOBV-Aa kládokhoz csatlakoztak. Eredményeink alátámasztották azt a vélekedést, mely szerint a DOBV-t több rágcsáló is terjeszti, és nem minden A. agrarius hordozta vírus SAAV. Amennyiben a vírus szaporításához a megkövetelt biztonsági feltételek adottak lesznek, célunk a teljes genom analízis elvégzéséhez az elmaradt két vírusnál a teljes NPG-t kódoló S szegmenst, mind a 10 törzs esetében a glikoproteineket kódoló M szegmenst és az RNS polimerázt kódoló L szegmenst sokszorozni. A gyakoriság felmérése érdekében az összes állat vérmintáját szerológiai módszerrel (ELISA) is megvizsgáltuk. Ennek érdekében csonka rekombináns NPG-t állítottunk elő Escherichia coli expressziós rendszer segítségével, melyet indirekt ELISA fejlesztéséhez használtunk fel. A szenzitivitás (88,8%) és specificitás (97,6%) értékek meghatározása
után,
módszerünket
alkalmasnak
találtuk
vizsgálataink
további
folytatásához. A kisemlősökkel végzett vizsgálatok eredményeiből egyértelműen látszik, hogy a vírus gyakorisága nagyobb, mint amit az előzetes kísérletek eredményei illetve más kutatócsoportok tanulmányai alapján becsülni lehetett. Jelen tanulmányban tesztelt állatok jelentős hányada, 17%-a (21/125) legalább az egyik módszerrel pozitívnak bizonyult: öt állat (4%) volt mindkét módszerrel pozitív, míg öt rágcsálónál (4%) csak molekuláris módszerrel, 11 (8,8%) esetben pedig csak szerológiával sikerült igazolni a fertőzést. Eredményeink rámutattak, hogy a vírus gyakoriságának megállapítása érdekében szükséges a PCR és szerológiai módszer párhuzamos, egyidejű alkalmazása. Mindezen eredmények mellet, jelentős sikernek tekintjük, hogy kidolgoztunk egy hatékony módszert, amelyet nagy biztonsággal használhatunk a későbbiekben akár humán vizsgálatokra, akár további hantavírussal összefüggő kutatásokra is (pl. fertőzésterjedési dinamizmus vizsgálatok), mivel egyaránt alkalmas a Magyarországon cirkuláló hatnatvírus törzsek kimutatására, illetve a különböző szerotípusok elkülönítésére.
54
8. Summary Hantaviruses are widespread infectious agents carried by different rodent species. The majority of them belongs to viral zoonotic pathogens, sometimes causing severe human infections. Hantaviruses inflict hemorrhagic fever with renal syndrome in Eurasia and supposedly in Africa, and hantavirus cardio-pulmonary syndrome in the Americas. The relationship between the virus and its host species is a result of a several million year co-evolution. Although virus replication is most intense in the infected rodents' lungs, these animals do not develop disease, instead they carry and spread the pathogens throughout their lifetime by body fluids. In the majority of infections, the virus gets into the human body by vaporization of rodent body fluids or by direct contact. In Europe, Puumala (PUUV) and Dobrava-Belgrade (DOBV) hantaviruses are the most abundant hantaviral infectious agents. DOBV is carried by three rodent hosts: Apodemus flavicollis (DOBV-Af), A. agraius (DOBV-Aa) and A. ponticus (DOBV-Ap). A. agrarius is also the host of Saaremaa virus (SAAV), which has only been detected in the Estonian island of Saaremaa. There are a variety of methods to identify hantaviral infections. Molecular biological methods (RT-PCR) - also enabling genotyping - and virus neutralization tests proved to be the most reliable tools. The latter technique requires virus culturing, which can only be carried out in high-containment laboratories (BSL-3 level). As a result, multiple research teams as well as companies with research and development profile have developed numerous tests, that can be performed under routine circumstances in standard microbiological laboratories. Along with hantaviruses' wide geographical range, they possess high genetic and antigenic variability, hence certain tests occasionally fail to specifically detect circulating local virus strains. Sadly, commercially available test tools are expensive, making their use difficult even for countries with a high research budget. Our aims were the molecular biological characterization of viruses detected by rRT-PCR in rodents captured in the Southern Transdanubia and Northern Croatia as well as the accurate estimation of virus prevalence by using RT-PCR and ELISA in parallel. A total of 125 Apodemus individuals (67 Apodemus agrarius, 58 Apodemus flavicollis) were tested. Firstly, viral pathogens were detected in the rodents' lung tissues, followed by amplification of the gene encoding the viral nucleocapsid protein (vNP) for further molecular biological and phylogenetic analyses. During preliminary experiments, DOBV nucleic acid could be detected in ten cases out of the 125 animals, while total 55
nucleocapsid protein gene was amplified from eight samples. Identified virus strains were belonging to the DOBV-Af and DOBV-Aa clades, according to the expectations. Our results supported the hypothesis that DOBV is spread by multiple rodent species, and that not all A. agrarius rodents are hosts of SAAV. Given that we have the required biosafety level circumstances for virus culturing, we would like to amplify the whole S segment encoding the vNP in the missing two cases; furthermore, we are also going to amplify the M segment encoding the glycoproteins and L segment encoding the viral RNA polimerase in all ten cases to be able to analyze the whole viral genome. To estimate hantavirus prevalence in the most accurate way, blood samples of all collected animals were tested also by serological methods (ELISA). A truncated recombinant nucleocapsid protein was produced in an E. coli bacterial expression system, for use in indirect ELSIA. After determining sensitivity (88,8%) and specificity (97,6%) values, our method was found suitable for serological screening of rodent blood samples. Combined RT-PCR and ELISA screening results clearly show that viral prevalence is higher than estimated based on preliminary experiments and on studies of other research teams. A significant amount, 17% (21/125) of small mammals were positive for hantavirus with at least one testing method. Five animals (4%) were positive with both methods, five (4%) were positive with molecular and 11 (8,8%) animals were positive with serological methods. Our data show that it is necessary to use both molecular and serological testing methods simultaneously to estimate virus prevalence at the most accurate level. Next to the above mentioned results, we consider it a success that our serological method is suitable even for testing human samples or other hantavirus-related studies (infection spread dynamics), due to being appropriate for the detection of hantavirus strains circulating in Hungary, as well as for the differentiation of viral serotypes.
56
9. Köszönetnyílvánítás Ezúton szeretném megköszönni mindazoknak, akik bármilyen formában segítették munkámat, és ezáltal e disszertáció létrejöttét. Elsőként témavezetőmnek, Dr. Jakab Ferencnek köszönöm munkám irányítását, szakmai támogatását. Köszönöm, hogy helyet biztosított számomra évekkel ezelőtt laboratóriumában. Köszönöm a PTE TTK Állatökológiai Tanszék munkatársainak, kiváltképp Dr. Horváth Győzőnek, hogy az általuk gyűjtött állatokkal dolgozhattam. Köszönöm Dr. ifj. Kellermayer Miklósnak, hogy a PTE ÁOK Biofizikai Intézetében elsajátíthattam a rekombináns fehérjetermelési technikákat. Köszönettel tartozom Madai Mónika, Oldal Miklós, Pintér Réka Dóró Renáta és Kemenesi Gábor munkatársaimnak a laboratóriumi munkában nyújtott segítségükért, baráti támogatásukért. Köszönöm barátaimnak, Dr. Szabadfi Krisztinának és Szalontai Bálintnak, hogy mindig mellettem álltak. Hálás vagyok a Sorsnak, hogy PhD éveimet velük tölthettem. Végezetül köszönöm férjemnek a kitartást, a biztatást és a sokszor erőn felüli támogatást.
