PÉCSI TUDOMÁNYEGYETEM Biológiai Doktori Iskola
Szinaptikus átrendezıdés, mint az epilepszia kialakulásának mechanizmusa - Elektrofiziológiai és fotostimulációs mérések patkány epilepszia modellben
PhD értekezés
Molnár Péter
PÉCS, 2010
PÉCSI TUDOMÁNYEGYETEM Biológiai Doktori Iskola
Szinaptikus átrendezıdés, mint az epilepszia kialakulásának mechanizmusa - Elektrofiziológiai és fotostimulációs mérések patkány epilepszia modellben
PhD értekezés
Molnár Péter
Konzulens: Dr. Hernádi István Ph.D.
PÉCS, 2010
TARTALOMJEGYZÉK 1
ÖSSZEFOGLALÁS
1
2
BEVEZETÉS
3
2.1
Epilepszia
3
2.2
Temporális lebeny epilepszia
4
2.3
Állatmodellek az epilepszia kutatásában
8
2.4
Egyszeri pilokarpin kezelés által kiváltott státusz epileptikusz krónikus hatásai Temporális lebeny epilepszia modell
10
A moharost sarjadzás a hippokampusz gyrus dentatusában mint a spontán visszatérő epileptikus rohamok egy lehetséges oka
19
2.6
Az újonnan született szemcsesejtek szerepe az epilepszia kialakulásában
23
2.7
Növekedési faktorok megváltozott expressziójának a szerepe az epilepszia kialakulásában
24
2.8
A moharostok által kibocsátott cink feltételezett szerepe
25
2.9
Moharost sarjadzás vizsgálatának technikai módszerei
27
3
PROBLÉMAFELVETÉS, CÉLKITŐZÉSEK
32
4
MÓDSZEREK
33
4.1
Pilokarpinnal kiváltott státusz epileptikusz
33
4.2
Szövettani eljárások
33
4.3
Extracelluláris elektrofiziológiai mérések
34
4.4
Patch clamp mérések elektromos stimulálással
35
4.5
Fotostimuláció
36
4.6
Külsőleg adott cink direkt hatásának a mérése GABAA és NMDA receptorokon
37
4.7
Cink hatásának mérése a spontán mini gátló posztszinaptikus áramokra (mIPSC)
37
4.8
Moharostokból felszabaduló cink hatásának mérése a GABAA receptor mediálta áramokra
38
4.9
cGABA hatásának mérése a monoszinaptikus IPSC-re
39
2.5
4.10 CaEDTA (cink kelátor) hatása a moharost és a perforáns pálya ingerléssel kiváltott EPSC NMDA receptor mediálta komponensére
39
5
EREDMÉNYEK
40
5.1
Sejtpusztulás, moharost sarjadzás és spontán epileptikus rohamok a pilokarpinnal kiváltott státusz epileptikusz után
40
A moharost sarjadzás során létrejövő moharost – szemcsesejt szinaptikus kapcsolatok funkcionális jellemzése
43
A moharostok által tartalmazott és szinaptikusan kibocsátott cink hatása a szemcsesejtek excitabilitására
57
6
EREDMÉNYEK MEGBESZÉLÉSE
70
6.1
Szemcsesejt – szemcsesejt monoszinaptikus kapcsolatok egészséges és epileptikus állatokban
70
Szemcsesejt – szemcsesejt monoszinaptikus kapcsolatok AMPA és NMDA receptor mediálta komponense
76
5.2 5.3
6.2
i
6.3
GABAerg gátlás epilepsziában
77
6.4
A moharostokból szinaptikusan ürülő cink szerepe epilepsziában
78
6.5
Összegzés
83
7
SUMMARY
85
8
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS
86
9
IRODALOM
87
10
SAJÁT PUBLIKÁCIÓS JEGYZÉK
99
10.1 A PhD disszertáció témájául szolgáló referált közlemények
99
10.2 A PhD disszertáció témájául szolgáló konferencia összefogalók
99
10.3 Egyéb referált közlemények
100
10.4 Egyéb konferencia összefoglalók
103
ii
RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE
ACSF: AMPA: BDNF: BrdU: cGABA: cGlutamát D-AP5: DG: DNQX: EEG: EC: EPSC: GABA: GDNF: HC: HEPES: IPSC: MES: MTLE: NBQX: NGF: NMDA: NT-3: PTZ: QX-314: SAS: SE: TLE: TPEN: UV:
Artificial Cerebrospinal Fluid α-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionate Brain-derived neurotrophic factor Bromodeoxyuridine γ-aminobutyrate, α-carboxy-2-nitrobenzyl ester γ-(CNB-caged) L-glutamát D-2-amino-5-phosphonopentanoate Gyrus Dentatus 6,7-dinitroquinoxaline-2,3-dione Electro-Encefalogramm Entorhinális Cortex Excitátoros Posztszinaptikus Áram γ-Aminobutyric acid Glial cell-derived neurotrophic factor Hippocampus 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid Gátló Posztszinaptikus Áram Maximális Elektrosokk Mediális Temporális Lebeny Epilepszia 2,3-dihydroxy-6- nitro-7-sulfamyl-benzo(F)quinoxaline Nerve growth factor N-methyl-D-aspartic acid Neurotrophin-3 Pentilentetrazol (N-ethyl lidocaine) chloride Hosszantartó amygdala stimuláció Státusz Epileptikusz Temporális Lebeny Epilepszia N,N,N9,N9-tetrakis(2-pyridyl-methyl)ethylenediamine Ultraibolya
iii
1 ÖSSZEFOGLALÁS A temporális lebeny epilepszia a felnıttkorban leggyakrabban elıforduló epilepsziás tünetegyüttes, a felnıtt lakosság majdnem 1%-át érinti. A betegek közel kétharmadánál figyelhetı meg hippokampális lézió (hippokampalis sclerosis). A hippokampális lézió gyakorlatilag a hippokampusz minden területét (különösen a CA1, a CA3 és a gyrus dentatus hilus – területeket) érintheti. Ebben a dolgozatban a hippokampusz gyrus dentatus – hilus területein bekövetkezı változásokra, ezeknek a változásoknak az epilepszia kifejlıdésében betöltött szerepének tisztázására koncentráltunk.. A temporális lebeny epilepsziát egy állatmodellben vizsgáltuk. Ebben a modellben pilokarpin adásával státusz epileptikuszt váltottunk ki felnıtt patkányokban. A státusz epileptikusz hasonló változásokat idéz elı az agyban, mint amilyet humán temporális lebeny epilepsziában leírtak. Ezek a változások egy csendes periódus után spontán komplex parciális rohamok megjelenéséhez vezetnek. A hippokampális lézió többféleképpen vezethet az epileptikus állapot kialakulásához, ezek egyike a moharost sarjadzás jelensége. A moharost sarjadzás folyamán a gyrus dentatus szemcsesejtjeinek axonjai terebélyesednek és megjelennek a gyrus dentatus belsı molekuláris rétegében, ahol excitátoros szinapszisokat alkotnak magukkal a szemcsesejtekkel. Ezzel egy pozitív visszacsatolás jöhet létre, amely magyarázatot adhat a gyrus dentatus lecsökkent ellenállóképességére epileptikus szinkronizált aktivitással szemben. Normális esetben a gyrus dentatust a hippokampusz ‘kapuırzıjének’ tekintik, mivel különlegesen magas a küszöbe szinkronizált aktivitással szemben. Ez annak köszönhetı, hogy a gyrus dentatusban nagyon erıs a feed-back és feedforward gátlás, valamint nincs pozitív excitátoros visszacsatolás. A temporális lebeny epilepszia kifejlıdése során ez drasztikusan megváltozik: egyrészt a mohasejtek pusztulása miatt a feed-forward / feed-back gátlás meggyengül (bár kompenzáló mechanizmusok ezt ellensúlyozzák) másrészt a direkt moharost – szemcsesejt monoszinaptikus stimuláló kapcsolatok kialakulásával létrejön az a pozitív visszacsatolás, ami az epileptikus aktivitás generálásához szükséges. Ez a pozitív visszacsatolás hasonló ahhoz, amely normál esetben is megfigyelhetı a CA1 és CA3 területén, és ami miatt ezek a területek hajlamosak az epileptikus aktivitás generálására. A moharost sarjadzás során azonban nem csak epileptogén, hanem antiepileptogén folyamatok is lejátszódhatnak Ilyen például GABAerg interneuronok fokozott beidegzése a moharost kollaterálisok által. 1
A moharost sarjadzás nem csak a pozitív visszacsatolás létrehozásán keresztül befolyásolhatja a gyrus dentatus excitabilitását. A moharostok nagy koncentrációban tartalmaznak
cinket,
amely
szinaptikusan,
aktivitásfüggıen
ürül
a
glutamát
neurotranszmitterrel együtt. A cinknek összetett hatása van a szinaptikus transzmisszióra a gyrus dentatusban: egyrészt a GABAA receptorokat gátolja, ez epileptogén hatás; másrészt az NMDA receptorokat is gátolja, ez antiepileptogén hatás. Temporális lebeny epilepsziában azt is leírták, hogy a GABAA receptorok cink érzékenysége megnövekedik, vagyis a cink epileptogén hatása fokozottan érvényesülhet. Ebben a kísérletsorozatban a moharost sarjadzás funkcionális következményeit vizsgáltuk elektrofiziológiai, fotostimulációs, farmakológiai és hisztológiai módszerekkel a pilokarpin kiváltotta temporális lebeny epilepszia modellben, patkányokban. Hisztológiai módszereket alkalmazva megállapítottuk, hogy a caudális (ventrális) hippokampusz gyrus dentatus molekuláris rétegében még egészséges állatokban is megfigyelhetık cinket tartalmazó moharostok, bár csak nagyon kis számban. Elektrofiziológiai és fotostimulációs méréseink ezzel összhangban bizonyították, hogy epileptikus tüneteket nem mutató állatokban is létrejönnek szemcsesejt – szemcsesejt monoszinaptikus kapcsolatok, de csak alacsony valószínőséggel. Moharost sarjadzás során epileptikus állatokban ezeknek a kapcsolatoknak a valószínősége drasztikusan megnı. Epileptikus állatokban a moharost szemcsesejt szinaptikus kapcsolatok fiziológiai valamint farmakológiai tulajdonságai ugyanolyanok, mint kontroll állatokban, valamint nagyon hasonlóak a moharost – CA3 piramissejt kapcsolatokhoz. Kísérleti rendszerünkben nem láttuk annak semmi nyomát, hogy a moharostokból szinaptikusan ürülı cinknek bármilyen hatása lenne a posztszinaptikus GABAA receptorokra a szemcsesejteken. Ezzel szemben megállapítottuk, hogy a moharostokból ürülı cink gátolja a posztszinaptikus NMDA receptorokat, vagyis valószínőleg antiepileptogén hatású. Ezek a vizsgálatok jelentısen kiterjesztették ismereteinket a moharost sarjadzás jelenségével kapcsolatban, megerısítették azt a feltételezést, hogy ennek a folyamatnak az eredményeként funkcionális pozitív visszacsatolás jön létre a gyrus dentatusban amely hozzájárulhat a temporális lebeny epilepszia kialakulásához. Vizsgálataink hozzájárultak a moharostok által szinaptikusan ürített cink epilepsziában betöltött szerepének korrekt értelmezéséhez, valamint olyan kísérlet-technikai fejlesztéseket eredményeztek, amelyek megkönnyítik ezeknek a folyamatoknak a késıbbi tanulmányozását.
2
2 BEVEZETÉS 2.1 Epilepszia Epilepszia az agyi infarktus után a leggyakrabban elıforduló neurológiai betegség, a lakosság 0,5 – 3% - át érinti (Loscher, 2002; Orbán-Kis és mtsai., 2008). Az epilepsziát, mint betegséget az ismétlıdı, spontán jelentkezı epilepsziás rohamok jellemzik. Mindhárom jellemzı megállapítása szükséges az epilepszia diagnózisához (Janszky és Szőcs, 2002). Tüneteit és okait tekintve az epilepszia nem kezelhetı egységes betegségként, bár a különféle epilepsziás tünetegyütteseknek van számos közös sajátossága, mint például az epileptiform elektroenkefalogram (EEG) megjelenése, valamint a visszatérı, többé-kevésbé azonos formában zajló, hirtelen kezdıdı és végzıdı rohamok (Orbán-Kis és mtsai., 2008). Az epilepszia kialakulásának oka valamilyen agyi rendellenesség (metabolikus, neurokémiai, anatómiai vagy fiziológiai), amelynek eredményeként nagyszámú idegsejt kórosan túlfokozott szinkronizált aktivációja jön léte (Fisher és mtsai., 2005). Az epilepsziás tünetegyütteseket sokféleképpen csoportosíthatjuk: eredet szerint (örökletesek, vagy szerzett agykárosodás következtében alakultak ki); klinikai tüneteik alapján; az EEG alapján, az epileptikus fókusz lokalizációja alapján vagy az elsı roham jelentkezésének idıpontja szerint; 1. ábra).
1. ábra. Az epilepsziás tünetegyüttesek kétdimenziós osztályozása (Halász, 1997). Az epilepsziás rohamokat megkülönböztethetjük az alapján, hogy az agy egészére (generalizált), vagy annak csak egy részére (parciális vagy fokális) terjed ki. A parciális rohamokat tovább csoportosíthatjuk annak alapján, hogy öntudatvesztéssel járnak-e 3
(komplex parciális roham), vagy sem (egyszerő parciális roham). A generalizált rohamokat fı tüneteik alapján különböztetjük meg (absence, myoklónusos, klónusos, tónusos, tónusosklónusos rohamok), ezek mindegyike tudatvesztéssel jár. Az epilepsziát kiváltó ok lehet idiopathikus (valószínőleg genetikai, de nem ismerjük), szimptomatikus (ismert agysérülés, vagy betegség), és kriptogenikus (feltételezett lézió). Az idiopathikus epileptikus szindrómák gyakran jelentkeznek gyerekkorban, ilyen például a gyerekkori vagy ifjúkori absence epilepszia, de ezek a kor elıhaladtával gyakran maguktól elmúlnak. Az epilepszia gyógyszeres kezelése részben megoldott, a betegek 75-80%-a elıbb vagy
utóbb
rohammentessé
válik
a
megfelelı
antiepileptikumok
hatására.
A
gyógyszerrezisztens betegek 30-40%-nál mőtéti kezelés szünteti meg a rohamokat (Cascino, 1994; Janszky és Szőcs, 2002). A gyógyszeres kezelés viszonylagos hatékonysága bizonyos értelemben félrevezetı, ugyanis a gyógyszerek nem az epilepszia okát szüntetik meg, hanem csak a tüneteit, vagyis a betegek hosszú ideig, gyakran életük végéig kezelésre szorulnak. Az epileptikus roham bármikori visszatérésének lehetısége, valamint a gyógyszerek súlyos mellékhatásai jelentısen rontják a betegek életminıségét. Az oki kezelés fı akadálya egyrészt az epilepsziás tünetegyüttesek rendkívül széles köre (1. ábra), másrészt az a tény hogy évszázados kutatás után az epileptikus rohamok kialakulásának okait még mindig nem ismerjük elegendı részletességgel (Orbán-Kis és mtsai., 2008). Az 1. táblázat jobb oldala foglalja össze az epilepszia kezelésére leggyakrabban
használt
vegyületek
klinikai
hatékonyságát
különféle
epilepsziás
tünetegyüttesekben.
2.2 Temporális lebeny epilepszia Temporális lebeny epilepszia (TLE) a leggyakoribb és talán legjelentısebb parciális epilepsziás tünetegyüttes (Halász és Fogarasi, 2006). A TLE definíciója egyrészt magában foglalja, hogy a pacemaker – és/vagy szimptomatogén zóna a temporális lebenyben van, másrészt azt, hogy az epilepszia kialakulásának oka ismert (vagy legalábbis feltételezett). Vagyis a TLE definíció nem csak lokalizációra utal, hanem megjelöli a patomechanizmust és a kórlefolyást is. A TLE klinikai jellemzıit a 2. ábra összegzi.
4
2. ábra. A temporális lebeny epilepsziás szindróma klinikai jellemzıi (Janszky és Szőcs, 2002). Lokalizáció szerint megkülönböztetünk mediális és laterális TLE szindrómát (Halász és Fogarasi, 2006; Sharma és mtsai., 2007). Felnıtt korban a mediotemporális epilepszia sokkal gyakoribb (az összes epilepsziás eset 50-60%-a ide sorolható), és ez a tünetegyüttes, amelyben a hippokampusz – amygdala együttes játszik meghatározó szerepet, valamint a rohamok kiterjedhetnek az egész limbikus rendszerre (3. ábra).
3. ábra. Temporális epilepsziás roham foramen ovale (alsó elvezetésekkel) és skalp elektródákkal regisztrált EEG-képe. Jól látható, hogy a roham a mediotemporális struktúrákból indul, és csak késéssel jelenik meg a felszíni elektródákban (Halász és Fogarasi, 2006).
5
Laterális TLE gyermekkorban gyakoribb és általában fejlıdési rendellenesség vagy daganat okozza. A mediotemporális epilepszia a betegek többségénél visszavezethetı valamilyen elsıdleges agysérülésre / eseményre, mint például gyermekkori lázgörcs, státusz epileptikusz, agyhártyagyulladás, vagy trauma, amely következtében létrejövı funkcionális változások az agyban egy hosszú látens periódus (5-10 év) után a spontán rohamok megjelenéséhez vezetnek (Sharma és mtsai., 2007). A betegek kb. 70-80%-ban figyelhetı meg hippokampális lézió, amelyet általában neuronális degeneráció, asztrogliózis, szemcsesejtek diszperziója, aberráns moharost sarjadzás jellemez (A moharost sarjadzás a hippokampusz gyrus dentatusában lévı szemcsesejtek axonjainak az újrarendezıdése; (Babb és mtsai., 1991; Meldrum, 1991; Sloviter, 1994; Sutula és mtsai., 2003). Mivel a hippokampusz egyoldali mőtéti eltávolítása hatékonyan meggátolja a rohamok kialakulását (Spencer, 2002), valamint mivel a betegek nagy részénél megfigyelhetı a hippokampális lézió, ezért általánosan elfogadott az a nézet, hogy a hippokampusz központi szerepet tölt be az epilepsziás rohamok kialakulásában mediotemporális epilepsziában. A hippokampusz központi szerepe elfogadott, de a rohamok kialakulásában szerepet játszó többi agyterület, valamint az azok funkciójában / anatómiájában / fiziológiájában a temporális lebeny epilepszia kialakulása során bekövetkezett változások szerepe a spontán rohamok létrejöttében még ma is erısen vitatott. A 4. ábra az epileptikus rohamok kialakulásában szerepet játszó agyterületeket, azok valószínő funkcióját foglalja össze. Nyilvánvaló, hogy még a legegyszerőbb modellben is több agyterület kölcsönhatására és egy visszacsatolási hurokra van szükség a rohamok kialakulásához. Számos, egymást kiegészítı, de az epilepszia kialakulásához vezetı változások különbözı
aspektusait
mechanizmusáról
kihangsúlyozó
mediotemporális
elmélet
született
epilepsziában
a
(Sharma
rohamok és
keletkezési
mtsai.,
2007).
Általánosságban ezek az elméletek a hippokampusznak a limbikus rendszerben betöltött különleges szerepét, valamint a rekurrens excitációban és gátlásban bekövetkezı változásokat hangsúlyozzák. Mediotemporális epilepsziában megfigyelt változások: 1) Csökken a GluR2 glutamát receptor alegység expressziója a hippokampuszban, aminek következményeképpen megnövekedhet az ionotróp glutamát receptor Ca2+ permeabilitása, növekedhet a sejtek excitabilitása, valamint azt is kimutatták, hogy a GluR2 expresszió gátlása sejtpusztulást / degenerációt okoz (Sanchez és mtsai., 2001; Gashia és mtsai., 2007). 2) Megváltozott GABAA subunit expresszió a hippokampuszban, amely csökkent rekurrens gátláshoz vezethet (Poulter és mtsai., 1999; Loup és mtsai., 2000) 3) Moharost 6
sarjadzás a hippokampusz gyrus dentatusában, amely egy excitátoros pozitív visszacsatolást hoz létre (Okazaki és mtsai., 1999) 4) A mohasejtek epilepsziában bekövetkezı pusztulása miatt a feed–back gátlás kevésbé mőködik a hippokampuszban. A mohasejtek fı bemenetei a moharostok. Mivel a mohasejtek fıleg gátló interneuronokon képeznek excitátoros szinaptikus kapcsolatokat pusztulásuk elviekben csökkenti a feed-back gátlást (csendes kosársejt elmélet) (Lothman, 1992; Sloviter és mtsai., 2003) Késıbbi kísérletekben nem találtak ilyen egyértelmü kapcsolatot a mohasejtek pusztulása és a gyrus dentatus excitabilitása között (Ratzliff és mtsai., 2004).
4. ábra. Mediális temporális lebeny epilepszia (MTLE) funkcionális anatómiájának sematikus vázlata. A: A hagyományos modellben a rohamok az enthorhinális kortexbıl valamint a hippokampusz gyrus dentatusából és CA1 területébıl álló visszacsatolásos (reverberating) hurokban keletkeznek. Egy bizonyos ponton az epileptikus aktivitás átterjed az amigdalára és más határos területekre mielıtt a neokortex bevonásával másodlagos generalizáció jönne létre. B: Újabb eredmények egy alternatív modellt valószínősítenek, amelyben kezdetben számos limbikus terület egymástól függetlenül kölcsönhat egymással. Mivel a középvonali thalamusz magok kölcsönös kapcsolatban állnak mindezekkel a területekkel ezért szerepet játszhatnak a rohamok keletkezésében és szubkortikális szinkronizációs funkciót láthatnak el. A generalizáció történhet a rohamok fokozatos átterjedésével a határos neokortexre vagy a thalamuszon keresztül a neokortex másodlagos bevonásával. DG: gyrus dentatus; EC: entorhinális kortex; HC: hippokampusz (Schwarcz és mtsai., 2002).
A mediotemporális epilepszia (MTLE) gyógyszeres kezelése csak részben hatékony, a betegek kb. 30-50%-a rezisztens mindenféle gyógyszeres beavatkozásra. Talán még nagyobb probléma, hogy a kezelés csak tüneti, mivel fı célja az epileptikus rohamok
7
megszüntetése, valamint az ezekbıl adódó másodlagos sérülések megakadályozása (Halász, 1997; Halász és Fogarasi, 2006; Loscher és Schmidt, 2006; Nehlig, 2007). A MTLE elsı ajánlott gyógyszere még mindig a karbamazepin (Halász és Fogarasi, 2006), egy nátrium csatorna blokkoló, amelynek csatorna blokkoló hatékonysága függ az idegsejtek membránpotenciáljától (depolarizált sejtekre magasabb), vagyis a normális neuronális aktivitást viszonylag nem befolyásolja, de a fokozott (kóros) aktivitást hatékonyan gátolja. Ha a karbamazepin egy betegnél nem bizonyul hatékonynak, egy másik antiepileptikummal kell kiegészíteni, ami sok esetben a clobazam, egy benzodiazepin származék (növeli az agyi gátló GABAerg transzmissziót). Ha ez sem hatékony, számos más antiepileptikumot ki lehet próbálni, de a siker esélye minden próbálkozással egyre kisebbé válik. Az új fejlesztéső antiepileptikumok legfıbb elınye a jelentısen kisebb mellékhatások. A 3. táblázat utolsó oszlopa illusztrálja a MTLE kezelésére leggyakrabban használt gyógyszerek hatékonyságát. A gyógyszeres kezelés sikertelensége után a mőtéti beavatkozás következhet, ami MTLE esetén talán a leghatásosabb, akár 80-85%-os is lehet. A mőtéti kezelés tulajdonképpen a roham kialakulásában központi szerepet játszó visszacsatolásos hurok megszakítását szolgálja és általában elülsı temporális lobectomiát vagy amygdalo-hippocampectomiát foglal magába (Halász és Fogarasi, 2006).
2.3 Állatmodellek az epilepszia kutatásában A minél relevánsabb és magasabb prediktív értékő állatmodellek kialakítása központi jelentıségő az epilepszia (és a farmakológiai) kutatás számára. Egy ideális állatmodell nem csak a betegség tüneteit reprodukálja, de annak okát, kialakulásának mechanizmusát is. Emellett magas a prediktív értéke, vagyis helyesen jósolja meg a vegyületek klinikai hatékonyságát (Ribak és mtsai., 1998; Hosford, 1999; Orbán-Kis és mtsai., 2008). A klinikában használt antiepileptikumok döntı többségét akut epilepszia tesztekre alapozva fejlesztették ki. Egy akut epilepszia tesztben valamilyen behatással (ez lehet kémiai, pld. pentilentetrazol (PTZ) adminisztráció vagy maximális elektrosokk (MES) teszt) epilepsziás rohamot váltanak ki állatokban (legtöbbször egerekben, bár fıemlısökön is tanulmányozták már az epilepszia kialakulását /Ribak 1998/) és a vegyületek hatékonyságát ezen rohamok kivédésén mérik. Nyilvánvaló, hogy ezek a tesztek az epilepsziás állapot kialakulását egyáltalán nem modellezik, s ennek folytán az ezeken a teszteken kifejlesztett gyógyszerek csak tüneti kezelésre alkalmasak (Loscher és Schmidt, 2006).
8
Antikonvulzáns aktivitás
Klinikai hatékonyság
Állatmodelleken Vegyület
MES
PTZ
Amygdala
Parciális
teszt
teszt
kindling
rohamok
Generalizált rohamok
Tónusos-
Absence
Myoklónusos
Klónusos Karbamazepin
+
NH
+
+
+
NH
NH
Phenytoin
+
NH
+
+
+
NH
NH
Phenobarbital
+
+
+
+
+
NH
+
Primidon
+
+
+
+
+
NH
+
Valporat
+
+
+
+
+
+
+
Benzodiazepin
+
+
+
+
+
+
+
NH
+
NH
NH
NH
+
±
Lamotrigin
+
NH
+
+
+
+
+
Topiramat
+
NH
+
+
+
±
+
Oxcarbazepin
+
±
?
+
+
?
?
Felbamat
+
+
+
+
+
±
+
Vigabatrin
NH
+
+
+
?
NH
NH
Tiagabin
NH
+
+
+
+
NH
NH
±
±
+
+
?
NH
NH
NH
NH
+
+
?
?
?
Zonisamid
+
+
+
+
+
+
+
NMDA Ant.
+
+
NH
NH
?
?
?
Ethosuximid
Gabapentin Levetiracetam
1. táblázat. A leggyakrabban használt antiepileptikumok állatmodelleken, valamint az epilepszia különbözı típusaiban klinikai vizsgálatokban mért hatékonyságának összehasonlítása. MES: maximális elektrosokk, PTZ: pentilentetrazol, + : hatékony, (±) : részben hatékony, NH: nem hatékony, ?: nincs adat (Loscher, 2002). Az idık folyamán számos krónikus epilepszia modellt is kifejlesztettek, amelyek az epilepszia kialakulásának, az agyban bekövetkezett változásoknak különbözı aspektusait emelik ki. A leggyakrabban használt ilyen modell a ‘kindling’, ahol a hippokampusz vagy az amygdala elektromos stimulálásával ismétlıdı (egyre könnyebben elıhívható) rohamokat váltanak ki (Sato és mtsai., 1990; Loscher, 2002), valamint a pilokarpinnal vagy kaináttal kiváltott státusz epileptikusz, mely hatására spontán rohamokkal jellemezhetı epileptikus állapot jön létre (Sharma és mtsai., 2007; Curia és mtsai., 2008; Williams és 9
mtsai., 2009). Az 1. táblázat összegzi a klinikumban használt antiepileptikumok hatékonyságát a különbözı akut és krónikus állatmodelleken valamint a különbözı típusú epileptikus tünetegyüttesekben.Megfigyelhetı, hogy a krónikus modell (kindling) prediktív értéke nagyon jó a parciális rohamok (MTLE) esetén, megfelelı a generalizált epilepsziák közül a tónusos-klónusos rohamokra és egyáltalán nem megfelelı az absence vagy myoklónusos rohamokra. Ennek az az oka, hogy a kindling, a kainát és a pilokarpin modell elsısorban az elsıdleges neuronális sérülés / státusz epileptikusz után kialakuló temporális lebeny epilepsziát modellezi. Szimptómás epilepszia modellek Elektromos stimulálással kiváltott
Kindling Epilepszia az elektromos stimulálással kiváltott státusz epileptikusz után alakul ki
Kémiai indukcióval kiváltott
Pilokarpin, Kainát modellek Epilepszia a kémiai vegyülettel kiváltott státusz epileptikusz után alakul ki
Idiopátiás epilepszia modellek Spontán
mutációk
különbözı Mutáns állat kiváltható rohamokkal
állatfajokban
(hang, fény) Mutáns állat spontán rohamokkal
Indukált mutációk egerekben
Transzgén vagy knock-out egér
2. táblázat. Krónikus epilepszia modellek (Loscher, 2002). Az is megfigyelhetı, hogy az akut modellek prediktív értéke alacsony. Azokra az epilepsziás tünetegyüttesekre, ahol az epilepszia kialakulásának oka pontosan nem ismert, nagyon nehéz okozati állatmodellt kifejleszteni. Ilyen esetekben gyakran a véletlen siet a segítségünkre
egy
olyan
állattörzs
azonosításával,
amely
valamilyen
genetikai
rendellenesség miatt produkálja a megfelelı tüneteket [ilyen pld. a WAG/Rij modell absence epilepsziára (Coenen és van Luijtelaar, 2003)] vagy pedig fáradtságos munkával az epileptikus tünetegyüttes okát feltételezve genetikai módosításokkal hozunk létre egy megfelelı modellt (Hosford, 1999; Gurbanova és mtsai., 2006; van Luijtelaar és Sitnikova,
10
2006; Polack és mtsai., 2007). A 2. táblázat foglalja össze a leggyakrabban használt krónikus epilepszia modelleket.
2.4 Egyszeri pilokarpin kezelés által kiváltott státusz epileptikusz krónikus hatásai - Temporális lebeny epilepszia modell Pilokarpin az acetilkolin muscarin típusú receptorának agonistája. Már korán megfigyelték, hogy kolinerg agonisták, köztük pilokarpin adása epileptikus rohamokat, státusz epileptikuszt vált ki kísérleti állatokban (Turski és mtsai., 1989). Azonban ez a modell a pilokarpin kezelésnek nem az akut, hanem a krónikus hatásai miatt kapott kitüntetett szerepet. Az akut pilokarpin kezelés által kiváltott, elhúzódó generalizált epileptikus roham ugyanis olyan maradandó változásokat / sérüléseket okoz az agyban, amelyek hatására (egy kezdeti tünetmentes szakasz után) krónikus epilepszia alakul ki, melyet az idırıl idıre jelentkezı parciális komplex rohamok jellemeznek (Curia és mtsai., 2008). A patkányban pilokarpinnal kiváltott krónikus epilepsziás állapotot azért tartják a humán temporális lebeny epilepszia (TLE) egyik talán legjobb modelljének, mivel nagymértékben reprodukálja annak nemcsak a fiziológiai és hisztopathológiai tüneteit, de kialakulásának folyamatát is, valamint az antiepileptikus szerek hatékonysága ezen a modellen jól korrelál a vegyületek klinikailag használt dózisaival (3. táblázat; Leite és mtsai., 2002; Loscher, 2002; Curia és mtsai., 2008). A gyógyszerek hatékonysága a kindling modellen is jól korrelál a klinikai dózisokkal, de meg kell jegyezni, hogy a kindling esetén kiváltott rohamokon, míg a pilokarpin esetén spontán rohamokon mérik a vegyületek hatását. Az utóbbi közelebb áll a humán epilepszia modellhez. A humán temporális lebeny epilepsziának a fı jellemzıi, hogy 1) az epileptikus fókusz a limbikus rendszerben található, különösen a hippokampuszban, entorhinális kéregben vagy az amigdalában, 2) az epilepszia kialakulása gyakran valamilyen fizikai sérülésre vezethetı vissza 3) jellemzı egy tünetmentes ‘látens periódus’ közvetlenül az eredeti sérülés után 4) jelentıs hippokampális szklerózis figyelhetı meg, különösen a szubikulum-CA1 valamint a hilus dentatus területén (Mathern és mtsai., 1996; Morimoto és mtsai., 2004; Curia és mtsai., 2008).
11
Vegyület
Kindling
Krónikus poszt-státusz epileptikusz modell
Parciális
Pilokarpin
Kainát
SAS
epilepszia
Phenytoin
+
+
?
?
+
Karbamazepin
+
+
?
(+)
+
Phenobarbital
+
+
(+)
?
+
Valporat
+
+
+
+
+
Gabapentin
+
?
+
?
+
Levetiracetam
+
+
?
?
+
Lamotrigin
+
?
?
(+)
+
NH
NH
?
NH
NH
Ethosuximid
3. táblázat. A leggyakrabban használt antiepileptikumok hatékonysága állatmodelleken, valamint parciális epilepsziában. + : hatékony, (+) : részben hatékony, NH: nem hatékony, ?: nincs adat. SAS: hosszantartó amygdala stimuláció (Loscher, 2002).
