Název disertační práce

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav agrochemie, půdoznalství, mikrobiologie a výživy rostlin

Název disertační práce Mikroorganismy s dekarboxylázovou aktivitou z mléka a mléčných výrobků

Vedoucí práce: Ing. Libor Kalhotka, Ph.D.

Vypracovala: Ing. Michaela Hůlová

Brno 2013

PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem disertační práci na téma Mikroorganismy s dekarboxylázovou aktivitou z mléka a mléčných výrobků vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji uvádím v přiloženém seznamu literatury. Disertační práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. dne ………………………………………. Podpis

doktoranda

………………

PODĚKOVÁNÍ Ráda bych touto cestou poděkovala Ing. Liboru Kalhotkovi, Ph.D. za odborné vedení, konzultace, cenné rady a ochotu při zpracování této disertační práce. Dále bych chtěla poděkovat také své rodině za veškerou podporu a trpělivost v průběhu celého studia. Disertační práce vznikla s podporou projektu MŠMT 2B08069 Národní program výzkumu - NPV II, program 2B - Výzkum vztahů mezi vlastnostmi kontaminující mikroflóry a tvorbou biogenních aminů jako rizikových toxikantů v systému hodnocení zdravotní nezávadnosti sýrů na spotřebitelském trhu a projektu IGA AF MENDELU – IP 2003/2010 – Metabolická aktivita kontaminujících mikroorganismů v mléce a mléčných výrobcích.

ABSTRAKT Disertační práce se zabývá bakteriemi, které jsou schopné dekarboxylovat jednu nebo více aminokyselin a tím se podílet na tvorbě biogenních aminů. Cílem disertační práce bylo charakterizovat dekarboxylázovou aktivitu bakterií Escherichia coli, Bacillus, Lactobacillus, Enterococcus izolovaných z mléka a mléčných výrobků. Mikroorganismy byly inokulovány do zkumavek s diagnostickým médiem. Pro testování bylo použito 7 aminokyselin. Inkubace zkumavek probíhala při teplotě 6, 25, 30 a 37 °C po dobu 10 dnů v jejichž průběhu byla kontrolována barevná změna. U testovaných izolátů Escherichia coli byla zjištěna dekarboxylázová aktivita a to především pro tyrozin a ornitin. U bakterie Bacillus licheniformis byla zjištěna dekarboxylázová aktivita a to především pro tyrozin. U testovaných izolátů bakterie Lactobacillus byla prokázána nejsilnější dekarboxylázová aktivita především pro arginin. U bakterie Enterococcus byla prokázána nejsilnější dekarboxylázová aktivita především pro arginin. Dále byla sledována produkce oxidu uhličitého a tvorba biogenních aminů kontaminujícími mikroorganismy v kravském a kozím tvarohu. Klíčová slova : Dekarboxylázová aktivita, biogenní aminy, aminokyselina

ABSTRACT This thesis deals with bacteria that are capable decarboxylase one or more amino acids and thus contribute to the formation of biogenic amines. The aim of this work was to characterize the bacteria with decarboxylase activitthe Escherichia coli, Bacillus, Lactobacillus, Enterococcus isolated from milk and dairy products. Microorganisms were inoculated into tubes with diagnostic medium. To test was used seven amino acids. Incubation tubes conducted at 6, 25, 30 and 37 ° C for 10 days during which the color change was monitored. The tested isolates of Escherichia coli were detected decarboxylase activity, especially for tyrosine and ornithine. The bacterium Bacillus licheniformis was found decarboxylase activity, especially on tyrosine. The bacteria Lactobacillus isolates tested were shown the strongest decarboxylase activity especially for arginine. The bacteria Enterococcus was demonstrated the strongest decarboxylase activity especially for arginine. Furthermore, the observed production of carbon dioxide and formation of biogenic amines contaminating microorganisms in cow’s and goat’s curd. Keywords: Decarboxylase activity, biogenic amines, amino acid

OBSAH 1 ÚVOD………………………………………………………………………………………8 2 LITERÁRNÍ PŘEHLED……………………………………………………………... ….9 2.1 Dekaboxylázová aktivita mikroorganismů……………………………………………...9 2.2 Mikroorganismy s dekarboxylázovou aktivitou………………………………………...9 2.2.1 Nežádoucí bakteriální kontaminanty…………………………………………………10 2.2.1.1 Čeleď Enterobacteriaceae ……………………………………………………......10 2.2.1.2 Čeleď Bacillaceae…………………………………………………………………….......14 2.2.1.3 Čeleď Pseudomonadaceae ……………………………………………………………....16 2.2.1.4 Čeleď Staphylococcaceae………………………………………………………………..16 2.2.1.5 Čeleď Micrococcaceae……………………………………………………………….......17 2.2.2 Bakterie mléčného kvašení……………………………………………………….......17 2.2.2.1 Čeleď Lactobacillaceae……………………………………………………………..........18 2.2.2.2 Čeleď Streptococcaceae………………………………………………………………......21 2.2.2.3 Čeleď Enterococcaceae……………………………………………………………….......24 2.2.2.4 Čeleď Propionibacteriaceae………………………………………………………….......25 2.3 Biogenní aminy………………………………………………………………………......25 2.3.1 Faktory ovlivňující růst mikroorganismů a dekarboxylázovou aktivitou a tvorbu biogenních aminů…………………………………………………………………………......26 2.3.1.1 Dostupnost substrátu……………………………………………………………….27 2.3.1.2 Aktivita vody………………………………………………………………………27 2.3.1.3 Teplota……………………………………………………………………………..29 2.3.1.4 pH…………………………………………………………………………………..30 2.3.1.5 Koncentrace soli…………………………………………………………………....31 2.3.1.6 Redox potenciál přístupu kyslíku ………………………………………………….32 2.3.1.7 Doba zrání a skladování……………………………………………………………33 2.3.1.8 Startovací kultury…………………………………………………………………..34 2.3.1.9 Přísná aplikace hygienických zásad získávání surovin i při jejich následném zpracování ……………………………………………………………………………………35 2.3.1.10 Tepelné ošetření mléka…………………………………………………………...35 2.3.1.11 Homogenizace…………………………………………………………………….35 2.3.2 Fyziologické účinky biogenních aminů……………………………………………….36 2.3.3 Toxikologické účinky biogenních aminů……………………………………………...37 5

2.3.4 Reakce biogenních aminů……………………………………………………………39 2.3.5 Odbourávání biogenních aminů v organismu………………………………………..39 2.3.6 Hygienické limity obsahu biogenní aminů v potravinách…………………………… 40 2.3.7 Snížení hladiny biogenních aminů v potravině……………………………………….41 2.3.8 Výskyt biogenních aminů v mléce a mléčných produktech………………………... 42 2.3.8.1 Biogenní aminy v mléce…………………………………………………………. 42 2.3.8.2 Biogenní aminy v sýrech………………………………………………………….42 2.3.8.3 Biogenní aminy v ostatních mléčných produktech………………………………. 48 3 CÍL PRÁCE……………………………………………………………………………… 49 4 MATERIÁLY A METODY……………………………………………………………... 50 4.1 Metoda průkazu dekarboxylázové aktivity mikroorganismů………………………….. 50 4.1.2 Mikroorganismy testované na dekarboxylázovou aktivitu………………………….. 52 4.1.2.1 Testované izoláty Escherichia coli ………………………………………………. 52 4.1.2.2 Testované izoláty Bacillus licheniformis…………………………………………..53 4.1.2.3 Testované izoláty rodu Bacillus……………………………………………………54 4.1.2.4 Testované izoláty rodu Lactobacillus……………………………………………………54 4.1.2.5 Testované izoláty rodu Enterococcus……………………………………………………55 4.2 Kontaminující mikroorganismy v mléce a mléčných výrobcích a tvorba biogenních aminů………………………………………………………………………………………….56 4.2.1 Inokulace a kultivace mikroorganismů……………………………………………….56 4.2.2 Stanovení produkce oxidu uhličitého………………………………………………...58 4.2.3 Stanovení biogenních aminů………………………………………………………….59 5 VÝSLEDKY……………………………………………………………………………….60 5.1 Dekarboxylázová aktivita mikroorganismů……………………………………………..60 5.1.1 Dekarboxylázová aktivita Escherichia coli………………………………………………..60 5.1.2 Dekarboxylázová aktivita Bacillus licheniformis………………………………………....69 5.1.3 Dekarboxylázová aktivita rodu Bacillus……………………………………………...76 5.1.4 Dekarboxylázová aktivita rodu Lactobacillus………………………………………..80 5.1.5 Dekarboxylázová aktivita rodu Enterococcus………………………………………..83

6

5.2 Kontaminující mikroorganismy v mléce a v tvarohu a jejich tvorba biogenních aminů a produkce oxidu uhličitého…………………………………………………………………..88 5.2.1 Produkce biogenních aminů bakterií Enterococcus faecium…………………………93 5.2.2 Produkce biogenních aminů bakterií Enterobacter aerogenes……………………….96 5.2.3 Produkce biogenních aminů bakterií Escherichia coli………………………………..99 5.2.4 Produkce biogenních aminů bakterií Pseudomonas fluorescens……………………102 5.2.5 Produkce biogenních aminů bakterií Proteus vulgaris……………………………...104 5.2.6 Produkce biogenních aminů mikromycetou Geotrichum candidum………………...107 6 ZÁVĚR……………………………………………………………………………………110 7 SUMMARY………………………………………………………………………………112 8 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY…………………………………………………..113

7

1 ÚVOD Mléko a mléčné výrobky představují vhodné prostředí pro růst mikroorganismů, které svou metabolickou činností mohou ovlivnit příznivě nebo nepříznivě kvalitu a biologickou hodnotu výrobku (GRIGER, HOLEC, 1990). Mikroorganismy v mléce mohou vyvolat různé změny, které jsou závislé především na druhu mikroorganismu a na složce mléka, kterou tyto mikroorganismy rozkládají. Mezi hlavní změny, které vyvolávají mikroorganismy v mléce a mléčných výrobcích, patří změny vyvolané fermentační činností mikroorganismů, dále změny způsobené proteolýzou, lipolýzou, tvorbou alkalické reakce mléka, případně slizovatění mléka, změny barvy, tvorba biogenních aminů aj. (CEMPÍRKOVÁ et al., 1997). Při hodnocení zdravotní nezávadnosti potravin se hlavní pozornost věnuje cizorodým látkám kontaminujícím. Naproti tomu přirozené škodlivé složky, ať již obsažené v potravních surovinách nebo vznikající během skladování a zpracování, jsou až na výjimky (mykotoxiny, glykoalkaloidy) sledovány podstatně v menší míře. Do této skupiny patří rovněž biogenní aminy a zčásti i polyaminy (KALAČ, KŘÍŽEK, 2005). Některé biogenní aminy jsou pro organismus nepostradatelné, neboť mají významné biologické funkce. Jsou zdrojem dusíku, prekurzory pro syntézu hormonů nebo samy působí jako hormony, podílejí se na syntéze nukleových kyselin, proteinů, alkaloidů atd. (SILLA SANTOS, 1996). Spotřeba potravin obsahující vysoké koncentrace některých aminů může vyvolat nežádoucí účinky. Symptomy konzumace vysokých dávek biogenní aminy jsou především nucení ke zvracení, dýchací potíže, bušení srdce, bolesti hlavy, zrudnutí v obličeji, pálení v ústech, červená vyrážka na kůži, hypotenze a hypertenze (VELÍŠEK, 2002; KALAČ, KŘÍŽEK, 2002). Koncentrace biogenních aminů v čerstvém mléce je nepatrná, výskyt je většinou pod 1 mg/l. Podmínkou vzniku toxického množství aminů v mléčných výrobcích je proteolýza, která je při zrání sýrů považována za jeden z nejdůležitějších pochodů ovlivňující kvalitu sýra. Na proteolýze mléčných bílkovin se podílejí nativní proteázy z mléka, proteázy zákysových kultur, syřidlové enzymy, proteázy kontaminující mikroflóry, ale hlavně bakterie startovacích kultur (Lactococcus lactis, Lactobacillus delbrueckii subs. bulgaricus, Enterococcus faecalis a Enterococcus faecium) (GREIF, GREIFOVÁ, 2006). Pozitivně dekarboxylující mikroorganismy mohou být tedy součástí mikroflóry potravin, ale mohou být i jako důsledek kontaminace během výroby a skladování potravin. Proto je potřeba věnovat 8

náležitou pozornost výběru surovin, jejich mikrobiologické kvalitě, ale i technologickým operacím a skladovacím podmínkám (GREIF, GREIFOVÁ, 2004).

2 LITERÁRNÍ PŘEHLED 2.1 Dekarboxylázová aktivita mikroorganismů Biogenní aminy (BA) vznikají v potravinách především působením bakterií, jejichž enzymy dekarboxylázy odštěpují karboxylové skupiny z dané aminokyseliny za vzniku aminu a oxidu uhličitého (KALAČ, KŘÍŽEK 2002). Dekarboxylázy jsou enzymy řazené do třídy lyáz, které jsou většinou orientované na určitou aminokyselinu především její L- formy. Rozhodující složkou dekarboxyláz je pyridoxal-5-fosfát, což je forma vitamínu B6, která se může jako kofaktor účastnit metabolických pochodů spojených s přeměnami aminokyselin zahrnujících např. transaminaci a dekarboxylaci (GREIF, GREIFOVÁ, 1998). Zjistilo se, že může dekarboxylace proběhnout i bez pyridoxal-5-fosfátu. Tato dekarboxylace požaduje pyruvoylový zbytek, který je vázán kovalentní vazbou k amino skupině fenylalaninového zbytku enzymu. Tento aktivní proenzym pyruvyolového zbytku se chová v dekarboxylační rekaci podobně jako pyridoxal-5-fosfát (SHALABY, 1996, cit. podle KRAJNACOVÁ, 2011). Dekarboxylázy mohou navenek měnit oblasti účinku a intenzitu aktivity a některé mikrobiální dekarboxylázy přežívají i podmínky pasterace, takže enzymy mohou působit i přes nepřítomnost inhibovaných mikroorganismů (GREIF, GREIFOVÁ, 1998). Tyto enzymy jsou rozdílné pro různé druhy mikroorganismů.

2.2 Mikroorganismy s dekarboxylázovou aktivitou Mezi bakterie, které mohou produkovat dekarboxylázy a podílet se tak na vzniku biogenních aminů, patří v mléce a mléčných výrobcích např. druhy rodu Bacillus, Clostridium,

Pseudomonas,

Staphylococcus,

Micrococcus

dále

bakterie

čeledi

Enterobacteriaceae (např. Citrobacter, Escherichia, Klebsiella, Proteus, Enterobacter, Salmonella, Shigella, Hafnia) a některé bakterie mléčného kvašení Lactobacillus, Pediococcus a Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus a Leuconostoc nebo i probiotické a startovací kultury (SILLA SANTOS, 1996; KALHOTKA et al., 2001; ČERNÝ et al., 2009). Produkce biogenních aminů je vlastnost specifická spíše pro určité kmeny bakterií než vlastnost pro daný druh, takže různé kmeny téhož druhu se mohou lišit v produkci biogenních aminů (ARENA, MANCA DE NADRA, 2001).

9

2.2.1 Nežádoucí bakteriální kontaminanty 2.2.1.1 Čeleď Enterobacteriaceae Čeleď Enterobacteriaceae zahrnuje gramnegativní, nesporulující tyčinky. Jsou to fakultativně anaerobní mikroby a pro většinu druhů je teplotní optimum 37 °C, ale dobře snášejí i změny teplot a do jisté míry i vyschnutí. Enterobacteriaceae většinou fermentují glukózu, ale fermentují i jiné sacharidy za tvorby kyseliny mléčné, kyseliny octové a jiných kyselin ve stopovém množství a obyčejně za tvorby plynu (CO2 a H2). Jsou oxidáza negativní a redukují dusičnan na dusitan (GÖRNER, VALÍK, 2004). Biochemické vlastnosti enterobakterií se liší i mezidruhově. Parazitické druhy (Salmonella sp., Shigella sp.) jsou zpravidla méně aktivní, saprofytické jsou aktivnější, protože by těžko mohly využívat nejrůznější

organické

zbytky.

Pozoruhodnou

vlastností

některých

bakterií

čeledi

Enterobacteriaceae (Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter) je schopnost vázat molekulární dusík. Využívají této schopnosti ovšem jen v nouzi (ZAHRADNÍČEK 2003). Mezi bakterie, které jsou schopné dekarboxylovat jednu nebo více aminokyselin a tím se podílet na tvorbě BA patří: Enterobacter, Escherichia, Citrobacter, Hafnia, Klebsiela, Leclercia, Pantoea, Plesiomonas, Proteus, Serratia, které se podílejí na kažení potravin (SIILA SANTOS, 1995; SHALABY, 1996). Tyto druhy jsou spojovány s tvorbou kadaverinu a putrescinu (BOVER-CID, HOLZAPFEL, 1999). Putrescin by mohl sloužit jako indikátor kvality v sýrařství (MARINO et al., 2008). Dále existuje pozitivní korelace mezi koncentrací kadaverinu a množstvím Enterobacteriaceae v sýrech (MARINO et al., 2000). Mnoho bakterií čeledi Enterobacteriaceae může tvořit značné množství histaminu, zejména E. cloacae, E. aerogenes, Klebsiella oxytoca, E. coli, Proteus morganii (SUZI, GARDINI, 2003). Vysoké hladiny putrescinu (PUT) jako důsledek kontaminace bakteriemi čeledi Enterobacteriaceae jsou časté u tradičních jihoevropských sýrů, které se obvykle vyrábějí z nepasterovaného mléka za nedostatečných hygienických podmínek (GALGANO et al. 2001; MARTUSCELLI et al., 2005). Enterobakterie jsou značně termolabilní, ale při nedostatečném tepelném ošetření mléka nebo masivní kontaminaci během výroby však může dojít k uvolnění dekarboxyláz již v počátečních fázích a následné tvorbě BA i v nepřítomnosti mikroorganismů (FONTECHA et al., 1990; ROIG-SAGUÉS et al., 2002).

10

Rod Citrobacter Jsou gramnegativní tyčinky, vyskytující se jednotlivě nebo v párech, jsou peritrichní, fakultativně anerobní. Optimální teplota růstu je 37 °C. Je běžný obyvatel střevního traktu zvířat a člověka, ale ve vyšších koncentracích může způsobit onemocnění oslabených jedinců. Významným druhem vyskytující se v potravinách je Citrobacter freundii a Citrobacter intermedius. Často se vyskytuje v kontaminovaných potravinách a v kontaminované vodě (GÖRNER, VALÍK, 2004; KALHOTKA, 2007; ŠILHÁNKOVÁ, 2008). U bakterie Citrobacter feundii je zjištěna produkce putrescinu, kadaverinu a histaminu (BOVER-CID, HOLZAPFEL, 1999).

Rod Enterobacter Gramnegativní, fakultativně anaerobní tyčinky, jejich optimální teplota růstu je 30 až 37 °C (SEDLÁČEK, 2007). Tyto bakterie jsou schopny přežívat pouze v prostředí o pH vyšším než 4,2 (GREIF et al., 1999). Vyskytují se ve střevním traktu, rostlinách, sekundárně i v mléce. Účastní se kažení potravin, patří do skupiny koliformních mikroorganismů, zkvašují sacharidy za vzniku oxidu uhličitého a vodíku (GÖRNER, VALÍK, 2004). Jsou široce rozšířené v prostředí, nacházejí se ve sladké vodě, půdě, odpadní vodě, na rostlinách, zelenině, ve zvířecích výkalech i lidské stolici (SEDLÁČEK, 2007). Nejvýznamnější pro člověka jsou druhy Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes a Enterobacter sakazakii (ZAHRADNÍČEK, 2003). Enterobakterie patří mezi významné producenty kadaverinu (CAD) a putrescinu (PUT) (SCHIRONE, 2012).

Rod Escherichia Gramnegativní, fakultativně anaerobní, rovné tyčinky vyskytující se jednotlivě a ve dvojicích. Optimální teplota růstu je 37 °C. Vyskytuje se jako normální flóra v koncové části střevního traktu teplokrevných zvířat (SEDLÁČEK, 2007). Některé kmeny jsou však schopné vyvolat onemocnění v mírném rozsahu ve formě průjmu anebo mohou vést k potenciálně smrtelným komplikacím jako je hemolyticko - uremický syndrom (HEREDYA et al., 2009). Ve střevě je to možné jen tehdy, když je kmen vybaven specifickými faktory virulence. Mimo střevo je E. coli téměř vždy patogenní. Biochemicky je to průměrně aktivní bakterie. Štěpí glukózu a laktózu za tvorby plynu, tvoří indol a neštěpí močovinu (ZAHRADNÍČEK, 2003). 11

GREIF, GREIFOVÁ (2004) zjistili u E. coli produkci lyzindekarboxylázy v důsledku toho vzniká kadaverin a také zjistili produkci putrescinu. Dále byla zjištěna produkce tyrozina histidindekarboxylázy (SIILA SANTOS, 1996).

Rod Hafnia Gramnegativní, fakultativně anaerobní tyčinky, jejich optimální teplota růstu je 30 - 37 °C (SEDLÁČEK, 2007). Jediným druhem je Hafnia alvei, která je přirozeným patogenem včel (ZAHRADNÍČEK, 2003). Podílí se na kažení potravin (GÖRNER, VALÍK, 2004). Produkce histaminu byla zjištěna v mletém mase a v rybách (SHALABY, 1996).

Rod Klebsiella Gramnegativní, fakultativně aerobní tyčinky vyskytující se jednotlivě nebo v řetízcích. Optimální teplota růstu je 37 °C (SEDLÁČEK, 2007). Je blízká rodu Enterobacter se kterým sdílí řadu charakteristik. Je ale lépe adaptovaná i na život mimo střevo (ZAHRADNÍČEK, 2003). Mezi nejvýznamnější druhy patří Klebsiella oxytoca a Klebsiella pneumonie. Klebsiella pneumonie bývá přítomna ve střevním traktu člověka a zvířat, v půdě a ve vodě. Za vhodných podmínek může produkovat enterotoxiny s podobnými vlastnostmi jako mají enterotoxiny E. coli (GÖRNER, VALÍK, 2004). BOVER-CID, HOLZAPFEL (1999) zjistili u bakterie Klebsiella oxytoca produkci histaminu a kadaverinu.

Rod Leclercia Gramnegativní, pohyblivé tyčinky s optimální teplotou růstu 37 °C. Jsou indol a ornitindekarboxyláza pozitivní, negativní arginindekarboxyláza. Zástupce: L. adecarboxylata (SEDLÁČEK, 2007).

Rod Pantoea Gramnegativní, pohyblivé tyčinky, jejich optimální růstová teplota je 30 °C. Netvoří plyn, indol negativní. Většinou produkuje žlutý pigment. Oportunní patogen člověka, některé jsou fytopatogenní. Zástupce: P. aglomerans (SEDLÁČEK 2007).

Rod Plesiomonas Gramnegativní tyčinky, pohyblivé pomocí polárních bičíků. Optimální teplota růstu je 37 °C. Netvoří plyn, oxidáza i kataláza pozitivní. Produkují indol a dekarboxylují lyzin 12

a ornitin. U člověka způsobuje průjmová onemocnění a příležitostně oportunní infekce. Rod obsahuje pouze jeden druh: P. schigeloides (SEDLÁČEK, 2007) a u něj byla zjištěna produkce histidindekarboxylázy (SHALABY, 1996).

Rod Proteus Gramnegativní, pohyblivé, fakultativně anaerobní tyčinky, optimální teplota růstu je 37 °C (SEDLÁČEK, 2007). Obecně se jedná o bakterie s mohutnou biochemickou, především proteolytickou aktivitou. Jde o saprofyty dokonale přizpůsobené k likvidaci organických zbytků. Výrazně štěpí močovinu, oxidačně deaminují fenylalanin a tryptofan, lyzin nedekarboxylují, jsou agrinindihydroláza negativní a také tvoří sirovodík (ZAHRADNÍČEK, 2003, KALHOTKA 2007). Vyskytují se ve střevním traktu člověka a zvířat, dále nacházíme v hnoji, půdě a znečištěných vodách. Hlavními zástupci jsou: Proteus mirabilis, Proteus vulgaris a Proteus penneri, Proteus morganii (SEDLÁČEK, 2007). U bakterií Proteus morganii a Proteus vulgaris byla zjištěna produkce histaminu v rybích výrobcích (SHALABY, 1996).

Rod Salmonella Jsou to gramnegativní, fakultativně anaerobní tyčinky. Optimální teplota růstu je 37 °C, nicméně, některé kmeny jsou schopny růst i při teplotách 4 °C (FERNANDES, 2009). Na rostlinách, v hnoji a v potravinách přežívají někdy měsíce až rok a přitom si zachovávají svoji virulenci. V bujónové kultuře se devitalizují okamžitým zahřátím na 72 °C a při 57 °C 10 minut. Při pasteraci mléka a při pasteraci vaječné směsi jsou spolehlivě devitalizovány. Přenos na člověka je kontaminovanými potravinami. Do této skupiny patří salmonely náležející k sérovarům typhi, paratyphi A, B, C - původci břišního tyfu a S. enteriditispůvodce salmonelózy (GÖRNER, VALÍK, 2004).

Rod Shigella Jsou to gramnegativní, nepohyblivé tyčinky, které nefermentují laktózu. Mohou přežít při nízkém pH několik hodin (HEREDYA et al., 2009). Jsou původci bacilární úplavice, kterou mohou způsobit při nízké infekční dávce 10 až 100 buněk. Je to onemocnění, které se vyznačuje střevními křečemi, krvavými průjmy a neurologickými příznaky jako jsou bolesti hlavy, letargie, zmatenost. Jde o nemoc tzv. špinavých rukou. Výrazným rozdílem oproti salmonelóze je, že u shigelózy jde o čistě lidskou infekci bez zvířecích rezervoárů 13

(ZAHRADNÍČEK, 2003; HEREDYA et al., 2009). U bakterie Shigella byla zjištěna produkce tyraminu (SILLA SANTOS, 1996).

2.2.1.2 Čeleď Bacillaceae Rod Bacillus Zahrnuje grampozitivní, fakultativně anaerobní, pohyblivé, sporulující tyčinky s optimální teplotou růstu kolem 37 °C (DE VOS et al., 2009). Bakterie tohoto rodu nesnášejí nižší pH (GÖRNER, VALÍK, 2004). Důležitým znakem tohoto rodu je schopnost tvořit jednu endosporu. Sporulace probíhá pouze za přítomnosti kyslíku, protože pro sporulaci získává buňka energii především oxidací zásobních lipidů z cytoplazmy (RŮŽIČKA, 2003). Štěpí bílkoviny za vzniku amoniaku. Sacharidy fermentují s méně výraznou tvorbou kyselin a některé i s tvorbou plynu. Druhy: psychrotrofní - Bacillus insolitus, B. globisporus mezofilní - B. cereus, B. antracis, B. megaterium a jiné termofilní - B. stearothermophillus, B. coagulans, B. acidicaldarius, B. substilis, B. licheniformis (GÖRNER, VALÍK, 2004). Bacillus cereus je kultivačně nenáročná, fakultativně anaerobní bakterie, schopná růst v širokém teplotním rozmezí 8 - 55 °C a při pH 4,9 - 9,3 (RŮŽIČKA, 2003). Kataláza pozitivní a oxidáza negativní. Citrát využívá jako jediný zdroj uhlíku. Deaminuje tyrozin (DE VOS et al., 2009). Původním stanovištěm je půda a prach a jimi kontaminované potraviny rostlinného a živočišného původu jako masitá hotová jídla, rýže, zelenina, ale i mléko a mléčné výrobky, pudinky a jiné (GÖRNER, VALÍK, 2004). B. cereus je producentem řady toxinů a enzymů např. fosfolipázy C, hemolyzin. Za vznik enterotoxikóz jsou zodpovědné enterotoxiny: průjmový a emetický toxin (RŮŽIČKA, 2003). RODRIGUEZ-JEREZ et al. (1994) cit. podle SHALABY (1996) vyizolovali z italského sýra Bacillus macerans tvořící histamin. Bacillus stearothermophilus je schopen aktivního růstu za nepřístupu kyslíku, jeho spory jsou silně termorezistentní, takže často přežívají tepelný sterilační zákrok u nekyselých zeleninových a masozeleninových konzerv. Může být příčinou tzv. plynoprostého kysnutí nekyselých konzerv, neboť při vhodné teplotě tvoří značné množstvé kyselin. Intenzivně se rozmnožuje při teplotě 55 - 65 °C (ŠILHÁNKOVÁ, 2008). Bacillus coagulans bývá rovněž příčinou plynuprostého kažení teplem sterilovaných konzerv. Optimální teplota růstu je při 45 - 55 °C (ŠILHÁNKOVÁ, 2008). 14

Bacillus licheniformis je také fakultativně anaerobní, pohyblivá tyčinka, vyskytující se jednotlivě v párech nebo řetízcích. Teplota růstu se pohybuje v rozmezí od 15 do 50 - 55 °C. Optimální pH růstu je mezi 5,7 až 6,8. Roste i při 7 % NaCl. Kataláza pozitivní, oxidáza variabilní. Citrát a propionát jsou využívány jako zdroje uhlíku pro většinu kmenů (LOGAN, DE VOS, 2009). B. licheniformis patří mezi bacily s menší proteolytickou aktivitou (KALHOTKA et al., 2011). Spolu s B. cereus, B. subtilis a dalšími druhy je B. licheniformis častým kontaminantem syrového i tepelně ošetřeného mléka a mléčných výrobků. (FRANK, 2001; GRIFFITHS, 2009). KALHOTKA et al. (2011) prokázali u testovaných izolátů Bacillus licheniformis dekarboxylázovou aktivitu pro tyrozin, tryptofan, fenylalanin a ornitin.

Rod Clostridium Zahrnuje sporulující bakterie rostoucí za anaerobních podmínek. Vegetativní formy těchto bakterií mají tvar tyčinek a to poměrně velkých. Jsou grampozitivní, ale postupem času mohou jejich kultury grampozitivu ztrácet. Většinou jsou díky peritrichálně uloženým bičíkům pohyblivé. Bakterie se vyskytují obvykle jako saprofyté a účastní se hnilobných procesů. K jejich hojnému rozšíření v přírodě přispívá schopnost tvořit vysoce rezistentní spory, které jsou značně odolné vůči nepříznivým podmínkám zevního prostředí, jako je teplota, záření, vyschnutí a různé chemické látky. Energii získávají fermentačními procesy. Bohatá enzymatická výbava umožňuje většině klostrídiím rozkládat proteiny za vzniku hnilobných produktů (H2S, NH3) či kvasit sacharidy za vzniku kyseliny máselné, kyseliny octové, CO2, H2, proměnlivého množství alkoholu a acetonu (RŮŽIČKA, 2003; GÖRNER, VALÍK, 2004). K proteolytickým druhům patří: Clostridium botulinum typ A, C. sporogenes, C. histolyticum a jiné. A k sacharolytickým druhům patří: C. botulinum typ E, C. butyricum, C. felsineum, C. pasteurianum, C. tyrobutyricum, C. perfringens a jiné. Jen pár druhů je schopno vyvolat onemocnění člověka či zvířat, mezi něž patří botulismus, tetanus, sněť, enterotoxikózy, neurotoxikózy, sepse, které často komplikuje intoxikace bakteriálními toxiny a metabolickými produkty (RŮŽIČKA, 2003; JOHNSON, 2009). U bakterie Clostridium perfringes byla zjištěna produkce histaminu v rybách ( SHALABY, 1996).

15

2.2.1.3 Čeleď Pseudomonadaceae Rod Pseudomonas Zahrnuje obvykle mírně zahnuté gramnegativní, striktně aerobní tyčinky, které jsou většinou pohyblivé, oxidáza a kataláza pozitivní a biochemicky poměrně aktivní (ONDROVČÍK, 2003; GÖRNER, VALÍK, 2004; ŠILHÁNKOVÁ, 2008). Řada druhů tvoří fenazinová barviva žlutých, zelených, modrých nebo červených odstínů, která uvolňují do růstového prostředí. Tím způsobují nežádoucí zabarvení potravin (např. modrání nebo červenání mléka). Přítomnost železa v médiu tvorbu pigmentů podporuje (ŠILHÁNKOVÁ, 2008; FERNANDES 2009). Jejich optimální teplota růstu je v rozmezí 25 - 30 °C (PALLERONI, 2005). U bakterií Pseudomonas spp. byly zjištěny pozitivní histidina tyrozindekarboxylázy (SILLA SANTOS, 1996) a také produkce putrescinu (SHALABY, 1996).

2.2.1.4 Čeleď Staphylococcaceae Rod Staphylococcus Zahrnuje grampozitivní, fakultativně anaerobní nepohyblivé koky s optimální teplotou růstu 30 - 37 °C. Dokáže přežít i při nízkých teplotách, pasterace tuto bakterii devitalizuje. Většina kmenů stafylokoků roste v rozsahu pH 4,2 - 9,3 (FERNANDES 2009, HEREDIA et al., 2009). Bakterie je také velmi odolná na sůl (až 10 %), odolná proti dusitanům a schopná růst i při aw 0,83. Rod Staphylococcus má 47 druhů a poddruhů a v praxi se tradičně dělí podle jejich schopnosti koagulovat plazmu, na stafylokoky koagulázapozitivní a koagulázanegativní. Hlavní zástupce koagulázapozitivních stafylokoků je S. aureus, ten produkuje mnoho enzymů a toxinů, které zahrnují 4 hemolyziny, nukleázy, proteinázy, lipázy, hyaluronidázy a kolagenázy. S. auerus je nejčastější příčinou otravy vyvolané požitím tepelně stabilního enterotoxinu produkovaného v potravinách enterotoxigenním S. aureus. Tyto enterotoxiny jsou stabilní i při tepelném zpracování 100 °C po dobu 30 minut. Potraviny ze kterých může být často stafylokoková otrava jsou hovězí a vepřové maso, klobásy, šunka, mléko, sušené mléko a další mléčné výrobky (ONDROVČÍK, 2003; HEREDIA et al., 2009). Potravinářsky významné jsou dva druhy koagulázanegativních stafylokoků Staphylococcus carnosus a S. xylosus. Tyto bakterie jsou součástí startovacích kultur pro výrobu masných výrobků (SEDLÁČEK, 2007). Staphylococcus spp. byl identifikován jako histamin produkující bakterie v rybách (SILLA SANTOS, 1996).

