DOKTORI ÉRTEKEZÉS TÉZISEI
Növényvédőszerek kölcsönhatása ciklodextrinekkel Készítette: Orgoványi Judit
Témavezető neve: Horváthné Dr. Otta Klára, egyetemi docens (Témavezető tudományos fokozata: PhD)
Doktori iskola: ELTE Kémia Doktori Iskola vezetője: Prof. Dr. Inzelt György, egyetemi tanár Program: Analitikai, kolloid- és környezetkémia, elektrokémia vezetője: Prof. Dr. Záray Gyula, egyetemi tanár
EÖTVÖS LORÁND TUDOMÁNYEGYETEM, KÉMIAI INTÉZET BUDAPEST 2006
I. BEVEZETÉS, CÉLKITŰZÉSEK A piretrumféle növényekből előállított természetes növénykivonatot már közel 400 éve használják rovarirtó szerként. Mivel ennek a növénykivonatnak az előállítása költséges, ezért szintetikus módon állítottak elő néhány hasonló szerkezetű vegyületet, a szintetikus piretroidokat. Ezek a molekulák rovarokra való szelektív toxicitásuk és hatékonyságuk miatt előnyösebbek, mint a többi növényvédőszer. Számos vegyületet kereskedelmi készítménnyé fejlesztettek, ezeket főleg háztartási rovarirtásra, vagy mezőgazdasági rovarölő szerként alkalmazzák. A piretroidok mezőgazdasági alkalmazhatóságát korlátozza, hogy általában könnyen bomló, fényérzékeny vegyületek és vízben nehezen oldódó anyagok. A felhasználás során a szilárd állapotú rovarirtók mellett tömény oldataik alkalmazására lenne igény, de ennek a rossz vízoldhatóság szab határt. Ha az elkészíthető oldatok koncentrációja kicsi, és a piretroid stabilitása rossz, a környezetbe jóval több anyagot kell kijuttatni ahhoz, hogy a kellő hatást elérjük. Ezen kívül – mivel ezek a vegyületek rovarokra gyomron át, illetve érintkezéssel ható idegmérgek – óriási hátrányuk, hogy méhekre is toxikusak. A ciklodextrinekkel való zárványkomplex képződés egyfajta stabilizálási lehetőséget nyújthat, emellett a rosszul oldódó molekula vizes szuszpenziójához ciklodextrint adva az oldhatóság növekedhet a ciklodextrin fajtájától függő mértékben. A ciklodextrinek alkalmazásával vízzel (locsolással, esővel) kontrollálható (gyorsított, illetve lassított) hatóanyag leadású szilárd készítmények hozhatók létre, amelyek nem rendelkeznek kontakt aktivitással, így csak a növények leveleit elfogyasztó tényleges kártevőkre hatnak. Nagyon lényeges szempont továbbá, hogy ciklodextrinekkel való molekuláris kapszulázással nyerhető formulációk 5-20%-os vendégmolekula tartalmúak, így a kívánt hatás eléréséhez jóval kisebb mennyiségű hatóanyag kiszórása szükséges, ami lényegesen kisebb környezeti terhelést jelent. Az ELTE Kémiai Technológiai és Környezetkémiai Tanszékének munkatársai már több évtizede foglalkoznak ciklodextrinek alkalmazási lehetőségeinek kutatásával. Ehhez a munkához csatlakozva doktori munkámban tanulmányoztam két szintetikus piretroid növényvédőszer, a cipermetrin és a fenpropatrin viselkedését ciklodextrinek jelenlétében. A ciklodextrinek keményítőből előállítható, 6, 7 illetve 8 glükopiranóz egységből álló ciklikus oligoszacharidok, ezek az α-, β- és γ-ciklodextrinek. Az alap ciklodextrineken kívül szubsztituált ciklodextrinek is előfordulnak, több 100 féle ciklodextrin származék ismeretes. A szubsztituált ciklodextrinek közül a leggyakoribbak az alkil-származékok (metil-, etil-, propil-, hidroxi-alkilciklodextrinek). Vizsgálataim során az alap ciklodextrinek, valamint a ciklodextrin származékok közül a véletlenszerűen (random) metilezett származékok (RAMEA, RAMEB és RAMEG), a 1
dimetil-β-ciklodextrin (DIMEB), a hidroxi-propil-β-ciklodextrin (HPBCD) és a peracetil-βciklodextrin (Ac-β-CD) származékokkal foglalkoztam. Kísérleteim célja a két piretroid előnytelen tulajdonságainak (rossz oldhatóság, fénybomlás) módosítása volt ciklodextrineket és ciklodextrin származékokat alkalmazva segédanyagként. Célom volt továbbá a vizsgált piretroidok ciklodextrinekkel képzett zárványkomplexeinek elkészítése, a különböző komplexképzési módszerek összehasonlítása és az előállított komplexek vizsgálata, elsősorban a hatóanyagtartalmuk megoszlása és vízben való kioldódásuk alapján. Ezen túlmenően célom volt olyan ciklodextrint tartalmazó korszerű növényvédőszer formuláció létrehozása, amely a jelenleg ismerteknél hatékonyabb és környezetkímélőbb.