Patkányokban az akut pilokarpin kezeléssel kiváltott státusz epileptikusz konzekvensen, szinte 100%-ban epilepsziához, ismétlıdı rohamokhoz vezet (5. ábra; (Morimoto és mtsai., 2004; Curia és mtsai., 2008). Ezek a rohamok az akut pilokarpin kezelés után néhány hetes késéssel (4-tıl 44 nap, átlag 14,8 ± 3 nap; csendes periódus) jelentkeznek elıször, hasonlóan az agysérülés vagy státusz epileptikusz által kiváltott humán temporális lebeny epilepsziában tapasztalható több éves nyugalmi periódushoz (6. ábra) (Cavalheiro, 1995; Coulter és mtsai., 1996; Arzimanoglou és mtsai., 2002; Leite és mtsai., 2002; Epsztein és mtsai., 2006).
12
5. ábra. Epileptikus rohamok humán mediális temporális lebeny epilepsziában és annak patkány modelljeiben: a megváltozott neuronális fiziológia illusztrálása. A kísérleti állatokban a krónikus epilepsziát vagy kemokonvulzánssokkal (pilokarpin) vagy hosszantartó elektromos stimulációval (kindling) váltották ki. A: Kétoldali EEG mérés a hippokampuszból (LH, RH) és az amigdalából (LA, RA) patkányon (A1) és emberen (A2). Mindkét terület részt vesz a roham indításában, ami egy külsı szinkronizációs terület létét valószínősíti. A humán mérésen megfigyelhetı a bal hemiszféra késıbbi, de regionálisan egyidejő aktivációja. Ez az idıkülönbség nem látható a patkány méréseknél, valószínőleg az agyféltekék közötti erısebb kapcsolat következménye. B: Intracelluláris mérések egészséges és epileptikus patkányok hippokampuszából és amigdalájából. Mindkét agyterületen egy rövid, (0,1 ms) elektromos stimuláció az epileptikus állatokban a neuronok elnyúló depolarizációját és többszörös akciós potenciálokat váltott ki, ami a kontroll állatokban nem volt megfigyelhetı. C: Az entorhinális kérgen végzett intracelluláris mérések szintén elnyújtott depolarizációt és többszörös akciós potenciálokat mutatnak (Schwarcz és mtsai., 2002).
Az intraperitoneálisan adott pilokarpin akut hatásait az acetilkolin M1 muszkarin típusú receptorain hatva fejti ki, ugyanis a rohamok és a státusz epileptikusz kifejlıdését az M1 antagonisták gátolják (Cavalheiro és mtsai., 1991; Cavalheiro, 1995), a státusz epileptikusz kifejlıdése után azonban a rohamot már nem lehet kolinerg szerekkel befolyásolni, ilyenkor leginkább glutamát antagonisták vagy GABA agonisták hatásosak.
13
6. ábra. Pilokarpin kezelés akut és krónikus hatásainak idıbeli lefutása. Intraperitoneálisan adott pilokarpin (380 mg/kg) patkányokban státusz epileptikusz kialakulásához, valamint kiterjedt strukturális agykárosodáshoz vezet az akut szakaszban. A csendes szakasz folyamán az EEG és az állatok viselkedése normalizálódik, de ez a szakasz az elsı spontán epileptikus roham megjelenésével végzıdik. A krónikus szakaszra a spontán ismétlıdıen jelentkezı komplex parciális rohamok jellemzık (Cavelheiro, 1991).
2.4.1
Pilokarpin által kiváltott státusz epileptikusz akut hatásai – kiterjedt sejtpusztulás a hippokampuszban, amigdalában, thalamuszban, szaglókéregben, neokortexben és a substancia nigrában
Egyszeri pilokarpin vagy kainát kezelés hatására patkányokban státusz epileptikusz (SE) alakul ki, amely akár 6-12 órán keresztül is tarthat, és ennek következtében az állatok 30%−a is elpusztulhat. Az ezután következı 10-24 órában a roham intenzitása fokozatosan gyengül míg végül is az EEG aktivitás normalizálódik. Az állatok kímélése érdekében krónikus kísérletekben a SE idıtartalmát általában limitálják a generalizált roham kifejlıdése után 3-4 órával phenobarbitál adásával. A hosszantartó státusz epileptikusz jelentıs és számos agyterületre kiterjedı sejtpusztulást okoz az agyban (7. Ábra; (Liu és mtsai., 1994; Du és mtsai., 1995; Houser és Esclapez, 1996; Mello és Covolan, 1996; Fisher és mtsai., 1998; Sankar és mtsai., 1998; Covolan és Mello, 2000; Covolan és mtsai., 2000; Wu és mtsai., 2007; Deshpande és mtsai., 2008). A sejtpusztulás ultrastruktúrális szerkezete hasonló ahhoz, amit embereknél írtak le agysérülést követı epilepsziában (Cavalheiro, 1995). Jellemzı rá a neuronok dendritjeinek és sejttestjeinek duzzadása (swelling), valamint az asztroglia duzzadása. A leginkább érintett agyterületek a hippokampusz, a thalamusz, amygdala, piriform kortex, entorhinal kortex, neocortex, substancia nigra, de még a kisagyban is leírtak jelentıs sejtpusztulást (Correia és mtsai., 1998; Dinocourt és mtsai., 2003; Druga és mtsai., 2005; Faria és mtsai., 2005; Chen és mtsai., 2007). A sejtpusztulás szelektív, bizonyos jól elkülönülı sejttípusokat érint, mint például a mohasejteket a gyrus dentatus hilusában. A pilokarpinnal vagy kaináttal kiváltott SE által okozott sejtpusztulás nagyon hasonló területi mintázatot mutat, bár megfigyeltek 14
szignifikáns különbségeket is, elsısorban a sejtpusztulás mértékében és idıbeli lefutásában (7. ábra; Covolan és Mello, 2000). 7. ábra. Ezüst impregnációs technikával (Gallyas féle módszer, sérült neuronok festıdnek, de nem mindegyik pusztul el) láthatóvá tett sérült idegsejtek az agy különbözı területein pilokarpinnal vagy kaináttal kiváltott státusz epileptikusz után. A, B, C, D: Sejtpusztulás idıbeli lefutása a hippokampuszban. 2,5 órával a státusz epileptikusz (SE) kiváltása után erıs festıdés figyelhetı meg a gyrus dentatusban (DG) és a hilusban, gyengébb festıdés a CA1-ben és a CA3-strátum oriensben. 8 órával SE után erıs festıdés a CA1-ben és a CA3a piramissejt rétegben valamint a gyrus dentatusban. 24 órával SE után festıdés a CA1, CA3a és DG területeken. 48 órával a SE után már csak gyenge festıdés figyelhetı meg a DG hilusában. E, F, G, H, I, J: Pilokarpin és kainát által indukált SE kiváltotta sejtpusztulás területi eloszlása patkány agyban 8 órával a SE után. Sematikus diagramm. E, F: 2,6 mm-re; G, H: 3,25 mm-re; I, J: 5,65 mm-re a Bregmától kaudálisan. Fekete szín jelöli az erısen, szürke a közepesen és világosszürke a gyengén festıdött területeket (Covolan és Mello, 2000).
Ez a hasonlóság a különbözı mechanizmussal kiváltott SE következményeiben, valamint az a tény, hogy SE nélkül pilokarpin nem okoz agykárosodást azt sugallják, hogy az agykárosodás elsıdleges oka maga a SE és nem a kiváltására alkalmazott kemokonvulzáns. Covolan és munkatársai (2006) megmutatták, hogy az elsı státusz epileptikuszt követı újabb SE rohamok már nem járnak további jelentıs sejtpusztulással vagy azért mivel az elsı roham során az arra hajlamos sejtek már elpusztultak, vagy pedig azért, mivel az elsı SE után olyan folyamatok játszódnak le az agyban amelyek gátolják a további 15
sejtpusztulást az epileptikus rohamok során (Gorter és mtsai., 2003; Covolan és Mello, 2006). Más szerzık azt állapították meg, hogy a rekurrens epilepsziás rohamok további sejtpusztulást okoznak (összhangban az epilepszia progresszív természetével), bár messze nem olyan mértékőt, mint az elsı SE (Mello és Covolan, 1996). 2.4.2
A ‘csendes szakasz’ szerepe – neuronális változások, szinaptikus reorganizáció, amely során krónikus epilepszia alakul ki
A státusz epileptikusz lezajlása után a ‘csendes szakaszban’ (~ 14 nap; 6. ábra) a pilokarpinnal kezelt állatok általában normális viselkedést és EEG aktivitást mutatnak. Ez a szakasz azonban egyáltalán nem eseménymentes, ekkor történnek azok a változások az agyban amik végül is a krónikus epileptikus állapot kialakulásához vezetnek (Curia és mtsai., 2008). Mivel még most sem tudjuk pontosan, hogy ezek közül az események közül melyik jelentıs az epilepszia kialakulása szempontjából, mindegyik jelenség intenzív kutatás tárgya. A pilokarpin által kiváltott sejtpusztulás szelektív, bizonyos sejttípusok szinte teljesen eltőnnek; például a mohasejtek a gyrus dentatus hilusában szinte mind elpusztulnak a hosszan tartó státusz epileptikusz eredményeként. A mohasejtek fontos szerepet játszanak feed-back gátlásban a hippokampuszban, mivel fı bemenetüket a moharostok képezik, bár kismértékben kaphatnak beidegzést a perforáns pálya felıl is (feltételezett feed-forward gátlásban betöltött szerep; Amaral és mtsai., 2007). Mivel a mohasejtek fıleg gátló interneuronokon képeznek excitátoros synaptikus kapcsolatokat, pusztulásuk csökkenti a feed-back (és talán a feed-forward) gátlást (Lothman, 1992; Sloviter és mtsai., 2003; Ratzliff és mtsai., 2004). Meglepı, hogy a központi idegrenszer képes hiányukat szinte teljesen kompenzálni (Silva és Mello, 2000; Santhakumar és mtsai., 2005; Kang és mtsai., 2006). Egyes szerzık szerint (Stief és mtsai., 2007) SE a túlélı GABAerg interneuronok morfológiájában is permanens változást okoz a hippokampuszban, de ezeknek a változásoknak a funkcionális hatásai nem ismertek. A csendes szakasz folyamán zajlik le a moharost sarjadzás jelensége, ahol a szemcsesejtek axonjai rekurrens kollaterálisokat növesztenek és egy pozitív visszacsatolási hurkot hoznak létre azáltal, hogy önmagukkal szinaptikus kapcsolatokat létesítenek (Tauck és Nadler, 1985; Mello és mtsai., 1993; Okazaki és mtsai., 1995; Molnar és Nadler, 1999; Okazaki és mtsai., 1999; Scharfman és mtsai., 2003). Ilyen szinaptikus átrendezıdést más agyterületeken is megfigyeltek, például a hippokampusz CA1 (Esclapez és mtsai., 1999; Lehmann és mtsai., 2000; Lehmann és mtsai., 2001) és CA3 (Siddiqui és Joseph, 2005) 16
területén (8. ábra), a thalamuszban (Drummen és mtsai., 1999), a neokortexben (Sanabria és mtsai., 2002), és a kisagyban (Faria és mtsai., 2005).
8. ábra. Aberráns szinaptikus kapcsolatok létrejötte a hippokampuszban a krónikus epilepszia kifejlıdése folyamán. Sematikus, egyszerősített ábra. A kísérletben fluoreszcens festékkel feltöltött axonok növekedését követték. A moharost sarjadzáson kívül megfigyelhetı a CA3 retrográd innervációja a CA1 irányából, visszacsatolás létrejötte a CA1-ben, a CA1 sejtek retrográd innervációja a subiculum felıl valamint a megnövekedett kapcsolat a gyrus dentatus és a subiculum között (szaggatott vonal). (Lehmann és mtsai., 2001) alapján módosítva. Az ábrán nem szerepel a nem epileptikus állatokban is megfigyelhetı CA3 DG / Hilus kapcsolat, a Subiculum EC kapcsolat, valamint a Subicularis Complex, amely újabb eredmények szerint jelentıs szerepet tölt be az epileptikus rohamok kialakulásában.
A szinaptikus pályák átrendezıdésének megfigyelését nehezíti, hogy általában, a moharostok kivételével, amelyek cinket tartalmaznak és ezért Timm-féle festési eljárással jól megjeleníthetık, nincs rájuk könnyen végrehajtható specifikus festési eljárás. Az sem világos, hogy a szinaptikus átrendezıdésnek mi a szerepe az epilepszia kifejlıdésében és fenntartásában, ugyanis az új pályák, attól függıen, hogy milyen sejten végzıdnek, egyaránt erısíthetik a serkentı, valamint a gátló mechanizmusokat a különbözı agyterületeken.
17
Státusz epileptikusz hatására drasztikus módon felgyorsul a neurogenezis a hippokampusz gyrus dentatus területén (Parent és mtsai., 2006; Curia és mtsai., 2008) (9. és 10. Ábrák). Sokáig azt tartották, hogy a neuronok a felnıtt központi idegrendszerben nem újulnak meg, új neuronok egy bizonyos kor után már nem születnek. A gyrus dentatus az egyik olyan agyterület, ahol neuronális progenitorsejtekbıl még képzıdnek neuronok, de ez a folyamat olyan lassú, hogy jelentıségét az idegrendszer regenerációjában sokáig vitatták.
9. ábra. Neurogenezis és neuron vándorlás a hippokampuszban pilokarpinnal kiváltott SE után. Az újonnan született szemcsesejteket bromodeoxyuridine (BrdU) –nel jelölték. A-F: Gyrus dentatuson keresztül futó koronális szekciók pilokarpinnal kezelt (B, D, F) és kontroll állatok (A, C, E) esetén. BrdU adminisztráció a pilokarpin kezelés utáni 7. napon történt; a metszeteket a 9.,14. és 35. napon készítették. Jól megfigyelhetı a neurogenezis felgyorsulása a SE után, valamint az újonnan született sejtek aberráns vándorlása a hilusban. Pilokarpinnal kezelt állatokban az újonnan született szemcsesejtek a hilusba vándorolnak. G, H: A hilusban megfigyelhetı új szemcsesejtek száma kontroll és epileptikus állatokban kétféle módszerrel megfestve (BrdU és Prox-1 expresszió; (Parent és mtsai., 2006).
Annak a felfedezése, hogy sérülés (pld. SE) után ez a folyamat drasztikusan felgyorsul, új lehetıségeket nyitott meg az idegrendszer regenerációs képességének gyógyszeres fokozásához.
A SE hatására újonnan született szemcsesejtek fiziológiai
szerepe intenzív kutatás tárgya (Parent és mtsai., 1997; Parent és mtsai., 1999; Covolan és mtsai., 2000; Scharfman és mtsai., 2000; Parent, 2002; Radley és Jacobs, 2003; OverstreetWadiche és mtsai., 2006; Parent és mtsai., 2006; Pierce és mtsai., 2007; Scharfman és mtsai., 2007; Shapiro és mtsai., 2007). Egyrészt hiperexcitabilitásuk, aberráns elhelyezkedésük és szinaptikus kapcsolataik miatt hozzájárulhatnak az epileptikus rohamok 18
kialakulásához, másrészt bizonyos mértékben átvehetik az elpusztult mohasejtek szerepét a rekurrens / feed-forward gátlás folyamatában.
10. ábra. Epileptikus roham által kiváltott neuro- és gliagenezis patkány hippokampuszban. Az új sejtek a gyrus dentatus szemcsesejt rétegének (dgc) hilus felé esı oldalán (1) születnek és normál esetben a szemcsesejt rétegbe vándorolnak. Pilokarpinnal kiváltott SE után megnövekedett számú szemcsesejt születik, amelyeknek többsége a szemcsesejt réteg belsı oldalán marad és aberráns axonokat küld a szemcsesejt réteg másik oldalára. Más részük aberráns módon kivándorol a hilusba (2). A másik terület az agyban, ahol új sejtek születnek az agykamra (LV) alatt helyezkedik el (3). SE után ezek a sejtek is aberráns módon vándorolnak a CA1 és CA3 területére (4) és nagy valószínőséggel asztrocitává vagy oligodendrocitává differenciálódnak (Parent, 2002). Más kutatók szerint az újonnan született szemcsesejtek szerepe kevésbé jelentıs az epilepszia kialakulásában, egyrészt mivel a szemcsesejtek száma inkább csökken mint növekszik a betegség elırehaladása során, másrészt a szemcsesejtréteg kiszélesedését inkább a reelin hiánya, mintsem az új szemcsesejtek okozzák (Haas és Frotscher, 2009).
2.5 A moharost sarjadzás a hippokampusz gyrus dentatusában mint a spontán visszatérı epileptikus rohamok egy lehetséges oka Talán a legnyilvánvalóbb anatómiai változás az agyban, ami humán mediotemporális epilepsziában,
valamint
annak
krónikus
állatmodelljeiben
(pilokarpin,
kainát)
megfigyelhetı: a moharost sarjadzás jelensége a hippokampusz gyrus dentatus területén. A pilokarpin modellben a szemcsesejtek axonjai a státusz epileptikuszt követı néhány nap után drámai módon megnövekednek és nagy számban jelennek meg a gyrus dentatus
19
molekuláris rétegében, ahol normális esetben nagyon kevés található belılük (11. ábra; (Golarai és Sutula, 1996b; Wuarin és Dudek, 1996; Okazaki és mtsai., 1999; Blasco-Ibanez és mtsai., 2000). A moharost sarjadzás megfigyelését nagyon megkönnyíti, hogy ezen az agyterületen csak a szemcsesejtek axonjai tartalmaznak cinket, amit Timm-féle festéssel kitőnıen ki lehet mutatni.
11. ábra. Moharost sarjadzás a hippokampusz gyrus dentatusában. Fekete: normális szemcsesejt, a szemcsesejt axonja a CA3 piramissejtekkel képez szinaptikus kapcsolatokat. Axon kollaterálisai a gyrus dentatus hilusában interneuronokat idegeznek be. Piros: epileptikus állatból származó szemcsesejt, melynek axonja visszatér a gyrus dentatus molekuláris rétegének belsı harmadába és ott képez szinaptikus kapcsolatokat más szemcsesejtekkel. ML: molekuláris réteg, GCL: szemcsesejt réteg, DH: dentát hilus, DG: gyrus dentatus, CA3: CA3 terület, PCL: piramissejt réteg (Koyama és Ikegaya, 2004). A hippokampusz központi szerepet játszik az epileptikus rohamok kialakulásában mediotemporális epilepsziában (Barbarosie és Avoli, 1997). Ezt EEG mérések, a hippokampális jellegzetes lézió megjelenése valamint a mőtéti beavatkozások sikere egyértelmően jelzik. Az epileptikus rohamok keletkezésére, átterjedésére a limbikus rendszerre és esetleges generalizációjára több elmélet született (4. ábra). Ezekben az elméletekben központi szerepet foglal el a hippokampusz sajátságos szerkezete. (Nagyon) Leegyszerősítve: az információ (neuronális aktivitás) egy irányban, sejtrétegrıl sejtrétegre terjed a hippokampuszban, a gyrus dentatus - CA3 – CA1 triszinaptikus jól definiálható pályán keresztül (8. ábra). Az aktivitás a hippokampuszról a szubikulumon keresztül az entorhinális kortexre terjed, ahonnan a perforáns pálya (a hippokampusz fı
20
bemenete) zárja be a visszacsatolásos hurkot. Ennek a pozitív visszacsatolásnak a megléte teszi lehetıvé az epilepsziás rohamok kialakulását és továbbterjedését. Normális esetben azonban nem alakul ki epileptikus aktivitás (a sejtek kóros szinkronizációja). Elektrofiziológiai tulajdonságai alapján a gyrus dentatust tartják a hippokampusz ‘kapuırzıjének’ (Lothman és mtsai., 1992; Koyama és Ikegaya, 2004). In vivo és in vitro mérések bizonyítják, hogy normál esetben nagyon nehéz epileptikus aktivitást kiváltani a gyrus dentatusban (5. ábra), amit elsısorban az erıs negatív feed-back (Ribak és Peterson, 1991; Acsady és mtsai., 1998) és feed-forward gátlás jelenléte, valamint az excitációs pozitív visszacsatolás (ami pedig jellemzı a hippokampusz más területeire – lásd CA1, CA3; (Miles és mtsai., 1984; Traub és mtsai., 1984; Traub és mtsai., 1987; Pan és Stringer, 1996) hiánya magyaráz. A 12. ábra illusztrálja a hippokampusz gyrus dentatusának felépítését, valamint annak a neuronális hálózatnak az elemeit és összeköttetéseit, amelyek ezt a feed-back, feed-forward gátlást, valamint a szinkronizált epileptikus aktivitással szembeni ellenállását biztosítják. Normális esetben a szemcsesejtek a gyrus dentatusban csak lassan, 0,1-1 Hz frekvenciával tüzelnek és szinkronizáció csak akkor következik be, ha az aktivitás ami a perforáns pályán keresztül érkezik az entorhinális kéregbıl abnormálisan magas (Jung és Mcnaughton, 1993; Pan és Stringer, 1996). Státusz epileptikusz hatására a gyrus dentatusban jelentıs anatómiai és fiziológiai változások zajlanak le, amelyek meggyengítik az epileptikus aktivitás terjedésével szembeni ellenállását (5. ábra). A mohasejtek pusztulása
jelentısen megváltoztatja a feed-back és a feed forward gátlást a gyrus
dentatusban, bár a GABAerg gátlás csökkenése egyáltalán nem olyan nagy mértékő, mint amilyet elméleti meggondolások alapján várnánk (Isokawa, 1996; Magloczky és Freund, 2005). Valószínőleg kompenzációs mechanizmusok kapcsolódnak be, mint amilyen a GABA receptorok expressziójának megnövekedése (Houser és Esclapez, 1996; Fritschy és mtsai., 1999), a GABAerg interneuronok axonjainak sarjadzása (Davenport és mtsai., 1990; Bausch, 2005) valamint a GABAerg interneuronok beidegzése a kiterebélyesedett moharostok által (Ribak és Peterson, 1991; Blasco-Ibanez és mtsai., 2000).
21
12. ábra. A gyrus dentatus neuronális hálózata epilepsziában. A szemcsesejtek a fı bemenetüket a perforáns pályán keresztül kapják. A perforáns pálya az interneuronokat is stimulálja (az excitátoros mohasejteket és a gátló kosár sejteket), ezzel egy feed-forward gátló hurkot hoz létre. A kosársejtek gátolják a szemcsesejtek mőködését, a mohasejtek a kosársejteket stimulálják, ezzel erısítik a feed-forward gátlást. A szemcsesejtek axonjai a hilusban ágaznak el és szintén az interneuronokat stimulálják, ezzel egy hatékony feed-back gátlást hoznak létre. Epilepsziában ez a hálózat jelentısen átalakul. A moharost sarjadzás során a szemcsesejtek axonjai visszafordulnak a gyrus dentatusban és önmagukkal (szomszédos szemcsesejtekkel) képeznek serkentı kapcsolatot, ezzel létrehoznak egy pozitív visszacsatolást, ami elısegítheti a szinkronizált epileptikus aktivitás kialakulását és tovaterjedését (Sharma és mtsai., 2007).
Ezzel párhuzamosan a gyrus dentatusban a moharost sarjadzás létrehozza azt a pozitív visszacsatolást, ami számos kutató szerint magyarázatot adhat a gyrus dentatus epileptikus aktivitással szembeni ellenállásának meggyengülésére (12. ábra; Cronin és mtsai., 1992; Patrylo és Dudek, 1998; Hardison és mtsai., 2000). Kísérletek bizonyították, hogy a moharost sarjadzás során kiterebélyesedett szemcsesejt-axonok szinaptikus kapcsolatokat létesítenek a szemcsesejtekkel (ez hozza létre a pozitív visszacsatolást) de ezzel egyidejüleg gátló interneuronokkal is (Ribak, 1985; Ribak és Peterson, 1991; Kotti és mtsai., 1997; Ribak és Dashtipour, 2002; Sharma és mtsai., 2007). Elektrofiziológiai kísérletek azt is bizonyították, hogy a létrejött szemcsesejt-szemcsesejt kapcsolatok funkcionálisak és excitátorosak (Molnar és Nadler, 1999; Scharfman és mtsai., 2003). A moharost sarjadzás kialakulása a státusz epileptikusz után (‘a csendes periódusban’) egybeesik a spontán rohamok megjelenésével. Ezen tények ellenére a moharost sarjadzás, 22
mint a mediotemporális epilepszia elsıdleges oka ma is erısen vitatott (Morimoto és mtsai., 2004). Egyrészt megmutatták, hogy ha cyclohexamiddel meggátolják a moharost sarjadzást akkor is kialakulhatnak epileptikus rohamok (Longo és Mello, 1997; Longo és Mello, 1998), másrészt még az epileptikus hippokampuszban is, ahol a moharost sarjadzás jelentıs,
nehezen váltható ki epileptikus neuronális aktivitás in vitro. Valószínőleg a
moharost sarjadzás csak egy (bár jelentıs) azok közül a mechanizmusok közül amik lehetıvé teszik az epileptikus rohamok keletkezését és terjedését mediotemporális epilepsziában. A moharost sarjadzás pontos kiváltó oka nem ismert (Curia és mtsai., 2008). Egyes feltételezések szerint a mohasejtek pusztulásával a moharostok rekurrens ágai elveszítik célsejtjeiket és a moharost sarjadzás folyamán más célt keresnek maguknak. Ennek ellentmond az a megfigyelés, hogy a kindling modellben sejtpusztulás nélkül is létrejön moharost sarjadzás. Más elméletek szerint az epileptikus aktivitás bizonyos növekedési faktorok (NGF, BDNF, NT-3, TGF) valamint axon vezérlı molekulák (ephrinek, szemaforinok) fokozott termelıdését / átrendezıdését okozza, ami hozzájárulhat a moharost sarjadzás serkentéséhez (Morimoto és mtsai., 2004).
2.6 Az újonnan született szemcsesejtek szerepe az epilepszia kialakulásában A moharost sarjadzáson kívül talán a legmeglepıbb felfedezés az epilepszia kutatásban a 90-es évek végén született, amikor megfigyelték, hogy a pilokarpinnal kiváltott státusz epileptikusz után a neurogenezis drasztikusan felgyorsul a gyrus dentatusban (9. és 10. Ábrák; (Parent és mtsai., 1997; Covolan és mtsai., 2000; Scharfman és mtsai., 2007; Shapiro és mtsai., 2007; Shapiro és mtsai., 2008). A felfedezés azért is volt jelentıs, mivel bár neurogenezist korábban is megfigyeltek az agy egyes területein, ami magába foglalta a gyrus dentatust, de funkciója és esetleges regulációja ismeretlen volt. Egy olyan folyamat megismerése ahol az agy sérülése / neuronális pusztulás egy valószínőleg javító folyamatot – az elpusztult sejtek pótlását indítja el elméleti és gyakorlati szempontból is nagyon nagy jelentıségő volt. Késıbb az epileptikus rohamok hatását a neurogenezisre embereken is igazolták (Parent és mtsai., 2006), bár ez a kérdés még mindíg vitatott. Azt is megállapították, hogy a gyrus dentatus szemcsesejtjeinek abnormális diszperziója, amit korábban is a mediotemporális epilepszia egyik jellegzetességének tartottak, az újonnan született szemcsesejtek aberráns vándorlásának a következménye. Az újonnan született szemcsesejtek epilepsziában betöltött szerepe vitatott. Elméleti elvárások szerint a hilusba vándorolt újonnan született szemcsesejtek az elpusztult mohasejtek szerepét vehetnék át, 23
mivel a szemcsesejtek és a mohasejtek fiziológiailag nagyon hasonlók (excitátoros neuronok). Újabb mérések szerint azonban nem ez történik, az ektopikus szemcsesejtek nagyrészt CA3 piramissejtekkel vagy a gyrus dentátus szemcsesejtjeivel létesítenek kapcsolatokat, ezzel az excitációt erısítik a gyrus dentatusban (Scharfman és mtsai., 2000; Overstreet-Wadiche és mtsai., 2006; Pierce és mtsai., 2007). Ektopikus elhelyezkedésük miatt a hilusban sokkal erısebb beidegzıdést kaphatnak a moharostok kollaterálisain keresztül, mint az eredeti szemcsesejtek moharost sarjadzás után a gyrus dentatusban. Ezért felmerült az a lehetıség is, hogy az újonnan született szemcsesejtek epileptikus szinkronizációs fókuszként mőködhetnek. A neurogenezis meggátlása radioaktív besugárzással, amely a neuronális progenitor sejteket pusztítja csak el, vagy cytosine-β-Darabinofuranosiddal, amely megakadályozza osztódásukat, antiepileptikus hatásúnak bizonyult (Jung és mtsai., 2004; Overstreet-Wadiche és mtsai., 2006). Ezzel szemben azt is kimutatták, hogy neurogenezis nem szükséges az epilepszia kialakulásához, sem a moharost
sarjadzás
kifejlıdéséhez
(Radley
és
Jacobs,
2003).
A
neurogenezis
felgyorsulásáért felelıs mechanizmusok csak részben ismertek, valószínőleg ugyanazok a növekedési faktorok játszhatnak benne szerepet, amelyek a moharost sarjadzásért felelısek. Azt is leírták, hogy ehhez a folyamathoz a szerotonin receptorok aktivációja szükséges (Radley és Jacobs, 2003).
2.7 Növekedési faktorok megváltozott expressziójának a szerepe az epilepszia kialakulásában Epileptikus aktivitás hatására számos szignál molekula expressziója megváltozik a hippokampuszban. A moharost sarjadzással, valamint a neurogenezis felgyorsulásával kapcsolatban már felmerült a növekedési faktorok kitüntetett szerepe, valamint hogy a növekedési faktorok expressziója drasztikusan megváltozik fokozott neuronális aktivitás (epileptikus rohamok) esetén. A moharost sarjadzás és a neurogenezis feltételezett vezérlésén kívül ezeknek a növekedési faktoroknak maguknak is leírták akut epileptogén és antiepileptogén hatásait is (Scharfman és mtsai., 1999; Morimoto és mtsai., 2004). NGF, BDNF, NT-3, GDNF növekedési faktoroknak már bebizonyították mediotemporális epilepsziában
betöltött
szerepét.
NGF,
BDNF,
GDNF
expressziója
növekszik
epilepsziában, míg NT-3-é csökken (Morimoto és mtsai., 2004). A növekedési faktorok antagonistáinak alkalmazásával, valamint a növekedési faktorok direkt adásával próbálták feltérképezni ezeknek a faktoroknak a hatásait. Ezek alapján nagyon bonyolult kép alakult 24
ki a növekedési faktorok sokrétő akut és krónikus hatásairól. Mind NGF, BDNF és NT-3 növeli a hippokampusz neuronjainak ingerelhetıségét és epileptogénnek tekinthetı, de NGF-fel és NT-3-al szemben BDNF nem játszik jelentıs szerepet a moharost sarjadzás indukálásában (Kokaia és mtsai., 1995; Scharfman és mtsai., 2002; Xu és mtsai., 2002). GDNF egyértelmően antiepileptogén és részlegesen gátolja a moharost sarjadzást (Martin és mtsai., 1995). A növekedési faktorok közül BDNF kapott a legnagyobb figyelmet, mivel a moharostok nagy koncentrációban tartalmazzák, expressziója drasztikusan megnövekedik státusz epileptikusz után, az agykamrákba adva epileptikus rohamokat vált ki, akut kísérletekben jelentısen növeli a hippokampusz elsıdleges sejtjeinek ingerelhetıségét és ez a hatás szelektíven, az epileptikus agyban érvényesül (Scharfman és mtsai., 1999; Scharfman és mtsai., 2002). A 13. ábra. Illusztrálja BDNF eloszlását és akut hatását a hippokampusz gyrus dentatusában. Mint ahogy a BDNF példáján láthatjuk, a növekedési faktoroknak nagyon összetett hatásuk van a mediotemporális epilepsziában, akut és krónikus hatásaikat nagyon nehéz szétválasztani, és még egyáltalán nem értjük szerepüket az epilepszia kialakulásában. Ami egyértelmő az eddigi megfigyelések alapján, hogy központi szerepet játszanak az epilepsziában bekövetkezı anatómiai és fiziológiai változásokban, és hatásaik megértése elvezethet az epilepszia oki terápiájához.
2.8 A moharostok által kibocsátott cink feltételezett szerepe A növekedési faktorok tárgyalása során felmerült, hogy a moharost sarjadzás nemcsak a pozitív visszacsatolás létrejöttén keresztül járulhat hozzá a gyrus dentatus epileptikus szinkronizált aktivitással szembeni ellenállásának meggyengüléséhez, hanem azzal is, hogy a moharostok nagy koncentrációban tartalmaznak BDNF növekedési faktort, ami erıs stimuláló hatással van a szemcsesejtekre. A másik anyag, amit a moharostok kivételesen magas koncentrációban tartalmaznak a cink {Kay, 2006 #17257. A Timm-féle festési eljárás, aminek a segítségével a moharost sarjadzást eredetileg felfedezték, éppen a cink kimutatásán alapul. A moharostok axon terminálisain belül a szinaptikus vezikulák tartalmaznak nagy koncentrációban cinket, és a cink kalcium függı módon a glutamát neurotranszmitterrel együtt ürül preszinaptikus aktivitás esetén (Aniksztejn és mtsai., 1987; Frederickson és Danscher, 1990; Budde és mtsai., 1997).