16

2.2.1.5 Čeleď Micrococcaceae Rod Micrococcus Jsou grampozitivní, nepohyblivé, kataláza a oxidáza pozitivní a koaguláza negativní, striktně aerobní koky, uspořádané často v tetrádách (ČERNOHORSKÁ, 2003). Produkují oranžovočervený pigment, redukují dusičnan a jsou halotoleratní - rostou v prostředí s 5 % NaCl. Jejich optimální teplota růstu je 25 - 35 °C. Vyskytují se především v mléce a v mléčných výrobcích. Zvýšený počet bakterií poukazuje na nedostatečnou sanitaci. (GÖRNER, VALÍK, 2004; SEDLÁČEK, 2007). U mikrokoků byla zjištěna produkce histaminu (SILLA SANTOS, 1996). 2.2.2 Bakterie mléčného kvašení (BMK) Tato skupina je tvořena 13 rody grampozitivních bakterií Carnobacterium, Enterococcus,

Lactococcus,

Lactobacillus,

Lactosphaera,

Leuconostos,

Oenococcus,

Pediococcus, Paralactobacillus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus, Weisella (JAY et al., 2005). Společným znakem bakterií mléčného kvašení je tvorba kyseliny mléčné z fermentovaných sacharidů. Dále je možno je třídit podle hlavních a vedlejších fermentačních produktů na homofermentativní (fermentovaný sacharid se přemění výlučně na kyselinu mléčnou) a heterofermentativní (fermentovaný sacharid se mění na kyselinu mléčnou asi 50 %, kyselinu octovou, oxid uhličitý a za určitých okolností i na ethanol). U některých rodů BMK je možné jako identifikační znak použít optickou otáčivost vzniklé kyseliny mléčné. Z morfologického hlediska se BMK vyskytují s menší pestrostí, nacházíme koky v párech, v krátkých a delších řetízcích, tyčinky izolované i v řetízcích (GÖRNER, VALÍK, 2004). Laktokoky mají malou schopnost rozkládat aminokyseliny. Naproti tomu laktobacily katalyzují řadu přeměn aminokyselin. Enterokoky mají výraznou schopnost dekarboxylovat aminokyseliny na biogenní aminy (GÖRNER, VALÍK, 2004). Laktobacily jsou považovány za producenty histaminu, tyraminu a putrescinu (SCHIRONE, 2012). Enterokoky mohou produkovat vysoké koncentrace histaminu a tyraminu, ale pouze v případě, když potravina obsahuje tyto bakterie v množství 107 KTJ/g a v sýru, který zraje po dobu alespoň 6 měsíců (HASSAÏNE et al., 2009). Slabými producenty aminů jsou i bakterie z rodu Propionibacterium, které jsou důležité při zrání tvrdých sýrů a pro tvorbu ok a některé laktobacily (L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. plantarum a jiné) (GÖRNER, VALÍK, 2004).

17

Tabulka 1: Rody BMK, jejich fermentační typ a produkty (GÖRNER, VALÍK, 2004) ROD

TYP

HLAVNÍ

FERMENTACE

PRODUKTY

Lactococcus

homofermentativní

laktát

Streptococcus

homofermentativní

laktát

Pediococcus

homofermentativní

laktát

Lactobacillus

homofermentativní

Laktát

Leuconostoc

heterofermentativní

laktát: acetát: CO2

2.2.2.1 Čeleď Lactobacillaceae Rod Lactobacillus Zahrnuje fakultativně anaerobní anebo mikroaerofilní nepohyblivé tyčinkovité BMK. (GÖRNER, VALÍK, 2004). Mohou se množit i v kultivačním prostředí s hodnotou pH 5. Jestli však pH poklesne pod 4, růst většiny laktobacilů se zastavuje. Neprodukují enzym katalázu, který katalyzuje rozklad peroxidu vodíku na kyslík a vodu (KLABAN, 2001). Jejich hlavním metabolitem fermentace je kyselina mléčná, ale i octová, etanol a CO2 (GÖRNER, VALÍK, 2004). Rod Lactobacillus se podle fementace dělí na 3 skupiny: Skupina I: Jsou obligátně homofermentativní laktobacily, které hexózy fermentují na kyselinu mléčnou. Jejich optimální teplota růstu je mezi 30 - 45 °C a optimální pH 5,5 - 6,2 (GÖRNER, VALÍK, 2004). Tyto druhy jsou uvedeny v tabulce 2. U bakterie Lactobacillus delbrueckii spp. bulgaricus byla zjištěna produkce tyrozindekarboxylázy a tvorba histaminu. U bakterie Lactobacillus acidophilus byla zjištěna tvorba histidindekarboxylázy. U bakterie Lactobacillus heleveticus byla zjištěna tvorba histaminu (SHALABY, 1996). Skupina II: Jsou fakultativně heterofermentativní laktobacily, které hexózy fermentují na kyselinu mléčnou. Při nedostatku glukózy produkují některé druhy kyselinu octovou a kyselinu mravenčí. Jsou to mezofilní, grampozitivní, mikroaerofilní tyčinky a jejich optimální teplota růstu je 28 - 32 °C (GÖRNER, VALÍK, 2004). Tyto druhy jsou uvedeny v tabulce 3. U bakterie Lactobacillus plantarum byla zjištěna produkce histaminu. U bakterie Lactobacillus casei

a Lactobacillus curvatus byla zjištěna tvorba histidindekarboxyláza

(SHALABY, 1996; RUSSO, 2010). Skupina III: Jsou obligátně heterofermentativní laktobacily, které fermentují hexózy na kyselinu mléčnou a kyselinu octovou, etanol a CO2. Pentózy fermentují na kyselinu mléčnou 18

a kyselinu octovou. Jejich optimální teplota růstu je 28 - 32 °C (GÖRNER, VALÍK, 2004). Tyto druhy jsou uvedeny v tabulce 4. U bakterie Lactobacillus buchneri byla zjištěna produkce histaminu a u Lactobacillus brevis produkce tyraminu (SHALABY, 1996; RUSSO, 2010).

Tabulka 2: Skupina I obligátně homofermentativní (GÖRNER, VALÍK, 2004) upraveno Druh ssp. L. delbrueckii ssp.

Prostředí ve kterém se převážně vyskytuje a jiné charakteristiky Rostl. mat. fermentovaný při vyšších teplotách (40 - 53 °C)

delbrueckii L. delbrueckii ssp.

Jogurt a sýry

bulgaricus L. delbrueckii ssp.

Kyselé mléko, sýry, lisované kvasnice, obilní zápary

lactis L. helveticus

Ementálská kultura, tvrdé sýry (ementálský typ), kyselé mléko, maximum při 50 - 52 °C

L. acidophilus

Intestinální trakt lidí a zvířat, ústní dutina lidí

L. farciminis

Masné výrobky (tepelně neošetřené), pekárenský kvas, snáší 10 - 12 % NaCl

L. salivarius

Ústní dutina a intestinální trakt lidí a zvířat

19

Tabulka 3: Skupina II fakultativně heterofermentativní (GÖRNER, VALÍK, 2004) upraveno Druh ssp.

Prostředí ve kterém se převážně vyskytuje a jiné charakteristiky

L. bavaricus

Kysané zelí, růst mezi 2 - 37 °C

(L. sake) L. casei ssp.

Mléko, sýry, ml. výrobky, pek. kvas, kravský hnůj, siláž, intestinální

casei

trakt a ústní dutina lidí

L. casei ssp.

Dtto

rhamnosus L. curvatus

Mléko, masné výrobky, kysané zelí, kravský hnůj, pek. kvas

L. plantarum

Mléčné výrobky, siláž, kysané zelí a jiná zelenina, pek. kvas, intestinální trakt a ústní dutina lidí, kravský hnůj

L. sake

Kys. zelí a jiné ferm.rostl. produkty, masné výrobky, pek. kvas, původně

(L. bavaricus)

izolován z kvasnic na výrobu japonského saké, roste i při 2 - 4 °C

Tabulka 4: Skupina III. Obligátně heterofermentativní (GÖRNER, VALÍK, 2004) upraveno Druh ssp.

Prostředí ve kterém se převážně vyskytuje a jiné charakteristiky

L. brevis

Mléko, sýry, kysané zelí, pek. kvas, intestinální trakt a ústní dutina lidí

L. buchneri

Mléko, sýry, fermentovaný rostlinný materiál, ústní dutina lidí

L. fermentum

Kvasnice, mléčné výrobky, pek. kvas, fermentovaný rostlinný materiál, kravský hnůj, intestinální trakt a ústní dutina lidí

L. kefir

Kefírová zrna a kefír

L. reuteri

Masné výrobky, lidské a zvířecí fekálie

Rod Pediococcus Jsou to grampozitivní, aerobní až mikroaerofilní, nepohyblivé koky, jež se často seskupují do čtveřic neboli tetrád. Při zkvašování sacharidů tvoří jenom kyselinu mléčnou, jsou tedy homofermentativní. Rostou optimálně při pH prostředí 5 - 5,8. Také poměrně dobře snášejí velmi široké teplotní rozmezí od 5 - 45 °C. Jejich původním stanovištěm jsou rostliny a z nich se dostávají do příslušných potravin. V některých škodí, v jiných jsou součástí fermentační mikroflóry. Zpravidla se vyskytují ve společenstvu s laktokoky, s leukonostoky 20

a laktobacily. Pozitivní úlohu mají pediokoky při fermentaci rostlinných potravin: zelí, zeleninových směsí, v sójových a rýžových fermentovaných produktech. Při kvašení zelí se uplatňuje jejich acidotolerantnost. Rozmnožují se v třetí fázi kysnutí, při nižších teplotách i v prostředí které obsahuje 1,5 - 2 % kyselin. Fermentují přitom i těžce fermentovatelné pentózy (arabinóza, xylóza). Pediokoky jsou také složkou bakteriálních kultur používaných při výrobě a zrání klobás a salámu. Negativně působí v pivovarnictví, neboť produkují aceton, který se oxidací vzdušným kyslíkem mění na aromatický diacetyl. Ten nepříznivě ovlivňuje chuť piva. Do piva se dostávají ze sladovnického ječmene a z něho vyrobeného sladu (GÖRNER, VALÍK, 2004). Nejznámější druhy jsou Pediococcus pentosaceus, P. acidilactici a P. halophilus snášející až 15 % koncentraci NaCl. V Japonsku se uplatňuje při výrobě sýru „miso“ ze sojové mouky. Dále lze uvést i druhy P.dextrinicum, P. inopinatus a P. parvulus (KLABAN, 2001).

2.2.2.2 Čeleď Streptococcaceae Rod Lactococcus Tento rod byl vyčleněn z rodu Streptococcus. Laktokoky jsou grampozitivní ovoidní buňky vyskytující se v párech nebo v řetízcích, fakultativně anaerobní, homofermentativní. Optimální teplota růstu je 30 ºC. Jsou součástí čistých mlékařských kultur používaných při výrobě smetany, másla, kysaného mléka, tvarohů a sýrů (GÖRNER, VALÍK, 2004).

Lactococcus lactis ssp. lactis V bujónové kultuře s glukózou dosahuje při teplotě 30 ºC konečnou hodnotu 4,5 až 4 pH. Je schopen růst na krevním agaru se 40 % žluči, neroste však v přítomnosti 6,5 % NaCl. Kyselinu citrónovou neštěpí, netvoří aceton, diacetyl a ani CO2. Pepton štěpí ta tvorby amoniaku. Pro růst v syntetickém médiu vyžaduje přítomnost 4 až 5 vitamínu skupiny B, 10 - 13 aminokyselin, octan, oleát a lipoát. Některé kmeny produkují bakteriocin nisin, v potravinářství je používaný na inhibici grampozitivních bakterií. Některé kmeny produkují aminokyselimu leucin za vzniku 3- metylbutanalu, který je nosnou aromatickou látkou, která určuje sladkou chuť v mléčných produktech. Je také součástí kyselinotvorné složky všech typů základních smetanových kultur používaných v mlékárenské výrobě (KLABAN, 2001; GÖRNER, VALÍK, 2004).

21

Lactococcus lactis ssp. cremoris Má některé charakteristické vlastnosti, kterými se liší od Lactococcus lactis ssp. lactis: má nižší optimální teplotu - udává se 28 ºC, tvoří měřitelné množství CO2, morfologicky se vyznačují zpravidla většími buňkami a tvorbou dlouhých řetízků a laktózu fermentuje pomaleji. Roste v médiu s obsahem 2 % NaCl, ale při 4 % už ne. Je proto typickým smetanovým

nebo

mléčným

streptokokem,

ne

však

univerzálním

sýrařským

mikroorganismem. V 4 % roztoku peptonu neuvolňuje amoniak. Kasein nepatrně peptonizuje (GÖRNER, VALÍK, 2004).

Rod Leuconostoc Jsou to grampozitivní, nesporulující, nepohyblivé koky ovoidního tvaru seskupené do dvojic nebo řetízků. Jsou fakultativně anaerobní, nehemolyzují, jsou kataláza negativní a neredukují dusičnan na dusitan. Kolem svých buněk většinou vytvářejí slizové pouzdro. Jejich optimální teplota růstu je v širokém rozmezí 20 - 30 ºC, některé rostou i při teplotě kolem 5 ºC. V živných půdách vyžadují přítomnost růstových faktorů, aminokyselin a vitamínů skupiny B. Růst je podmíněný přítomností fermentovatelného sacharidu. Většina leukonostoků disimiluje za přítomnosti fermentovatelného sacharidu citran za tvorby diacetylu, acetonu a 2,3 butylenglykolu. Diacetyl je v mlékařství významnou aromatickou látkou. Naproti tomu v pivu a ve víně je nežádoucí. Kmeny leukonostoků tvořící dextranový sliz mají v buněčné stěně enzym dextran - sacharázu. Bakterie z rodu Leuconostoc se zúčastňují i při fermentaci zeleniny a plodů, například zelí. Jsou též významnou složkou mikroflóry masa a masných výrobků (KLABAN, 2001; GÖRNER, VALÍK, 2004). Mezi významné leukonostokoky patří: L. mesenteroides ssp. cremoris, L. mesenteroides ssp. dextranicum, L. mesenteroides ssp. mesenteroides

L. mesenteroides ssp. cremoris Je součástí tzv. máslařské kultury. Produkuje diacetyl dodávající vyrobenému máslu příjemné aroma. Je syntetizován z kyseliny citrónové jako vedlejšího produktu mléčného kvašení. Netvoří za sacharosy sliz. V bujónu tvoří zpravidla dlouhé řetízky sedimentující na dno jako vločky. Z rodu Leuconostoc je nejméně aktivní a nejnáročnější na růstové faktory, vitamíny skupiny B a aminokyseliny. Upřednostňuje redukční prostředí a teploty 18 - 25 °C (KLABAN, 2001; GÖRNER, VALÍK, 2004).

22

L. mesenteroides ssp. dextranicum Je méně náročný na živiny a růstové faktory. Disimiluje citran a používá se v mlékárenské technologii jako složka smetanového zákysu na produkci aromatického diacetylu. Tento leukonostok se také používá k výrobě dextranu, což je vysokomolekulární polymer glukózy s relativní molekulovou hmotností 15 tisíc až 20 miliónů. Používá se jako náhrada krevní plazmy k udržení funkce krevního oběhu při akutně vzniklých krvácivých stavech s velkou ztrátou krve. Dextran se však také využívá v oboru tzv. gelové chromatografie k dělení různých směsí bílkovin (KLABAN, 2001; GÖRNER, VALÍK, 2004).

Rod Streptococcus Ve starší klasifikaci se rod Streptococcus dělí na šest skupin. Pyogenní streptokoky, orální streptokoky, jiné streptokoky, anaerobní streptokoky, enterokoky a mléčné streptokoky. Fermentují sacharidy hlavně na kyselinu mléčnou a malé množství kyseliny octové, mravenčí, ethanolu a CO2. V alkalickém prostředí produkují z glukózy významné množství ethanolu, kyseliny octové a mravenčí. Některé druhy fermentují i organické kyseliny (malonová, citrónová) a aminokyseliny (serin a arginin). Neredukují dusičnan na dusitan. Jsou náročné na živiny, vyžadují pro svůj růst a metabolismus aminokyseliny, peptidy, puriny, pyrimidiny a vitamíny (GÖRNER, VALÍK, 2004).

Streptococcus salivarius ssp. thermophilus Má velký význam pro mlékárenský průmysl, kde je běžně používaný jako složka zákysových kultur pro výrobu jogurtu, kysaného mléka, a mnoha druhů sýrů. (MARINO et al., 2008). Nesnáší zvýšené koncentrace NaCl (nad 2 %). Je velmi citlivý na antibiotika a jiné inhibiční látky. Tvoří kulovité až vejčité buňky vyskytující se v párech nebo v řetízcích. Roste v teplotní rozmezí 20 - 50 ºC, jeho optimální teplota je mezi 40 - 50 ºC, dohromady dobře roste při 37 ºC. Nejvhodnější prostředím pro jeho kultivaci je mléko. V syntetických mediích je náročný na živiny a růstové faktory. Mléko sráží při teplotě do 30 - 45 ºC do jednoho dne. Čerstvé kultury dobře fermentují sacharózu a laktózu. Glukózovou část laktózy fermentuje na kyselinu mléčnou a galaktózu vylučuje do prostředí (GÖRNER, VALÍK, 2004). U několika kmenů S. thermophilus byla popsána produkce tyraminu (MARINO et al., 2008).

23

2.2.2.3 ČeleďEnterococcaceae Rod Enterococcus Zástupci rodu Enterococcus patří do skupiny mikroorganismů označovaných jako bakterie mléčného kvašení, které mají význam v životním prostředí, potravinách i klinické mikrobiologii (FRANZ et al., 2003). Z lékařského hlediska jsou prakticky významné 4 druhy: Enterococcus faecalis, E. faecium, E. durans, E. avium (KLABAN, 1999). Enterokoky jsou grampozitivní, nesporulující, fakultativně anaerobní koky, které se vyskytují jednotlivě, v párech anebo v řetízcích (DUCKOVÁ et al., 2008). Enterokoky jsou schopny růst v bujónu v přítomnosti 6,5 % NaCl, při pH 9, 6, 40 % žlučových kyselin a přežívají 30 minutový záhřev při 60 °C (GARDINI, 2001). Z potravinářského hlediska je z těchto kritérií významná značná odolnost vůči zvýšené koncentraci soli v potravinách a tím i nízkým hodnotám aw a skutečnost, že může přežívat nižší pasterační a termizační teploty (GÖRNER, VALÍK, 2004). Enterokoky v potravinářské mikrobiologii na první pohled působí protichůdně. Ve fermentovaných potravinách mají probiotické vlastnosti, jsou schopny tvořit bakteriociny nazývané enterociny, které působí inhibičně například na Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Vibrio cholera, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens. Dále jsou potřebné při zrání sýrů a vytváření jejich aroma, pravděpodobně v důsledku jejich proteolytické, lipolytické aktivity a rozkladu kyseliny citrónové na diacetyl, acetoin a dalších důležitých prchavých látek (GREIFOVÁ et al., 2003; DUCKOVÁ et al., 2008). Naopak v nefermentovaných potravinách poukazují na nedostatečné zahřátí suroviny a na nedostatečnou sanitaci výrobního zařízení (GÖRNER, VALÍK, 2004). Tyto mikroorganismy podporují hromadění 2 - fenylethylaminu (SUZZI, GARDINI, 2003). Dále v sýrech typu čedar významnou proteolýzu vykazoval hlavně E. faecalis. Aminokyselinu tyrozin dekarboxyluje na biogenní amin tyramin (SILLA SANTOS, 1996; GÖRNER, VALÍK, 2004). Některé druhy enterokoků vykazují i lyzin-, histidin- a ornithindekarboxylázovou aktivitu (VALENZUELA et al., 2009). LADERO et al. (2011) zjišťovali obsah termorezistentních kmenů laktobacilů a enteokoků v mléce po proběhlé pasteraci a nejvyšší odolnost ukázala bakterie E. durans. Tato bakterie je nejběžnější enterokok v mléce, což znamená, že pokud je přítomná v surovině, může přežít pasteraci a může růst během zrání sýrů, což může přispívat k akumulaci tyraminu (LADERO et al., 2011). DE PALENCIA et al. (2011) zjistili, že tyramin produkující kmen IPLA655 E. durans, který byl obsažen v sýru je schopen přežít a produkovat tyramin během průchodu GIT a proto může přispět k obsahu tyraminu v hostiteli.

24

2.2.2.4 Čeleď Propionibacteriaceae Rod Propionibacterium Zahrnuje druhy tvořící grampozitivní, nepohyblivé, nesporulující, anaerobní až aerotolerantní bakterie. Sacharidy fermentují vždy na propionovou kyselinu spolu s octovou kyselinou a některými dalšími organickými kyselinami a s CO2 a H2O. Některé druhy se používají pro výrobu kvašených mléčných výrobků nebo pro kvasnou výrobu propionové kyseliny, která má silné protiplísňové účinky. Příslušnící tohoto rodu jsou také součástí sýrařské kultury při výrobě ementálského typu (GÖRNER, VALÍK, 2004; ŠILHÁNKOVÁ, 2008). U bakterie Propionibacterium byla zjištěna tvorba histaminu (SHALABY, 1996).

2.3 Biogenní aminy Biogenní aminy (BA) jsou nízkomolekulární bazické dusíkaté látky vznikající v potravinách a potravinových surovinách nejčastěji dekarboxylací aminokyselin nebo aminací a transaminací aldehydů a ketonů. Tyto organické báze se mohou tvořit působením nativních enzymů potravin nebo činností bakteriálních dekarboxyláz (SILLA SANTOS, 1996; PALEOLOGOS et al., 2004; KOMPRDA, 2005). Pozitivně dekarboxylující mikroorganismy mohou být součástí přirozené mikroflóry potravin nebo mohou být přítomny jako důsledek kontaminace při zpracování, výrobě a skladování potravin (GREIF, GREIFOVÁ, 2004). Dle chemické struktury se BA člení do několika skupin.

Tabulka 5: Rozdělení biogenních aminů (KALAČ, KŘÍŽEK, 1998) Chem.struktura

Biogenní amin

Aminokyselina

ALIFATICKÉ

Putrescin (PUT)

Ornitin (Orn)

Kadaverin (CAD)

Lysin (Lys)

Tyramin (TYR)

Tyrozin (Tyr)

2-fenylethylamin (FEA)

Fenylalanin (Fea)

Histamin (HIS)

Histidin (His)

Tryptamin (TRY)

Tryptofan (Try)

Spermin (SPM)

Ornitin (Orn)

Spermidin (SPD)

Ornitin (Orn)

Agmatin (AGM)

Arginin (Arg)

Putrescin (PUT)

Arginin (Arg)

AROMATICKÉ

HETEROCYKLICKÉ

POLYAMINY

25

Z histidinu vzniká jako produkt dekarboxylace histidindekarboxylázou histamin. Z lyzinu

vzniká

působením

arginindekarboxylázou

lyzindekarboxylázy kadaverin.

vzniká

agmatin.

Dekarboxylací

Dekarboxylací

argininu

fenylalaninu

fenylalanindekarboxylázou vzniká 2-fenylethylamin, z tyrosinu činností tyrosindekarboxylázy tyramin. Dekarboxylací tryptofanu tryptofandekarboxylázou vzniká tryptamin (VELÍŠEK, 2002).

Putrescin

může

vznikat

2

způsoby:

buď

přímo

z ornitinu

působením

ornitindekarboxylázy, což je hlavní cesta nebo nepřímo z argininu přes agmatin působením ureohydrolázy (KALAČ, KŘÍŽEK, 2005). Putrescin je řazen i mezi polyaminy, protože je přímým meziproduktem syntézy sperminu a spermidinu (KOMPRDA, 2005). Polyaminy jsou tedy BA, které nevznikají bakteriální činností, ale biochemickou syntézou v živých organismech od bakterií po člověka (KALAČ, KŘÍŽEK, 2005). Biosyntéza polyaminů vychází z aminokyselin argininu či ornitinu, které dekarboxylací dávají vznik agmatinu a diaminu putrescinu. Polyaminy spermidin a spermin vznikají z putrescinu připojením aminopropylových

zbytků vzniklých z S-adenozylmetioninu po jeho dekarboxylaci

(PROCHÁZKA et al., 1998). Podle GREIFA a GREIFOVÉ (1998) biogenní aminy v potravinách mohou být i fyziologického původu vzniklé aminací aldehydů a ketonů. Tvorba BA z aldehydů je možná dvěma cestami: redukční aminací a transaminací aldehydů a ketonů pomocí aminotransferáz. Celkový počet vzniklých biogenní aminů závisí na typu potraviny a na počtu a druhu přítomných mikroorganismů. Situace je komplikovaná tím, že uvnitř jednotlivých druhů existují desítky kmenů, které se mohou v této vlastnosti lišit. Uvádí se, že rozdíly mohou být až tisícinásobné. To pak způsobuje, že obsahy jednotlivých aminů v určitém druhu potraviny kolísají v širokém rozpětí nejen mezi jednotlivými výrobci, ale i mezi šaržemi stejného výrobce (BRINK et al., 1990; KALAČ, KŘÍŽEK, 2002).

2.3.1 Faktory ovlivňující růst mikroorgasnimů s dekarboxylázovou aktivitou a tvorbu biogenních aminů Produkce BA je komplexní jev, který závisí na několika proměnných faktorech, jako je například přítomnost BA - produkujících mikroorganismů, jejich proteolytické a dekarboxylační činnost, doba zrání a skladování, atd. Nicméně, podobně jako jiné chemicko - fyzikální podmínky (např. dostupnost aminokyseliny, teplota, pH nebo koncentrace soli), je obtížné změnit tyto parametry, protože jsou vlastní procesu fermentace. To jasně ukazuje, že klíčové akce, aby se zabránilo hromadění BA je třeba řešit směrem k snížení počtu 26

mikroorganismů produkující BA během výroby sýru (LINARES 2012). K nejdůležitějším faktorů, které ovlivňují růst mikroorganismů a tvorbu BA patří: Dostupnost substrátu, aktivita vody, teplota, pH, koncentrace soli, redox potenciál a přístup kyslíku, doba zrání a skladování, startovací kultury, přísná aplikace hygienických zásad získávání surovin a i při jejich následném zpracováním, tepelné ošetření a mléka, homogenizace.

2.3.1.1 Dostupnost substrátu Význam má nejen přítomnost volných aminokyselin, ale také přítomnost využitelných cukrů. Jako optimální je v této souvislosti uváděna koncentrace glukózy 0,5 – 2 % (SILLASANTOS, 1996). BOVER-CID et al. (2008) nezjistili výraznější vliv dostupnosti glukózy na produkci tyraminu u Lactobacillus curvatus, přičemž mírně vyšší produkce byla zaznamenána v prostředí s vyšší koncentrací glukózy.

2.3.1.2 Aktivita vody Voda je základní složkou živé hmoty. Činí až 80 % živé váhy bakteriální buňky. Stupeň dostupnosti vody se označuje jako vodní aktivita aw. Matematicky se vyjadřuje jako podíl tlaku vodní páry nad příslušným roztokem vůči tlaku vodní páry nad čistou vodou. Čistá voda má aw = 1. Je zřejmé, že čím vyšší je koncentrace rozpuštěných látek, případně čím vyšší je osmotický tlak, tím nižší je vodní aktivita (aw) (VOTAVA, 2001). Hlavní význam vodní aktivity z hlediska mikrobiologie spočívá v tom, že určuje, zda v dané potravině může nebo nemůže dojít k pomnožování mikroorganismů (BARTL, 2001). Mikroorganismy ke svému životu potřebují určité hodnoty aw. Optimální hodnota aw je pro většinu mikroorganismů aw > 0,98. Při snížení hodnoty aw prostředí odnímáním vody (sušením, uzením), přídavkem soli, cukru, mrazením atd. se koncentrace mikroorganismy využitelné vody snižuje a jejich růst je částečně nebo úplně inhibovaný. Každý druh nebo dokonce i typ mikroorganismu má určitou limitní hodnotu aw a pod tuto hodnotu již není schopen růstu ani pomnožování a není schopen ani vytvářet toxin. Minimální hodnoty aw, které mikroorganismy potřebují pro svůj růst, jsou do značné míry spoluurčované i s dalšími faktory jako je pH, teplota a parciální tlak kyslíku (BARTL et al., 2003; GÖRNER, VALÍK, 2004). Limitující hodnota aw pro různé druhy mikroorganismů je různá. Obecně lze říct, že bakterie vyžadují pro růst více dostupné vody, tj. prostředí s vyšší aw, kvasinky a plísně jsou 27

tolerantní k nižším hodnotám aw. Růst většiny patogenů je inhibován při aw < 0,9. Minimální hodnota probakterie působící kažení potravin je 0,9 - 0,91, pro kvasinky 0,87 - 0,94 a pro plísně 0,7 - 0,8. Převážná část mikroorganismů není schopna růst při aw pod 60 (BARBOSA et al., 2007). Řada mikroorganismů má schopnost reagovat na sníženou hodnotu aw a upravovat si osmotický tlak protoplazmy. Pro běžnou potravinářskou praxi to ale nemá význam, protože zvýšení osmotolerance je nepatrné (BARTL et al., 2003). Mezi aktivitou vody a produkcí biogenních aminů byl zjištěn pozitivní vztah. Vysoké hodnoty vodní aktivity tedy podporují dekarboxylázovou aktivitu a tím i produkci biogenních aminů (KŘÍŽEK, KALAČ, 1998).

Tabulka 6: Minimální hodnoty aw pro růst mikroorganismů (GÖRNER, VALÍK, 2004) Interval Hodnot aw

Skupina mikroorganismů

Min. Hodnota aw

Příklady mikroorganismů (druh nebo rod)

0,97 - 0,95

bakterie

0,94 - 0,91

většina bakterií

0,97 0,96 0,95 0,94

0,94 - 0,87

kvasinky

Pseudomonas spp. C. botulinum typ E., Acinetobacter Lactococcus, E. coli, Klebsiella, Shigella Salmonella, Enterobacteriaceae, Bacillus, Clostridium, Microbacterium, Lactobacillus, Streptococcus, Pediococcus Candida utilis Většina kvasinek kazící potraviny Debaromyces Micrococcus Staphylococcus aureus Rhizopus nigricans Penicillium expansum Penicilium patulum Většina plísní kazící potraviny Halobacterium halobium Zygosaccharomyces rouxii

0,90 - 0,86 0,93 - 0,80

0,80 - 0,75 0,65 - 0,61 0,78 - 0,61

0,94 0,88 0,87 grampozitivní koky 0,90 0,86 plísně 0,93 0,83 0,81 0,80 halofilní bakterie 0,75 osmotolerantní/filní 0,62 kvasinky xerotolerantní/filní 0,78 plísně 0,77 0,75 0,71 0,70 0,69 0,62

Aspergillus flavus Aspergillus ochraceus Walemia sebi Aspergillus glaucus Europium chevalieri Chrysosporium fastidium Europium echinulatum

28

2.3.1.3 Teplota Mikroby jsou schopny se množit jen v určitém rozmezí teplot. Odlišné skupiny mikroorganismů mají různé nároky na teplotu prostředí, ve kterém se mohou rozmnožovat a metabolizovat (VOTAVA, 2001; GÖRNER, VALÍK, 2004). Podle vztahu k teplotě rozdělujeme mikroorganismy do tří hlavních skupin: PSYCHROFILNÍ MIKROORGANISMY - jsou to takové mikroorganismy, které mají optimální teplotu nižší než 20 °C a rostou ještě poměrně intenzivně při teplotě 0 - 5 °C. Některé z těchto mikroorgasnimů (např. některé plísně) jsou chopny pomalého růstu ještě při teplotách -10 °C (ŠILHÁNKOVÁ, 2008). Z potravinářského hlediska jsou důležité tzv. PSYCHROTROFNÍ MIKROORGANISMY - to je taková skupina mikroorganismů, která dobře roste při teplotě 7 °C a nižší a mají optimální teplotu růstu mezi 20 - 30 °C (JAY et al., 2005). Mezi tyto mikroorganismy řadíme rody gramnegativních bakterií např.: Pseudomonas, Flavobacterium, Aeromonas, Alcaligenes a některé zástupci rodu Enterobacteriaceae a patří se i grampozitivní bakterie jejichž zástupci jsou Bacillus, Clostridium, Microbacterium, Streptococcus, Micrococcus a Corynebacterium (DUCKOVÁ, ČANIGOVÁ, 2004). MEZOFILNÍ MIKROORGASNIMY - to jsou označovány takové mikroorganismy, kterým se nejlépe daří ve 20 - 45 °C. Optimální teplota růstu bakterií je kolem 37 °C, kvasinek a plísní kolem 30 °C (JAY et al., 2005; ŠILHÁNOVÁ, 2008). Patří k nim většina bakterií, které způsobují otravu potravinami. Jsou to zejména bakterie Salmonella, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Staphylococcus aureus. Dále bakterie z čeledí Enterobacteriaceae a většina grampozitivních bakterií a bakterie mléčného kvašení (GÖRNER, VALÍK, 2004). TERMOFILNÍ MIKROORGANISMY - jsou to takové mikroorganismy, které dobře rostou při teplotě 45 °C a více s optimem mezi 55 - 65 °C (JAY et al., 2005). Termofilní bakterie mají své zástupce v rodech Bacillus, Clostridium, Lactobacillus. Vyznačují se mimořádně vysokou metabolickou aktivitou a rychlostí růstu za optimální teploty, vysoká metabolická aktivita při těchto teplotách je výsledkem odlišného složení bílkovinných složek jejich enzymů (ŠILHÁNKOVÁ, 2008). Jedním z nedůležitějších faktorů ovlivňující termorezistenci mikroorganismů je obsah vody v prostředí i buňkách, neboť v suchém prostředí jsou mikroorganismy mnohem rezistentnější k vysokým teplotám než v prostředí vlhkém. K látkám působícím ochranně patří především lipidy, bílkoviny a vyšší koncentrace sacharidů. Termorezistenci vegetativních buněk i spor silně ovlivňuje pH prostředí, obecně můžeme říci, že termorezistence je nejvyšší, je-li pH optimální pro růst daného mikroorganismu (ŠILHÁNKOVÁ, 2008). 29

Teplota má tedy na růst mikroorganismů a vznik BA výrazný vliv. Obsah BA je závislý na teplotě a vzrůstá s délkou skladování. S rostoucí teplotou se zvyšuje proteolytická a dekarboxylační činnost mikroorganismů a tím i množství biogenních aminů (SUZZI, GARDINI, 2003; JUNEJA, SOFOS, 2010). KOMPRDA (2005) zjistil, že histamin se při 5 °C tvoří řádově méně než při 20 °C. GREIF a GERIFOVÁ (1998) ukázali, že sýr skladovaný při teplotě 21 °C obsahoval po roce zrání třikrát větší množství histaminu oproti sýru skladovanému při teplotě 9 °C. Dále byl pozorován vliv teploty (15, 20, 25, 30, 30, 37 °C) na růst a tvorbu tyraminu pro Enterococcus faecalis. Se stoupající teplotou narůstala specifická rychlost růstu, zkracovala se lag fáze a zkracoval se čas na začátku produkce tyraminu. Bylo také zjištěno, že teploty pod 15 °C významně ovlivňují činnost tyrozindekarboxylázy, čemu odpovídali nízké koncentrace tyraminů (GREIFOVÁ et al., 2003). Analytické rozbory ukázaly (GREIFOVÁ et al., 2003), že Escherichia coli při všech sledovaných teplotách (10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 °C) produkovala CAD a PUT. Optimální teplota růstu E. coli je 37 °C. Již po devíti hodinách při teplotě 37 °C začala Escherichia coli produkovat CAD, maximální obsah CAD byl dosažen po 45 hodinách při teplotě růstu 10 °C.

Za deset hodin po

naočkování potraviny při teplotě 37 °C začala E. coli produkovat PUT. Maximální obsah PUT byl dosažen po 70 hodinách, při teplotě 10 °C. PUT byl tvořený z argininu, zatímco přímý prekurzor pro tvorbu PUT - ornitin se v substrátu nevyskytoval. Některé mikrobiální dekarboxylázy přežívají i podmínky pasterace, takže enzymy mohou působit dále i přes likvidaci mikroorganismů v substrátu, který byl opracován teplem (GREIF, GREIFOVÁ, 1998). Obsah sperminu během tepelného zpracování klesá, zatímco histamin je termostabilní a je možné ho zničit až po zahřátí na 116 °C po dobu 90 minut (GREIF, GREIFOVÁ, 1998; SILLA-SANTOS, 2001).

