OBMSB

CVIČENÍ Z MIKROBIOLOGIE LS 2011/2012, předmět BOT/OBMSB Vyučující: Zuzana Trojanová (24.-26.2.2012) Michaela Sedlářová (9.-11.3.2012) Barbora Mieslerová (23.-25.3.2012) + Anna Zedková (laborantka) Podmínky k udělení zápočtu: Protokoly Zápočtový test – termíny dle domluvy s vyučujícími

Mikrobiologické předměty a vybavení mikrobiologické laboratoře Katedry botaniky PřF UP v Olomouci jsou inovovány v rámci projektu OPVK „Zvyšování konkurenceschopnosti studentů oboru botanika a učitelství biologie“ CZ.1.07/2.2.00/15.0316 http://isb-up.cz

Požadavky na zápočet - 100% účast na cvičení 1. skupina – Zuzana Trojanová (blok 24. – 26. 2. 2012) pátek 24. 2. 8.00 – 14.00 sobota 25 .2. 8.15 – 15.15 (nebo 9.00 – 16.00) neděle 26 .2. 8.15 – 14.15 (nebo 9.00 – 15.00) 2. skupina – Michaela Sedlářová (blok 9. – 11. 3. 2012) pátek 9. 3. 8.00 – 14.00 sobota 10. 3. 8.15 – 15.15 (nebo 9.00 – 16.00) neděle 11.3. 8.15 – 14.15 (nebo 9.00 – 15.00) 3. skupina – Barbora Mieslerová (blok 23. – 25. 3. 2012) pátek 25. 3. 8.00 – 14.00 sobota 26. 3. 8.15 – 15.15 (nebo 9.00 – 16.00) neděle 27. 3. 8.15 – 14.15 (nebo 9.00 – 15.00) - protokoly – odevzdat do 5. 3. (1. skupina), 19. 3. (2. skupina), 2. 4. (3. skupina) - zápočtový test – 8.00 učebna mikrobiologie 28. 2. – 1. skupina 13. 3. – 2. skupina 27. 3. – 3. skupina

Bezpečnost práce Základní požadavky při práci v laboratoři: 1) neznečistit okolí patogenními mikroorganismy, protože může vzniknout nákaza, infekce pracovníka (i mezi nepatogenními kmeny mohou být patogenní mutanty) 2) zabránit kontaminaci kultur mikroorganismy z okolí

Zásady práce v mikrobiologické laboratoři: Dbáme na to, aby se mikroorganismy nedostaly na pracovní stůl, na přístroje, do ovzduší Používáme čistý laboratorní plášť (dlouhé rukávy), který chrání oděv před kontaminací, při barvení mikroorganismů před znečištěním barvivy. Čistá obuv. Upravené a svázané dlouhé vlasy. Odložení šperků. Upravené nehty. Udržujeme pořádek a čistotu v mikrobiologické laboratoři. Nábytek, stěny, přístroje a podlahu pravidelně desinfikujeme desinfekčními prostředky. Ovzduší sterilizujeme UV zářením (před vstupem zaměstnanců germicidní zářivky vypnout). Při práci nesmí být otevřeny dveře či okna – průvan, vniknutí hmyzu. V prostoru mikrobiologické laboratoře je zákaz konzumace jídla, pití, kouření, manipulace s potravinami.

Snažíme se zabránit vzniku aerosolů. U kolonií mikromycet už při otevření víčka dochází k rozprášení do ovzduší (mohou vyvolávat po vdechnutí plicní onemocnění nebo alergii). I u bakterií je riziko vzniku aerosolů – při rozbití Petriho misky a rozstříknutí infekčního materiálu, neopatrném přelévání kultur, prudkém vyjmutí zátek nebo vyfukování pipet. Před započetím práce, po jejím ukončení a před odchodem z laboratoře je nutné si umýt ruce desinfekčním prostředkem (např. Spitaderm). Zkumavky s naočkovaným materiálem ukládáme do stojanů Při zřeďování kyselin: kyselinu lijeme pomalu do vody!! Nikdy nepipetovat ústy!! (používaní pipetovacích násadců) Při práci s chemikáliemi a likvidaci kontaminovaného materiálu používat ochranné pomůcky (gumové rukavice)