25
D F
E
13. ábra. BDNF eloszlása a gyrus dentatusban és hatása a szemcsesejtekben hilus stimulálással kiváltható válaszokra. A: BDNF immunohisztokémia olyan patkány agyszeleten ahol a Timm-festés jelentıs moharost sarjadzást mutatott ki (a Timm-festés a B ábrán látható). Erıs BDNF expresszió mutatható ki a hilusban és a belsı molekuláris rétegben. C: Abban az állatban, amelyikben moharost sarjadzás nem volt megfigyelhetı BDNF expresszió is minimális. D: Azokban a patkányokban, ahol kialakult moharost sarjadzás, a hilus stimulálása két populációs spike-ot váltott ki; az elsı az antidromikus spike, a második a moharost kollaterálisokon keresztül közvetítıdik. Ez a komponens jelentısen megnövekedett BDNF adminisztráció után és többszörös populációs spike-ok alakultak ki. E: Abban az állatban, amelyikben nem alakult ki moharost sarjadzás BDNF hatástalan volt. F: Az D. ábrán bemutatott állatban BDNF után spontán epileptikus neuronális aktivitás volt megfigyelhetı (Scharfman és mtsai., 1999). A moharost – CA3 piramissejt szinapszisok esetén a glutamáttal együtt ürülı cink gátolja az N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptorokat (Mellor és mtsai., 2000; Vogt és mtsai., 2000); ez a hatás antiepileptogén) valamint a GABAA receptorokat (ez a hatása epileptogén; (Buhl és mtsai., 1996).Epilepszia esetén (mind a kindling, mind a pilokarpin modellben megfigyelték) a GABAA receptorok cink érzékenysége drasztikusan megnı, valószínőleg a GABAA receptorok alegység szerkezetének megváltozása miatt (Buhl és mtsai., 1996; Gibbs és mtsai., 1997; Brooks-Kayal és mtsai., 1998b). Például a kindling 26
modellben 200 µM cink jelentısen csökkenti a GABAerg gátló posztszinaptikus áramokat (Buhl és mtsai., 1996), míg ez egészséges állatban nem figyelhetı meg. Humán mediotemporális epilepsziában mőtéti mintákon hasonlóan cinkre fokozottan érzékeny GABAA receptorokat írtak le (Shumate és mtsai., 1998). Mindezen tények alátámasztják azt az elméletet, hogy a moharost sarjadzás során kiterebélyesedett moharostokból kiürülı cink a GABAerg gátlás felfüggesztése révén növeli a hippokampusz ingerelhetıségét és ez a folyamat vezethet az epileptikus rohamok kialakulásához. Ezzel ellentétes hatású folyamat az NMDA receptorok cink általi gátlása. A moharost – CA3 piramissejt szinapszisokban egyetlen preszinaptikus stimulus is kiürít annyi cinket, amely gátolja a posztszinaptikus NMDA receptorokat (Vogt és mtsai., 2000). Az epileptikus állatokban a moharost – szemcsesejt szinapszisok is tartalmaznak NMDA receptorokat. Ezeknek a receptoroknak a gátlása antiepileptogén hatású (Patrylo és Dudek, 1998). A cink szerepe az mediotemporális epilepsziában még mindig vitatott, mivel mind epileptogén, mind antiepileptogén hatásait leírták. Hogy melyik hatása a jelentısebb in vivo még nem eldöntött (Timofeeva és Nadler, 2006; Noyan és mtsai., 2007; Foresti és mtsai., 2008; Lavoie és mtsai., 2007)
2.9 Moharost sarjadzás vizsgálatának technikai módszerei A moharost sarjadzás jelenségének kísérletes vizsgálatára számos módszert fejlesztettek ki (Frye, 2009). Az alkalmazott eszköztár szerint a módszer lehet hisztológiai (Kuo és mtsai., 2008), mint például a Timm-féle festés, vagy immunohisztokémiai (Chi és mtsai., 2008), ahol egy fehérje jelenlétét mutatják ki egy antitest – antigén reakció alapján. Molekuláris biológiai módszereket (Simeone és mtsai., 2003) akkor használnak, ha egy fehérje / gén expresszióját akarják quantitatív módon vizsgálni, vagy kísérletes módon befolyásolni. Az elektrofiziológiai módszerek (Davis és mtsai., 2002) a funkcionális módszerek közé tartoznak, vagyis neuronális rendszerek, vagy ioncsatornák aktivitását lehet mérni velük többé-kevésbé fiziológiás környezetben. Talán a legkevésbé invazív funkcionális technikák közé tartoznak az optikai detektálási módszerek (Hillman, 2007), pld kalcium imaging, ahol egy festék molekula fluoreszcens színképében calcium kötıdés hatására bekövetkezı változást mérik. Napjainkban a fotostimuláció (fényimpulzus generálta kémiai változás kiváltotta biológiai reakció) elterjedésével optikai úton már nem csak detektálni, de aktívan kontrollált módon beavatkozni is lehet biológiai rendszerekbe. A preparátum összetettsége 27
és származása szerint megkülönböztetünk in vivo módszereket, ilyen például egy viselkedési teszt, ahol a pilokarpinnal kiváltott epileptikus rohamok frekvenciáját mérik, in vitro módszereket, ahol pld. sejttenyészetben egy adott ion csatornára ható vegyületeket vizsgálják és ex vivo módszereket, ilyen például egy agyszeleten végzett elektrofiziológiai kísérlet, ahol a szövet integritása többé-kevésbé megtartott, de a szövet ki van szakítva eredeti környezetébıl. 2.9.1
Extracelluláris elektrofiziológia
Extracelluláris elektrofiziológia módszereket már több mint 200 éve (a ‘bioelektromosság’ felfedezése óta) használnak fiziológiai mérésekben és az orvostudományban (Lábos, 1996). Ez a mérési módszer azon alapszik, hogy a szervezet magas víz – és ion tartalma miatt elektrolitnak tekinthetı amely vezeti az elektromosságot. A sejtek membránján a normális fiziológiai folyamatok során átáramló ionok áramot keltenek, amely a környezı vezetı közegben elektromos teret gerjeszt Ez az un. ‘volume conductor model’ (Ganapathy és Clark, 1987; Gold és mtsai., 2006; Hallez és mtsai., 2007). Ezt az elektromos teret lehet az extracelluláris térben különbözı helyre helyezett elektródákkal érzékelni. A 14. ábra mutatja az elektrofiziológiában leggyakrabban alkalmazott elvezetési formákat.
14. ábra. Alapvetı extracelluláris és intracelluláris elektrofiziológiai mérési technikák. AEP: Auditory Kiváltott Potenciál; EP: Kiváltott Potenciál; FP: Field Potenciál; RP: Nyugalmi potenciál; PSP: Posztszinaptikus Potenciál (Karmos és mtsai., 2009).
28
A mért jel amplitúdója, alakja nagymértékben függ az eredeti elektromos szignál generátor tulajdonságaitól,
valamint
az
elektród
és
a
jelforrás
egymáshoz
viszonyított
elhelyezkedésétıl. Általánosságban extracelluláris mérésekkel csak több sejt szinkronizált aktivitását lehet mérni (field potenciál, populációs spike), de ha az elektróda elég kicsi és közel van a jelforráshoz, akkor akár egy sejt aktivitását is detektálni lehet, akár szabadon mozgó állatban / emberben is.Az utóbbi 50 évben az agyszelet, különösen a hippokampusz szelet mérések nagyon elterjedtek az idegtudományban, mivel egyrészt lehetıvé tették az idegsejtek könnyü elérhetıségét és a sejtek környezetének manipulálását, másrészt az agyszelet többé – kevésbé megtartja az élı szövet organizációját és struktúráját ami lehetıvé teszi fiziológiás neuronális hálózatok tanulmányozását (Banczerowski és mtsai., 1999; Suter és mtsai., 1999; Purves és mtsai., 2004) (Henze és Buzsaki, 2007). 2.9.2
A patch clamp módszer
Az extracelluláris mérési módszer elınye, hogy nem túlságosan invazív és viszonylag könnyen végrehajtható, nem igényli a mérı elektróda nagyon pontos pozícionálását. Hátránya viszont, hogy csak gyors változásokat tud mérni, mint amilyenek az akciós potenciálok, és teljesen alkalmatlan a nyugalmi membránpotenciál vagy membrán ionáramok mérésére. Az extracelluláris mérésekkel párhuzamosan kifejlesztették az intracelluláris mérési technikát, amit elıször nagy ellenállású ‘sharp’ elektródokkal végeztek. A patch clamp módszer ennek az intracelluláris mérési technikának a jelentısen továbbfejlesztett változata (15. ábra). Ezt a módszert Bert Sakmann és Erwin Neher fejlesztette ki a 80-as évek legelején. Érzékenységére jellemzı, hogy egy csatorna (single channel) módban egyetlen ioncsatornán áthaladó ionok áramát képes detektálni olyan idıfelbontásban, hogy az ioncsatorna konformációs fluktuációi megállapíthatók. A patch clamp módszert a farmakológusok és a fiziológusok inkább az egész sejt (whole-cell) módban használják.
29
15. ábra. A patch clamp módszer különbözı konfigurációi (Purves és mtsai., 2004).
2.9.3
Fotostimuláció Az optikai detektálási módszerek a tradícionális hisztológiai / mikroszkópiai
módszerekbıl fejlıdtek ki azt kihasználva, hogy a molekulák gerjeszthetısége és fénykibocsátása függ térbeli szerkezetüktıl (ami egy kémiai anyag hozzákötıdése, vagy a molekula környezetének megváltozása esetén módosulhat). Vagyis kifejleszthetık olyan festékek, amelyekkel élı sejtek fiziológiai tulajdonságait lehet nagy térbeli és idıbeli felbontással mérni. A fotostimuláció ennek egy továbbfejlesztett változata ( 16. ábra), amikor is a fényt nem csak az információ kiolvasására használjuk, de arra is, hogy elıre eltervezett kémiai változásokat okozzunk a sejtek környezetében, s belılük egy megtervezett reakciót kiváltsunk. Az utóbbi években arra is történtek sikeres törekvések, 30
hogy az elektrofiziológiai és a fotostimulációs méréseket összekapcsolják és
mindkét
módszer elınyeit kihaszálják (Sarkisov és Wang, 2007).
16. ábra. Fotostimuláció sematikus vázlata. Bal oldal: A glutamát egyik inaktív analógja UV fény hatására kettéhasad és glutamát szabadul fel. Jobb oldal: a mérési elrendezés vázlata. Az UV fényt a mikroszkóp objektívje fókuszálja a sejtek közelébe (Kotter és mtsai., 2005).
31
3 PROBLÉMAFELVETÉS, CÉLKITŐZÉSEK Temporális lebeny epilepsziában, valamint annak állatmodelljeiben megfigyelhetı a moharost sarjadzás jelensége, aminek során a gyrus dentatus szemcsesejtjeinek axonjai, a moharostok megjelennek a gyrus dentatus belsı molekuláris rétegében és serkentı szinapszisokat képeznek a szemcsesejtekkel. Ha ezek a szinapszisok funkcionálisak és elég nagy számban jönnek létre, akkor ezzel egy olyan pozitív visszacsatolás jöhet létre, ami magyarázatot adhat a gyrus dentatus lecsökkent ellenállóképességére epileptikus szinkronizált aktivitással szemben, ami megfigyelhetı temporális lebeny epilepsziában. Ezen túlmenıen a moharostokból a gyrus dentatus molekuláris rétegében szinaptikusan ürülı cink gátolhatja a GABAA receptorokat, s ez egyes kutatók szerint a feed-back gátlás összeomlásához vezethet. A moharostokból ürülı cinknek ennek ellentétes hatását is leírták: cink gátolja az NMDA receptorokat, ami antiepileptogén hatású lehet. Az epilepszia kialakulása során kialakuló szemcsesejt – szemcsesejt szinaptikus kapcsolatok fiziológiai és farmakológiai jellemzése közelebb vihet bennünket a temporális lebeny epilepszia kialakulásának megértéséhez, valamint esetleges új oki terápia kifejlesztéséhez.
Célkitőzések: •
Az spontán epileptikus rohamok kialakulása folyamán létrejövı szemcsesejt – szemcsesejt szinaptikus kapcsolatok funkcionális jellemzése a pilokarpin epilepszia modellben.
•
Szemcsesejt – szemcsesejt szinaptikus kapcsolatok farmakológiai jellemzése különös tekintettel a szinaptikus áram NMDA komponensére.
•
A moharostokból szinaptikus úton ürülı cink posztszinaptikus GABAA és NMDA receptorokra kifejtett hatásainak jellemzése epileptikus állatokban.
32
4 MÓDSZEREK 4.1 Pilokarpinnal kiváltott státusz epileptikusz A kísérletekre hím Sprague-Dawley patkányokat használtunk (150–200 g; Zivic-Miller Laboratories, Allison Park, PA). A patkányokat elıször 2 mg/kg scopolamin methyl bromiddal (Sigma, St. Louis, MO) majd fél óra múlva 330 – 360 mg/kg pilokarpin hydrokloriddal (Sigma) kezeltük intraperitoneálisan (i.p.). Nem mindegyik állatnál fejlıdött ki státusz epileptikusz. A státusz epileptikuszt Racine (1972) leírása alapján definiáltuk mint 2-es szintnél erısebb rohamot (Racine, 1972). A státusz epileptikuszt annak kezdete után 3-4 órával Na-phenobarbitállal (Sigma, 50 mg/kg i.p.) állítottuk meg. Azokat az állatokat, amelyeknél nem fejlıdött ki státusz epileptikusz, a kezeletlen állatok mellett kontrollként használtuk.
4.2 Szövettani eljárások Pilokarpin kezelés után 10 héttel, egyes kísérletekben 4-6 nappal, 400 µm vastag, a hippokampusz
hossztengelyére
merıleges
szeleteket
készítettünk
a
kaudális
hippokampuszból vibratóm (Vibratome 600 McIlvain) segítségével. Minden második szeletet
használtunk
szövettani
vizsgálatokra,
míg
a
fennmaradó
szeleteken
elektrofiziológiai méréseket végeztünk. A szövettanra szánt szeleteket Na2S (Sigma) oldatban 90 percig inkubáltuk, majd 10% formalint (Sigma) tartalmazó foszfát-pufferelt fiziológiás sóoldattal (Sigma) 4 ºC on 1-2 napig fixáltuk. Ezután a szeleteket albumingelatinba ágyaztuk be (Okazaki és mtsai., 1995) majd 30 µm vastag szeleteket készítettünk belılük a vibratómmal. Váltakozó szeleteket mikroszkóp lemezekre rögzítettünk, majd a páratlan szeleteket Timm-festéssel (Danscher, 1981), a páros szeleteket krezil-ibolya festéssel megfestettük. A hisztológiai analízisre azokat a szeleteket használtuk, amelyek a Paxinos és Watson atlasz (Paxinos és Watson, 1986) szerint a 101 és a 103 horizontális síkok között helyezkedtek el. A hisztológiai analízist úgy végeztük el, hogy nem ismertük a metszetek származását. A hilus neuronjait a krezil-ibolya metszeteken számoltuk meg és az adatokat átlagoltuk. A hilus területét NIH Image program segítségével mértük meg. A hilus neuronjainak sőrőségét a két szám hányadosaként adtuk meg.
33
Külön kísérletsorozatban tanulmányoztuk a neuronális degenerációt státusz epileptikusz után. Epileptikus és kontroll patkányokat transzkardiálisan 4% paraformaldehidet tartalmazó foszfát-pufferelt fiziológiás sóoldattal átperfundáltunk, majd 3-20 napig a paraformaldehid oldatban 4ºC –on tároltunk. Ezután belılük 40 µm vastag horizontális vagy koronális szeleteket készítettünk a fagyasztva metszés technikájával. Váltakozó szeleteket vagy krezil-ibolya festéssel, vagy ezüst impregnációs technikával (Nadler és Evenson, 1989) festettük.
4.3 Extracelluláris elektrofiziológiai mérések Elektrofiziológiai mérésekre 400 µm vastag agyszeleteket használtunk amelyeket a kaudális hippokampusz merıleges metszésével kaptunk. A metszeteket vibratóm segítségével készítettük. A kísérletek kezdetéig a szeleteket egy különálló kamrában szobahımérsékleten tartottuk mesterséges cerebrospinális folyadékban (ACSF) amely a következı konponenseket tartalmazta (koncentrációk mM-ban): 122 NaCl, 25 NaHCO3, 3,1 KCl, 1,8 CaCl2, 1,2 MgSO4, 0,4 KH2PO4, and 10 D-glucose, pH 7,4. Az ACSF-ot folytonosan buborékoltattuk 95% O2-5% CO2 elegyével. A szeleteket 1,5 óra inkubálás után a mérı kamrába helyeztük, ahol folytonosan áramoltattuk az ACSF-ot 1,5 ml/perc sebességgel. Stimulálásra szigetelt (Formvar) 25 µm vastag Ni-chrome huzalból készített monopoláris elektródát használtunk. A stimuláló elektródát a hippokampusz CA3b stratum lucidum területére helyeztük, kb. 100 µm-re a hilus nyílásától. Ez az elektród elhelyezés lehetıvé tette, hogy a moharostokat antidromikusan stimulálhattuk, anélkül hogy a hilus interneuronjait direkt módon aktiváltuk volna. Az extracelluláris elvezetéshez üveg elektródát használtunk, amit egy elektróda húzóval (Sutter, P93) készítettünk boroszilikát üvegbıl és 1M NaCl-dal töltöttünk fel (2-6 MΩ ellenállás). Az extracelluláris elektródát a szemcsesejt rétegbe helyeztük, és megkerestük azt a pozíciót, ahol az antidromikus stimulálással kiváltott populációs spike amplitúdója maximális volt.
Ezután a stimuláló
elektróda pozícióját optimalizáltuk. A legutolsó lépés az elektródák mélységének optimalizálása volt a lehetı legnagyobb amplitúdójú populációs spike elérése érdekében. A stimulálást 100 µs széles monopoláris pulzusokkal végeztük, a stimuláló áramot (kb. 490 µA) úgy választottuk meg, hogy közel maximális választ hozzon létre. A szeletet 30 s-ként stimuláltuk, hogy elkerüljünk minden szinaptikus plaszticitást a kísérlet során. Más kísérletekben a stimuláló elektródát a perforáns pályához helyeztük, ott ahol a perforáns pálya belép a hippokampuszba az entorhinális kéreg felıl. A stimuláló és az elvezetı 34
elektróda pozícióját az elızıekben leírtak szerint optimalizáltuk. Azokban a kísérletekben, amelyekben csak a glutamaterg szinaptikus komponensre voltunk kíváncsiak, 30 µM bicuculline-t (GABAA antagonista) adtunk az extracelluláris folyadékhoz. A visszamaradt szinaptikus komponens glutamaterg voltát NBQX (AMPA antagonista) és D-AP5 (NMDA antagonista) adásával bizonyítottuk.
4.4 Patch clamp mérések elektromos stimulálással Tradicionális whole-cell patch clamp méréseket végeztünk a gyrus dentatus szemcsesejt rétegében közel ahhoz az extracelluláris elektródához, amelynek az optimalizálását az elızı fejezetben leírtuk. A patch elektródát boroszilikát üvegbıl készítettük egy Sutter (Novato, CA) P93-as elektródahúzó segítségével. Az elektródát intracelluláris oldattal töltöttük fel, aminek az összetétele a következı volt (mM-ban): 120 cesium gluconate, 10 HEPES, 2 MgATP, és 10 QX-314 (N-ethyl lidocaine) chloride, pH 7,2, az ozmolaritás 276–277 mOsm. Az elektróda ellenállása 5–8 MΩ volt. A szemcsesejteket ‘vakon’ kerestük meg, vagyis a sejtek megfigyelése nélkül az elektródát addig süllyesztettük a szemcsesejt rétegbe, amíg az elektróda elektromos ellenállásának megnövekedésén észre nem vettük, hogy közel járunk egy sejthez. Ekkor gyenge negatív nyomással ‘giga-seal’-t hoztunk létre. Csak azokon a sejteken folytattuk a mérést, amelyeknek a membrán áttörésénél a membránpotenciálja alacsonyabb volt -60 mV-nál. A mért membránpotenciál értékekbıl 10 mV elektród (tip) potenciált levontunk. A patch clamp méréseket egy Axopatch 200A (Axon Instruments, Foster City, CA) erısítıvel végeztük 15-20 perccel a membrán áttörése után. A membrán ellenállást current clamp módban mértük, 50 pA, 200 ms hosszú hiperpolarizáló áram injekció segítségével. A soros ellenállás 8 és 20 MΩ között változott, és az erısítı segítségével 75%-ban kompenzáltuk. A jeleket 2 kHz-en szőrtük, 10 kHz-en mintavételeztük és pClamp 6 (Axon) programmal mértük és értékeltük ki. Az antidromikus stimulációval
kiváltott
excitátoros
posztszinaptikus
áramokat
(EPSC)
-80
mV
membránpotenciál mellett mértük voltage clamp módban 30-100 µM bicuculline vagy 50 µM picrotoxine mellett és úgy definiáltuk, hogy az az áram, amit 50 µM D-2-amino-5phosphonopentanoate (D-AP5) és 20 µM 6,7-dinitroquinoxaline-2,3-dione (DNQX) vagy 5 µM
2,3-dihydroxy-6-
nitro-7-sulfamyl-benzo(F)quinoxaline
(NBQX)
blokkol.
Az
antidromikus stimulációval kiváltott gátló posztszinaptikus potenciálokat (IPSC) 0 mV membránpotenciál mellett mértük voltage clamp módban és úgy definiáltuk, hogy az az áram, amit 30-100 µM bicuculline vagy 50 µM picrotoxine blokkol. GABAB receptorok 35
aktiválódását a cesium-alapú intracelluláris oldat megakadályozta. Az EPSC AMPA és NMDA receptorok által mediált komponenseit egyrészt feszültségfüggésük, másrészt farmakológiájuk alapján különítettük el. Az AMPA receptor mediálta áramot -80 mV-on, bicuculline és D-AP5 jelenlétében mértük és úgy definiáltuk, hogy az az a komponens amit DNQX blokkol. Az NMDA receptor mediálta áramot -22 mV-on, bicuculline jelenlétében mértük és úgy definiáltuk, hogy az a komponens amit D-AP5 blokkol.
4.5 Fotostimuláció Fotostimulációra egy 80 mW Coherent Enterprise 653 argon ion UV lézert (Coherent Laser Group, Santa Clara, CA) használtunk. A lézert egy Nikon Optiphot-2 mikroszkóphoz kapcsoltuk az epifluoreszcens porton keresztül egy üvegszálas kábel segítségével. A mikroszkóp fel volt még szerelve egy Noran Odyssey konfokális mikroszkóp rendszerrel (Noran Indtruments, Middleton, WI). A lézer fényét egy 40x Olympus víz-immerziós objektívvel fókuszáltuk. A lézer stimulációs pulzust a patch clamp mérıprogramból (Pclamp6) vezéreltük. Fotostimulációhoz 200 µM γ-(CNB-caged) L-glutamátot (Molecular Probes, Eugene, OR) adtunk az extracelluláris oldathoz (caged glutamát nélkül csak a fényimpulzus nem volt képes akciós potenciálokat kiváltani a szemcsesejtekben). Elıször az elızı fejezetekben leírtakhoz hasonlóan patch clamp mérést végeztünk egy szemcsesejten. Ezután a szemcsesejttıl 75 µm-re kezdve fotostimulációt végeztünk a szemcsesejt rétegben. A fotostimuláció 4 ms széles, 50mW teljesítményő lézer pulzusokból állt, amit 10 s-ként alkalmaztunk. Ha 5 pulzus nem váltott ki EPSC-t a mért szemcsesejten, a stimuláció helyét 25 µm-rel a sejttıl távolabbra mozgattuk és megismételtük a stimulációt. Ha a fotostimuláció EPSC-t váltott ki akkor a stimuláció pozícióját optimalizáltuk valamint a lézer teljesítményét csökkentettük, amíg meg nem találtuk azt a minimális lézer teljesítményt, ami még megbízhatóan EPSC-ket váltott ki. Ezután a stimulálás frekvenciáját 1/15 Hz-re csökkentettük. Egyes kísérletekben a patch clamp mérést alternálva -80 és -20 mV-on végeztük. Más kísérletekben megpróbáltunk mohasejt – szemcsesejt kapcsolatokat találni, ilyenkor a stimuláló fényimpulzus helyét nem a szemcsesejt rétegen futtattuk végig, hanem a hiluson, ahol a mohasejtek várhatóan elhelyezkedtek. Kontroll kísérletekben megállapítottuk, hogy a fotostimulációhoz használt γ-(CNB-caged) L-glutamát fényimpulzus nélkül semmilyen hatással sincs az AMPA és NMDA receptorokra (nem antagonista). Ezekben a kísérletekben szemcsesejteken perforáns pálya stimulációval EPSC-t váltottunk ki, farmakológiai módszerekkel 36
elkülönítettük az AMPA és az NMDA komponenst, majd az extracelluláris oldatba cagedglutamátot adva meggyızıdtünk róla, hogy az AMPA és NMDA komponens amplitúdója nem változott. Más
kísérletekben
farmakológiai
módszerrel
(50
µM
D-AP5
adásával)
elkülönítettük az EPSC NMDA és AMPA receptorok mediálta komponenseit. Az NMDA komponenst -20 mV membránpotenciál mellett mértük. 4.5.1
A fotostimuláció helyének valamint a szemcsesejt – moharost – szemcsesejt kapcsolat megjelenítése
Néhány kísérletben DiI-hidrofób fluoreszcens festéket használtunk a stimuláció helyének megjelölésére. A DiI-t forró csukamáj olajban oldottuk fel és egy pipettából injektáltuk a fotostimuláció helyére. A DiI-jelölt terület átmérıje kb. 50 µm volt. Ezzel párhuzamosan a mért szemcsesejtet is feltöltöttük egy fluoreszcens festékkel (Lucifer Yellow). Fixálás után 50 µm szeleteket készítettünk és a konfokális mikroszkóppal képeket készítettünk 488 excitáció és egy 510 nm-es felüláteresztı szőrı mellett.
4.6 Külsıleg adott cink direkt hatásának a mérése GABAA és NMDA receptorokon Egy üveg mikroelektródát (nyílásátmérı: 5-10 µm) használtunk a GABAA agonista (muscimol, 400 µM) közvetlenül egy mért szemcsesejt dendritjéhez juttatásához. Ehhez egy Picospritzert (General Valve, Fairfield, NJ) használtunk 6-10 psi nyomáson. A muscimolt 300-500 ms hosszan adtuk 2 perc idıközönként. A cinket normál valamint olyan extracelluláris oldatban adtuk, amelybıl eltávolítottuk a kétértékő anionokat (PO4/SO4mentes ACSF). NMDA-receptor mediálta áramokat a perforáns pálya elektromos ingerlésével váltottunk ki és -20 mV membránpotenciálon, 5 µM NBQX és 30 µM bicuculline jelenlétében mértük. A stimuláláshoz 100 µm széles négyszög impulzusokat használtunk. A stimuláció erısségét úgy állítottuk be, hogy 150-200 pA NMDA receptor mediálta áramot eredményezzen.
4.7 Cink hatásának mérése a spontán mini gátló posztszinaptikus áramokra (mIPSC) Ezeket a méréseket módosított intracelluláris oldattal végeztük, amelyben a Cs-gluconátot CsCl-ra cseréltük
és kihagytuk a QX314-t. Ezzel a Cl eqilibrium potenciál 0 mV-ra 37
változott, vagyis a GABAA receptor mediálta áramok -70 mV membránpotenciálnál befelé irányultak. Az extracelluláris oldat 5 µM NBQX-t, 50 µM D-AP5-t valamint 1 µM tetrodotoxint tartalmazott. A spontán mIPSC-ket pClamp6 programmal mértük és analizáltuk. A detektálási limit 6 pA volt. A méréseket
PO4/SO4-mentes ACSF-ben
végeztük.
4.8 Moharostokból felszabaduló cink hatásának mérése a GABAA receptor mediálta áramokra Ezekben a kísérletekben a moharostokat antidromikus stimulálással aktiváltuk hasonlóan az elızıekben leírtakkal. Csak olyan szemcsesejteken végeztük a mérést, ahol antidromikus moharost stimuláció nagy amplitúdójú EPSC-t váltott ki. Ezután az EPSC-t blokkoltuk NBQX és D-AP5-tel (Ezek a posztszinaptikus receptorokat blokkolják, glutamát és cink ettıl még ürül preszinaptikus aktivitás esetén). A méréseket PO4/SO4 mentes ACSF-ben végeztük. A szemcsesejteket Alexa 488 fluoreszcens festékkel töltöttük fel a patch elektródán keresztül és a sejteket a konfokális mikroszkóppal jelenítettük meg. A GABAA mediálta áramokat egy olyan GABA analóggal váltottuk ki, amelyet UV fénnyel aktiváltunk.
A γ-aminobutyrate, α-carboxy-2-nitrobenzyl ester-t (cGABA) 200 µM
koncentrációban adtuk az extracelluláris oldathoz. Az elızıekben leírthoz hasonlóan a lézert a mikroszkóp objektívjával fókuszáltuk a mért sejt szómájára, majd attól 50, 75 és 100 µm távolságra a fluoreszcens apikális dendrit mentén (Elızetes adatok azt mutatták, hogy a moharost – szemcsesejt kapcsolatok itt helyezkednek el). A lézer pulzus paramétereit úgy állítottuk be, hogy 150 – 200 pA GABAA áramot váltsunk ki. A GABAA mediálta áramokat az elızıekben leírt módon 0 mV membránpotenciálnál mértük. A cinket a moharostok nagyfrekvenciájú (10 vagy 100 Hz, 1 s -ig) antidromikus stimulálásával bocsátottuk ki. Közben 10 s-ként mértük a GABAA áramot. A nagyfrekvenciás stimulációt minden második GABAA-aktiválásra idızítettük, mégpedig úgy, hogy az utolsó impulzusok közvetlenül a GABAA áram aktiválása utánra essenek. Más kísérletekben a moharostokat 10 Hz-en stimuláltuk 5 percig, és közben 10 s-ként mértük a GABAA áramokat. A moharost stimulációval és anélkül felvett görbéket átlagoltuk és a cink hatását mint százalékos változást fejeztük ki. Néhány kísérletben további lépéseket tettünk, hogy megnöveljük a stimulációval kibocsátott cink mennyiségét, pld. eltávolítottuk a magnéziumot is az extracelluláris oldatból, felemeltük a kálium koncentrációját 6 mM-ra valamint a hımérsékletet 33°C-ra. 38
4.9 cGABA hatásának mérése a monoszinaptikus IPSC-re Monoszinaptikus IPSC indukálásához egy bipoláris stimuláló elektródát (25 µm nichromevezeték, szigetelt, 0,3 mm csúcs szeparáció) helyeztünk a gyrus dentatus szemcsesejt rétegébe, 200–500 µm távolságra a mért szemcsesejttıl. A stimuláláshoz 100 µs hosszúságú négyszög impulzust használtunk és a stimulus áramot (200 – 300 µA) úgy választottuk meg, hogy a mért szemcsesejtben közel maximális IPSC-t váltsunk ki. A stimulálást 30 s-ként végeztük. A patch clamp méréseket 0 mV membránpotenciálnál végeztük 5 µM NBQX és 50 µM D-AP5 jelenlétében. Egyes mérésekben a membránpotenciált 10 mV lépésenként változtattuk.
4.10 CaEDTA (cink kelátor) hatása a moharost és a perforáns pálya ingerléssel kiváltott EPSC NMDA receptor mediálta komponensére Az EPSC-ket az elızıekben leírt módon (bicuculline jelenlétében) antidromikus moharost és perforáns pálya ingerléssel váltottuk ki. Az EPSC NMDA receptor mediálta komponensét NBQX-szel szeparáltuk és D-AP5-tel gátoltuk. Ezekben a kísérletekben 1 mM CaEDTA, egy magas affinitású és specifikus cink kelátor hatását teszteltük a moharost (amely nagy koncentrációban tartalmaz cinket) valamint a perforáns pálya (amely nem tartalmaz
cinket)
stimuláció
által
kiváltott
NMDA
áramokra
gyrus
dentatus
szemcsesejteken epileptikus állatokban. Egyes kísérletekben a membránpotenciált -30 és + 40 mV között alternálva változtattuk.