II. KÍSÉRLETI MÓDSZEREK ÉS KÉSZÜLÉKEK A komplexek és fizikai keverékek előállítására az alábbiakban leírt módszereket alkalmaztam: Komplexképzés együttkristályosítással: A bemért hatóanyagot 96%-os etanolban feloldottam és cseppenként hozzáadtam a ciklodextrin 50%-os vizes etanolos oldatához. A reakcióelegyet 50 °Con kevertettem, majd lehűtve hűtőszekrényben tároltam. A kivált kristályokat üvegszűrőn leszűrtem és vákuum-exszikkátorban P2O5 felett tömegállandóságig szárítottam. Komplexképzés szuszpenzióban: A hatóanyag 96%-os etanolos oldatát a ciklodextrin desztillált vizes szuszpenziójához adagoltam, majd szobahőmérsékleten kevertettem, végül lehűtöttem. A kivált kristályokat üvegszűrőn szűrtem és P2O5 felett vákuum-exszikkátorban szárítottam tömegállandóságig. Komplexképzés szilárd fázisban: A bemért szilárd anyagokat (ciklodextrint és a hatóanyagot) achát mozsárba helyeztem és kevés desztillált víz cseppenkénti hozzáadagolása közben mozsártörő felhasználásával erősen dörzsöltem. Végül a kapott kristályos anyagot P2O5 felett vákuumexszikkátorban szárítottam tömegállandóságig. Komplexképzés olvasztással: A ciklodextrinhez desztillált vizet adtam, majd folyamatos kevertetés mellett vízfürdőn a hatóanyag olvadási hőmérséklete fölé melegítettem (t- és c-cipermetrinnél 90 °C-ra, fenpropatrinnál 60 °C-ra). A ciklodextrin oldódása után a bemért szilárd hatóanyagot is hozzáadtam az oldathoz. A kevertetés után hagytam lehűlni a lombik tartalmát, majd hűtőszekrénybe helyeztem. A kivált kristályos anyagot üvegszűrőn leszűrtem és P2O5 felett vákuum-exszikkátorban tömegállandóságig szárítottam. Komplexképzés szerves oldószerben: A szilárd acetil-β-ciklodextrint achát mozsárba helyeztem, és acetont adtam hozzá. A bemért a szilárd hatóanyagot is acetonban oldottam, majd hozzáöntöttem a 2
mozsárban levő ciklodextrin oldathoz. Keverés után a mozsarat 40 °C-os szárítószekrénybe tettem, majd a mozsár tartalmát levegőn tömegállandóságig szárítottam. Fizikai keverékek elkészítése: Kilenc β-ciklodextrin – t-cipermetrin fizikai keveréket készítettem különböző hatóanyag-tartalommal oldószer hozzáadása nélkül. A szilárd alkotók keverékét egy achát mozsárban mozsártörő segítségével homogenizáltam. A komplexek vizsgálati módszerei a következők voltak: Az oldhatósági vizsgálatot α-, β-, γ-ciklodextrinekkel, ezek random-metilezett származékaival (RAMEA, RAMEB, RAMEG), dimetil-β-ciklodextrinnel (DIMEB) és hidroxi-propil-β-ciklodextrinnel (HPBCD) végeztem el. Az adott ciklodextrin 10%-os oldatához (kivéve a β-CD esetén, aminél 1%-os oldatot alkalmaztam, mivel abból nem készíthető 10%-os oldat) feleslegben adtam a hatóanyagot. A mintákat szobahőmérsékleten kevertettem, majd 0,45 μm-es membránszűrőn leszűrtem és UV-spektrofotométerrel, illetve a hatóanyagot kisebb koncentrációban tartalmazó minták esetén HPLC-vel határoztam meg a hatóanyagtartalmat. Felvettem az oldhatósági izotermákat a hatóanyagok oldhatóságát leginkább növelő ciklodextrin származékok oldataiban: RAMEB, DIMEB valamint fenpropatrin esetén HPBCD oldatban is. 20 mg hatóanyagot mértem be, majd 5 cm3 0-10% ciklodextrin tartalmú oldatokat pipettáztam hozzá. A mintákat folyamatosan