Odkládání pracovních nástrojů nebo pomůcek, které mohou být znečištěny živými mikroorganismy na pracovní plochu je hrubým porušením bezpečnosti práce. Veškeré pracovní pomůcky po použití desinfikovat, sterilizovat. Očkovací nástroje: očkovací kličku, preparační jehlu a háček odkládáme vždy až po vypálení v plamenu. Pipety, drigalského tyčky, se dávají do válce naplněného desinfekčním roztokem (1-2 % roztok Incidur). Podobně i mikroskopická sklíčka. Mikroorganismy na nepoužitém nebo nepotřebném materiálu usmrtíme autoklávováním (při přetlaku 0,1 MPa, což odpovídá teplotě 121°C po dobu nejméně 30 min) nebo uložíme do desinfekčního roztoku, např. pipety do ajatinu. Obsluhovat autokláv smí pouze vyškolený pracovník. Kultury mikroorganismů, preparáty, živné půdy vždy přesně označujeme, aby se zabránilo omylu. Při odchodu z laboratoře vypneme plyn, elektřinu, zastavíme vodu V případě požáru elektrického zařízení pod proudem používáme práškové nebo sněhové hasící přístroje.

V laboratoři musí být lékárnička na poskytnutí první pomoci. První pomoc se poskytuje při pracovních nehodách: Při nasátí materiálu mikroorganismů do úst – materiál je třeba vyplivnout, nebo vyvolat zvracení, ústa vypláchnout desinfekčním prostředkem (0,5 až 1% roztok KMnO4). Žvýkat chléb a pak jej vyplivnout. Živočišné uhlí. Při vstříknutí mikroorganismů do oka – oplachovat delší dobu pod proudem vody, pak vypláchneme 3% kyselinou boritou, pak ošetříme desinfekčním prostředkem (Ophtalmo-septonex) Při polití kyselinou - omýt tekoucí vodou a 1% roztokem NaHCO3 (hydrogenuhličitan sodný) Při polití louhem – omýt tekoucí vodou a 1% roztokem kyseliny octové (nebo citronová šťáva) Při vniknutí mikroorganismů do poraněné kůže – ránu desinfikovat jodovou tinkturou, opláchnout ji roztokem ajatinu

Úvod ke cvičení

VYBAVENÍ LABORATOŘE: Laboratorní sklo Přístrojové vybavení mikrobiologické laboratoře Sterilizační zařízení Laboratorní pomůcky

STERILIZACE

LABORATORNÍ SKLO 1. Petriho misky – používají se na izolaci kultur, krátkodobou kultivaci, přípravu mikrokolonií a rozličné testy na ztužených půdách. Pro běžnou praxi se nejvíce používají Petriho misky o průměru 90 až 100 mm.

2. Bakteriologické zkumavky – v běžné praxi – asi slabé ale ani příliš silnostěnné – riziko prasknutí. Po prasknutí zkumavky s kulturou se může při zranění vážně ohrozit zdraví pracovníka (infekce) nebo způsobit kontaminaci pracovní plochy. Používat pouze zkumavky s rovným okrajem. Pokud mají zahnuté okraje – umožňuje to zachytávání mikroorganismů padajících z ovzduší, kterými pak po vyjmutí zátky je možno kultury při přeočkování kontaminovat.

3. Fermentační zkumavky – v mikrobiologické praxi se používají ke sledování schopnosti mikroorganismů fermentovat řadu cukrů. Nejjednodušším typem fermentačních zkumavek jsou zkumavky s plynovkami podle Durhmana. b) Plynovka podle Durhmana c) Einhornova kvasná rourka d) Dunbarova kvasná rourka

a) Zkumavky s plynovkami podle Durhmana. Jsou to zkumavky, v nichž dnem vzhůru jsou v kultivačním médiu ponořeny zkumavky (epruvety) o podstatně menší délce i průměru. Plyn tvořící se v médiu se zachycuje v malé zkumavce, kde tvoří viditelnou bublinu. b) Dalším typem jsou tzv. Dunbarovy kvasné rourky. Obvykle jsou o užším průměru než běžné zkumavky. Jejich spodní část je ohnuta směrem vzhůru tak, že připomíná tvar písmena „V“. Kratší rameno je zataveno, takže se v něm může hromadit plyn. c) Pro přesnější práci a kvantitativní stanovení tvořícího se plynu slouží Einhornovy kvasné rourky. V podstatě je to skleněná rourka ohnutá do tvaru písmena „U“, která je přitavena na podložce. Delší rameno, válcovitě rozšířené, je zataveno a kalibrováno, takže je možné přesně zjistit objem plynu vytvořeného v závislosti na čase. Druhé rameno rourky bývá baňkovitě rozšířené a je kratší. Je otevřené a uzavírá se vatovou zátkou.