39
5 EREDMÉNYEK 5.1 Sejtpusztulás, moharost sarjadzás és spontán epileptikus rohamok a pilokarpinnal kiváltott státusz epileptikusz után Kísérleteinkhez egy már korábban optimalizált temporális lebeny epilepszia modellt használtunk (Okazaki és mtsai., 1995). A mi kísérleteinkben 330 mg/kg i.p. adott pilokarpin státusz epileptikuszt váltott ki az állatok kb. 2/3-ban. A státusz epileptikusz 4 órája alatt ezeknek az állatoknak kb. az 1/3-a elpusztult. Így egy tipikus kísérletben 10 injektált állatból 3 nem mutatta az epilepszia jeleit, ezeket kontrollnak tekintettük, mivel semmilyen további mérés alapján nem tudtuk megkülönböztetni ıket a nem kezelt, vagy fiziológiás sóoldattal kezelt állatoktól. A pilokarpinnal kezelt kontroll állatokban nem fejlıdtek ki spontán epilepsziás rohamok, nem találtunk sejtpusztulást a hippokampuszban és nem figyeltünk meg moharost sarjadzást a gyrus dentatusban. Az a kb. 4-5 állat, amelyik túlélte a státusz epileptikusz 4 óráját visszakerült a ketrecébe és kb. 2-3 nap alatt teljesen felépült, vagyis ugyanúgy viselkedett mint a kontroll állatok. A státusz epileptikusz után kb. 3 héttel figyelhettük meg az elsı spontán komplex parciális roham megjelenését, ami jellegzetesen fejrázással, majd az elsı láb klónusos görcsével indult.
Konzekvensen,
minden státusz epileptikuszon átesett állatnál jelentkeztek ezek a spontán rohamok, de a rohamok frekvenciája nagy variációt mutatott (heti egytıl napi 3-4 roham között). A spontán rohamok frekvenciája kb. az 5. hét végére stabilizálódott és stabil maradt a kísérletsorozat végéig, vagyis a pilokarpin injekciót követı 10. hét végéig. Ebben a kísérletsorozatban nem próbáltuk meg kvantifikálni a spontán epileptikus rohamok különbözı paramétereit, csak megállapítottuk mindegyik státusz epileptikuszon átesett állatnál a spontán rohamok meglétét (és a kontroll állatoknál a rohamok hiányát). A szövettani és az elektrofiziológiai méréseket két idıpontban végeztük: a pilokarpin adása után 4-6 nappal, amikorra az állatok már felépültek a státusz epileptikusz akut hatásaiból, de még spontán epileptikus rohamok (sem moharost sarjadzás) nem alakult ki, valamint 10 héttel a státusz epileptikusz után, amikorra a spontán rohamok frekvenciája elérte a maximumot és stabilizálódott.
40
5.1.1
A moharost sarjadzás kimutatása Timm-féle festéssel
A Timm-féle festési eljárás a moharostokban nagy koncentrációban található cink kimutatására szolgál. Pilokarpin injektálás után 4-6 nappal, valamint 10 héttel 30 µm vastag, a hippokampusz tengelyére merıleges szeleteket készítettünk a kaudális hippokampuszból és megfestettük a Timm-féle eljárással. A 17. ábra illusztrálja a moharostok elhelyezkedését egy kontroll és egy epileptikus állatban 10 héttel pilokarpin injektálása után.
17. ábra. Moharost sarjadzás a hippokampusz gyrus dentatus (DG) területén. A hisztológiai metszetek, valamint a Timm-féle festés 10 héttel a pilokarpin kezelés után történt olyan állatból, amely státusz epileptikuszon esett át (D-F) valamint olyan állatból, amely nem mutatta státusz epileptikusz kifejlıdésének jeleit (A-C, kontroll) A: A kontroll állaton végzett Timm-festés nem mutat jelentıs moharostra jellemzı festıdést a gyrus dentatus belsı molekuláris rétegében. Kismértékő festıdés, néhány jelölt axon megfigyelhetı nagyobb nagyítás esetén ebben a rétegben, a festıdés erısebb az infrapiramidális (C) ágán a gyrus dentatusnak mint a suprapiramidális ágán (B). D: Ezzel szemben a státusz epileptikuszon átesett állatban a Timm-festés erıs moharost növekedést jelez a gyrus dentatus molekuláris rétegének belsı harmadában. Ezen az állaton nem lehetett különbséget megfigyelni a Timm-festés intenzitásában a infrapiramidális (F) és suprapyramidális (E) ág között. Skála: 0,5 mm (A és D) és 0,1 mm (B, C, E, és F). Az epileptikus állatban erıs festıdés figyelhetı meg a gyrus dentatus belsı molekuláris rétegében. A kontroll állatban a moharostok csak elvétve, sporadikusan, csak 41
nagyobb nagyítás esetén figyelhetık meg a belsı molekuláris rétegben. Minden epileptikus állatnál kivétel nélkül megfigyelhetı volt az erıs moharostokra jellemzı festıdés a gyrus dentatus belsı molekuláris rétegében 10 héttel a kezelés után, míg kontroll állatban függetlenül attól, hogy kezeltük pilokarpinnal vagy sem, sohasem találtunk a szinte észrevehetetlen szporadikus jeleknél erısebb festıdést. Státusz epileptikusz után 4-6 nappal a moharost sarjadzás még kimutathatatlan volt, az ekkor készített szeletek Timm festés alapján megkülönböztethetetlenek voltak a kontrolltól. 5.1.2
Státusz epileptikusz által kiváltott sejtpusztulás a hilusban
Státusz epileptikusz után szinte közvetlenül (SE után 1-3 nappal) kiterjedt sejtpusztulás volt megfigyelhetı több agyterületen a hippokampuszt is beleértve (18.. ábra).
C * *
18. ábra. Neurodegeneráció a hippokampuszban ezüstimpregnációs technikával festve 1 nappal státusz epileptikusz után. A: degenerálódó neuronális sejttestek figyelhetıek meg a CA1 és CA3 piramissejt rétegében, a hilusban (h) és a gyrus dentatus szemcsesejt rétegében (g). B: A hilus kiterjedt neuronális degenerációja mellett az axonvégzıdések erıs degenerációja figyelhetı meg a gyrus dentatus belsı molekuláris rétegében (nyíl). Ez az eredmény azt sugallja, hogy a hilusban degenerálódó sejtek nagy része mohasejt. C: Státusz epileptikusz után a hilus sejtjeinek kb. 50%-a elpusztult. A sejtpusztulás szinte azonnal bekövetkezett SE után, késıbbi spontán rohamok nem okoztak további mérhetı sejtpusztulást. *: szignifikáns eltérés, p<0.05, kétmintás Students’s t teszt.
42
A hippokampuszon belül elszórt neuronális degeneráció volt látható a CA1 és CA3 piramissejt rétegében valamint a gyrus dentatus szemcsesejt rétegében. A legerısebb degeneráció a gyrus dentatus hilusban volt, ott a sejtek kb. fele elpusztult (ezt sejtszámlálás is megerısítette SE után 10 héttel). Ezzel párhuzamosan erıs axonális degeneráció volt megfigyelhetı a gyrus dentatus belsı molekuláris rétegében, ahol normális esetben a hilusban található mohasejtek axonjai végzıdnek, míg egyáltalán nem volt axonális degeneráció a külsı molekuláris rétegben, ahol a perforáns pálya axonjai végzıdnek. Ezek az adatok azt sugallják, hogy a neuronális degeneráció szelektív a gyrus dentatusban, nagyrészt a hilus mohasejtjei pusztulnak el. Kontroll állatokban nem lehetett neuron degenerációt kimutatni.
5.2 A moharost sarjadzás során létrejövı moharost – szemcsesejt szinaptikus kapcsolatok funkcionális jellemzése A moharost sarjadzás jelenségét temporális lebeny epilepsziában már nagyon régen leírták, mivel a Timm-féle festés segítségével kiválóan lehetett látni a moharostok megjelenését a gyrus dentatus belsı molekuláris rétegében (17. ábra). Szövettani módszerek és elektonmikroszkópia kombinálásával azt is bizonyítani lehetett, hogy moharost – szemcsesejt szinaptikus kapcsolatok valószínőleg képzıdnek státusz epileptikusz után (Okazaki és mtsai., 1995).
Annak a bizonyítása azonban, hogy ezek a szinapszisok
fiziológiásak, vagyis a szinaptikus transzmisszió aktuálisan létrejön két szemcsesejt között, valamint ennek a jellemzése, sok nehézségbe ütközött: 1) Még erıs moharost burjánzás esetén is a szemcsesejt – szemcsesejt kapcsolatok valószínősége nagyon alacsony, vagyis pld. tradícionális intracelluláris elektrofiziológiai módszerekkel szinte reménytelen két szinaptikusan összekapcsolt szemcsesejtet találni. 2) A moharostok a hiluson keresztül térnek vissza a molekuláris rétegbe, a hilus pedig sokfajta sejttípust (pld. mohasejteket, amelyek szintén szemcsesejteket idegezhetnek be) tartalmaz, a moharostok szelektív aktiválása nehéz. Ezeknek a problémáknak a megoldására mi háromféle (egymást kiegészítı / megerısítı) módszert dolgoztunk ki: 1) Antidromikus moharost stimulálással kiváltott extracelluláris field-potenciálok vizsgálata a szemcsesejt rétegben 2) Antidromikus moharost stimulálással kiváltott szinaptikus áramok vizsgálata patch clamp módszerrel 3) Preszinaptikus szemcsesejt stimulálása glutamát neurotranszmitter fényimpulzussal történı 43
felszabadításával, és ezzel párhuzamosan a szinaptikus áramok mérése a posztszinaptikus szemcsesejtben patch clamp módszerrel. 5.2.1
Moharost – szemcsesejt szinaptikus jelátvitel vizsgálata extracelluláris elektrofiziológiai módszerekkel
Ezekben a kísérletekben a moharostokat stimuláltuk antidromikusan, ezzel egy populációs spike-ot váltottunk ki a szemcsesejtekben, valamint az axonok felıl visszafelé terjedı akciós potenciál elérte a moharostok axon terminálisait is és szinaptikus úton egy extracelluláris field potenciált hozott létre azon a területen, ahol a moharostok végzıdtek. Mivel a mérést a szemcsesejtek rétegében végeztük, így az antidromikus populációs spikeot minden esetben megfigyeltük (19. ábra), míg a szinaptikus komponenst csak akkor, amikor a moharostok monoszinaptikusan vagy poliszinaptikusan stimulálták magukat a szemcsesejteket. Mivel a moharostok glutamatergek, ezeket a kísérleteket a GABAerg szinaptikus jelátvitel gátlása mellett végeztük (30 µM bicuculline jelenlétében). Moharostok antidromikus stimulálásával kiváltott glutamát mediálta field potenciált a státusz epileptikuszon átesett állatok kevesebb, mint felében találtunk, pedig a kísérleteket akkor végeztük, amikor a moharost sarjadzás maximális volt (10 héttel SE után). A field potenciál glutamaterg komponense általában egy rövid látenciájú negatív hullámból és egy kis amplitúdójú késleltetett burst aktivitásból állt (19. ábra). Mind a két komponenst NBQX-el blokkolni lehetett. Meglepı módon mind a kezelt, mind a kezeletlen kontroll állatokból származó szeletek egy kis százalékában megfigyelhetı volt a glutamaterg szinaptikus komponens (csak az elsı rövid latenciájú negatív hullám), amely NBQX-el blokkolható volt.
44
19. ábra. A moharostok antidromikus stimulációjával kiváltott extracelluláris térpotenciálok (field potentials) a gyrus dentatus szemcsesejt rétegében. A: Státusz epileptikusz után 10 héttel a moharostok antidromikus stimulációja bicuculline jelenlétében egy rövid latenciájú negatív hullámot, majd egy kis amplitúdójú késleltetett burst aktivitást hozott létre. NBQX adása csökkentette a negatív hullám amplitúdóját és megszüntette a burst aktivitást. Ez azt jelenti, hogy ezeket a komponenseket glutamát mediálta szinaptikus transzmisszió hozta létre. B: Kontroll állatban nem találtunk szinaptikus aktivitásra utaló jeleket. *: antidromikus populációs spike.
45
5.2.2
Moharost – szemcsesejt szinaptikus stimulálással és patch clamp módszerrel
jelátvitel
vizsgálata
elektromos
Ezekben a kísérletekben az elızıekhez hasonlóan a moharostokat stimuláltuk antidromikusan, ezzel a moharost terminálisokat aktiváltuk. Intracelluláris patch clamp elvezetésekkel a gyrus dentatus szemcsesejtjein azt néztük, hogy vajon a preszinaptikus moharost aktiváció kivált-e posztszinaptikus áramokat a szemcsesejtekben, és ha igen, akkor azokat az áramokat milyen receptorok közvetítik. A posztszinaptikus receptorokat farmakológiai (antagonisták) és fiziológiai (feszültségfüggés) tulajdonságaik alapján különböztettük meg egymástól. Elızetes elvárásunk szerint antidromikus moharost stimulálás monoszinaptikusan (excitátoros glutamát transmitterrel) aktiválhatja a gyrus dentatus szemcsesejtjeit, ekkor a szemcsesejteken excitátoros posztszinaptikus áramokat (EPSC) mérhetünk. Feltételezésünk szerint ez a komponens a moharost sarjadzás miatt jelentısen megnı. Emellett a moharostok gátló interneuronokon keresztül poliszinaptikusan gátolhatják a szemcsesejteket (GABAerg feed-back gátlás) ekkor gátló posztszinaptikus áramokat (IPSC) figyelhetünk meg. 5.2.2.1 Státusz epileptikusz hatása a feed-back GABAerg gátlásra Amint azt a 20. ábra szemlélteti, minden esetben sikerült antidromikus moharost stimulálással egy GABAA receptor mediálta posztszinaptikus komponenst kiváltanunk függetlenül attól, hogy epileptikus vagy kontroll állatról volt szó. A posztszinaptikus áram GABA-erg komponensét úgy definiáltuk, hogy az áramnak az a része, amit picrotoxinnal vagy bicuculline-nal blokkolni tudtunk. Külön kísérletekben 0 mV membránpotenciálnál vizsgáltuk az antidromikus moharost stimulációval kiváltható IPSC-ket, mivel ennél a membránpotenciálnál a glutamát mediálta komponens minimális, a GABA-erg komponens pedig megfelelıen nagy (A reversal potenciál AMPA, NMDA esetén ~0, GABAA esetén ~50 mV). A kísérlet eredményét a 4. táblázat összegzi. Megfigyelhetı, hogy 4-6 nappal státusz epileptikusz után a GABAerg feed-back gátlás szignifikánsan csökkent, ami lehet a mohasejtek vagy a gátló interneuronok pusztulásának következménye.
46
20. ábra. Moharostok antidromikus stimulálásával kiváltott posztszinaptikus áramok a gyrus dentatus szemcsesejtjeiben epileptikus (A, D) és kontroll (B, C, E) állatokban. A: A posztszinaptikus áramot picrotoxin adása csökkentette. A különbség a posztszinaptikus áram GABAA receptor mediálta komponense (IPSC); míg a picrotoxin jelenlétében felvett görbe megfelel az excitátoros posztszinaptikus áramnak (EPSC). D: Az EPSC-t DNQX és DAP5 adása szinte teljesen megszüntette. A különbség az AMPA és NMDA receptorok mediált áram. B, E: Kontroll, itt picrotoxin helyett bicuculline-t használtunk a GABAA receptorok gátlására. C: Ebben a kontroll állatban bicuculline teljesen legátolta a posztszinaptikus áramokat, itt nem volt excitátoros komponens. F: Kumulatív hisztogram ábrázolja az EPSC amplitúdókat. A függıleges tengelyen azon sejtek %-t ábrázoltuk, amelyekben az X tengely értékénél nagyobb EPSC-t mértünk. Ahol a görbe metszi az Y tengelyt az megadja, hogy abban a csoportban a szeletek hány százalékában mértünk EPSC-t. Ahol a görbe metszi az X tengelyt az megadja a maximális EPSC-t abban a csoportban. Megfigyelhetı, hogy az epileptikus csoportban sokkal gyakrabban és nagyobb amplitúdójú EPSC-ket mértünk.
47
Leolvasható a táblázatból egy teljesen váratlan eredmény: A kontroll csoportokban az állatok korának elırehaladtával a GABAerg feed-back gátlás szignifikánsan csökken, míg az epileptikus állatoknál nem változik, ennek eredményeképpen a 10. hétre az epileptikus állatoknál a feedback gátlás a hasonló korú kontrollhoz képest erısebbé válik. Hogy ebben milyen mechanizmusok játszanak szerepet, ebben milyen szerepe van a moharost sarjadzásnak, további kutatás tárgya.
Státusz Epileptikusz Kezelt Kontroll Kezeletlen Kontroll
Eltelt idı SE után 10+ hét 4–6 nap 198 ± 29* (19) 213 ± 82 (13) 394 ± 38 (17) 138 ± 22† (14) 361 ± 62 (10) 113 ± 20† (15)
4. táblázat. Antidromikus moharost stimulálással kiváltott Gátló (GABAA receptor mediálta) Posztszinaptikus Áramok (IPSC) a gyrus dentatus szemcsesejtjeiben. A számok az IPSC-k maximális amplitúdóját jelentik pA-ben 0 mV membránpotenciálnál mérve. A zárójelbe tett számok a vizsgált szeletek számát jelentik. Kétutas ANOVA alapján a SE utáni túlélési idınek (p<0.001) valamint a kezelésnek (p<0.002) is szignifikáns hatása volt az IPSC-k maximális amplitúdójára.
5.2.2.2 Antidromikus moharost stimulálással kiváltott EPSC szemcsesejtekben Az antidromikus moharost stimulálással kiváltható EPSC-ket -80 mV membránpotenciálnál a GABAerg receptorok gátlása mellett (bicuculline vagy pictotoxin az extracelluláris folyadékban) mértük (20. ábra). Az eredményeket az 5. táblázat foglalja össze. Meglepı eredmény, hogy elızetes várakozásainkkal ellentétben (bár az extracelluláris elvezetéssel végzett mérések valamint a hisztológia már elırevetítették) nem csak az epileptikus, hanem a kontroll állatok viszonylag magas százalékában is megfigyelhettünk EPSC-ket. Tehát a kontroll és az epileptikus állatok között az EPSC alapján nem igazán minıségi, hanem mennyiségi különbségek voltak. EPSC-t leggyakrabban a státusz epileptikuszon átesett állatok esetén 10 hét elteltével figyelhettünk meg, a vizsgált szeletek ~74%-ban. A kezelt kontroll esetén ~38%, míg a kezeletlen kontroll esetén ~26% volt ez az arány. Az EPSC maximális amplitúdója is szignifikánsan nagyobb volt a státusz epileptikuszon átesett állatok esetén. Ebben a csoportban extrém nagy értékek is elıfordultak, amelyet kontroll állatoknál nem figyeltünk meg. Az epileptikus állatoknál, ritkán, késleltetett EPSC-ket is megfigyeltünk (több 100 ms késés), amelyek poliszinaptikus módon aktiválódtak és amplitúdóban elérhették a 700 pA is. Az EPSC amplitúdója valamint a Timm-festés alapján
48
megbecsült moharost sarjadzás mértéke között nem volt nyilvánvaló korreláció. Más elektrofiziológiai paraméterekben (membránpotenciál, membrán ellenállás) nem találtunk a csoportok között szignifikáns eltérést. Szintén nem találtunk eltérést a csoportok között semmilyen paraméterben sem 4-6 nappal a pilokarpin adása után.
Szemcsesejtek EPSC-vel/Összes sejt
Áram
Vm
RN
(pA)
( mV)
(MΩ)
Antidromic PS (mV)
4–6 napos túlélési idı Státusz epileptikusz Kezelt kontroll Kezeletlen kontroll
1/19* (5) 8/20 (40) 4/11 (36)
12.7 34.5 ± 7.0 21.2 ± 7.6
-76 ± 1 -78 ± 1 -82 ± 1
990 ± 70‡ 640 ± 70 480 ± 90
5.4 ± 0.4 5.4 ± 0.4 6.7 ± 0.6
25/34† (74) 17/45 (38) 6/23 (26)
95.8 ± 30.7 30.9 ± 3.5 22.7 ± 2.5
-77 ± 1 -78 ± 1 -78 ± 1
440 ± 50 540 ± 60 670 ± 70
4.1 ± 0.4 4.3 ± 0.4 3.9 ± 0.4
10 hét túlélési idı Státusz epileptikusz Kezelt kontroll Kezeletlen kontroll
5. táblázat. Antidromikus moharost stimulálással kiváltott excitatórikus posztszinaptikus áramok (EPSC) a gyrus dentatus szemcsesejtjeiben.
5.2.2.3 Az EPSC NMDA és AMPA receptorok által mediált komponenseinek jellemzése Az antidromikus moharost stimulálással kiváltható EPSC NMDA receptor mediálta komponensét farmakológiai módszerrel, NBQX, majd késıbb D-AP5 adásával határoztuk meg és azonosítottuk (21. ábra). NBQX (AMPA antagonista) hatására a -80 mV-on mérhetı
EPSC
amplitúdója
drasztikusan
csökkent.
Ezzel
szemben
-30
mV
membránpotenciálnál (ahol az NMDA receptor mediálta áram amplitúdója a legnagyobb, az AMPA receptor mediálta komponens pedig már kicsiny) egy jelentıs áram-komponens visszamaradt, amely D-AP5-tel blokkolható volt. Ezt tekintettük az EPSC NMDA receptor által mediált komponensének.
49
21. ábra. Antidromikus moharost stimulálással kiváltott EPSC NMDA receptor mediálta komponense. Az NMDA komponenst -30 mV membránpotenciálnál mértük bicuculline és NBQX jelenlétében és úgy határoztuk meg, hogy az a komponens, amit D-AP5-tel blokkolni lehetett. A státusz epileptikusz és a kontroll csoportokat 10 hét túlélési idı mellett összehasonlítva a státusz epileptikusz csoportban nagyobb NMDA áramokat találtunk (6. táblázat). Az NMDA receptor mediálta áram az AMPA komponenshez viszonyítva is nagyobbnak adódott (utolsó oszlop). Nem találtunk különbséget az NMDA komponens feszültségfüggésében a csoportok között.
Státusz Epileptikusz
Kezelt Kontroll
Ár am (pA) AMPA-KA 2 8.5 3 3.6
NMDA 35.7 35.3
Töltés Transzfer ( pC) AMPA-KA NMDA 4,716 6,702 4,101 6,687
Töltés Transzfer (Arány) NMDA/AMPA-KA 1.4 1.6
1 91 .1
201.8
22,616
39,242
1.7
2 1.1
10.4
883
1,987
2.2
2 0.3
4.4
6,153
646
0.1
3 0.1
39.2
2,623
5,826
2.2
3 1.2 2 0.9
7.1 19.7
1,167 1,251
636 3,285
0.5 2.6
4 1.7
4.8
2,597
566
0.2
3 9.0
9.3
1,883
872
0.5
6. táblázat. Antidromikus moharost stimulálással kiváltott EPSC-k AMPA és NMDA receptor mediálta komponense 10 héttel pilokarpin kezelés után, -80 és -30 mVmembránpotenciálnál mérve. Az utolsó oszlop arányszámaiból látható, hogy SE után az NMDA komponens az AMPA komponenshez viszonyítva megnıtt.
50
5.2.2.4 Perforáns pálya stimulálással szemcsesejtekben kiváltható posztszinaptikus áramok Az elızı fejezetekben leírtakhoz hasonló módon megmértük a perforáns pálya stimulálással szemcsesejtekben kiváltható posztszinaptikus áramokat.
22. ábra. Perforáns pálya stimulálással szemcsesejtekben kiváltott áramok pilokarpin injektálás után 4-6 nappal, valamint 10 héttel. A státusz epileptikusz és a kontroll csoportok között nem találtunk semmi különbséget, de az állatok kora szignifikánsan befolyásolta a GABAerg komponens nagyságát (2-utas ANOVA, p<0.02).
A perforáns pálya izgató monoszinaptikus kapcsolatokat képez a szemcsesejtekkel, vagyis minden szemcsesejtben várható EPSC kiváltása. Emellett a perforáns pálya direkt módon, valamint indirekt módon a szemcsesejteken keresztül a hilus gátló interneuronjait stimulálja, vagyis az IPSC komponens jelenléte is nagyon valószínő. A mérési eredményeket röviden összefoglalva: semmilyen különbséget sem találtunk a perforáns pálya stimulálásával kiváltott GABAerg, AMPA receptor mediálta vagy NMDA receptor mediálta áramokban a státusz epileptikusz és a kontroll csoportok között (22. ábra).
51
Az állatok kora, ahogyan azt a moharostok antidromikus stimulálása esetén is megfigyeltük, szignifikánsan befolyásolta a GABAA receptor által mediált komponens nagyságát, az állatok korának elırehaladtával ez a komponens csökkent. 5.2.3
Moharost – szemcsesejt szinaptikus jelátvitel vizsgálata fotostimulációval és patch clamp módszerrel
Az elızı fejezetekben leírt méréseknek az a hibája, hogy az extracelluláris stimuláció miatt, még az elektróda pozíciójának a leggondosabb megválasztása mellett sem lehetünk biztosak abban, hogy csak és kizárólag szemcsesejteket stimulálunk. A hilusban ott találhatók a mohasejtek, bár az epileptikus állatokban számuk jelentısen csökken, valamint gátló interneuronok is. Az extracelluláris elektromos stimulációval járó problémákat elkerülhetnénk, ha egy új módszerrel képesek lennénk szelektíven egyes szemcsesejteket stimulálni miközben mérnénk a posztszinaptikus áramokat egy másik szemcsesejtben. Intracelluláris stimulációval ezt meg lehetne tenni, azonban a szemcsesejt-szemcsesejt kapcsolatok ritkasága miatt egy ilyen mérés nagyon sokáig tartana. Ennek a problémának az áthidalására vezettük be a fotostimuláció módszerét. Ezekben a kísérletekben egy olyan glutamát analógot használtunk az extracelluláris oldatban, amelynek az aktiválásához egy UV fényimpulzus szükséges. Egy UV lézer fényét egy mikroszkóp objektívvel a gyrus dentatus szemcsesejt rétegére fókuszáltuk, így egy kis térfogatban szabadítottunk fel glutamátot, és a felszabadított glutamát csak kisszámú környezı szemcsesejtben váltott ki akciós potenciálokat. Eközben egy másik szemcsesejten a szinaptikus áramokat mértük az elızıleg leírt módon patch clamp módszerrel. Az objetív fókuszát periodikus fényimpulzusok mellett végigsétáltattuk a szemcsesejt rétegen, amíg egy olyan helyet nem találtunk, ahol stimulálva szinaptikus áramokat váltottunk ki a mért szemcsesejtbıl. A mérés végeztével a stimuláció helyét megjelöltük egy olyan fluoreszcens festékkel, amely a teljes sejtmembránt megfestette, valamint a mért sejtet is feltöltöttük fluoreszcens festékkel így megfigyelhettük a stimuláló és elvezetı hely között futó axonokat. Néhány kísérletben meggyızıdtünk arról, hogy módszerünkkel a hilust stimulálva nem tudunk posztszinaptikus áramokat kiváltani szemcsesejtekben.
52
5.2.3.1 Fotostimuláció jellemzése A fotostimuláció során csak kisszámú szemcsesejtet akartunk stimulálni, ezért az UV lézer fényét egy kismérető területre fókuszáltuk a mikroszkóp fókuszsíkjában. UV-fénnyel aktiválható fluoreszcens festék segítségével megmértük ennek a területnek az átmérıjét, ez ~ 5,3 µm-nek adódott tipikus lézer energia és 2 ms-os pulzus mellett (23. ábra).
23. ábra. A fotostimuláláshoz használt UV lézersugár mérete az objektív fókuszsíkjában. A: mikroszkóp tárgylemezét 4,5-dimethoxy-2nitrobenzyl (DMNB)-inaktivált fluorescein dextran-nal vontuk be. A fókuszált UV fény felszabadította a fluoreszkáló fluorescein-t. A kísérlethez 2 ms hosszú, 20 mW teljesítményő pulzust használtunk. B: A fotostimulációs terület méretét úgy számoltuk, hogy a fluoreszkáló terület intezitás eloszlását mértük és a görbe félértékszélességét számítottuk. Az intenzitáseloszlás normál eloszlásúnak bizonyult, félérték szélessége 5,3 µm Skála: 10 µm
A következı kísérletben (24. ábra) megállapítottuk, hogy a fotostimulálásnál használt paraméterekkel a fókuszsíkban kb. 12 µm távolságból tudunk akciós potenciált kiváltani szemcsesejtekbıl. Ismerve a stimulációs fénykúp 3 dimenziós alakját kiszámoltuk azt a térfogatot, amelyben lévı szemcsesejteket stimuláltuk az adott stimulussal. Ismerve a szemcsesejtek sőrőségét megbecsülhettük, hogy tipikus körülmények között kb. 25-38 szemcsesejtet stimulálhattunk egy fényimpulzussal. 5.2.3.2 Fotostimulációval kiváltott moharost - szemcsesejt EPSC-k jellemzése A szemcsesejt réteg fotostimulációval történı ingerlése a legnagyobb gyakorisággal a státusz epileptikuszon átesett állatok esetében váltott ki EPSC-t a szemcsesejtekben (7. táblázat).
53
24. ábra. A fotostimuláció hatékonyságának vizsgálata. A: A lézer fotostimulációs pulzusokat különbözı távolságra fókuszáltuk a fluoreszcens festékkel feltöltött szemcsesejttıl. A szómán 4 ms hosszú, 15 mW energiájú pulzus elég volt az akciós potenciál kiváltásához, kis távolságra odébb már 16 ms, 56 mW pulzusra volt szükség, távolabbi pontot stimulálva már nem lehetett akciós potenciált kiváltani. B: Ugyanebben a kísérletben a fotostimuláció tipikus paramétereit használva (4 ms, 50mW) megnéztük, mi az a maximális távolság, ahonnan még stimulálni lehet a szemcsesejtet. Az elektrofiziológiai görbén az elsı depolarizációt áram injekcióval váltottuk ki (kontroll), a második depolarizáció mutatja a fotostimuláció hatását. A görbék számozása megfelel az A-ábrán jelölt stimulációs pozícióknak. A szómán a fotostimuláció egy sorozat akcióspotenciált, a kicsit távolabb lévı 2-es pozícióban egy akciós potenciált váltott ki, a kicsit távolabb lévı 3-as pontban nem váltott ki akciós potenciált. Hasonló értékeket kaptunk 5 kísérletben.
Szemcsesejt EPSC-vel/Total
Áram ( pA)
Felfutási idı ( ms)
τ (ms)
Félérték Szélesség (ms)
Hiba Százalék (%)
Minden EPSC Státusz Epileptikusz Kezelt Kontroll
230.9 ± 12.5 225.9 ± 9.9
1.2 ± 0.6 1.3 ± 0.5
10.9 ± 5.7 10.8 ± 2.8
8.6 ± 4.9 8.0 ± 2.4
69 ± 13 71 ± 12
Kezeletlen Kontroll
233.7 ± 12.8
0.9 ± 0.3
7.5 ± 2.4
7.0 ± 1.4
73 ± 16
232.7 ± 13.2 225.6 ± 11.4 233.7 ± 12.8
1.3 ± 0.5 1.2 ± 0.4 0.9 ± 0.3
11.3 ± 5.7 10.4 ± 3.1 7.5 ± 2.4
9.1 ± 4.8 7.3 ± 2.5 7.0 ± 1.4
69 ± 13 67 ± 11 73 ± 16
Csak Elsı EPSC Státusz Epileptikusz Kezelt Kontroll Kezeletlen Kontroll
48/79* (61) 11/71 (16) 6/47 (13)
7. táblázat. Fotostimulálással kiváltott moharost – szemcsesejt EPSC-k jellemzése. Az EPSC-ket -80 mV membránpotenciálnál mértük. Az EPSC-k lefutási idıkonstansát egy exponenciális illesztésével kaptuk. Minden EPSC: azzal a feltételezéssel éltünk, hogy többszörös EPSC-k több preszinaptikus sejt aktiválásával jöttek létre. Csak Elsı EPSC: a többszörös EPSC-ket ugyanannak a preszinaptikus sejtnek az ismétlıdı aktiválásával magyaráztuk. Átlag ± SD; *: Kontrollhoz képest szignifikánsan magasabb elıfordulási gyakoriság (p<0.001, χ2-test) 54
Általában kb. 7 stimulációs helyet kellet kipróbálnunk, mielıtt találtunk egy szinaptikus kapcsolatot, vagyis kb. 176 – 266 sejtet kellett tesztelnünk. Amint azt a 25. ábra mutatja, különbözı
típusú
EPSC-ket
figyelhettünk
meg.
Optimális
esetben
-80
mV
membránpotenciálnál mérve hirtelen (kb. 10 – 20 ms késéssel) jelentkezı egyedi, kb. 30 – 100 pA amplitúdójú egy exponenciális idıkonstanssal hanyatló befelé irányuló áramokat láthattunk. Nem mindegyik stimulus indukált EPSC-t, a hiba százalék kb. 60-70% volt. Más sejtek esetén a fotostimuláció komplex EPSC-ket váltott ki, amelyek vagy több egymásra, egymás után szuperponált egyszerő EPSC-bıl állt (ilyenkor nem tudtuk eldönteni, hogy egy sejtet stimulálunk-e amely több akciós potenciált tüzel, vagy több preszinaptikus sejtet, amelyek egymástól függetlenül tüzelnek) vagy pedig egymástól elkülöníthetetlen komplex, polisszinaptikusnak tőnı áramokból.
