Nehézfém nanopartikulumok magatartás- és neurotoxikológiai hatásai állatkísérletes modellekben Nagymajtényi László SZTE ÁOK Népegészségtani Intézet
Velence, 2013. október 16.
Porártalmak •
Kémiai kóroki tényező
•
Porképződéssel járó munkakörök – – – – – –
•
bányászat fémipar üveggyártás porcelángyártás faipar mezőgazdaság stb.
Porok egészségkárosító hatása függ – – – – –
expozíciós idő koncentráció kémiai, fizikai tulajdonság szemcse alakja szemcse mérete ülepedő por (>10 µm) lebegő por (1-10 µm) nanorészecskék (<100nm)
Nano-részecskék Eredet természetes – kőzetek hő okozta mállása – vulkáni tevékenység – erdőtűz
mesterséges – égetés - fosszilis tüzelőanyagok – diesel motorok – fémek megmunkálása - kohászat, hegesztés, csiszolás – nanotechnológiai termékek előállítása
Sajátosságok – 1nm-100nm – tömegükhöz képest jelentős felület és darabszám • biológiai aktivitás • lerakódás • határoló hártyákhoz való viszony
A nanorészecskék humán egészségkárosító hatásai Epidemiológia - foglalkozási, környezeti, lakossági (kozmetikumok -Ti,Zn) - UK - 1 millió dolgozó - EU - Határértékek (?), mérési lehetőségek „ - The recent EU definition of nanomaterials will be considered by current and future legislation - The growing importance of the nano sector for the economy and for innovation is recognised - Risk assessment can be conducted with current methods but more research is required (e.g. testing methods/protocols; nano vs bulk form)” (Forrás: NanoSight Webinar)
~800.000 (+400.00) hegesztő - Al, Cd, Cr3x,6+, Cu, F, Fe, Pb, Mn, Mg, Mo, Ni, Si, Ti, Zn; (CO, CO2, NO, NO2, O3) - UV, IR; hő, zaj, vibráció
- pulmonaris funkció, asthma, pneumonitis, pneumoconiosis, fibrosis, tumor neurofunkcionális hatások – manganizmus ♦ diesel kipufogógáz - nanoparticulumok, gázok, (NO2, CO, CO2 stb.) szénhidrogének - légzőrendszeri és szisztémás hatás - olfactorius rendszer - oxidatív stress - légúti gyulladásos folyamat - neurológiai folyamatok (kognitív hatások)
Mangán (Mn) •
Esszenciális mikroelem – enzim kofaktor
Kadmium (Cd) • Foglalkozási expozíció - akkumulátor gyártás; galvanizálás - hegesztés - festék pigmentek - műanyag stabilizálók - réz, ólom cink bányászat - fém ötvözetek
(MnSOD, glutamin szintetáz)
•
•
Foglalkozási expozíció – fémipari folyamatok • • • •
szárazelem gyártás acélgyártás hegesztés festékgyártás/használat
• Lakossági expozíció
Lakossági expozíció
- táplálkozás (gabona félék; máj, vese) - dohányzás (1-2 ug Cd/cigeretta szál)
– MMT (metilciklopentadienil-Mntrikarbonil)
– fungicidek (Maneb, Mancozeb)
•
Toxicitás - KIR
• manganizmus • myoclonus • megváltozott EEG és kérgi kiváltott potenciálok
•
Toxicitás - KIR - amyotrophias lateralis sclerosis - nervus opticus károsodás - peripherias polyneuropathia - striatalis pályák sérülése - megváltozott vizuális és akusztikus kiváltott potenciálok - viselkedés zavarok
Ólom (Pb) •
Foglalkozási expozíció
Vas (Fe) •
– fém, üveg, kerámia ipar – akkumulátor gyártás – festékek
•
•