4. Fernbachovy baňky a Rouxovy láhve se používají při kultivaci, kde se vyžaduje velký povrch substrátu

Rouxova láhev

Fernbachova baňka

5. Pipety – pro mikrobiologické potřeby je nutno vybírat takové typy, které se přesně a rychle vyprazdňují, bez vyfukování na tzv. vylitý objem. Skleněné pipety, gumové balónky, násadce, automatické pipety, jednorázové umělohmotné špičky.

Pipety a multikanálové pipety

Skleněná pipeta s násadcem

6. Pasteurovy pipety – slouží k odběru kultur mikrobů z tekutých medií k očkování kultur do tekutých médií, k přidávání různých reagencií či suplementů do kultivačních medií.

Pasteurovy pipety

7. Baňky varné neboli Erlenmayerovy – na kultivaci v kapalných půdách na třepačce nebo na přípravu živných půd.

8. Odměrné válce – mikrobiologické praxi se používají především při zhotovování různých roztoků a kultivačních médií. Slouží pouze k odměřování většího objemu kapaliny. 9. Podložní a krycí sklíčka – používají se na přípravu preparátů.

PŘÍSTROJOVÉ VYBAVENÍ MIKROBIOLOGICKÉ LABORATOŘE

1. Mikroskop - patří mezi základní vybavení mikrobiologické laboratoře, pomocí kterého lze pozorovat jednotlivé preparáty 2. Chladnička - slouží k uchovávání vzorků, sterilních kultivačních médií v zásobních nádobách, zkumavek, Petriho misek či kultur mikroorganismů. Je nepřípustné v chladničce vyhrazené pro mikrobiologické účely uchovávat potraviny. Pravidelně je třeba chladničku vyklidit, odmrazit, řádně umýt a ošetřit desinfekčním roztokem. 3. Mrazící box, mraznička - slouží k uchovávání lyofilizovaných kultur i k jiným speciálním účelům a stanovením. Denně kontrolovat teplotu. Jednou za půl roku odmrazit a vyčistit.

4. Očkovací box Kovová skříň se skleněnými výplněmi stěn. Je v něm zaveden přívod sterilního vzduchu, dále plyn, voda. Měl by být vybaven germicidními zářivkami. Obvykle je uvnitř udržován mírný přetlak Manipulace s mikrobiologickým materiálem se provádí uvnitř boxu za nepřístupu vzduchu z vnějšího okolí. Očkovací box slouží k provádění všech druhů práce s vysokými nároky na vyloučení kontaminace (přeočkování čistých kultur). Před použitím vydesinfikovat. Nutnost kontrolovat filtry na vzduch 1x za měsíc- prověřovat sterilnost atmosféry v boxu.

Laminární box

5. Inkubátory - termostaty Při kultivačním stanovení mikroorganismů je většinou potřeba vyšší teplota než je běžná teplota laboratorní. Správný inkubátor musí spolehlivě udržovat konstantní teplotu s kolísáním menších než 0,5°C Termostaty vodní – kovové skříně s dvojitými stěnami, v nichž cirkuluje voda na předem zvolenou teplotu ohřátá elektrickými topnými tělísky. Výhoda – minimální pokles teploty při krátkodobém výpadku elektrické energie. Pro běžné mikrobiologické rozbory jsou předepsány kultivační teploty 20°C, 37°C a 43°C (stanovení koliformních bakterií a stanovení fekálních koliformních bakterií), popřípadě 44°C (Stanovení termotolerantních koliformních bakterií) V laboratoři je potřeba více termostatů Denně provádět kontrolu teploty – maximominimální teploměr 2x za měsíc nutno čistit a desinfikovat

Termostat

6. Váhy Nejlépe váhy digitální – jedny v citlivostí nejméně 0,1 g a možností navážky do 150 g a druhé s citlivostí 1 mg a navážkou do 10 g 7. pH metr používá se pro určování hodnoty pH kultivačních medií a roztoků 8. Třepačka pomocí elektrického motoru pohybuje v horizontální poloze krouživými pohyby pultem, na němž jsou přichyceny kultivační nádoby. Tento pohyb způsobuje intenzivní promíchávání obsahu kultivačních nádob, což umožňuje optimální podmínky růstu.

Třepačka

9. Vodní lázeň Slouží k provádění pasteurizace vzorků pro stanovení sporulujících mikroorganismů. Pouze ve výjimečných případech může sloužit k roztápění ztuhlých kultivačních médií - zkumavky se pak pomoří přímo do vody ve vodní lázni.

10. Destilační aparát Pro práci veškerého druhu v mikrobiologické laboratoři je povoleno používat pouze destilovanou vodu. Možno nahradit vodou deionizovanou. 11. Centrifuga Je určena k separování drobných suspendovaných partikulí hmoty v kapalině odstředivou silou.