25. ábra Fotostimulációval kiváltott moharost – szemcsesejt EPSC-k. Reprezentatív mérések. A fotostimuláció frekvenciája 1/15 Hz volt. Az EPSC-ket alternálva -80 és -20 mV membránpotenciálon mértük, az ábrán csak a -80 mV-os méréseket ábrázoltuk. *: Az EPSC nagyítva látható az alsó sorban. A: Egyszeresnek tőnı EPSC . Skála: fenn: 100 pA, 20 ms, alul: 10 pA, 10 ms. B: Többszörös EPSC-k. Skála: fenn: 100 pA, 20 ms, alul: 10 pA, 10 ms. C: Összetett EPSC-k. Skála: fenn: 200 pA, 40 ms, alul: 20 pA, 40 ms. Hogy kizárjuk azt a lehetıséget, hogy a fotostimuláció direkt módon hatott a mért sejtre és nem szinaptikus jelátvitelen keresztül, fokozatosan csökkentettük a stimuláció erısségét. Azt tapasztaltuk, hogy az EPSC-k nem fokozatosan, hanem hirtelen, “minden 55
vagy semmi” módon tőntek el. Vagyis valószínőleg akciós potenciálok generálták ıket. Nem
találtunk
szignifikáns
különbséget
az
EPSC-k
tulajdonságaiban
(csak
a
gyakoriságban) a státusz epileptikuszon átesett és a kontroll állatok között. A szemcsesejt – szemcsesejt szinaptikus kapcsolatok további jellemzése során megállapítottuk, hogy hasonlóan a perforáns pálya – szemcsesejt és moharost CA3piramissejt kapcsolatokhoz itt is részt vesznek az NMDA receptorok a szinaptikus transzmisszióban (26. ábra). Az EPSC NMDA-mediálta komponensét úgy definiáltuk, hogy az a komponens, amit D-AP5 gátol és -20 mV membránpotenciálon mértük.
. 26. ábra. A moharost – szemcsesejt szinaptikus jelátvitel NMDA receptor mediálta komponense. Az EPSC-t alternálva -80 és -20 mV membránpotenciál mellett mértük. Az EPSC-ket szinkronizáltuk a maximális amplitúdójukra, és átlagoltuk ıket. A: Átlagolt EPSC-k -80 mV membránpotenciálnál. B: Átlagolt EPSC-k -20 mV membránpotenciálnál. C: Átlagolt EPSC-k -20 mV membránpotenciálnál 50 µM D-AP5 jelenlétében. D: Az EPSC NMDA receptor mediálta komponensét a B – és C görbék különbsége adja.
Néhány kísérletben a stimuláció helyét egy hidrofób fluoreszcens festékkel (DiI) jelöltük. Ez a festék a sejtek membránját festi, és egy idı után még a fixált sejtben is végigdiffundál az axon és a dendritek membránján és a teljes sejtet megfesti. Másik elınye, hogy vízben nem oldódik, vagyis csak azokat a sejteket festi, amelyek közvetlen kapcsolatba kerülnek vele. Az injektált festék mennyiségét úgy választottuk meg, hogy kb. a stimulált területet jelölje. A mért sejtet Lucifer Yellow-val töltöttük fel. 56
A moharost – szemcsesejt kapcsolatokat egy konfokális mikroszkóppal 3D rekonstrukció után vizsgáltuk (27. ábra). Megfigyelhetıek az óriás (~2 µm) varikozitások az axonon, ami jellemzı a moharostokra. A jelölt, feltehetıen szemcsesejt axonok párhuzamosan haladtak a szemcsesejt réteggel és látszólag szinapszist képeztek a jelölt szemcsesejttel.
27. ábra. A moharost – szemcsesejt kapcsolatok megjelenítése. A mért szemcsesejtet Lucifer Yellow festékkel töltöttük fel a patch-elektródán keresztül, míg a stimuláció helyét DiI-al jelöltük. A jelölt sejteket egy konfokális mikroszkóppal vizsgáltuk 488 nm excitáció és 510 nm feletti emisszió mellett. A kapott képekbıl 3D rekonstrukciót készítettünk. A nyíl a feltételezett moharost-szemcsesejt szinapszist jelöli. Skála: 10 µm.
5.3 A moharostok által tartalmazott és szinaptikusan kibocsátott cink hatása a szemcsesejtek excitabilitására A moharostok nagyon nagy koncentrációban tartalmaznak cinket, ezt a tulajdonságukat a moharost sarjadzás vizsgálatakor a Timm-féle festéssel ki is használtuk. A cink az axon terminálisokban a glutamát neurotranszmitterrel együtt szinaptikus vezikulákban található és calcium és aktivitás függıen ürül a terminálisokból. A cinknek összetett hatása van a szemcsesejtekre, mivel mind a gátló GABAA receptort, mind a serkentı NMDA receptort gátolja. Temporális lebeny epilepsziában leírták, hogy a GABAA receptorok alegység 57
szerkezete státusz epileptikusz után megváltozik oly módon, hogy érzékenyebbé válik a cink gátló hatására. Felmerült, hogy a moharost sarjadzás úgy is hozzájárulhat a szemcsesejtek ingerelhetıségének növekedéséhez, hogy a moharostokból kiáramló cink eljut a GABA-erg szinapszisokhoz és ez a GABA-erg gátlás összeomlásához vezethet. A következı méréseket csak epileptikus állatokon végeztük.
28. ábra. Külsıleg adott 200 µM cink gátolta mind a GABAA, mind az NMDA receptorokat a szemcsesejteken epileptikus állatokban, de csak akkor, ha a többértékő anionokat (PO4/SO4) eltávolítottuk az extracelluláris folyadékból. A: a GABAA receptor mediálta áramokat muscimol (egy GABAA receptor agonista) közvetlenül a szemcsesejtek dendritjéhez való adásával váltottuk ki. A mérést 0 mV membránpotenciálnál végeztük. Megfigyelhetı a muscimol-kiváltotta áram cink általi reverzibilis gátlása. B: A perforáns pálya ingerlésével kiváltott EPSC NMDA receptor mediálta komponensét 5 µM NBQX és 30 µM bicuculline adásával szeparáltuk el. A mérést -20 mV membránpotenciálnál végeztük. Megfigyelhetı az NMDA áram reverzibilis gátlása. C: Cink csak akkor csökkentette szignifikánsan a muscimol kiváltotta áramokat ha a mérést PO4/SO4-mentes ACSF-ben végeztük. D: Cink jobban csökkentette az NMDA receptor mediálta áramokat ha a mérést PO4/SO4-mentes ACSF-ben végeztük. Az adatokat átlag ± SD –alakban adtuk meg. P <0.001, Student’s t-teszt.
58
5.3.1
Külsıleg adott cink hatása a GABAA és NMDA receptorokra
Az elsı méréssorozatban meg akartunk gyızıdni arról, hogy cink valóban gátolja mind a GABAA, mind az NMDA receptorokat a mi kísérleti rendszerünkben. GABAA áramokat muscimol (egy GABAA agonista) adásával, míg NMDA áramokat a perforáns pálya GABAA és AMPA receptorok blokkolása melletti stimulálásával váltottunk ki. Meglepı módon az elsı kísérletekben nem tapasztaltunk GABAA gátlást. Ekkor a kísérleteket megismételtük PO4/SO4-mentes ACSF-ben (28. ábra) és azt találtuk, hogy ilyen körülmények között cink mind a GABAA mind az NMDA receptor mediálta áramokat gátolta. Az NMDA receptorokon a cink hatása erısebb volt, mint a GABAA receptorokon. 29. ábra. Külsıleg adott 200 µM cink csökkentette mind a frekvenciáját, mind az amplitúdóját az mIPSC-knek, de csak akkor, ha a többértékő anionokat (PO4/SO4) eltávolítottuk az extracelluláris folyadékból. Az ACSF 5 µM NBQX-et, 50 µM D-AP-öt és 1 µM tetrodotoxint tartalmazott. A, C, E: a befelé irányuló mIPSC-ket -70 mV membránpotenciálnál mértük. B, D, F: Amplitúdó hisztogrammok, amelyek mutatják a cink jelenlétében mért kisebb amplitúdót és frekvenciát. G, H, I: kumulatív hisztogrammok, amelyek mutatják, hogy cink szignifikánsan kisebb értékek felé tolta a kumulatív amplitúdó hisztogrammot (p<0.0001: Kolmogorov-Smirnov test), de nem befolyásolta az mIPSC-k idıbeli lefutását.
5.3.2
Külsıleg adott cink hatása GABAA receptor-mediálta szinaptikus áramokra a gyrus dentatusban
Ebben a kísérletben azt mértük, hogy vajon cink képes-e gátolni a természetes módon szinaptikus úton kibocsátott GABA posztszinaptikus hatását a gyrus dentatus szemcsesejtjeiben epileptikus állatokban. Ennek érdekében spontán mini gátló szinaptikus
59
áramokat (mIPSC) mértünk tetrodotoxin (Na csatorna gátló) valamint glutamát antagonisták jelenlétében. Külsıleg adott 200 µM cink szignifikánsan gátolta az mIPSC-k amplitúdóját és frekvenciáját (de idıbeli lefutását nem), de csak akkor, ha a mérést PO4/SO4-mentes ACSF-ben végeztük (29. ábra és 8. táblázat).
Kontroll Kontroll ACSF Frekvencia (Hz) Amplitúdó (pA) 10-90% Felfutási Idı (ms) Lefutási idıállandó (ms) Töltés mozgás (pC) PO4/SO4-mentes ACSF Frekvencia (Hz) Amplitúdó (pA) 10-90% Felfutási Idı (ms) Lefutási idıállandó (ms) Töltés mozgás (pC)
+ZnCl2
Különbség (%)
1.4 ± 0.5 18.5 ± 7.9 3.3 ± 1.1 14.2 ± 2.0 251 ± 98
1.1 ± 0.5 16.9 ± 4.2 3.4 ± 0.6 14.1 ± 2.7 231 ± 75
-9 ± 22 -4 ± 18 7 ± 20 -1 ± 10 -5 ± 20
1.6 ± 0.6 27.5 ± 11.6 3.1 ± 0.6 12.6 ± 1.6 355 ± 151
1.1 ± 0.6* 18.7 ± 7.8* 3.4 ± 0.8 11.4 ± 1.9 224 ± 106*
-36 ± 20 -31 ± 10 7 ± 14 10 ± 10 -37 ± 12
8. táblázat. Külsıleg adott 200 µM ZnCl2 hatása az mIPSC –kre gyrus dentatus szemcsesejteken epileptikus állatokban normál és PO4 /SO4-mentes ACSF-ben mérve. *: szignifikáns különbség, P<0.005 (Student’s t-teszt).
5.3.3
A moharostokból szinaptikus úton ürülı cink hatása a gyrus dentatus szemcsesejtek GABAA receptoraira
A moharost sarjadzás eredményeként sőrő moharost hálózat jön létre a gyrus dentatus belsı molekuláris rétegében. Antidromikus moharost stimuláció hatására a moharostokból a cink szinaptikusan ürül, és ha eljut a szemcsesejteken található GABAerg szinapszisokhoz, akkor ez a GABAerg feed-back és feed-forward gátlás összeomlásához vezethet. Ezekben a kísérletekben a cink feltételezett szinaptikus kibocsátását (párhuzamos kísérletekben bizonyítottuk, hogy a cink valóban ürül a moharost terminálisokból a mi kísérleti körülményeink között és gátolja az NMDA receptorokat) a moharostok nagyfrekvenciás (10 és 100 Hz) antidromikus stimulálásával értük el, miközben a GABAA receptorokat egy GABA prekurzor fényimpulzussal történı felszabadításával teszteltük. Mivel a mért szemcsesejtet fluoreszcens festékkel feltöltöttük, ezért ez a módszer lehetıvé tette, hogy a GABAA receptorokat nagyon pontosan lokalizálva ott stimuláljuk, ahol a feltételezett moharostok terminálisai találhatók, vagyis 100 µm-nél közelebb a mért szemcsesejt
60
szómájához a jelölt dendrit mentén. A GABA prekurzor, amit használtunk γ-aminobutyrate, α-carboxy-2-nitrobenzyl ester-t (cGABA) volt. A mérések során megfigyeltük, hogy bár a GABA fényimpulzussal történı felszabadítása és a GABAA receptorok aktiválása tökéletesen mőködött, amikor 200 µM cGABA-t adtunk az extracelluláris oldathoz, a korábban spontán módon jelentkezı GABA mediálta IPSC-k eltőntek (9. táblázat). Tehát a cGABA nem volt teljesen inaktív, valamilyen módon befolyásolta a GABAerg transzmissziót. A kísérleteket nem folyattuk addig, amíg meg nem gyızıdtünk arról, hogy a cGABA ezen tulajdonsága nem befolyásolja a méréseink eredményét.
Kontroll
+cGABA
Különbség (%)
Frekvencia (Hz)
1.4 ± 0.5
0.4 ± 0.2*
-71 ± 12
Amplitúdó (pA)
17.8 ± 9.1
9.6 ± 4.2*
-44 ± 9
10-90% Felfutási Idı (ms)
3.6 ± 0.8
4.6 ± 1.0
+28 ± 30
Lefutási idıállandó (ms)
11.0 ± 2.2
8.1 ± 2.2*
-26 ± 12
Töltés mozgás (pC)
221 ± 137
104 ± 59*
-52 ± 5
9. táblázat. 40 µM cGABA hatása a mini spontán gátló posztszinaptikus áramokra (mIPSC) gyrus dentatus szemcsesejteken. mIPSC-ket 0 mV membránpotenciálnál mértük, glutamát antagonisták jelenlétében. *: P<0.005 (Student’s t-teszt). Az értékeket átlag ± SD formában adtuk meg.
5.3.3.1 cGABA hatása a serkentı és gátló szinaptikus transzmisszióra Antidromikus moharost valamint a gyrus dentatus direkt stimulálásával IPSC-ket, valamint a perforáns pálya stimulálásával EPSC-ket váltottunk ki a gyrus dentatus szemcsesejtjeiben. Az extracelluláris oldatban adott 160-200 µM cGABA szinte teljesen blokkolta az IPSC-ket és szinte alig módosította az EPSC-ket (30. ábra). Annak az eldöntésére, hogy cGABA milyen mechanizmussal (preszinaptikus vagy posztszinaptikus) gátolja a GABAerg szinaptikus transzmissziót megvizsgáltuk cGABA hatását a muscimollal kiváltott GABAA receptor mediálta áramokra.
61
30. ábra. cGABA hatása a gátló és serkentı posztszinaptikus áramokra gyrus dentatus szemcsesejteken. A: Az IPSC-t antidromikus moharost stimulálással váltottuk ki. A mérés közben a membránpotenciál 0 mV volt. 200 µM cGABA szinte teljesen blokkolta az IPSC-t. B: Az IPSC-t a szemcsesejtréteg direkt stimulálásával váltottuk ki, és farmakológiai módszerekkel izoláltuk, így az monoszinaptikus kapcsolatnak felelt meg. A mérés közben a membránpotenciál 0 mV volt. 160 µM cGABA erısen gátolta az IPSC-t. Ez a hatás reverzibilis volt. C: 200 µM cGABA nem befolyásolta szignifikánsan a perforáns pálya stimulálásával kiváltott EPSC-ket. A membránpotenciál -80 mV volt.
Ebben a kísérleti elrendezésben a muscimol csak posztszinaptikus receptorokon hat, vagyis cGABA esetleges preszinaptikus hatása nem játszik szerepet. Amint azt a 31. ábra mutatja, 200 µM cGABA csak kismértékben gátolta a GABAA receptor mediálta áramokat. Bicuculline adásával meggyızıdtünk arról, hogy a mért áramokat valóban GABAA receptorok mediálták.
62
31.
ábra.
200
µM
cGABA
csak
kismértékben csökkentette a 400 µM muscimollal kiváltott GABAA receptor mediálta
áramokat.
membránpotenciálja
A
szemcsesejt
0
mV
volt,
a
muscimolt 2 percenként 300 ms-ig alkalmaztuk. A cGABA kimosása után 5 és 10 µM bicuculline-t adtunk. A bicuculline
hatása
is
reverzibilisnek
bizonyult. A: reprezentatív mérés. B: oszlopdiagram
összegzi
a
eredményét.
Bicuculline
mérés sokkal
hatékonyabbnak bizonyult mint cGABA a GABAA receptorok gátlásában. Az értékeket átlag ± SD-ként adtuk meg.
Az elızı eredmények azt sugallták, hogy cGABA esetleg preszinaptikus mechanizmussal, a GABA kibocsátás gátlásán keresztül hat, ezért megvizsgáltuk cGABA hatását a preszinaptikus GABAB receptorokon (32. ábra). Egy GABAB receptor antagonista referencia vegyülettel összehasonlítva megállapíthattuk, hogy nem ugyanazon a receptoron hatnak,
mivel
nem
hatásmechanizmusának
befolyásolták az
is
egymás
ellentmond,
hatását. hogy
A
amikor
cGABA
preszinaptikus
megmértük
hatásának
feszültségfüggését a monoszinaptikus (szemcsesejt réteg stimulálásával kiváltott) IPSC-k amplitúdóján, gyenge feszültségfüggést tapasztaltunk (33. ábra), vagyis cGABA-nak kell, hogy legyen posztszinaptikus hatása. Ezekbıl a mérésekbıl azt a következtetést vontuk le, hogy cGABA csak kismértékben befolyásolhatja az eredeti mérésünk eredményét, vagyis a cink hatásának a mérését a posztszinaptikus GABAA receptorokra. A cGABA által kiváltott gyenge posztszinaptikus gátlás eredményeképp a fényimpulzus hatására felszabadított GABA hatása csak kismértékben lesz gyengébb a posztszinaptikus receptorokon. cGABA egyáltalán nem befolyásolja a cink ürülését a preszinaptikus moharost terminálisokból.
63
32. ábra. 1 µM CGP 55845A, egy GABAB receptor antagonista szinte teljesen visszafordította 10 µM baclofen, egy GABAB agonista hatását a szemcsesejtréteg stimulálásával kiváltott monoszinaptikus IPSC-ken (B), de nem fordította vissza 40 µM cGABA hatását (A), vagyis cGABA nem GABAB receptorokon keresztül hat.
33. ábra. cGABA hatásának feszültségfüggése a monoszinaptikus IPSC-ken dentát szemcsesejteken mérve. cGABA hatása erısebb volt negatívabb membránpotenciáloknál. Az IPSC-k amplitúdóját a 0 mV-nál mérhetı amplitúdóra normalizáltuk. Az adatokat átlag ± SD formában adtuk meg. 64
5.3.3.2 A moharostokból nagyfrekvenciás stimulálással kibocsátott cink hatása a fotostimulációval felszabadított GABA kiváltotta áramokra a gyrus dentatus szemcsesejtjeiben
34. ábra. A moharostok nagyfrekvenciás antidromikus stimulációja nem gátolta a cGABA fotóaktivációjával kiváltott GABAA receptor mediálta áramokat gyrus dentatus szemcsesejteken, epileptikus állatokban. A kísérleteket PO4/SO4-mentes ACSF-ben, 0 mV membránpotenciálnál végeztük. A: a szemcsesejteket Alexa Fluor 488 festékkel töltöttük fel a patch pipettán keresztül. A fotostimulációs lézersugarat a sejt dendritjére fókuszáltuk 75 µm-re a sejttestıl (X). Minden páros kísérletben a moharostokat 10 Hz (B) vagy 100 Hz (C) frekvenciával antidromikusan stimuláltuk 1s hosszan. A fényimpulzust az elektromos stimuláció befejezıdése elıtt 0.1 s-ra idızítettük. A páratlan kísérletekben nem stimuláltunk. A stimulált és a kontroll görbéket átlagoltuk. Stimuláció nem változtatta meg a GABAA áramok amplitúdóját. D: A GABAA áramokat 10 s-ként váltottuk ki az UV fényimpulzussal, mialatt a moharostokat folytonosan 10 Hz-el stimuláltuk. A GABAA válaszok a stimuláció megkezdése után kb. 2 perccel kissé csökkentek, de ezt a hatást nem lehetett N,N,N9,N9-tetrakis(2-pyridyl-methyl)ethylenediamine (TPEN) –nel (egy cink kelátor) visszafordítani. Ezekben a kísérletekben csak státusz epileptikuszon átesett állatokat használtunk. A moharostokat antidromikusan stimuláltuk. Csak olyan szemcsesejten végeztünk mérést,
65
amelyen a moharost stimuláció nagy amplitúdójú EPSC-t váltott ki. A méréseket PO4/SO4mentes ACSF-ben végeztük. Elméletileg a cink a glutamát transzmitterrel együtt szinaptikusan ürül. Ezekben a kísérletekben a glutamát posztszinaptikus receptorait antagonistákkal legátoltuk. Hogy maximalizáljuk annak a valószínőségét, hogy cink valóban kibocsátódott a szinapszisokból, különbözı stimulációs protokollokat (10 Hz, 100 Hz, zéró magnézium, magas kálium, folytonos stimulálás, magasabb hımérséklet) próbáltunk ki (10. táblázat). Eközben a GABAA receptor mediálta áramokat caged GABA foto-aktiválásával váltottuk ki nagyon pontosan a fluoreszcens festékkel megjelölt szemcsesejt dendritjén, a szómától olyan távolságban, ami megfelel a moharostok terminális zónájának (34. ábra).
ACSF
Variációk
Kontroll
+ 200 µM Zn2+
Stimulációs frekvencia (Hz)
Fotostimuláció Elektromos sejttestıl mért stimuláció távolsága (µm) hatása (%)
10
0 50 100 100 0 50 100 100 0 75 0 75 0 75 0 75 0 75
100 10
100 10
PO4/SO4–nélkül
100 + 200 µM Zn2+
10 100
6 mM K+, 0 Mg2+, 33°C
10
+4.8 ± 8.3 +3.8 ± 5.5 +2.5 ± 5.0 -2.3 ± 16.6 +2.3 ± 6.2 +3.2 ± 5.6 -0.3 ± 5.1 -11.7 ± 21 -1.2 ± 2.2 -0.6 ± 2.6 -1.7 ± 8.2 -3.9 ± 12 -1.9 ± 6.8 +1.0 ± 9.0 -12.5 ± 12 -12.7 ± 11 +3.7 ± 2.7 -4.4 ± 8.0
10. táblázat. Moharostok nagyfrekvenciás antidromikus stimulációja nem változtatta meg szignifikánsan a fotostimulációval kiváltott GABAA mediálta áramok amplitúdóját Bár sok kísérleti protokollt kipróbáltunk (10. táblázat) nem találtuk olyan esetet, amikor a moharostok stimulációja megváltoztatta volna a GABAA áramokat a szemcsesejteken, még olyan körülmények között sem, amit arra terveztünk, hogy megnöveljük a szinaptikusan kibocsátott cink mennyiségét (35. ábra).
66
35. ábra. A moharostok nagyfrekvenciás antidromikus stimulációja nem gátolta a cGABA fotoaktivációjával kiváltott GABAA receptor mediálta áramokat gyrus dentatus szemcsesejteken, epileptikus állatokban még olyan kísérleti körülmények között sem, amikor Mg2+-t kihagytuk a PO4/SO4-mentes ACSF-bıl, a K+ koncentrációt 6 mM-ra növeltük, valamint a hımérsékletet 33°C-ra emeltük. A: Moharostok antidromikus stimulálása normál körülmények között egy populációs spike-ot váltott ki, míg a módosított ACSF-ben epileptikus spike-sorozatot. B: Moharostok stimulálása sokkal nagyobb EPSC-ket váltott ki a módosított ACSF-ben. A mérést -80 mV membránpotenciálon végeztük. C: 10 Hz moharost stimuláció nem befolyásolta a GABAA receptor mediálta áramokat a szemcsesejteken még a módosított ACSF-ben sem.
5.3.4
A moharostokból szinaptikus úton ürülı cink hatása a gyrus dentatus szemcsesejtek NMDA receptoraira
A moharostokból szinaptikus úton ürülı cink hatását az NMDA receptorokra egy magas affinitású és specifikus cink kelátor, CaEDTA segítségével végeztük, valamint kihasználtuk azt a tényt, hogy a moharostok tartalmaznak, míg a perforáns pálya rostjai nem tartalmaznak cinket. A moharostok antidromikus valamint a perforáns pálya stimulálásával kiváltott EPSC NMDA receptor mediálta komponensét bicuculline és NBQX jelenlétében mértük (36. ábra). Az NMDA áramot D-AP5 teljesen eltüntette. Az extracelluláris oldatba adott 1 mM CaEDTA növelte a moharost stimulációval, de nem változtatta meg a perforáns pálya stimulációval kiváltott NMDA áram amplitúdóját (36. ábra).
67
36. ábra. CaEDTA (1 mM) szelektíven megnövelte a moharost stimulációval, de nem befolyásolta a perforáns pálya stimulációval kiváltott EPSC-k NMDA receptor mediálta komponensét epileptikus állatokban. A mérést -20 mV membránpotenciálnál végeztük 30 µM bicuculline és 5 µM NBQX jelenlétében. 50 µM D-AP5 teljesen legátolta az NMDA áramokat. K: kontroll, M: mosás, *: stimulus mőtermék. Az adatokat mint átlag ± SD formában adtuk meg.
A cinknek az NMDA receptorokra kifejtett gátló hatásának van egy feszültségfüggı és egy feszültségfüggetlen komponense, ezért a moharostokból ürülı cink NMDA receptorokra kifejtett gátló hatását megmértük -30 és +40 mV membránpotenciál mellett. Amint azt 37. ábra mutatja, a cink NMDA receptor gátló hatása feszültségfüggınek bizonyult,
-30
mV
membránpotenciálnál
erıs
membránpotenciálnál nem volt gátlás.
68
volt
a
gátlás,
míg
+40
mV
37. ábra. CaEDTA (1 mM) hatásának feszültségfüggése. CaEDTA növelte az antidromikus moharost stimulálással kiváltott EPSC-k NMDA receptor mediálta komponensét amikor a membránpotenciált -30 mV-on tartottuk, de nem befolyásolta az NMDA komponenst amikor a membránpotenciál + 40 mV volt (A membránpotenciált váltakozva tartottuk -30 és + 40 mV-on). Az adatokat mint átlag ± SD formában adtuk meg.
69
6 EREDMÉNYEK MEGBESZÉLÉSE Ebben a kísérletsorozatban a temporális lebeny epilepszia kialakulása során jelentkezı moharost sarjadzás jelenségét vizsgáltuk hisztológiai, elektrofiziológiai, fotostimulációs és farmakológiai módszerekkel. A temporális lebeny epilepsziát a pilokarpin patkány modellen vizsgáltuk; ebben a modellben pilokarpin adásával felnıtt patkányokon státusz epileptikuszt (SE) váltottunk ki, a státusz epileptikusz olyan változásokat (karakterisztikus sejtpusztulás, moharost sarjadzás) indukált az agyban, amelyek egy csendes periódus után kivétel nélkül spontán komplex parciális epileptikus rohamok megjelenéséhez vezettek. Méréseinket két idıpontban végeztük: 4-6 nappal és 10 héttel pilokarpin kezelés után. 4-6 nappal státusz epileptikusz után a pilokarpin kezelés akut hatásai már elmúltak, a státusz epileptikusz kiváltotta sejtpusztulás már lezajlott, de a moharost sarjadzás még nem volt megfigyelhetı (mint ahogy spontán epileptikus rohamok sem). 10 héttel SE után a moharost sarjadzás már lezajlott,
a
spontán
epileptikus
rohamok
frekvenciája
stabilizálódott, vagyis kialakult az epilepszia a kísérleti állatokban. A két idıpontban kapott eredmények összehasonlításával bizonyos mértékig szétválaszthattuk a SE akut (sejtpusztulás) és krónikus (szinaptikus átrendezıdés) következményeit. A pilokarpin esetleges hatásait, amelyek befolyásolhatták volna a mérési eredményeinket, úgy ellenıriztük, hogy a méréseket két kontrollal szemben végeztük. Az egyik kontroll a kezeletlen csoport volt, míg a másikat azok az állatok alkották, amelyek ugyan kaptak pilokarpin kezelést, de nem alakult ki náluk SE. Összefoglalva: nem találtunk semmilyen különbséget a kétféle kontroll csoport között, vagyis a vizsgálatainkban leírt hatásokat a státusz epileptikusz és nem a pilokarpin kezelés okozta.
6.1 Szemcsesejt – szemcsesejt monoszinaptikus kapcsolatok egészséges és epileptikus állatokban 6.1.1
Szemcsesejt – szemcsesejt kapcsolatok normál állatokban
Megállapítottuk, hogy a caudális hippokampuszban normál, státusz epileptikuszon nem átesett és spontán epileptikus rohamokat nem mutató állatokban is létrejönnek funkcionális szemcsesejt – szemcsesejt monoszinaptikus kapcsolatok, csak alacsony gyakorisággal. Amikor jobban, nagyobb nagyítással megvizsgáltuk a Timm-festéssel készített szeleteket, elszórtan megfigyelhettünk jelölt moharostokat a gyrus dentatus belsı molekuláris rétegében kezeletlen állatokban is. Az extracelluláris elektrofiziológiai kísérletekben
70
antidromikus moharost stimulációval kiválthattunk a kontroll hippokampusz szeletek egy kis százalékában glutamát antagonistákkal blokkolható field potenciált. Patch clamp mérésekben antidromikus moharost stimuláció vagy a szemcsesejtek fotostimulációval való ingerlése kiváltott monoszinaptikusnak tőnı excitatórikus posztszinaptikus áramokat (EPSC) szemcsesejtekben a kontroll állatok egy részében is. Korábban
normál,
nem
epileptikus
állatban
szemcsesejt
–
szemcsesejt
monoszinaptikus kapcsolatokat nem figyeltek meg (Wuarin és Dudek, 1996). Egyik lehetıség, hogy technikai nehézségek miatt nem csak szemcsesejteket, de a dentát hilusban található mohasejteket is stimuláltuk. Az antidromikus moharost stimulálás során monoszinaptikusan CA3 piramissejteket is stimuláltunk (Scharfman, 1994a), amelyek rekurrens axon kollaterálisai aktiválhattak mohasejteket, amelyek végül is kiválthatták a szemcsesejteken mért EPSC-ket (Scharfman, 1995). Ennek ellentmond az a megfigyelés, hogy minden, antidromikus moharos stimulálással vagy fotostimulálással kiváltott EPSCnek mérhetı volt az NMDA-receptor mediálta komponense NBQX jelenlétében, vagyis nagy valószínüséggel monoszinaptikus EPSC-rıl volt szó. Ezt alátámasztja, hogy Scharfmann et al. (1994) megfigyelte, hogy az AMPA/kainát receptorok blokkolása (NBQX-szel) meggátolta a mohasejtek aktiválását a CA3-felıl. Ezen kívül a fotostimulációs mérésekben egyértelmüen megfigyelhettünk monoszinaptikusnak tőnı szemcsesejt – szemcsesejt kapcsolatokat a kontroll állatokban is. Ezek alapján az adatok alapján el kellett fogadnunk, hogy legalábbis a caudális hippokampuszban, kis valószínőséggel, de létrejönnek monoszinaptikus szemcsesejt-szemcsesejt kapcsolatok egészséges állatokban is. Annak az oka, hogy korábban más kutatók ezt nem figyelték meg valószínőleg abban keresendı, hogy a moharostok sőrősége / lefutása nem homogén a hippokampuszban. Timm-féle festés segítségével például moharostokat meg lehetett figyelni a gyrus dentatus molekuláris rétegében kontroll állatok esetében is, de csakis a caudális hippokampuszban, ettıl eltávolodva már nem. A legtöbb korábbi mérést nem a caudális hippokampuszban végezték. Mi azért választottuk ezt a területet, mivel megfigyeléseink szerint a moharost sarjadzás itt volt a legerısebb. További kísérleteket igényel annak az eldöntése, hogy a kaudális hippokampusz mennyiben és hogyan különbözik a hippokampusz többi részétıl.