57
10. Irodalomjegyzék Alexeyev OA, Morozov VG (1995): Neurologac manifestations of hemorrhagic fever renal syndrome caused by Puumala virus? Review of 811 cases. Clin Infect Dis; 20(2): 255-8. Arai S, Song JW, Sumibcay L, Bennett SN, Merurkar VR, Parmenter C, Cook JA, Yates TL, Yanagihara R (2007): Hantavirus in northern short-tailed shrew, United States. Emerg Infect Dis, 13(9): 1420-3. Arai S, Ohdachi SD, Asakawa M, Kang HJ, Mocz G, Arikawa J, Okabe N, Yanagihara R (2008): Molecular phylogeny of a newfound hantavirus int he Japanese shrew mole (Urotrichus talpoides). Proc Natl Acad Sci USA; 105(42): 16296-301. Araki K, Yoshimatsu K, Ogino M, Ebihara H, Lundkvist A, Kariwa H, Takashima I, Arikawa J (2001): Truncated hantavirus nucleocapsid proteins for serotyoing Hantaan, Seoul, and Dobrava hantavirus infections. J Clin Microbiol; 39(7):2397-404. Araki K, Yoshimatsu K, Lee BH, Kariwa H, Takashima I, Arikawa J (2004): a new model of Hantaan virus persistence in mice: the balance between HTNV infection and DC8(+) T-cell responses. Virology; 322(2): 318-27. Avsic-Zupanc T, Xiao SY, Stojanovic R, Gligic A, van der Groen G, LeDuc JW (1992): Characterisation of Dobrava virus: a Hantavirus from Slovenia, Yugoslavia. J Med Virol; 38(2): 132-7. Avsic-Zupanc T, nemirov K, Petrovec M, Trilar T, Poljak M, vaheri A, Plyusnin A (2000): Genetic analysis of wild-type Dobrava hantavirus in Slovenia: co-existence of two distinct genetic lineages within the same natural focus. J Gen Virol; 81(Pt 7): 1747-55. Belkaid Y (2007): Regulatory T cells and infection: a dangerous necessity. Nat Rev Immunol; 7(11): 875-88. Bernstein AD, Apekina NS, Mikhailova TV, Myasnikov YA, Khlyp LA, Korotkov YS, Gavrilovskaya IN (1999): Dynamics of Puumala hantavirus infection in naturally infected banc voles (Clethrinomys glareolus). Arch Virol; 144(12): 2415-28. Botros BA, Sobh M, Wierzba T, Arthur RR, Mohareb EW, Frenck R, El Refaie A, Mahmoud I, Chapman GD, Graham RR (2004): Prevalence of hantavirus antibody in patients with chronic renal disease in Egypt. Trans R Soc Trop Med Hyg; 98(6): 331-6. Boudreau EF, Josleyn M, Ullman D, Fisher D, Dalrymple L, Sellers-Myers K, Loudon P, Rusnak J, Rivard R, Schmaljohn C, Hooper JW (2012): A Phase 1 clinical trial of Hantaan virus and Puumala virus M-segment DNA vaccines for hemorrhagic fever with renal syndrome. Vaccine; 30(11): 1951-8.
58
Bowen MD, Gelbmann W, Ksiazek TG, Nichol ST, Nowotny N (1997): Puumala virus and two genetic variants of Tula virus are present in Austrian rodents. J Med Virol; 53(2): 174-81. Brummer-Korvenkontio M, Vaheri A, Hovi T, von Bonsdorff CH, Vuorimies J, Manni T, Penttinen K, Oker-Blom N, Lähdevirta J (1980): Nephropathia epidemica: detection of antigen in bank voles and serologic diagnosis of human infection. J Infect Dis; 141(2): 131-4. Brummer-Korvenkontio M, Vapalahti O, Henttonen H, Koskela P, Kuusisto P, Vaheri A (1999): Epidemiological study of nephropathia epidemica in Finland 1989-96. Scand J Infect Dis; 31(5): 427-35. Childs JE, Ksiazek TG, Spiropoulou CF, Krebs JW, Morzunov, Maupin GO, Gage KL, Rollin PE, Sarisky , Enscore RE et al. (1994): Serologic and genetic identification of Peromyscus maniculatus as the primary rodent reservoir for a new hantavirus in the southwestern United States. J Infect Dis; 169(6): 1271-80. Clement J, Lameire N, Kevaerts E, Maes P, Van Ranst M (2003): Hantavirus infections in Europe. Lancet Infect Dis; 3(12):752-3; discussion 753-4. Clement J, Vercauteren J, Verstraeten WW, Ducoffre G, Barrios JM, Vandamme AM, Maes P, Van Ranst M (2009): Relating increasing hantavirus incidences to the changing climate: the mast connection. Int J Health Geogr; 8:1. Dohmae K, Koshimizu U, Nishimune Y (1993): In utero and mammary transfer of hantavirus antibody from dams to infant rats. Lab Anim Sci; 43(6): 557-61. Dohmae K, Nishimune Y (1998): Maternal transfer of Hantavirus antibodies in rats. Lab Anim Sci; 48(4): 395-7. Duchin JS, Koster FT, Peters CJ, Simpson GL, Tempest B, zaki SR, Ksiazek TG, Rollin PE, Nichol S, Umland ET et al. (1994): Hantavirus pulmonary syndrome: a clinical description of 17 patients with a newly recognized disease. The Hantavirus Study Group. N Engl J Med; 330(14): 949-55. Dzagurova TK, Klempa B, Tkachenko EA, Slyusareva GP, Morozov VG, Auste B, Krüger DH (2009): Molecular diagnostics of hemorrhagic fever with renal syndrome during a Dobrava virus infection outbreak in the European part of Russia. J Clin Microbiol; 47(12): 4029-36. Dzagurova TK, Witkowski PT, Tkachenko EA, Klempa B, Morozov VG, Auste B, Zavora DL, Iunicheva IV, Mutnih ES, Krüger DH (2012): isolation of Sochi virus from a fatal case of hanatvirus disease with fulminant clinical course. Clin Infect Dis; 54(1):e1-4. Easterbrook JD, Zink MC, Klein SL (2007): Regulatory T cells enhance persistence of the zoonotic pathogen Seoul virus in its reservoir host. Proc Natl Acad Sci USA; 104(39): 15502-7.
