PAPÍRKROMATOGRÁFIA Állófázis: speciális szűrőpapír, illetve erre a papírra felvitt oldószer, a cellulózon megkötött víz képezi a megosztó fázist. Mozgófázis: szerves oldószerek és vizes puffer oldatok. Mintafelvitel: mikropipetta segítségével egy papírcsík szélén lévő jelre visszük fel, beszárítjuk, majd a papírcsík végét egész szélességében az oldószerbe merítjük.
Ha a papírcsík az oldószert tartalmazó edényből lefelé lóg, az oldószer a papírcsíkon lefelé halad, leszálló kromatográfiának hívjuk. Ennek ellentétje a felszálló kromatográfia, ez esetben az oldószer csak a kapilláris erők hatására felfelé mozog.
Kifejlesztés: Az előrevándorló oldószer magával mossa a különböző sebességgel mozgó komponenseket, amelyek így fokozatosan elkülönülnek egymástól. A futtatást akkor kell befejezni, mikor az oldószer a papírcsík végéhez közeledik.
Felszálló módszer
Felszálló kromatográfia
A kapilláris jelenség egyensúlyi viszonyai Egyensúly: a görbült felület miatti nyomáscsökkenés = a folyadékoszlop hidrosztatikai nyomása.
Kapilláris erő h = 2γcosθ ρgr
h = folyadék oszlop magassága (m) γ = felületi feszültség (J/m2 vagy N/m) θ = nedvesítés szöge, meniszkusz éle és a fal közötti szög ρ = sűrűség (kg/m3) g = gravitációs gyorsulás (m/s2) r = kapilláris sugár (m)
Kapilláris üvegcsőben a vízoszlop magassága (levegőn, légköri nyomáson, 20 0C-on): γ = 0.0728 J/m2 θ = 20° ρ = 1000 kg/m3 g = 9.8 m/s2 Ha r = 1 cm h = 1,4 mm r = 0,1 mm h = 14 cm
A vegyületek papírkromatográfiás azonosítását (kvalitatív analízis) megkönnyíti a retenciós faktor (Rf), amely a kromatográfiás eljárás során a vegyület által és a mozgó fázis által megtett utak hányadosa, tehát értéke 0,00 (a vegyület a start-ponton marad) és 1,00 (a vegyület a fronton fut) között változhat. RfA = a RfB = b c c c = az oldószer által megtett út Az Rf érték nagysága egy anyagra jellemző, bár abszolút értéke sok tényezőtől függ.
Rf számolás
Oldószerek jellemzői A, Egyfázisú - vízzel korlátlanul elegyedő (metil-, etilalkohol, aceton, piridin). B, Kétfázisú - vízzel csak korlátozottan elegyedő (butanol vízzel, vagy ecetsavval telítve). Oldószerek kiválasztásának szempontjai: Szétválasztandó anyag Rf értéke 0,10 és 0,90 között legyen. Vizsgált mintakomponens ne változzon. Megoszlási egyensúly hamar beálljon folt alakja ne változzon a futtatás alatt. Kifejlesztés ideje 2-8 óra között legyen. Mintafelvitel: 5-20 μl mikropipettával, vagy Hamilton fecskendővel, pontszerűen a startvonalra. Beszárítás.
Kifejlesztés
Kromatografáló edény: saválló, átlátszó és zárt, általában üveg.
1. A kifejlesztés előtt a papírt telíteni kell az oldószer
gőzeivel (kb. 20% vizet köt meg és ezzel kialakul a megosztó állófázis). 2. Papír behelyezése a mozgófázisba. 3. Futtatás, amíg 1 cm-re megközelíti az oldószerfront a papír végét. Fontos az állandó T. Standard oldatokat együtt futtatjuk a vizsgált mintakomponensekkel – minőségi meghatározás Rf értékek alapján.