kevertettem, majd szűrés után UV-spektrofotométerrel, illetve HPLC-vel elemeztem. Minden esetben 3-3 párhuzamos mérést végeztem. Az UV-bomlás vizsgálatához mindhárom hatóanyagot 50%-os etanolban, illetve 10%-os RAMEB, DIMEB (és a fenpropatrin esetében HPBCD is) vizes oldatokban oldva nagy nyomású higanygőz lámpa fényével világítottam meg. 6-7 percenként felvettem az oldatok UV-spektrumát, illetve mintát vettem, amit acetonitrillel hígítva HPLC-vel mértem. A hatóanyagok és komplexek kioldódásának vizsgálatához a szilárd mintát (komplexet illetve hatóanyagot) mértem be, majd vizet adtam hozzá és kevertettem. 5-10 percenként mintát vettem, amit 0,45 μm pórusú membránszűrőn leszűrtem. A szűrlet hatóanyag-tartalmát HPLC-vel határoztam meg.
III. SAJÁT TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK Munkám során szintetikus piretroidok, a cipermetrin különböző izomerjeinek és a fenpropatrinnak ciklodextrinekkel való kölcsönhatását, ciklodextrinnel képzett komplexeit vizsgáltam részben oldatban, részben pedig szilárd állapotban. Ebben a sorrendben mutatom be és foglalom össze a kapott eredményeket. 3
A hatóanyagokkal vízoldhatósági vizsgálatokat végeztem különböző ciklodextrinek (α-, β-, γ−CD, RAMEA, RAMEB, RAMEG, DIMEB és HPBCD) oldataiban. Alap ciklodextrinekkel csak kisebb oldhatóság növekedést tapasztaltam, transz- és cisz-cipermetrin esetén a RAMEB és DIMEB, fenpropatrin esetén a RAMEB és DIMEB mellett a HPBCD okozta a legnagyobb oldhatóság növelést. Megállapítottam, hogy mindhárom hatóanyag elsősorban a β-ciklodextrinnel és származékaival lép kölcsönhatásba. Az oldhatósági izotermákat a legnagyobb oldhatóságot okozó ciklodextrin származékokkal vettem fel. A transz- és cisz cipermetrin esetében RAMEB és DIMEB-bel felvett izotermák az izomereknél hibahatáron belül megegyeztek. RAMEB-re Ap-típusú, DIMEB-re közel lineáris görbe nyerhető. Fenpropatrinnál DIMEB-re An-típusú míg RAMEB-re és a kisebb oldhatóságot eredményező HPBCD-re Ap-típusú izoterma nyerhető. Komplexképzési állandók ezekben az esetekben nem számolhatók. A hatóanyagok vizes oldatban UV-fény hatására bekövetkezett bomlásának követését elvégeztem önmagukban, valamint a legnagyobb kölcsönhatást eredményező ciklodextrin származékok jelenlétében. A hatóanyagok UV-bomlásának összehasonlítása során megállapítottam, hogy a cisz-izomerekből álló cipermetrin keverék lassabban bomlott, mint a transz-cipermetrin izomerek. A fenpropatrin a cipermetrin izomereknél stabilabb vegyületnek bizonyult. A ciklodextrinek valamennyi hatóanyag esetén csökkentették az UV-fény hatására bekövetkező bomlást, a származékoktól függő mértékben. Transz- és cisz-cipermetrin esetén a DIMEB volt a hatásosabb bomlást gátló CD származék, míg a fenpropatrin bomlását a HPBCD