59
Easterbrook JD, Klein SL (2008): Immunological mechanisms mediating hantavirus persistence in rodent reservoirs. PLoS Pathog; 4(11): e1000172. Elgh F, Lundkvist A, Alexeyev OA, Wadell G, Juto P (1996): a major antigenic domain for the human humoral response to Puumala virus nucleocapsid protein is located at the amino-terminus. J Virol Methods; 59(1-2): 161-72. Elgh F, Linderholm M, Wadell G, Tärnyik A, Juto P (1998): Development of humoral cross-reactivity to the nucleocapsid protein of heterologous hantaviruses in nephropathia epidemica. FEMS Immunol Med Microbiol; 22(4): 309-15. Escutenaire S, Chalon P, Heyman P, Van der Auwera G, van der Groen G, Verhagen R, Thomas I, Karelle-Bui L, Vaheri A, Pastoret PP, Plyusnin A (2001): Genetic characterization of Puumala hantavirus strains from Belgium: evidence for distinct phylogenetic lineage. Virus Res; 74(1-2): 1-15. Faludi G, Ferenczi E (1995): Serologically verified hantavirus infections in Hungary. Acta Microbiol Immunol Hung; 42(4): 419-26. Ferenczi E, Rácz G, Szekeres J, Balog K, Tóth E, Takács M, Csire M, Mezey I, Berencsi G, Faludi G (2003). New data for the public health importance of hantaviruses in Hungary (Article in Hungarian). Orv Hetil; 144(109):467-74. Ferenczi E, Rácz G, Faludi G, Czeglédi A, Mezei I, Berencsi G: Natural foci of classical emerging viral Zoonoses in Hungary (2005). Emerging biological threat; vol. 370. 43-50. Filipe AR, Andrade HR, Sommer AI, Traavik T (1991): Hantaviral antigens and antibodies in wild rodents in Portugal. Acta Virol; 35(3): 287-91. French G, Foulke R, Brand O, Eddy G (1981): Korean hemorrhagic fever: propagation of the etiologic agent in a cell line of human origin. Science; 211(4486):1046-8. Gajdusec DC (1962): Virus hemorrhagic fevers. Special reference to hemorrhagic fever with renal syndrome (epidemic hemorrhagic fever). J Pediatr; 60(6): 841-57. Garanina SB, Platonov AE, Zhuravlev VI, Murashkina AN, Yakimenko VV, Korneev AG, Shipulin GA (2009): Genetic diversity and geographic distribution of hantaviruses in Russia. Zoonoses Public Health; 56(6-7): 297-309. Gavrilovskaya IN, Shepley M, Shaw R, Ginsberg MH, Mackow ER (1998): Beta3 Integrins mediate the cellular entry of hantaviruses that cause respiratory failure. Proc Natl Acad Sci USA; 95(12):7074-9. Geimonen E, Neff S, Raymond T, Kocer SS, Gavrilovskaya IN, Mackow ER (2002): Pathogenic and nonpazhogenic hantaviruses differentially regulate endothelial cell responses. Proc Natl Acad Sci USA; 99(21): 13837-42.
60
Glass GE, Child JE, Korch GW, Leduc JW (1988): Association of intraspecific wounding with hantaviral infection in wild rats (Rattus norvegicus). Epidemiol Infect; 101(2): 459-72. Gligic A, N Dimkovic, SY Xiao, Buckle GJ, Jovanovic D, Velimirovic D, Stojanovic R, Obradovic M, Diglisic G, Micic J et al. (1992): Belgrade virus: a new hantavirus causing severe hemorrhagic fever with renal syndrome in Yugoslavia. J Infect Dis; 166(1): 113-20. Goldsmith CS, Elliott LH, Peters CJ, Zaki SR (1995): Ultrastructural characteristics of Sin Nombre virus, causative agent of hantavirus pulmonary syndrome. Arch Virol; 140(12):2107-22. Gonzalez JP, Josse R, Johnson ED, Merlin M, Georges AJ, Abandja J, Danyod M, Delaporte E, Dupont A, Ghogomu A, et al. (1989): Antibody prevalence against haemorrhagic fever viruses in randomized representative Central African populations. Res Virol; 140(4):319-31. Hannah MF, Bajic VB, Klein SL (2008): Sex differences int he recognition of and innate antiviral responses to Seoul virus in Norway rats. Brain Behav Immun; 22(4): 503-16. Hayasaka D, Maeda K, Ennis FA, Terajima M (2007): Increases permeability of human endothelial cell line EA.hy926 induced by hantavirus-specific cytotoxic T lymphocytes. Virus Res; 123(2):120-7. Heiske A, Anheier B, Pilaski J, Volchkov VE, Feldmann H (1999): A new Clethrionomysderived hantavirus from Germany: evidence for distinct genetic sublineages of Puumala viruses in Western Europe. Virus Res; 61(2): 101-12. Heyman P, Klingström J, de Jaegere F, Leclercq G, Rozenfeld F, Escutenaire S, Vandenvelde C, Zizi M, Plyusnin A, Lundkvist A (2002): Tula hantavirus in Belgium. Epidemiol Infect; 128(2): 251-6. Heyman P, Plyusnina A, Berny P, Cochez C, Artois M, Zizi M, Pirnay JP, Plyusnin A (2004): Seoul hantavirus in Europe: first demonstration of the virus genome in wild Rattus norvegicus captured in France. Eur J Clin Microbiol Infect Dis; 23(9): 711-7. Heyman P, Baert K, Plyusnina A, Cochez C, Lundkvist A, Van Esbroeck M, Goossens E, Vandenvelde C, Plyusnin A, Stuyck J (2009a): Serological and genetic evidence for the presence of Seoul hantavirus in Rattus norvegicus in Flanders, Belgium. Scand J Infect Dis; 41(1):51-6. Heyman P, Vaheri A, Lundkvist A, Avsic-Zupanc T (2009b): Hantavirus infections in Europe: from virus carriers to a major public-health problem. Expert Rev Anti Infect Ther; 7(2): 205-17.
61
Heyman P, Ceianu CS, Christova I, Tordo N, Beersma M, João Alves M, Lundkvist A, Hukic M, Papa A, Tenorio A, Zelená H, Essbauer S, Visontai I, Golovkójova I, Connell J, Nicoletti L, Van Esbroeck M, Gjeruldsen Dudman S, Aberle SW, AvsicZupanc T, Korukluoglu G, Nowwakowska A, Klempa B, Ulrich RG, Bino S, Engler O, Opp M, Vaheri A (2011): A five-year perspective ont he situation of haemorrhagic fever with renal syndrome and status of the hantavirus reservoirs in Europe, 2005-2010. Euro Surveill; 16(36) pii:19961. Hewlett MJ, Pettersson RF, Baltimore D (1977): Circular forms of UUkuniemi virion RNA: an electron microscopic study. J Virol; 21(3): 1085-93. Hinson ER, Shone SM, Zink MC, Glass GE, Klein SL (2004): Wounding: the primary mode of Seoul virus transmission among male Norway rats. Am J Trop Med Hyg, 70(3): 310-7. Hofmann J, Führer A, Bolz M, Waldschläger-Terpe J, Meier M, Lüdders D, Enders M, Oltmann A, Meisel H, Krüger DH (2012): Hantavirus infections by Puumala or Dobrava-Belgrade virus in pregnant womwn. J Clin Virol; 55(3): 266-9. Hooper JW, Larsen T, Custer DM, Schmaljohn CS (2001): A lethal disease model for hantavirus pulmonary syndrome. Virology, 289(1):6-14. Hutchinson KL, Rollin PE, Shien WJ, Zaki S, Geer PW, Peters CJ (2000): Transmission of Black Creek Canal virus between cotton rats. J Med Virol; 60(1): 70-6. Inoue, H, Nojima, H, Okayama, H (1990) High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene; 96: 23-28 Jääskeläinen KM, Kaukinen P, Minskaya ES, Plyusnina A, Vapalathi O, Elliott RM, Weber F, Vaheri A, Plyusnin A (2007): Tula and Puumala hantavirus NSs ORFsare functional and the products inhibit activation of the interferon-beta promoter. J Med Virol; 79(10): 1527-36. Jääskeläinen KM, Plyusnina A, Lundkvist A, Vaheri A, Plyusnin A (2008): Tula hantavirus isolate with the full-length ORF for nonstructural protein NSs survives for more consequent passages in interferon-competent cells than the isolate having truncated NSs ORF. Virol J; 5:3. Jakab F, Horváth G, Ferenczi E, Sebők J, Varecza Z, Szűcs G (2007): Detection of Dobrava hantavirus in Apodemus agrarius mice in the Transdanubian region of Hungary. Virus Res; 128(1-2): 149-52. Jakab F, Horváth G, Ferenczi E, Sebők J, Szűcs G (2008): First detection of Tula hantaviruses in Microtus arvalis voles in Hungary. Arch Virol; 153(11):2093-6. Jin M, Park J, Lee S, Park B, Shin J, Song KJ, Ahn TI, Hwang SY, Ahn BY, Ahn K (2002): Hantaan virus enters cells by clathrin-dependent receptor-mediated endocytosis. Virology, 294(1): 60-9.