2.3.1.4 pH Záporný dekadický logaritmus koncentrace vodíkových iontů je důležitým faktorem ovlivňující růst mikroorganismů a jejich dekarboxylační aktivitu (GARDINI et al., 2001). Příliš vysoké nebo příliš nízké pH mikroby usmrcuje. Příčinou je inhibice enzymů a transportních bílkovin anebo též přímé poškození cytoplasmatické membrány (VOTAVA, 2001).

Minimální

hodnota

pH

pro

většinu

bakterií

(mnohé

bakterie

z čeledi

Enterobacteriaceae, druhy rodu Bacillus) jež se účastní kažení potravin je pH 4,4 - 4,6. Patogenní a toxigenní bakterie (Např. Clostridium botulinum, Vibrio parahaemolyticus, Bacillus cereus a Pseudomonas aeruginosa) jsou vůči nižším hodnotám pH citlivější. Naproti 30

tomu některé druhy bakterií mléčného kvašení z rodu Lactobacillus mají optimum růstu mezi 5,5 – 6. Maximální hodnota u bakterií, plísní a kvasinek je mezi pH 8 - 9. Toleranci mikroorganismů vůči nízkým hodnotám pH v potravinách závisí na dalších vlivech jako např.: vodní aktivita, zásobení O2, vliv samotných složek potravin, procesy výroby a skladování potravin (GÖRNER, VALÍK, 2004). HALÁSZ et al. (1994) cit. podle KALHOTKA (2007) uvádí, že optimální pH pro dekarboxylaci aminokyselin ke kyselé v rozmezí 2,5 - 6,5 a že růst bakterií v kyselém prostředí stimuluje tvorbu dekarboxyláz. Nižší hodnoty pH inhibují bakterie čeledi Enterobacteriaceae, zatímco bakterie mléčného kvašení , plísně a kvasinky jsou tolerantní proti kyselejšímu prostředí a jsou schopné růst i pod pH 4,5 (BOVER-CID, HOLZAPFEL, 1999; ROBINSON, ROBINSON, 2005). Například laktobacily, enterokoky aj. si adaptivně zvyšují suboptimální pH prostředí dekarboxylací aminokyselin histidinu a fenylalaninu na histamin a tyramin (JIČINSKÁ, HAVLOVÁ, 1995). V sýru s pH 5,39 bylo po roce skladování dvakrát více histaminu než v sýru při pH 5,19 (GREIF, GREIFOVÁ, 1998). GARDINI et al. (2001) zjistili, že Enterococcus faecalis produkuje méně BA v prostředí s nízkým pH, ale uvádějí, že důležitou roli hraje i růstový faktor. Dále studie (GREIFOVÁ et al., 2003) ukázala, že specifická růstová rychlost pro Enterococcus faecalis a Enterococcus faecium byla nejvyšší při vstupní hodnotě pH 7. Při vyšších a nižších hodnotách pH rychlost růstu klesala. E. faecalis a E. faecium jsou schopné produkovat enzym tyrozindekarboxylázu, v důsledku čehož vzniká tyramin. E. faecalis produkoval 1,5 až 2 násobné vyšší koncentrace tyraminu než E. faecium. (GARDINI et al., 2001). Někteří autoři naznačují, že rychlé okyselení mléka spojené s poklesem růstu mikroorganismů s dekarboxylázovou aktivitou by mohlo snížit obsah BA (GARDINI et al., 2001).

2.3.1.5 Koncentrace soli Koncentrace soli obecně inhibuje tvorbu BA, ale na druhé straně histamin nebo tyramin působí na některé bakterie osmoprotektivně a jejich syntéza je tedy v přitomnosti NaCl v některých případech zvýšena (KOMPRDA, 2005). Autoři TSAI et al. (2006) zjistili významnou produkci HIS halotolerantními kmeny Staphylococcus capitis v typických fermentovaných čínských sojových produktech i při koncentraci NaCl 10 %. Přídavek NaCl se využívá při výrobě mléčných, masných a rybích výrobků. Na+ ionty všeobecně podporují enzymatické reakce (GARDINI et al., 2001). Jak ukázaly výsledky výzkumu GREIFOVÉ et al. (2003) koncentrace NaCl do 2,2 % příznivě ovlivnila rychlost nárůstu tyraminu 31

produkovaného E. faecium avšak v případě E. faecalis rychlost nárůstu tyraminu klesala. Vyšší koncentrace NaCl může přispívat k snížení schopnosti mikroorganismů produkovat histamin. STRATTON et al. (1991) dokázali, že při koncentraci NaCl 3,5 % je částečně inhibována schopnost Lactobacillus buchneri (vyskytuje se jako kontaminant sýrů) tvořit histamin a při koncentraci 5 % se tvorba histaminu zastavuje, což je v souladu se zjištěním GARDINI et al. (2001), kteří uvádí, že koncentrace NaCl v rozmezí od 3,5 do 5,5 % může inhibovat produkci histaminu. Také záleží na složení použité solící směsi. Bylo zjištěno, že přídavek dusitanové soli zpomalí nárůst BA oproti stejnému množství obyčejné soli (KAMENÍK, 2007).

2.3.1.6 Redox potenciál (Eh) a přístup kyslík Oxidoredukční

nebo

též

redox

potenciál

odráží

poměr

mezi

oxidovanými

a redukovanými látkami v daném prostředí. Zhruba řečeno, je-li pozitivní, převládají v daném prostředí podmínky oxidující, je-li negativní, je dané prostředí výrazně redukováno. Běžné kultivační půdy vystavené vlivu kyslíku jsou zřetelně oxidovány a mají redox potenciál kolem +200 mV (VOTAVA, 2001). Oxidoredukční potenciál se mění v průběhu technologického zpracování a skladování potravin za přispění přítomných mikroorganismů (CEMPÍRKOVÁ et al., 1997). Přidáním chemických látek s redukční schopností (např. kyselina askorbová), růstem mikroorganismů spotřebující kyslík, vznikem vodíku a tvorbou redukujících zplodin metabolismu anaerobných bakterií se redox potenciál v potravině snižuje (GÖRNER, VALÍK, 2004). Oxidované prostředí vyhovuje aerobům (např. Pseudomonas fluorescens roste v oblasti od +100 po +500 mV), i když při svém metabolismu redox potenciál snižují (někdy k tak nízkým hodnotám, které umožní zahájit množení anaerobům). Anaeroby tedy vyžadují nízký redox potenciál a to v hodnotách asi -300 mV (VOTAVA, 2001; GÖRNER, VALÍK, 2004). V anaerobních podmínkách byla zaznamenána vyšší produkce tyraminu bakteriemi rodu Lactococcus (BUŇKOVÁ et al., 2011). Klebsiella pneumonie syntetizuje v anaerobních podmínkách méně kadaverinu než za přístupu kyslíku, ale získává zase schopnost produkovat putrescin. Dále Enterobacter cloaceae produkoval v anaerobním prostředí o polovinu méně putrescinu než za aerobních podmínek (HALÁSZ et al., 1994; cit. podle SILLA SANTOS, 1996). Dále bylo zjištěno, že snížení redox potenciálu může stimulovat produkci histaminu a aktivita histidindekarboxylázy se zdá být inaktivována za přítomnosti kyslíku (ARNOLD, BROWN, 1978; HALÁSZ et al., 1994; cit. podle SILLA.SANTOS, 1996). Přístupnost kyslíku ne zcela jednoznačně ovlivňuje dekarboxylační aktivitu přislušných mikroorganismů, 32

protože na tvorbě BA se mohou podílet mikroorganismy aerobní, anaerobní i fakultativně anaerobní (KOMPRDA, 2005).

2.3.1.7 Doba zrání a skladování Doba zrání a skladování patří k důležitým faktorům ovlivňující výskyt biogenních aminů ve fermentovaných potravinách. Podle KOMPRDY (2005) se obsah BA ve fermentovaných výrobcích s delší dobou zrání a skladování zvyšuje. V případě skladování potravin může být obsah BA ukazatelem jakosti vstupní suroviny a úrovně hygieny během výrobního procesu a skladování (STANDAROVÁ et al., 2008). Podmínkou vzniku toxického množství biogenních aminů v sýru je proteolýza, která je při zrání sýrů považována za jeden z nejdůležitějších pochodů ovlivňujících kvalitu sýra. Obecně platí, že čím delší je proces zrání a skladování, tím vyšší je proces stárnutí. (FERNÁNDEZ et al., 2007; ČERNÝ et al., 2009). LEUSCHNER et al. (1998) se zabývali vlivem bakterií Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus buchneri a Lactobacillus brevis na tvorbu BA v goudě po dobu zrání 12 týdnů. Lactobacillus delbrueckii vyprodukoval prvních 6 týdnů zrání minimální množství BA (až na TYR u kterého bylo v 6. týdnu zrání naměřeno 250,89 mg/kg). A po 12 týdnech zrání bylo naměřeno 237,94 HIS, 636,19 mg/kg TYR a 41,57 mg/kg PUT. Lactobacillus buchneri v 12. týdnu zrání vyprodukoval 418 mg/kg HIS a 12,86 mg/kg PUT. A v goudě s bakterií Lactobacillus brevis bylo naměřeno po 12 týdnech zrání 776,28 mg/kg TYR (263,69 mg/kg TYR bylo naměřeno už ve 4. týdnu zrání) a 25,67 mg/kg PUT. ANTILA et al. (1984) potvrdili, že nejnižší koncentrace BA (PUT, CAD, HIS, TYR) byla v eidamských sýrech (85 mg/kg), střední v sýru Romadúr (937 mg/kg) a nejvyšší koncentrace byla ve vyzrálých sýrech ementálského typu (1820 mg/kg). Podobné závěry potvrdily i STANDARTOVÁ et al. (2009), které z naměřených výsledků došli k závěru, že obsah BA v sýrech je závislý zejména na typu sýra. Nejvyšší hladiny BA byly nalezeny v sýrech s vysokodohřívanou sýřeninou a v měkkých zrajících sýrech, zatímco u sýrů terminovaných a smetanových jednotlivé BA nebyly detekovány nebo byly obsaženy v malém množství. Skladování sýru sledovali i CELANO et al. (1996), kteří se zaměřili na ovčí sýr Pecorino pugliese. Analýzou vzorků sýrů odebraných v různých časových intervalech zjistili, že biogenní aminy PUT, HIS a TYR, které byly na začátku skladování přítomné jen ve stopových množstvích, rychle zvyšovaly svou koncentraci v sýru po šedesátidenním skladováním. Tento nárůst pokračoval do stodvacátého dne, kdy obsah aminů začal klesat. Po dvěstědvaceti dnech skladování nebyly tyto aminy v sýru zaznamenané anebo se vyskytovaly 33

jen ve stopových množstvích. Výjimkou byl CAD, který byl přítomný od začátku skladování a maximální koncentraci dosahoval i na konci skladování (GREIF, GREIFOVÁ, 2006).

2.3.1.8 Startovací kultury Hlavní funkcí startovacích kultur je produkovat kyselinu mléčnou v průběhu fermentace. Nicméně také přispívají ke zrání sýru, kde jsou jejich enzymy zapojené do proteolýzy a přeměňují aminokyseliny na chuťové látky (BERESFORD et al., 2001). Startovací kultury ve většině fermentovaných mléčných výrobků slouží k zajištění standardní finální kvality (LINARES et al., 2012). Při výrobě fermentovaných potravin je vhodné testovat startovací kultury na dekarboxylázovou aktivitu a vybírat v této souvislosti pouze mikroorganismy v uvedeném znaku negativní (KOMPRDA, 2005). Startovací kultury mohou ke zvýšeným koncentracím BA přispívat buď přímou dekarboxylací aminokyselin nebo častěji nepřímo, ovlivněním pH a proteolýzou s následným zvýšením nabídky volných aminokyselin pro ostatní nedekarboxylující mikroorganismy (FERNÁNDEZ-GARCÍA et al., 2000). Využitím některých startovacích kultur v sýrařské technologii je možné významně snížit koncentraci HIS ale i PUT a CAD. Nisin produkovaný Lactococcus lactis a Enterococcin EFS 2 a Enterocin 4 produkovaný Enterococcus faecalis výrazně inhibují růst mikroorganismů produkujících histamin v sýrech. Těmito mikroorganismy jsou především Lactobacillus buchneri a Lactobacillus brevis (GREIF, GREIFOVÁ, 2006). Vznik BA ovlivňují i tzv. nestartérové bakterie mléčného kvašení (NSLAB) s dekarboxylázovou aktivitou. Jedná se o bakterie, které se nevyskytují v čerstvé sýřenině, ale objevují se až po určité době zrání (WALSTRA et al., 2006). NSLAB mají jedinečnou schopnost růst za vysoce selektivních podmínek panujících ve zrajících sýrech a bylo prokázáno, že připívají k tvorbě malých peptidů a aminokyselin, které jsou prekurzory pro aromatické složky, ale také pro tvorbu BA (WOUTERS, 2002). Jedná se hlavně o bakterie rodu Lactobacillus, Enterococcus, Pediococcus a Leuconostoc (WALSTRA et al., 2006).

34

2.3.1.9 Přísná aplikace hygienických zásad získávání surovin i při jejich následném zpracováním Přísná aplikace hygienických zásad získávání surovin i při jejich následném zpracováním je zcela zásadním faktorem omezující obsah BA ve finálním výrobku (KOMPRDA, 2005). Základem je kvalitní výchozí surovina (STRATTON et al., 1991). Tedy obsah BA, může sloužit jako ukazatel jakosti vstupní suroviny a úrovně hygieny během výrobního procesu a skladování (STANDAROVÁ et al., 2008). Rozdíly v obsahu BA pravděpodobně souvisí i s rozdílnou hygienickou kvalitou surovin a zásahy pracovníků (INNOCENTE et al., 2009).

2.3.1.10 Tepelné ošetření mléka Pasterizace je tepelné zpracování, které snižuje mikrobiální zátěž syrového mléka, včetně producentů BA. Cílem pasterizace není absolutní eliminace bakterií přítomných v mléce, ale snížení množství bakterií na úroveň bezpečnou pro zdraví konzumenta (LINARES, 2012). Sýry vyráběné z pasterovaného mléka obsahují prokazatelně nižší hodnoty BA, oproti sýrům z mléka syrového. Pasterací se zničí původní mikoorganismy a zpomalí se proteolýza a také dojde k inaktivaci kofaktoru pyridoxal-5-fosfátu, který je termolabilní (NOVELLARODRÍGUEZ et al., 2003). NOVELLA-RODRÍGUEZ et al. (2004) zjistili v sýrech ze syrového mléka až 30x vyšší množství tyraminu než v sýrech z pasterizovaného mléka. Jakmile jsou BA vytvořeny, je obtížné je zničit tepelným záhřevem a i některé dekarboxylázy zůstávají aktivní i po pasteraci, takže obsah BA může vzrůstat i během skladování (BRINK et al., 1990; SILLA-SANTOS, 1996).

2.3.1.11 Homogenizace Vysokotlaká homogenizace (HPH) se používá za účelem vyšší výtěžnosti a zkrácení doby zrání, může však být i užitečným nástrojem ke snížení akumulace nežádoucích sloučenin, jako jsou biogenní aminy. Vysokotlaká homogenizace je srovnatelná s terminací, dochází k deaktivaci většiny mikroorganismů a výrazné redukci tvorby aminů (LANCIOTTI et al., 2007).

35

2.3.2 Fyziologické účinky biogenních aminů Některé biogenní aminy jsou pro organismus nepostradatelné, neboť mají významné biologické funkce. Jsou zdrojem dusíku, prekurzory pro syntézu hormonů nebo samy působí jako hormony, podílejí se na syntéze nukleových kyselin, proteinů, alkaloidů atd. (SILLA SANTOS, 1996). Speciálně histamin má významnou funkci při alergické odezvě organismu. Svou strukturou patří mezi biogenní aminy také katecholaminy adrenalin a noradrenalin. Adrenalin je důležitým hormonem dřeně nadledvin s účinkem na hladkou svalovinu krevních cév. V kosterní svalovině vyvolává adrenalin vasodilataci arteriol, naopak jeho vazba na příslušné receptory arteriol kůže a vnitřností, především střev, vyvolá konstrikci. Celkově převládá účinek vasodilatační, u noradrenalinu vazokonstrikční. Důsledkem účinku adrenalinu je zvýšení srdeční funkce, v metabolické rovině zvýšení hladiny krevní glukózy (KOMPRDA, 2005). Jedním z nejvýznamnějších biogenních aminů je histamin, který vykazuje jak účinky psychoaktivní, tak vasoaktivní. Histamin hraje prvotní úlohu jako mediátor alergických reakcí a zánětu, stimuluje hladkou svalovinu dělohy, střeva a respiračního traktu, působí snížení krevního tlaku a zvyšuje sekreci žaludeční kyseliny. HIS také přispívá k regulaci tělesné teploty, hojení ran, ovlivňuje denní a noční biorytmy, proces učení i paměť (MAINTZ, NOWAK, 2007; LADERO et al., 2010; HUNGERFORD, 2010). Za nezbytné součásti všech živých buněk se považují polyaminy (PA) - SPM, SPD, AGM a PUT, ale jejich přesná biologická role v buněčné výměně látek je stále nejasná (SILLA SANTOS, 1996). Polyaminy jsou všudypřítomné látky považované za bioregulátory četných buněčných funkcí, které se účástní buněčného růstu, dělení a diferenciace. Také mohou hrát důležitou roli v regulaci enzymů vázaných na membrány. PA jsou přítomny ve všech typech buněk v různých koncentracích (GALGANO et al., 2012). Zjistilo se, že jejich obsah vzrůstá ve tkáních se zvýšenou intenzitou dělení buněk, např. v hojících se ranách, ale také v rostoucích nádorech. Polyaminy podle soudobých poznatků nejsou karcinogenní, nevyvolávají tedy vznik nádorů, jejich růst však podporují. Organismus si polyaminy za těchto okolností jednak syntetizuje, jednak je přesouvá do rostoucích tkání z rezerv v jiných částech těla (zejména svaly a kůže), ale také je ve zvýšené míře využívá z potravy (KALAČ, KŘÍŽEK, 2002; KALAČ, KŘÍŽEK, 2005).V některých studiích bylo zjištěno, že růst maligních buněk byl spojený s přítomností zvýšených obsahů biogenních aminů. Takže vysoké hladiny některých polyaminů v moči mohou sloužit jako ukazatelé rakovinných nádorů. V moči zdravých jedinců byl naměřen celkový obsah polyaminů v hodnotě 2,01 µg 36

na mg kreatininu a u pacientů s rakovinou 44,74 µg na mg kreatininu (ZHAO et al., 2009). Pro dietology je zatím obtížné sestavit dietu, která by v případě zjištění vzniku nádorových onemocnění omezovala příjem polyaminů, příp. naopak při pooperačních stavech či zraněních, kdy je nutné zintenzivnit hojení těchto ran, přísun těchto složek zvyšovala (KALAČ, KŘÍŽEK, 2002). Dále bylo zjištěno že příjem vysokých koncentrací PA v potravinách může zintenzivnit toxikologický účinek histaminu (GALGANO et al., 2012).

2.3.3 Toxikologické účinky biogenních aminů Spotřeba potravin obsahující vysoké koncentrace některých aminů může vyvolat nežádoucí účinky. Biogenní aminy se v nadlimitních koncentracích mohou projevit jako látky psychoaktivní tj, že působí jako přenašeči v centrálním nervovém systému nebo jako látky vasoaktivní a působit tedy přímo nebo nepřímo na vaskulární systém. Vasoaktivní aminy se podle účinku dělí na ▪ vasodilatační - rozšiřuje cévy (histamin) ▪ vasokonstrikční - stahuje cévy (tyramin) Symptomy konzumace vysokých dávek BA jsou především nucení ke zvracení, dýchací potíže, bušení srdce, bolesti hlavy, zrudnutí v obličeji, pálení v ústech, červená vyrážka na kůži, hypotenze a hypertenze (VELÍŠEK, 2002; KALAČ, KŘÍŽEK, 2002). Histamin

Histamin je v lidském těle uložen v žírných buňkách a basofilních granulocytech, což je druh bílých krvinek. Odtud je při alergických reakcích uvolňován do krevního oběhu. Druhým zdrojem je potrava. Účinky po požití histaminu se projevují do 30 minut, část se vstřebává již v dutině ústní. Příznaky jsou obdobné jako alergie na určité potraviny, takže je otrava často mylně diagnostikována jako alergická reakce (BRINK et al., 1990; KATZUNG, 1994; DABROWSKI, SIKORSKI, 2005). HIS projevuje svou toxicitu pomocí interakcí s receptory na buněčných membránách. Negativní účinky histaminu na organismus jsou poměrně různorodé. Vazba histaminu na příslušné receptory cévní stěny vyvolává dilataci hladké svaloviny periferních krevních cév s důsledkem poklesu tlaku, což u citlivých jedinců může mít za následek zrudnutí obličeje a silné bolesti hlavy. Naopak interakce histaminu s receptory střevní stěny vyvolává kontrakce hladké svaloviny střeva s klinickými projevy břišních křečí, průjmu, resp. zvracení. Kromě toxického účinku ve vlastním slova smyslu mají význam jednak reakce imunologické (alergie), jednak negativní reakce probíhající na jiném než imunologické podkladě - intolerance. K typickým alergickým reakcím, např. po požití 37

vyšších dávek histaminu v některých potravinách, patří u citlivých jedinců kopřivka (urticaria), zrudnutí očí, dechové potíže a svalový třes. Riziková množství příjmu HIS se vesměs uvádějí tyto: 8 - 40 mg jako dávka vyvolávající projevy lehké otravy, 40 - 100 mg otravy střední a dávka nad 100 mg silné intoxikace. Toxický účinek histaminu závisí kromě velikosti přijatého množství, závisí na přítomnost jiných BA, aktivitě aminooxidáz (viz. níže), požití alkoholu nebo užívání léčiv a na celkovém stavu fyziologie střeva (SILLA SANTOS, 1996; KOMPRDA, 2005; DABORWSKI, SIKORSKI, 2005; KALAČ, KŘÍŽEK, 2005). Inkubační doba histaminových otrav je velmi krátká (obvykle 5 - 30 minut po požití), příznaky potom odeznívají během několika hodin (MAINTZ, NOWAK, 2007). Nicméně histamin je běžná součást těla, kde se vytváří z histidinu prostřednictvím dekarboxylázy reagující s pyridoxal - fosfátem a jeho koncentrace v krvi je přísně regulována (FOX et al., 2004). KING (2000) ve své klinické studii uvádí vliv přísné diety neobsahující histamin u pacientů s chronickou kopřivkou a s angioedémem. Po 14 dnech diety došlo k výraznému zlepšení stavu pacientů a dávkování užívaných antihistaminik mohlo být značně sníženo.

Tyramin Tyramin je nejúčinnější ze skupiny vasoaktivních aminů (KALAČ, KŘÍŽEK, 1998). Tyramin způsobuje zúžení periferních cév, hypertenzi, zvýšení srdeční činnosti, plicní edém. Tyramin také rozšiřuje zornice, cévy víčka, ovlivňuje slzení a salivaci, zvýšení krevního cukru, migrény a uvolnění noraderanalinu ze sympatického nervového systému (SHALABY 1996; VINCI, ANTONELLI, 2002; LAWLEY et al., 2008; RAO, YERAGANI, 2009). KALAČ A KŽÍŽEK (2005) uvádí, že dávka 10 - 80 mg může vyvolat otoky a dávka nad 100 mg migrénu. U pacientů užívajících právě inhibitory MAO a antidepresiva může dojít k nahromadění TYR, čímž může dojít ke vzniku hypertenzní krize s možným vznikem mrtvice nebo srdečního infarktu (WESTFALL, WESTFALL, 2006; RAO, YERAGANI, 2009). TYR také může zvyšovat přilnavost E. coli O157 : H7 k buňkám střevního epitelu (LYTE, 2004). Zvýšené koncentrace TYR v mozku mohou souviset i s výskytem neurologických onemocnění jako je schizofrenie, Parkinsonova choroba či deprese (CORUZZI et al., 2001; PREMONT et al., 2001). Toxicitu tyraminu ještě zesiluje vysoký obsah putrescinu, jehož přítomnost působí synergicky (BOVER-CID et al., 2000).

38

Fenylethylamin Fenylethylamin zvyšuje tlak a způsobuje migrény. Je prekurzorem tyraminu (KALAČ, KŘÍŽEK, 2002; VELÍŠEK,2002).

Putrescin Putrescin je dáván do souvislosti s virulentními faktory řady grampozitivních a gramnegativních patogenních mikroorganismů (SHAH, SWIATLO, 2008). Jeho přítomnost v extracelulárním slizu plazivých a plovoucích buněk, typických pro rod Proteus, také usnadňuje vzájemnou buněčnou komunikaci a významně se tak podílí na pohyblivosti těchto bakterií, jenž způsobují např. záněty močových cest (JONES et al., 2007).

2.3.4 Reakce biogenních aminů Biogenní aminy jsou reaktivní látky. Kromě enzymových reakcí, které vedou k derivátům biogenních aminů a dalším sloučeninám, mohou oxidativní deaminací poskytovat aldehydy. Dlouhodobým skladováním nebo za zvýšené teploty reagují s triacylglyceroly za vzniku amidů mastných kyselin. Vstupují stejně jako další aminosloučeniny do reakcí neenzymového hnědnutí, kde vznikají jako primární reakční produkty příslušné iminy. Ty se tvoří také oxidací aminů, např. peroxidem vodíku nebo hyperperoxidy lipidů (VELÍŠEK, 2002). Biogenní aminy mohou sloužit jako prekurzory karcinogenních N - nitroso sloučenin. Podstatně nebezpečnější jsou v této souvislosti sekundární aminy, které vytvářejí stabilní produkty na rozdíl od těkavých produktů reakcí s účastí primárních aminů (KOMPRDA, 2005). Zahříváním putrescinu může vznikat pyrrolidin a dále N - nitrosopyrrolidin, zahříváním kadaverinu piperidin a následně N - nitrosopiperidin (SHALABY, 1996). Zvýšené koncentrace PUT byly zjištěny rovněž při karcinomech žaludku způsobených H. pylori (LADERO, 2010).

2.3.5 Odbourávání biogenních aminů v organismu U zdravých jedinců nemusí být projevy při zvýšeném příjmu BA příliš výrazné, zatímco u osob trpících migrénami, ve vyspělých zemích se jedná asi o pět procent populace, představuje zvýšený příjem aminů riziko. Zdravý člověk má totiž pro běžný příjem účinný detoxikační mechanismus, představovaný střevními enzymy aminooxidázami (KALAČ, KŘÍŽEK,

2002).

Ten

tvoří

systém

enzymů

aminooxidas

s prostetickou

FAD

(flavinadenindinukleotid) skupinou. Nejdůležitějšími jsou enzymy HMT (histamin39

metyltransferáza), MAO (monoaminooxidáza) a DAO (diaminooxidáza) (GREIFOVÁ et al., 2003). Aminooxidázy, které se podílejí na odbourání histaminu mají teplotní optimum kolem 37 °C (SUZZI, GARDINI, 2003). Při detoxikaci, ke které dochází v tenkém střevě a játrech, jde o dehydrogenace aminu podobně jako u oxidační deaminace, přes imin (za uvolnění H2O2), ze kterého hydrolýzou uvolňuje amoniak a vzniklý aldehyd, jenž je pak oxidován na karboxylovou kyselinu. Detoxikační aktivita je však značně individuální. K výraznému oslabení může dojít při některých onemocnění. Aktivitu nejúčinnějšího enzymu MAO snižuje alkohol, ale ještě podstatněji některé léky, především ze skupiny psychofarmak (např. Sepatrem, Niar, Selegin). Pro pacienty léčené těmito léky představuje riziko především tyramin, protože silné zvýšení krevního tlaku může vést až k ohrožení života. Aktivitu enzymu diaminooxidázy, který se podílí na odbourávání putrescinu a kadaverinu snižují například léky na odkašlávání a uvolňování hlenů (Ambroxol a Acetylcystein). V takovém případě rostou nároky na aktivitu MAO, která pak může chybět pro detoxikaci především histaminu a tyraminu. (VELÍŠEK, 2002; KALAČ, KŘÍŽEK, 2002; KALAČ, KŘÍŽEK, 2005). Kouření je další rizikový faktor, který zvyšuje pravděpodobně toxický účinek BA až o 30 % (LADERO, 2010).

2.3.6 Snížení hladiny biogenních aminů v potravině Hlavním opatřením k zabránění vzniku BA je chlazení. Nicméně, protože některé bakterie, které tvoří BA mohou růst i při teplotě nižší než 5 °C a je také obtížné pracovat s nízkou teplotou v případě fermentovaných potravin, kde mikrobiální růst je rozhodující pro dosažení konečného produktu, rozvíjí se další kontrolní opatření. Metody k omezení růstu mikroorganismů mohou zahrnovat hydrostatické tlaky, ozáření, ochrannou atmosféru nebo použití potravinářských přídatných a konzervačních látek, dále použití oxidačních bakterií a enzymy jako DAO (NAILA et al., 2010). NOVELLA –RODRIGUES et al. (2002) cit. podle NAILA et al. (2010) zjistili sýrů snížení BA za použití hydrostatického tlaku 400 MPa, který působil po dobu 5 min s kombinací hydrostatického tlaku 50 MPa po dobu 72 dodin. Dále někteří autoři naznačují, že rychlé okyselení by mohlo snížit hladinu BA spojenou s poklesem růstu dekarboxylujících mikroorganismů (GARDINI et al., 2001). Nicméně, je obtížné jednat o tomto parametru, protože je nedílnou součástí procesu fermentace (LINARES, 2012). Fyziologické inaktivace BA je možné dosáhnout použitím mikroorganismů, majících aminooxidázovou aktivitu, mezi tyto mikroorganismy patří např. Brevibacterium linens, které 40

snižuje množství TYR a HIS po dobu zrání sýrů (GREIF, GREIFOVÁ, 2006). Dále mezi mikroorganismy, které mohou rozkládat BA patří Micrococcus varians (LEUSCHNER, HAMMES, 1998, cit. podle NAILA et al., 2010), Lactobacillus curvatus a L. sakei (DAPKEVICIUS et al., 2000, cit. podle NAILA et al., 2010).

2.3.7 Hygienické limity obsahu biogenních aminů v potravinách Otázka posouzení toxické dávky BA je komplikovaná, protože odezva organismu na intoxikaci aminy je z genetických důvodů velmi individuální a závisí na množství různých faktorů, jako je množství spotřebované potravy, množství aminů v potravě, přítomnost dalších aminů (GREIF, GREIFOVÁ, 1998). Nejvyšší přípustné množství BA v potravinách je v jednotlivých zemích stanoveno různě. Často se týkají potravin významných pro danou zemi např. mořských ryb a výrobků z nich v přímořských zemích či vína v zemích s jeho velkou spotřebou (KALAČ, KŘÍŽEK, 2005). Ve vyhlášce MZd č. 298/1997 Sb. O potravinách a tabákových výrobcích bylo stanoveno nejvyšší přípustné množství histaminu v rybách 200 mg/kg a 20 mg/l v pivu a vínu. Pro tyramin činí přípustná množství 50 mg/l pro červená vína, 100 mg/kg pro základní suroviny a 200 mg/kg pro sýry. Ustanovení soudobé vyhlášky MZd č. 305/2004, harmonizované s legislativou EU, uvádí pouze přípustné množství histaminu 100 mg/kg v rybách a rybích výrobcích s tím, že uvedený obsah může být u dvou z devíti vzorků odebraných z jedné šarže překročen až do 200 mg/kg. V literatuře se pro většinu potravin uvádí jako přijatelný obsah široké rozmezí 100 - 800 mg/kg (KALAČ, KŘÍŽEK, 1998; KALAČ, KŘÍŽEK, 2002). Zatím v žádné zemi neurčuje legislativa výrobcům deklarovat obsah histaminu a tyraminu na obalu. Takovýto údaj by však jistě ocenili především jedinci trpící migrénami a dietologové (KALAČ, KŘÍŽEK, 2005). Velice významná je i existence indexu biogenních aminů (BAI). Z hygienického hlediska mohou BA sloužit jako indikátory stupně kažení. V této souvislosti index biogenních aminů využívá skutečnosti, že obsah kvantitativně významných biogenních aminů (HIS, PUT, CAD) se v průběhu skladování daného produktu zvyšuje, na druhé straně se však obsahu polyaminů (SPM, SPD) nemění nebo dokonce snižuje. Index biogenních aminů se vypočte jako: BAI= HIS + PUT + CAD/(1 + SPM + SPD) Obsahy všech BA uvedených v této rovnici jsou v mg/kg dané potraviny (KOMPRDA, 2005). Je- li BAI maximálně 1,0 jde o prvotřídní potravinu, je- li vyšší než 10, tak jde o potravinu silně narušenou. Řada autorů dokazuje korelaci mezi BAI a mikrobiální kontaminací. Největší význam mají samozřejmě mikroorganismy s produkcí dekarboxylasy. 41

Z výše uvedeného vyplývá, že BAI platí jak pro nefermentované, tak i pro fermentované potraviny (HRUBÝ et al., 1994).

2.3.8 Výskyt biogenních aminů v mléce a v mléčných výrobcích 2.3.8.1 Biogenní aminy v mléce V nefermentovaných potravinách lze považovat přítomnost biogenních aminů nad určitou úroveň za ukazatel nežádoucí mikrobiální kvality. Nicméně, přítomnost BA v potravinách, nemusí korelovat s růstem kazících mikroorganismů, protože nejsou všechny dekarboxyláza pozitivní (SILLA-SANTOS, 1996). Koncentrace biogenních aminů v čerstvém mléce je nepatrná, výskyt je většinou pod 1 mg/l (tabulka 7). V mléce samotném převládají polyaminy spermidin a spermin (GREIF, GREIFOVÁ, 2006; SPANO et al., 2010, cit. podle LINARES et al., 2012), avšak není jasné, zda jsou syntetizovány mikroorganismy nebo mají endogenní původ (LINARES et al., 2012). Dále byl zjištěn v mléce výskyt histaminu a tyraminu. Obsah histaminu v mléce se pohyboval od 0,5 - 0,8 mg/kg a v sušeném mléce 131 mg/kg. Obsah tyraminu v sušeném mléce byl 42 mg/kg. (GREIF, GREIFOVÁ, 2006). V tabulce 7 jsou v mléce zaznamenány pouze koncentrace histaminu a sperminu.