71
6.1.2
Szemcsesejt – szemcsesejt kapcsolatok epileptikus állatokban
Az epilepszia indukciójának, vagyis a státusz epileptikusznak a hatása nem minıségi, hanem mennyiségi volt, 10 héttel státusz epileptikusz után mérve (de nem 4-6 nappal) az epileptikus állatokban drasztikusan megnövekedett a szemcsesejt – szemcsesejt szinapszisoknak a száma. A szemcsesejt – szemcsesejt szinapszisokat több, egymást kiegészítı módszerrel vizsgáltuk. A hippokampusz gyrus dentatus szemcsesejt rétegébıl történı extracelluláris elvezetésnek az a hátránya, hogy mérhetı jelet csak több sejt szinkronizált aktivitása biztosít, vagyis a mért jel nagysága nem lineárisan arányos a szemcsesejt – szemcsesejt kapcsolatok számával. Ezen kívül a monoszinaptikus és a poliszinaptikus komponens nem különíthetı el egymástól. Patch clamp módszerrel a mért szemcsesejten aktiválódó összes szinapszis által kiváltott áram mérhetı, de az antidromikus moharost stimulálás aktiválhat poliszinaptikus excitátoros transzmissziót. A szemcsesejtek fotostimulációja erre a problémára ad megoldást, ezekben a mérésekben nagy valószínőséggel monoszinaptikus szemcsesejt – szemcsesejt kapcsolatokat mértünk. Mindhárom mérési módszer egybehangzóan alátámasztotta, hogy a szemcsesejt – szemcsesejt
szinaptikus
kapcsolatok
száma
jelentısen
megnövekedett
státusz
epileptikuszon átesett állatok esetében. A fotostimulációs mérések adatait használva kiszámolhattuk, hogy SE kb. hatszorosára növeli a szemcsesejt – szemcsesejt kapcsolatok számát, valamint hogy a szinaptikus kapcsolat valószínősége két szemcsesejt között epileptikus állatokban kb. 0.5%. Ezek a számok még ellenırzésre szorulnak további kísérletekben. Ezek az eredmények alátámasztják azt az elméletet, hogy a moharost sarjadzás során nagy számban létrejövı funkcionális szemcsesejt – szemcsesejt kapcsolatok egy pozitív visszacsatolást hoznak létre amely hozzájárul a gyrus dentatus excitabilitásának megnövekedéséhez temporális lebeny epilepsziában. Az is alátámasztja a moharost sarjadzás jelentıségét az epilepszia kialakulásában, hogy kísérleteink szerint a perforáns pálya ingerlésével a szemcsesejtekben kiváltott válaszok nem különböztek epileptikus vs kontroll állatokban, vagyis státusz epileptikusz szelektíven befolyásolta a moharostok által mediált szinaptikus transzmissziót. A mi eredményeink összhangban vannak más kutatók korábbi eredményeivel is a moharost sarjadzás funkcionális következményeivel kapcsolatban. Jól ismert tény, hogy a gyrus dentatus szemcsesejtek excitabilitása növekszik epilepsziában in vivo (Buckmaster és Dudek, 1997a) mind in vitro (Tauck és Nadler, 1985;
72
Cronin és mtsai., 1992; Masukawa és mtsai., 1992; Franck és mtsai., 1995; Patrylo és Dudek, 1998) körülmények között. Korábbi in vivo field potenciál mérések epileptikus patkányokon megmutatták, hogy a moharostok megjelenésével a gyrus dentatus molekuláris rétegében létrejön egy ún. 'áramnyelı’ (current sink) ezen a területen, amely azt jelzi, hogy a moharostok funkcionális szinaptikus kapcsolatokat képeznek a szemcsesejtekkel (Golarai és Sutula, 1996a). Azt is megfigyelték, hogy egy κ-opioid antagonista, amely szelektíven gátolja a glutamát felszabadulást a moharostokból, csökkentette a populációs spike-ok amplitúdóját a gyrus dentatusban epileptikus állatokban (Simmons és mtsai., 1997). A mi fotostimulációs méréseinkhez hasonló elrendezésben glutamát lokális injekciója a szemcsesejt rétegbe megnövelte a spontán excitatórikus posztszinaptikus áramok frekvenciáját a szemcsesejteken (Wuarin és Dudek, 1996). Mindezek a mérések azonban, a korábban említett technikai nehézségek miatt, amiket nekünk is le kellett gyıznünk, csak közvetett és bizonytalan információt szolgáltattak a szemcsesejt-szemcsesejt szinaptikus kapcsolatokról. A mi fotostimulációs méréseink demonstrálták elıször egyértelmően a szemcsesejt – szemcsesejt monoszinaptikus kapcsolatok létezését és fiziológiai jellemzıit. A méréseink arra is rávilágítottak azonban, hogy funkcionális szemcsesejt – szemcsesejt szinaptikus kapcsolatok még az epileptikus állatokban is, amelyekben hisztológiai módszerekkel nagyon erıs moharost sarjadzás mutatható ki, viszonylag ritkák. Ha ehhez hozzávesszük, hogy normál aktivitás esetén a szinaptikus hiba százalék viszonylag magas ezekben a szinapszisokban, akkor nem tőnik valószínőnek, hogy a moharost sarjadzás és az újonnan képzıdött szemcsesejt – szemcsesejt szinaptikus kapcsolatok az elsıdleges / egyedüli okai az epileptikus rohamok kialakulásának temporális lebeny epilepsziában. Valószínőbb, hogy ez az újonnan kialakuló pozitív visszacsatolás csak hozzájárul a gyrus dentatus excitabilitásának növekedéséhez, és más folyamatok is szükségesek a rohamok kialakulásához. Meg kell jegyeznünk, azonban, hogy a szemcsesejt-szemcsesejt szinaptikus kapcsolatok frekvenciafüggését nem vizsgáltuk, vannak arra utaló bizonyítékok, hogy erısebb aktivitás esetén ennek a pályának a hatékonysága megnı (rövid idejő plaszticitás, az NMDA receptorok megnövekedett szerepe depolarizáció esetén, a GABAerg gátlás csökkenése, stb.) (Mott és mtsai., 1993; Salin és mtsai., 1996). A mi méréseinkben, hasonlóan másokhoz, sem volt egyértelmő korreláció a moharostokat a gyrus dentatus molekuláris rétegében kimutató Timm-festés intenzitása és 73
az antidromikus moharost stimulációval vagy fotostimulációval kiváltott EPSC-k amplitúdója / gyakorisága között. Erre nem tudtunk egyértelmü magyarázatot találni, de ez a tény is kiemeli a funkcionális vizsgálatok szükségességét. 6.1.3
Szemcsesejt – szemcsesejt monoszinaptikus EPSC-k tulajdonságai azonosak kontroll és epileptikus állatokban és hasonlóak a szemcsesejt – CA3 piramissejt kapcsolatokhoz
Az fotostimulációval kiváltott monoszinaptikus EPSC-k amplitúdója (~30 pA) kisebbnek bizonyult a szemcsesejt – CA3 piramissejt esetében korábban leírtaknál (~70 pA) (Jonas és mtsai., 1993) de nagyobbnak a hippokampusz más területein leírt EPSC-knél (Allen és Stevens, 1994; Kneisler és Dingledine, 1995). Ez a megfigyelés összhangban van korábbi hisztológiai adatokkal, ugyanis a moharostok axon terminálisai a gyrus dentatus molekuláris rétegében kisebbek, mint a CA3-ban, de mindenképpen nagyobbak mint egy átlagos axon terminális (Okazaki és mtsai., 1995). A mi kísérleteinkben Az EPSC-k idıbeli lefutása a szemcsesejteken lassabb volt, mint amit korábban mások a CA3 piramissejtek esetében megfigyeltek (Jonas és mtsai., 1993). Erre nem tudunk egyértelmü magyarázatot adni. Kísérleteinkben a DiI fluoreszcens festékkel jelölt szemcsesejt axonok a szemcsesejtek sejttestjeitıl a várt távolságban, a gyrus dentatus belsı molekuláris rétegében futottak, vagyis a szinapszisok sejttesttıl mért távolsága nem magyarázhatja az EPSC-k lassabb lefutását. Mivel nagy gondot fordítottunk az elektróda ellenállás (access resistance) minimalizálására a kísérletek során, ezért nem valószínő, hogy az ún. ‘space-clamp error’ okozta volna ezt az eltérést (Carnevale és mtsai., 1997). Egy lehetséges magyarázat, hogy mi a kísérleteinket öreg állatokon végeztük, és a szemcsesejtek elektrofiziológiai tulajdonságai korfüggıek lehetnek. A viszonylag magas szinaptikus hiba százalék (failure rate), amit kísérleteink során tapasztaltunk, összhangbam van mások megfigyeléseivel a moharost – CA3 szinaptikus kapcsolatokra (Jonas és mtsai., 1993), valamint a Schaffer kollaterális – CA1 piramissejt kapcsolatokra (Allen és Stevens, 1994) vonatkozóan. A szinaptikus hiba százalék a moharost - CA3 piramissejt szinapszisokban frekvenciafüggı, alacsony frekvenciás (mint a mi esetünkben) stimulálás esetén magasabb. A moharost – kosársejt szinapszisok esetén a mienkhez hasonló körülmények között a szinaptikus hiba százalék 33%-nak bizonyult (Kneisler és Dingledine, 1995).
74
6.1.4
Kísérleti elrendezés problémái – a mohasejtek lehetséges szerepe
Méréseink kiértékelését és értelmezését nehezítette annak a lehetısége, hogy a stimuláció során közvetlenül vagy közvetve nemcsak szemcsesejteket, de a hilusban található mohasejteket is aktiválunk. Ezek (mivel glutamatergek) a szemcsesejteken mért posztszinaptikus hatásuk alapján megkülönböztethetetlenek a szemcsesejtektıl (Scharfman, 1994b; Scharfman, 1995). Mohasejtek stimulálásának az esélyét epileptikus állatokban csökkenti, hogy státusz epileptikusz után éppen ezek a sejtek pusztulnak el nagy számban (Sloviter, 1987; Scharfman és Schwartzkroin, 1990), mint ahogyan ezt mi is megfigyelhettük az ezüst impregnációs kísérleteinkben. A méréseink tervezése során nagy figyelmet fordítottunk ennek a lehetıségnek a kizárására. A fotostimulációs méréseknél például csak egy nagyon kis számú szemcsesejtet stimuláltunk a szemcsesejt rétegben, ahol mohasejtek nem találhatók. A mérést így végezve a poliszinaptikus aktiválás esélye a kisszámú
stimulált
szemcsesejt
miatt
nagyon
alacsony
volt.
Ellenırzésként
a
fotostimulációt a hilus azon területén is több (600) kísérletben megismételtük, ahol a mohasejtek gyakran elıfordulnak, de sosem tapasztaltunk posztszinaptikus választ a szemcsesejteken még kontroll állatokban sem, amelyek hilusában pedig a mohasejtek nagy számban találhatók. Ennek talán az a magyarázata, hogy a mohasejtek minden olyan behatásra érzékenyek, amely intracelluláris kálcium emelkedést okoz (Scharfman és Schwartzkroin, 1989) vagyis esetleg nem élik túl a hippokampusz szelet készítés procedúráját. Antidromikus moharost stimulációval kiváltott EPSC-k valószínősége méréseink szerint lecsökkent 4-6 nappal SE után a kontroll csoporthoz képest. Erre a jelenségre nem tudunk egyértelmü magyarázatot adni, lehetséges, hogy a szemcsesejtek ingerelhetıségét csökkentı
kompenzációs mechanizmusról, a szemcsesejtek tranziens funkcionális
sérülésérıl vagy a moharost sarjadzás kezdeti lépéseivel kapcsolatos mechanizmusról van szó. Korábbi kísérletekben megfigyelték, hogy excitatórikus inzultus után a szemcsesejtek idılegesen elveszíthetik szinaptikus kapcsolataik jelentıs részét (Nadler és Cuthbertson, 1980). Ezen kívül más kutatók leírták, hogy axon regeneráció során a növekvı axonok szinaptikus kapcsolataik nagy részét elveszítik, amiket aztán a regeneráció után újra képeznek (Purves, 1975; Mendell és mtsai., 1976). Mindezek a mechanizmusok hozzájárulhatnak az antidromikus moharost stimulációval kiváltható EPSC idıleges csökkenéséhez SE után.
75
6.2 Szemcsesejt – szemcsesejt monoszinaptikus kapcsolatok AMPA és NMDA receptor mediálta komponense Mindhárom mérési módszerünk egybehangzóan bizonyította, hogy mind kontroll, mind epileptikus
állatokban
a
glutamaterg
szemcsesejt
–
szemcsesejt
szinaptikus
transzmisszióban mind AMPA, mind NMDA receptorok részt vesznek. Ez nem meglepı, mivel
NMDA
receptorok
általában
részt
vesznek
a
glutamaterg
szinaptikus
transzmisszióban a gyrus dentatusban: szerepüket leírták a moharost – CA3 piramis sejtek (Weisskopf és Nicoll, 1995) valamint a moharost – gátló kosársejtek (Kneisler és Dingledine, 1995) szinaptikus kapcsolatok esetén is. Kísérleteink szerint az NMDA komponens amplitúdója nagyobb volt az epileptikus állatokban, mint a kontroll állatokban (legalábbis, amikor a moharostokat stimuláltuk). Epileptikus fokozott aktivitás során ez kiemelt jelentıségő lehet, mivel ilyenkor a szemcsesejtek depolarizálódnak és a lassan inaktiválódó NMDA receptorok fokozott aktivációja elısegítheti az epileptikus szinkronizált aktivitás terjedését a gyrus dentatuson keresztül (Dingledine és mtsai., 1990; Traub és mtsai., 1994). Ezt azok a korábbi megfigyelések is alátámasztják, amelyek szerint D-AP5, egy NMDA antagonista, gátolta az antidromikus moharost ingerléssel kiváltható epileptikus aktivitás kialakulását a gyrus dentatusban (Patrylo és Dudek, 1998). Az a mechanizmus, amivel az antidromikus moharost stimulálással kiváltott EPSC-k NMDA komponense epileptikus patkányokban többszörösére növekedett, amíg a perforáns pálya ingerléssel kiváltott EPSC-k NMDA komponense nem változott, nem ismert. A magyarázat erre a jelenségre nem egyszerü, mivel ha a posztszinaptikus NMDA receptorok expressziója változott volna meg SE után, akkor ez a perforáns pálya stimulálása esetén is jelentkezne. A jelenség mindenképpen további tanulmányozást igényel, mivel az NMDA receptorok fontos szerepet játszanak sok fiziológiai (mint például tanulás, memória) és patofiziológiai (sejtpusztulás, hypoxia) folyamatban. Az NMDA receptorok epilepsziában betöltött szerepének értékelését bonyolítja, hogy az elızı fejezetben leírtakkal ellentétben, a fotostimulációs kísérleteinkben nem tapasztaltuk a monoszinaptikus EPSC-k NMDA receptor mediálta komponensének növekedését epileptikus állatokban. Egy lehetséges magyarázat erre a jelenségre, hogy az antidromikus moharost stimulálás esetén az EPSC-ben nem csak a szinapszisban, hanem az extraszinaptikusan elhelyezkedı NMDA receptorok is részt vehettek. Az NMDA
76
receptorok érzékenyebbek a glutamátra mint az AMPA receptorok, ezért erısebb stimulálás esetén a kis koncentrációban a szinapszisokból kidiffundáló glutamát esetleg stimulálhatott NMDA receptorokat, míg az AMPA receptorok nem aktiválódtak (Kullmann és Asztely, 1998). A fotostimulációs kísérletben a stimuláció erıssége sokkal kisebb volt, vagyis valószímőleg az extraszinaptikus NMDA receptorok kevésbé jutottak szerephez. Az antidromikus moharost ingerléssel kiváltott NMDA komponens amplitúdójának megnövekedésén kívül mi nem találtunk más változást az NMDA receptor mediálta áramokban, méréseink szerint az antidromikus moharost stimulálással kiváltható EPSC NMDA komponensének a feszültségfüggése nem változott. Ez a megfigyelés azt sugallja, hogy a pilokarpin modellben az NMDA receptor Mg2+ ionokra való érzékenysége nem változik. Ebbıl a szempontból a pilokarpin modell különbözhet a kindling modelltıl, ahol leírták az NMDA receptorok lecsökkent érzékenységét a Mg2+ ionok által kifejtett gátlásra (Kohr és mtsai., 1993). Kísérlet-technikai szempontból az is kiemeli az EPSC NMDA receptor mediálta komponensének jelentıségét, hogy ezeknek a detektálását NBQX jelenlétében, a gyors glutamaterg transzmisszió részleges gátlásával végeztük, vagyis az NMDA komponens jelenléte bizonyítja, hogy ezek az EPSC-k nagy valószínüséggel monoszinaptikusak voltak.
6.3 GABAerg gátlás epilepsziában Méréseink egy érdekes tényre világítottak rá a GABAerg gátlással kapcsolatban a gyrus dentatus szemcsesejt rétegében. Az antidromikus moharost stimulálással kiváltott gátló posztszinaptikus áramok (IPSC) amplitúdója mintegy 40%-al kisebbnek bizonyult státusz epileptikuszon átesett patkányokban mint a kontroll állatokban 4-6 nappal a státusz epileptikusz után mérve. Ez valószínüleg annak az eredménye, hogy a mohasejtek, amelyek kiemelt szerepet játszanak a gátló interneuronok stimulálásában, szelektíven elpusztulnak státusz epileptikuszt követıen (Obenaus és mtsai., 1993). Az igazán meglepı eredmény azonban az volt, hogy kontroll állatokban a moharost-függı GABAerg gátlás szignifikánsan csökken az állatok korának elırehaladtával, és ez a csökkenés nem következik be epileptikus állatokban. 10 héttel a státusz epileptikusz után mérve az antidromikus moharost stimulálással kiváltható IPSC-k amplitúdója szignifikánsan nagyobbnak bizonyult a státusz epileptikuszon átesett patkányokban mint a kontroll állatokban. Vagyis valamilyen mechanizmus, amely összefügghet a moharost sarjadzással, növeli a moharost-függı GABAerg gátlást a gyrus dentatusban epilepsziás állatokban. Ezt 77
az is alátámasztja, hogy bár a perforáns pálya stimulálással kiváltott IPSC-k amplitúdója is csökkent az állatok korának az elırehaladtával, de itt nem volt különbség az epileptikus és a kontroll állatok között. A mohasejtek pusztulásán kívül a gátló interneuronok szelektív pusztulása is magyarázatot adhat a moharost-függı GABAerg gátlás szelektív csökkenésére a gyrus dentatusban SE után. Az un. ‘HIPP’ sejtek (gátló interneuronok egyik típusa) különösen érzékenyek az epileptikus aktivitásra, és szelektíven pusztulnak SE után (Buckmaster és Dudek, 1997b; Lurton és mtsai., 1997). Ezeknek a sejteknek a dendritjei a hilusban helyezkednek el és így valószínüleg a moharost-függı feed-back gátlásban van szerepük (Freund és Buzsaki, 1996). A kosár sejtek és az un. ‘MOPP’ sejtek ezzel szemben nem érzékenyek a SE hatásaira (Buckmaster és Dudek, 1997b). Ezeknek a sejteknek a dendritjei a perforáns pálya szinaptikus zónájában vannak és ebbıl következıen valószínüleg a feedforward gátlásban van szerepük. A GABAerg gátlás korfüggı csökkenését a gyrus dentatusban több faktor is okozhatja. Korábbi eredmények azt sugallják, hogy a GABAerg interneuronok száma csökken az állatok korának az elırehaladtával (Shetty és Turner, 1998). Az elpusztuló interneuron populáció azonos lehet azzal, amely SE után pusztul el, ez magyarázatot adhat arra, hogy az SE utáni sejtpusztulás lezajlása után a GABAerg gátlás nem csökken tovább epileptikus állatokban. Arra is van bizonyíték, hogy a moharost sarjadzással párhuzamosan a GABAerg gátlás erısödik a gyrus dentatusban epileptikus állatokban (Buckmaster és Dudek, 1997a; Gibbs és mtsai., 1997), hasonlóan ahhoz, amit mi a moharost-függı gátlással kapcsolatban tapasztaltunk. Ezzel párhuzamosan, szintén a mi méréseinkkel összhangban, más szerzık nem találtak különbséget a perforáns pálya ingerléssel kiváltott IPSC-k amplitúdójában kontroll és epileptikus állatok között (Isokawa, 1996). Ezek az eredmények nem mondanak feltétlenül ellent egymásnak a kísérleti elrendezések különbségei miatt (moharost ingerlés vs. perforáns pálya ingerlés).
6.4 A moharostokból szinaptikusan ürülı cink szerepe epilepsziában Ezeket a kísérleteket kízárólag epileptikus állatokon végeztük. Megállapítottuk, hogy az extracelluláris oldathoz adott cink csökkentette mind a muscimol helyi adásával kiváltott GABAA receptor mediálta áramokat, mind a perforáns pálya ingerlésével kiváltott NMDA receptor mediálta áramokat, de csak akkor, amikor a kétértékő anionokat eltávolítottuk az 78
extracelluláris oldatból. Külsıleg adott cink hatása erısebbnek bizonyult az NMDA receptorokon, mint a GABAA receptorokon. Cink a mi kísérleteinkben jelentısen gyengébben gátolta a GABAA receptorokat mint ahogyan azt más kutatók korábban leírták (Gibbs és mtsai., 1997). Ennek egy lehetséges magyarázata lehet, hogy mi a szemcsesejtek dendritjén, a gyrus dentatus belsı molekuláris rétegében teszteltük a GABAA receptorokat agyszeletben, míg a korábbi kísérleteket izolált sejteken, a sejt szómáján elhelyeszkedı receptorokon végezték. Vannak arra utaló eredmények, hogy a különbözı elegységekbıl felépülı (és ezzel különbözı cink érzékenységő) GABAA receptorok eloszlása a sejtek felszínén nem egyenletes (Brickley és mtsai., 1999). Külsıleg adott cink nem csak a muscimollal kiváltott GABAA receptor mediálta áramokat csökkentette, hanem a szemcsesejteket beidegzı gátló szinaptikus terminálokból spontán módon, preszinaptikus aktivitás nélkül felszabaduló GABA által kiváltott mIPSC-k amplitúdóját és frekvenciáját is. Cink mIPSC frekvencia csökkentı hatását meg lehet magyarázni posztszinaptikus GABAA receptor gátló hatással, ha figyelembe vesszük, hogy az mIPSC-k amplitúdójának csökkenésével bizonyos részük a detektálási küszöb alá kerül, vagyis a detektált mIPSC-k száma / frekvenciája csökken. Itt is meg kell jegyeznünk, hogy a mi kísérleti rendszerünkben zink kevésbé volt hatékony az mIPSC-k gátlásában, mint ahogy korábbi eredmények alapján várható lett volna (Buhl és mtsai., 1996), valamint nálunk az mIPSC-k idıbeli lefutását nem befolyásolta szignifikánsan. Ezekre a különbségekre további vizsgálatok nélkül nem tudunk magyarázattal szolgálni, elképzelhetı, hogy a kísérletekben használt különbözı epilepszia modellek (kindling vs. pilokarpin) sajáságaiból következnek. 6.4.1
A moharostokból szinaptikusan ürülı cink még extrém körülmények között sem gátolta jelentıs mértékben a posztszinaptikus GABAA receptorokat
Ezeknek a kísérleteknek az volt a célja, hogy igazoljuk (vagy elvessük) azt az elméletet, hogy a moharostokból szinaptikusan ürülı cink a gyrus dentatus belsı molekuláris rétegében gátolja az ott található szomszédos GABAerg gátló szinapszisokat, s ez a feedback / feed-forward gátlás összeomlásához vezethet (Buhl és mtsai., 1996). Ezt az elméletet alátámasztották azok a megfigyelések, hogy a GABAA receptorok alegységszerkezete megváltozik epilepsziában, és így érzékenyebbé válnak a cink hatására (Saxena és Macdonald, 1994; Buhl és mtsai., 1996; Knoflach és mtsai., 1996; Brooks-Kayal és mtsai., 1998a). Röviden összefoglalva: nem találtuk semmi jelét annak, hogy ez bekövetkezne: 79
antidromikus moharost stimulálás NBQX és D-AP5 jelenlétében semmilyen hatással sem volt
a szemcsesejtek dendritjén fotostimulálással kiváltott GABAA receptor mediálta
áramokra epileptikus állatokban, még olyan körülmények között sem, amikor a cink ürülésének valószínüségét megnöveltük. A kísérletek technikai nehézségei miatt ez az eredmény nem jelenti azt, hogy 100% biztonsággal kizártuk ezt a lehetıséget, de mindenesetre a valószínüsége annak, hogy ez bekövetkezzék a mi méréseink alapján nagyon alacsony. Ahhoz, hogy a moharostokból ürülı cink gátolhassa a GABAA receptorokat, elıször is elég nagy koncentrációban kell kilépnie a terminálisokból ahhoz, hogy a szinaptikus résbıl kijutva elérje a szomszédos GABAerg terminálisokat még elég magas koncentrációban ahhoz, hogy gátolni tudja azokat. Mások mérései szerint a moharost szinapszisban a cink legalább 100-300 µM koncentrációban van jelen epileptikus aktivitás esetén (Frederickson és mtsai., 1990). A GABAA receptorok gátlásához legalább 10 µM cink szükséges (Gibbs és mtsai., 1997). A cink szabad diffúzióját a szinaptikus résbıl két folyamat is gátolja. Az egyik: a neurotranszmitterekhez hasonlóan létezik olyan transzporter, amelynek a feladata cink visszavétele a preszinaptikus terminálisba, vagyis preszinaptikus aktivitás után a cink koncentrációja nagyon gyorsan csökken a szinapszisban, nem a viszonylag lassú diffúzió a meghatározó tényezı (Howell és mtsai., 1984). Másodsorban a sejtközötti folyadék mindíg tartalmaz kétértékü anionokat, amelyek megkötik a szabad cinket így azt hatástalanítják. A cinknek ezek a tulajdonságai magyarázatul szolgálhatnak a negatív eredményünkre. Más kísérletekben megállapítottuk, hogy a szinaptikusan a moharostokból ürülı cink kismértékben gátolja a posztszinaptikus NMDA receptorokat, vagyis játszhat (eszerint gátló) szerepet az epileptikus rohamok kialakulásában. Késıbbi saját mérések és más kutatók vizsgálatai ellentmondó képet festettek a cink lehetséges szerepérıl epilepsziában, de általában a cink hatása kicsi volt és igen nehezen kimutatható vagy értékelhetı. Legújabb eredmények szerint cink epileptogén hatású a kindling modellben (Foresti és mtsai., 2008), nincs hatása a pilokarpin által kiváltott rohamokra (Noyan és mtsai., 2007) de más szerzıknél facilitálta a gyrus dentatus szemcsesejtjeinek epileptikus aktivitását kifejlett epilepszia esetén a pilokarpin modellben (Timofeeva és Nadler, 2006).
80
6.4.2
Kísérlet-tervezési megfontolások
A legfıbb probléma ami megnehezítette / megnehezíti ezeknek a méréseknek a kiértékelését, hogy nem tudtuk pontosan ott tesztelni a posztszinaptikus GABAA receptorokat, ahol a cink a preszinaptikus moharost terminálisokból kiürült. Ennek következtében nem zárhatjuk ki annak a lehetıségét, hogy bizonyos speciális esetekben, amikor egy GABAerg gátló szinapszis nagyon közel esik egy moharost terminálishoz, akkor a GABAA receptorok cink általi gátlása valóban bekövetkezik. A mi következtetéseink inkább általános jellegüek: Erıs moharost aktivitás esetén is a gátló szinaptikus kapcsolatok csak kis része gátlódhat a kibocsátott cink által (Mi nem találtunk egy esetet sem, amikot jelentıs gátlást figyeltünk volna meg). A kísérlet tervezése során mindent megtettünk, hogy 1) pontosan a mért szemcsesejt dendritjének azon szegmensére lokalizáljuk a GABAA receptorok aktiválást, ahol a moharost terminálisok végzıdnek (és megismételjük a kísérletet annyiszor, ahányszor csak tudjuk különbözı helyeken) és 2) annyi cinket ürítsünk ki a moharost terminálisokból, amennyit csak lehet. A moharostok antidromikus stimulására olyan protokollt használtunk (10 Hz, 100 Hz), amely mások szerint optimális a cink kibocsátására (Aniksztejn és mtsai., 1987). A kísérleteinket megismételtük olyan körülmények között is, amikor a cink kibocsátását maximáltuk (Mg2+ mentes ACSF, 6 mM K+, 33 ºC). Mások (és késıbb mi is) bizonyítottuk, hogy a mi kísérleti körülményeink között cink ürül a moharost szinapszisokból és gátolja az NMDA receptorokat (Budde és mtsai., 1997; Quinta-Ferreira és mtsai., 2000; Vogt és mtsai., 2000; Molnar és Nadler, 2001). Ezenkívül a mi NMDA receptor kísérleteinkben nem találtuk annak nyomát, hogy a moharost terminálisokból a cink kibocsátás idıvel csökkenne. Vagyis nagy valószínüséggel a protokoll, amit a cink moharostokból való felszabadítására használtunk müködött, a negatív eredményért nem a cink felszabadulás hiánya volta a felelıs. 6.4.3
A kísérletben használt cGABA ‘extra’ hatásai
A GABAA receptorok lokalizált aktiválásához fotostimulálást használtunk, vagyis GABA egy inaktív prekurzorát (cGABA) UV fénnyel aktiváltuk, s az így felszabadított GABA hatását mértük a szemcsesejteken. Az általunk használt GABA prekurzornak korábbi mérések szerint semmilyen aktivitása nem volt GABAA receptorokon (Gee és mtsai., 1994).
A mi kísérleti rendszerünkben cGABA 200 µM koncentrációban egy gyenge
GABAA receptor antagonistaként viselkedett, a muscimollal kiváltott GABAA receptor 81
mediálta áramokat kismértékben gátolta. Ezzel szemben 200 µM cGABA-nak drasztikus hatása volt a GABAerg szinaptikus transzmisszióra, a GABA mediálta spontán IPSC-k teljesen eltőntek a szemcsesejteken mérve. cGABA-nak nem volt mérhetı hatása az glutamaterg szinaptikus transzmisszióra a gyrus dentatusban. Méréseink alapján nem tudtuk egyértelmően eldönteni, vajon cGABA hatása a GABAerg szinaptikus transzmisszióra preszinaptikus vagy posztszinaptikus mechanizmussal mediálódik-e, mivel mindkét mechanizmusra találtunk jeleket. cGABA nemcsak az amplitúdóját csökkentette a monoszinaptikus és a poliszinaptikus IPSC-knek, de megváltoztatta a frekvenciájukat és az idıbeli lefutásukat is. GABAB receptor antagonistákkal bizonyítottuk, hogy cGABA hatását nem preszinaptikus GABAB receptorokon keresztül fejti ki. A posztszinaptikus mechanizmusra utaló jel volt, hogy cGABA hatása gyengén feszültségfüggınek bizonyult, a
cGABA
által
az
membránpotenciáljától.
IPSC-re
kifejtett
Összefoglalva:
gátlás
cGABA
függött
hatása
a
a
mért
GABAerg
szemcsesejt szinaptikus
transzmisszióra hasonlónak mutatkozott, mint amit bizonyos phenothiazine-típusú antipszichotikus gyógyszerek esetén leírtak (Zorumski és Yang, 1988; Morzymas és mtsai., 1999). Az sem zárható ki, hogy cGABA által kifejtett gátlás szelektív bizonyos gátló szinaptikus kapcsolatokra. Nyilválnvalóan cGABA hatásmechanizmusának eldöntése további részletesebb vizsgálatokat igényel. A mi kísérletünk szempontjából azonban úgy gondoltuk, a cGABA által a GABAA receptorokra kifejtett, a mi kísérleti körülményeink között gyenge gátlás nem befolyásolta a méréseink kimenetelét, különösen, hogy cGABAnak semmilyen hatása sem volt a glutamaterg transzmisszióra és így nagy valószínüséggel a cink szinaptikus ürülésére sem. 6.4.4
A moharostokból szinaptikusan ürülı posztszinaptikus NMDA receptorokat
cink
kismértékben
gátolta
a
Ezeket a kísérleteket kizárólag epileptikus állatokon végeztük. A cink szerepének vizsgálatához egy specifikus cink kelátort, CaEDTA-t használtunk. CaEDTA nem teljesen szelektív cinkre, de a kísérleti körülményeink között cink volt az egyetlen nehézfém, amit megköthetett. Eredményeinket úgy validáltuk, hogy összehasonlítottuk CaEDTA hatását az antidromikus moharost (amelyik cinket tartalmaz) valamint perforáns pálya (amelyik nem tartalmaz cinket) stimulálással kiváltott NMDA áramokra. Megfigyelhettük, hogy CaEDTA szelektíven, bár csak kis mértékben, növelte az antidromikus moharost stimulálással kiváltott NMDA receptor mediálta áramok amplitúdóját. Ez a hatás úgy magyarázható,
82
hogy normál esetben a glutamáttal együtt a moharostokból ürülı cink gátolja a posztszinaptikus NMDA receptorokat. CaEDTA megakadályozta ezt a gátlást. Arra vonatkozóan ellentmondóak az adatok, hogy milyen erısségü stimuláció szükséges a cink ürítéséhez. Korábbi feltételezések szerint cink csak nagyfrekvenciájú stimuláció esetén ürül a moharost szinapszisból, ekkor a szerepe az NMDA receptorok gátlása epileptikus aktivitás esetén, míg nem befolyásolja a szinapszis normál müködését (Assaf és Chung, 1984; Aniksztejn és mtsai., 1987). Más megfigyelések szerint már egyetlen preszinaptikus akciós potenciál is üríti a cinket a moharost terminálisból (Vogt és mtsai., 2000). CaEDTA hatása az NMDA áramokra feszültségfüggınek bizonyult, -30 mV membránpotenciálnál
kb.