62
Kallio ER, Klingström J, Gustafsson E, Manni T, Vaheri A, Henttonen H, Vapalathi O, Lundkvist A (2006): Prolonged survival of Puumala hantavirus outside the host: evidence for indirect transmission via the environment. J Gen Virol; 87(Pt 8): 2127-34. Kallio-Kokko H, Leveelahti R, Brummer-Korvenkontio M, Lundkvist A, Vaheri a, Vapalahti O (2001): Human immune response to Puumala virus glycoproteins and nucleocapsid protein expressed in mammalian cells. J Med Virol; 65(3): 605-13. Kang HJ, Arai S, Hope AG, Song JW, Cook JA, Yanagihara R (2009a): Genetic diversity and phylogeography of Seewis virus int he Eurasian common shrew in Finland and Hungary. Virol J; 6:208. Kang HJ, Bennett SN, Dizney L, Sumibcay L, Arai S, Ruedas LA, Song JW, Yanagihara R (2009b): Host switch during evolution of a genetically distinct hantavirus in the American shrew mole (Neurotrichus gibbsii). Virology; 388(1): 8-14. Kang HJ, Bennett SN, Hope AG, Cook JA, Yanagihara R (2011): Shared ancestry between a newfound mole-borne hantavirus and hantaviruses harbored by cricetid rodents. Virol; 85(15): 7496-503. Kariwa H, Fujiki M, yoshimatsu K, Arikawa J, Takashima I, Hashimoto N (1998): Urine-associated horizontal transmission of Seoul virus among rats. Arch Virol; 143(2): 365-74. Kaukinen P, Vaheri A, Plyusnin A (2005): Hantavirus nucleocapsid protein: a multifunctional molecule with bith housekeeping and ambassadorial duties. Arch Virol; 150(9): 1693-713. Kehm R, Jakab NJ, Welzel TM, Tobiasch E, Viczian O, JockS, Geider K, Süle S, Darai G (2001): Expression of immunogenic Puumala virus nucleocapsid protein in transgenic tobacco and potato plants. Virus Genes; 22(1): 73-83. Kilpatrick ED, Terajima M, Koster FT, Catalina MD, Cruz J, Ennis FA (2004): Role of specific CD8+ T cells int he severity of a fulminant zoonotic viral hemorrhagic fever, hantavirus pilmonary syndrome. J Immunol; 172(5): 3297-304. Kirsanovs S, Klempa B, Franke R, Lee MH, Schönrich G, Rang A, Krüger DH (2010): Genetic reassortment between high-virulent and low virulent Dobrava-Belgrade virus strains. Virus Genes; 41(3): 319-28. Klein SL, Bird BH, Glass GE (2001): Sex differences in immune responses and viral shedding following Seoul virus infection in Norway rats. Am J Trop Med Hyg; 65(1): 57-63. Klein SL, Marson AL, Scott AL, Ketner G, Glass GE (2002): Neonatal sex steroids affect responses to Seoul virus infection in male but not female Norway rats. Brain Behav Immun; 16(6): 736-46.
63
Klein SL, Zink MC, Glass GE (2004): Seoul virus infection increases aggressive behaviour in male Norway rats. Animal Behaviour; 67(3):421-29. Klempa B, Schmidt HA, Ulrich R, Kaluz S, Labuda M, Meisel H, Kjelle B, Krüger DH (2003a): Genetic interaction between distinct Dobrava hantavirus subtypes in Apodemus agrarius and A. flavicollis in nature. J Virol; 77(1): 804-9. Klempa B, Meisel H, Räth S, Bartel J, Ulrich R, Krüger DH (2003b): Occurence of renal and pulmonary syndrome in a region of northeast Germany where Tula hantavirus circulates. J Clin Microbiol; 41(10): 4894-7. Klempa B (2004): Dobrava and Tula hantaviruses from Central Europe: molecular evolution and pathogenic relevance. Berlin Humboldt-Univ., Dissertation. Klempa B, Stanko M, Labuda M, Ulrich R, Meisel H, Krüger DH (2004): Central European Dobrava hantavirus isolate from a striped field mouse (Apodemus agrarius). J Clin Microbiol; 43(6):2756-63. Klempa B, Fichet-Calvet E, Lecompte E, Auste B, Aniskin V, Meisel H, Denys C, Koivogui L, ter Meulen J, Krüger DH (2006): Hantavirus in African wood mouse, Guinea. Emerg Infect Dis; 12(5):838-40. Klempa B, Fichet-Calvet E, Lecompte E, Auste B, Aniskin V, Meisel H, Barrière P, Koivogui L, ter Meulen J, Krüger DH (2007): Novel hantavirus sequences in Shrew, Guinea. Emerg Infect Dis; 13(3): 520-2. Klempa B, Tkachenko EA, Dzagurova TK, Yunicheva YV, Morozov VG, Okulova NM, Slyusareva GP, Smirnov A, Krüger D (2008): Hemorrhagic fever with renal syndrome caused by 2 lineages of Dobrava hantavirus, Russia. Emerg Infect Dis; 14(4): 617-25. Klempa B, Witkowski PT, Popugaeva E, Auste B, Koivogui L, Fichet-Calvet E, Strecker T, ter Meulen J, Krüger DH (2012a): Sangassou virus, the first hantavirus isolate from Africa, displays genetic and funktional properties distinct from those of other murinae-associated hantaviruses. J Virol; 86(7): 3819-27. Klempa B, Avsic-Zupanc T, Clement J, Dzagurova TK, Henttonen H, Heyman P, Jakab F, Krüger DH, Maes P, Papa A, Tkachenko EA, Ulrich RG, Vapalahti O, Vaheri A (2012b): Complex evolution and epidemiology of Dobrava-belgrade hantavirus: definition of genotypes and their characteristics. Arch Virol; Epub. Kolakofsky D, Hacker D (1991): Bunyavirus RNA synthesis: genome transcription and replication. Curr Top Microbiol Immunol; 169: 143-59. Koma T, Yoshimatsu K, Pini N, Safronetz D, Taruishi M, Levis S, Endo R, Shimizu K, Yasuda SP, Ebihara H, Feldmann H, Enria D, Arikawa J (2010): Truncated hantavirus nucleocapsid proteins for serotyping Sin Nombre, Andes, and Laguna Negra hantavirus infections in humans and rodents. J Clin Microbiol; 48(5): 1635-42.