Centrifuga

12. UV lampa (360 nm) Užívá se k vyhodnocení fluorescence u stanovení koliformních bakterií (presumptivní Escherichia coli), enterokoků, klostridií moderními metodami, které jsou založeny na enzymatické hydrolýze specifických substrátů obsahujících fluorochromové báze v molekule. Ty se při enzymatické hydrolýze uvolňují do média a v UV záření vykazují světle modrou fluorescenci. UV lampa se užívá i při vyhodnocování přirozené fluorescence ve vodě rozpustného pigmentu u typických kolonií Pseudomonas aeruginosa. (UV lampa o záření 360 nm + 20 nm. UV lampy o jiném vlnovém rozsahu (horská sluníčka)- ne vždy vyhovují. Chránit zrak brýlemi. Vyhodnocování presumptivních kolonií v UV světle se provádí v zatemnělé místnosti.

Potvrzené fluoreskující kolonie E. coli

UV lampa a kultivační miska s mCOLI testem

STERILIZAČNÍ ZAŘÍZENÍ Zařízení sloužící k dokonalému usmrcení všech živých mikroorganismů a jejich spor vyskytujících se v čerstvě připravených kultivačních mediích nebo ulpívající na stěnách laboratorního nádobí. 1. Autokláv Kovová nádoba hermeticky uzavíratelná , v níž při zahřívání dochází ke vzniku zvýšeného tlaku páry, a tak i k přehřátí prostoru na vyšší teplotu než 100°C. Ve většině případů se ke sterilizaci používá přetlaku 0,1MPa což odpovídá teplotě 121°C. Přístroj určený k přípravě kultivačních médií má být instalovaný ve varně médií, samostatný autokláv sloužící k likvidaci pomnožených kultur má být umístěn v umývárně. Smí ho obsluhovat pouze vyškolený pracovník.

Moderní typ autoklávu

2. Kochův parní hrnec (sterilizátor) Slouží k tzv. sterilizaci v proudící páře. V tomto zařízení se dosahuje teploty max. 100°C, která usmrcuje pouze vegetativní buňky mikroorganismů. Spory při této teplotě převážně nehynou. Používá se především k rozváření agarových kultivačních medií, k jejich roztápění před použitím. Nikdy se nepoužívá k sterilizaci laboratorního nádobí. 3. Horkovzdušný sterilizátor Schopnost spolehlivě udržovat teplotu předepsanou v rozmezí 160 až 180°C po dobu 20 min. Registrace teploty. Slouží výhradně ke sterilizaci laboratorního skla a pomůcek. Umístění do umývárny. Nelze používat ke sterilizaci kultivačních medií, membránových filtrů či pomůcek z plastů. Může se používat jako sušička.

Horkovzdušný sterilizátor

4. Sterilizační filtry Principem je mechanické odstranění mikroorganismů z kultivačních medií nebo z roztoků ve speciálních filtračních zařízeních, nichž jsou použity speciální filtry s velmi malými póry, které při současném působení elektrostatických procesů na hraničních plochách pórů dokonale zadrží obsažené bakteriální buňky. Nejčastěji používané filtry: a) Chamberlandovy – filtrační materiál je vyroben z porcelánu bez glazury b) Berkefeldovy – podobné jako předchozí, ale vyrobené křemeliny

z lisované

c) Seitzovy – kruhové destičky zhotovené lisováním směsi nitrocelulózy d) Skleněné – připravují se zahříváním a lisováním jemného skleněného prášku e) Speciální membránové filtry – na bázi celulózy a acetátu

Filtrace se provádí buď odsáváním tekutiny nalité přímo do filtračního aparátu přes vlastní filtr (pod tlakem) nebo nasáváním kapaliny z venku do filtru (přetlakem). Při filtraci je nutné dodržovat konstantní přetlak či podtlak. Zvýšení tlaku nad 0,05 MPa může způsobit průchod buněk mikroorganismů. Není to sterilizace, neboť L- formy bakterií (bakterie bez buněčné stěny ve formě protoplastů), viry, mykoplazmata filtrem procházejí. Dále procházejí spirochéty - buňky s dokonalou plasticitou buňky. Po filtraci filtry opláchnout destilovanou vodou.

a potom řádně propláchnout horkou

Tento způsob sterilizace se používá pouze v těch případech, kdy kultivační médium nebo některé roztoky používané jako suplementy pro přípravu kultivačních medií obsahují vysoce termolabilní látky, jako např. vitamíny, proteiny, sera, cukry apod.