2.3.8.2 BA v sýrech Podmínkou vzniku toxického množství aminů v mléčných výrobcích je proteolýza, která je např. při zrání sýrů považována za jeden z nejdůležitějších pochodů ovlivňující kvalitu sýra (GREIF, GREIFOVÁ, 2006). Sýry patří mezi potraviny s vysokým obsahem bílkovin, u kterých enzymatická a mikrobiální aktivita způsobuje vznik aminokyselin a biogenních aminů. V průběhu zrání sýrů dochází k degradaci kaseinu a tím k nahromadění volných aminokyselin, které mohou být přeměněny činností bakteriálních dekarboxyláz na biogenní aminy (INNOCENTE et al., 2009). Ve vyzrálých sýrech mohou být stovky až tisíce mg/ kg BA (NOVELLA - RODRÍGUES et al., 2004). Mezi hlavní BA obsažené v sýru patří tyramin, histamin, putrescin a kadaverin (SILLA SANTOS, 1996; LINARES et al., 2012). K nejdůležitějším faktorům ovlivňujícím obsah BA v sýrech patří hygienické podmínky uchovávání výchozích surovin, teplota syřidla, startovací kultura, proteolytická činidla, pH, vodní aktivita, obsah soli, obsah tuku, teplota zrání a doba skladování. Zajímavý je i vliv tvaru sýrů: Ve zrajících sýrech kulatého tvaru jsou zjišťovány až několikanásobně vyšší hodnoty obsahu BA ve srovnání s tvarem hranatým. V sýru zrajícím pod fólií byl nalezen vyšší obsah celkových BA než v sýru zrajícím pod kůrou (3500 resp. 1500 mg/kg). Pravděpodobnou 42

příčinou je rozdílná hodnota aw v povrchových vrstvách sýru (KŘÍŽEK, KALAČ, 1998; KOMPRDA, 2005). Nejvyšší obsahy těchto aminů jsou ve zrajících sýrech pod mazem (typu tvarůžků či romaduru) a v sýrech poloměkkých a plísňových. Další skupinou jsou sýry vyráběné z nepasterovaného mléka a za zhoršených hygienických podmínek (např. brynza). V tvrdých sýrech holandského typu jsou hladiny BA nižší (KALAČ, KŘÍŽEK, 2005). V sýrech, které mají vysoké hladiny volných aminokyselin, se může vytvořit významné množství aminů i při malém množství obsahu mikroorganismů (STANDAROVÁ et al., 2009). Ve studii STANDAROVÁ et al. (2008) zjistili nejvyšší koncentrace celkových BA u tvarůžků (2540 mg/kg), brynzy (2490 mg/kg) a u nivy (950 mg/kg). Hlavními biogenními aminy v sýrech jsou tyramin, putrescin, kadaverin a histamin (NOVELLA - RODRÍGUES et al., 2004). Obsah BA v sýrech se mění v průběhu celého zrání, kromě vzrůstu, ale může dojít i k poklesu, opětovnému nárůstu a může se měnit i zastoupení jednotlivých aminů (MERCOGLIANO et al., 2010). Tabulka 7: Biogenní aminy v mléce a v mléčných produktech (mg/kg) (LINARES, 2012) POTRAVINA

DRUH

CAD

HIS

FEA

PUT

TYR

SPM

SPD

ZDROJ

Mléko

Kravské

nd

nd

nd

nd

nd

0,18

nd

NovellaRodriguez et al.,

syrové

2000 --

0,3

--

--

--

--

--

Bodmer

et

al.,

et

al.,

et

al.,

1999 Mléko

--

0,7

--

--

--

--

--

1999

pasterované Jogurt

Bodmer

--

13

--

--

--

--

--

Bodmer 1999

0,27

nd

nd

nd

nd

0,43

0,34

NovellaRodriguez et al., 2000

Kefír

1,8

4,0

nd

12,1

12,8

nd

4,5

Özdestan,Üren, 2010

2,2

1,6

nd

1,4

9,8

nd

1,5

Özdestan,Üren, 2010

43

Tabulka 8: Biogenní aminy v sýru (mg/kg) (LINARES, 2012) POTRAVINA

DRUH

CAD

HIS

Sýr

ovčí

123,07

50

FEA PUT --

107,69

TYR

SPM

SPD

ZDROJ

125

115,38

369,23

Mercogliano et al., 2010

ze syrového mléka

26,8

0

28,6

394,1

499,6

96,4

--

Schirone et al., 2011

Kozí

394,72

15,6

9,39

217,84

216,28

nd

nd

Pinho et al., 2004

88,7

88,4

11,7

191,8

830,5

--

--

NovellaRodriguez et al., 2000

94

117

160

941

258

70,5

23,5

Galgano et al., 2000

kravský ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

Fernández et al, 2007 b

Parmigiano

kravský 3,2

10,9

--

1,8

6,4

4,4

--

Mayer et al., 2010

kravský 15,56

28,5

9,51

75,87

29,89

7,71

4,46

Innocente, D’Agostin, 2002

Extra

hard kravský

--

249

--

--

18

--

--

Mayer et al., 2010

grana

Různé studie se zabývaly vlivem různých bakterií na tvorbu BA v sýrech. Přítomnost Gram-negativních mikroorganismů v mléce zapříčinila vzrůst hlavně CAD a TYR v sýrech. Enterokoky byly zodpovědné za tvorbu TYR a FEA. Pediokoky nebyli schopné způsobit tvorbu BA v sýrech. Vzrůst Bacterium proteolyticum v sýru byl doprovázen nežádoucí chutí a vedl k tvorbě PUT (GREIF, GREIFOVÁ, 1998). STANDAROVÁ et al. (2008) stanovili v měkkých zrajících sýrech BA. Nejvíce byl zastoupen kadaverin, jehož maximální hodnota byla 1110 mg/kg, u putrescinu byla zjištěna hladina 591,1 mg/kg, kadaverin měl 417 mg/kg a histamin 283 mg/kg. A u tvarůžků byl zjištěn putrescin v hodnotě 514 mg/kg a kadaverin 739 mg/kg. 44

Protože zrající sýry jsou jednou ze základních surovin pro výrobu tavených sýrů, nejsou bez zajímavosti údaje o průměrném obsahu tyraminu, sperminu a putrescinu v různých druzích taveného sýru: 59, 56, resp. 21 mg/kg (KOMPRDA 2005). GREIFOVÁ et al. (2003) naměřili nejvyšší obsah histaminu v tavených sýrech 105 mg/kg, tyraminu 13 - 172 mg/kg, kadaverinu 95 mg/kg a putrescinu 77 mg/kg (GREIFOVÁ et al., 2003). V tavených sýrech je obsah BA oproti sýrům tvrdým nízký (STANDAROVÁ et al., 2008). V Sýrech s plísní na povrchu STANDAROVÁ et al. (2008) stanovili v sýrech s plísní na povrchu maximální množství u tyraminu 187 mg/kg, u putrescinu 266 mg/kg, kadaverinu 388 mg/kg a histaminu 166 mg/kg. U sýru Camembert obsahoval značné množství CAD a to i přes 1000 mg/kg a v hermelínu bylo stanoveno 187 mg/kg TYR. V sýru Niva bylo nejvíce tyraminu (10 - 875 mg/kg) a kadaverinu (3 - 491 mg/kg) (KOMPRDA et al., 2008).

GREIFOVÁ et al. (2003) naměřili v nivě nejvyšší hladinu

kadaverinu 25 - 705 mg/kg. PUT, HIS a TYR byly neměřeny v množství méně než 100 mg/kg. Podobné výsledky naměřili i STANDAROVÁ et al. (2008). Tyramin byl stanoven v nejvyšší hladině 699 mg/kg, tyramin 444 mg/kg, putrescin 123 mg/kg. TRY, FEA, HIS, SPD, SPM byly v nízkých hladinách. V tabulce 9 jsou znázorněny další hodnoty BA naměřené ve vzorcích ze sýru roquefort.

Tabulka 9: Biogenní aminy v sýru roquefort (mg/kg) (LINARES, 2012) DRUH

DRUH

SÝRU

MLÉKA

Roquefort

CAD

HIS

FEA

PUT

8,9

9,9

7,7

18,3

TYR

SPM

SPD

ZDROJ

4,6

18,1 Mayer et al., 2010

ND

50

ND

25

2000

ND

18

Rabie et al., 2011

2101,4 376,6

39,7

257,2

1585,4

--

--

NovellaRodriguez et al., 2003

směs

756,78 1041,8 875,8 1051,98

--

--

--

Fernandéz et al., 2007 b

45

Brynza patří do skupiny měkkých roztíratelných sýrů a vyrábí se z nepasterizovaného mléka na různých salaších, za různých hygienických podmínek a často i rozdílnou technologií GREIF, GREIFOVÁ, 2006). Přirozená mikroflóra u sýrů vyráběného ze syrového mléka hraje významnou

roli

v tvorbě

biogenních

aminů

(MERCOGLIANO

et

al.,

2010).

GREIF, GREIFOVÁ (2006) v zimní brynze naměřili nejvyšší hodnoty BA 731 mg/kg a nejnižší 58 mg/kg. Dominantní podíl z celkového množství sledovaných aminů tvořil kadaverin s nejvyšší hodnotu 414 mg/kg, potom tyramin 144 mg/kg, putrescin 143 mg/kg a histamin 30 mg/kg. V jarní brynze (vyrábí se kombinací čerstvého ovčího a kravského sýru) bylo 900 - 1220 mg/kg kadaverinu, 520 - 610 mg/kg putrescinu, 408 - 435 mg/kg tyraminu a 180 - 202 mg/kg histaminu. V zimní brynze bylo všech BA podstatně méně (GREIFOVÁ et al., 2003). V tabulce 8 jsou znázorněny další hodnoty BA naměřené v ovčím sýru z nepasterovaného mléka. MERCOGLIANO et al., (2010) cit. podle LINARES (2012) naměřili v tomto sýru nejvyšší hodnoty u SPD (369 mg/kg) a CAD (123,07 mg/kg). SCHIRONE et al. (2011) cit. podle LINARES (2012) naměřili nejvyšší hodnoty u TYR (499,6 mg/kg) a PUT (394,1 mg/kg). MARTUSCELLI et al. (2005) sledovali obsah BA v italském sýru Pecorino Abruzze vyrobeném z ovčího mléka. Po 60 dnech zrání v sýru ze syrového mléka bez startovací kultury naměřili 697 mg/kg celkových BA a u sýru z pasterovaného mléka s použitím startovací kultury naměřili 1086 mg/kg celkových BA. Existují důkazy o tom, že startovací kultury jsou občas spojeny s tvorbou tyraminu a mohou tvořit i putrescin (MARINO et al., 2003). U portugalských sýrů Azeitão, které byly skladovány první 2 týdny při teplotě 4 °C bylo z původní hodnoty celkových BA 838 mg/kg naměřeno 869 mg/kg a po dalších 2 týdnech při teplotě 25 °C činila hodnota BA 1393 mg/kg ( PINHO et al., 2001). V tabulce 8 jsou uvedeny hodnoty BA kozích sýrů vyrobených z nepasterovaného mléka. Z tabulky je zřejmé, že z BA jsou nejvíce zastoupeny HIS, PUT a CAD. PINHO et al. (2004) naměřili nejvíce CAD a to v množství 394,72 mg/kg. NOVELLA-RODRIGUEZ et al. (2000) zjistili nejvíce tyraminu (830,5 mg/kg) a GALGANO et al. (2000) naměřili největší obsah PUT (941 mg/kg). GREIFOVÁ et al. (2003) naměřili v ementálu nejvíce TYR (130 - 420 mg/kg), dále byl stanoven HIS (5 - 50 mg/kg), PUT (4 - 20 mg/kg) a CAD (5 - 30 mg/kg). BA v ementálu stanovovaly i STANDAROVÁ et al. (2008) a zjistily TYR nejvíce v množství 1123 mg/kg a HIS 51 mg/kg, CAD měl nejvyšší množství 233 mg/kg a putrescin 223 mg/kg. REA et al. 46

(2004) v sýru Čedar sledovali koncentraci TYR během výroby a zrání. Koncentrace v sýru se pohybovala od 36 mg/kg do 47 mg/kg. Po 36 týdnech zrání byla největší hodnota TYR nalezena u sýru obsahující kmen Enterococcus durans. GREIFOVÁ et al. (2003) stanovili v sýru Primátor nejvyšší hodnotu tyraminu 120 mg/kg, putrescinu 30 mg/kg, kadaverinu 42 mg/kg a histaminu 20 mg/kg. STANDAROVÁ et al. (2008) naměřili v eidamu nejvyšší hladinu u tyraminu 360 mg/kg, u kadaverinu 432 mg/kg, putrescin měl nejvyšší množství 184 mg/kg a histamin 58 mg/kg. Další hodnoty BA v tvrdých sýrech jsou v tabulce 10.

Tabulka 10: Biogenní aminy v sýru z pasterovaného mléka (mg/kg) (LINARES, 2012) DRUH

DRUH

SÝRU

MLÉKA

Feta

kozí

CAD

HIS

FEA

PUT

TYR

SPM

SPD

ZDROJ

82,8

84,6

4,94

193

246

ND

ND

Valsamaki et al., 2000

kravské

Ementál

98,3

23,5

--

38

52,2

--

16,8 Mayer et al., 2010

Čedar

kravské

ND

25,4

--

4,8

Gouda

kravské

ND

--

--

Eidam

ND

3,2

Gorgonzola

ND

Pecorino

ovčí

--

8,5

18,2 Mayer et al,

--

2,43

0,5

1,73 2010

--

--

--

--

--

23,7

--

--

--

--

--

33,7

255,3

--

3,2

13,2

10,8

17,2

80

90

300

200

280

ND

20

et al, 2005

Abruzzese Semiripenned

Martuscelli

kravské

33,49

24,38

25,75 22,6

32,92

24,35

23,4 LatorreMoratalla et al., 2009

ND

65,42

--

175,39

80,9

--

--

Fernandéz et al., 2007b

GIUFFRIDA et al. (2006) sledovali obsah BA v italském sýru pasta filata a to v různém stupni zrání. Nejvíce zastoupený biogenní amin byl HIS a TYR. Koncentrace TRY a FEA byly po celou dobu zrání pod 0,1 mg/kg. HIS byl přítomen v největším množství u všech vzorků (16,72 mg/kg, 22,39 mg/kg v 90 dnu zrání). Nízká koncentrace celkových BA může být způsobena správnou hygienou a kvalitou použitého mléka. 47

Sýr Feta patří do skupiny sýrů, které zrají v solném roztoku (VALSAMAKI et al., 2000). VALSAMAKI et al. (2000) zjistili v sýru Feta z kozího mléka přítomnost TYR, PUT, HIS, CAD, a malé množství TRY a FEA. Celkový obsah biogenních aminů po 60 dnech byl 330 mg/kg a po 120 dnů skladování 617 mg/kg. Po 60 dnech bylo naměřeno 152 mg/g TYR, 77,7 mg/kg PUT, 47 mg/kg HIS a CAD bylo 44 mg/kg. A po 120 dnech zrání obsah TYR byl 246 mg/kg, PUT byl 193 mg/kg a koncentrace HIS 84,6mg/kg, CAD byl 82,8mg/kg (tabulka 10). GREIFOVÁ et al. (2003) zjistili nejvyšší obsah histaminu 112 mg/kg, tyraminu 30 mg/kg, kadaverinu 35mg/kg a putrescinu 25 mg/kg.

2.3.8.3 BA v ostatních mléčných produktech Kromě sýrů, je kefír další fermentovaný mléčný výrobek, kde mohou být BA přítomny. ÖZDESTAN, ÜREN (2010) cit. podle LINARES et al. (2012) uvádí obsah celkových BA ve vzorcích kefíru mezi 2,4 a 35,2 mg/l přičemž tyramin je zde převažující BA (tabulka 7). Podobně CHAVES-LÓPEZ et al. (2011) cit. podle LINARES et al. (2012) uvádí celkový obsah BA v množství 15,31 mg/l ve vzorcích kumysu. Nicméně, tyto úrovně jsou hluboko pod doporučenými limity. Ostatní mléčné kysané výrobky, včetně podmáslí nebo jogurtu neobsahují významné úrovně BA (tabulka 7). Hlavním důvodem je krátká fementace, využití startovací kultury, řízené výrobní podmínky, jako je zahřívání při 90 - 95 °C před kvašením

a tedy i nízký obsah mikroorgasnimů v surovině. (NOVELLA-RODRÍGUEZ et

al., 2000; SOUCI et al., 2000, cit. podle LINARES et al., 2012; ÖZDESTAN, ÜREN, 2010, cit. podle GALGANO et al., 2012)

48

3 CÍL PRÁCE Cílem disertační práce bylo: ▪ charakterizovat dekarboxylázovou aktivitu Escherichia coli a bakterií Bacillus, Lactobacillus a Enterococcus izolovaných z mléka a mléčných výrobků, ▪ vybranými mikroorganismy (Enterococcus faecium, Enterobacter aerogenes, Escherichia coli, Proteus vulgaris, Pseudomonas fluorescens a Geotrichum candidum) inokulovat kravské a kozí mléko a tvarohy z něj vyrobené a sledovat dynamiku růstu jejich počtu, ▪

sledovat produkci CO2 ve vzorcích mléka a tvarohů záměrně kontaminovaných vybranými

mikroorganismy, ▪

ve vzorcích tvarohů stanovit množství biogenních aminů.

49

4 MATERIÁL A METODY 4.1 Metoda průkazu dekarboxylázové aktivity mikroorganismů Princip: Při dekarboxylaci aminokyseliny obsažené v diagnostickém médiu odštěpí příslušná dekarboxyláza z karboxylové skupiny aminokyseliny oxid uhličitý za vzniku alkalického aminu. Pozitivní výsledek se pak projeví změnou zbarvení indikátoru způsobenou změnou pH.

Postup: Sterilní zkumavky byly naplněny 1 ml diagnostické půdy A nebo 2 ml diagnostické půdy B, zality 0,5 ml parafinového oleje a sterilizovány 15 min při 121 °C. Do takto připravených zkumavek byla inokulován 24 hodinová kultura příslušné bakterie. Zkumavky byly poté vloženy do termostatů a kultivovány při 37 °C , 30 °C, 25 °C, 6 °C po dobu 10 dnů. Během této doby byly pravidelně po 24 hodinách hodnoceny barevné změny. Pro testování bylo použito 7 aminokyselin: lyzin (Lys), arginin (Arg), ornithin (Orn), fenylalanin (Fea), histamin (His), tyrosin (Tyr) a tryptofan (Try). Vizuální hodnocení barevných reakcí je uvedeno v tabulce 11.

Diagnostická půda A (BROOKS et SODEMAN, 1974) Složení: Pepton 0,5 g, yeast extract 0,3 g, bromkresolpurpur (0,2 % roztok v 50 % ethanolu) 1 ml, L- aminokyselina 1g, destilovaná voda 100 ml. Příprava: Jednotlivé složky rozpustíme v uvedeném pořadí v destilované vodě, přidáme aminokyselinu (lysin, arginin, histidin, tryptofan, tyrozin, ornitin a fenylalanin) a upravíme pH na 5 – 5,3. Nakonec přidáme indikátor bromkresolpurpur.

Diagnostická půda B (DAVIS, 1955, modifikace CCM) Složení: Pepton 0,5 g, yeast extract 0,3 g, glukóza 0,3 g, octan sodný 1g, tween 80 0,1 ml, roztok solí A ( K2HPO4 10 g, KH2PO4 10 g, destilovaná voda 100 ml) 0,5 ml, roztok solí B ( MgSO4. 7H2O 11,5 g, MnSO4. 4H2O 2,4 g, FeSO4. 7H2O 0,68 g, destilovaná voda 100 ml) 0,5 ml, bromkresolpurpur (BKP) (0,2 % roztok v 50 % ethanolu) 1 ml Příprava: Jednotlivé složky rozpustíme v uvedeném pořadí v destilované vodě, přidáme aminokyselinu (lysin, arginin, histidin, tryptofan, tyrozin, ornitin a fenylalanin) a upravíme pH na 6. Nakonec přidáme indikátor bromkresolpurpur. 50

Bromkresolpurpur 0,2 % roztok Složení: Bromkresolpurpur (BKP) 0,2 g, NaOH 0,05 mol/l 7,4 ml, ethanol 50 % doplnit do 100 ml Příprava: 0,2 g BKP rozetřeme v porcelánové misce, přidáme postupně 7,4 ml 0,05 mol/l NaOH, až se vytvoří homogenní suspenze, doplníme do 100 ml 50 % ethanolem.

Použité aminokyseliny pro zjištění dekarboxylázové aktivity L- lyzin (výrobce Sigma-Aldrich chemie, čistota min. 98 %) L- histidin (výrobce Sigma-Aldrich chemie, čistota min. 99 %) L- ornitin (výrobce Sigma-Aldrich chemie, čistota min. 98 %) L- fenylalanin (výrobce Sigma-Aldrich chemie, čistota min. 98 %) L-tyrosin (výrobce Sigma-Aldrich chemie, čistota min. 98 %) L- arginin (výrobce Sigma-Aldrich chemie, čistota min. 98 %) L- tryptofan (výrobce Sigma-Aldrich chemie, čistota min. 98 %)

Tabulka 11: Vizuální hodnocení barevných reakcí Barevná

Intenzita reakce

Aktivita dekarboxyláz

reakce

Hodnocení reakce

žlutá

bez reakce

dekarboxylázy jsou neaktivní

0

žlutavé

slabá reakce

nízká aktivita dekarboxyláz

1

slabě fialová

středně silná reakce

středně vysoká aktivita dekaboxyláz

2

sytě fialová

silná reakce

vysoká aktivita dekarboxyláz

3

fialová

Pro kultivaci bakterií bylo použito následující živné médium: PCA M agar (Plate Count agar with skimmed milk) na 1 litr média Použití: Ke stanovení mezofilních aerobních a fakultativně anaerobních mikroorganismů Složení: Trypton (5g), Yeast extract (2,5 g), glukoźa (1g), Sušené odstředěné mléko (1g), bakteriologický agar (12g). Příprava: 21,5 g dehydrovaného živného média se smíchá s destilovanou vodou. Potom se zahřívá k varu do úplného rozpuštění za častého míchání. Upraví se pH na 7 ± 0,2 při 25 °C a sterilizuje se 121 °C 15 minut.

51

4.1.2 Mikroorganismy testované na dekarboxylázovou aktivitu 4.1.2.1 Testované izoláty Escherichia coli Pro testování dekarboxylázové aktivity bylo použito 24 izolátů Escherichia coli (viz. tabulka 12) dodaných z Výzkumného ústavu pro chov skotu VUCHS Rapotín, získaných z mléka a sýrů. Dané izoláty byly rozočkovány na šikmý agar s živnou půdou (PCAM agar) a následně byly kultivovány 24 hod při 37 °C. Poté byly zaočkovány do tekuté diagnostické půdy A s testovanou aminokyselinou. Inkubace zkumavek probíhala při teplotě 30 a 37 °C (izoláty č. 12 - 25 pouze při 37 °C) po dobu 10 dnů, v jejichž průběhu byla kontrolována barevná reakce.

Tabulka 12: Izoláty bakterie Escherichia coli Izolát

Označení Původ

1 Ec 2 Ec 3 Ec 4 Ec 5 Ec 6 Ec 7 Ec 8 Ec 9 Ec 10 Ec 11 Ec 12 Ec 13 Ec 14 Ec 15 Ec 16 Ec 17 Ec 18 Ec 19 Ec 20 Ec 21 Ec 22 Ec 23 Ec 24 Ec

Ec 1 Ec 2 Ec 82 Ec 007 Ec 040 Ec 091 Ec 094 Ec 104 Ec 106 Ec 109 Ec 139 Ec 164 Ec 171 Ec 185 Ec 272 Ec 315 Ec 320 Ec 341 Ec 345 Ec 360 Ec 371 Ec 384 Ec 395 Ec 349

Syrové kravské mléko - bazén Malonty 17.4.2008 Syrové kravské mléko - bazén Malonty 17.4.2008 Syrové kravské mléko - individuální vzorek Jedlí 22.4.2008 Syrové kozí mléko Syrové kozí mléko Syrové kozí mléko Syrové kozí mléko Syrové kravské mléko Syrové kravské mléko Syrové kravské mléko Syrové kravské mléko Kozí sýr - tržní síť, kozí farma Březí Kozí sýr - tržní síť, Král sýrů kozí, Polsko Kozí sýr Kozí sýr Syrové ovčí mléko Ovčí sýr Ovčí sýr Syrové ovčí mléko Syrové ovčí mléko Syrové ovčí mléko Ovčí sýr – tržní síť, Hypernova SR, dod. Regia Logistik Ovčí sýr – tržní síť, Tesco Brno Mléko bazén - Květná II 2009

52

4.1.2.2 Testované izoláty Bacillus licheniformis Pro testování dekarboxylázové aktivity bylo použito 20 izolátů Bacillus licheniformis (viz. tabulka 13) získaných z mléka a dodaných z VUCHS Rapotín. Dané izoláty byly rozočkovány na šikmý agar s živnou půdou (PCA M agar) a následně byly kultivovány 24 hod při 30 °C. Poté byly zaočkovány do tekuté diagnostické půdy A s testovanou aminokyselinou. Inkubace zkumavek probíhala při teplotě 6, 25, 30 a 37 °C po dobu 10 dnů, v jejichž průběhu byla kontrolována barevná reakce.

Tabulka 13: Izoláty bakterie Bacillus licheniformis Izolát 1Bl 2Bl 3Bl 4Bl 5Bl 6Bl 7Bl 8Bl 9Bl 10Bl 11Bl 12Bl 13Bl 14Bl 15Bl 16Bl 17Bl 18Bl 19Bl 20Bl

označení 296 299 300 306 311 313 314 315 316 318 320 326 327 334 335 346 353 354 355 374

Původ mléko mléko mléko mléko mléko mléko mléko mléko mléko mléko mléko mléko mléko mléko mléko mléko mléko mléko mléko mléko

Trnov kravín Rychlý Pavel Újezd dojírna I cisterna Bohemilk Bureš Jan Pisty Medvědice firma Klapý Brejcha Václav linka 2 linka 4 Přemysl Brodský Šedivec II kravín Dolní Sloupnice Opatovec cisterna 9 cisterna 2 Hostice II Hostice IV Ing Divišová Blažena Fa Chlumek

53

4.1.2.3 Testované izoláty rodu Bacillus Dále byly testovány 4 izoláty bakterií rodu Bacillus získané z mléka a dodané z VUCHS Rapotín. Dané izoláty byly rozočkovány na šikmý agar s živnou půdou (PCAM agar) a následně byly kultivovány 24 hod při 30 °C. Poté byly zaočkovány do tekuté diagnostické půdy A s testovanou aminokyselinou. Inkubace zkumavek probíhala při teplotě 6, 25, 30 a 37 °C po dobu 10 dnů, v jejichž průběhu byla kontrolována barevná reakce.

Tabulka 14: Izoláty rodu Bacillus Izolát 1B 2Bc 3Bc 4Bc

Označení 333 341 345 359

Původ mléko mléko mléko mléko

Rudoltice Zámecký vrch Pohora VKK dojírna Jílek Jan Martinec Jaroslav

Druh bakterie Bacillus sp. B. cereus B. cereus B. cereus

4.1.2.4 Testované izoláty rodu Lactobacillus Testováno bylo 13 izolátů bakterií rodu Lactobacillus získaných ze sýrů a dodaných z Výzkumného ústavu mlékárenského Tábor. Dané izoláty byly rozočkovány na šikmý agar s živnou půdou (PCA

M

a agar) a následně byly kultivovány 24 hod při 37 °C. Poté byly

zaočkovány do tekuté diagnostické půdy B s testovanou aminokyselinou. Inkubace zkumavek probíhala při teplotě 25, 30 a 37 °C po dobu 10 dnů, v jejichž průběhu byla kontrolována barevná reakce.

Tabulka 15: Izoláty rodu Lactobacillus Izolát 1L 2L 3L 4L 5L 6L 7L 8L 9L 10L 11L 12L 13L

Označení L16 L17(18/10) L17(29/9) L26-P1 10147-4 10147-5 10156-3A 10167-5 7271 4438 L19 10127-4 10127-9

původ vysokodohřívaný sýr vysokodohřívaný sýr vysokodohřívaný sýr vysokodohřívaný sýr nízkodohřívaný sýr nízkodohřívaný sýr měkký sýr nízkodohřívaný sýr sbírkový kmen sbírkový kmen vysokodohřívaný sýr měkký sýr měkký sýr

Druh bakterie Lactobacillus casei/paracasei Lactobacillus curvatus subsp.curvatus Lactobacillus curvatus subsp.curvatus Lactobacillus curvatus subsp.curvatus Lactobacillus curvatus subsp.curvatus Lactobacillus curvatus subsp.curvatus Lactobacillus curvatus subsp.curvatus Lactobacillus curvatus Lactobacillus curvatus Lactobacillus curvatus subsp.curvatus neidentifikováno Lactobacillus curvatus subsp.curvatus Lactobacillus curvatus subsp.curvatus 54

4.1.2.5 Testované izoláty rodu Enterococcus Pro testování dekarboxylázové aktivity bylo použito 9 izolátů bakterií rodu Enterococcus, izolovaných z kozího mléka a sýrů. Dané izoláty byly rozočkovány na šikmý agar s živnou půdou (PCA M agar) a následně byly kultivovány 24 hod při 37 °C. Poté byly zaočkovány do tekuté diagnostické půdy A s testovanou aminokyselinou. Inkubace zkumavek probíhala při teplotě 6, 25, 30 a 37 °C po dobu 10 dnů, v jejichž průběhu byla kontrolována barevná reakce.

Tabulka 16: Izoláty rodu Enterococcus Izolát 1En 2En 3En 4En 5En 6En 7En 8En 9En

Původ kozí mléko kozí mléko Kozí sýr Kozí sýr kozí mléko kozí mléko kozí mléko Kozí sýr Kozí sýr

Šošůvka Šošůvka Ratibořice Šošůvka Šošůvka Šošůvka Šošůvka Ratibořice Ratibořice

Druh bakterie Enterococcus faecium Enterococcus faecium Enterococcus sp. Enterococcus mundtii Enterococcus faecium Enterococcus faecium Enterococcus faecium Enterococcus durans Enterococcus durans

55

4.2 Kontaminující mikroorganismy v mléce a mléčných výrobcích, jejich produkce oxidu uhličitého a tvorba biogenních aminů Syrové kozí mléko (Farma dojných a kašmírských koz, Šošůvka) a syrové kravské mléko (ŠZP Žabčice) bylo na Ústavu technologie potravin pasterováno a z části byl vyroben tvaroh. Ve vzorcích kozího a kravského syrového mléka, pasterovaného mléka a v kravském a kozím tvarohu byly stanovoveny podle norem nebo doporučení tyto skupiny mikroorganismů: •

celkový počet mikroorganismů (ČSN ISO 6610 na PCA whit skimmet milk za 72 hodin při 37 ºC),

•

psychrotrofní mikroorganismy (ČSN ISO 6730 na PCA whit skimmet milk za 10 dní při 6,5 ºC),

•

koliformní mikroorganismy (ČSN ISO 5541/1 na VRBL za 24 hodin při 37 ºC),

•

enterekoky (COMPASS ENTEROCOCCUS AGAR za 24 hodin při 44 ºC),

•

kvasinky a plísně ( ČSN ISO 6611 na CHL za 120 hodin při 25 ºC). Dále byly kozí, kravské mléko a tvarohy inokulovány vybranými mikroorganismy

(Enterococcus faecium CCM 7250, Pseudomonas fluorescens CCM 2826, Proteus vulgaris CCM 4553, Enterobacter aerogenes CCM 2531, Escherichia coli CCM 2024, Geotrichum candidum CCM 8265). Čisté kultury mikrooganismů pro inokulaci vzorků byly pořízeny z České sbírky mikroorganismů (CCM). V průběhu jejich kultivace (3 dny) při teplotě 6, 25 a 30 °C byly podle norem nebo doporučení stanovovány jejich počty. Dále byla v průběhu jejich kultivace stanovována produkce oxidu uhličitého. A v zaočkovaném kozím a kravském tvarohu byly po 3 dnech kultivace stanoveny biogenní aminy.

4.2.1 Inokulace a kultivace mikroorganismů Lahvičky s 10 ml kozího nebo kravského pasterovaného mléka byly inokulovány bakteriemi Pseudomonas fluorescens (kravské mléko 1,12 . 107 KTJ/ml, kozí mléko 9,36 . 108 KTJ/ml), Enterococcus faecium (kravské mléko 5,5 . 107 KTJ/ml, kozí mléko 1,12 . 108 KTJ/ml), Enterobacter aerogenes (kravské mléko 5,14 . 106 KTJ/ml, kozí mléko 2,72 . 105 KTJ/ml), Escherichia coli (kravské mléko 2,23 . 107 KTJ/ml, kozí mléko 1,39 . 108 KTJ/ml), Proteus vulgaris (kravské mléko 4,03 . 108 KTJ/ml, kozí mléko 4, 62 . 108 KTJ/ml), Geotrichum candidum (kravské mléko 4,91 . 106 KTJ/ml, kozí mléko 4,54 . 104 KTJ/ml).

56

Lahvičky s 10 g kravského a kozího tvarohu byly inokulovány bakteriemi Pseudomonas fluorescens (kravský tvaroh 1,12 . 107 KTJ/ml, kozí tvaroh 9,36 . 108 KTJ/ml), Enterococcus faecium (kravský tvaroh 5,5 . 107 KTJ/ml, kozí tvaroh 1,12 . 108 KTJ/ml), Escherichia coli (kravský tvaroh 2,23 . 107 KTJ/ml, kozí tvaroh 1,39 . 108 KTJ/ml), Enterobacter aerogenes (kravský tvaroh 5,14 . 106 KTJ/ml, kozí tvaroh 2,72 . 105 KTJ/ml), Proteus vulgaris (kravský tvaroh 4,03 . 108 KTJ/ml, kozí tvaroh 4, 62 . 108 KTJ/ml), Geotrichum candidum (kravský tvaroh 4,91 . 106 KTJ/ml, kozí tvaroh 4,54 . 104 KTJ/ml). V průběhu jejich kultivace (3dny) při teplotě 6 °C, 25 °C a 30 °C byly podle norem nebo doporučení stanovovány jejich počty. Escherichia coli byla kultivována na VRBL (Biokar Diagnostic, France) 24 hodin při 37 ºC. Pseudomonas fluorescens na PCA with skimmet milk (Biokar Diagnostic, France) 72 hod při 30 ºC a Enterococcus faecium na COMPASS ENTEROCOCCUS AGAR (Biokar Diagnostic, France) 24 hodin při 44 ºC. Enterobacter aerogenes byl kultivován na VRBL (Biokar Diagnostic, France) 24 hodin při 37 ºC, Proteus vulgaris na PCA whith skimmet milk (Biokar Diagnostic, France) 72 hod při 30 ºC, Geotrichum candidum bylo kultivováno na Chloramphenicol glukose agar 120 hodin při 25 ºC). U kontrolních neinokulovaných vzorků mléka se stanovoval celkový počet mikroorganismů na PCA whith skimmet milk (Biokar Diagnostic, France) za 72 hod při 30 ºC. U kontrolních neinokulovaných vzorků tvarohu a mléka se stanovoval celkový počet mikroorganismů na PCA whit skimmet milk (Biokar Diagnostic, France) za 72 hod při 30 ºC.

Složení živných půd: PCA M agar (Plate Count agar with skimmed milk) na 1 litr média Použití: Ke stanovení mezofilních aerobních a fakultativně anaerobních mikroorganismů Složení: trypton (5 g), yeast extract (2,5 g), glukóza (1 g), sušené odstředěné mléko (1 g), bakteriologický agar (12 g). Výrobce: Biokar Diagnostic, Francie Příprava: 21,5 g dehydrovaného živného média se smíchá s destilovanou vodou. Potom se zahřívá k varu do úplného rozpuštění za častého míchání. Upraví se pH na 7 ± 0,2 při 25 °C a sterilizuje se při 121 °C 15 minut.