64
Koma T, Yoshimatsu K, Taruishi M, Miyashita D, Endo R, Shimizu K, Yasuda SP, Amada T, Seto T, Murata R, Yoshida H. Kariwa H. Takashima I, Arikawa J (2012): Development of serotyping enzyme-linked immunosorbent assay system based on recombinant truncated hantavirus nucleocapsid proteins for New World hantavirus infection. J Virol Methods; 185(1): 74-81. Korva M, Duh D, Puterle A, Trilar T, Zupanc TA (2009): First molecular evidence of Tula hantavirus in Microtus voles in Slovenia. Virus Res; 144(1-2):318-22. Korva M, Saksida A, Kunilo S, Vidan Jeras B, Avsic-Zupanc T (2011): HLA-associated hemorrhagic fever with renal syndrome disease progression in slovenian patients. Clin Vaccine Immunol; 18(9): 1435-40. Kraus AA, Raftery MJ, Giese T, Ulrich R, Zawatzky R, Hippenstiel S, Suttorp N, Krüger DH, Schönrich G (2004): Differential antiviral response of endothelial cells after infection with pathogenic and nonpathogenic hantaviruses. J Virol; 78(12): 6143-50. Larkin Ma, Blackshields G, Brown NP, Chenna R, McGettigan PA, McWilliam H, Valentin F, Wallace IM, Wilm A, Lopez R, Thompson JD, Gibson TJ, Higgins DG (2007): Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics, 23: 2947-48. Lee HW, Lee PW (1976): Korean hemorrhagic fever. I. Demonstration of causative antigen and antibodies. Korean J Intern Med; 19: 371-83. Lee HW, Lee PW, Johnson KM (1978): Isolation of the etiologic agent of Korean Hemorrhagic fever. J Infect Dis;137(3): 298-308. Lee HW (1982): Hemorrhagic fever with renal syndrome. History of Hantaan virus and epidemiological features. Scand J Infect Dis Suppl; 36: S82-5. Lee HW, Baek LJ, Johnson KM (1982): Isolation of Hantaan virus, the etiologic agent of Korean hemorrhagic fever, from wild urban rats. J Infect Dis; 146(5): 638-44. Lee PW, Amyx HL, Yanagihara R, Gajdusek DC, Goldgaber D, Gibbs CJ (1985): Partial characterization of Prospect Hill virus isolated from meadow voles in the United States. J Infect Dis; 152(4):826-9. Li G, Pan L, Mou D, Chen Y, Thang y, Li X, Ren J, Wang P, Zhang Y, Jia Z, Huang C, Sun Y, Yang W, Xiao SY, Bai X (2006): Characterization of truncated hantavirus nucleocapsid proteins and their applicazion for serotyping. J Med Virol; 78(7): 926-32. Linderholm M, Billström A, Settergren B, Tärnyik A (1992): Pulmonary involvement in nephropathia epidemica as demonstrated by computed tomograpy. Infection; 20(5): 263-6.
65
Linderholm M, Ahlm C, Settergren B, Waage A, Tärnyik A (1996): Elevated plasma levels of tumor necrosis factor (TNF)-alpha, soluble TNF receptors, Interleukin (IL)-6, and IL-10 in patients with hemorrhagic fever with renal syndrome. J Infect Dis; 173(1): 38-43. Linderholm M, Sandström T, Rinnström O, Groth S, Blomberg A, Tärnyik A (1997): Impaired pulmonary function in patients with hemorrhagic fever with renal synsrome. Clin Infect Dis; 25(5): 1084-9. Lindkvist M, Lahti K, Lilljehöök B, Holmström A, Ahlm C, Bucht G (2007): Crossreactive immune responses in mice genetic vaccination with cDNA encoding hantavirus nucleocapsid proteins. Vaccine; 25(9): 1690-9. Lundkvist A, Hörling J, Niklasson B (1993): The humoral response to Puumala virus infection (nephropathia epidemica) investigated by viral protein specific immunoassay. Arch Virol; 130(1-2): 121-30. Lundkvist A, Hukic M, Hörling J, Gilljam M, Nichol S, Niklasson B (1997): Puumala and Dobrava viruses cause hemorrhagic fever with renal syndrome in BosniaHerzegovina: evidence of highly cross-neutralizing antibody responses in early patient sera. J Med Virol; 53(1): 51-9. Lundkvist A, Wiger D, Hörling J, Sjölander KB, Plyusnina A, Mehl R, Vaheri A, Plyusnin A (1998): Isolation and characterisation of Puumala hantavirus from Norway: evidence for distinct phylogenetic sublineage. J Gen Virol; 79(Pt 11): 2603-14. Lü X, Zhang F, Li Y, Xue X, Yin W, Xu Z (2011): Antigenic characterization of expressed complete and different truncated recombinant nucleocapsid proteins of Hantaan virus by monoclonal antobidies. Hybridoma (Larchmt); 30(5): 445-50. Maes P, Keyaerts E, Clement J, Bonnet V, Van Ranst M (2004): Detection of Puumala hantavirus antibody with ELISA using a recombinant truncated nucleocapsid protein expressed in Escherichia coli. Viral Immunol; 17(2): 315-21. Maes P, Klempa B, Clement J, Matthijnssens J, Gajdusek DC, Krüger DH, Van Ranst M (2009): Proposal for new criteria for the classification of hantaviruses, based on S and M segment protein sequences. Infect Genet Evol; 9(5):813-20. Makary P, Kanerva M, Ollgren J, Virtanen MJ, Vapalathi O, Lyytikäinen O (2010): Disease burden of Puumala virus infections, 1995-2008.: Epidemiol Infect; 138(10): 1484-92. Mäkelä S, Mustonen J, Ala-Houhala I, Hurme M, Partanen J, Vapalathi O, Vaheri A Pasternack A (2002): Human leucocyte antigen-B8-DR3 is a more important risk factor for severe Puumala hantavirus infection than the tumor necrosis factor-α(308) G/A polymorphism. J Infect Dis; 186(6): 843-6.