30
%
növekedést
tapasztaltunk
az
NMDA
áramok
amplitúdójában, míg + 40 mV membránpotenciálnál nem tapasztaltunk semmilyen hatást. Mivel az NMDA receptoron mind feszültségfüggı, mind feszültségfüggetlen cink kötı helyek vannak, ezért ez az eredmény is összhangban van korábbi megfigyelésekkel (Chen és mtsai., 1997; Paoletti és mtsai., 1997; Vogt és mtsai., 2000). Kísérleteink alapján nem becsülhetjük meg a cink teljes hatását a posztszinaptikus NMDA receptorokon, mivel CaEDTA calcium kötı kinetikája lassú (Vogt és mtsai., 2000), valószínüleg nem volt képes 100 %-ban megkötni az összes cinket amely a szinaptikus transzmisszió során ürült, vagyis a posztszinaptikus NMDA receptorok még CaEDTA jelenlétében is részleges cink gátlás alatt állhattak.
6.5 Összegzés Ebben a kísérletsorozatban megmutattuk, hogy funkcionális szemcsesejt-szemcsesejt kapcsolatok normál, nem epileptikus patkányokban is megfigyelhetık a kaudális hippokampuszban. Státusz epileptikusz hatására a moharost sarjadzás során a funkcionális szemcsesejt – szemcsesejt szinapszisok száma drasztikusan megnı. Ezek az újonnan képzıdött szinapszisok fiziológiai és farmakológiai tulajdonságaikban nem különböznek a kontroll állatokban megfigyelhetı szemcsesejt – szemcsesejt szinapszisoktól. A szemcsesejt – szemcsesejt szinaptikus jelátvitelben nem csak AMPA, de NMDA receptorok is részt vesznek. A moharostokból szinaptikus aktivitás során ürülı cink folyamatosan és lehet, hogy frekvenciafüggıen gátolja a posztszinaptikus NMDA receptorokat, de valószínőleg a szomszédos GABAerg szinapszisok mőködésére csak minimális hatással van. Ezek az eredmények alátámasztják azt az elméletet, hogy a moharost sarjadzás során 83
egy funkcionális pozitív visszacsatolás jön létre a gyrus dentatusban, amely növeli a gyrus dentatus excitabilitását és elısegítheti az epileptikus aktivitás keletkezését / terjedését; azonban a szemcsesejt – szemcsesejt szinaptikus kapcsolatok még epileptikus állatokban is viszonylag ritkák, vagyis a moharost sarjadzás valószínüleg nem lehet az epilepszia kialakulásának elsıdleges / egyyetlen mechanizmusa.
84
7 SUMMARY Temporal lobe epilepsy is the most common form of human epilepsy. It is frequently associated with hippocampal sclerosis and synaptic reorganization including mossy fiber sprouting, a phenomena characterized by the appearance of granule cell axons in the dendritic layer of the dentate granule cells. If granule cells are forming functional excitatory synapses with other granule cells in the epileptic brain, this positive feed-back circuit could explain the increased excitability in the dentate gyrus observed in temporal lobe epilepsy. Moreover, it was also hypothized that synaptically released zinc from sprouted mossy fibers could block postsynaptic inhibitory GABAA receptors on granule cells leading to a ‘collapse’ of feed-back inhibition in epilepsy. In this study the physiological properties of granule cell – granule cell synapses were
characterized
using
electrophysiological,
histological,
pharmacological
and
photostimulation methods in the pilocarpine rat model of temporal lobe epilepsy. Using glutamate uncaging to stimulate a small group of granule cells and patch clamp recordings to detect postsynaptic excitatory currents in other granule cells we have shown that functional granule cell – granule cell synaptic connections were present not only in the epileptic but also in the normal brain in the rat caudal hippocampus. After status epileptikus the number of functional granule cell – granule cell synapses increased
drastically
concurrently with histologically confirmed mossy fiber sprouting, but there was no physiological or pharmacological difference between mossy fiber – granule cell synapses measured in control or epileptic animals. Synaptic transmission in granule cell – granule cell synapses was mediated not only by AMPA, but also by NMDA type glutamate receptors. Using zinc chelators we have also shown that synaptically released zinc from the sprouted mossy fibers inhibited postsynaptic NMDA receptors, but it did not affect GABAA receptor mediated responses evoked by GABA uncaging in the molecular layer of the dentate gyrus. These results support the idea that, as a consequence of mossy fiber sprouting, a functional positive feed-back circuit is developing in the dentate gyrus during epileptogenesis, but the extent of the interconnectivity between granule cells, even in the most serious epileptic cases, is low, thus, most possibly, mossy fiber sprouting could not be the main / sole mechanism leading to the development of temporal lobe epilepsy.
85
8 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Köszönetemet szeretném nyilvánítani Dr. Victor Nadlernek, akinek a laborjában ezeket a méréseket végezhettem, Dr. Maxine Okazakinak, aki sokat segített az agyszelet elektrofiziológiai
módszerek
elsajátításában,
Dr.
Hernádi
Istvánnak,
jelenlegi
konzulensemnek, a sok segítségért, amit kaptam tıle, Dr. Csoknya Mária Professzor Asszonynak a dolgozat többszöri átnézéséért és javításáért, valamint az önzetlen segítségéért, Dr. Gábriel Róbert Rektor Úrnak, a Doktori Iskola vezetıjének hogy lehetıvé tette a programban való részvételemet valamint a Pécsi Tudományegyetem Biológia Doktori Iskola minden közremőködıjének színvonalas munkájáért.
86
9 IRODALOM Acsady, L., A. Kamondi, A. Sik, T. Freund és G. Buzsaki (1998). "GABAergic Cells Are the Major Postsynaptic Targets of Mossy Fibers in the Rat Hippocampus." Journal of Neuroscience 18(9): 3386-3403. Allen, C. és C. F. Stevens (1994). "An Evaluation of Causes for Unreliability of Synaptic Transmission." Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 91(22): 10380-10383. Amaral, D. G., H. E. Scharfman és P. Lavenex (2007). "The dentate gyrus: fundamental neuroanatomical organization (dentate gyrus for dummies) " Progress in Brain Research 163: 3-22. Aniksztejn, L., G. Charton és Y. Benari (1987). "Selective Release of Endogenous Zinc from the Hippocampal Mossy Fibers Insitu." Brain Research 404(1-2): 58-64. Arzimanoglou, A., E. Hirsch, A. Nehlig, P. Castelnau, P. Gressens és A. P. de Vasconcelos (2002). "Epilepsy and neuroprotection: an illustrated review." Epileptic Disorders 4(3): 173-182. Assaf, S. Y. és S. H. Chung (1984). "Release of Endogenous Zn-2+ from Brain-Tissue during Activity." Nature 308(5961): 734-736. Babb, T. L., W. R. Kupfer, J. K. Pretorius, P. H. Crandall és M. F. Levesque (1991). "Synaptic Reorganization by Mossy Fibers in Human Epileptic Fascia-Dentata." Neuroscience 42(2): 351-363. Banczerowski, J., I. Világi, L. Détári, J. Dóczi és T. Kukorelli (1999). "Kockázat és biztonság az élelmiszer-gazdaságban. Mikotoxinok az élelmiszerekben.Toxikus hatások, idegrendszeri változások biomonitorozása." Magyar Tudomány 4. Barbarosie, M. és M. Avoli (1997). "CA3-driven hippocampal-entorhinal loop controls rather than sustains in vitro limbic seizures." Journal of Neuroscience 17(23): 93089314. Bausch, S. B. (2005). "Axonal sprouting of GABAergic interneurons in temporal lobe epilepsy." Epilepsy & Behavior 7(3): 390-400. Blasco-Ibanez, J. M., F. J. Martinez-Guijarro és T. F. Freund (2000). "Recurrent mossy fibers preferentially innervate parvalbumin-immunoreactive interneurons in the granule cell layer of the rat dentate gyrus." Neuroreport 11(14): 3219-3225. Brickley, S. G., S. G. Cull-Candy és M. Farrant (1999). "Single-channel properties of synaptic and extrasynaptic GABA(A) receptors suggest differential targeting of receptor subtypes." Journal of Neuroscience 19(8): 2960-2973. Brooks-Kayal, A., M. Shumate, H. Jin, T. Rikhter és D. Coulter (1998a). "gammaaminobutyric acid-A receptor expression and function in epileptic dentate granule cells resemble those in immature neurons." Annals of Neurology 44(3): 544-544. Brooks-Kayal, A. R., M. D. Shumate, H. Jin, T. Y. Rikhter és D. A. Coulter (1998b). "Selective changes in single cell GABA(A) receptor subunit expression and function in temporal lobe epilepsy." Nature Medicine 4(10): 1166-1172. Buckmaster, P. S. és F. E. Dudek (1997a). "Network properties of the dentate gyrus in epileptic rats with hilar neuron loss and granule cell axon reorganization." Journal of Neurophysiology 77(5): 2685-2696. Buckmaster, P. S. és F. E. Dudek (1997b). "Neuron loss, granule cell axon reorganization, and functional changes in the dentate gyrus of epileptic kainate-treated rats." Journal of Comparative Neurology 385(3): 385-404.
87
Budde, T., A. Minta, J. A. White és A. R. Kay (1997). "Imaging free zinc in synaptic terminals in live hippocampal slices." Neuroscience 79(2): 347-358. Buhl, E. H., T. S. Otis és I. Mody (1996). "Zinc-induced collapse of augmented inhibition by GABA in a temporal lobe epilepsy model." Science 271(5247): 369-373. Carnevale, N. T., K. Y. Tsai, B. J. Claiborne és T. H. Brown (1997). "Comparative electrotonic analysis of three classes of rat hippocampal neurons." Journal of Neurophysiology 78(2): 703-720. Cascino, G. D. (1994). "Epilepsy - Contemporary Perspectives on Evaluation and Treatment." Mayo Clinic Proceedings 69(12): 1199-1211. Cavalheiro, E. A. (1995). "The Pilocarpine Model of Epilepsy." Italian Journal of Neurological Sciences 16(1-2): 33-37. Cavalheiro, E. A., J. P. Leite, Z. A. Bortolotto, W. A. Turski, C. Ikonomidou és L. Turski (1991). "Long-Term Effects of Pilocarpine in Rats - Structural Damage of the Brain Triggers Kindling and Spontaneous Recurrent Seizures." Epilepsia 32(6): 778-782. Chen, N. S., A. Moshaver és L. A. Raymond (1997). "Differential sensitivity of recombinant N-methyl-D-aspartate receptor subtypes to zinc inhibition." Molecular Pharmacology 51(6): 1015-1023. Chen, S., M. Kobayashi, Y. Honda, S. Kakuta, F. Sato és K. Kishi (2007). "Preferential neuron loss in the rat piriform cortex following pilocarpine-induced status epilepticus." Epilepsy Research 74(1): 1-18. Chi, Z. H., X. Wang, J. Q. Cai, M. Stoltenberg, G. Danscher és Z. Y. Wang (2008). "Zinc transporter 3 immunohistochemical tracing of sprouting mossy fibres." Neurochemistry International 52(7): 1305-1309. Coenen, A. M. L. és E. van Luijtelaar (2003). "Genetic animal models for absence epilepsy: A review of the WAG/Rij strain of rats." Behavior Genetics 33(6): 635-655. Correia, I. L., R. Spreafico, S. De Biasi, E. A. Cavalheiro és M. Bentivoglio (1998). "Selective thalamic damage in pilocarpine-induced chronic epilepsy." European Journal of Neuroscience 10: 48-48. Coulter, D. A., A. Rafiq, M. Shumate, Q. Z. Gong, R. J. DeLorenzo és B. G. Lyeth (1996). "Brain injury-induced enhanced limbic epileptogenesis: Anatomical and physiological parallels to an animal model of temporal lobe epilepsy." Epilepsy Research 26(1): 81-91. Covolan, L. és L. E. Mello (2006). "Assessment of the progressive nature of cell damage in the pilocarpine model of epilepsy." Brazilian Journal of Medical and Biological Research 39(7): 915-924. Covolan, L. és L. E. A. M. Mello (2000). "Temporal profile of neuronal injury following pilocarpine or kainic acid-induced status epilepticus." Epilepsy Research 39(2): 133-152. Covolan, L., L. T. C. Ribeiro, B. M. Longo és L. E. A. M. Mello (2000). "Cell damage and neurogenesis in the dentate granule cell layer of adult rats after pilocarpine- or kainate-induced status epilepticus." Hippocampus 10(2): 169-180. Cronin, J., A. Obenaus, C. R. Houser és F. E. Dudek (1992). "Electrophysiology of Dentate Granule Cells after Kainate-Induced Synaptic Reorganization of the Mossy Fibers." Brain Research 573(2): 305-310. Curia, G., D. Longo, G. Biagini, R. S. G. Jones és M. Avoli (2008). "The pilocarpine model of temporal lobe epilepsy." Journal of Neuroscience Methods 172(2): 143-157. Danscher, G. (1981). "Histochemical-Demonstration of Heavy-Metals - a Revised Version of the Sulfide Silver Method Suitable for Both Light and Electron-Microscopy." Histochemistry 71(1): 1-16. 88
Davenport, C. J., W. J. Brown és T. L. Babb (1990). "Sprouting of Gabaergic and Mossy Fiber Axons in Dentate Gyrus Following Intrahippocampal Kainate in the Rat." Experimental Neurology 109(2): 180-190. Davis, K. L., D. Charney, J. T. Coyle, C. Nemeroff, G. S. Aston-Jones és G. R. Siggins (2002). Neuropsychopharmacology: The Fifth Generation of Progress. New York, Lippincott Williams & Wilkins Deshpande, L. S., J. K. Lou, A. Mian, R. E. Blair, S. Sombati, E. Attkisson és R. J. DeLorenzo (2008). "Time course and mechanism of hippocampal neuronal death in an in vitro model of status epilepticus: Role of NMDA receptor activation and NMDA dependent calcium entry." European Journal of Pharmacology 583(1): 7383. Dingledine, R., C. J. Mcbain és J. O. Mcnamara (1990). "Excitatory Amino-Acid Receptors in Epilepsy." Trends in Pharmacological Sciences 11(8): 334-338. Dinocourt, C., Z. Petanjek, T. F. Freund, Y. Ben-Ari és M. Esclapez (2003). "Loss of interneurons innervating pyramidal cell dendrites and axon initial segments in the CA1 region of the hippocampus following pilocarpine-induced seizures." Journal of Comparative Neurology 459(4): 407-425. Druga, R., P. Mares, J. Otahal és H. Kubova (2005). "Degenerative neuronal changes in the rat thalamus induced by status epilepticus at different developmental stages." Epilepsy Research 63(1): 43-65. Drummen, G. P. C., J. A. F. Op den Kamp és J. A. Post (1999). "Validation of the peroxidative indicators, cis-parinaric acid and parinaroyl-phospholipids, in a model system and cultured cardiac myocytes." Biochimica Et Biophysica Acta-Molecular and Cell Biology of Lipids 1436(3): 370-382. Du, F., T. Eid, E. W. Lothman, C. Kohler és R. Schwarcz (1995). "Preferential Neuronal Loss in Layer-Iii of the Medial Entorhinal Cortex in Rat Models of Temporal-Lobe Epilepsy." Journal of Neuroscience 15(10): 6301-6313. Epsztein, J., M. Milh, R. I. Bihi, I. Jorquera, Y. Ben-Ari, A. Represa és V. Crepel (2006). "Ongoing epileptiform activity in the post-ischemic hippocampus is associated with a permanent shift of the excitatory-inhibitory synaptic balance in CA3 pyramidal neurons." Journal of Neuroscience 26(26): 7082-7092. Esclapez, M., J. C. Hirsch, Y. Ben-Ari és C. Bernard (1999). "Newly formed excitatory pathways provide a substrate for hyperexcitability in experimental temporal lobe epilepsy." Journal of Comparative Neurology 408(4): 449-460. Faria, L. C., A. C. Silva, N. R. Priel, M. D. Naffah-Mazzacoratti, I. Mody és E. A. Cavalheiro (2005). "Damage, neuronal loss and alterations in the cerebellum of rodents submitted to the pilocarpine model of epilepsy." Epilepsia 46: 101-101. Fisher, P. D., E. F. Sperber és S. L. Moshe (1998). "Hippocampal sclerosis revisited." Brain & Development 20(8): 563-573. Fisher, R. S., W. V. Boas, W. Blume, C. Elger, P. Genton, P. Lee és J. Engel (2005). "Epileptic seizures and epilepsy: Definitions proposed by the International League against Epilepsy (ILAE) and the International Bureau for Epilepsy (IBE)." Epilepsia 46(4): 470-472. Foresti, M. L., G. M. Arisi, A. Fernandes, C. Q. Tilelli és N. Garcia-Cairasco (2008). "Chelatable zinc modulates excitability and seizure duration in the amygdala rapid kindling model." Epilepsy Research 79(2-3): 166-172. Franck, J. E., J. Pokorny, D. D. Kunkel és P. A. Schwartzkroin (1995). "Physiological and Morphologic Characteristics of Granule Cell Circuitry in Human Epileptic Hippocampus." Epilepsia 36(6): 543-558. 89
Frederickson, C. J. és G. Danscher (1990). "Zinc-Containing Neurons in Hippocampus and Related Cns Structures." Progress in Brain Research 83: 71-84. Frederickson, R. E., C. J. Frederickson és G. Danscher (1990). "Insitu Binding of Bouton Zinc Reversibly Disrupts Performance on a Spatial Memory Task." Behavioural Brain Research 38(1): 25-33. Freund, T. és G. Buzsaki (1996). "Interneurons of the hippocampus." Hippocampus 6: 347470. Fritschy, J. M., T. Kiener, V. Bouilleret és F. Loup (1999). "GABAergic neurons and GABA(A)-receptors in temporal lobe epilepsy." Neurochemistry International 34(5): 435-445. Frye, C. A. (2009). "Psy 314, 601 Survey of Biopsychology. Methods." http://www.albany.edu/faculty/cafrye/apsy601/Ch.05ResearchMethods.html. Ganapathy, N. és J. W. Clark (1987). "Extracellular currents and potentials of the active myelinated nerve fiber." 52(5): 749-761. Gashia, E., J. Avallonea, T. Webstera és L. K. Friedman (2007). "Altered excitability and distribution of NMDA receptor subunit proteins in cortical layers of rat pups following multiple perinatal seizures." Brain Research 1145(11 ): 56-65. Gee, K. R., R. Wieboldt és G. P. Hess (1994). "Synthesis and Photochemistry of a New Photolabile Derivative of Gaba - Neurotransmitter Release and Receptor Activation in the Microsecond Time Region." Journal of the American Chemical Society 116(18): 8366-8367. Gibbs, J. W., M. D. Shumate és D. A. Coulter (1997). "Differential epilepsy-associated alterations in postsynaptic GABA(A) receptor function in dentate granule and CA1 neurons." Journal of Neurophysiology 77(4): 1924-1938. Golarai, G. és T. P. Sutula (1996a). "Bilateral organization of parallel and serial pathways in the dentate gyrus demonstrated by current-source density analysis in the rat." Journal of Neurophysiology 75(1): 329-342. Golarai, G. és T. P. Sutula (1996b). "Functional alterations in the dentate gyrus after induction of long-term potentiation, kindling, and mossy fiber sprouting." Journal of Neurophysiology 75(1): 343-353. Gold, C., D. A. Henze, C. Koch és G. Buzsaki (2006). "On the Origin of the Extracellular Action Potential Waveform: A Modeling Study." J Neurophysiol 95(5): 3113-3128. Gorter, J. A., P. M. G. Pereira, E. A. van Vliet, E. Aronica, F. H. L. da Silva és P. J. Lucassen (2003). "Neuronal cell death in a rat model for mesial temporal lobe epilepsy is induced by the initial status epilepticus and not by later repeated spontaneous seizures." Epilepsia 44(5): 647-658. Gurbanova, A. A., R. Aker, K. Berkman, F. Y. Onat, C. M. van Rijn és G. van Luijtelaar (2006). "Effect of systemic and intracortical administration of phenytoin in two genetic models of absence epilepsy." British Journal of Pharmacology 148(8): 10761082. Haas, C. és M. Frotscher (2009). "Reelin deficiency causes granule cell dispersion in epilepsy." Experimental Brain Research Published Online. Halász, P. (1997). Epilepsziás tünetegyüttesek, Springer Hungarica Kiadó kft. Halász, P. és A. Fogarasi (2006). "Temporal lobe epilepsy--state of art review - Temporalis lebeny epilepszia--"state of art" beszámoló." Ideggyógyászati szemle 59(9-10): 331352. Hallez, H., B. Vanrumste, R. Grech, J. Muscat, W. De Clercq, A. Vergult, Y. D'Asseler, K. P. Camilleri, S. G. Fabri, S. Van Huffel és I. Lemahieu (2007). "Review on solving the forward problem in EEG source analysis " J Neuroeng Rehabil 4: 46. 90
Hardison, J. L., M. M. Okazaki és J. V. Nadler (2000). "Modest increase in extracellular potassium unmasks effect of recurrent mossy fiber growth." Journal of Neurophysiology 84(5): 2380-2389. Henze, D. A. és G. Buzsaki (2007). Hilar mossy cells: functional identification and activity in vivo. Dentate Gyrus: A Comphrehensive Guide to Structure, Function, and Clinical Implications. Amsterdam, Elsevier Science Bv. 163: 199-+. Hillman, E. M. C. (2007). "Optical brain imaging in vivo: techniques and applications from animal to man." Journal of Biomedical Optics 12: 051402-1 - 28. Hosford, D. A. (1999). "Animal models of nonconvulsive status epilepticus." Journal of Clinical Neurophysiology 16(4): 306-313. Houser, C. R. és M. Esclapez (1996). "Vulnerability and plasticity of the GABA system in the pilocarpine model of spontaneous recurrent seizures." Epilepsy Research 26(1): 207-218. Howell, G. A., M. G. Welch és C. J. Frederickson (1984). "Stimulation-Induced Uptake and Release of Zinc in Hippocampal Slices." Nature 308(5961): 736-738. Isokawa, M. (1996). "Decrement of GABA(A) receptor-mediated inhibitory postsynaptic currents in dentate granule cells in epileptic hippocampus." Journal of Neurophysiology 75(5): 1901-1908. Janszky, J. és A. Szőcs (2002). "Az epilepsziás rohamok diagnózisa és kezelése." Hippocrates 4(2): 104-110. Jonas, P., G. Major és B. Sakmann (1993). "Quantal Components of Unitary Epscs at the Mossy Fiber Synapse on Ca3 Pyramidal Cells of Rat Hippocampus." Journal of Physiology-London 472: 615-663. Jung, K. H., K. Chu, M. Kim, S. W. Jeong, Y. M. Song, S. T. Lee, J. Y. Kim, S. K. Lee és J. K. Roh (2004). "Continuous cytosine-b-D-arabinofuranoside infusion reduces ectopic granule cells in adult rat hippocampus with attenuation of spontaneous recurrent seizures following pilocarpine-induced status epilepticus." European Journal of Neuroscience 19(12): 3219-3226. Jung, M. W. és B. L. Mcnaughton (1993). "Spatial Selectivity of Unit-Activity in the Hippocampal Granular Layer." Hippocampus 3(2): 165-182. Kang, T. C., D. S. Kim, S. E. Kwak, J. E. Kim, M. H. Won, D. W. Kim, S. Y. Choi és O. S. Kwon (2006). "Epileptogenic roles of astroglial death and regeneration in the dentate gyrus of experimental temporal lobe epilepsy." Glia 54(4): 258-271. Karmos, G., M. Molnár, I. Ulbert és B. Weiss (2009). Elektrofiziológiai mérések és protézisek - Egyetemi jegyzet. http://digitus.itk.ppke.hu/~magan/downloads/Education/. Kneisler, T. B. és R. Dingledine (1995). "Synaptic Input From CA3 Pyramidal Cells to Dentate Basket Cells in Rat Hippocampus." Journal of Physiology-London 487(1): 125-146. Knoflach, F., D. Benke, Y. Wang, L. Scheurer, H. Luddens, B. J. Hamilton, D. B. Carter, H. Mohler és J. A. Benson (1996). "Pharmacological modulation of the diazepaminsensitive recombinant gamma-aminobutyric acid(A) receptors alpha 4 alpha 2 gamma 2 and alpha 6 beta 2 gamma 2." Molecular Pharmacology 50(5): 1253-1261. Kohr, G., Y. Dekonick és I. Mody (1993). "Properties of Nmda Receptor Channels in Neurons Acutely Isolated from Epileptic (Kindled) Rats." Journal of Neuroscience 13(8): 3612-3627. Kokaia, M., P. Ernfors, Z. Kokaia, E. Elmer, R. Jaenisch és O. Lindvall (1995). "Suppressed Epileptogenesis in Bdnf Mutant Mice." Experimental Neurology 133(2): 215-224. 91
Kotter, R., D. Schubert, J. Dyhrfjeld-Johnsen, H. J. Luhmann és J. F. Staiger (2005). "Optical release of caged glutamate for stimulation of neurons in the in vitro slice preparation." Journal of Biomedical Optics 10(1): 011003-15. Kotti, T., P. J. Riekkinen és R. Miettinen (1997). "Characterization of target cells for aberrant mossy fiber collaterals in the dentate gyrus of epileptic rat." Experimental Neurology 146(2): 323-330. Koyama, R. és Y. Ikegaya (2004). "Mossy fiber sprouting as a potential therapeutic target for epilepsy." Current Neurovascular Research 1(1): 3-10. Kullmann, D. M. és F. Asztely (1998). "Extrasynaptic glutamate spillover in the hippocampus: evidence and implications." Trends in Neurosciences 21(1): 8-14. Kuo, L. W., C. Y. Lee, J. H. Chen, V. J. Wedeen, C. C. Chen, H. H. Liou és W. Y. I. Tseng (2008). "Mossy fiber sprouting in pilocarpine-induced status epilepticus rat hippocampus: A correlative study of diffusion spectrum imaging and histology." Neuroimage 41(3): 789-800. Lábos, E. (1996). "Az Elektrofiziológia Fejlıdésének Állomásai." Fizikai Szemle 6: 195. Lehmann, T. N., S. Gabriel, A. Eilers, M. Njunting, R. Kovacs, K. Schulze, W. R. Lanksch és U. Heinemann (2001). "Fluorescent tracer in pilocarpine-treated rats shows widespread aberrant hippocampal neuronal connectivity." European Journal of Neuroscience 14(1): 83-95. Lehmann, T. N., S. Gabriel, R. Kovacs, A. Eilers, A. Kivi, K. Schulze, W. R. Lanksch, H. J. Meencke és U. Heinemann (2000). "Alterations of neuronal connectivity in area CA1 of hippocampal slices from temporal lobe epilepsy patients and from pilocarpine-treated epileptic rats." Epilepsia 41: S190-S194. Leite, J. P., N. Garcia-Cairasco és E. A. Cavalheiro (2002). "New insights from the use of pilocarpine and kainate models." Epilepsy Research 50(1-2): 93-103. Liu, Z., T. Nagao, G. C. Desjardins, P. Gloor és M. Avoli (1994). "Quantitative-Evaluation of Neuronal Loss in the Dorsal Hippocampus in Rats with Long-Term Pilocarpine Seizures." Epilepsy Research 17(3): 237-247. Longo, B. M. és L. E. A. M. Mello (1997). "Blockade of pilocarpine- or kainate-induced mossy fiber sprouting by cycloheximide does not prevent subsequent epileptogenesis in rats." Neuroscience Letters 226(3): 163-166. Longo, B. M. és L. E. A. M. Mello (1998). "Supragranular mossy fiber sprouting is not necessary for spontaneous seizures in the intrahippocampal kainate model of epilepsy in the rat." Epilepsy Research 32(1-2): 172-182. Loscher, W. (2002). "Animal models of epilepsy for the development of antiepileptogenic and disease-modifying drugs. A comparison of the pharmacology of kindling and post-status epilepticus models of temporal lobe epilepsy." Epilepsy Research 50(12): 105-123. Loscher, W. és D. Schmidt (2006). "New horizons in the development of antiepileptic drugs: Innovative strategies." Epilepsy Research 69(3): 183-272. Lothman, E. W. (1992). "Basic Mechanisms of the Epilepsies." Current Opinion in Neurology and Neurosurgery 5(2): 216-223. Lothman, E. W., J. L. Stringer és E. H. Bertram (1992). "The Dentate Gyrus as a Control Point for Seizures in the Hippocampus and Beyond." Epilepsy Research: 301-313. Loup, F., H.-G. Wieser, Y. Yonekawa, A. Aguzzi és J.-M. Fritschy (2000). "Selective Alterations in GABAA Receptor Subtypes in Human Temporal Lobe Epilepsy." Journal of Neuroscience 20(14): 5401-5419.
92
Lurton, D., L. Sundstrom, C. Brana, B. Bloch és A. Rougier (1997). "Possible mechanisms inducing granule cell dispersion in humans with temporal lobe epilepsy." Epilepsy Research 26(2): 351-361. Magloczky, Z. és T. F. Freund (2005). "Impaired and repaired inhibitory circuits in the epileptic human hippocampus." Trends in Neurosciences 28(6): 334-340. Martin, D., G. Miller, M. Rosendahl és D. A. Russell (1995). "Potent Inhibitory Effects of Glial Derived Neurotrophic Factor against Kainic Acid-Mediated Seizures in the Rat." Brain Research 683(2): 172-178. Masukawa, L. M., K. Uruno, M. Sperling, M. J. Oconnor és L. J. Burdette (1992). "The Functional-Relationship between Antidromically Evoked Field Responses of the Dentate Gyrus and Mossy Fiber Reorganization in Temporal-Lobe Epileptic Patients." Brain Research 579(1): 119-127. Mathern, G. W., T. L. Babb, J. P. Leite, J. K. Pretorius, K. M. Yeoman és P. A. Kuhlman (1996). "The pathogenic and progressive features of chronic human hippocampal epilepsy." Epilepsy Research 26(1): 151-161. Meldrum, B. S. (1991). "Excitatory Amino-Acid Transmitters in Epilepsy." Epilepsia 32: S1-S3. Mello, L. E. A. M., E. A. Cavalheiro, A. M. Tan, W. R. Kupfer, J. K. Pretorius, T. L. Babb és D. M. Finch (1993). "Circuit Mechanisms of Seizures in the Pilocarpine Model of Chronic Epilepsy - Cell Loss and Mossy Fiber Sprouting." Epilepsia 34(6): 985995. Mello, L. E. A. M. és L. Covolan (1996). "Spontaneous seizures preferentially injure interneurons in the pilocarpine model of chronic spontaneous seizures." Epilepsy Research 26(1): 123-129. Mellor, J. R., K. E. Vogt, G. Tong és R. A. Nicoll (2000). "Zinc release modulates synaptic NMDA receptor function at hippocampal mossy fibre synapses." Journal of Physiology-London 523: 186p-187p. Mendell, L. M., J. B. Munson és J. G. Scott (1976). "Alterations of Synapses on Axotomized Motoneurons." Journal of Physiology-London 255(1): 67-79. Miles, R., R. K. S. Wong és R. D. Traub (1984). "Synchronized Afterdischarges in the Hippocampus - Contribution of Local Synaptic-Interactions." Neuroscience 12(4): 1179-&. Molnar, P. és J. V. Nadler (1999). "Mossy fiber-granule cell synapses in the normal and epileptic rat dentate gyrus studied with minimal laser photostimulation." Journal of Neurophysiology 82(4): 1883-1894. Molnar, P. és J. V. Nadler (2001). "Synaptically-released zinc inhibits N-methyl-Daspartate receptor activation at recurrent mossy fiber synapses." Brain Research 910(1-2): 205-207. Morimoto, K., M. Fahnestock és R. J. Racine (2004). "Kindling and status epilepticus models of epilepsy: rewiring the brain." Progress in Neurobiology 73(1): 1-60. Morzymas, J. W., A. Barberis, K. Michalak és E. Cherubini (1999). "Chlorpromazine inhibits miniature GABAergic currents by reducing the binding and increasing the unbinding rate of GABAA receptors." Journal of Neuroscience 19: 2472-2488. Mott, D. D., C. W. Xie, W. A. Wilson, H. S. Swartzwelder és D. V. Lewis (1993). "Gaba(B) Autoreceptors Mediate Activity-Dependent Disinhibition and Enhance Signal Transmission in the Dentate Gyrus." Journal of Neurophysiology 69(3): 674691.