57

VRBL na 1 litr média Použití: Ke stanovení koliformních bakterií Složení: ppticky natrávené maso (7 g), kvasničný extrakt (3 g), laktóza (10 g), žlučové soli (1,5 g), NaCl (5 g), neutrální červeň (0,03 g), krystalová violeť (0,002 g), bakteriologický agar (12 g) Výrobce: Biokar Diagnostic, Francie Příprava: 38,5 g dehydrovaného živného média se smíchá s destilovanou vodou a ponechá několik minut stát, pak se směs důkladně promíchá a upraví se pH, aby jeho hodnota po uvaření činila 7,4 při 25 °C. Směs se přivede k varu za občasného míchání. Vaří se 2 minuty, pak se půda ihned ochladí ve vodní lázni na 45 °C. Půda se použije do 3 hodin od její přípravy.

Chloramphenicol glucose agar na 1 litr média Použití: Ke stanovení plísní a kvasinek Složení: kasničný extrakt (5 g), glukóza (20 g), chloramfenikol (0,1 g), bakteriologický agar (15 g) Výrobce: Biokar Diagnostic, Francie Příprava: Všechny složky se smíchají s dehydratovanou vodou a ponechají několik minut stát, pak se směs zahřívá k varu za častého míchání do úplného rozpuštění agaru. Upraví se pH na hodnotu 6,6 ± 0,2 a sterilizuje se při 121 °C 15 minut.

COMPASS ENTEROCOCCUS AGAR na 1 litr média Použití: Ke stanovení počtu enterokoků Složení: pepton (27,5 g), kvasniční extrakt (5 g), NaCl (5 g), tween 80 (1 g), x - glykosid (0,1 g), selektivní činidlo (0,3 g), bakteriologický agar (14 g) Výrobce: Biokar Diagnostic, Francie Příprava: 52,9 g dehydrovaného živného média se smíchá s destilovanou vodou. Potom se zahřívá k varu do úplného rozpuštění za častého míchání. Upraví se pH na 7,5 ± 0,2 při 25 °C a sterilizuje se při 121 °C 15 minut. 4.2.2 Stanovení produkce oxidu uhličitého Inokulované vzorky o objemu 10 ml (mléko) a 10 g (tvaroh) byly umístěny do sterilních sérovek a inkubovány za stanovených podmínek (6 ºC, 25 ºC, 30 ºC). Odběr plynu byl prováděn 58

po 24 hodinách po dobu 3 dnů přes pryžovou membránu jehlou s 2 ml stříkačkou. Poté byly stříkačky s odebraným vzorkem plynu zapíchnuty do označené pryžové zátky. Odebrané vzorky plynů byly analyzovány na plynovém chromatografeu (FIŠEROVÁ et al., 2001, 2008; PROKEŠ et al., 2006). Obsah oxidu uhličitého byl stanoven na plynovém chromatografu CHROM 5 s katharometrem

s 1,5

m

dlouhou

náplňovou

kolonou

plněnou

PORAPAKem

(PROKEŠ et. al., 2006).

4.2.3 Stanovení biogenních aminů (BA) Na konci doby inkubace byly odebrány vzorky kozího a kravského tvarohu pro stanovení biogenních aminů. Biogenní aminy byly stanoveny na kapalinovém chromatografu na Ústavu technologie potravin. Od každého vzorku bylo naváženo 10g (±1 mg) do 85 ml zkumavky, do niž bylo dále přidáno 0,5 ml vnitřního standardu (1,7- diaminoheptanu o koncentraci 1mg/ml) a vzorky byly extrahovány 2 minuty s 30 ml 0,1 M HCl. Vzniklá suspenze byla centrifugována po dobu 10 minut

při 4 °C a při 3000 otáčkách /min

(HETTICH Universal 32R, Hettich, Německo). Supernatan byl filtrován přes papírový filtr a pevný podíl byl opět extrahován. Spojené supernatany byly doplněny na 50 ml 0,1 M HCl. Z extraktu byl odebrán 1 ml do vialky ( ml) k němu bylo přidáno 0,5 ml nasyceného Na2CO3 a 1 ml derivatizačního činidla dansylchloridu (5-dimethylaminoheptanem-sulfonil chloridem, DCL), směs byla promíchávána 1 minutu (MS2 Minishaker IKA, IKA Šerme GmbH, Staufen, Německo). Derivatizace probíhala 1 hodinu při 40 °C. po té došlo k přidaní 0,250 ml roztoku NH3 a k promíchání vzniklé suspenze. NH3 zreagoval se zbytkem dansylchloridu, hydrofobní deriváty aminů byly pak následně extrahovány 3 krát 1 ml diethyletheru. Organická fáze byla odpařena do sucha dusíkem a vzniklý odparek byl rozpuštěn v 1 ml acetonitrilu (ACN). Roztok byl zfiltrován přes nylonový

membranový filtr 0,45 um a nastříknut na

chromatografickou kolonu. BA byly separovány pomocí kapalinové chromatografie HP 1100 (Agilent Technologies, Wilmington, USA) složeného z kvartérní pupy (G1311A), vakuového devateru (G1322A), autosampleru (G1313A) a UV/VIS detektoru s proměnou vlnovou délkou (G1314A). Separace po derivatizaci DCL byla provedena pomocí gradientové eluce H2O/ACN na koloně Zorbax Elipse XDB C18 s předkolonou Meta Gard ODS-2 při průtoku 0,8 ml/mim s použitím fotometrického UV/VIS detektoru při 245 nm. Byly stanoveny biogenní aminy: tyramin, histamin, fenylethylamin, kadaverin a polyaminy: putrescin, spermin a spermidin. 59

Q

5 VÝSLEDKY A DISKUZE 5.1 Dekarboxylázová aktivita mikroorganismů V experimentální části disertační práce byla stanovována dekarboxylázová aktivita mikroorganismů izolovaných z mléka a mléčných výrobků. K detekci dekarboxylázové aktivity mikroorgasnimů se mohou používat různé kvalitativní a kvantitativní metody. My jsme využili rychlou screeningovou metodu využívající ke stanovení tvorby biogenních aminů diferenciačního média obsahující příslušnou aminokyselinu a pH indikátor (MAIJALA, 1993; ACTIS et al., 1999; ROIG-SAGUÉS, 1997; BOVER-CID, HOLZAPFEL, 1999, cit. podle BUŇKOVÁ, 2010). Určitá nevýhoda těchto metod může být v omezení citlivosti detekce produkce biogenních aminů, která vede k protikladným výsledkům. Nezanedbatelná je přítomnost falešně pozitivních výsledků z důvodu tvorby jiných produktů s alkalickou reakcí a falešně negativních výsledků. Z těchto důvodů by měla být produkce biogenních aminů potvrzena analytickými kvantitativními metodami (ACTIS et al., 1999, cit. podle BUŇKOVÁ, 2010; KALHOTKA et al., 2011). Mezi nejběžnejší metody separace biogenních aminů patří vysokotlaká kapalinová chromatografie (HPLC), jak uvádí KOMPRDA (2004). Dále je využívána tenkovrstvá chromatografie (TLC), plynová chromatografie (GC) a iontově výměnná chromatografie za použití automatického analyzátoru aminokyselin (SILLA-SANTOS, 1996; KŘÍŘEK, KALAČ, 1998, cit. podle KALHOTKA, 2007). V poslední době se pro detekci bakterií produkujících biogenní využívají i metody molekulární biologie, zejména PCR, pomocí které lze s využitím specifických primerů rychle zachytit bakterie nesoucí příslušné geny zodpovědné za produkci dekarboxylačních enzymů (LANDETE et al., 2007, cit. podle BUŇKOVÁ, 2010). 5.1.1 Dekarboxylázová aktivita Escherichia coli Bakterie Escherichia coli jsou gramnegativní, fakultativně anaerobní, rovné tyčinky vyskytující se jednotlivě a ve dvojicích. Optimální teplota růstu je 37 °C. Vyskytují se jako normální flóra v koncové části střevního traktu teplokrevných zvířat (SEDLÁČEK, 2007). Biochemicky je to průměrně aktivní bakterie. Štěpí glukózu a laktózu za tvorby plynu, tvoří indol a neštěpí močovinu (ZAHRADNÍČEK, 2003). V průběhu 10 dnů byla u 24 izolátů Escherichia coli (viz. tabulka 12) testována dekarboxylázová aktivita při teplotě 30 a 37 °C (izoláty 12 - 25 pouze při 37 °C) po tuto dobu byla vždy po 24 hodinách hodnocena barevná reakce. Po 10 dnech inkubace byly zjištěny 60

následující výsledky. V grafu 1 je znázorněna dekarboxylace aminokyselin izoláty 1 - 11 Escherichia coli při teplotě 30 °C. Na základě barevných reakcí byla zjištěna dekarboxylace argininu u izolátu 3Ec a 7Ec, ornitinu u izolátu 1Ec a 3 - 11Ec, fenylalaninu u izolátů 1Ec, 3Ec, 6Ec, 7Ec, 8Ec, 10Ec a 11Ec. Dekarboxylace tyrozinu byla zjištěna u izolátu 1Ec a 3 11Ec a tryptofanu 1Ec a 3 - 8Ec, 10 a 11Ec. U lyzinu a histidinu nebyla dekarboxylázová aktivita zaznamenána. 2,5 1 Ec 2 Ec

Intenzita reakce

2

3 Ec 4 Ec

1,5

5 Ec 1

6 Ec 7 Ec

0,5

8 Ec 9 Ec

0 LYS

ARG

ORN

PHE

HIS

TYR

TRP

Aminokyseliny

10 Ec 11 Ec

Graf 1: Dekarboxylázová aktivita Escherichia coli při teplotě 30 °C 10. den kultivace V grafu 2 je znázorněna dekarboxylace aminokyselin všech 24 izolovaných izolátů E. coli při teplotě 37 °C. Optimální teplota růstu E. coli je 37 °C (SEDLÁČEK, 2007) a při této teplotě je v grafu 2 znázorněna silná intenzita dekarboxylace aminokyseliny Orn, Fea, Tyr, Try některými kmeny E. coli. Dekarboxylázová aktivita pro arginin byla zjištěna jen u izolátu 3Ec a 7Ec. Ornitin byl dekarboxylován všemi kmeny kromě 2Ec a 14Ec. Z ornitinu pomocí enzymu ornitindekarboxylázy může vznikat putrescin, který naměřili i GREIF, GREIFOVÁ (2004). Nejvyšší koncentrace putrescinu produkovaného E. coli naměřili také při teplotě 37 °C. Fenylalanin byl dekarboxylován izoláty 7Ec, 12Ec, 13Ec, 15Ec, 16Ec a 19 – 24Ec. Dekarboxylázová aktivita u histidinu byla zjištěna jen u izolátu 9Ec. Tyrozin byl dekarboxylován všemi izoláty kromě 5Ec, 13Ec, 14Ec a tryptofan byl dekarboxylován všemi izoláty kromě 1Ec, 2Ec, 9Ec, 10Ec a 14Ec. Produkce tyrozindekarboxylázy bakterií Escherichia coli zjistila SILLA SANTOS (1996). U lyzinu nebyla dekarboxylázová aktivita námi testovanými kmeny zaznamenána. Naměřené výsledky, které uvádí GREIF, GREIFOVÁ (2004), ale ukázaly produkci enzymu lyzindekarboxylázy, jenž by měla 61

dekarboxylovat lyzin na kadaverin. Maximální koncentrace kadaverinu při teplotě 37 °C byla zaznamenána již po 16 hodinách. Dle KALAČE, KŘÍŽKA (2002, 2004) je schopnost dekarboxylovat danou aminokyselinu rozdílná. V rámci jednoho druhu mohou existovat desítky kmenů, které se mohou v této vlastnosti velmi výrazně lišit. 3,5 3

Intenzita reakce

2,5 2 1,5 1 0,5 0 LYS

ARG

ORN

PHE

HIS

TYR

TRP

Aminokyseliny

1Ec 2 Ec 3 Ec 4 Ec 5 Ec 6 Ec 7 Ec 8 Ec 9 Ec 10 Ec 11 Ec 12 Ec 13 Ec 14 Ec 15 Ec 16 Ec 17 Ec 18 Ec 19 Ec 20 Ec 21 Ec 22 Ec 23 Ec 24 Ec

Graf 2: Dekarboxylázová aktivita Escherichia coli při teplotě 37 °C 10. den kultivace

62

Tab 17: Bakterie Escherichia coli s dekarboxylázovou aktivitou Izolát 1 Ec 2 Ec 3 Ec 4 Ec 5 Ec 6 Ec 7 Ec 8 Ec 9 Ec 10 Ec 11 Ec 12 Ec 13 Ec 14 Ec 15 Ec 16 Ec 17 Ec 18 Ec 19 Ec 20 Ec 21 Ec 22 Ec 23 Ec 24 Ec

Původ Syrové kravské mléko Syrové kravské mléko Syrové kravské mléko Syrové kozí mléko Syrové kozí mléko Syrové kozí mléko Syrové kozí mléko Syrové kravské mléko Syrové kravské mléko Syrové kravské mléko Syrové kravské mléko Kozí sýr Kozí sýr Kozí sýr Kozí sýr Syrové ovčí mléko Ovčí sýr Ovčí sýr Syrové ovčí mléko Syrové ovčí mléko Syrové ovčí mléko Ovčí sýr Ovčí sýr Mléko bazén

Aktivita Identifikace ldc adc E. coli E. coli E. coli + E. coli E. coli E. coli E. coli + E. coli E. coli E. coli E. coli E. coli E. coli E. coli E. coli E. coli E. coli E. coli E. coli E. coli E. coli E. coli E. coli E. coli -

odc fdc hdc tdc trdc + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

+ pozitivní dekarboxylázová aktivita, - negativní dekarboxylázová aktivita

ldc - lyzindekarboxyláza, adc - arginindekarboxyláza, odc - ornitindekarboxyláza, fdc - fenyalanindekarboxyláza, hdc - histidindekarboxyláza, tdc - tyrozindekarboxyláza, trdc - tryptofandekarboxyláza V tabulce 17 je znázorněna námi zjištěná celková dekarboxylázová aktivita pro daný izolát E. coli. Z tabulky lze vidět, že u všech izolátů, které jsme testovali byla zaznamenána dekarboxylázová aktivita pro nějakou aminokyselinu. Většina izolátů dekarboxylovala 2 - 3 aminokyseliny. Pouze izolát 14Ec a 17Ec dekarboxyloval jen jednu aminokyselinu. Tryptofan dekarboxylovalo 21 izolátů, tyrozin a ornitin 22 izolátů, fenylalnin 17 izolátů, arginin 2 kmeny a histidin dekarboxyloval jen 1 izolát. V dalších grafech 3 - 10 je znázorněna intenzita dekarboxylace ornitinu, tyrozinu, tryptofanu a fenylalaninu v průběhu 10 dnů při teplotě 37 °C 63

1 Ec 2 Ec 3 Ec 3

4 Ec 5 Ec

2,5

12 Ec 11 Ec 10 Ec 9 Ec 8 Ec 7 Ec Izoláty 6 Ec 5 Ec 4 Ec 3 Ec 2 Ec 1 Ec

1,5 1 0,5

Intenzita reakce

2

6 Ec 7 Ec 8 Ec 9 Ec 10 Ec 11 Ec 12 Ec

0 8 9 10 5 6 7 4 3 1 2 Dny

Graf 3: Dekarboxylace ornitinu izoláty Escherichia coli (1 - 12Ec) v průběhu 10 dnů při teplotě 37 °C

13 Ec 14 Ec 15 Ec 16 Ec

3

17 Ec 2,5

24 Ec 23 Ec 22 Ec 21 Ec 20 Ec 19 Ec Izoláty 18 Ec 17 Ec 16 Ec 15 Ec 14 Ec 13 Ec

1,5 1 0,5

Intenzita reakce

2

18 Ec 19 Ec 20 Ec 21 Ec 22 Ec 23 Ec 24 Ec

0 1

2

3

4

5 6

10 7 8 9

Dny

Graf 4: Dekarboxylace ornitinu izoláty Escherichia coli (12 - 24Ec) v průběhu 10 dnů při teplotě 37 °C 64

V grafech 3 - 4 je znázorněna dekarboxylace ornitinu v průběhu 10 dnů. První pozitivní reakce u některých izolátů byly zjištěny již po 24 hodinách kultivace a s dobou kultivace se intenzita reakcí zvyšovala. Ornitin z 24 izolátů dekarboxylovalo 20 izolátů. Od 7. dne byla u většiny izolátů zaznamenána silná pozitivní reakce pro ornitin.

1 Ec 2 Ec 3 Ec 4 Ec

3

5 Ec 2,5

12 Ec 11 Ec 10 Ec 9 Ec 8 Ec 7 Ec Izoláty 6 Ec 5 Ec 4 Ec 3 Ec 2 Ec 1 Ec

1,5 1 0,5

Intenzita reakce

2

6 Ec 7 Ec 8 Ec 9 Ec 10 Ec 11 Ec 12 Ec

0 8 9 10 5 6 7 4 3 1 2 Dny

Graf 5: Dekarboxylace tyrozinu izoláty Escherichia coli (1 - 12Ec) v průběhu 10 dnů při teplotě 37 °C V grafech 5 - 6 je znázorněna dekarboxylace tyrozinu v průběhu 10 dnů při teplotě 37 °C. Tyto reakce neprobíhaly s takovou intenzitou jako dekarboxylace ornitinu. Po 48 hodinách byla slabá reakce zaznamenána jen u 9 izolátů a postupně se počet kmenů dekarboxylující tyrozin zvyšoval. Od 7. dne byla u většiny izolátů zjištěna dekarboxylace tyrozinu, kromě izolátů 13Ec, 14Ec a 17Ec, u kterých dekarboxylace neproběhla vůbec.

65

13 Ec 14 Ec 3

15 Ec 16 Ec

2 24 Ec 23 Ec 22 Ec 21 Ec 20 Ec 19 Ec Ec Izoláty 18 17 Ec 16 Ec 15 Ec 14 Ec 13 Ec

1,5 1

Intenzita reakce

2,5

17 Ec 18 Ec 19 Ec 20 Ec 21 Ec 22 Ec

0,5

23 Ec

0

24 Ec

9 10 5 6 7 8 1 2 3 4

Dny

Graf 6: Dekarboxylace tyrozinu izoláty Escherichia coli (12 - 24Ec) v průběhu 10 dnů při teplotě 37 °C

1 Ec 2 Ec 3 Ec

3

4 Ec

2 1,5 1

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

12 Ec 11 Ec 10 Ec 9 Ec 8 Ec 7 Ec Izoláty 6 Ec 5 Ec 4 Ec 3 Ec 2 Ec 1 Ec

Intenzita reakce

2,5

5 Ec 6 Ec 7 Ec 8 Ec 9 Ec

0,5

10 Ec

0

11 Ec 12 Ec

Dny

Graf 7: Dekarboxylace tryptofanu izoláty Escherichia coli (1 - 12Ec) v průběhu 10 dnů při teplotě 37 °C

66

V grafech 7 - 8 je znázorněna dekarboxylace tryptofanu v průběhu 10 dnů při teplotě 37 °C. Tyto reakce měly podobný průběh jako u dekarboxylace tyrozinu. Po 48 hodinách byla slabá a střední reakce zjištěna jen u 5 izolátů, postupně se počet izolátů a intenzita reakce zvyšovali. Od 5. dne byla u většiny izolátů zjištěna dekarboxylace tryptofanu, kromě izolátů 1, 2, 5, 9, 10Ec a 14Ec u kterých dekarboxylázová aktvita nebyla zjištěna vůbec.

13 Ec 14 Ec 15 Ec

3

16 Ec

2 24 Ec 23 Ec 22 Ec 21 Ec 20 Ec 19 Ec Izoláty 18 Ec 17 Ec 16 Ec 15 Ec 14 Ec 13 Ec

1,5 1 0,5 0

Intenzita reakce

2,5

17 Ec 18 Ec 19 Ec 20 Ec 21 Ec 22 Ec 23 Ec 24 Ec

9 10 5 6 7 8 4 3 2 1 Dny

Graf 8: Dekarboxylace tryptofanu izoláty Escherichia coli (12 - 24Ec) v průběhu 10 dnů při teplotě 37 °C V grafech 9 - 10 je znázorněna dekarboxylace fenylalaninu v průběhu 10 dnů při teplotě 37 °C. Průběh dekarboxylace zde byl nejslabší. První 2 dny nedekarboxyloval fenylalanin ani jeden izolát. Po třech dnech jen 1 izolát (19Ec) a po 4 a 5 dnech dekarboxylovaly FEA jen 2 izoláty (13Ec a 19Ec). Z 24 izolátů byla zaznamenána barevná reakce u 14 izolátů.

67

1 Ec 2 Ec 3 Ec

1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0

4 Ec Intenzita reakce

12 Ec 11 Ec 10 Ec 9 Ec 8 Ec 7 Ec Izoláty 6 Ec 5 Ec 4 Ec 3 Ec 2 Ec 1 Ec

2

5 Ec 6 Ec 7 Ec 8 Ec 9 Ec 10 Ec 11 Ec 12 Ec

9 10 5 6 7 8 4 3 2 1 Dny

Graf 9: Dekarboxylace fenylalaninu izoláty Escherichia coli (1 - 12Ec) v průběhu 10 dnů při teplotě 37 °C

13 Ec 14 Ec 3

15 Ec 16 Ec

2 24 Ec 23 Ec 22 Ec 21 Ec 20 Ec 19 Ec Izoláty 18 Ec 17 Ec 16 Ec 15 Ec 14 Ec 13 Ec

1,5 1

9 10 5 6 7 8 1 2 3 4 Dny

Intenzita reakce

2,5

17 Ec 18 Ec 19 Ec 20 Ec 21 Ec

0,5

22 Ec

0

23 Ec 24 Ec

Graf 10: Dekarboxylace fenylalaninu izoláty Escherichia coli (12 - 24Ec) v průběhu 10 dnů při teplotě 37 °C

68

5.1.2 Dekarboxylázová aktivita Bacillus licheniformis Bacillus licheniformis patří mezi kvantitativně významné zástupce termorezistentních mikroorganismů v mléce a mléčných výrobcích (NĚMEČKOVÁ et al., 2006, cit. podle NĚMEČKOVÁ et al., 2010). Jsou to fakultativně anaerobní, pohyblivé tyčinky, vyskytující se jednotlivě v párech nebo řetízcích. Teplota růstu se pohybuje v rozmezí od 15 do 50 - 55 °C. Optimální pH růstu je mezi 5,7 až 6,8. Roste i při 7 % NaCl. Kataláza pozitivní, oxidáza variabilní. Citrát a propionát jsou využívány jako zdroje uhlíku pro většinu kmenů (LOGAN, DE VOS, 2009). B. licheniformis patří mezi bacily s menší proteolytickou aktivitou (KALHOTKA et al., 2011). V průběhu 10 dnů při teplotách 6, 25, 30 a 37 °C bylo testováno 20 izolátů Bacillus licheniformis získaných z mléka (viz. tabulka 13). V Grafu 11 a 12 je znázorněna dekarboxylace aminokyselin všech 20 izolátů Bacillus licheniformis při teplotě 25, 30 a 37 °C. Kultivací při 6 °C nebyla zjištěna dekarboxylázová aktivita ani u jednoho kmene. NĚMEČKOVÁ et al. (2010) zjistili, že B. licheniformis při 6 °C neroste a tedy riziko kažení mléčných výrobků při této teplotě prakticky nepředstavuje. Při teplotě 25 °C byla zjištěna dekarboxylace tyrozinu izoláty 1 - 13Bl. Při teplotě 37 °C byla dekarboxylace argininu zjištěna jen u izolátu 8Bl, ornitin byl dekarboxylován izolátem 1, 8, 13 a 19Bl. FEA byl dekarboxylován izolátem 2Bl a 13Bl a tyrozin byl dekarboxylován všemi izoláty kromě 17Bl. 17Bl, který nedekarboxyloval žádnou aminokyselinu. U histidinu nebyla dekarboxylázová aktivita zjištěna. Z výsledků je zřejmé, že dekarboxylázová aktivita rostla přímo úměrně s růstem teploty kultivace. V modelovém případu při skladování trvanlivého polotučného mléka ve 4 °C nebyla u B. licheniformis zaznamenána proteolýza, při skladování při teplotě 24 °C byl po třech týdnech zjištěn pokles obsahu bílkovin a zvýšení množství volného tyrosinu (JANŠTOVÁ et al., 2004). Zvětšující se počet kmenů B. licheniformis vykazující dekarboxylázovou aktivitu tedy odpovídá teplotním nárokům. Protože B. licheniformis lyzin ani ornithin nedekarboxyluje (LOGAN, DE VOS, 2009) může se v případech, kdy byla u těchto aminokyselin zaznamenána pozitivní reakce jednat o reakce falešně pozitivní, které se mohou někdy vyskytnout (BOVER-CID, HOLZAPFEL, 1999). Ve většině námi zjištěných případů šlo o slabé reakce.

69

3,5 1Bl

Intenzita reakce

3

2Bl

2,5

3Bl

2

4Bl

1,5

5Bl 6Bl

1

7Bl 0,5

8Bl

0

9Bl 30°C 37°C 30°C 37°C 30°C 37°C 30°C 37°C 30°C 37°C 25°C 30°C 37°C 30°C 37°C LYS

ARG

ORN

PHE

HIS

TYR

10Bl

TRP

Graf 11: Dekarboxylázová aktivita izoláty Bacillus licheniformis (1 - 10Bl) při teplotě 25,30, 37 °C 10. den kultivace

3,5 11Bl

Intenzita reakce

3

12Bl

2,5

13Bl

2

14Bl

1,5

15Bl 16Bl

1

17Bl 0,5

18Bl

0

19Bl 30°C 37°C 30°C 37°C 30°C 37°C 30°C 37°C 30°C 37°C 25°C 30°C 37°C 30°C 37°C LYS

ARG

ORN

PHE

HIS

TYR

20Bl

TRP

Graf 12: Dekarboxylázová aktivita izoláty Bacillus licheniformis (11 - 20Bl) při teplotě 25,30, 37 °C 10. den kultivace

70

Tabulka 18: Bakterie Bacillus licheniformis s dekarboxylázovou aktivitou Izolát 1Bl 2Bl 3Bl 4Bl 5Bl 6Bl 7Bl 8Bl 9Bl 10Bl 11Bl 12Bl 13Bl 14Bl 15Bl 16Bl 17Bl 18Bl 19Bl 20Bl

Původ mléko mléko mléko mléko mléko mléko mléko mléko mléko mléko mléko mléko mléko mléko mléko mléko mléko mléko mléko mléko

identifikace B.licheniformis. B. licheniformis B. licheniformis B. licheniformis B. licheniformis B. licheniformis B. licheniformis B. licheniformis B. licheniformis B. licheniformis B. licheniformis B. licheniformis B.licheniforsmis B. licheniforsmis B. licheniformis B. licheniformis B. licheniformis B. licheniformis B. licheniformis B. licheniformis

Aktivita ldc adc + + - -

odc + + + + + + + -

fdc + + + + + -

hdc -

tdc + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

trdc + + + + + +

+ pozitivní dekarboxylázová aktivita, - negativní dekarboxylázová aktivita

V tabulce 18 je znázorněna námi zjištěná celková dekarboxylázová aktivita pro daný izolát B. licheniformis. Z tabulky lze vidět, že u všech izolátů, které jsme testovali byla zaznamenána dekarboxylázová aktivita (až na 14 Bl). Většina izolátů, tedy až na izolát 14Bl, dekarboxylovala tyrozin. Sedm z 20 izolátů dekarboxylovalo více než 1 aminokyselinu, 7 izolátů dekarboxylovalo ornitin, 6 izolátů tryptofan, 5 izolátů fenylalanin a 1 izolát lyzin a arginin.

71

3,5

Intenzita reakce

3 2,5

6 °C

2

25 °C

1,5

30 °C 37 °C

1 0,5

1B l 2B l 3B l 4B l 5B l 6B l 7B l 8B l 9B l 10 B l 11 B l 12 B l 13 B l 14 B l 15 B l 16 B l 17 B l 18 B l 19 B l 20 B l

0

Izoláty

Graf 13: Dekarboxylázová aktivita pro tyrozin izoláty Bacillus licheniformis při teplotě 6, 25, 30 a 37 °C 10.den kultivace V grafu 13 je znázorněna intenzita dekarboxylace tyrozinu 10. den kultivace při teplotě 6, 25, 30 a 37 °C. Z grafu je zřejmé, že dekarboxylace tyrozinu rostla se zvyšující se teplotou kultivace. Při 6 °C nebyla zjištěna žádná dekarboxylace aminokyselin. Při teplotě 25 °C dekarboxylovalo tyrozin prvních 13 izolátů. Při teplotě 30 °C byla dekarboxylace tyrozinu zjištěna u všech izoláty kromě izolátu 17Bl. A při teplotě 37 °C dekarboxylovaly tyrozin všechny kmeny. V grafech 14 - 15 je znázorněna dekarboxylace tyrozinu v průběhu 10 dnů při teplotě 25 °C. První pozitivní reakce u některých izolátů byly zjištěny až po 3 dnech kultivace. U žádného z izolátů nebyla zjištěna silná intenzita dekarboxylace tyrozinu. Tyrozin dekarboxylovalo prvních 13 izolátů.

72

1Bl 2Bl

2,5 2 1,5

10Bl 9Bl 8Bl 7Bl 6Bl Izoláty 5Bl 4Bl 3Bl 2Bl 1Bl

1 0,5

Intenzita reakce

3Bl 4Bl 5Bl 6Bl 7Bl 8Bl 9Bl 10Bl

0

7 8 9 10 4 5 6 3 2 1 Dny

Graf 14: Dekarboxylace tyrozinu izoláty Bacillus licheniformis (1 - 10Bl) v průběhu 10 dnů při teplotě 25 °C

11Bl 12Bl

1,4

13Bl

1,2

14Bl

1

20Bl 19Bl 18Bl 17Bl 16Bl Izoláty 15Bl 14Bl 13Bl 12Bl 11Bl

0,8 0,6 0,4

7 8 9 10 4 5 6 1 2 3 Dny

Intenzita reakce

1,6

15Bl 16Bl 17Bl 18Bl

0,2

19Bl

0

20Bl

Graf 15: Dekarboxylace tyrozinu izoláty Bacillus licheniformis (11 - 20Bl) v průběhu 10 dnů při teplotě 25 °C

73

1Bl 2Bl 2

3Bl Intenzita reakce

4Bl 1,5

10Bl 9Bl 8Bl 7Bl 6Bl Izoláty 5Bl 4Bl 3Bl 2Bl 1Bl

1 0,5

5Bl 6Bl 7Bl 8Bl 9Bl 10Bl

0

9 10 5 6 7 8 4 3 1 2 Dny

Graf 16: Dekarboxylace tyrozinu izoláty Bacillus licheniformis (1 - 10Bl) v průběhu 10 dnů při teplotě 30 °C

11Bl 12Bl 13Bl

2,5

14Bl

2

20Bl 19Bl 18Bl 17Bl 16Bl Izoláty 15Bl 14Bl 13Bl 12Bl 11Bl

1,5 1 0,5 0

Intenzita reakce

3

15Bl 16Bl 17Bl 18Bl 19Bl 20Bl

9 10 5 6 7 8 1 2 3 4

Dny

Graf 17: Dekarboxylace tyrozinu izoláty Bacillus licheniformis (11 - 20Bl) v průběhu 10 dnů při teplotě 30 °C V grafech 16 - 17 je znázorněna dekarboxylace tyrozinu v průběhu 10 dnů při teplotě 30 °C. U izolátů 17Bl a 19Bl nebyla zjištěna dekarboxylace tyrozinu vůbec. U ostatních izolátů byla zjištěna dekarboxylace postupně od 2. dne. Intenzita dekarboxylace byla podobná jako při teplotě 25 °C. 74

1Bl 2Bl

3

2 10Bl 9Bl 8Bl 7Bl 6Bl Izoláty 5Bl 4Bl 3Bl 2Bl 1Bl

1,5 1 0,5

Intenzita reakce

3Bl 2,5

4Bl 5Bl 6Bl 7Bl 8Bl 9Bl

0

10Bl

8 9 10 4 5 6 7 1 2 3 Dny

Graf 18: Dekarboxylace tyrozinu izoláty Bacillus licheniformis (1 - 10Bl) v průběhu 10 dnů při teplotě 37 °C

11Bl 12Bl 13Bl

2,5

14Bl

2

20Bl 19Bl 18Bl 17Bl 16Bl Izoláty 15Bl 14Bl 13Bl 12Bl 11Bl

1,5 1 0,5 0

Intenzita reakce

3

15Bl 16Bl 17Bl 18Bl 19Bl 20Bl

9 10 5 6 7 8 1 2 3 4 Dny

Graf 19: Dekarboxylace tyrozinu izoláty Bacillus licheniformis (11 - 20Bl) v průběhu 10 dnů při teplotě 37 °C V grafech 18 - 19 je znázorněna dekarboxylace tyrozinu v průběhu 10 dnů při teplotě 37 °C. Při této teplotě byla intenzita reakce největší a s dobou kultivace se zvyšovala. První pozitivní reakce byly u některých izolátů zjištěny už po 48 hodinách kultivace 9. den kultivace byla zjištěna dekarboxylace už u všech izolátů. Z výše uvedených výsledků 75

vyplývá, že izoláty bakterie Bacillus licheniformis, pocházející z mléka by se mohly za vhodných podmínek podílet na tvorbě biogenních aminů, převážně na tvorbě tyraminu.

5.1.3 Dekarboxylázová aktivita dalších bakterií rodu Bacillus Kromě B. licheniformis byl z mléka izolován také B. cereus (3 izoláty) a jeden izolát Bacillus sp. Zástupci rodu Bacillus jsou grampozitivní, fakultativně anaerobní, pohyblivé, sporulující tyčinky s optimální teplotou růstu kolem 37 °C (DE VOS et al., 2009). Bakterie tohoto rodu nesnášejí nižší pH a jsou schopny tvořit vysoce rezistentní spory schopné přežít pasterační záhřev. V rámci rodu vykazují značnou diverzitu fyziologických vlastností a vynikající schopnost adaptovat se svým enzymovým vybavením na podmínky prostředí (GÖRNER, VALÍK, 2004; FARRAR, REBOLI, 2006, cit. podle NĚMEČKOVÁ et al., 2010). Nejsilněji proteolytické kmeny patří k druhům B. subtilis, B. cereus, B. polymyxa, B. amyloliquefaciens (DE JONGHE et al., 2010). Množství a poměr jednotlivých enzymů se kmen od kmene liší. Proto mezi počtem sporotvorných aerobních bakterií a rizikem kažení neexistuje významná korelace. Pokud jsou enzymy v mléce jednou vytvořeny, je obtížné jejich aktivitu zcela zastavit, neboť jsou relativně rezistentní vůči záhřevu. Bacilární proteázy vykazují nižší tepelnou stabilitu než lipázy, přesto si po záhřevu 72 °C/2 min zachovávají 50 % původní aktivity (CHEN et al., 2004, cit. podle NĚMEČKOVÁ et al., 2010). V průběhu 10 dnů byly při teplotách 6, 25, 30 a 37 °C testovány 4 izoláty rodu Bacillus (3 izoláty B. cereus a 1 izolát Bacillus sp.) získaných z mléka. Po 10 dnech (viz. graf 20) byla zjištěna pozitivní reakce pro tyrozin při teplotě 25, 30 a 37 °C. Dále lyzin byl dekarboxylován kmeny 2Bc a 3Bc při teplotě 25 °C, ornitin byl dekarboxylován při teplotě 25 °C všemi izoláty a při teplotě 30 °C izoláty 1B a 4Bc. Fenylalanin byl dekarboxylován jen při 30 °C izolátem 3Bc. Tryptofan byl dekarboxylován jen izolátem 3Bc při teplotě 37 °C. U argininu a histidinu nebyla zjištěna žádná pozitivní reakce u žádné z kultivačních teplot.Při teplotě 6 °C nebyla žádná aminokyselina dekarboxylována. Podle NĚMEČKOVÉ et al. (2010) je Bacillus cereus schopen růst i při relativně nízkých teplotách (okolo 12 °C) a tvořit proteolytické a lypolitické enzymy. Avšak i oni nezaznamenali růst B. cereus při teplotě 6 °C.