hatóanyag-tartalommal és fokozott kioldódási tulajdonsággal rendelkeznek. Munkám során 3 féle hatóanyag (t-cipermetrin, c-cipermetrin és fenpropatrin) 5 különböző ciklodextrinnel (α-, β-CD, RAMEB, DIMEB és Ac-β-CD) képzett összesen 27 komplexét készítettem el különböző komplexképzési technikákkal. Az elkészített zárványkomplexeket megvizsgáltam és összevetettem hatóanyag-tartalmuk (UV- és HPLC mérések alapján), termoanalitikai jellemzőik és vízben való kioldódási tulajdonságuk szerint. Összehasonlítottam a különböző komplexképzési technikákkal előállított t-cipermetrin/β-CD komplexeket. Azt tapasztaltam, hogy az irodalomból ismert komplexképzési eljárások (együttkristályosítás, szuszpenziós és szilárd fázisú eljárás) nem eredményeztek teljesen komplexált végterméket. A kapott termékek nagy mennyiségű felületen tapadt vendégmolekulát tartalmaztak. Az általam kifejlesztett olvasztásos komplexképzési technika volt az egyetlen módszer, amellyel nagy komplexált hatóanyag-tartalmat lehetett elérni t-cipermetrin/β-CD komplexek esetén. A különböző mólarányban összekevert alkotókból 12,2% hatóanyagtartalomig teljesen komplexált zárványkomplex jött létre, míg ennél nagyobb hatóanyag-tartalomnál szabad vendégmolekula is maradt a mintában. A bemutatott 7 eset közül 3-ban az 1:2,5, illetve az 1:2,8 vendégmolekula/CD arány alakult ki, szilárd állapotban ez lehet a kedvező sztöchiometria. XRPD mérések szerint a megvizsgált komplexek esetén új csúcsok jelentek meg és a tiszta alkotóknál szereplő csúcsok közül némelyek eltűntek, ami új kristályos fázis képződésére utal. Megállapítottam,
hogy
metilezett
ciklodextrin
származékok
esetén
a
komplexképzés
egyértelműen a szilárd fázisú komplexképzési technikával adja a legmagasabb komplexált hatóanyag-tartalmú mintákat, míg a vizes közeget alkalmazó technikák kevésbé hatékonyak. Vizsgálataim szerint acetil-β-ciklodextrinnel képzett komplexek esetén a 25,2% t-cipemetrint tartalmazó minta mutatott egyedül felületen kötött hatóanyagot (a DSC- és kioldódás mérésekben), melynek mennyisége nem volt meghatározható. Ennél kisebb hatóanyag-tartalmú minták teljesen komplexáltnak mutatkoztak. A cisz-cipermetrin esetén – a t-cipermetrinhez hasonlóan – az olvasztásos komplexképzési eljárással teljesen komplexált hatóanyag-tartalmú 1:2 mólarányú zárványkomplexet állítottam elő. A fenpropatrinnál az általam kidolgozott olvasztásos eljárás nem működött olyan jól, mint az előző két esetben; felületen tapadt szabad vendégmolekulát is tartalmazott az így készült minta. Megállapítottam, hogy ennél a hatóanyagnál az együttkristályosítással készült komplex mutatkozott teljesen komplexáltnak, a mólarány ebben az esetben 1:2,1. Megvizsgáltam az elkészített komplexek vízben való kioldódási tulajdonságait. A t-cipermetrin/α-, β-CD, RAMEB és DIMEB-bel képzett komplexeiből víz hatására több hatóanyag szabadult fel, 5
mint a nem komplexált hatóanyagból valamennyi technikával készített komplex esetén. A legnagyobb mértékű kioldódás-fokozást a β-CD-nel olvasztásos módszerrel készített komplexek vizsgálata során tapasztaltam, amelyeknél a víz hozzáadását követően az első pár perc alatt túltelített oldat alakult ki igen magas vendégmolekula koncentrációval, majd ez fokozatosan csökkenve beállt a komplex oldhatóságának értékére. A legkisebb hatóanyagtartalmú, 2%-os komplex esetén is 6-szor nagyobb cipermetrin koncentráció érhető el 8 perc alatt (5,9±0,2 mg/dm3), mint a tiszta cipermetrinből maximálisan kioldódó hatóanyag koncentrációja 700 perc alatt (0,94±0,03 mg/dm3). Hasonló eredmény mutatkozott a c-cipermetrinnel