- haemoglobin, mioglobin - enzimek kofaktora (citokróm) - neurotranszmitter-szintézis - myelogenezis - transzport mechanizmus (transzferrin, DMT-1)
Lakossági expozíció – ólmozott benzin – horgászok, vadászok – dohányzás
• Foglalkozási expozíció - kohászat, acélgyártás, hegesztés - járműipar - elektronika - orvosbiológiaás (célzott terápia, diagnosztika)
Toxicitás - KIR - csökkent tanulási képesség - hallás és egyensúly érzékelés zavara - peripherias polyneuropathia - ideg vezetési sebesség csökkenés
Biológiai szerep
•
Toxicitás - túlzott bevitel - lerakódás - energiatermelés zavara - ROS képződés - oxidatív stressz - lysosoma degradáció - sejthalál
- KIR - Parkinson- és Alzheimer-kór, SM, epilepszia - demielinizáció - AUD KP - Nano - mikrovaszkuláris permeabilitás nő - membránsérülés
Célkitűzések • A humán expozíció modellezése - Bevitt anyag formája szerint • oldat • NP
- Kezelési mód szerint • per os • intranasalis • intratracheális
- Dózis szerint - Önálló adagolás és kombinációk szerint
• A dózis-hatás összefüggések megállapítása - általános toxikológiai hatások (testtömeg, szervtömeg stb.) - elektrofiziológiai változások - magatartási változások
Az alkalmazott nanorészecskék Mangán
Ólom
Kadmium
SZTE TTIK Alkalmazott és Környezeti Kémiai Tanszék
Anyagok és módszerek
Per os kezelés
Intranasalis kezelés
Intratracheális instilláció
Anyagok és módszerek Elektrofiziológia - agykéreg Preparálás – altatás (uretán ip. 1000 mg/kg) – agy feltárása – elektródok elhelyezése • primer szomatoszenzoros (SS) • vizuális (VIS) • auditív (AUD) kérgi mezőkre
Regisztrálás Spontán kérgi aktivitás (ECoG) Kérgi kiváltott válaszok - latencia, amplitudó, időtartam SS: 50 stimulus, 1, 2 és 10 Hz (bajuszmező) AUD: 50 stimulus, 1 Hz (hallójárat, „klikk”) VIS: 50 stimulus, 1 Hz (fényvillanások)
Elektrofiziológia - perifériás ideg – farokideg - ingerlés - elektromos impulzus - sorozat; kettős impulzus - kiváltott válasz - latencia (A-B, A-C),csúcstól-csúcsig amplitúdó (B-C), - második:első arány
B D
0 A
2 mV C
10 ms
Anyagok és módszerek ♦
Open field teszt (OF) - Spontán motoros aktivitás ↓
10-10 perc regisztrálás állatonként • megtett út hossza • helyváltoztatással, helyzetváltoztatással, ágaskodással, mozdulatlansággal töltött idő • események száma
♦
Biokémiai vizsgálatok - SOD, GSH (fehérje)
♦ Szerv
fémtartalom mérés
- (ICP-MS)
♦ (Morfológiai vizsgálatok) Statisztika: SPSS 15.0 for Windows; kétmintás t-próba; varianciaanalízis (F-próba), egyutas-ANOVA, post hoc LSD teszt; MS Excel Lineáris illeszkedés
I. Modell – per os Fém
Vegyület
Dózisok (mg/ttkg)
Mangán oldott forma NP forma
MnCl2 4H2O
15; 60
MnO2
2,63
Kadmium oldott forma
CdCl2 2,5H2O
3,5
NP forma
CdO2
0,04
Ólom oldott forma Pb(CH3COO)2 3H2O NP forma
PbO
80; 320 2
Mangán Ólom
3 hét (po.),3+3 hét (po.+ it.); 6 hét (po.); 6+6 hét (po.+ it.)
Kadmium
3 hét (po.),3+1 hét (po.+ it.); 1+3 hét (it.+po.)
Eredmények Open field aktivitás
Mangán *, **: p<0.05, 0.01 vs. C; #, ##: p<0.05, 0.01 vs. VC.