76

3

Intenzita reakce

2,5 2

1B 2Bc

1,5

3Bc 4Bc

1 0,5 0 25 30 °C °C LYS

37 °C

25 30 °C °C ARG

37 25 °C °C

30 37 °C °C ORN

25 °C

30 37 °C °C PHE

25 30 °C °C

37 25 °C °C

HIS

30 °C

37 25 °C °C

TYR

30 37 °C °C TRP

Graf 20: Dekarboxylázová aktivita izoláty rodu Bacillus při teplotě 25,30, 37 °C 10. den kultivace

Tabulka 19: Izolát rodu Bacillus s dekarboxylázovou aktivitou Izolát 1B 2Bc 3Bc 4Bc

Původ mléko mléko mléko mléko

Aktivita Identifikace ldc adc B. sp. B. cereus + B. cereus + B. cereus -

odc fdc hdc tdc trdc + + + + + + + + + -

+ pozitivní dekarboxylázová aktivita, - negativní dekarboxylázová aktivita

V tabulce 19 je znázorněna námi zjištěná celková dekarboxylázová aktivita pro daný kmen. Zde je vidět, že u izolátu 1B (Bacillus sp.) byla prokázána činnost ornitina tyrozindekarboxylázy. U kmenu 2Bc (Bacillus cereus) byla prokázána činnost lyzin-, ornitin- a tyrozindekarboxylázy. U kmenu 3Bc (Bacillus cereus) byla prokázána činnost lyzin-, ornitin-, tyrozin- a tryptofandekarboxylázy. U kmenu 3Bc (Bacillus cereus) byla prokázána činnost ornitin- a tyrozindekarboxylázy.

77

1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0

4Bc 3Bc 2Bc 1B

8

7

6

5

4

3

2

1

Intenzita reakce

2 1,8

1B 2Bc 3Bc 4Bc

9 10

Dny

Graf 21: Dekarboxylace tyrozinu izoláty rodu Bacillus v průběhu 10 dnů při teplotě 25 °C

V grafu 21 je znázorněna dekarboxylace tyrozinu v průběhu 10 dnů při teplotě 25 °C. První pozitivní reakce byla až po 6 dnech izolátem 1B a 2Bc a až po 9 dnech byla dekarboxylace tyrozinu zjištěna u všech izolátů. Pozitivní reakce při 25 °C byla slabá až středně silná.

2 1,5 1

Intenzita reakce

2,5

1B 2Bc 3Bc 4Bc

0,5 4Bc 3Bc 2Bc 1B

0 1

2

3

4

5

6

7

8

9 10

Dny

Graf 22: Dekarboxylace tyrozinu izoláty rodu Bacillus v průběhu 10 dnů při teplotě 30 °C

78

Graf 22 ukazuje dekarboxylaci tyrozinu izoláty rodu Bacillus v průběhu 10 dnů při teplotě 30 °C. První tři izoláty mají průběh reakce podobný jako při teplotě 25 °C. První pozitivní reakce nastala od 6 - 8 dne a intenzita reakce byla o půl stupně slabší než teploty 30 °C. Izolát 4Bc dekarboxyloval tyrozin už pátý den a desátého dne dosáhl o stupeň vyšší intenzitu reakce než při teplotě 25 °C

1,5 1 0,5 4Bc 3Bc 2Bc 1B

Intenzita reakce

2

1B 2Bc 3Bc 4Bc

0 1

2

3

4

5

6

7

8

9 10

Dny

Graf 23: Dekarboxylace tyrozinu izoláty rodu Bacillus v průběhu 10 dnů při teplotě 37 °C V grafu 23 je znázorněna dekarboxylace tyrozinu v průběhu 10 dnů při teplotě 37 °C. Ve srovnání s ostatními teplotami je dekarboxylace při teplotě 37 °C nejslabší. Desátý den dekarboxylace je u všech izolátů intenzita reakce slabá. Z grafů vyplývá, že největší intenzita dekarboxylace tyrozinu byla při teplotě 30 °C. Podobný výsledek zjistili i RODRIGUEZ-JEREZ et al. (1994), kteří testovali produkci histaminu bakterií Bacillus macerans izolovanou z italského sýra.

79

5.1.4 Dekarboxylázová aktivita izolátu rodu Lactobacillus Zástupci rodu Lactobacillus jsou fakultativně anaerobní anebo mikroaerofilní nepohyblivé tyčinkovité BMK (GÖRNER, VALÍK, 2004). Mohou se množit i v kultivačním prostředí s hodnotou pH 5. Jestli však pH poklesne pod 4, růst většiny laktobacilů se zastavuje. Neprodukují enzym katalázu, který katalyzuje rozklad peroxidu vodíku na kyslík a vodu (KLABAN, 2001). Jejich hlavním metabolitem fermentace je kyselina mléčná, ale i octová, etanol a CO2 (GÖRNER, VALÍK, 2004). V průběhu 10 dnů bylo při teplotách 25, 30 a 37 °C testováno 13 izolátů bakterie Lactobacillus (viz. tabulka 15) získaných ze sýrů. Po 10 dnech (graf 24) byla zjištěna pozitivní reakce na arginin, ornitin, tyrozin a lyzin. Lyzin byl slabě dekarboxylován izolátem 5L při teplotě 37 °C. Arginin byl dekarboxylován při všech teplotách kmenem 5L a 11L, ornitin byl dekarboxylován slabě izolátem 9L při teplotě 25 a 30 °C a tyrozin byl dekarboxylován jen při teplotě 37 °C izolátem 2L, 10L, 12L a 13L. U aminokyselin fenylalanin, histidin a tryptofan nebyla dekarboxylázová aktivita prokázána. 1L

3,5

2L Intenzita reakce

3

3L

2,5

4L

2

5L 6L

1,5

7L

1

8L

0,5

9L 10L

0 25°C 30°C 37°C 25°C 30°C 37°C 25°C 30°C 37°C 25°C 30°C 37°C 25°C 30°C 37°C 25°C 30°C 37°C 25°C 30°C 37°C LYS

ARG

ORN

PHE

HIS

TYR

TRP

Graf 24: Dekarboxylázová aktivita izolátů rodu Lactobacillus při teplotě 25, 30, 37 °C 10. den kultivace Bakterie Lactobacillus patří mezi bakterie mléčného kvašení, které jsou označovány jako hlavní producenti BA v sýrech (LINARES et al., 2012). Rod Lactobacillus je uváděn jako producent tyraminu v sýrech (KALAČ, GLÓRIA, 2009). Toto zjištění bývá obzvláště důležité, protože tyto izoláty patří ke druhům, které se používají jako starovací kultury pro výrobu sýrů (LINARES et al., 2012). Několik izolátů bakterie Lactobacillus brevis a Lactobacillus curvatus získaných ze sýrů byly určeny jako producenti histaminu, tyraminu a putrescinu (LINARES et al., 2012). To potvrdili i autoři STRAUB et al. (1994); ARENA et al. (2007); LADERO et al. (2011) citace podle LINARES (2012) kteří izolovali bakterii 80

11L 12L 13L

Lactobacillus ze zrajících sýrů, u níž byla prokázána produkce tyraminu a putrescinu. BURDYCHOVÁ, KOMPRDA (2007) izolovali bakterii Lactobacillus helveticus, která produkovala histamin. Autoři SUMMER et al. (1985); GARG a MITAL (1991); GIRAFFA et al. (1995) citace podle MARINO et al. (2000) zjistili, že bakterie Lactobacillus mohou produkovat vysoké koncentrace histaminu a tyraminu v sýrech, ale pouze pokud jsou přítomny v hustotách 107 KTJ/g. Tabulka 20: Izolát rodu Lactobacillus s dekarboxylázovou aktivitou Izolát

Druh bakterie

1L

Lactobacillus casei/paracasei Lactobacillus curvatus subsp.curvatus Lactobacillus curvatus subsp.curvatus Lactobacillus curvatus subsp.curvatus Lactobacillus curvatus subsp.curvatus Lactobacillus curvatus subsp.curvatus Lactobacillus curvatus subsp.curvatus Lactobacillus curvatus Lactobacillus curvatus Lactobacillus curvatus subsp.curvatus

2L 3L 4L 5L 6L 7L 8L 9L 10L 11L 12L 13L

neidentifikováno Lactobacillus curvatus subsp.curvatus Lactobacillus curvatus subsp.curvatus

Původ vysokodohřívaný sýr vysokodohřívaný sýr vysokodohřívaný sýr vysokodohřívaný sýr

aktivita ldc adc odc fdc hdc tdc trdc -

-

-

-

-

-

-

+

-

-

-

+

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

nízkodohřívaný sýr

+

+

-

-

-

-

-

nízkodohřívaný sýr

-

-

-

-

-

-

-

měkký sýr nízkodohřívaný sýr sbírkový kmen

-

-

+

-

-

-

-

sbírkový kmen vysokodohřívaný sýr

-

-

-

-

-

+

-

-

+

-

-

-

-

-

měkký sýr

-

-

-

-

-

+

-

měkký sýr

-

-

-

-

-

+

-

+ pozitivní dekarboxylázová aktivita, - negativní dekarboxylázová aktivita

V tabulce 20 je znázorněna námi zjištěná celková dekarboxylázová aktivita pro daný izolát. Z tabulky lze vidět, že u izolátu 1L, 3L, 4L, 6L, 7L a 8L nebyla zjištěna žádná dekarboxylázová aktivita. Mezi ně patří i bakterie Lactobacillus casei/paracasei, která podle LANDENTE et al. (2007) cit. podle BUŇKOVÁ et al. (2010) nepatří k obvyklým producentům biogenních aminů. Naše testované izoláty (4 ze 13 izolátů) tyrozin dekarboxylovaly jen slabě. U histidinu nebyla dekarboxylace zaznamenána. Lyzin byl dekarboxylován jen izolátem 5L (Lactobacillus curvatus subsp. curvatus). BUŇKOVÁ et al. 81

(2010) zjistili u 1 izolátu L. curvatus, který byl vyizolovaný z přírodních sýrů eidamského typu produkci kadaverinu. Tato produkce není obvykle popisována. U Lactobacillus curvatus (9L) byla zjištěna aktivita ornitindekarboxylázy. Nejsilnější intenzita reakce byla zaznamenána u argininu pro izoláty Lactobacillus curvatus. Dekarboxylací argininu vzniká nejdřívě agmatin, z kterého může dále ureohydrolázou být tvořený putrescin (GREIF, GREIFOVÁ, 2004). BUŇKOVÁ et al. (2010) izolovali 3 kmeny bakterie Lactobacillus curvatus z přírodních sýrů eidamského typu, které byly určeny jako výhradní producenti putrescinu. V grafu 25 je znázorněna dekarboxylace argininu v průběhu 10 dnů při teplotě 25 , 30 a 37 °C. Izolát 2L dekarboxyloval jen při teplotě 25 °C, první pozitivní reakce byla zaznamenána již 2. den a 4. den u něj byla zjištěna silná intenzita reakce. Izolát 5L dekarboxyloval aminokyseliny při všech teplotách. Nejrychlejší nárůst intenzity pozitivní reakce byl při teplotě 25 °C. S růstem teploty se ale nárůst intenzity reakce zpomaloval. Podobný nárůst měl izolát 11L při teplotě 25 a 30 °C. Při teplotě 37 °C byl nárůst intenzity dekarboxylace pozvolnější.

3

2 1,5 11L 37 °C 11L 30 °C 11L 25 °C 5L 37 °C 5L 30 °C 5L 25 °C 2L 25 °C

1 0,5 0 1

2L 25 °C Intenzita reakce

2,5

5L 25 °C 5L 30 °C 5L 37 °C 11L 25 °C 11L 30 °C 11L 37 °C

8 9 10 5 6 7 2 3 4 Dny

Graf 25 : Dekarboxylace argininu izoláty rodu Lactobacillus v průběhu 10 dnů při teplotě 25, 30 a 37 °C

82

5.1.5 Dekarboxylázová aktivita izolátů bakterií Enterococcus Enterokoky jsou grampozitivní, nesporulující, fakultativně anaerobní koky, které se vyskytují jednotlivě, v párech anebo v řetízcích (DUCKOVÁ et al., 2008). Enterokoky jsou schopny růst v bujónu v přítomnosti 6,5 % NaCl, při pH 9,6, 40 % žlučových kyselin a přežívají 30 minutový záhřev při 60 °C (GARDINI, 2001). Z potravinářského hlediska je z těchto kritérií významná značná odolnost vůči zvýšené koncentraci soli v potravinách a tím i nízkým hodnotám aw a skutečnost, že může přežívat nižší pasterační a termizační teploty (GÖRNER, VALÍK, 2004). V průběhu 10 dnů bylo při teplotách 6, 25, 30 a 37 °C testováno 9 izolátů bakterie Enterococcus (viz. tabulka 16) získaných z kozích sýrů a mléka. V Grafu 26 je zaznamenána dekarboxylace aminokyselin námi testovanými izoláty. Při teplotě 6 °C nebyla izoláty dekarboxylována žádná aminokyselina. Při teplotě 25, 30 a 37 °C byla zjištěna činnost tyrozindekarboxylázy (tdc) a arginindekarboxylázy (adc). Při teplotě 25 °C byl dekarboxylován arginin 5 izoláty z 9 (2, 3, 4, 5 a 7En) a tyrozin 4 izoláty z 9 (1, 3, 4 a 7En). Při teplotě 30 °C byl dekarboxylován arginin 5 izoláty z 9 (2, 3, 4, 5 a 7En) a tyrozin 4 izoláty z 9 (3, 4, 6, 7En). Při teplotě 37 °C byl dekarboxylován arginin 8 izoláty z 9 (všemi kromě 1En) a tyrozin 6 izoláty z 9 (1, 3, 4, 5, 8 a 9En). Aminokyseliny lysin, ornitin, fenylalanin, histidin a tryptofan nebyly dekarboxylovány enterokoky vůbec. 1En

2En

3En

4En

25 °C

30 °C

5En

6En

7En

8En

9En

3,5

Intenzita reakce

3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 25 °C

30 °C LYS

37 °C

25 °C

30 °C ARG

37 °C

25 °C

30 °C ORN

37 °C

25 °C

30 °C PHE

37 °C

HIS

37 °C

25 °C

30 °C TYR

37 °C

25 °C

30 °C TRP

Graf 26: Dekarboxylázová aktivita izoláty rodu Enterococcuss při teplotě 25, 30, 37 °C 10. den kultivace

83

37 °C

V tabulce 21 je znázorněna námi zjištěná celková dekarboxylázová aktivita pro daný kmen. Činnost tyrozindekarboxylázy byla zaznamenána u všech kmenů kromě izolátu 2En (Enterococcus faecium) a činnost arginindekarboxylázy byla zjištěna u všech izolátů. Tabulka 21: Izoláty rodu Enterococcus s dekarboxylázovou aktivitou Vzorek Druh bakterie Enterococcus faecium 1En Enterococcus faecium 2En Enterococcus spp. 3En Enterococcus mundtii 4En Enterococcus faecium 5En Enterococcus faecium 6En Enterococcus faecium 7En Enterococcus durans 8En Enterococcus durans 9En

Původ kozí mléko kozí mléko Kozí sýr

Aktivita ldc adc odc fdc hdc tdc trdc -

+

-

-

-

+

-

-

+ +

-

-

-

+

-

Kozí sýr kozí mléko kozí mléko kozí mléko

-

+

-

-

-

+

-

-

+

-

-

-

+

-

-

+

-

-

-

+

-

-

+

-

-

-

+

-

Kozí sýr

-

+

-

-

-

+

-

Kozí sýr

-

+

-

-

-

+

-

+ pozitivní dekarboxylázová aktivita, - negativní dekarboxylázová aktivita

Enterokoky jsou obecně považovány za producenty tyraminu, což se v našich testech prokázalo. Autoři SUZZI et al. (2000), GIRAFFA et al. (1995) a CELANO et al. (1992) cit. podle SCHIRONE et al. (2012) zjistili, že velká část enterokoků izolovaných ze sýrů dokáže produkovat tyramin, ale ne histamin. To potvrdili i KUČEROVÁ et al. (2009), kteří zaznamenali produkci tyrozindekarboxylázy (tdc). Pozitivní reakci na tyrozin mělo 20 kmenů ze 33 kmenů. Dále zjištovali i činnost histidindekarboxylázy, pozitivita vyšla u 3 izolátů ze 33, ale výsledky byly v průběhu dalších experimentů potvrzeny jako falešně pozitivní. I v našich testech nebyla dekarboxylace histidinu vůbec zaznamenána. Naopak arginin byl dekarboxylován nejintenzivněji. Celkově největší dekarboxylázová aktivita u bakterie Enterococcus byla zaznamenána u izolátů 3En (Enterococcus spp.) a 4En (Enterococcus mundtii) zvláště při 37 °C. V grafu 27 lze pozorovat po 2 dnech slabou intenzitu dekarboxylace argininu kmenem 3En, která hned druhý den přešla v silnou intenzitu. Izolát 4En začal arginin dekarboxylovat v průběhu 24 hodin kultivace a také již třetí den byla intenzita zaznamenána jako silná. Dekarboxylace tyrozinu izolátem 3En byla zjištěna druhý 84

den kultivace a intenzita reakce pozvolna rostla. Silná dekarboxylace byla zaznamenána až šestý den kultivace. Činnost tyrozindekarboxylázy izolátu 4En byla zjištěna třetí den kultivace, ale poté průběh byl podobný jako u izolátu 3En.

3,5 Intenzita reakce

3 2,5 2 1,5 1 0,5 0

4En ARG 3En ARG 4En TYR 3En TYR

1

2

3

3En TYR 4En TYR 3En ARG 4En ARG

10 6 7 8 9

4 5

Dny

Graf 27: Dekarboxylace argininu a tyrozinu izoláty 3En (Enterococcus sp.) a 4En (Enterococcus mundtii) v průběhu 10 dnů při teplotě 37 °C 3,5

2,5 2 1,5 1

Intenzita reakce

3 6 °C 25 °C 30 °C 37 °C

0,5

37 °C 30 °C 25 °C 6 °C

0 1

2

3

4

5

6

7

8

9 10

Dny

Graf 28: Dekarboxylace argininu izolátem 3En (Enterococcus sp.) v průběhu 10 dnů při teplotě 6, 25, 30, 37 °C

85

V grafu 28 je znázorněna aktivita arginindekarboxylázy produkované izolátem 3En (Enterococcus sp.) při teplotě 6, 25, 30 a 37 °C. Z grafu je vidět, že intenzita reakce byla ovlivněna teplotou. Při teplotě 6 °C dekarboxylace argininu vůbec nenastala a při teplotě 37 °C růst arginindekarboxylázy byla nejintenzivnější. Intenzita reakcí byla ovlivněna teplotou. Rovněž při teplotě 6 °C nebyla dekarboxylace tyrozinu zjištěna. BEUTLING (1996) cit. podle GREIFOVÁ et al. (2003) uvádí, že teploty pod 10 °C nedovolují tvorbu tyraminu z důvodu inaktivace enzymu tyrozindekarboxylázy. Činnost tyrozindekarboxylázy, ale i počet dekarboxylujících izolátů se zvyšuje s nárůstem teploty (GARDINI et al., 2008, cit. podle NAILA et al. 2010). Při teplotě 25 °C dekarboxylovaly tyrozin už 4 izoláty (graf 29). Při teplotě 30 °C dekarboxylovaly tyrozin 5 izolátů (graf 30) a při teplotě 37 °C dekarboxylovaly tyrozin 6 izolátů z 9 (graf 31).

1En

3

2En

2 1,5 9En 7En 5En 3En 1En

1

Intenzita reakce

2,5

3En 4En 5En 6En 7En

0,5

8En

0

9En

10 5 6 7 8 9 1 2 3 4 Dny

Graf 29: Dekarboxylace tyrozinu izoláty rodu Enterococcus při 25 °C

86

3,5

1En

2,5 2 1,5 9En 7En 5En 3En 1En

1

Intenzita reakce

3

2En 3En 4En 5En 6En 7En

0,5

8En

0

9En

9 10 5 6 7 8 1 2 3 4 Dny

Graf 30: Dekarboxylace tyrozinu izoláty rodu Enterococcus při 30 °C

3 1En

2 1,5 1 9En 7En 5En 3En 1En

0,5

Intenzita reakce

2,5

2En 3En 4En 5En 6En 7En 8En

0 10 5 6 7 8 9 1 2 3 4 Dny

9En

Graf 31: Dekarboxylace tyrozinu izoláty rodu Enterococcus při 37 °C Enterokoky patří mezi termorezistentní bakterie, které přežívají pasterizační teploty a proto jsou normální součástí pasterizovaného mléka (GREIFOVÁ et al., 2003). Tyto bakterie jsou schopné se množit i při nízké vodní aktivitě a jsou schopné přežít v prostředí GIT lidí a zvířat. Bakterie E. faecalis, E. faecium a E. durans byli izolovány z lidské stolice (GREIFOVÁ et al., 2003). To prokázaly i celkové výsledky DE PALENCIA et al. (2011), kteří zjistili, že kmen IPLA655 E. durans, který produkuje tyramin v sýru, může přežít v zažívacím traktu a syntetizovat tyramin i v tlustém střevě, díky své schopnosti adheze na střevní epitel. 87

5.2 Kontaminující mikroorganismy v mléce a v tvarohu a jejich tvorba biogenních aminů a produkce oxidu uhličitého Kozí mléko, stejně jako kravské patří mezi kaseinová mléka a v základní složením se mu i podobá. Bílkoviny resp. aminokyseliny obsažené v mléce jsou pro mikroorganismy zdrojem dusíku (GAJDŮŠEK, 2002). V tabulce 22 je znázorněn obsah aminokyselin v kozím a kravském mléce. U některých aminokyselin jsou vidět rozdíly v množství, které by mohly mít vliv na tvorbu jednotlivých biogenních aminů.

Tabulka 22: Průměrné zastoupení vybraných aminokyselin a mastných kyselin v kozím a kravským mléce (Gajdůšek, 2002; Dičáková, 2005) Složka

Kravské mléko

Kozí mléko

Histidin (mg/100 ml)

90,7

102

Fenylalanin (mg/100 ml) 113,8

158,0

Tyrozin (mg/100 ml)

130,3

158

Lyzin (mg/100 ml)

281,4

194,8

Arginin (mg/100 ml)

131,5

109,9

Glycin (mg/100 ml)

110,3

52,1

Izoleucin (mg/100 ml)

153,8

67,1

Vzorky pasterovaného kozího a kravského mléka a kravského a kozího tvarohu byly inokulovány čistými kulturami mikroorganismů (Enterococcus faecium CCM 7250, Pseudomonas fluorescens CCM 2826, Proteus vulgaris CCM 4553, Enterobacter aerogenes CCM 2531, Escherichia coli CCM 2024, Geotrichum candidum CCM 8265). V Průběhu kultivace (3 dny) byl sledován růst jednotlivých mikroorganismů a produkce oxidu uhličitého. V rámci analýz byl po 3 dnech kultivace stanoven v zaočkovaném kravském a kozím tvarohu obsah biogenních aminů. Ve vybraných vzorcích syrového kravského a kozího mléka byly zjištěny počty mikroorganismů (tabulka 23). Syrové mléko bylo pasterováno (72 °C/30s) a z části byl vyroben tvaroh. Výchozí vzorky pasterovaného kozího a kravského mléka před inokulací vybranými mikroorganismy, obsahovaly relativně nízké počty mikroorganismů. U kravského 88

a kozího tvarohu byly zjištěny vyšší hodnoty celkového počtu mikroorganismů (tabulka 24), tyto hodnoty jsou spíše orientační, protože u tohoto výrobku byly použity ušlechtilé bakteriální kultury. Počet mikromycet a psychrotrofních mikroorganismů byl jak u kravského, tak u kozího tvarohu také zvýšené. Mikromycety v tvarohu mohou indikovat nedostatečnou sanitaci výrobního zařízení a sekundární kontaminaci. Tabulka 23: Stanovené skupiny mikroorganismů v syrovém kozím a kravském mléce Počty mikroorganismů

Syrové

Syrové

kravské mléko

kozí mléko

6,44 . 103

2,02 . 104

Psychrotrofní mikroorganismy

2,17 . 103

210

Koliformní mikroorganismy

2,56 . 102

4,96 . 104

17

4,16 . 103

3,11 . 102

1,05 . 106

Celkové počty mikroorganismů

Enterokoky Mikromycety

89

Tabulka 24: Stanovené skupiny mikroorganismů v pasterovaném kozím a kravském mléce a tvarohu

Pasterované

Pasterované

kravské mléko

kozí mléko

Kravský tvaroh z pasterované ho mléka

212

1530

5,9 . 108

5,47 . 108

Psychrotrofní mikroorganismy

7

6

7,53 . 105

9,71 . 105

Koliformní mikroorganismy

14

1

27

Méně jak 10

Méně jak 10

8

9

Méně jak 10

3

2

3,54 . 104

1,36 . 103

Počty mikroorganismů

Celkové počty

Kozí tvaroh z pasterovaného mléka

mikroorganismů

Enterokoky Mikromycety

Pasterované kravské a kozí mléko bez inokulovaných mikroorganismů bylo použito jako kontrolní vzorek (tabulka 25). Z výsledků je zřejmé, že již po 24 hodinách při 6 °C vzrostly počty CPM z 102 KTJ/ml na hodnoty 105 KTJ/ml u kravského mléka. Tento nárůst není v podstatě ovlivněn teplotou kultivace. Při 6 °C budou však v mléce převládat psychrotrofní bakterie, byť byl jejich počet na počátku pokusu v mléce velmi malý. V kravském a kozím mléce byl stanoveny oxid uhličitý. Oxid uhličitý vzniká jak při rozkladu tuků a bílkovin, tak i při fermentaci laktózy (KÁŠ, 1964). V kontrole při 25 a 30 °C třetí den kultivace byla zaznamenána u všech kontrolních vzorků vyšší tvorba oxidu uhličitého.

90

Tabulka 25: Počty mikroorganismů v KTJ/ml a produkce CO2 v µl/l u kontrolního vzorku kravského a kozího mléka kultivované 3 dny při daných teplotách den

Kultivace při 6 °C

Kultivace při 25 °C

Kultivace při 30 °C

Kravské mléko

Kozí mléko

Kravské mléko

Kozí mléko

Kravské mléko

Kozí mléko

1

9,6 . 105

9,1 . 103

5,7 . 108

5,3 . 107

1,2 . 109

6,1 . 107

2

6,5 . 105

7,7 . 103

1,3 . 109

4,9 . 108

7,8 . 108

5,9 . 108

3

3,6 . 105

3,5 . 105

3,6 . 105

6,9 . 108

1,9 . 109

6,8 . 108

1

1,9 . 104

14

1,0 . 106

2,5 . 102

1,0 . 106

4,4 . 102

2

2,1 . 104

17

7,0 . 105

3,1 . 102

5,2 . 105

4,5 . 102

3

2,7 . 103

19

5,6 . 105

2,6 . 103

3,1 . 105

4,7 . 103

1

9,4 . 102

8

1,0 . 104

8,6 . 104

9,2 . 104

2,7 . 105

2

9,9 . 102

8

1,2 . 105

8,9 . 105

8,9 . 104

2,2 . 105

3

4,6 . 102

25

5,0 . 106

7,9 . 104

2,7 . 105

2,4 . 105

Kontrola

CPM

Koliformní mikroorg.

Enterokoky

Mikromycety

CO2 (µl/l)

1

4,5 . 103

4,22 . 104

2,64 . 104

4,1 . 104

2,48 . 104

4,16 . 106

2

1 . 104

4,4 . 103

5,1 . 104

7,23 . 105

8,13 . 104

6,13 . 105

3

1,9 . 104

2

5,35 . 104

3

8,6 . 104

9

1

7,42

6,67

42,39

5,65

127,55

12,54

2

3,32

2,97

187,02

88,29

104,33

135,63

3

8,25

5,08

159,69

258,45

270,70

325,41

91

Tabulka 26: Počty mikroorganismů v KTJ/ml a produkce CO2 v µl/l u kontrolního vzorku kravského a kozího tvarohu kultivované 3 dny při daných teplotách den

Kultivace při 6 °C

Kultivace při 25 °C

Kultivace při 30 °C

Kravský tvaroh

Kozí tvaroh

Kravský tvaroh

Kozí tvaroh

Kravský tvaroh

1

1,01 . 107

6,03 .106

2,87 .108

2,63 . 108

2,72 . 106

2,63 . 108

2

1,03 . 107

5,82 . 107

2,3 . 107

3,15 . 108

3,56 . 107

3,55 . 108

3

8,69 . 106

4,95 . 107

1,78 . 107

2,3 . 108

2,53 . 108

2,09 . 108

1

Méně jak 10

18

Méně jak 10

18

4

18

4

4

18

4

4

40

Kontrola

CPM

Koliformní MO

2

3 Enterokoky

Mikromycety

CO2 (µl/l)

Méně jak 10 Méně jak 10

4

Méně jak 10

Méně jak 10 Méně jak 10

Kozí tvaroh

1

22

4

15

13

9

45

2

12

4

10

18

15

45

3

13

13

13

18

80

45

1

2,04 . 104

1,6 . 104

4,17 . 104

4,56 . 107

3 . 105

5,31 . 107

2

2,9 . 104

172

2,86 . 104

6,6 . 107

3,02 . 105

5,25 . 106

3

4,31. 105

184

5,6 . 106

1,06 . 107

6,95 . 106

7,18 . 106

1

70,62

18,62

86,23

37,97

102,21

32,02

2

17,16

15,5

69,7

33,86

118,39

48,55

3

20,93

15,79

106,65

227,13

486,6

272,75

V tabulce 26 je vyjádřena produkce plynu a růst celkového počtu mikroorganismů v kontrolních vzorcích. V kravském a kozím tvarohu vyrobeném z pasterovaného mléka, pak tvoří CPM především ušlechtilé bakterie mléčného kvašení, použité při jeho výrobě. V kontrole při 25 a 30 °C třetí den kultivace byla zaznamenána u všech kontrolních vzorků 92

vyšší tvorba oxidu uhličitého. U kravského tvarohu dosahovala až 486 µl/l. Produkce oxidu uhličitého může být způsobená bakteriemi mléčného kvašení, které jsou v tvarohu obsaženy.