93
Nadler, J. V. és G. J. Cuthbertson (1980). "Kainic Acid Neurotoxicity toward Hippocampal-Formation - Dependence on Specific Excitatory Pathways." Brain Research 195(1): 47-56. Nadler, J. V. és D. A. Evenson (1989). Use of excitatory amino acids to make axon-sparing lesions of hypothalamus. Neuroendocrine Peptide Methodology. P. M. Conn. San Diego, CA, Academic Press: 881-890. Nehlig, A. (2007). "What is animal experimentation telling us about new drug treatments of status epilepticus?" Epilepsia 48: 78-81. Noyan, B., M. S. Jensen és G. Danscher (2007). "The lack of effects of zinc and nitric oxide in initial state of pilocarpine-induced seizures." Seizure-European Journal of Epilepsy 16(5): 410-416. Obenaus, A., M. Esclapez és C. R. Houser (1993). "Loss of Glutamate-Decarboxylase Messenger-Rna Containing Neurons in the Rat Dentate Gyrus Following Pilocarpine-Induced Seizures." Journal of Neuroscience 13(10): 4470-4485. Okazaki, M. M., D. A. Evenson és J. V. Nadler (1995). "Hippocampal Mossy Fiber Sprouting and Synapse Formation after Status Epilepticus in Rats - Visualization after Retrograde Transport of Biocytin." Journal of Comparative Neurology 352(4): 515-534. Okazaki, M. M., P. Molnar és J. V. Nadler (1999). "Recurrent mossy fiber pathway in rat dentate gyrus: Synaptic currents evoked in presence and absence of seizure-induced growth." Journal of Neurophysiology 81(4): 1645-1660. Orbán-Kis, K., E. Metz és T. Szilágyi (2008). "Állatmodellek jelentısége az epilepszia kutatásában." Orvostudományi Értesítı 81(2): 88-91. Overstreet-Wadiche, L. S., D. A. Bromberg, A. L. Bensen és G. L. Westbrook (2006). "Seizures accelerate functional integration of adult-generated granule cells." Journal of Neuroscience 26(15): 4095-4103. Pan, E. H. és J. L. Stringer (1996). "Burst characteristics of dentate gyrus granule cells: Evidence for endogenous and nonsynaptic properties." Journal of Neurophysiology 75(1): 124-132. Paoletti, P., P. Ascher és J. Neyton (1997). "High-affinity zinc inhibition of NMDA NR1NR2A receptors." Journal of Neuroscience 17(15): 5711-5725. Parent, J. M. (2002). "The role of seizure-induced neurogenesis in epileptogenesis and brain repair." Epilepsy Research 50(1-2): 179-189. Parent, J. M., R. C. Elliott, S. J. Pleasure, N. M. Barbaro és D. H. Lowenstein (2006). "Aberrant seizure-induced neurogenesis in experimental temporal lobe epilepsy." Annals of Neurology 59(1): 81-91. Parent, J. M., E. Tada, J. R. Fike és D. H. Lowenstein (1999). "Inhibition of dentate granule cell neurogenesis with brain irradiation does not prevent seizure-induced mossy fiber synaptic reorganization in the rat." Journal of Neuroscience 19(11): 45084519. Parent, J. M., T. W. Yu, R. T. Leibowitz, D. H. Geschwind, R. S. Sloviter és D. H. Lowenstein (1997). "Dentate granule cell neurogenesis is increased by seizures and contributes to aberrant network reorganization in the adult rat hippocampus." Journal of Neuroscience 17(10): 3727-3738. Patrylo, P. R. és F. E. Dudek (1998). "Physiological unmasking of new glutamatergic pathways in the dentate gyrus of hippocampal slices from kainate-induced epileptic rats." Journal of Neurophysiology 79(1): 418-429. Paxinos, G. és C. Watson (1986). The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. San Diego, Academic Press 94
Pierce, J. P., M. Punsoni, D. P. McCloskey és H. E. Scharfman (2007). "Mossy cell axon synaptic contacts on ectopic granule cells that are born following pilocarpineinduced seizures." Neuroscience Letters 422(2): 136-140. Polack, P. O., I. Guillemain, E. Hu, C. Deransart, A. Depaulis és S. Charpier (2007). "Deep layer somatosensory cortical neurons initiate spike-and-wave discharges in a genetic model of absence seizures." Journal of Neuroscience 27(24): 6590-6599. Poulter, M. O., L. A. Brown, S. Tynan, G. Willick, R. William és D. C. McIntyre (1999). "Differential expression of alpha(1), alpha(2), alpha(3), and alpha(5) GABA(A) receptor subunits in seizure-prone and seizure-resistant rat models of temporal lobe epilepsy." Journal Of Neuroscience 19(11): 4654-4661. Purves, D. (1975). "Functional and Structural-Changes in Mammalian Sympathetic Neurons Following Interruption of Their Axons." Journal of Physiology-London 252(2): 429-&. Purves, D., G. J. Augustine, D. Fitzpatrick, W. C. Hall, A.-S. Lamantia, J. O. McNamara és S. M. Williams (2004). Neuroscience. New York, Sinauer Associates. Quinta-Ferreira, M. E., C. M. Matias, M. Arif és J. C. Dionisio (2000). "Zinc signals associated with mossy fiber LTP in area CA3 of the hippocampus." European Journal of Neuroscience 12: 459-459. Racine, R. J. (1972). "Modification of Seizure Activity by Electrical Stimulation .2. Motor Seizure." Electroencephalography and Clinical Neurophysiology 32(3): 281-&. Radley, J. J. és B. L. Jacobs (2003). "Pilocarpine-induced status epilepticus increases cell proliferation in the dentate gyrus of adult rats via a 5-HT1A receptor-dependent mechanism." Brain Research 966(1): 1-12. Ratzliff, A. D. H., A. L. Howard, V. Santhakumar, I. Osapay és I. Soltesz (2004). "Rapid deletion of mossy cells does not result in a hyperexcitable dentate gyrus: Implications for epileptogenesis." Journal of Neuroscience 24(9): 2259-2269. Ribak, C. E. (1985). "2 Different Abnormal Gabaergic Circuits in Experimental-Models of Epilepsy - Loss of Inhibition and Disinhibition." Epilepsia 26(5): 525-525. Ribak, C. E. és K. Dashtipour (2002). "Neuroplasticity in the damaged dentate gyrus of the epileptic brain." Progress in Brain Research 136: 319-328. Ribak, C. E. és G. M. Peterson (1991). "Intragranular mossy fibers in rats and gerbils from synapses with the somata and proximal dendrites of basket cells in the dentate gyrus." Hippocampus 1(4): 355-364. Ribak, C. E., L. Seress, P. Weber, C. J. Epstein, T. R. Henry és R. A. E. Bakay (1998). "Alumina gel injections into the temporal lobe of rhesus monkeys cause complex partial seizures and morphological changes found in human temporal lobe epilepsy." THE JOURNAL OF COMPARATIVE NEUROLOGY 401(2): 266-290. Salin, P. A., M. Scanziani, R. C. Malenka és R. A. Nicoll (1996). "Distinct short-term plasticity at two excitatory synapses in the hippocampus." Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 93(23): 1330413309. Sanabria, E. R. G., A. V. da Silva, R. Spreafico és E. A. Cavalheiro (2002). "Damage, reorganization, and abnormal neocortical hyperexcitability in the pilocarpine model of temporal lobe epilepsy." Epilepsia 43: 96-106. Sanchez, R. M., S. Koh, C. Rio, C. Wang, E. D. Lamperti, D. Sharma, G. Corfas és F. E. Jensen (2001). "Decreased Glutamate Receptor 2 Expression and Enhanced Epileptogenesis in Immature Rat Hippocampus after Perinatal Hypoxia-Induced Seizures." Journal of Neuroscience 21(20): 8154-8163.
95
Sankar, R., D. H. Shin, H. T. Liu, A. Mazarati, A. P. de Vasconcelos és C. G. Wasterlain (1998). "Patterns of status epilepticus-induced neuronal injury during development and long-term consequences." Journal of Neuroscience 18(20): 8382-8393. Santhakumar, V., I. Aradi és I. Soltesz (2005). "Role of mossy fiber sprouting and mossy cell loss in hyperexcitability: A network model of the dentate gyrus incorporating cell types and axonal topography." Journal of Neurophysiology 93(1): 437-453. Sarkisov, D. V. és S. S.-H. Wang (2007). Combining Uncaging Techniques with PatchClamp Recording and Optical Physiology. Patch-Clamp Analysis: Advanced Techniques W. Walz. Totowa, NJ, Humana Press. 38. Sato, K., K. Morimoto, M. Okamoto, Y. Nakamura, S. Otsuki és M. Sato (1990). "An Analysis of Anticonvulsant Actions of Gaba Agonists (Progabide and Baclofen) in the Kindling Model of Epilepsy." Epilepsy Research 5(2): 117-124. Saxena, N. C. és R. L. Macdonald (1994). "Assembly of Gaba(a) Receptor Subunits - Role of the Delta-Subunit." Journal of Neuroscience 14(11): 7077-7086. Scharfman, H., J. Goodman és D. McCloskey (2007). "Ectopic granule cells of the rat dentate gyrus." Developmental Neuroscience 29(1-2): 14-27. Scharfman, H. E. (1994a). "Epsps of Dentate Gyrus Granule Cells during Epileptiform Bursts of Dentate Hilar Mossy Cells and Area Ca3 Pyramidal Cells in Disinhibited Rat Hippocampal Slices." Journal of Neuroscience 14(10): 6041-6057. Scharfman, H. E. (1994b). "Synchronization of Area Ca3 Hippocampal Pyramidal Cells and Non-Granule Cells of the Dentate Gyrus in Bicuculline-Treated Rat Hippocampal Slices." Neuroscience 59(2): 245-257. Scharfman, H. E. (1995). "Electrophysiological Evidence That Dentate Hilar Mossy Cells Are Excitatory and Innervate Both Granule Cells and Interneurons." Journal of Neurophysiology 74(1): 179-194. Scharfman, H. E., J. H. Goodman és A. L. Sollas (1999). "Actions of brain-derived neurotrophic factor in slices from rats with spontaneous seizures and mossy fiber sprouting in the dentate gyrus." Journal of Neuroscience 19(13): 5619-5631. Scharfman, H. E., J. H. Goodman és A. L. Sollas (2000). "Granule-like neurons at the hilar/CA3 border after status epilepticus and their synchrony with area CA3 pyramidal cells: Functional implications of seizure-induced neurogenesis." Journal of Neuroscience 20(16): 6144-6158. Scharfman, H. E., J. H. Goodman, A. L. Sollas és S. D. Croll (2002). "Spontaneous limbic seizures after intrahippocampal infusion of brain-derived neurotrophic factor." Experimental Neurology 174(2): 201-214. Scharfman, H. E. és P. A. Schwartzkroin (1989). "Protection of Dentate Hilar Cells from Prolonged Stimulation by Intracellular Calcium Chelation." Science 246(4927): 257-260. Scharfman, H. E. és P. A. Schwartzkroin (1990). "Consequences of Prolonged Afferent Stimulation of the Rat Fascia-Dentata - Epileptiform Activity in Area-Ca3 of Hippocampus." Neuroscience 35(3): 505-517. Scharfman, H. E., A. L. Sollas, R. E. Berger és J. H. Goodman (2003). "Electrophysiological evidence of monosynaptic excitatory transmission between granule cells after seizure-induced mossy fiber sprouting." Journal of Neurophysiology 90(4): 2536-2547. Schwarcz, R., H. Scharfman és E. H. Bertram (2002). Temporal lobe epilepsy: Renewed emphasis on extrahippocampal areas. Neuropsychopharmacology: The Fifth Generation of Progress. K. L. Davis, D. Charney, J. T. Coyle and C. Nemeroff. Philadelphia, Lippincott Williams & Wilkins. 96
Shapiro, L. A., S. Figueroa-Aragon és C. E. Ribak (2007). "Newly generated granule cells show rapid neuroplastic changes in the adult rat dentate gyrus during the first five days following pilocarpine-induced seizures." European Journal of Neuroscience 26(3): 583-592. Shapiro, L. A., C. E. Ribak és S. Jessberger (2008). "Structural changes for adult-born dentate granule cells after status epilepticus." Epilepsia 49: 13-18. Sharma, A. K., R. Y. Reams, W. H. Jordan, M. A. Miller, H. L. Thacker és P. W. Snyder (2007). "Mesial temporal lobe epilepsy: Pathogenesis, induced rodent models and lesions." Toxicologic Pathology 35(7): 984-999. Shetty, A. K. és D. A. Turner (1998). "Hippocampal interneurons expressing glutamic acid decarboxylase and calcium-binding proteins decrease with aging in Fischer 344 rats." Journal of Comparative Neurology 394(2): 252-269. Shumate, M. D., D. D. Lin, J. W. Gibbs, K. L. Holloway és D. A. Coulter (1998). "GABA(A) receptor function in epileptic human dentate granule cells: comparison to epileptic and control rat." Epilepsy Research 32(1-2): 114-128. Siddiqui, A. H. és S. A. Joseph (2005). "CA3 axonal sprouting in kainate-induced chronic epilepsy." Brain Research 1066(1-2): 129-146. Silva, J. G. és L. E. A. M. Mello (2000). "The role of mossy cell death and activation of protein synthesis in the sprouting of dentate mossy fibers: Evidence from calretinin and neo-timm staining in pilocarpine-epileptic mice." Epilepsia 41: S18-S23. Simeone, T. A., S. D. Donevan és J. M. Rho (2003). "Molecular biology and ontogeny of gamma-aminobutyric acid (GABA) receptors in the mammalian central nervous system." Journal of Child Neurology 18(1): 39-48. Simmons, M. L., G. W. Terman és C. Chavkin (1997). "Spontaneous excitatory currents and kappa-opioid receptor inhibition in dentate gyrus are increased in the rat pilocarpine model of temporal lobe epilepsy." Journal of Neurophysiology 78(4): 1860-1868. Sloviter, R. S. (1987). "Decreased Hippocampal Inhibition and a Selective Loss of Interneurons in Experimental Epilepsy." Science 235(4784): 73-76. Sloviter, R. S. (1994). "The Functional-Organization of the Hippocampal Dentate Gyrus and Its Relevance to the Pathogenesis of Temporal-Lobe Epilepsy." Annals of Neurology 35(6): 640-654. Sloviter, R. S., C. A. Zappone, B. D. Harvey, A. V. Bumanglag, R. A. Bender és M. Frotscher (2003). "Dormant basket cell hypothesis revisited: Relative vulnerabilities of dentate gyrus mossy cells and inhibitory interneurons after hippocampal status epilepticus in the rat." THE JOURNAL OF COMPARATIVE NEUROLOGY 459(1): 44-76. Spencer, S. S. (2002). "Neural networks in human epilepsy: Evidence of and implications for treatment." Epilepsia 43(3): 219-227. Stief, F., W. Zuschratter, K. Hartmann, D. Schmitz és A. Draguhn (2007). "Enhanced synaptic excitation-inhibition ratio in hippocampal interneurons of rats with temporal lobe epilepsy." European Journal of Neuroscience 25(2): 519-528. Suter, K. J., B. N. Smith és F. E. Dudek (1999). "Electrophysiological Recording from Brain Slices." METHODS: A Companion to Methods in Enzymology 18: 86-90. Sutula, T. P., J. Hagen és A. Pitkanen (2003). "Do epileptic seizures damage the brain?" Current Opinion in Neurology 16(2): 189-195. Tauck, D. L. és J. V. Nadler (1985). "Evidence of Functional Mossy Fiber Sprouting in Hippocampal-Formation of Kainic Acid-Treated Rats." Journal of Neuroscience 5(4): 1016-1022. 97
Timofeeva, O. és J. V. Nadler (2006). "Facilitation of granule cell epileptiform activity by mossy fiber-released zinc in the pilocarpine model of temporal lobe epilepsy." Brain Research 1078: 227-234. Traub, R. D., J. G. R. Jefferys és M. A. Whittington (1994). "Enhanced Nmda Conductance Can Account for Epileptiform Activity-Induced by Low Mg2+ in the Rat Hippocampal Slice." Journal of Physiology-London 478(3): 379-393. Traub, R. D., W. D. Knowles, R. Miles és R. K. S. Wong (1984). "Synchronized Afterdischarges in the Hippocampus - Simulation Studies of the Cellular Mechanism." Neuroscience 12(4): 1191-1200. Traub, R. D., W. D. Knowles, R. Miles és R. K. S. Wong (1987). "Models of the Cellular Mechanism Underlying Propagation of Epileptiform Activity in the Ca2-Ca3 Region of the Hippocampal Slice." Neuroscience 21(2): 457-470. Turski, L., C. Ikonomidou, W. A. Turski, Z. A. Bortolotto és E. A. Cavalheiro (1989). "Review - Cholinergic Mechanisms and Epileptogenesis - the Seizures Induced by Pilocarpine - a Novel Experimental-Model of Intractable Epilepsy." Synapse 3(2): 154-171. van Luijtelaar, G. és E. Sitnikova (2006). "Global and focal aspects of absence epilepsy: The contribution of genetic models." Neuroscience and Biobehavioral Reviews 30(7): 983-1003. Vogt, K., J. Mellor, G. Tong és R. Nicoll (2000). "The actions of synaptically released zinc at hippocampal mossy fiber synapses." Neuron 26(1): 187-196. Weisskopf, M. G. és R. A. Nicoll (1995). "Presynaptic Changes during Mossy Fiber Ltp Revealed by Nmda Receptor-Mediated Synaptic Responses." Nature 376(6537): 256-259. Williams, P. A., A. M. White, S. Clark, D. J. Ferraro, W. Swiercz, K. J. Staley és F. E. Dudek (2009). "Development of Spontaneous Recurrent Seizures after KainateInduced Status Epilepticus." Journal of Neuroscience 29(7): 2103-2112. Wu, X. P., A. A. Sosunov és G. M. Mckhann (2007). "Pro-epileptogenic alterations in reactive astrocytes in the rat pilocarpine model of epilepsy." Epilepsia 48: 271-271. Wuarin, J. P. és F. E. Dudek (1996). "Electrographic seizures and new recurrent excitatory circuits in the dentate gyrus of hippocampal slices from kainate-treated epileptic rats." Journal of Neuroscience 16(14): 4438-4448. Xu, B., B. Michalski, R. J. Racine és M. Fahnestock (2002). "Continuous infusion of neurotrophin-3 triggers sprouting, decreases the levels of TrkA and TrkC and inhibits epileptogenesis and activity-dependent axonal growth in adult rats." Neuroscience 115(4): 1295-1308. Zorumski, C. F. és J. Yang (1988). "Non-Competitive Inhibition of Gaba Currents by Phenothiazines in Cultured Chick Spinal-Cord and Rat Hippocampal-Neurons." Neuroscience Letters 92(1): 86-91.
98
10 SAJÁT PUBLIKÁCIÓS JEGYZÉK 10.1 A PhD disszertáció témájául szolgáló referált közlemények 1. Okazaki, M., P. Molnar és J. V. Nadler, “Recurrent mossy fiber pathway in the rat dentate gyrus: synaptic currents evoked in the presence and absence of seizureinduced growth,” J. Neurophysiol. 81:1645-1660 (1999). 2. Molnar P. és J. V. Nadler, “Mossy fiber - granule cell synapses studied with whole cell patch clamp recording and laser photostimulation,” J. Neurophysiol. 82:18831894 (1999). 3. Molnar P. és J. V. Nadler, “O-(CNB-caged) GABA selectively blocks inhibitory synaptic transmission in rat hippocampal slices,” Eur. J. Pharmacol. 391:255-262 (2000). 4. Molnar P. és J. V. Nadler, “Lack of effect of mossy fiber-released zinc on postsynaptic GABAA receptors in the pilocarpine model of epilepsy,” J. Neurophysiol. 85:1932-40 (2001). 5. Molnar P. és J. V. Nadler, “Synaptically-released zinc inhibits N-methyl-Daspartate receptor activation at recurrent mossy fiber synapses,” Brain Res. 910:205-207 (2001). 6. Feng, L. P. Molnar és J. V. Nadler: Short-Term Frequency-Dependent Plasticity at Recurrent Mossy Fiber Synapses of the Epileptic Brain. J. Neurosci. 23. 5381-5390 (2003).
10.2 A PhD disszertáció témájául szolgáló konferencia összefogalók 1. Molnár, P. és J.V. Nadler: Mossy fiber - granule cell synapses studied with whole cell patch clamp recording and laser photostimulation (27th. Annual meeting of American Neuroscience Association, New Orleans, USA, 1997).
99
10.3 Egyéb referált közlemények 1. Gaál L. és P. Molnár, “Effects of vinpocetine on noradrenergic neurons in rat locus coeruleus,” Eur. J. Pharmacol. 187:537-539 (1990). 2. Molnár P. és L. Gaál, “Effect of different subtypes of cognition enhancers on longterm potentiation in the rat dentate gyrus in vivo,” Eur. J. Pharmacol. 215:17-22 (1992). 3. Tarnawa, I., P. Molnár, L. Gaál, és F. Andrási, “Inhibition of hippocampal field potentials by GYKI 52466 in vitro és in vivo,” Acta Physiol. Hungarica 79:169-175 (1992). 4. Molnár P., L. Gaál, és Cs. Horváth, “The impairment of long-term potentiation in rats with medial septal lesion és its restoration by cognition enhancers,” Neurobiology 2:255-266 (1994). 5. Maksay G., P. Molnár, és L. Gruber, “Common modes of action of g butyrolactones and pentylenetetrazol on the convulsant és benzodiazepine sites and channel activity of the GABA receptor-ionophore complex,” Eur. J. Pharmacol. Mol. Pharmacol.Sect. 288:61-68 (1994). 6. Molnár P. és S.L. Erdı, “Vinpocetine is as potent as phenytoin in blocking voltagegated sodium channels in rat cortical neurons,” Eur. J. Pharmacol. 273:303-306 (1995). 7. Lakics V., P. Molnár, és S.L. Erdı, “Protection against veratridine toxicity in rat cortical neurons: relationship to sodium channel blockade,” Neuroreport 7:89-92 (1995). 8. Maksay G., P. Molnár, és M. Simonyi, “Thermodinamics and kinetics of tbutylbicyclophosphorothionate binding differentiate convulsant and depressant barbiturate stereoisomers acting via GABAA ionophores,” Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology 353:306-13 (1996). 9. Molnár P. és S.L. Erdı, “Differential effects of five glycine site antagonists on NMDA receptor desensitization,” Eur. J. Pharmacol. 311:311-314 (1996). 10. Erdı S.L., P. Molnár, V. Lakics, J.Zs. Bence, és Zs. Tömösközi, “Vincamin and vincanol are potent blockers of voltage-gated Na channels,” Eur. J. Pharmacol. 314:69-73 (1996).
100
11. Das, M., P. Molnar, H. Devaraj, M. Poeta és J. J. Hickman: Electrophysiological and morphological characterization of rat embryonic motoneurons in a defined system. Biotechnology Progress 19. 1756-1761 (2003) 12. Das, M., P. Molnar, C. Gregory, L. M. Riedel és J. J. Hickman: Long-term culture of embryonic rat cardiomyocytes on organosilane surface in serum-free media. Biomaterials, 25: 5643-47 (2004) 13. Natarajan, A., P. Molnar, K. Sieverdes, A. Jamshidi és J.J. Hickman: Microelectrode array recordings of cardiac action potentials as a high throughput method to evaluate pesticide toxicity. In Vitro Toxicology, 20 (3): 375-81 (2005) 14. Mohan, D. K., P. Molnar, és J. J. Hickman: Toxin detection based on action potential shape analysis using a realistic mathematical model of differentiated NG108-15 cells. Biosensors and Bioelectronics, 21 (9): 1804-11 (2006) 15. Das M, Bhargava N, Gregory C, Riedel L, Molnar P és Hickman JJ. Adult Rat Spinal Cord Culture on an Organosilane Surface in a Novel Serum-Free Medium. In Vitro – Animal, 41 (10): 343-8 (2005) 16. Peng, P.L., Zhong, X., Tu W., Soundarapandian, M.M., Molnar, P. Zhu D., Lau L., Liu S. , Liu F. és Lu Y.M. ADAR2-Dependent RNA Editing of AMPA Receptor Subunit GluR2 Determines Vulnerability of Neurons in Forebrain Ischemia. Neuron, 49, 719-733 (2006). 17. Xu, T., C. Gregory, P. Molnar, S. Jalota, S. B. Bhaduri, T. Boland: Viability and Electrophysiology of Neural Cell Structures made by the Inkjet Printing. Biomaterials, 27, 3580-3588. (2006) 18. Das M., C. Gregory, P. Molnar, L. M. Riedel és J. J. Hickman: A Defined System to Allow Skeletal Muscle Differentiation and Subsequent Integration with Silicon Microstructures. Biomaterials. 27, 4374-80 (2006) 19. Molnar P., W. Wang, A. Natarajan, J. W. Rumsey és J. J. Hickman: Photolithographic Patterning of C2C12 Myotubes using Vitronectin as Growth Substrate in Serum-Free Medium. Biotechnology Progress, 23: 265-268 (2007) 20. Wilson K. A., P. Molnar és J. J. Hickman: Integration of functional myotubes with a Bio-MEMS device for non-invasive interrogation. Lab on a Chip, 7, 920-922 (2007)
101
21. Das, M., K. Wilson, P. Molnar, és J. J. Hickman: Differentiation of skeletal muscle and integration of myotubes with silicon microstructures using serum-free medium and a synthetic silane substrate. Nature Protocols, 2, 1795-1801. (2007) 22. Das, M., J. W. Rumsey, C. A. Gregory, N. Bhargava, J. F. Kang, P. Molnar, L. Riedel, X. Guo és J. J. Hickman: Embryonic motoneuron-skeletal muscle co-culture in a defined system. Neuroscience, 146. 481-488 (2007) 23. Rumsey, J. W., M. Das, J. F. Kang, R. Wagner, P. Molnar és J. J. Hickman: Tissue engineering
intrafusal
fibers:
Dose-
and
time-dependent
differentiation.
Biomaterials. 29. 994-1004 (2008) 24. Ramalingam, M., P. Molnar, K. P. Rao és J. J. Hickman: Biomaterial Surface patterning utilizing self assembled monolayers to control neuronal cell behavior. International Journal of Biomedical Engineering and Technology. 2, 104 - 134 (2009) 25. Natarajan
A.,
C.J.
Chun,
J.J.
Hickman
és
P.
Molnar:
Growth
and
Electrophysiological Properties of Rat Embryonic Cardiomyocytes on Hydroxyland Carboxyl-Modified Surfaces. Journal of Biomaterials Science: Polymer Edition. 19, 1319-31 (2008) 26. Rolland, J., K. , K. S. Lee, L. A. Mahmood, L. Fluck, J. Duarte, I. Kaya, A. Santhanam, P. Meemon, S. Murali, O. Ilegbusi, P. Kupelian, W. Warren, P. Molnar, J. J. Hickman és P. E. Kolattukudy. " Collaborative Engineering: 3-D Optical Imaging and Gas Exchange Simulation of In-Vitro Alveolar Constructs." Studies in health technology and informatics 132: 426-432. (2008) 27. Thakore, V., A. Behal, P. Molnar, D. Leistritz és J.J. Hickman, Nanoscale Nonlinear Dynamic Characterization of the Neuron-Electrode Junction. Journal of Computational and Theoretical Nanoscience, 5, 2164-2169 (2008) 28. Liu, J., J.W. Rumsey, M. Das, P. Molnar, C. Gregory, L. Riedel, et al., Electrophysiological and immunocytochemical characterization of DRG neurons on an organosilane surface in serum-free medium. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Animal. 44(5-6): p. 162-168. (2008) 29. Varghese, K., M. Das, N. Bhargava, M. Stancescu, P. Molnar, M. S. Kindy és J. J. Hickman: Regeneration and characterization of adult mouse hippocampal neurons in a defined in vitro system . Journal of Neuroscience Methods: 177, 51-59 (2009)
102
30. Dhir, V., A. Natarajan, M. Stancescu, A. Chunder, N. Bhargava, M. Das, L. Zhai, P. Molnar: Patterning of diverse mammalian cell types in serum free medium with photoablation. Biotechnology Progress: 25, 594-603 (2009) 31. Xu, T., P. Molnar, C. Gregory, M. Das, T. Boland és J.J. Hickman: Electrophysiological characterization of embryonic hippocampal neurons cultured in a 3D collagen hydrogel. Biomaterials. In Press (2009)
10.4 Egyéb konferencia összefoglalók 1. Kang J-F, M. Poeta, L. Riedel, M. Das, C. Gregory, P. Molnar és J. J. Hickman, “Patterned Neuronal Networks for Robotics, Neurocomputing, Toxin Detection and Rehabilitation,” Proceeding of 24th Army Science Conference, Nov. 29th, 2004. 2. Hickman, JJ, Das, M., Kang, J-F, Chun, ChJ, Molnar, P., Wilson, K., Varghese, K. és Leistritz, D.: Hybrid Biological / Non-biological Systems for Toxin Detection, Functional Drug Screening and as Disease Models. Florida Tech Transfer Conference, Orlando, May 2005. Regional 3. Das, M., Bhargava, N., Patil, S., Riedel, L., Molnar, P., Seal, S. és Hickman, J.J.: Novel In Vitro Cell Culture Model of Adult Mammalian Spinal Cord Cells. In vitro Biology Meeting, Baltimore, June 2005, International 4. Molnar, P., Mohan, D.K. és Hickman, J.J.: Toxin detection based on action potential shape analysis using a realistic mathematical model of differentiated NG108-15 cells. Society for Neuroscience, Washington, November, 2005, International 5. Hickman, J.J., Molnar, P., Das, M., Riedel, L., Kang, J-F., Chun, ChJ. és Wilson, K.: Patterned Neuronal Networks for High-Throughput Functional Drug Screening and for Functional Models of Neurodegenerative Diseases. Society for Neuroscience, Washington, November, 2005, International 6. Molnar, P. és Hickman, J.J.: Engineered Neuronal Networks. Winter conference on neuronal plasticity. Guadeloupe, February, 2005, International 7. Mitchell P.O., Molnar, P., Gourdie R.G., Borg, T.K. és Gao, B.Z.: FibroblastMyocyte Electrical Coupling in a Micropatterned Cell Coculture Biomedical Engineering Society, Baltimore, September, 2005. International
103
8. Kerry A. Wilson, Mainak Das, Peter Molnar, és J. J. Hickman: Reflex-arc on a chip: An in silico cell culture analog American Chemical Society Meeting & Exposition. March 26 - 30, 2006. Atlanta, GA USA 9. Peter Molnar, Melissa Kuchma, Anupama Natarajan, Jung-Fong Kang, Neelima Bhargava, Mainak Das és J. J. Hickman: Photolithographical patterning of single cells and cell assemblies on commercial multielectrode arrays. 5th MEA meeting on Substrate Embedded Microelectrode Arrays, July 04-07, 2006, Reutlingen, Germany, 10. Peter Molnar, Jung-Fong Kang, Neelima Bhargava, Mainak Das, Anupama Natarajan és James J. Hickman: Design, implementation and characterization of engineered neuronal networks. FENS Forum, July 8-12, 2006, Vienna, Austria 11. Peter Molnar, Jung-Fong Kang, Neelima Bhargava, Mainak Das, Anupama Natarajan és James J. Hickman: Characterization and applications of engineered neuronal networks. 36th Annual Meeting of the Society for Neuroscience, October 14-18, 2006 Atlanta, GA 12. Thakore, V., A. Behal, P. Molnar, D. C. Leistritz és J. J. Hickman: Nonlinear dynamic characterization of the neuron-electrode interface. 36th Annual Meeting of the Society for Neuroscience, October 14-18, 2006 Atlanta, GA 13. Kerry A. Wilson, Mainak Das, J. W. Rumsey, Peter Molnar, és J. J. Hickman: A Bio-MEMS Device for Modeling the Reflex-arc. 53rd Annual conference of the American Vacuum Society Meeting. Novemver 12-17, 2006. San Francisco, 14. Peter Molnar, Neelima Bhargava, Mainak Das, Anupama Natarajan, Kerry Wilson és James J. Hickman: Integration of living cells with silicon nanostructures for MEMS applications. NSTI Nanotech 10th Annual Conference. May 20-24, 2007 Santa Clara, CA, USA 15. Vipra Dhir, Anupama Natrajan, Anindarupa Chunder, Neelima Bhargava, Mainak Das, Lei Zhai, Peter Molnar: Micropatterned self assembled polyelectrolyte based cytophobic coatings. 234th ACS National Meeting, August 19-23, 2007. Boston, MA, USA 16. Anupama Natarajan, Peter Molnar, Neelima Bhargava, Vipra Dhir, Mainak Das, Kucku Varghese és James J Hickman: Surface modification and photolithographic patterning of microelectrode arrays for cell-based biosensor applications. 234th ACS National Meeting, August 19-23, 2007. Boston, MA, USA 104
17. Vipra Dhir, Anupama Natrajan, Anindarupa Chunder, Lei Zhai, Peter Molnar: Micropatterning cardiac myocytes on self assembled polyelectrolyte multilayers Materials Science Society 2007 Fall Meeting, November 26 - 30, 2007, Boston, MA, USA 18. Kerry A. Wilson, Mainak Das, Peter Molnar, Kathy J. Wahl, Richard J. Colton és James J. Hickman: A Bio-MEMS Device for Measuring Contractile Forces of Cultured Myotubes on Microfabricated Cantilevers. AVS 54th International Symposium October 14-19, 2007, Seattle, USA 19. Anupama Natarajan, Neelima Bhargava, Peter Molnar, Mainak Das, James J. Hickman: Surface Modification and Photolithographic Patterning of Microelectrode Arrays for Cell-Based Biosensor Applications. AVS 54th International Symposium October 14-19, 2007, Seattle, USA
105