66
Mertens M, Hofmann J, Petraityte-Burneikiene R, Ziller M, Sasnauskas K, Friedrich R, Niederstrasser O, Krüger DH, Groschup MH, Petri E, Werdermann S, Ulrich RG (2011): Seroprevalence study in foresty workers of a non-endemic region on eastern Germany reveals infections by Tula and Dobrava-Belgrade hantaviruses. Med Microbiol Immunol; 200(4):263-8. Mertz GJ, Hjelle B, Crowley M, Iwamoto G, Tomicic V, Vial PA (2006): Diagnosis and treatment of new world hantavirus infections. Curr Opin Infect Dis; 19(5): 437-42. Meyer BJ, Schmaljohn CS (2000): Persistent hantavirus infections: characteristics and mechanisms. Trends Microbiol; 8(2): 61-7. Milazzo ML, Eyzaguirre EJ, Molina CP, Fulhorst CF (2002): maporal viral infection int he Syrian golden hamster: a model of hantavirus pulmonary syndrome. J Infect Dis; 186(10): 1390-5. Moolenaar RL, Dalton C, Lipman HB, Umland ET, Gallaher M, Duchin JS, Chapman L, Zaki SR, Ksiazek TG, Rollin PE, et al. (1995): Clinical features that differentiate hantavirus pulmonary syndrome from three other acute respiratory illnesses. Clin Infect Dis; 21(3):643-9. Mustonen J, Partanen J, Kanerva M, Pietilä K, Vapalathi O, Vaheri A (1998): Association of HLA B27 with benign clinical course of nephropathia epidemica caused by Puumala hantavirus. Scand J Immunol; 47(3): 277-9. Mustonen J, Huttunen NP, Partanen J, Baer M, Paakkala A, Vapalathi O, Uhari M (2004): Human leucocyte antigens B8-DRB1*03 in pediatric patients with nephropathia epidemica caused by Puumala hantavirus. Pediatr Infect Dis J; 23(10): 959-61. Myhrman G (1951): Nephropathia epidemica a new infectious diseasa in Northern Scandinavia. Acta Medica Scandinavica; 140: 52-6. Nakamura I, yoshimatsu L, lee BH, Okumura M, Taruishi M, Araki K, Kariwa H, Takashima I, Arikawa J (2008): Development of serotyping ELISA system for Thailand virus infection. Arch Virol; 153(8): 1537-42. Nemirov K, Vapalathi O, Lundkvist A, Vasilenko V, Golovjova I, Plyusnina A, Niemimaa J, Laakkonen J, Henttonen H, Vaheri A, Plyusnin A (1999): Isolation and characterization of Dobrava hantavirus carried by the striped field mouse (Apodemus agrarius) in Estonia. J Gen Virol; 80 (Pt 2): 371-9. Nemirov K, Vapalathi O, Papa A, Plyusnina A, Lundkvist A, Antoniadis A, Vaheri A, Plyusnin A (2003): Genetic characterization of new Dobrava hantavirus isolate from Greece. J Med Virol; 69(3): 408-16. Nemirov K, Andersen HK, Leirs H, Henttonen H, Vaheri A, Lundkvist A, Plyusnin A (2004): Saaremaa hantavirus in Denmark. J Clin Virol; 30(3): 254-7.
67
Nichol ST, Spiropoulou CF, Morzunov S, Rollin PE, Ksiazek TG, Feldmann H, Sanchez A (1993): Genetic identification of a hantavirus associated with an outbreak of acute respiratory illness. Science; 262(5135): 914-7. Nicholas KB, Nicholas HB, Deerfield DW (1997): GeneDoc: analysis and visualization of genetic variation. Embnew News, 4:14. Nolte KB, Feddersen RM, Foucar K, Zaki SR, Koster FT, Madar D, Merlin TL, McFeeley PJ, Umland ET, Zumwalt RE (1995): Hantavirus pulmonary syndrome in the United States: a pathological description of a disease caused by a new agent. Hum Pathol; 26(1): 110-20. Obijeski JF, Bishop DH, Palmer EL, Murphy FA (1976): Segmented genome and nucleocapsid of La Crosse virus. J Virol; 20(3): 664-75. Okumura M, Yoshimatsu K, Kumperasart S, Nakamura I, Ogino M, Taruishi M, Sungdee A, Pattamadilok S, Ibrahim IN, Erlina S, Agui T, Yanagihara R, Arikawa J (2007): Development of serological assays for Thottapalayam virus, an insectovore-borne Hantavirus. Clin Vaccine Immunol, 14(2): 173-81. Paakkala A, Mustonen J, Viander M, Huhtala H, Pasternack A (2000): Complement activation in nephropathia epidemica caused by Puumala hantavirus. Clin Nephrol; 53(6): 424-31. Padula PJ, Edelstein A, Miguel SD, López NM, Rossi CM, Rabinovich RD (1998): Hantavirus pilmonary syndrome outbreak in argentina: moleculer evidence for person-to-person transmission of Andes virus. Virology; 241(2): 323-30. Park K, Kim CS, Moon KT (2004): Protective effectiveness of hantavirus vaccine. Emerg Infect Dis; 10(12): 2218-20. Peters CJ, Simpson GL, Levy H (1999): Spectrum of hantavirus infection: hemorrhagic fever with renal syndrome and hantavirus pulmonary syndrome. Annu Rev Med; 50: 531-45. Plyusnin A, Vapalathi O, Lankinen H, Lehväslaiho H, Apekina N, Mvasnikov Y, Kallio-Kokko H, Henttonen H, Lundkvist A, Brummer Korvenkontio M et al. (1994): Tula virus: a newly detected hantavirus carried by European common voles. J Virol; 68(12): 7833-9. Plyusnin A, Vapalathi O, Vaheri A (1996): Hantaviruses: genome structure, expression and evolution. J Gen Virol; 77 (Pt 11): 2677-87. Plyusnin A, Vapalathi O, Vasilenko V, Henttonen H, Vaheri A (1997): Dobrava hantavirus in Estonia: does the virus exist throughout Europe? Lancet; 349(9062): 1369-70. Plyusnin A, Nemirov K, Apekina N, Plyusnina A, Lundkvist A, Vaheri A (1999): Dobrava hantavirus in Russia. Lancet; 353(9148).207.
68
Plyusnin A, Vaheri A, Lundkvist A (2003): Genetic interaction between Dobrava and Saaremaa hantaviruse: now or millions of years ago? J Virol; 77(12):7156-7; author reply 7157-8. Plyusnin A, Vaheri A, Lundkvist A (2006): Saaremaa hantavirus should not be confused with its dangerous relative, Dobrave virus. J Clin Microbiol; 44(4): 1608-9; author reply 1608-11. Plyusnina A, Aberle SW, Aberle JH, Plyusnin A (2006): Genetic analysis of Puumala hantavirus strains from Austria. Scand J Infect Dis; 38(6-7): 512-9. Plyusnina A, Ferenczi E, Rácz GR, Nemirov K, Lundkvist A, Vaheri A, Vapalathi O, Plyusnin A (2009): Co-circulation of three pathogenic hantaviruses? Puumala, Dobrava and Saaremaa in Hungary. J Med Virol; 81(12):2045-52. Plyusnina A, Krajinović LC, Margaletić J, Niemimaa J, Nemirov K, Lundkvist A, Markotić A, Miletić-Medved M, Avsic-Zupanc T, Henttonen H, Plyusnin A (2011): Genetic evidence for the presence of two distinct hantaviruses associated with Apodemus mice in Croatia and analysis of local strain. J Med Virol; 83(1): 108-14. Popugaeva E, Witkowski PT, Schlegel M, Ulrich RG, Auste B, Rang A, Krüger DH, Klempa B (2012): Dobrava-Belgrade hantavirus infection from Germany shows receptor usage and innate immunity induction consistent with the pathogenicity of the virus in humans. PloS One; 7(4): e35587. Razzauti M, Plyusnina A, Sironen T, Henttonen H, Plyusnin A (2009): Analysis of Puumala hantavirus in a bank vole population in northern Finland: evidence for cocirculation of two genetic lineages and frequent reassortment between strains. J Gen Virol; 90(Pt 8): 1923-31. Razzauti M, Plyusnina A, Niemimaa J, Henttonen H, Plyusnin A (2012): Co-circulation of two Puumala hantavirus lineages in Latvia: a Russian lineage described previously and a novel Latvian lineages. J Med Virol; 84(2):314-8. Reusken C, de Vries A, Adema J, Vos W, van der Giessen J, Bekker D, Heyman P (2008): First genetic detection of Tula hantavirus in wild rodents int he Netherlands. J Infect; 57(6): 500-3. Sadeghi M, Eckerle I, Daniel V, Burkhardt U, Opelz G, Schnitzler P (2011): cytokine expression during early and late phase of acute Puumala hantavirus infection. BMC Immunol; 12:65. Saluzzo JF, Digoutte JP, Adam F, Bauer SP, McCormick JB (1985): Serological evidence for Hantaan-related virus infection in rodents and in Senegal. Trans R Soc Trop Med Hyg; 79(6):874-5. Scharninghausen JJ, Meyer H, Pfeffer M, Davis DS, Honeycutt RL (1999): genetic evidence of Dobrava virus in Apodemus agrarius in Hungary. Emerg Infect Dis; 5(3): 468-70.