Eredmények - Mn Kiváltott kérgi aktivitás
1,3 1,2
10 Hz
1
1,1
0,95
1
0,9
0,9
MnVC3 MnL3
MnH3
MnVC3 MnL3
MnVC33 MnL33 MnH33 Csoportok
*,**,***: p<0.05, 0.01, 0.001 vs. MnVC, , , : p<0., .01, 0.001 vs. 1 Hz
1,5 1,4 1,3
AUD
1,2
1
1,1
0,95
1
0,9
0,9
MnVC6 MnL6
VIZ
*** *** *** ***
*** ** **° *** ** *°
°
1,05
*
1,1
*** ** ** °°°
1,15
MnVC33 MnL33 MnH33 Csoportok
*,**,***: p<0.05, 0.01, 0.001 vs. MnVC
Rel. latencia
Szsz
** °°
Rel. latencia 1,2
MnH3
** **
1,05
1,4
*
2 Hz
AUD
* ** ** ***
* *
** °° 1 Hz
**
°°
1,1
°
1,15
VIZ
Rel. latencia 1,5
** *** *** ***
Szsz
*** °°°
Rel. latencia 1,2
MnH6
MnVC66 MnL66 MnH66 Csoportok
MnVC6 MnL6
MnH6
MnVC66 MnL66 MnH66 Csoportok
Eredmények - Mn Perifériás (farok) ideg
*,**,***: p<0.05, 0.01, 0.001 vs. VC
Következtetések I. (per os) • A kiválasztott kezelési sémák és dózisok alkalmazhatóak voltak • Az oldott formával történt per os expozícióhoz viszonyítva a NP formájú fémeknek a bevitt dózishoz képest erőteljesebb hatásuk volt • Mn, Cd - testtömeg-gyarapodás • Mn, Pb, Cd - OF magatartási és kiváltott válaszok
•
A különbségek okai lehetnek • NP-specifikus (oxidatív stressz) • fém-specifikus (megváltozott szinaptikus ingerületátvitel)
• A dózis-hatás összefüggés különbségei • külső dózis - belső dózis (szöveti fémszint) összefüggései
II. modell
Anyagok
Intranasalis
Intratrachealis
I.
III.
II.
Nano MnO2 Oldott MnCl2
Kezelési időtartamok
Egyszeri beadás
3 és 6 hét
Dózisok (Mn mg/ttkg)
10.12
10.12
IV.
Nano MnO2 3 hét
3, 6, 9 hét
(napi 1 vagy 2 kezelés)
2.63 5.26 (napi 2 x 2.63 vagy napi 1 x 5.26)
2.63 5.26
Eredmények - intranasalis Mn Open Field
3 hetes kezelés
6 hetes kezelés *: p< 0,05 vs kontroll csoport **:p<0,01 vs kontroll csoport ##:p<0,01 vs nano-csoport ###: p<0,001 vs nano -csoport
Eredmények - intratranasalis Mn Szenzoros kiváltott potenciálok
*: p< 0,05 vs kontroll csoport #: p<0,05 vs nano-csoport °: p<0,05 vs 1Hz frekvencia
18
Eredmények - intratracheális Mn Open Field
*: p< 0,05 vs kontroll csoport **:p<0,01 vs kontroll csoport #: p<0,05 vs nano-csoport ##:p<0,01 vs nano-csoport
Eredmények - intratracheális Mn Szenzoros kiváltott potenciálok
*: p< 0,05 vs kontroll csoport **:p<0,01 vs kontroll csoport ***: p<0,001 vs kontroll csoport #: p<0,05 vs nano-csoport ##:p<0,01 vs nano-csoport
Eredmények - intratracheális Mn Perifériás (farok) ideg
**:p<0,01 vs kontroll csoport ###:p<0,001 vs nano-csoport
Eredmények - intratracheális Mn Mn-szintek
A: kontroll tüdő, B: kontroll agy C: nagy dózissal kezelt tüdő, D: nagy dózissal kezelt agy
Következtetések II. Oldott és NP Mn kezelés - hasonló (szignifikáns) neurotoxikus hatások - spontán és kiváltott kérgi aktivitás paraméterei szignifikánsan megváltoztak - OF magatartás az inaktivitás irányába tolódott el