készített komplexekre is. Megállapítottam, hogy a kioldódási tulajdonságot a komplexen kötött hatóanyag-tartalom mellett a felületre tapadt szabad vendégmolekulák mennyisége is befolyásolja, míg az első tényező pozitívan hat a kioldódásra, addig a szabad vendégmolekulák a komplexen kötött hatóanyagok kioldódását gátolják. A fenpropatrinnal készített valamennyi komplex esetén a hatóanyag vízbe való kioldódásának növekedését tapasztaltam. β-CD-nel alkotott komplexek közül az együttkristályosításos technika eredményezte a legnagyobb kioldódás fokozást, míg az Ac-β-CD-nel a tiszta hatóanyagnál kicsit jobb, de a többi β-CD-nel képzett komplexhez viszonyítva mérsékelten fokozott kioldódás érhető el. A t-cipermetrin/Ac-β-CD-nel képzett komplexeit vizsgálva megállapítottam, hogy az elkészített 4 komplexből 3 teljesen komplexáltnak bizonyult és a hatóanyag kioldódását visszatartja, míg a negyedik – a legnagyobb hatóanyagtartalmú minta – a szabad hatóanyagtartalmának köszönhetően a hatóanyaggal teljesen egyező kioldódást mutat. Felismertem, hogy acetil-β-ciklodextrinnel retardált kioldódású formuláció készíthető, megfelelő vendégmolekula/ciklodextrin mólarányt alkalmazva. IV: KÖVETKEZTETÉSEK Új módszert dolgoztam ki szilárd ciklodextrin komplexekben lévő komplexen kötött hatóanyag mennyiségének meghatározására. Ez a módszer hiánypótló a ciklodextrin kutatás területén, mivel igen fontos a komplexált és a felületen kötött vendégmolekula arányának ismerete nem csak növényvédőszerek, hanem gyógyszerek és kozmetikumok területén is. Új ún. olvasztásos komplexképzési technikát dolgoztam ki, amely alacsony olvadáspontú vendégmolekulák esetén használható. Magas komplexen kötött vendégmolekula arány és igen nagy kioldódás fokozás érhető el az így készített komplexekkel. Kísérleteim alapján az általam vizsgált piretroidok esetén a ciklodextrinek és származékaik alkalmazására a következő javaslatokat tettem: 6
1. A β-ciklodextrinnel létrehozott zárványkomplexeket elsősorban szilárd állapotú formulációban érdemes használni, a hatóanyagnak megfelelően a leghatékonyabb komplexképzési módszert alkalmazva. A főként komplexált hatóanyagot tartalmazó minták esetén víz hatására igen erőteljes hatóanyag felszabadulás tapasztalható, tehát kontrollált, gyorsított kioldódású mikrokapszulázott készítmény állítható így elő. 2. Alkilezett ciklodextrin származékokkal jelentős oldhatóság-növekedést és fénybomláscsökkentést érhetünk el, ugyanakkor ezek szilárd állapotú komplexeinek elkészítése problémás, és nem hoz jelentős javulást a β-CD komplexekhez viszonyítva. Ezeket a származékokat elsősorban folyadék formulációk során célszerű használni, hiszen töményebb oldatoknál így elkerülhető a szerves oldószer használata, ezen túlmenően a CD származékok stabilizálják a hatóanyagot, ami ezáltal jobban eltarthatóvá válik. 