69
Scharninghausen JJ, Pfeffer M, Meyer H, Davis DS, Honeycutt RL, Faulde M (2002): Genetic evidence for Tula virus in Microtus arvalis and Microtus agrestis population in Croatia. Vector Borne Zoonotic Dis; 2(1):19-27. Schlegel M, Klempa B, Auste B, Bemmann M, Schmidt-Chanasit J, Büchner T, Groschup MH, Meier M, Balkema-Buschmann A, Zoller H, Krüger DH, Ulrich RG (2009): Dobrava-Belgrade virus spillover infections, Germany. Emerg Infect Dis; 15(12): 2017-20. Schmaljohn CS, Dalrymple JM (1983): Analysis of Hantaan virus RNA: evidence for a new genus of bunyaviridae. Virology; 131(2):482-91. Schmaljohn CS, Hasty SE, Dalrymple JM, LeDuc JW, Lee HW, von Bonsdorff CH, Brummer-Korvenkontio M, Vaheri A, Tsai TF, Regnery HL et al. (1985): Antigenic and genetic properties of viruses linked to hemorrhagic fever with renal syndrome. Science; 227(4690): 1041-4. Schmaljohn CS, Jennings GB, Hay J, Dalrymple JM (1986): Coding strategy of the S genome segment of Hantaan virus. Virology; 155(2):633-43. Schmaljohn CS, Schmaljohn AL, Dalrymple JM (1987): Hantaan virus M RNA: coding strategy, nucleotide sequence, and gene order. Virology; 157(1):31-9. Schmaljohn CS, Nichol ST (2007): Bunyaviridae. In Knipe DM, Howley PM ed., Fields virology, 5th ed. Lippincott Williams&Wilkins, Philadelphia, PA; pp 1741-89. Schountz T, Prescott J, Cogswell AC, Oko L, Mirowsky-Garcia K, Galvez AP, Hjelle B (2007): Regulatory T cell-like responses in deer mice persistently infected with Sin Nombre virus. Proc Natl Acad Sci USA; 104(39): 15496-501. Schultze D, Lundkvist A, Blauenstein U, Heyman P (2002): Tula virus infection associated with fever and exanthema after a wild rodent bite. Eur J Clin Microbiol Infect Dis; 21(4): 304-6. Sibold C, Meisel H, Krüger DH, Labuda M, Lysy J, Kozuch O, Peicoch M, Vaheri A, Plyusnin A (1999): Recombination in Tula hantavirus evolution: analysis of genetic lineages from Slovakia. J Virol; 73(1): 667-75. Sibold C, Ulrich R, Labuda M, Lundkvist A, Martens H, Schütt M, Gerke P, Leitmeyer K, Meisel H, Krüger DH (2001): Dobrava hantavirus causes hemorrhagic fever with renal syndrome in central Europe and is carried by two different Apodemus mice species. J Med Virol; 63(2): 158-67. Sironen T, Vaheri A, Plyusnin A (2001): Molecular evolution of Puumala hantavirus. J Virol; 75(23): 11803-10. Sjölander KB, Golovjova I, Vasilenko V, Plyusnin A, Lundkvist A (2002): Serological divergence of Dobrava and Saaremaa hantaviruses: Evidence form two distinct serotypes. Epidemiol Infect; 128(1): 99-103.
70
Song JW, Gligic A, Yanagihara R (2002): Identification of Tula hantavirus in Pitymys subterraneus captured in the Cacak region of Serbia-Yugoslavia. Int J Infect Dis, 6(1):31-6. Song JW, Baek LJ, Song KJ, Skrok A, Markowski J, Bratosiewicz-WWasik J, Kordek R, Liberski PP, Yanagihara R (2004): Charakterization of Tula virus from common voles (Microtus arvalis) in Poland: evidence for geographic-specific phylogenetic clustering. Virus Genes; 29(2): 239-47. Song JW, Baek LJ, Schmaljohn CS, Yanagihara R (2007a): Thottapalayam virus, a prototype shrewborne hantavirus. Emerg Infect Dis; 13(7): 980-5. Song JW, Gu SH, Bennett SN, Arai S, Puorger M, Hilbe M, Yanagihara R (2007b): Seewis virus, a genetically distinct hantavirus in the Eurasian common shrew (Sorex araneus). Virol J; 4:114. Spiropoulou CF, Albariño CG, Ksiazek TG, Rollin PE (2007): Andes and Prospect Hill hantaviruses differ in early induction of interferon although both can downregulate interferon signaling. J Virol; 81(6): 2769-76. Sumibcay L, Kadjo B, Gu SH, Kang HJ, Lim BK, Cook JA, Song JW, Yanagihara R (2012): Divergent lineage of a novel hantavirus in the banana pipistrelle (Neoromicia nanus) in Côte d'Ivoire. Virol J; 9:34. Tamura K, Peterson D, Peterson N, Stecher G, Nei M, Kumar S (2011): Mega5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Mol Biol Evol; 28:2731-9. Taruishi M, Yoshimatsu K, Hatsuse R, Okumura M, Nakamura I, Arikawa J (2008): Lack of vertical transmission of Hantaan virus from persistently infected dam to progeny in laboratory mice. Arch Virol; 153((9: 1605-9. Terajima M, Hayasaka D, Maeda K, Ennis FA (2007): Immunopathogenesis of hantavirus pulmonary syndrome and hemorrhagic fever with renal syndrome: Do CD8+ T cells trigger capillary leakage in viral hemorrhagic fevers? Immunol Lett; 113(2): 117-20. Trencséni T, Keleti B (1971): Clinical aspects and epidemiology of haemorrhagic fever with renal syndrome: analysis of clinical and epidemiological experiences in Hungary. Akadémiai Kiadó; 247 Vapalathi O, Lundkvist A, Kukkonen SK, Cheng Y, Gillian M, Kanerva M, Manni T, Pejcoch M, Niemimaa J, Kaikusalo A, Henttonen H, Vaheri A, Plyusnin A. (1996): Isolation and characterisation of Tula virus, a distinct serotype int he genus Hantavirus, family Bunyaviridae. J Gen Virol; 77(Pt 12): 3063-7. Weidmann M, Schmidt P, vackova M, krivanec K, Munclinger P, Hufert FT (2005): identification of genetic evidence for Dobrava virus spillover in rodents by nested reverse transcription (RT)-PCR and TaqMan RT-PCR. J Clin Microbiol; 43(2): 808-12.