front megjelölése után a kromatogramot előhívjuk. Ez rendszerint úgy történik, hogy a színreakciót előidéző reagensoldatot egy porlasztóval a papírra fújjuk. Mennyiségi meghatározás: A, A foltokat kivágva és a komponenseket extrahálva spektrofotometriásan (elúciós módszer). B, A papíron levő foltokat „leolvashatjuk”: denzitométerrel (UV és látható fény); radiográfiásan (fotópapír, vagy Geiger-Müller számláló). A papírkromatográfia felhasználási területe széles, használható szerves (növényi pigmentek, redukáló cukrok, aminosavak) és szervetlen anyagok (kationok, anionok) kimutatására. Legfőbb előnye az egyszerű és olcsó méréstechnika. A
A klorofill-a és klorofill-b szétválasztása papírkromatográfiával
A klorofillok oldékonysági tulajdonságaik alapján a
többi színanyagtól elkülöníthetők. A klorofill-a és klorofill-b papírkromatográfiával acetont tartalmazó petroléterben könnyen elválasztható. A futtatás frontvonalán (a futtatószer futási magasságában) a karotinoidok sárga foltja is látható.
A klorofill-a molekula egyik metilcsoportja helyett
a klorofill-b polárosabb formilcsoportot tartalmaz. A két anyag Rf értéke, színe és abszorpciós maximuma különbözik. A klorofill-a fut magasabbra, foltja kékeszöld, etanolos oldatának abszorpciós maximuma 660-670 nm. A klorofill-b foltja sárgászöld, etanolos oldatának abszorpciós maximuma 630-640 nm.
Tejsavas erjedés vizsgálata borokban
Almasav ---> Tejsav + szén-dioxid COOH-HOHC-H2C-COOH ---> CH3-CHOH-COOH + CO2 MLF 100 ml d.víz+ 100 ml n-butanol+ 11 ml cc. hangyasav+bromkrezol-zöld indikátor összerázni, vizes fázist eldobni, szervest használni a futtatáshoz 8óra.
Chargaff szabály A=T, G=C
VRK - Kromatográfiás állófázisok Hordozólapra (üveglap, alumíniumlemez) felvitt
(0,1-0,25 mm vastagság): Szilikagél (lsd. adszorpciós kromatográfia) Aluminium-oxid adszorpció (bázikus anyagok: alkaloidok, aminok; szteroidok, terpének, alifás- és aromás szénhidrogének) Kieselguhr – diatomaföld, mely a kova-moszatok páncéljából képződött, amorf kovasav. 70-95% SiO2, aluminium-, vas- alkáli- és alkáliföldfémoxidok. Magnézium-szilikátok - Florisil Cellulóz (lsd. megoszlási kromatográfia, papírkromatográfia) megoszlás
Kromatográfiás állófázisok Módosított szilikagél (lsd. nagyhatékonyságú
folyadékkromatográfia - HPLC): - fordított krom. (RP-8, RP-18) megoszlás - normál krom. (DIOL, CN) megoszlás Ioncserélők (lsd. Ioncsere kromatográfia) ioncsere CM-cellulóz, DEAE-cellulóz kémiailag kötött fázisok
Kromatográfiás állófázisok
Gélkromatográfiás anyagok – méretkizárásos kromatográfia Dextrán gélek – Sephadex G (részecskeméret 10-40 μm) Poliakrilamid – BioGel P
Szilikagél Kötőanyaggal 5-10% gipsz (G) 3% keményítő
Kötőanyag nélkül(H) Makropórusos változatát gélszűrésre használják.
Fajlagos felület: 300 – 600 m2/g Átlagos pórusátmérő: 40 – 150 Å Stabilitás: 1-8 pH
Szilikagél felülete Víz molekulát adszorbeált szilanolcsoportok H H H-hídas szilanol csoportok O Szabad szilanol csoportok OH OH
H
H
H H
O
O
O
O
Si
Si
Si
Si
Si
Si
O
O
O
O
O
O
A víz jelenléte csökkenti az elválasztás hatékonyságát.