5. UV sterilizační lampa (germicidní zářivka) Používá se především ke sterilizaci ovzduší a pracovních ploch a k likvidaci aerosolů v laboratoři v nočních hodinách. Dále slouží ke sterilizaci očkovacích boxů a dalších podobných zařízení. Princip sterilizačního účinku UV paprsků je jejich absorpce v buňkách mikroorganismů, kde způsobí radikální fotochemické změny, které při dostatečné dávce UV záření vyvolávají smrt mikroorganismů. Nejvyšší účinnost při vlnové délce UV kolem 200 až 280nm, přičemž optimum je 260nm. UV lampy produkující UV záření o vlnové délce 360nm používané pro vyhodnocování fluorescence, jsou prakticky neúčinné. Nelze tyto dva typy UV záření zaměňovat. Záření o vlnové délce 260nm při delší době působení může způsobovat poškození – záněty rohovky. Bezpečnost práce !

LABORATORNÍ POMŮCKY 1. Kahan Plynové kahany – Bunsenův kahan nebo Meckerův kahan Plyn z ocelové láhve a hořáky Lihové kahany Plamen se používá k ožívání hrdel zkumavek. Baněk i ostatních kultivačních nádob při jejich otevírání, dále zátek, roztíracích tyčinek, pipet, bakteriologických kliček, jehel, pinzet.

Lihový kahan Meckerův kahan Bunsenův kahan

Tecluho kahan

2. Očkovací klička - bakteriologická klička Pro běžné způsoby očkování je vyrobena z nikelinového, chromniklového nebo i ocelového drátu 0,6 až 0,8 mm silného, na jehož konci je zhotoveno očko o průměru přibližně 2 až 3 mm. Délka kličky 5,5 až 6 cm. Upevněna do Kolleho držátka - lze zatavit do skleněné tyčinky. Pouze pro provádění cytochromoxidázového testu se používá klička vyrobená z platinového drátu. Očkovací klička se používá k přeočkování čistých kultur z jednoho kultivačního media na druhé nebo k jejich izolaci.

3. Očkovací jehla Na konci drátu nemá očko. Připravuje se ze silnějšího (tužšího) drátu. Používá se při očkování vyizolované čisté kultury vpichem do hloubky kultivačního media.

4. Pinzeta Používá se při fixování a barvení mikroskopických preparátů, k přenášení membránových filtrů do filtračního aparátu a na povrch kultivačního média, či na papír nasycený určitým reagens.

5. Roztírací tyčinka dle Drigalskiho Jedná se o skleněnou tyčinku, jejíž spodní část je ohnutá do malého trojúhelníku nebo tvaru písmene „L“. Používá se k rovnoměrnému roztírání inokula po povrchu pevného kultivačního media. Provádí se krouživým pohybem při současném otáčení Petriho misky.

6. Stojánky na zkumavky Nejvhodnější jsou stojánky kovové z duralového plechu nebo antikorózní oceli.

7. Pomůcky na počítání kolonií Nejvhodnější pomůckou je přístroj na počítání kolonií vybavený velkou lupou, s možností volby horního či postranního osvětlení spodní části Petriho misky na světlém či tmavém pozadí a zařízením různého systému ke značení odpočítávaných kolonií, které je obvykle zároveň spojeno s mechanickým či elektronickým digitálním počítadlem.

Automatické počítací zařízení

8. Filtrační aparát Je většinou vyroben z antikorózní oceli a je silně pochromován Skládá se ze 2 až 3 částí Spodní část – držák na podložku pro membránový filtr, ventil na uzavření průchodu vzduchu a dlouhou trubkovitou stopku na níž se nasazuje gumová zátka Horní část je většinou válcovitá nebo kónická a slouží příslušného objemu vzorku může být i kalibrovaná.

k odměřování

Mezi horní a spodní částí se nalézá speciální kovová průlinčitá podložka, na níž se pokládá vlastní membránový filtr. Na trubkovitou stopku se nasazuje gumová zátka, kterou se celý filtrační aparát zasazuje do odsávací baňky, z níž se motorovou nebo vodní vývěvou odsává vzduch. Doporučuje se mezi odsávací baňku a vývěvu zařadit ještě pojistnou nádobu (promývačku), která zabraňuje vniknutí profiltrované vody do vývěvy zejména v případě, že je odsávačka již naplněná.