71
Weiss S, Witkowski PT, Auste B, Nowak K, Weber N, Fahr , Mombouli JV, Wolfe ND, Drexler JF, Drosten C, Klempa B, Leendertz FH, Krüger DH (2012): Hantavirus in bat, Sierra Leone. Emerg Infect Dis; 18(1): 159-61. Yasuda SP, Yoshimatsu K, Koma T, Shimizu K, endo R, Isozumi R, Arikawa J (2012): Application of truncated nucleocapsid protein (N) for serotyping ELISA of murinae-associated hantavirus infection in rats. J Vet Med Sci; 74(2): 215-9. Zaki SR, Greer PW, Coffield LM, Goldsmith CS, Nolte KB, Foucar K, Feddersen RM, Zumwalt RE, Miller GL, Kahn AS et al. (1995): Hantavirus pulmonary syndrome. Pathogenesis of an emerging infectious disease. Am J Pathol, 146(3): 552-79. Zhang XK, Takashima I, Hashimoto N (1988): Role of maternal antibody in protection from hemorrhagic fever with renal syndrome virus infection in rats. Arch Virol; 103(3-4): 253-65. Zhao C, Sun Y, Zhao Y, Wang S, Yu T, Du F, Yang XF, Luo E (2012): Immunogenicity of a multi-epitope DNA vaccine against hantavirus. Hum Vaccin Immunother, 8(2): 208-15. Zou Y, Hu J, Wang ZX, wang DM, Yu C, Zhou JZ, Fu ZF, Zhang Yz (2008): Genetic characterization og hantaviruses isolated from Guizhou, China: evidence for spillover and reassortment in nature. J Med Virol; 80(6):1033-41. Zöller L, Scholz J, Stohwasser R, Giebel LB, Sethi KK, Bautz EK, Darai G (1989): Immunoblot analysis of the serological response in Hantavirus infections. J Med Virol; 27(3):231-7.
72
11. Saját publikációk jegyzéke A disszertáció alapjául szolgáló tudományos közlemények
Jakab F, Sebők J, Szántó Z, Hang D, Imre M, Németh V, Madai M, Oldal M, Kovács T, Wittmann I (2011): Dobrava-Belgrade hantavirus infection mimics acute appendicitis. J Clin Virol; 50(2): 164-6. (2011, IF: 3,969) Németh V, Madai M, Maráczi A, Bérczi B, Horváth G, Oldal M, Kisfali P, Bányai K, Jakab F (2011): Detection of Dobrava-Belgrade hantavirus using recombinantnucleocapsid-based enzyme-linked immunosorbent assay and SYBR Green-based realtime reverse transcriptase-polymerase chain reaction. Arch Virol; 156(9):1655-60. (2011, IF: 2,111) A disszertáció alapjául szolgáló konferencia előadások és poszterek Németh V, Madai M, Bérczi B, Maráczi A, Horváth G, Oldal M, Kovács T, Jakab F: Seroprevalence and genetic characterization of Dobrava and Saaremaa hantaviruses among rodents (Apodemus agrarius, A. flavicollis) in Hungary and Northern Croatia. European Cogress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Vienna, Austria, 10-13 April 2010. Németh V, Madai M, Bérczi B, Maráczi A, Horváth G, Oldal M, Kovács T, Jakab F: High prevalence of Dobrava-Belgrade and Saaremaa hantaviruses among Apodemus mice in Hungary and Northern Croatia. Magyar Mikrobiológiai Társaság Kongresszusa, Keszthely, 2010. október. 12-15. (előadás) Németh V, Madai M, Bérczi B, Maráczi A, Horváth G, Oldal M, Kovács T, Jakab F: Seroprevalence and genetic characterization of Dobrava and Saaremaa hantaviruses among rodents (Apodemus agrarius, A. flavicollis) in Hungary and Northern Croatia. 20th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases; Vienna, Austria, 10-13 April 2010.
73
Németh V, Madai M, Bérczi B, Maráczi A, Horváth G, Oldal M, Bányai K, Jakab F: Detection of Dobrava-Belgrade hantaviruses among Apodemus mice in Hungary and Northern Croatia. 6th European Congress of Mammalogy (ECM); Paris, France, 19-23 July, 2011. Egyéb tudományos közlemények Jakab F, Németh V, Oldal M, Varga L, Nyul Z, Mitchell DK, Matson DO, Szucs G (2010): Epidemiological and clinical characterization of norovirus infections among hospitalized children in Baranya County, Hungary. J Clin Virol; 49(1): 75-6. (2010, IF: 4,023) Németh V, Oldal M, Egyed L, Gyuranecz M, Erdélyi K, Kvell K, Kalvatchev N, Zeller H, Bányai K, Jakab F: European brown hare as reservoir for Crimean-Congo hemorrhagic fever virus, Hungary. Vector Borne Zoonotic Dis; közlésre elfogadva, nyomtatásban (2011, IF: 2,437) Egyéb konferencia előadások és poszterek Kollár V., Németh V, Jakab F, Varga L, Nyúl Z, DK. Mitchell, DO. Matson, Szűcs Gy.: Humán norovírusok által okozott fertőzések jellemzése, epidemiológiai, klinikai és molekuláris biológiai vonatkozásban Magyarországon. Magyar Mikrobiológiai Társaság Kongresszusa, Keszthely, 2006. október 18-20. Szatmári D, Huber T, Németh V, Kollár V, Grama L, Kellermayer M: A titin mechanoszenzor tulajdonságainak vizsgálata. 38. Membrán-Transzport Konferencia, Sümeg, 2008. május 20-23. Szatmári D, Huber T, Németh V, Kollár V, Grama L, Kellermayer M: Dissecting the mechanosensor functions of titin. 9th International Symposium on Instrumental Analysis; Pécs, Hungary, June 29-July 2, 2008.
74
Németh, Oldal M, Kemenesi G, Gyuranecz M, Kvell K, Kalvatchev N, Zeller H, Bányai K, Jakab F: Serologic evidence of Crimean-Congo hemorrhagic fever virus infection in Hungary. Magyar Mikrobiológiai Társaság Kongresszusa; Keszthely, 2012. október 24-26. Madai M, Oldal M, Németh V, Horváth G, Dóró R, Kemenesi G, Pintér R, Bányai K, Jakab F: Prevalence of shrew-borne hantaviruses among insectovores captured in the transdanubian region of Hungary. Magyar Mikrobiológiai Társaság Kongresszusa; Keszthely, 2012. október 24-26. Oldal M, Németh V, Madai M, Dóró R, Kemenesi G, Pintér R, Bányai K, Jakab F: Detecting Dobrava-Belgrade and Puumala virus infections in Hungarian forestry workers by ELISA and Western Blot analyses. Magyar Mikrobiológiai Társaság Kongresszusa; Keszthely, 2012. október 24-26.
75