- dózisfüggő, kezelési idő függő - a hatások a kumulatív dózissal arányosak
- az oldott és nano-állapotú mangán hatásában nem volt minőségi különbség
Lehetséges mechanizmusok - Glutamáterg hiperaktivitás - EGoG lassú hullámkomponensek csökkenése, gyorsak fokozódása - Kiváltott potenciálok lassulása - glutamát-felhalmozódás, deszenzitizáció
- Mitokondriális toxicitás - Ideg vezetési sebesség csökkenése - Frekvencia-függő jelenségek - a neuronok/rostok kevésbé képesek gyakori ingerlésre reagálni
- Ca-csatorna gátlás - ideg vezetési sebesség, kiváltott potenciálok lassulása - Globus pallidus, striatum károsodás (energia-hiányból eredő nekrózis) - csökkent mozgássebesség - csökkent horizontális és vertikális aktivitás
III. Modell - intratracheális Csoport
Kód
Anyag
Dózis (mg fém / ttkg)
A kezelés időtartama
Kezeletlen kontrol
K
---
---
3, 6, 9 hét
Vivőanyagos kontrol
VK
Desztillált víz
---
3, 6, 9 hét
Mangán, kis dózis
Mn-KD
Mangán, nagy dózis
Mn-ND
Kadmium, kis dózis
Cd-KD
Kadmium, nagy dózis
Cd-ND
Ólom, kis dózis
Pb-KD
Ólom, nagy dózis
Pb-ND
MnO2 nanoszuszpenzió
CdO2 nanoszuszpenzió PbO nanoszuszpenzió
2,63 3, 6, 9 hét 5,26 0,04 3, 6 hét 0,40
2,00 4,00
3, 6 hét
Eredmények - Mn Kérgi kiváltott potenciálok SS latencia
VIS, AUD latencia
Perifériás (farok) ideg vezetési sebesség
Eredmények
- Mn szint és oxidatív stressz paraméterek
Csoportok
VK
Mn-KD
Agy Mn, ppb (n=8)
1931 476
Vér Mn, ppb (n=8)
514 217
782 169
1022 206*
Agy SOD, U/mg prot. (n=5)
46.65 3.26
49.83 4.83
70.57 9.52***
Agy Mn-SOD, U/mg prot. (n=5)
10.97 4.89
14.94 9.51
25.54 21.01
Agy GSH, μM (n=5)
0.0937 0.0058
0.0894 0.0038
0.0825 0.0043*
7151 2863**
Mn-ND 7230 2910**
Következtetések III. Szuszpendált fém nanorészecskék ismételt, több hetes intratracheális instillálása technikailag kivitelezhető (6, ill. 9 hét instillálás után magas fémszintek a szervekben)
Funkcionális idegrendszeri elváltozások mutathatók ki Legérzékenyebb - kérgi kiváltott potenciálok - Mn, Pb, Cd - perifériás idegvezetés, OF - Mn, Pb
Az oxidatív stresszre jellemző változások mérsékeltek
Mn, Pb - fémszintek - neurofunkcionális elváltozások (ECoG index) - fémszintek - oxidatív stressz markerek (agyi GSH)
Cd - neurofiziológiai és biokémiai elváltozások - vérben és agyban Cd nem volt kimutatható
Hasonló neurofunkcionális elváltozások → közös hatásmechanizmus (?) - oxidatív stressz, Ca-függő folyamatok, jelátvivő rendszerek - Mn, Pb, Cd – glutamát forgalom megzavarása
- deszenzitizálhatja a postsynapticus receptorokat → gyengébb/lassúbb postsynapticus excitatio → formatio reticularis↑→fokozott corticalis aktiváció
- OF – dopaminerg rendszer