Spodní část filtračního zařízení

Nalévání vody do horní části filtračního zařízení

Sada filtračních zařízení napojených na vodní vývěvu

STERILIZACE Přímá inaktivace (usmrcení) všech mikroorganismů (včetně spor) v určitém prostředí nebo určitém materiálu. Nemusí být odstraněny z prostředí a materiálů, výjimka jsou farmaceutické přípravky. Sterilizace absolutní – všechno je usmrceno Sterilizace relativní – jsou usmrceny pouze ty organismy, které mohou vegetovat jenom za podmínek určených složením, po případě uskladněním sterilizovaného materiálu

DESINFEKCE je záměrné odstraňování a ničení choroboplodných zárodků pomocí fyzikálních, chemických nebo kombinovaných postupů. Dezinfekční prostředky tvoří velmi heterogenní skupinu chemických látek, které vyvolávají změny nepříznivé pro trvalé přežívání mikroorganizmů.

Typy sterilizace 1. Fyzikální sterilizace 1.A. Sterilizace vlhkým teplem (sytou vodní párou) 1.B. Sterilizace proudícím horkým vzduchem 1.C. Sterilizace filtrací 1.D. Sterilizace plazmou 1.E. Sterilizace radiační 2. Chemická sterilizace 3. Mechanická očista

1. Fyzikální sterilizace 1. A. Sterilizace vlhkým teplem Pro sterilizaci kultivačních médií, suplementů do kultivačních medií.

zřeďovacích

roztoků,

různých

Také je vhodná pro sterilizaci zdravotnických prostředků z kovu, porcelánu, keramiky, textilu. Ke sterilizaci laboratorního skla a pomůcek, s výjimkou filtračního aparátu se zásadně nepoužívá. Důvod – při sterilizaci v autoklávech – zvlhnutí – riziko další kontaminace.

I. Sterilizace při vyšší teplotě než 100 °C za přetlaku v autoklávu Nejdokonalejší způsob sterilizace – možno docílit absolutní sterility. To co usmrcuje je vlhká teplota páry za odpovídajícího přetlaku Stupeň účinnosti – výška teploty a délka expozice Při sterilizaci nasycenou parou v autoklávu za přetlaku vše voda při vyšší teplotě než 100°C. Závislost hodnot teploty na hodnotách přetlaku Teplota v °C

Přetlak v MPa

100

0,0

105

0,019

110

0,041

115

0,067

120

0,096

121

0,1

125

0,129

134

0,2

1 atm = 0,1 MPa

Pouze tyto dvě povoleny ve zdravotnictví

Výška teploty Podle účelu sterilizace, ale i podle druhu nebo skupiny předpokládaných kontaminujících mikroorganismů Vegetativní formy mikroorganismů odumírají už při teplotě 55°C až 65°C během 10 min, zatímco jejich endospory až za 15 min při teplotě 120°C. Podobně saprofytická mikroflóra s optimem růstu při 35 až 37°C hyne při podstatně nižší teplotě a kratší účinnosti než striktně termofilní bakterie Čím vyšší teplota, tím kratší dobu sterilizace je možno použít Spory

Doba v min nutná ke spolehlivému usmrcení spor 120°C 130°C

140°C

150°C

Bacillus anthracis

-

-

-

Clostridium botulinum

120

60

Clostridium tetani

-

Půdní sporuláti -

160°C

170°C

180°C

60-120 9-90

-

3

15-60

25

-

10-15

10

20-40

5-15

-

12

5

1

-

-

180

30-90

15-60

15

Menší starší typ autoklávu

Moderní typ autoklávu

Volba sterilizační doby Pravidlo – čím vyšší teplota, tím kratší je doba sterilizace U teploty 121°C – stačí 12 min (podle normy 15 min) Pokud musíme provést rychlou sterilizaci, lze použít teplotu 134°C (= přetlaku 0,2MPa) bezpečné sterility lze dosáhnout už za 36 sec. V praxi s bezpečnostním koeficientem se to provádí 6 min. Bezpečnostní koeficient – při dosažení požadované teploty v autoklávu ještě jednotlivé předměty nejsou na tuto teplotu předehřáté. Graf časový průběh sterilizace

Průběh sterilizace lze rozdělit na čtyři fáze: 1. vyhřívání 2. vyrovnávání teploty 3. doba sterilizace 4. ochlazování Nejprve stoupá teplota v autoklávu, pak následuje doba nutná k vyrovnání teploty mezi parou a sterilizovanými předměty. Vlastní sterilizační doba začíná okamžikem, kdy i předměty vložené do autoklávu dosáhly a končí po průběhu zvolené sterilizační doby. Po vypnutí autoklávu – doba ochlazování. Nesmí se otevřít předčasně, až při teplotě kolem 80°C. Pokud bychom to otevřeli pokud je teplota nad 100°C, začnou všechny kapaliny vřít. Doporučené doby sterilizace v různých metodách či normách platí pouze pro malé objemy, zhruba do 500 ml