5.2.1 Produkce biogenních aminů a CO2 bakterií Enterococcus faecium Enterokoky jsou grampozitivní, nesporulující, fakultativně anaerobní koky, které se vyskytují jednotlivě, v párech anebo v řetízcích (DUCKOVÁ et al., 2008). Enterokoky jsou schopny růst v bujónu v přítomnosti 6,5 % NaCl, při pH 9,6, 40 % žlučových kyselin a přežívají 30 minutový záhřev při 60 °C (GARDINI, 2001). Z potravinářského hlediska je z těchto kritérií významná značná odolnost vůči zvýšené koncentraci soli v potravinách a tím i nízkým hodnotám aw a skutečnost, že může přežívat nižší pasterační a termizační teploty (GÖRNER, VALÍK, 2004). Enterococcus faecium (tabulka 27) byl do kravského mléka a tvarohu inokulován v množství řádově 107 KTJ/ml a do kozího mléka a tvarohu řádově 108 KTJ/ml, tomu pak odpovídala koncentrace ve vlastních vzorcích cca 106 resp. 107 KTJ/ml. Počty bakterie Enterococcus faecium při 6 °C se v průběhu 72 hodin sledování příliš neměnily, u kozího mléka byl ale zaznamenán jistý pokles počtů bakterií oproti výchozí koncentraci. Ve 25 °C docházelo během prvních 24 h kultivace k nárůstu počtů cca o jeden řád, u kravského mléka se počet po 72 h kultivace ještě zvýšil a to z 106 na 108 KTJ/ml. Velmi podobně se Enterococcus faecium choval též při kultivaci ve 30 °C. Počty bakterie Enterococcus faecium při 6 °C po 3 dnech kultivace v kravském tvarohu byly 4,53 . 105 KTJ/g a v kozím tvarohu 3,95 . 106 KTJ/g. Při teplotě 25 °C byl zjištěno množství v kravském tvarohu 3,38 . 106 KTJ/g a v kozím tvarohu 5,45 . 106 KTJ/g. A při teplotě 30 °C bylo množství bakterie v kravském tvarohu 1,79 . 106 KTJ/g a v kozím tvarohu 3,54 . 106 KTJ/g. Při teplotě 25 °C a 30 °C byla v kozím mléce a tvarohu zjištěna vysoká koncentrace oxidu uhličitého, která činila po 3 dnech kultivace cca 300 µl/l. Celkově vyšší produkce oxidu uhličitého je zjištěna v tvarohu a to i přesto, že počet bakterie Enterococcus je cca o 2 řády nižší. Vyšší koncentrace CO2 může být způsobena oxidací laktátu nebo glycerolu (ŠVEC, DEVRIESE, 2009) či dekarboxylací aminokyselin (KALAČ, KŘÍŽEK, 2002). Nelze říci, že by produkce oxidu uhličitého byla ukazatelem množení mikroorganismů nebo tvorby biogenních aminů. Při srovnání produkce CO2 a TYR v kozím tvarohu při 6 °C, je v hodnotě 15,79 µl/l CO2 vyprodukováno 2,39 mg/kg TYR a při teplotě 25 °C je v hodnotě 306 µl/l CO2 vyprodukováno 2,68 mg/kg TYR. 93

Tabulka 27: Růst bakterie Enterococcus faceium a jejich produkce oxidu uhličitého v pasterovaném kravském a kozím mléce a tvarohu Enterococcus

Kultivace při 6 °C den

KTJ/ml

CO2 (µl/l)

CO2 (µl/l)

Kultivace při 30 °C

Kravské

Kozí

Kravské

Kozí

Kravské

Kozí

mléko

mléko

mléko

mléko

mléko

mléko

1

5,6 . 106

5,2 . 106

1,9 . 107

5,5 . 108

4,8 . 107

4,5 . 108

2

3,7 . 106

3,9 . 106

4,7 . 107

2,0 . 108

9,5 . 107

2,4 . 108

3

4,0 . 106

5,7 . 106

6,4 . 108

8,7 . 108

6,2 . 107

4,9 . 108

1

10,28

6,96

74,59

31,40

269,63

53,40

2

6,10

1,74

277,49

139,35

189,66

62,06

3

8,97

6,73

160,41

306,65

185,27

296,18

Kultivace při 6 °C

KTJ/g

Kultivace při 25 °C

Kultivace při 25 °C

Kultivace při 30 °C

Kravský

Kozí

Kravský

Kozí

Kravský

Kozí

tvaroh

tvaroh

tvaroh

tvaroh

tvaroh

tvaroh

1

6,32 . 105

1,95 . 106

1,14 . 106

3,95 . 106

2,73 . 106

8,23 . 106

2

4,32 . 106

4,33 . 106

2,74 . 106

3,18 . 106

4,5 . 105

3,5 . 106

3

4,53 . 105

3,95 . 106

3,38 . 106

5,45 . 106

1,79 . 106

3,54 . 106

1

70,62

18,62

104,95

35,61

96,42

29,5

2

17,16

15,5

49,84

40,32

106,54

95,98

3

56,98

15,79

162,3

306,76

215,56

301,82

V grafech (32, 33) je znázorněna produkce biogenních aminů bakterií Enterococcus faecium, která vyprodukovala nejvíce tyraminu a to v kravském tvarohu 4,98 mg/kg při 25 °C a v kozím tvarohu 2,78 mg/kg při 30 °C. Nejvyšší hladina FEA (0,54 mg/kg) byla zjištěna při teplotě 25 °C v kozím tvarohu. Nejvyšší množství PUT (1,1531 mg/kg) byl zjištěn v kozím tvarohu při 30 °C. Nejvyšší množství CAD ( 0,39 mg/kg) bylo zjištěno v kravském tvarohu a v kozím tvarohu byla zjištěna hladina CAD jen při teplotě 6 °C. Dále v kozím tvarohu bylo zjištěno nejvyšší množství SPD (0,51 mg/kg) při teplotě 25 °C a SPM (0,56 mg/kg) při 30 °C. Hladina tryptaminu a histaminu nebyla v kravském ani v kozím tvarohu zjištěna. E. faecium patří k významným producentům tyraminu (RUSSO et al., 2010) i námi testovaný 94

kmen produkoval tyramin. Produkce tyraminu bakterií Enterococcus faecium se zvyšovala se vzrůstající teplotou, to potvrdili i MARCOBAL et al., (2006) cit. podle LINARES et al. (2012). Dále jsou enterokoky spojovány i s produkcí fenyletylaminu (BOVER - CID, 1999). Námi testovný kmen produkoval podobné množství FEA v kravském i kozím tvarohu, ale hodnota nebyla vyšší než 0,54 mg/kg. Enterokoky obecně patří k převládajícím mikroorgasnimům v nedozrálých sýrech, v čerstvých sýrech a v tvarozích. Stálost a dominanci enterokoků během zrání lze přisoudit k jejich širokému rozsahu růstových teplot a toleranci vůči teplu a soli (SARANTINOPOULOS et al., 2001). TRY

5

FEA

4

PUT Množství BA 3 mg/kg 2

CAD

1

TYR

HIS

0

6°C

25°C

30°C

SPD SPM

Graf 32: Produkce BA bakterií Enterococcus faecium v kravském tvarohu 3

TRY

2,5

FEA

2

PUT

Množství 1,5 mg/kg

CAD HIS

1

TYR

0,5

SPD

0

6°C

25°C

30°C

SPM

Graf 33: Produkce BA bakterií Enterococcus faecium v kozím tvarohu

95

5.2.2 Produkce biogenních aminů a CO2 bakterií Enterobacter aerogenes Enterobacter aerogenes patří mezi gramnegativní, fakultativně anaerobní tyčinky, jejich optimální teplota růstu je 30 až 37 °C (SEDLÁČEK, 2007). Tyto bakterie jsou schopny přežívat pouze v prostředí o pH vyšším než 4,2 (GREIF et al., 1999). Vyskytují se ve střevním traktu, na rostlinách, sekundárně i v mléce. Účastní se kažení potravin, patří do skupiny koliformních mikroorganismů, zkvašují sacharidy za vzniku oxidu uhličitého a vodíku (GÖRNER, VALÍK, 2004). Enterobacter aerogenes (tabulka 28) byl inokulován do kravského mléka a tvarohu v množství řádově 105 KTJ/ ml a do kozího mléka a tvarohu v množství řádově 105 KTJ/ ml. Výchozí počet bakterie byl o 1 řád nižší. Při 6 °C ve všech substrátech nedošlo k růstu bakterie, spíše k razantnímu poklesu výchozího množství. V kravském a kozím mléce při 25 °C a 30 °C došlo ke zvýšení o několik řádů. V kozím tvarohu na růst bakterie neměla teplota žádný vliv, bakterii se v tomto substrátu nedařilo. V kravském tvarohu to bylo podobné, i když při vyšších teplotách docházelo k menšímu růstu. 3. den kultivace při teplotě 6 °C bylo zjištěno množství v kravském tvarohu 9,09 . 104 KTJ/g a 1,4 . 102 KTJ/g v kozím tvarohu. Při teplotě 25 °C byl počet bakterie v kravském tvarohu 4,54 . 105 KTJ/g a v kozím tvarohu 1,91 . 102 KTJ/g. A při teplotě 30 °C bylo množství bakterie v kravské tvarohu 4,54 . 105 KTJ/g a v kozím tvarohu 2 . 102KTJ/g. Růst bakterie Enterobacter aerogenes ovlivnilo kyselé pH u obou druhů tvarohu. Je zajímavé, že ve srovnání se vzorky mléka nebyla zaznamenána nižší produkce oxidu uhličitého. Produkce plynu kolísala a to bez ohledu na dynamiku růstu bakterií. Lze tedy do jisté míry uvažovat o určité hladině mikroorganismů, která je schopna produkovat jisté množství plynu bez ohledu na jejich úbytek nebo přírůstek. Při teplotách 25 - 30 °C byla ve všech substrátech naměřena vysoká koncentrace oxidu uhličitého. Se zvyšující se teplotou se produkce zvyšovala. Nejvyšší množství 441, 88 µl/l CO2 bylo naměřeno v kozím mléce při 25 °C a 334 µl/l CO2 v kravském tvarohu. I zde nebyla zjištěna spojitost mezi produkcí některého z biogenních aminů a produkcí CO2. Např. CAD v kravském tvarohu při teplotě 25 °C byl zjištěn v množství 0,48 mg/kg při hodnotě 135,34 µl/l CO2 . A při teplotě 30 °C byl CAD zjištěn v množství 0,44 mg/kg při hodnotě 334,8 µl/l CO2 .

96

Tabulka 28: Růst bakterie Enterobacter aerogenes a její produkce oxidu uhličitého v pasterovaném kravském a kozím mléce a tvarohu Enterobacter

Kultivace při 6 °C den

KTJ/ml

CO2 (µl/l)

Kozí

Kravské

Kozí

Kravské

Kozí

mléko

mléko

mléko

mléko

mléko

mléko

1

9,4 . 104

4,5 . 102

2,9 . 108

3,6 . 106

2,7 . 108

3,2 . 108

2

2,4 . 104

5,0 . 102

9,4 . 107

1,4 . 108

5,4 . 107

3,4 . 108

3

9,1 . 102

5,5 . 102

2,7 . 108

3,6 . 108

2,7 . 106

6,1 . 108

1

8,91

5,12

113,06

11,29

173,11

15,60

2

5,15

1,96

210,52

263,66

148,37

418,91

3

7,70

5,06

197,65

441,88

233,56

360,42

Kravský tvaroh

CO2 (µl/l)

Kultivace při 30 °C

Kravské

Kultivace při 6 °C

KTJ/g

Kultivace při 25 °C

Kozí tvaroh

Kultivace při 25 °C

Kultivace při 30 °C

Kravský

Kozí

Kravský

Kozí

tvaroh

tvaroh

tvaroh

tvaroh

1

4,54 . 102

90

4,54 . 104

1. 102

4,54 . 104

1. 102

2

4,54 . 102

1. 102

4,54 . 104

1,38 . 102

4,54 . 104

1,59 . 102

3

9,09 . 104

1,4 . 102

4,5 . 105

1,91 . 102

4,54 . 105

2 . 102

1

52,56

14,12

73,76

26,46

88,7

31,33

2

27,49

12,8

58,84

39,87

240,09

57,7

3

24,71

10,03

135,34

248,07

334,8

246,68

Enterobacter aerogenes (graf 34, 35) vyprodukoval nejvíce tyraminu v kozím tvarohu (1,39 mg/kg) při 6 °C a v kravském tvarohu bylo nejvíce zjištěno množství putrescinu (1,13 mg/kg) při 30 °C. FEA byl v kravském tvarohu produkován až při teplotě 30 °C v množství 0,31 mg/kg. A v kozím tvarohu bylo zaznamenáno nejvyšší množství FEA při teplotě 30 °C v hodnotě 0,5 mg/kg. PUT měl nejvyšší množství v kravském tvarohu 1,13 mg/kg při teplotě 30 °C a i při této teplotě bylo nejvyšší množství PUT (1,63 mg/kg) zaznamenáno i v kozím tvarohu. Nejvyšší množství CAD (0,48 mg/kg) bylo naměřeno v kravském tvarohu a v kozím tvarohu byla hladina CAD naměřena pouze při teplotě 30 °C. 97

SPD byla v kravském tvarohu produkován pouze při teplotě 30 °C a v kozím tvarohu bylo nejvyšší množství zaznamenáno při teplotě 25 °C v hodnotě 0,6 mg/kg. SPM byl také nejvíce zastoupen v kozím tvarohu při teplotě 25 °C v hodnotě 0,79 mg/kg. Produkce TRY a HIS bakterií Enterobacter aerogenes nebyla v kravském ani v kozím tvarohu zjištěna. ADAMS et al. (2001) zjistili, že bakterie Enterobacter jsou zodpovědné za produkci putrescinu a kadaverinu, která byla potvrzena i u našeho testovaného kmenu. TRY

1,2 1

FEA

0,8

PUT

Množství BA 0,6 mg/kg

CAD

0,4

HIS

0,2

TYR

0

6°C

25°C

30°C

SPD SPM

Graf 34: Produkce BA bakterií Enterobacter aerogenes v kravském tvarohu TRY

2

FEA Množství BA mg/kg

1,5

PUT

1

CAD HIS

0,5

TYR 0

6°C

25°C

30°C

SPD SPM

Graf 35: Produkce BA bakterií Enterobacter aerogenes v kozím tvarohu

98

5.2.3 Produkce biogenních aminů a CO2 bakterií Escherichia coli E. coli jsou gramnegativní, fakultativně anaerobní, rovné tyčinky vyskytující se jednotlivě a ve dvojicích. Optimální teplota růstu je 37 °C. Vyskytuje se jako normální flóra v koncové části střevního traktu teplokrevných zvířat (SEDLÁČEK, 2007). Mimo střevo je E. coli téměř vždy patogenní. Biochemicky je to průměrně aktivní bakterie. Štěpí glukózu a laktózu za tvorby plynu, tvoří indol a neštěpí močovinu (ZAHRADNÍČEK, 2003). E. coli (tabulka 29) byla inokulována do kravského mléka a tvarohu v množství řádově 107 KTJ/ml a do kozího mléka a tvarohu v množství 108 KTJ/ml, což odpovídá koncentraci cca 106 resp. 107 KTJ/ml ve vlastním vzorku. U bakterie E. coli při 6 °C byl v kravském mléce zaznamenána jistý pokles počtu bakterií, u kozího mléka se hodnoty podstatně neměnily. U kultivace při 25 °C se počty E. coli v kravském mléce po 24 h zvýšily o jeden řád a v kozím mléce dokonce o dva řády. Ve 30 °C je trend podobný. Jen po 72 h kultivace dochází k poklesu počtu bakterií u obou druhů mléka pravděpodobně vlivem vyčerpání substrátu a nahromadění zplodin metabolismu. U E. coli při 6 °C byl v kravském tvarohu zaznamenán jistý pokles počtu bakterií a u kozího tvarohu se hodnoty podstatně neměnily. U kultivace při 25 °C se počty E. coli v kravském tvarohu po 24 h zvýšily o jeden řád. Ve 30 °C je trend podobný. Jen po 72 h kultivace dochází k poklesu počtu bakterií u pravděpodobně vlivem vyčerpání substrátu a nahromadění zplodin metabolismu.V kozím tvarohu má E. coli konstantní úbytek v rámci stejného řádu. Při 6 °C byl 3. den kultivace v kravském tvarohu zaznamenán počet E. coli 45 KTJ/g a v kozím tvarohu 3,54 . 105 KTJ/g. Při teplotě 25 °C bylo množství bakterie v kravském tvarohu 4,54 . 102 KTJ/g a v kozím tvarohu 1,89 . 105 KTJ/g. Při teplotě 30 °C byl počet bakterie v kravském tvarohu 4,54 . 102 KTJ/g a v kozím tvarohu 1,76 . 105 KTJ/g. E. coli je schopna fermentovat laktózu za vzniku kyseliny mléčné, kyseliny octové a plynů CO2 a H2 (GÖRNER, VALÍK, 2004). To potvrzují i zjištěné vyšší hladiny CO2 ve vzorcích mléka kultivovaného při 25 a 30 °C. V Kravském tvarohu a v kozím mléce při teplotě 25 a 30 °C bylo množství oxidu uhličitého produkované bakteriií E. coli podobné, ale i přesto nejvyšší produkce oxidu uhličitého 364, 17 µl/l byla zaznamenána v kravském tvarohu a v kravském mléce v hodnotě 337,17 µl/l 3. den kultivace při teplotě 30 °C. I zde nebyla zjištěna spojitost mezi produkcí oxidu uhličitého a BA. Např. PUT v kravském tvarohu při teplotě 25 °C byl zjištěn v množství 0,98 mg/kg při hodnotě 198,98 µl/l CO2 . Při teplotě 30 °C byl PUT v kravském tvarohu zjištěn v množství 0,49 mg/kg při hodnotě 364,17 µl/l CO2. Tudíž hodnota PUT byla nižší s vyšší produkcí CO2 99

Tabulka 29: Růst bakterie Escherichia coli a její produkce oxidu uhličitého v pasterovaném kravském a kozím mléce a tvarohu Escherichia

Kultivace při 6 °C den

KTJ/ml

CO2 (µl/l)

Kozí

Kravské

Kozí

Kravské

Kozí

mléko

mléko

mléko

mléko

mléko

mléko

1

1,5 . 104

4,0 . 107

5,4 . 107

1,1 . 109

1,7 . 107

2,0 . 108

2

3,6 . 107

7,5 . 107

4,4 . 107

1,5 . 109

1,0 . 107

1,3 . 109

3

4,5 . 102

6,0 . 107

3,4 . 107

1,2 . 109

9,1 . 105

9,0 . 108

1

7,70

9,57

88,46

85,72

152,32

96,06

2

5,03

1,90

194,65

78,54

322,79

120,94

3

9,17

15,42

192,91

77,67

337,17

131,95

Kravský

CO2 (µl/l)

Kultivace při 30 °C

Kravské

Kultivace při 6 °C

KTJ/g

Kultivace při 25 °C

Kozí

Kultivace při 25 °C

Kultivace při 30 °C

Kravský

Kozí

Kravský

Kozí

tvaroh

tvaroh

tvaroh

tvaroh

tvaroh

tvaroh

1

1 . 102

6,2 . 106

4,54 . 104

1,38 . 106

4,54 . 104

7,86 . 105

2

4,54 . 102

3,71 . 106

4,54 . 105

2,7 . 106

4,54 . 105

8,35 . 105

3

45

3,54 . 105

4,54 . 102

1,89 . 105

4,54. 104

1,76 . 105

1

48,21

20,39

78,53

24

69,08

36,28

2

32,49

14,09

64,05

33,06

143,81

63,88

3

25,06

10,94

198,98

277,56

364,17

290,64

U bakterie Escherichia coli (graf 36, 37) bylo zjištěno největší množství kadaverinu v kozím tvarohu v hodnotě 5,41 mg/kg při 6 °C a putrescinu v hodnotě 2,01 mg/kg při 30 °C. V kravském tvarohu nebyla zaznamenána produkce TRY, FEA A HIS. V kozím tvarohu hladina TRY byla naměřena pouze při teplotě 6 °C v hodnotě 0,63 mg/kg, FEA byl naměřen v kozím tvarohu pouze při teplotách 6 a 25 °C v hodnotách 0,22 a 0,26 mg/kg. PUT v kravském tvarohu byl nejvíce naměřen při teplotě 25 °C v hodnotě 0,98 a v kozím tvarohu při teplotě 30 °C v hodnotě 2,01 mg/kg. CAD měl nejvyšší množství (0,44 mg/kg) v kravském tvarohu při teplotě 25 °C, zato v kozím tvarohu bylo při teplotě 6 °C naměřeno 5,41 mg/kg. Produkci CAD a PUT bakterií Escherichia coli potvrdili i GREIF, GREIFOVÁ 100

(2004). TYR měl nejvyšší hladinu (1,1 mg/kg) v kozím tvarohu při teplotě 6 °C. Hladina SPM a SPD byla nejvyšší v kozím tvarohu při teplotě 30 °C v množství 0,88 a 0, 86 mg/kg. TRY

1

FEA

0,8

PUT Množství BA 0,6 mg/kg 0,4

CAD

0,2

TYR

HIS

0

6°C

25°C

30°C

SPD SPM

Graf 36: Produkce BA bakterií Escherichia coli v kravském tvarohu 6

TRY

5

FEA

4

PUT

Množství BA 3 mg/kg

CAD

2

HIS

1

TYR SPD

0

6°C

25°C

30°C

SPM

Graf 37: Produkce BA bakterií Escherichia coli v kozím tvarohu

101

5.2.4 Produkce biogenních aminů a CO2 bakterií Pseudomonas fluorescens Bakterie Pseudomonas zahrnuje obvykle mírně zahnuté gramnegativní, striktně aerobní tyčinky, které jsou většinou pohyblivé, oxidáza a kataláza pozitivní a biochemicky poměrně aktivní (ONDROVČÍK, 2003; GÖRNER, VALÍK, 2004; ŠILHÁNKOVÁ, 2008). Řada druhů tvoří fenazinová barviva žlutých, zelených, modrých nebo červených odstínů, která uvolňují do růstového prostředí. Tím způsobují nežádoucí zabarvení potravin (např. modrání nebo červenání mléka. Jejich optimální teplota růstu je v rozmezí 25-30 °C (PALLERONI, 2005). Bakterie Pseudomonas fluorescens (tabulka 30) byla inokulována do kravského mléka a tvarohu v množství cca 107 KTJ/ ml a do kozího mléka a tvarohu v množství řádově 108 KTJ/ ml. Výchozí počet bakterií v mléce byl pak řádově 106 resp. 107 KTJ/ml. Vezmeme-li při porovnání v úvahu množství inokula je dynamika růstu této bakterie v obou vzorcích mléka podobná. Při 6 °C se počty mikroorganismů pohybují velmi blízko stanovené hodnotě výchozí koncentrace inokula. Ke zvýšení počtu dochází až po 72 h kultivace u kozího mléka, kdy se počty zvýšily z 107 KTJ/ml na 109 KTJ/ml. U ostatních teplot kultivace (25 °C a 30 °C) došlo již po 24 h kultivace k nárůstu počtů cca o dva řády. Tyto počty se během kultivace v podstatě neměnily.V kravském tvarohu se při 25 °C zvýšila hodnota až o 1 řád, zato při 30 °C Pseudomonas fluorescens svoje množství nezvýšila.V kozím tvarohu Pseudomonas fluorescens rostla podobně jak při teplotě 25 °C, tak při 30 °C. Při 6 °C byl 3. den kultivace v kravském tvarohu zaznamenán počet 4,92 . 106 KTJ/g a v kozím tvarohu 6,40 . 107 KTJ/g. Při teplotě 25 °C bylo množství bakterie v kravském tvarohu 1,07 . 107 KTJ/g a v kozím tvarohu 3,25 . 108 KTJ/g. Při teplotě 30 °C byl počet bakterie v kravském tvarohu 7,28 . 106 KTJ/g a v kozím tvarohu 1,74 . 108 KTJ/g. Pseudomonas má silné proteolytické schopnosti umožňující jí rozklad bílkovinných potravin. Jejich lipolytické vlastnosti se uplatňují při kažení tuků. (ŠILHÁNKOVÁ, 2008). Pseudomonády jsou schopné degradovat řadu hexóz (glukózu, galaktózu atd.) (PALLERONI, 2005). Metabolická aktivita Pseudomonas se projevila produkcí plynů. Produkce CO2 se zvyšovala se vzrůstající teplotou kultivace. Největší produkce byla zaznamenána zpravidla 3. den kultivace. V kravském tvarohu při teplotě 30 °C bylo zaznamenáno nejvyšší množství v hodnotě 403,06 µl/l a v kozím mléce v hodnotě 368,56 µl/l.

102

Tabulka 30: Růst bakterie Pseudomonas fluorescens a její v pasterovaném kravském a kozím mléce a tvarohu Pseudomonas

Kultivace při 6 °C den

KTJ/ml

CO2 (µl/l)

Kultivace při 30 °C

Kozí

Kravské

Kozí

Kravské

Kozí

mléko

mléko

mléko

mléko

mléko

mléko

1

6,9 . 106

1,3 . 107

5,8 . 108

2,7 . 109

7,8 . 108

3,3 . 109

2

6,4 . 106

7,4 . 107

6,7 . 108

2,0 . 109

4,8 . 108

1,8 . 109

3

1,6 . 106

7,1 . 109

3,7 . 108

1,8 . 109

8,1 . 107

1,7 . 109

1

8,55

15,39

88,46

164,81

152,32

100,66

2

5,55

3,30

194,65

203,77

322,79

368,88

3

6,81

115,19

192,91

241,90

337,17

368,56

Kravský tvaroh

CO2 (µl/l)

Kultivace při 25 °C

Kravské

Kultivace při 6 °C

KTJ/g

produkce oxidu uhličitého

Kozí tvaroh

Kultivace při 25 °C

Kultivace při 30 °C

Kravský

Kozí

Kravský

Kozí

tvaroh

tvaroh

tvaroh

tvaroh

1

2,56 . 106

1,06 . 107

2,27 . 108

3,15 . 108

6,81 . 106

2,44 . 108

2

5,25 . 106

2,16 . 107

2,8 . 108

3,40 . 108

9,23. 107

2,19. 108

3

4,92 . 106

6,40 . 107

1,07 . 107

3,25 . 108

7,28 . 106

1,74 . 108

1

39,04

24,58

106,19

33,14

79,33

45,55

2

24,40

11,75

79,68

217,81

145,74

219,93

3

41,54

16,52

174,55

259,29

403,06

285,47

Ve vzorcích inokulovaných bakterií Pseudomonas fluorescens (graf 38 a 39) byla zjištěna nejvyšší produkce sperminu a spermidinu v množství 1,00 a 0,99 mg/kg při kultivaci ve 30 °C. TRY a HIS nebyly v tvarohu zjištěny a FEA byl zaznamenán pouze v kozím tvarohu od teploty 25 °C. U ostatních BA byly hodnoty menší jak 1mg/kg. Pseudomonas fluorescens patří mezí gramnegativní bakterie, které jsou schopné produkovat PUT a CAD (LINARES et al., 2012), což se potvrdilo i u námi testovaného izolátu.

103

TRY

0,4

FEA 0,3

PUT

Množství BA 0,2 mg/kg

CAD HIS

0,1

TYR

0

6°C

25°C

30°C

SPD SPM

Graf 38: Produkce BA bakterií Pseudomonas fluorescens v kravském tvarohu 1,2

TRY

1

FEA

0,8

PUT

Množství BA 0,6 mg/kg

CAD

0,4

HIS

0,2

TYR SPD

0

6°C

25°C

30°C

SPM

Graf 39: Produkce BA bakterií Pseudomonas fluorescens v kozím tvarohu

5.2.5 Produkce biogenních aminů a CO2 bakterií Proteus vulgaris Proteus vulgaris je gramnegativní aerobní tyčinka opatřená po celém povrchu bičíky, patřící do čeledi Enterobacteriaceae. V přírodě se účastní hnilobných procesů, neboť mají relativně silnou proteolytickou aktivitu. Při rozkladu bílkovin a bílkovinných substancích, oxidativní deaminací aminokyselin tvoří amoniak a ketokyseliny. Fermentují glukózu, ale laktózu ne (GÖRNER, VALÍK, 2004, KLABAN, 1996). Bakterie Proteus vulgaris (tabulka 31) byla inokulována do kravského mléka a tvarohu v množství cca 108 KTJ/ ml a do kozího mléka a tvarohu v množství cca 108 KTJ/ ml. Výchozí počet bakterie ve všech substrátech se pohyboval v množství řádově 107 KTJ/ ml. V kravském tvarohu při 6 °C byl zaznamenán pokles z výchozího množství o jeden řád, zato při 25 °C se během 24 hodin zvýšil jejich počet o 1 řád a při teplotě 30 °C až za 48 hodin. V kravském mléce při 6 °C byl zjištěn pokles z výchozího množství o jeden řád, zato při 25 °C se během 24 hodin zvýšil o 1 řád a při teplotě 30 °C až za 48 hodin. V kozím mléce při 6 °C zůstalo výchozí množství zaočkovaných bakterií. Při 6 °C a 25 °C došlo během 24 hodin ke zvýšení o 2 řády. Po 72 hodinách docházelo k pomalému odumírání. 104

V kozím tvarohu při 6 °C zůstalo výchozí množství zaočkovaných bakterií. Při 6 °C a 25 °C došlo během 24 hodin ke zvýšení o 1 řády. Po 72 hodinách docházelo k pomalému odumírání. 3. den kultivace při teplotě 6 °C bylo zjištěno množství v kravském tvarohu 4,21 . 105 KTJ/g a 4,3 . 107 KTJ/g v kozím tvarohu. Při teplotě 25 °C se byl počet bakterie v kravském tvarohu 9,5 . 106 KTJ/g a v kozím tvarohu 2,21 . 108 KTJ/g. A při teplotě 30 °C bylo množství bakterie v kravské tvarohu 1,06 . 107 KTJ/g a v kozím tvarohu 8,04 . 107 KTJ/g. Nejvyšší produkce oxidu uhličitého byla naměřena v kravském tvarohu při 30 °C v hodno 398,82 µl/l a v kravském mléce 326, 68 µl/l. Produkce oxidu uhličitého byla vyšší v mléce než v tvarohu a to i přes podobný počet bakterií. Tabulka 31: Růst bakterie Proteus vulgaris a její produkce oxidu uhličitého v pasterovaném kravském a kozím mléce a tvarohu Proteus

Kultivace při 6 °C den

KTJ/ml

CO2 (µl/l)

Kozí

Kravské

Kozí

Kravské

Kozí

mléko

mléko

mléko

mléko

mléko

mléko

1

7,6 . 106

1,31 . 107

2,95 . 108

2,1 . 109

7,8 . 108

3,34 . 109

2

7,22 . 106

7,06 . 107

1,03 . 109

1,4 . 109

4,8 . 108

1,77 . 109

3

3,74 . 106

8,37 . 107

7,57 . 108

1,32 . 109

8,14 . 107

1,72 . 109

1

10,16

6,04

68,52

43,61

152,32

100,66

2

6,13

2,30

183,10

186,16

322,79

368,88

3

8,75

14,24

166,12

255,19

337,17

368,56

Kravský tvaroh

CO2 (µl/l)

Kultivace při 30 °C

Kravské

Kultivace při 6 °C

KTJ/g

Kultivace při 25 °C

Kozí

Kultivace při 25 °C

Kultivace při 30 °C

Kravský

Kozí

Kravský

Kozí

tvaroh

tvaroh

tvaroh

tvaroh

tvaroh

1

6,28 . 106

4,5 . 107

1,1 . 108

4 . 108

8,18 . 105

4,45 . 108

2

5,82 . 106

8,04 . 107

2,8 . 108

4,69 . 108

1,64 . 108

1,46 . 108

3

4,21 . 105

4,3 . 107

9,5 . 108

2,21 . 108

1,06 . 107

1,06 . 107

1

55,04

10,69

92,37

37,70

87,36

36,55

2

25,57

16,46

59,40

29,12

127,50

31,53

3

24,37

15,94

184,25

47,09

398,82

102,89

105

Proteus vulgaris (graf 40, 41) vyprodukoval nejvíce putrescinu v kozím tvarohu v hodnotě 1,63 mg/kg při 30 °C a kadaverinu v hodnotě 1,77 mg/kg při 6 °C. Produkce TRY, HIS a FEA nebyla v kravském tvarohu zjištěna. PUT v kravském tvarohu měl nejvyšší množství při teplotě 30 °C v hodnotě 1,12 mg/kg A i při této teplotě byla zjištěno nejvyšší množství PUT v hodnotě 1,63 mg/kg. CAD byl zjištěn v kozím tvarohu jen při teplotě 6 °C v hodnotě 1,77 mg/kg a jeho nejvyšší hladina v kozím tvarohu byla zaznamenána při teplotě 25 °C v hodnotě 0,75 mg/kg. Nejvyšší hladina TYR byla zaznamenána v kozím tvarohu při teplotě 6 °C v hodnotě 0,89 mg/kg. Dále Nejvíce SPM a SPD bylo v kravském tvarohu při teplotě 25 °C v hodnotě 0,86 a 6,1 mg/kg. Proteus vulgaris patří ke slabším producentům biogenních aminů ( LAVIZZARI et al., 2010). TRY

1,2 1

FEA

0,8

PUT

Množství BA 0,6 mg/kg

CAD

0,4

HIS

0,2

TYR

0

6°C

25°C

30°C

SPD SPM

Graf 40: Produkce BA bakterií Proteus vulgaris v kravském tvarohu TRY

2

FEA 1,5

Množství BA mg/kg

PUT CAD

1

HIS 0,5

TYR SPD

0

6°C

25°C

30°C

SPM

Graf 41: Produkce BA bakterií Proteus vulgaris v kozím tvarohu

106

5.2.6 Produkce biogenních aminů a CO2 mikromycetou Geotrichum candidum Geotrichum candidum je vláknitá plíseň, která se vyskytuje převážně v různých mlékárenských výrobcích, např. tvarohu, tvarohových sýrech, v másle i samotném mléce (HUDCOVÁ et al., 2008, KLABAN, 1996). Geotrichum je enzymově velice aktivní, rozkládá sacharidy, tvoří ve značném množství lipolytické a proteolytické enzymy a proto rozkládá různé tukové a bílkovinné substráty. Geotrichum candidum je ukazatelem hygienické úrovně potravinářské výroby. Rovněž se objevuje ve splaškových odpadních vodách a proto má také označení splašková houba (KLABAN, 1996, GÖRNER, VALÍK, 2004). Geotrichum candidum (tabulka 32) bylo inokulováno do kravského mléka a tvarohu v množství cca 106 KTJ/ ml a do kozího mléka a tvarohu v množství řádově 104 KTJ/ ml. Výchozí počet ve všech substrátech byl o 1 řád nižší. Při srovnání všech substrátů při teplotě 6 °C došlo k výraznému snížení výchozího množství po zaočkovaní. U teplot 25 °C a 30 °C si Geotrichum candidum svoje množství udržovalo. 3. den kultivace při teplotě 6 °C bylo zjištěno množství v kravském tvarohu 3,5 . 103 KTJ/g a 9,09 . 102 KTJ/g v kozím tvarohu. Při teplotě 25 °C bylo množství této mikromycety v kravském tvarohu 1,29 . 106 KTJ/g a v kozím tvarohu 2,59 . 106 KTJ/g. Při teplotě 30 °C bylo množství bakterie v kravské tvarohu 1,44 . 106 KTJ/g a v kozím tvarohu 2,73 . 105 KTJ/g. Geotrichum candidum vyprodukovalo v kozím mléce při 30 °C 443,83 µl/l oxidu uhličitého, ale podobné hodnoty byly zaznamenány i v kravském a kozím mléce při 30 a 25 °C. V kravském tvarohu se hladina BA při 25 °C a 30 °C pohybovala okolo 360 mg/kg BA. Zato v kozím tvarohu byly hodnoty výrazně nižší a pohybovaly se v hodnotě do 104 mg/kg.

107

Tabulka 32: Růst mikromycety Geotrichum candidum a její v pasterovaném kravském a kozím mléce a tvarohu Geotrichum

Kultivace při 6 °C den

KTJ/ml

CO2 (µl/l)

Kultivace při 30 °C

Kozí

Kravské

Kozí

Kravské

Kozí

mléko

mléko

mléko

mléko

mléko

mléko

1

2,14 . 104

99

2,5 . 106

9,8 . 103

5 . 105

9,37 . 107

2

3,18 . 103

1,45 . 102

1,36 . 106

9,09 . 104

2,27 . 106

4,55 . 104

3

3,18 . 103

90

2,73 . 106

1,82 . 105

2,45 . 106

1,82 . 105

1

12,73

6,13

117,2

4,16

183,96

8,92

2

3,64

2,50

188,81

167,91

257,65

200

3

11,03

4,80

309,88

269,32

397,68

443,83

Kravský tvaroh

CO2 (µl/l)

Kultivace při 25 °C

Kravské

Kultivace při 6 °C

KTJ/g

produkce oxidu uhličitého

Kozí tvaroh

Kultivace při 25 °C

Kultivace při 30 °C

Kravský

Kozí

Kravský

Kozí

tvaroh

tvaroh

tvaroh

tvaroh

1

9,09 . 102

87

3,64 . 105

8,9 . 103

9,1 . 104

8,9 . 103

2

6,8 . 103

90

4,09 . 106

9,09 . 104

6,82 . 106

4,55 . 104

3

3,5 . 103

1,45 . 102

1,29 . 106

2,59 . 106

1,44 . 106

2,73 . 105

1

58,80

17,03

123,16

24,13

97,38

33,10

2

37,10

13,70

398,98

40,11

263,70

36,90

3

36,63

16,25

376,14

104,34

362,31

46,17

U Geotrichum candidum (graf 42, 43) bylo zjištěno největší množství putrescinu a to v kozím tvarohu v hodnotě 2,72 mg/kg při 30 °C. Dále byl nejvíce zastoupen v kravském tvarohu SPD a SPM při teplotě 30 °C v hodnotě 0,9 mg/kg a 0,64 mg/kg. Většina BA nebyla naměřena ve vyšší hodnotě než 0,5 mg/kg. TRY A HIS nebyl naměřen vůbec. A FEA byl naměřen jen v kozím tvarohu od 25 °C. Geotrichum candium patří k mikromycetám, které mohou produkovat putrescin a histamin (LINARES et al., 2012). Vyšší koncentraci PUT byla naměřena, ale produkce histaminu zjištěna nebyla.