dopaminerg neuronok különösen érzékenyek az oxidatív stresszre
IV. Modell - kombinációk I. kísérlet (Szubakut per os)
II. kísérlet
III. kísérlet
(Szubakut (Szubakut intratracheális) intratracheális)
Időtartam
6 hét
5 hét
Az alkalmazott fémek és dózisok
MnCl2 4 H2O
MnCl2 . 4 H2O
2,5 mg/ml 0,5 mg/ttkg
4 hét Fe3O4, MnO2, Cr(OH)3 NP-ok
IV. kísérlet (Szubakut kombinált intratracheális)
4 hét Fe3O4, MnO2, Cr(OH)3 NP-ok kettős, kis dózis: illetve 2 mg/ttkg hármas nagy dózis: kombinációi: 4 mg/ttkg 2 mg/ttkg
EREDMÉNYEK - III-IV. KÍSÉRLET Rel. latencia 1,3
SS &
1,25
1 Hz
1,2
&&&
&&&
1,15
*
*
&&
1,1
& &&
* *
1
*
*
*
10 Hz
&&
* &&&
&
&
*
1,05
2 Hz
*
*
***
*
**
*
*
*
0,95 0,9 0,85 0,8 FMVC
FeLD
FeHD
MnLD
Rel. latencia 1,3
MnHD
CrVC
CrLD
CrHD
SS 1 Hz
1,25
2 Hz
10 Hz
&
&&&
***
**
1,2 1,15 1,1
***
&&&
&&
** **
1,05
&
&
* ***
1 0,95 0,9 0,85 0,8 VC
FM
MC
FC
FMC
*, **, *** p<0,05, 0,01, 0,001 vs. megfelelő vivőkontroll &, &&, &&& p<0,05, 0,01, 0,001 vs. 1 Hz
EREDMÉNYEK - III-IV. KÍSÉRLET Rel. latencia 1,4
VIZ
AUD
**
1,3
*
***
1,2
*** *
** 1,1 1 0,9 0,8 FMVC Rel. latencia 1,4
FeLD
FeHD
MnLD
MnHD VIZ
CrVC
CrLD
CrHD
AUD
1,3
*
*
1,2
*
1,1 1 0,9 0,8 VC
FM
MC
FC
FMC
*, **, *** p<0,05, 0,01, 0,001 vs. megfelelő vivőkontroll
Következtetések IV. • A modellben Azonos kísérleti körülmények között a Cr ~ Mn Fe hatása minimális, részben ellentétes a Mn-éval
• A fémek interakciói Mn-nak a testtömeg gyarapodásra kifejtett negatív hatását a Fe kivédte Cr látszólag nem vett részt ilyen interakcióban Szöveti fémszintek - a Fe befolyással volt a Cr-ra, a Mn-ra azonban nem A belső dózisok szerepe a funkcionális elváltozások kialakításában nem kizárólagos nem a legjobb biomarkerek
A modellek általános/összefoglaló értékelése • A kísérleti rendszer alkalmasnak mutatkozott a NP expozíció idegrendszeri hatásainak modellezésére • • • •
bevitt anyag formája kezelési mód dózis (küls/belső dózis) önálló/kombinált adagolás
• Az elektrofiziológiai (és magatartási) vizsgálati módszerek • megfelelkők lehetnek az idegrendszeri elváltozások detektálására és nyomon követésére • egyes mért paraméterek potenciálisan biomarkernek tekinthetők - kiváltott potenciál latencia, kettős ingerlés második:első aránya
• Humán adatok trendbeli azonossága - adekvát a modell (?)
A kísérleteket vezették/végezték - Papp András egy. docens - Szabó Andrea egy. adjunktus - Lukács Anita egy. tanársegéd - Horváth Edina (PhD) - Máté Zsuzsanna (PhD) - Oszlánczy Gábor PhD) - Sárközi Leila (PhD) - Takács Szabolcs (PhD)
Köszönetnyílvánítás - SZTE TTIK Alkalmazott és Környezeti Kémiai Tanszék - †Prof. Dr. Kiricsi Imre - Kónya Zoltán és kollégái - MOL Analitikai Laboratórium (Algyő) - Szőke Attila és kollégái
KÖSZÖNÖM A FIGYELMET!