II. Sterilizace v proudící páře (v Kochově hrnci) Sterilizace se provádí při běžném atmosférickém tlaku v páře 100°C teplé. Používá se ke sterilizaci kultivačních médií, která by se při vyšší teplotě než 100°C znehodnotila (obsahující cukry, želatinu, mléko). - jednorázovým zahřátím při 100°C po dobu 90 min - formou frakcionované sterilizace

Kochův parní sterilizátor

III. Sterilizace varem K usmrcení nesporulujících mikroorganismů, pokud nejsou termofilní, obvykle postačí doba 5 až 10 minut při teplotě 100°C. Zahřát na vroucí vodní lázni. Při této teplotě však nejsou všechny spory usmrceny. Některé spory snesou zahřívání při bodu varu po několik hodin (např. půdní sporuláti). Varem se sterilizují membránové filtry, i média obsahující termolabilní organické látky (nesnášející vyšší teplotu než 100°C). V domácnostech – jen použití pro určitou osobu Var ve vodě není sterilizační metoda (pro zdravotnické účely nelze)

Vodní lázeň

IV. Frakcionovaná sterilizace Ve třech po sobě následujících stupních opakovaná sterilizace při pouhých 100°C vždy po dobu 30 min, se dvěma přestávkami trvajícími 24 hod, při nichž je sterilizovaný materiál uchováván (nejlépe ve tmě) při teplotě 18-22°C. Tento způsob sterilizace je vhodný pouze pro určité typy kultivačních médií. Frakcionovaná sterilizace je především určena pro sterilizaci kultivačních médií obsahujících termolabilní látky, které se při vyšší teplotě než 100°C znehodnocují. K provedení se používá především Kochův hrnec, méně vodní lázeň. Používání domácího tlakového hrnce je nevhodné, uvnitř je teplota 110112°C.

V. Sterilizace při nižší teplotě než 100°C Použití ke sterilizaci kultivačních médií, která obsahují značně termolabilní látky (mléko, vaječný žloutek, sérum). Obvykle 85°C po dobu 2 h, vodní lázeň.

VI. Tyndalizace Sterilizace při teplotě 57°C po dobu 1 hodiny, opakovaná po 8 dní po sobě, s přestávkami 24 h, při nichž sterilizovaný materiál je přechováván při laboratorní teplotě (18-22°C). Prakticky se provádí v laboratoři ve vodní lázni, nejlépe s automatickou regulací teploty. Používá se ke sterilizaci kultivačních médií, které obsahují organické látky nesnášející teploty vyšší než 60°C (nativní bílkoviny, enzymy, krevní sérum).

VII. Pasterizace Částečná sterilizace, při níž je většina mikroorganismů usmrcena, ale nejsou usmrceny všechny, zejména spory. V mikrobiologii se většinou užívá na oddělení spor bacilů, klostridií apod. od vegetativních buněk (stanovení sporulujících mikroorganismů). Používá se většinou teplota 80°C po dobu 15 min. Často se užívá i v potravinářském průmyslu (mléko, víno, pivo). Výrobky nejsou zcela sterilní. Teplota se volí podle nejvíce rezistentních mikroorganismů, které mají být usmrceny.

1. B. Sterilizace proudícím horkým vzduchem Je určena pro materiál z kovu, skla, porcelánu, keramiky a kameniny. Horkovzdušná sterilizace se provádí v přístrojích s nucenou cirkulací vzduchu při parametrech:

Teplota (°C)

Čas (min)

160

60

170

30

180

20

Horkovzdušný sterilizátor

1. C. Sterilizace filtrací Sterilizace filtrací – jedná se o proces, při němž všechny buňky, živé i mrtvé jsou z kapaliny, která má být sterilizována, mechanicky odstraněny. Při tom však nedochází k odstranění metabolických produktů, toxinů apod. z média. Používá se pro kapaliny a roztoky, které nesnášejí vliv vysoké teploty. Póry filtračních prostředků musí být dostatečně malé, proniknutí jednotlivých buněk bakterií. Je bezpodmínečně nutné autoklávu.

vysterilizovat předem celé

Viry procházejí většinou bakteriálních filtrů.

aby se zabránilo

filtrační zařízení

v

Principem je mechanické odstranění mikroorganismů z kultivačních medií nebo z roztoků ve speciálních filtračních zařízeních, nichž jsou použity speciální filtry s velmi malými póry, které při současném působení elektrostatických procesů na hraničních plochách pórů dokonale zadrží obsažené bakteriální buňky. Nejčastěji používané filtry Chamberlandovy – filtrační materiál je vyroben z porcelánu bez glazury Berkefeldovy – podobné jako předchozí, ale vyrobené z lisované křemeliny Seitzovy – kruhové destičky zhotovené lisováním směsi nitrocelulózy Skleněné – připravují se zahříváním a lisováním jemného skleněného prášku Speciální membránové filtry – na bázi celulózy a acetátu