Impregnált rétegek Ezüst-nitrát Telítetlen vegyületek kettős kötéseivel kialakított π komplexek: Cisz-transz vegyületek elválasztása. Telített, telítetlen vegyületek elválasztásának fokozása. Borát vegyületek Vicinális hidroxil csoportokat tartalmazó vegyületekkel komplex képzés. Koffein PAH
Mozgófázis Vizes pufferek és szerves oldószerek, valamint oldószer-
keverékek (lsd. eluotróp sor). Kapilláris erők mozgatják az eluenst (lsd. papírkromatogr.). Kifejlesztés ideje függ: - rétegvastagság; - szorbens szemcse jellemzői (méret, alak, stb.); - kromatografáló kád légtere; - lemez térbeli helyzete; - oldószer minősége (sűrűség). Futtatási körülmények optimálására használják a Stahlféle PRIZMA módszert.
Thin Layer Chromatography (TLC) sajátságai 1, Egyensúlyi viszonyok Állófázis
Mozgó fázis Minta komponensek
Gőzfázis
1, A gőztér szerepe: A gőztér komponensei lecsapódnak a rétegre és előnedvesítik a szorbenst, az aktív adszorpciós helyeket dezaktíválják. Az oldószer és a réteg között nem ugyanaz az egyensúly, mint az oldószer gőzök és a réteg között! Raoult törvénye alapján A gőztér kondenzálása telített kádból gyorsabb, ez gyorsabb futtatást tesz lehetővé.
Réteg előnedvesítése: „twin chambers”
TLC és HPLC
A mozgófázis frontja ( α front) „száraz” állófázison halad előre ↔ HPLC A szeparálodott komponenseket nyitott lemezen kapjuk, színes anyagok közvetlenül láthatók, könnyen archiválható ↔ HPLC Egyszerre több minta és standard futtatható (60-70 db), azonos körülmények között ↔ HPLC Álló- és mozgófázis (UV elnyelése megengedett ↔HPLC) szelektivítása egyaránt változtatható → HPLC
Elválasztási módszerek 1, Egy dimenziós Leszálló - Sephadex géleknél, mivel itt nincs kapillarítás. Felszálló - leggyakrabban használt, függőleges, vagy döntött réteg. Kör 2, Sokszorozó = lépésenkénti gradiens fejlesztés 3, Két- és sok dimenziós (planar chromatography = PC) Széleskörű 2D PC (PCxPC) Szelektív 2D PC (PC+PC) Kapcsolt rétegű PC (PC-PC)
PCxPC
PC+PC
PC-PC
Nagyhatékonyságú Vékonyréteg Kromatográfia High Performance Thin Layer Chromatography (HPTLC) Finomszemcsés rétegen, rövid futási távolságra, gyors és hatékony elválasztást tesz lehetővé.
Kifejlesztési távolság (cm)
Kifejlesztési idő (perc)
Vékonyréteg Kromatográfia (TLC) és Nagyhatékonyságú Vékonyréteg Kromatográfia (HPTLC) összehasonlítása Szempontok
TLC
HPTLC
Szorbens vastagság
0,25 mm
0,10 mm
Szemcseméret
10-15 um
5-7 um
Elválasztási úthossz
10-15 cm
3-7 cm
Rétegméret
20x20 cm
10x10 cm
Elválasztás időtartama 30-200 perc
3-20 perc
Futtató kádak
Normál kamra – hengeres, vagy hasábos, zárható üvegkád. Szendvics kamra – kis V, szimultán futtatás. Ultramikro (UM) kamra – a réteget kívülről gázzal nyomott fóliával, vagy üveglappal fedik és az oldószert túlnyomással áramoltatják. Horizontális futtatás
Rétegkromatogramok előhívása Fizikai módszerek:
-
-
UV fényben (254 és 366 nm) saját abszorpciójuk, vagy a háttérfluoreszcencia kioltása révén (fluoreszcens kioltás) sötét foltként detektálhatók (körbe rajzolás módszere). Minőségi jellemzés az Rf értékekkel (azonos körülmények között ΔRf = 2%. Mennyiségi jellemzés (direkt, vagy indirekt lsd eluciós): Denzitometriásan (abszorbancia, fluoreszcencia); autoradiográfiásan (radioaktív jelölés). TLC-MS leolvasás
Háttér fluoreszcencia kioltása
Denzitométer - TLC Scanner
VideoStore/VideoScan
Rétegkromatogramok előhívása Kémiai módszerek: - speciális kémiai reakciókkal (színes termék
keletkezésével); - Pl. aminosav-ninhidrin, lipid-jódgőz, szerves anyag-kénsav, kálium-permanganát, vanilin és ánizsaldehid. Biológiai módszerek: - speciális mikroorganizmusokkal.