3. Az acetil-β-ciklodextrin elsősorban szilárd formulációban hasznosítható segédanyagként; hatóanyagtól függően kis mértékben gyorsított, illetve retardált kioldódást eredményez. Összességében megállapítottam, hogy ciklodextrinek alkalmazásával kisebb hatóanyagtartalommal hatékonyabb, kontrollálható (szükség szerint gyorsított vagy lassított) kioldódású, molekulárisan kapszulázott szilárd formulációk; valamint szerves oldószer nélkül előállítható tömény vizes oldatok készíthetők szintetikus piretroidokkal, melyek eltarthatósága fokozott a ciklodextrin nélküli formulációkhoz viszonyítva. Így ciklodextrinek felhasználásával a környezet növényvédőszer (piretroid) túladagolása révén bekövetkező terhelése jelentősen csökkenthető, ami óriási előrelépés lehet a környezetkímélő növényvédelem irányában. V. DOLGOZAT TÉMÁJÁBAN MEGJELENT PUBLIKÁCIÓK Cikkek referált folyóiratban J. Orgoványi, G. A. Lovas, K. H-Otta, E. Oláh, É. Fenyvesi: Investigation of β-cyclodextrin complexes with different cypermethrin content, Journal of Inclusion Phenomena and Macrocyclic Chemistry, közlésre leadva J. Orgoványi, L. Pöppl, K. H.-Otta, Gy. A. Lovas: Thermoanalytical method for studying the guest content in cyclodextrin inclusion complexes, Journal of Thermal Analysis and Calorimetry, Vol. 81 (2005) 261-266 (Impakt faktor: 1,478) J. Orgoványi, K. H.-Otta, L. Pöppl, É. Fenyvesi, Gy. Záray: Spectrophotometric and thermoanalytical study of cypermethrin/cyclodextrin complexes, Microchemical Journal, 79 (2005) 77-82 (Impakt faktor: 1,806) 7
Poszterek J. Orgoványi, G. A. Lovas, K. H-Otta, E. Oláh, É. Fenyvesi: Investigation of β-cyclodextrin complexes with different cypermethrin content, XIII. International Cyclodextrin Symposium, Torino, Italy, May 14-17, 2006 J. Orgoványi, K. H.-Otta, L. Pöppl, É. Fenyvesi, Gy. Záray: Spectrophotometric and thermoanalytical study of cypermethrin/cyclodextrin complexes, XI. Italian-Hungarian Symposium on Spectrochemistry, Venice, Italy, October 19-24, 2003 J.
Orgoványi,
K.
H.-Otta,
L.
Pöppl,
É.
Fenyvesi:
Environmental
importance
of
cypermethrin/cyclodextrin complexes, First International Conference on Environmental Research and Assessment, Bucharest, Romania, March 23-27, 2003 Előadások J.
Orgoványi,
E.
Oláh,
K.
H-Otta,
É.
Fenyvesi:
Controlled
release
properties
of
insecticide/cyclodextrin complexes, Working Committee for Carbohydrate Chemistry of Hungarian Academy of Sciences, Mátrafüred, Hungary, May 31-June 2, 2006 J. Orgoványi, Gy. A. Lovas, L. Pöppl, K. H.-Otta, É. Fenyvesi: Thermoanalytical and X-ray powder
diffractional
investigation
of
cyclodextrin
complexes,
2nd
Austrian-Hungarian
Carbohydrate Conference, Somogyaszaló, Hungary, May 24-26, 2005 Orgoványi J., Pöppl L., Horváthné Otta K.: Növényvédőszerek ciklodextrin komplexeinek vizsgálata termoanalitikai módszerekkel, Magyar Spektrokémiai Vándorgyűlés és a Bioanalitika 2004 szimpózium, Balatonföldvár, 2004. június 30. - július 2. Orgoványi J., Pöppl L., Horváthné Otta Klára: Termoanalitikai módszerek jelentősége növényvédőszer/ciklodextrin komplexek vizsgálatában, MTA Termoanalitikai Munkabizottsági Ülés Dr. Pöppl László emlékére, Budapest, 2003. december 10. Orgoványi J., Pöppl L., Horváthné Otta K.: Cipermetrin/ciklodextrin komplexek kötött hatóanyagtartalmának meghatározása DSC-vel, MTA Termoanalitikai Munkabizottsági Ülés, Budapest, 2001. november 9. Orgoványi J.: Cisz- és transz-cipermetrin kölcsönhatása ciklodextrinekkel, XXIII. Kémiai Előadói Napok, Szeged, 2000. november 20-22.
8