1. D. Sterilizace plazmou Nízkoteplotní plazma - ve vakuu se nechá odpařit peroxid vodíku nebo peroctová kyselina, které pomocí vysokofrekvenčních vln vytvoří vysoce reaktivní částice. Nepřevýší se teplota 50°C. Používá se k sterilizaci lékařských nástrojů. Sterilizace plazmou se nepoužívá ke sterilizaci porézního a savého materiálu a materiálu vyrobeného na bázi celulózy. Výhoda při sterilizaci jakýchkoliv optických přístrojů používaných v lékařství

Plazmový sterilizátor

1. E. Sterilizace radiační I. Ultrafialové záření (UV) Optimální baktericidní účinek je při vlnové délce kolem 254 nm, kdy je záření maximálně absorbováno nukleovými kyselinami. Jako zářiče se používají obvykle germicidní lampy. UV záření slouží ke sterilizaci vzduchu a pracovních ploch přímo vystavených paprskům. Používá se k vyzařování operačních sálů, aseptických boxů, piteven, odběrových místností v léčebnách tuberkulózy apod. Vyzáření nemůže nahradit úklid pomocí dezinfekčních prostředků.

II. Ionizující (radioaktivní) záření Je výhodné, protože penetruje, ale nezahřívá sterilizovaný předmět a nemění vlastnosti většiny sterilizovaných látek. Zdrojem gama záření v praxi je obvykle radioaktivní kobalt (60Co). Gama záření se používá k průmyslové sterilizaci (obvazový materiál, plasty). Mezinárodně stanovená sterilizační dávka je 27kGy (KiloGray). Používá se na materiály z plastů k jednorázovému využití, které nebyly kontaminovány. Velmi penetrantní, slouží k bezpečnému a přitom šetrnému usmrcení patogenních mikroorganismů (kdy nesmí dojít k výrazným změnám chemického složení jejich intracelulární struktury) Usmrtí i mykobakterie, ale ne veškeré viry.

2. Chemická sterilizace Chemická sterilizace je určena pro materiál, který nelze sterilizovat fyzikálními způsoby. Sterilizačním médiem jsou plyny předepsaného složení a koncentrace Sterilizace probíhá v přístrojích za stanoveného přetlaku nebo podtlaku Povolené plyny Sterilizace formaldehydem – působení formaldehydu s vodní párou při teplotě 60-80°C v podtlaku Sterilizace ethylenoxidem – působení ethylenoxidu v podtlaku nebo přetlaku při teplotě 37-55°C

Kontrola sterility Kontrola sterilizace zahrnuje sledování správného průběhu sterilizačního cyklu, kontroly účinnosti přístrojů a kontroly sterility vysterilizovaných materiálů. KULTIVAČNÍ KONTROLNÍ TESTY STERILITY Kontrolované nádoby se naplní přiměřeným množstvím zřeďovacího roztoku, promíchá a odebere pipetou 2 ml a přenesou se na Petriho misky, zalijí se na 45°C ochlazeným agarovým médiem. Po promíchání se misky kultivují při 37°C 48 h. V případě, že se po kultivaci neprojeví růst kolonií na médiu, lze považovat vzorkovnice za sterilní.

Kontrola biologickými prostředky Použití biologických indikátorů – Geobacillus stearothermophilus pro parní, formaldehydové a plazmové sterilizátory a Bacillus atrophaeus pro horkovzdušné a ethylenoxidové sterilizátory. Po sterilizaci se provádí kultivace na kultivačním médiu při 55°C (termofilní mikroorganismus). Výsledky nemohou být zjištěny hned, ale kultivace trvá určitou dobu + doba nutná k resuscitaci vysokou teplotou stresovaných spor (několik dnů až týdnů). Kontrola nebiologickými prostředky Bowie-Dick test – je testem správného odvzdušnění a pronikavosti páry (Savý papír, který má specifickou kresbu, která po sterilizaci mění barvu) Chemické testy procesové – barevnou změnou reagují již jen na přítomnost sterilizačního média. Slouží k rozlišení materiálu připraveného ke sterilizaci a již vysterilizovaného. Kontrola fyzikálními systémy Vakuový test – je testem těsnosti přístroje a je zabudován v programovém vybavení přístroje