Ételszínezékek TLC elválasztása 7 ételszínezék: Erythrosin, Brillant Black BN, Fast Red E, Naphthol Red S, Yellow Orange S, Ponceau 4R, Tartrazine. Futattó oldószer: 2.5% nátrium-citrát oldat: 25%-os ammóniumhidroxid : 2-propanol (20 : 5 : 3).
Növényi pigmentek TLC elválasztása
Futattószer: petroléter, aceton
Kieselgel 60 F254
Aminosavak TLC elválasztása A hazai kutatások eredményeként kialakított, kati-
oncserélő tulajdonságú Fixion 50 x 8 vékonyréteg alkalmas az aminosavak elválasztására. A Fixion-50 x 8 kovalensen kötött karboxilcsoportokat tartalmazó kationcserélő gyanta, tehát rajta az aminosavak a startponttól a kromatogram kifejlesztéséhez használt citrát pufferben annál magasabbra futnak, minél inkább savas a karakterük. Az aminosavak minőségi azonosítása a standardként használt aminosavak egyidejű futtatása után az Rf (retenciós faktor) számításával történik. Rf = minta vándorlási távolsága (cm) oldószerfront távolsága (cm)
Előhívás ninhidrin reagenssel (lsd. Ioncserés kromatográfia)
Cukrok elválasztása vékonyrétegkromatográfiával Szilikagél vékonyrétegen ( Kieselgel 60 F 254 5 x 10 cm-es lemez) lehetőség van egyes szénhidrátok elválasztására. Az elválasztáshoz acetonitril : víz = 87 : 15 arányú keveréke alkalmazható. A minták specifikus reagenssel, a difenil-amin-anilin-foszforsavval előhívva, az egyes komponensek láthatóvá tehetők. Ezzel a módszerrel kb. 15 szénhidrát elválasztására van lehetőség.
dezoxiribóz ribóz xilóz arabinóz szorbóz fruktóz glükóz galaktóz szacharóz maltóz cellobióz melibióz raffinóz
futtatási irány
Ezüst kromatográfia
Elválasztást befolyásoló tényezők: Telítetlen aciklikus és karboxil csoportot tartalmazó vegyületek stabilabb komplexet képeznek, mint az aromások. A stabilitás a szénatom szám növekedésével csökken. A stabilitás a kettős kötésnél található szubsztituensek számának növekedésével csökken. Cisz-transz szabály: a cisz izomerek stabilabb komplexet képeznek, mint a transz formák.
Ezüst ion VRK, metil- cisz és transz oktadekanoát (C18 zsírsav- metil észter) vegyületek esetén. 15% (w/w) ezüstnitrát impregnálás, dibutil-éter-hexán (40:60, v/v) eluens. Számok = kettős kötés helye a molekulán belül.
Vékonyrétegkromatográfia alkalmazása
Előnyei: Szimultán (nagyszámú > 20) minta- és standard futtatása Gyors és olcsó, könnyen kivitelezhető Kis mennyiségű oldószer használat HPTLC HPLC Álló- és mozgófázis szelektivítása egyaránt változtatható.
Alkalmazási területek Tisztaságvizsgálat (gyártásközi gyógyszeripar) Kémiai reakciók nyomon követése Előtanulmány a HPLC mérésekhez Preparatív elválasztás - 0,1-1 g anyag, sávos mintafelvitel, elúciós (indirekt) detektálás.