108

TRY FEA

1

PUT

0,8

Množství BA 0,6 mg/kg 0,4

CAD

0,2

TYR

HIS

0

6°C

25°C

30°C

SPD SPM

Graf 42: Produkce BA mikromycetou Geotrichum candidum v kravském tvarohu TRY FEA 3

PUT

Množství BA 2 mg/kg 1

CAD HIS TYR

0

6°C

25°C

30°C

SPD SPM

Graf 43: Produkce BA mikromycetou Geotrichum candidum v kozím tvarohu

109

6 ZÁVĚR Z výsledků získaných při zpracování této disertační práce lze vyvodit následující závěry: V 1. části experimentů byla sledována dekarboxylázová aktivita u 4 druhů mikroorganismů

vyizolovaných z mléka a sýrů. U testovaných izolátů Escherichia coli byla zjištěna dekarboxylázová aktivita a to především pro tyrozin a ornitin, které dekarboxylovalo 22 z 24 testovaných kmenů, dále pro tryptofan, ten dekarboxylovalo 17 kmenů a fenylalanin byl dekarboxylován 17 kmenů, arginin dekarboxylaly jen 2 kmeny, histidin jen 1 a lyzin nebyl dekarboxylován vůbec. U testovaných izolátů Bacillus licheniformis byla zjištěna dekarboxylázová aktivita a to především pro tyrozin. Tyrozin dekarboxylovalo 19 ze 20 izolovaných kmenů, ornitin dekarboxylovalo 7 kmenů, tryptofan 6 kmenů, fenylalanin 5 kmenů a 1 kmen dekarboxyloval lysin a arginin. U histidinu nebyla dekarboxylace prokázána. U testovaných izolátů bakterie Bacillus byla prokázána dekarboxylázová aktivita především na tyrozin a ornitin, tyto aminokyseliny byly dekarboxylovány všemi testovanými kmeny. Lysin byl dekarboxylován 2 ze 4 kmenů a tryptofan 1 ze 4 kmenů. U argininu, fenylalaninu a histidinu nebyla dekarboxylace zjištěna. U

testovaných

izolátů

bakterie

Lactobacillus

byla

prokázána

nejsilnější

dekarboxylázová aktivita především na arginin. Co se týče kvantitativního hlediska arginin byl dekarboxylován 3 ze 13 testovaných kmenů, tyrozin 4 kmeny, lysin a ornitin jen 1 kmenem. U fenylalaninu, histidinu a tryptofanu nebyla zjištěna dekarboxylázová aktivita. U

testovaných

izolátů

bakterie

Enterococcus

byla

prokázána

nejsilnější

dekarboxylázová aktivita především pro arginin. Arginin dekarboxylovaly všechny testované kmeny a tyrozin dekarboxylovalo 8 z 9 testovaných kmenů. Na základě zjištěných výsledků lze odvodit závěr, že dekarboxylázová aktivita a tedy i možná tvorba BA je ovlivněna teplotou a dobou kultivace. Se vzrůstající teplotou a dobou kultivace se dekarboxylázová aktivita zvyšuje. Nejvyšší činnost dekarboxyláz byla zaznamenána při teplotě 30 a 37 °C. Naopak při teplotě 6 °C nebyla zjištěna dekarboxylázová aktivita u žádného z kmenů testovaných izolátů, tuto teplotu lze tedy považovat za vhodnou pro skladování. Námi používaná rychlá screeningovaná metoda může vést ke tvorbě falešně pozitivních výsledků, které mohou být způsobeny tím, že kultivované bakterie mohou produkovat látky s alkalickou reakcí (jiné než BA), čímž se mohou zrušit účinky testu, který je založen na barevné změně pH indikátoru. Z toho důvodu by měla být tvorba BA potvrzena

110

analytickými kvantitativními metodami. Přesto může být tato metoda využitelná v praxi pro rychlou a levnou predikci možné produkce biogenních aminů. V 2. části experimentů byla sledována produkce oxidu uhličitého a tvorba biogenních aminů kontaminujícími mikroorganismy v kravském a kozím tvarohu. Vyšší produkce biogenních aminů byla zjištěna v kozím tvarohu. I přesto zjištěná množství biogenních aminů byla velice nízká, většinou se pohybovala do 1 – 2 mg na kg tvarohu. Výjimkami byl pouze tyramin ( 4,98 mg/kg) v kravském tvarohu produkovaný bakterií Enterococcus faecium při 25 °C. Dále kadaverin (5,41 mg/kg) v kozím tvarohu produkovaný Escherichia coli a putrescin (2,72 mg/kg) v kozím tvarohu produkovaný Geotrichum candidum. Z výsledků je patrné, že se mikroorganismům v mléce dařilo lépe než v tvarohu a to z důvodu nižšího pH tvarohu způsobeného činností bakterií mléčného kvašení, jež byly použity na jeho výrobu. U obou druhů mléka je nárůst mikroorganismů podobný, přesto se však kozí mléko do jisté míry jeví jako lepší substrát pro rozvoj mikroorganismů. Je zřejmé, že se zvyšující se teplotou, se zvyšují také počty mikroorganismů a je tedy i vyšší produkce plynu, tento rozdíl je zvláště patrný mezi teplotami 6 a 25 °C resp. 30 °C, mezi teplotou 25 a 30 °C není rozdíl tak výrazný. Při srovnání produkce oxidu uhličitého, BA a počtů mikroorganismů u všech skupin inokulovaných mikroorganismů je jeho produkce diskutabilní. U některých bakterií produkce plynu kolísala a to bez ohledu na dynamiku růstu bakterií. Lze tedy do jisté míry uvažovat o určité hladině mikroorganismů, která je schopna produkovat jisté množství plynu bez ohledu na jejich úbytek nebo přírůstek. Nebo je také možné, že vliv na produkci oxidu uhličitého a biogenních aminů mohly mít i bakterie mléčného kvašení, které byly v tvarohu obsažené. Celkově ale nelze říci, že by produkce oxidu uhličitého byla v mléce a v tvarohu přímo úměrným ukazatelem množení mikroorganismů nebo tvorby biogenních aminů v tvarohu.

111

7 SUMMARY Biogenic amines are low molecular weight nitrogenous base derived substances in foodstuffs and food raw materials mostly decarboxylation of amino acids or amination and transamination of aldehydes and ketones. These organic bases may be formed action of native enzymes or activities of bacterial food decarboxylase (SILLA SANTOS, 1996; PALEOLOGOS et al., 2004; KOMPRDA, 2005). Positively dekarboxylyzing microorganisms may

be

part

of

the

natural

microflora

of

foods

or

may

be

present

as

a result of contamination during processing, manufacture or storage of foods. The aim of this study was to characterize bacteria with decarboxylase activity of selected strains of Escherichia coli, Bacillus, Lactobacillus and Enterococcus isolated from milk and dairy products. Also provide carbon dioxide production inoculated microorganisms Enterococcus faecium, Enterobacter aerogenes, Escherichia coli, Proteus vulgaris, Pseudomonas fluorescens and Geotrichum candidum in samples of cow's and goat's milk, and cow's and goat's curd. Furthermore, to detect the production of biogenic amines and CO2 production in microorganisms Enterococcus faecium, Enterobacter aerogenes, Escherichia coli, Proteus vulgaris, Pseudomonas fluorescens and Geotrichum candidum in cow's and goat's curd. Based on the results can be deduced conclusion that decarboxylase activity and thus possibly making the BA is influenced by the temperature and time of cultivation. With increasing temperature and time of incubation decarboxylase activity also increases. High decarboxylase activity was observed at 30 and 37 ° C. On the contrary, at 6 ° C decarboxylase activity was detected in any of the strains tested isolates, which can be regarded as the temperature suitable storage temperature. Our used screening rapid method may lead to the formation of false positive results, which may be caused by the cultured bacteria may produce a substance having an alkaline reaction (other than BA), which can cancel the effects of the test, which is based on the color change of the pH indicator. It should therefore be confirmed formation BA quantitative analytical methods.

112

8 LITERATURA ACTIS L. A., SMOOT J. C., BARANCIN C. E., FINDLAY R. H., 1999:Comparison of differential plating media and two chromatography techniques for the detection of histamine production in bacteria. In Journal of Microbiological Methods, 39, , s. 79-90.

ADAMS M.R., NOUT M.J.R, 2001: Toxic Nitrogen Compounds Produced during Processing: Biogenic amines, Ethyl Carbamides, Nitrosamines, Fermentation and Food Safety, Aspen Publisher, s. 119-140, ISBN 978-0-8342-1843-7

ANTILA P., ANTILA V., MATILLA J. et al, 1984: Determination of biogenic amines in finnish cheese using high performance chromatography, Biogenic amines in cheese, Milchwienssen- Schalft, 39, s. 81 – 89

ARENA M. E., FIOCCO D., MANCA DE NADRA M. C., PARDO I., SPANO G., 2007: Characterization of a Lactobacillus plantarum strain able to produce tyramine and partial cloning of a putative tyrosine decarboxylase gene. Curr. Microbiol.55, s. 205–210

ARENA M.E., MANCA DE NADRA M.C., 2001: Biogenic amine production by Lactobacillus, In Journal of Applied Microbiology, 90/2, s. 158-162

ARNOLD S.H., BROWN W.D., 1978: Histamine toxicity from fish products, In CHICHESTER C.O., MARK E.M, STEWART G.F., Advances Food Research, Vol 24, Academic Press, New York, s. 113-154

ASKAR A., TREPTOW H., 1986: Biogene Amine in Lebensmitteln, Verlag Eugen Ulmer,, Stuttgart Deutschland, s. 21-74, ISBN 38-00121328

BARBOSA-CÁNOVAS G. V., FONTANA J. A., SCHMIDT S. J., LABUZA T. P., 2007: Water aktivity in Foods: Fundamentals and Application, s.440, ISBN 978-0-8138-2408-6

113

BARDÓCZ S., GRANT G., BROWN D. S., RALPH A., PUSZTAI A., 1996: Polyamines in food – implications for growth and health, Journal of Nutritional Biochemistry,4, s. 66 - 71

BARTL V., 2001: Vodní aktivita, Maso, 1, s. 30-32

BARTL V., ERBAN V., HARING J., NEUŽILOVÁ J., 2003: Vodní aktivita a kvalita potravin, Kvalita potravin, 2, s. 10-13

BERESFORD T.P, FITZSIMONS N.A., BRENNAN N.L., COGAN T.M., 2001: Recent advancens in cheese mikrobiology, International Dairy Journal, 11, s. 259-274

BOVER – CID S., MIGUÉLEZ-ARRIZADO M.J., BECKER B., HOLZAPFEL W.H., VIDAL-CAROU M.C., 2008, Amino acid decarboxylation by Lactobacillus CTC273 affected by the pH and glukose availabilitym Food Microbiology 25, s. 269-277

BOVER – CID S., IZQUIERDO-PULIDO M., VIDAL-CAROU M.C.,2000: Influence of hygienic duality of raw materiál on biogenic amine production dutiny ripening and storage of dry fermented sausages, Journal of Food Protection, 63, s. 1556 – 1562

BOVER-CID S., HOLZAPFEL H.W., 1999: Improved screening procedur for biogenic amine production by lactic acid bacteria, International Journal of Food Microbiology, 53,s. 33-41

BRING B., DAMINK C., JOOSTEN H.M..L.J. et al., 1990: Occurence and formation of biologically aktive amines in foods, International Journal of Food Microbiology,11, s.73 – 84

BUŇKOVÁ L., BUŇKA F., POLLAKOVA E., PODEŠVOVÁ T., DRÁB V., 2011: The effects of lactose, NaCl and an aero/anaerobic enviroment on the tyrosine decarboxylase aktivity of Lactococcus lactis subsp cremoris and Lactococcus lactis subsp lactis. International Journal of Food Microbiology, 147/2, s. 112-119

BUŇKOVÁ L., BUŇKA F., MANTLOVÁ G., ČABLOVÁ A., SEDLÁČEK I., ŠVEC P., PACHLOVÁ V., KRÁČMAR S., 2010: Distribuce biogenních aminů během zrání přírodních sýrů eidamského typu a identifikace jejich původců, celostátní přehlídky sýrů 2010 114

BUŇKOVÁ L., BUŇKA F., HLOBILOVÁ M., VAŇÁTKOVÁ Z., NOVÁKOVÁ D., DRÁB V., 2009: Tyramine production of technological important strains of Lactobacillus, Lactococcus and Streptococcus, Evropan Food Research and Technology, 229, s. 533-538

BURDOVÁ O., BARANOVÁ M., 2005: Vplyv technologicky nežaidúcej mikroflóry na kvalitu mlieka a mliečnych výrobkov, Mliekarstvo, 36/2, s.18-21

BURDYCHOVA R., KOMPRDA T., 2007: Biogenic amine-forming microbial communities in cheese. FEMS Microbiol. Lett, 276, s.149–155

LADERO V., SÁNCHEZ-LLANA E., FERNÁNDEZ M., ÁLVAREZ M. A., 2011: Survival of biogenic amine-producing dairy LAB strains at pasteurisation conditions. Int. J,46, s.516– 521

CELANO G. V., CAFARCHIA C, TIECCO G., 1996: Formantion of biogenic amines in Pecorino Pugliese cheese, Ind Aliment, 35, s. 249 – 252

CELANO G. V., CAFARCHIA C., BUJA F., TIECCO G.,1992: Ricerca di amine biogene in alcuni formaggi. Ind. Aliment.31, s. 764–768

CEMPÍRKOVÁ E., LUKÁŠOVÁ J., HEJLOVÁ Š., 1997: Mikrobiologie potravin, Skriptum Jihočeská univerzita, České Budějovice, , s. 99-107

CORUZZI G., MORINI G., ADAMI M. GRANDI D., 2001: Role of histamine H3 receptors in theregulation of gastic functions, Journal of Physiology and Pharmacology, 52, p. 539-553

ČANIGOVÁ M., 1998: Vplyv psychrotrofnej mikroflóry na výrobu syrov, Mliekárstvo, 29/1, s. 29-30

ČERNOHORSKÁ L., 2003: Ostatní grampozitivní koky katalasapozitivní, In Votava M. a kol., Lékařská mikrobiologie speciální, Neptun Brno, s.129-133, ISBN: 80-902896-6-5 115

ČERNÝ V., KVASNIČKOVÁ E., HAVLÍKOVÁ Š., KALHOTKA L., 2009: Výskyt mikroorganismů s dekarboxylázovou aktivitou v sýrech, Mlékařské listy, 116, s. 16 – 18

DABROWSKI W.M., SIKORSKI Z.E., 2005: Toxins in food, FL:CRC Press, Boca Raton, s. 355, ISBN 08-493-1904-8

DAPKEVICIUS M.L.N.E, NOUT M.J.R., ROMBOUTS F.M., HOUBEN J.H., WYMENGA W., 2000: Biogenic amine formation and degradation by potential fish silane starter microorganisms, Int J Food Microbiol., 57/1-2, s. 107-14

DE JONGHE V., COOREVITS A., DE BLOCK J., VAN COILLIE E., GRIJSPEERDT K., HERMAN L., DE VOS A., HEYNDRICKX, M., 2010: Toxinogenic and spoilage potential of aerobic spore-formers isolated from raw milk, Int. J. Food Microbiol. 136, s. 318 – 325

DE PALENCIA P.F., FERNÁNDEZ M., MOHEDANO M.L., LADERO V., QUEVEDO C., ALVAREZ M.A., LOPÉZ P., 2011: Role of Tyramine Synthesi by Food-Borne Enterococcus durans in Adaptation to the Gastrointestinal Tract Environment, Appl Environ Microbiol, 77/2, s. 699-702

DE VOS P., GEORGE M. GARRITY, DOROTHY JONES, NOEL R. KRIEG, WOLFGANG LUDWIG, FRED A. RAINEY, KARL-HEINZ SCHLEIFER AND WILLIAM B. WHITMAN, 2009: BERGEY'S MANUAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY, second edition, Volume Two the Firmicutes, ISBN:978-0-387-95041-9 DUCKOVÁ V., ČANIGOVÁ M., 2004: Psychrotrofná mikroflóra mlieka, Mliekarstvo, 35/3, s.32-35

DUCKOVÁ V., ČANIGOVÁ M., KROČKO M., 2008: Enterokoky v potravinách živočišného původu, Mliekarstvo, 38/4, s. 26-28

116

ERBAN V., ČERNÝ V., 1999: Hygienické aspekty dojícího procesu z pohledu doplňkových mikrobiologických znaků a v kontextu možných budoucích požadavků EU, Mlékařské listy, 51, s.9-12

FARRAR W.E., REBOLI A.C., 2006: The genus Bacillus - medical. In book Dworkin, M., Falkow, S., Rosenberg, E., Schleifer, K. (Eds.): The Prokaryotes, A handbook of the biology of bacteria, Vol. 4, Bacteria: Firmicutes, Cyanobacteria, s. 609 - 631. Springer Science + Business Media, LLC, New York, USA. ISBN 978-0387-25494-4

FERNANDÉZ M., LINARES D.M., DEL RIO B., ÁLVAREZ M.A., 2007: HPLC quantification of biogenic amines in cheeses:correlation with PCR-detection of tyramineproducing microorganisms, J. Dairy Res., 74, s. 276-282

FERNANDES R., 2009: Microbiology handbook dairy products, Leatherhead Food International ltd, ISBN 978-1-905224-62-3 FERNANDÉZ- GARCÍA E., TOMILLO J., NUNEZ M., 2000: Formation of biogenic amines in raw milk Hispánico cheese manufactured with proteinases and different levels of starter culture, Journal of Food Protection, 63, s. 1551-1555 FIŠEROVÁ, H., HRADILÍK, J., 1994: Produkce etylénu a etanu při tvorbě adventivních kořenů na stonkových segmentech révy vinné. (Ethylene and ethane production during adventitious root formation on vine stem segments), Rostlinná výroba, 40: s.755 – 762. FIŠEROVÁ, H., KULA, E., KLEMŠ, M., REINÖHL, V., 2001: Phytohormones as indicators of the degree of damage in birch. Biológia 56/4: s. 405-409. FIŠEROVÁ, H., MIKUŠOVÁ, Z., KLEMŠ, M., 2008: Estimation of ethylene production and 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid content in plants by means. Plant, Soil and Environment : Rostlinná výroba 54/2, s. 55-60. ISSN 1214-1178 FONTECHA J.,PELÁEZ C., JUÁREZ M., REQUENA T., GÓMEZ C., 1990: Biochemical and microbiological characteristic of Artisanal hard goat´s cheese, Journal of dairy Science, 73, s. 1150-1157 FRANK J.P., 2001: Milk and Dairy products. In Doyle M.P. et al, Food Microbiology: fundamentals and frontiers, ASM Press Washington, ISBN 1-55581-208-2 117

FRANZ CH.M.P.A., STILES M.E., SCHLEIFER K.H., HOLZAPFEL W.H., 2003: Enterococci in food a conundrum for food safety, Journal of Food Microbiology 88, s. 105122. GALGANO F., CARUSO M., CONDELLI N, FAVATI F., 2012: Focused Review: Agmatine in Fermentef Foods, Front Microbiol. 3, s.199

GALGANO F., SUZII G., FAVATI F., CARUSO M., MARTUSCELLI M., GARDINI F., SALZANO G., 2001: Biogenic amines durong in Semicotto Caprino cheese: role of enterococci, International Journal of Food Science and Technology, 64, s. 105-107

GARDINI F., BOVER-CID S., TOFALO R., BELLETTI N., GATTO V., SUZZI G., TORRIANI S., 2008: Modeling the aminogenic potential of Enterococus faecalis EF37 in dry fermented sausages trhrough chemical and molekula approaches, Appl Environ Microbial, 74/9, s. 2740-2750

GARDINI F., MARTUSCELLI M., CARUSO M.C., GALGANO F., CRUDELE M.A., FAVATI F, GUERZONI E., SUZZI G., 2001: Effects of pH, temperature and NaCl concentration on the growth kinetics, proteolytic activity and biogenic amine production of Enterococcus faecalis, In International Journal of Food Microbiology 64/1-2, s. 105-117

GARG S.K., MITAL B.K., 1991: Enterococci in milk and milk products, Critical Rewiews in Microbiology 18, s.15-45

GIRAFFA G., PEPE G., LOCCI F., NEVIANI E., CARMINATI D., 1995: Haemolytic activity, production of thermonuclease and biogenic amines by dairy enterococci, Ital. J. Food Sci.7, s. 339–347.

GÖRNER F, VALÍK L´., 2004: Aplikovaná mikrobiológia poživatin, MALÉ CENTRUM, Bratislava, s. 528, ISBN: 80-967064-9-7

GRIFFITHS M.W., 2009: Food safety issues and the microbiology of milk and dairy products, In Heredita N., Wasley I., García S. Microbiologically Safe foods, WileyHoboken, New Persey, ISBN 978-0-470-0533-1 118

GREIF G., GREIFOVÁ M., 2006: Študium analýzy biogénnych amínov vybraných mliečnych výrobkov, Mliekarstvo, 37/2, s. 38 – 42

GREIFOVÁ M., GREIF G., NOVOROĽNÍKOVÁ B., KUBOVÁ A., 2003: Biogenní amíny v mliečnych výrobkov a ich tvorba enterokokami, Mliekarstvo 34/4, s. 31-33

GREIF G., GREIFOVÁ M., 1998: Výskyt biogénnych amínov v mliečnych produktech, Mliekarstvo, 29/3, s. 33-36

GREIFOVÁ M., GREIF G., KUKUROVÁ I., KAROVIČOVÁ J., KOHAJDOVÁ Z., 2003: Vplyv modelových podmienok na rast a produkci biogéných amínov mliekarensky významnými mikroorganismami, Celostátní přehlídka sýrů, s. 134- 138

GREIF G., GREIFOVÁ M., 2004: Vplyv teploty na dynamiku rastu a produkci zmíniv Escherichia coli, Mliekarstvo, 35/2, s.15-18

GREIF G., GREIFOVÁ M., DVORAN J., KAROVIČOVÁ J., BUCHTOVÁ V., 1999: Štúdium rastu a produkcie biogénnych aminóv nektorými mikroorganizmami za modelových podmínek, Czech Journal of Food Science,17, s. 15-21

GRIEGR C., HOLEC J., 1990 : Hygiena mlieka a mliečných výrobkov, Bratislava: Príroda, s. 39-49, ISBN 80- 07- 00253- 7 GUIFFRIDA D., ZIINO M., VERNERA A., CONDURSO C., ROMEO V., 2006: Biogenic amines in the typice Pasta Filata Italian cheese. Acta Alimentaria, 35/4, s. 435-443 HALÁSZ A., BARÁTH A, SIMON-SAKARDI L., HOLZAPFEL W.,1994: Biogenic amines and thein production by microorganisms in food, Trend Foods Sci.Technol, 5, s. 42-48 HASSAÏNE O., ZADI-KAMAR H., KARAM N., 2009: Evaluation of biogenic amines formation by proteolytic enterococci strains isolatér from raw dromedary milk from southern alergia, Journal of Food Safety, 29, s. 381-393 HAYES M. C., BOOR K., 2001: Raw Milk and fluid milk products. In. Marth E.H., Steele J.L., Applied Dairy Microbiolgy. New York, s. 744, ISBN 0-8247-0536- X, 119

Heredia N., Wesley I., García S., 2009: Microbiologically safe Foods, by John Wiley and Sons, s. 19-159

HRUBÝ S., ŠPELINA V., TUREK B., 1994: Ryby – ochranné faktory a rizika, Hygiena 39/4, s. 352 - 357 HUNGERFORD J.M., 2010: Scombroid poisoning, A review, Toxicon, 56, s. 231-243

CHAVES-LÓPEZ C., SERIO A., MARTUSCELLI M., PAPARELLA A., OSORIO E., SUZZI G., 2011: Microbiological characteristics of Kumis, a traditional fermented Colombian milk, with particular emphasis on enterococci population. Food Microbiol.,28, s.1041–1047

CHEN L., COOLBEAR T., DANIEL R. M., 2004: Characteristics of proteinases and lipases produced by seven Bacillus sp. isolated from milk powder production lines. Int. Dairy J., 14, s. 495 - 504. INNOCENTE N., BIASUTTI M., PADOVESE M., MORET S., 2009: Determination of biogennis amines in cheese using HPLC technice and direct derivatization of acid extarct, Food Chemistry,101, s.1285-1289

JAY J.M., LOESSNER M.J., GOLDEN D.A., 2005: Modern food microbiology, New York, s. 790, ISBN 0-387-23180-3

JONES S.M., YERLY J., HU Y., CERI H., MARTINUZZI R., 2007: Structure of Proteus mirabilis biofilms grown in artificial urine and standart laboratoř media, FEMS Microbiological Letters, 268, s. 16-21

JOHNSON S., 2009: Recurren Clostridium difficile infection: a of risk factors, treatments and cutcomes, Journal of infection, 58, p. 403-410

JUNEJA V.K, SOFOS J.N., 2010: Pathogens and toxins in foods: challenges and interventions, DC: ASM Press, Washington, s.512, ISBN 978-155-5814-595

120

KALAČ P., GLÓRIA M.B.A., 2009: Biogenic amines in cheeses, wines, burs and sauerkraut, in DANDRIFOSSE G.: Biological aspects of Biogenic amines, polyamines and conjugates, s. 267-309, ISBN: 978-81-7895-249-9

KALAČ P., KŘÍŽEK M., 2005: Biogenní aminy a polyaminy v potravinách a jejich vliv na lidské zdraví, Potravinářská revue, 2, s. 40-42

KALAČ P., KŘÍŽEK M., 2002: Biogenní aminy a polyaminy v potravinách, Výživa a potraviny, 1, s.12-13

KALAČ P., KŘÍŽEK M., 1998: Biogenní aminy v potravinách a jejich role ve výživě, Czech Journal of Food Science, 16, s. 151 – 159

KALHOTKA L., 2007: Mikrobiální aspekty tvorby biogenních aminů, disertační práce, Mendelova univerzita v Brně

KALHOTKA L., NĚMCOVÁ M., VYLETĚLOVÁ M., HAVLÍKOVÁ Š., 2011: Dekarboxylasová aktivita Bacillus licheniformis a její ovlivnění teplotou a dobou kultivace, Mlékařské listy, 124, s. 8-11

KAMENÍK J., 2007: Technologie fermentovaných trvanlivých salámů z pohledu prevence vad finálních produktů, Maso, 18/3, s. 12-14

KATZUNG B. G., 1994: Základní a klinická farmakologie, Jinočany: Nakladatelství a vydavatelství H & H, s. 1072, ISBN 80-85787-35-0

KING W., MCCARAG L., JONEJA J.M. IBARR S., 2000: Benefits of histamine-reducing diet for some patiens with chronic urticaria and angiodema, Canadian Journal of Dietetic Practice And Research, 1, s.24-26 KLABAN V., 2001: Svět mikrobů. Gaudeamus Univerzita Hradec Králová, s. 416, ISBN 80-7041-687- 4

121

KOMPRDA T., 2005: Biogenní aminy a polyaminy ve fermentovaných potravinách živočišného původu, Veterinářství , 10, s. 646-649

KOMPRDA T, DOHNAL V., ZÁVODNÍKOVÁ R., 2008: Contents of some biologically active amines in a Czech blue-vein cheese, Journal of Food Science, 26/6, s. 428-440

KRAJNACOVÁ P, 2011: Analýza biogenních aminů v sýrech infračervenou a ramanovou spektrometrií, diplomová práce,Univerzita Palackého v Olomouci

KŘÍŽEK M., KALAČ P., 1998: Biogenní aminy a polyaminy v potravinách a jejich role ve výživě, Czech Journal of Food Science, 15/4, s. 151-159

LADERO V., CALLES M., FERNÁNDEZ M., ALVAREZ A.M., 2010: Toxicological effects of dietary biogenic amines, Current Nutrition and Food Science ,6/2, s.145-156

LAFETO V., SÁNCHES- LIANA E., FERNÁNDEZ M., ALVAREZ M., 2001: Survival of biogenic amine – producing dairy LAB strains at pasteurisation conditions, International Journal of Food science and Technology, 46, s. 516-521

LANCIOTTI R., PATRIGNANI F., IUCCI L., GUERZONI M.E., SUZZI G., BELLETTI N., GARDINI F., 2007: Effects of milk high pressure homogenization on biogenic amine accumulation during ripening of ovine and bovine Italian cheeses, Food Chemistry, 104/2, s. 693-701

LANDENTE J.M., FERRER S., PARDO I., 2007: Biogenic amine production by lactic acid bakteria, acetin bakteria and yeast isolatér from wine, Food control., 18, s. 1569-1574

LAVIZZARI, T; BRECCIA, M; BOVER-CID, S; VIDAL-CAUROU, M C; VECIANA-NOGUÉS M T., 2010: Histamine, cadaverine, and putrescine produced in vitro by enterobacteriaceae and pseudomonadaceae isolated from spinach., Journal of Food Protection, Feb; 73/2, s. 385-9

122

LAWLEY R., CURTIS L., DAVIS J., 2008: The Food Safety Hazard Guidebook, Royal society of Chemistry, s. 442

LEUSCHNER R.G. K., HEIDEL M., HAMMES W.P., 1998a: Histamine and tyramine degradation by food

fermenting microorganisms, International Journal of Food

Microbiology, 39, s. 1-10 LEUSCHNER R.G.K, HAMMES W.P., 1998b: Tyramine degradation by micrococci during ripening of fermented sausage, Meat Sci., 49/3, s. 289-96

LEUSCHNER R.G.K, KURIHARA R., HAMMES W.P., 1998: Effects of enhanced proteolysis on formativ of biogenic amines by lactobacilli during Gouda cheese ripening, International Journal of Food Microbiology, 44, s.15-20

LINARES D.M., RÍO B.D., LADERO V., MARTÍNEZ N., FERNÁNDEZ M., MARTÍN M.C., ÁLVAREZ M.A., 2012: Factors Influencing Biogenic Amines Accumulation in Dairy Products, Front Microbiol., 3,180

LYTE M.: The biogenic amine tyramine modulates the adherence of Escherichia coli O157:H7 to intestinal mucosa, Journal of Food protection, 2004/67, s. 878-883

LOGAN N.A., DE VOS P., 2009: Genus I BAcillus, In de Vos et al, Bergey s Manual of Systematic Bakteriology, Vol. Three The Firmicutes, Springer, ISBN 978-03-387-95041-9

MAIJALA R. L., 1993: Formation of histamine and tyramine by some lactic acid bacteria in MRS-broth and modified decarboxylation agarp, In Letters in Applied Microbiology, 17, s. 40-43

MAINTZ L., NOWAK N., 2007: Histamine and histamine intolerance, American Journal of clinical Nutrition, 85, s. 1185-1196

MARCOBAL A., MARTIN-ALVAREZ P. J., MORENO-ARRIBAS M. V., MUÑOZ R., 2006: A multifactorial design for studying factors influencing growth and tyramine

123

production of the lactic acid bacteria Lactobacillus brevis CECT 4669 and Enterococcus faecium BIFI-58. Res. Microbiol.157, s. 417–424

MARINO M., MAIFRENI M., MORET S., RONDININI G., 2000: The capacity of Enterobacteriaceae species tu produces biogenic amines in cheese, Letters in Appl, Microbiology, 31, s. 169-173

MARINO M., MAIFRENI M., RONDINI G., 2003: Microbiological characterization of artisanal Montasio cheese, analysis of its indigenous lactic acid bakteria, Microbiol.Lett., 229, s. 133-140

MARINO M., MAIFRENI I., BARTOLOMEOLI I., RONDINI G., 2008: Evaluation of amino acid-decarboxylative microbiota throughout the ripening of an Italian PDO cheese produced using Different manufacturing practices, Journal of Applied Microbiology, 105/2, s.540-549

MARTUSCELLI M., GARDINI F., TORRIANI S., MASTROCOLA D., SERIO A, CHAVEZ-LÓPEZ C., SCHIRONE M., SUZZI G., 2005: Production of biogenic amines during ripening of Pecorino Abruzzese cheese, International Dairy Journal, 15, s.571-578

MERCOGLIANO R., DE FELICE A., CHIROLLO C., CORTESI M.L., 2010: Production of vasoactive amines during the ripening of Pecorino Carmascino cheese, Veterinary Research Communications, 34/1, s. 175-178

NAILA A., FLINT S., FLETCHER G., BREMER P., MEERDINK G.,2010: Control of biogenic amines in food-Existing and Emerging Approaches, J. Food Sci., 75/7, s.139-150

NĚMEČKOVÁ I., HANUŠOVÁ J., BUŃKA F., ROUBAL P., 2010: Nežádoucí enzymové aktivity B.cereus a B. licheniformis v mléce, Mlékařské listy, 123, s.10-13

NĚMEČKOVÁ

I.,

ROUBAL

P.,

PECHAČOVÁ

M.,

VYLETĚLOVÁ

M.,

NEJESCHLEBOVÁ L., 2006.: Výskyt Bacilu cereus a Bacillus licheniformis ve vybraných mlékárenských technologiích, Mlékařské listy, 99, s. 23 – 27 124

NOVELLA- RODRÍGUEZ S., VECIANA- NOGUÉS M.T., ROIG- SAGUÉS A.X., TRUJILLO-MESA A.J., VIDAL-CAROU M.C., 2004: Evaluation of biogenic amines and microbial counts throughout the ripening of goat cheese from pasteurized and raw milk, The journal of Dairy Research, 71/2, s. 245-252

NOVELLA- RODRÍGUEZ S., VECIANA-NOGUÉS M.T., IZQUIERDO-PULIDO M., VIDAL-CAROU M.C., 2003: Distribution of Biogenic Amines and Polyamines in Cheese, Journal of Food Science, 68, s.750-755

NOVELLA-RODRÍGUEZ S., VECIANA-NOGUÉS M. T., VIDAL-CAROU M. C., 2002: Effects of high hydrostatic pressure treatments on biogenic amine kontent in goat cheese dutiny ripening, J. Agric Food Chem., 50/25, s. 7288-92

NOVELLA-RODRÍGUEZ S., VECIANA-NOGUÉS M. T., VIDAL-CAROU M. C., 2000: Biogenic amines and polyamines in milks and cheeses by ion-pair high performance liquid chromatography. J. Agric. Food Chem.,48, s. 5117–5123

ONDROVČÍK P., 2003: Gramnegativní nefermentující bakterie, In Votava M. a kol., Lékařská mikrobiologie speciální, Neptun Brno, s.129-133, ISBN: 80-902896-6-5

ÖZDESTAN Ö., ÜREN A., 2010: Biogenic amine content of kefir: a fermented dairy product, Eur. Food Res. Technol., 231, s.101–107

PALEOLOGOS E.K. AND KONTOMINAS M.G., 2004: On-line solid-phase extraction with surfactant accelerated non-column derivatization and micellar liquid chromatographic separation as a tool for the determination of biogenic amines in various food substrates, Analytic Chemistry, 76, s. 1289-1294 PALLERONI N. J., 2005: Pseudomonas, In D. J. BRENNER et al. BERGEY'S MANUAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY, second edition, Volume Two the Proteobacteri, 2005 SPRINGER, ISBN 13: 978-0387-24144-9, s. 323-365

125

PINHO O., FERREIRA I.M.P.L.V.O., MENDES E., OLIVIEIRA B., FERREIRA M., 2001: Effects of temperature on evolution of free amino acid and biogenic amine contents during storage of Azeitão cheese, Food Chemistry, 75, s. 287-291

PREMONT

R.T., GAINETDINOV R.R., CARON M.G., 2001: Following the trace of

elusive amines. Proceeding of the National Academy of Sciens of United States of America, 98, s. 9474-9475

PROCHÁZKA S., MACHÁČKOVÁ I., KREKULE J., ŠEBÁNEK J. et al., 1998: Fyziologie rostlin, Academia Praha, s. 484, ISBN: 80- 200- 0586- 2

RAO T.S.S, YERAGANI V.K., 2009: Hypertensive crisis and cheese, Indian J Psychiatry, 51/1, s. 65-66

PROKEŠ J., FIŠEROVÁ H., HELÁNOVÁ A., HARTMANN J, 2006: Význam oxidu uhličitého a ethylenu v procesu sladování, Kvasný Prum., 52, 11-12, s. 349-352, ISSN 00235830 REA M., FRANZ C., HOLZAPFEL W. COGAN T., 2004: Development of enterococci and production of tyramine the manufacture and ripening of Cheddar cheese, Irish Journal of Agricultural and Food Research, 43, s. 247-258

ROIG-SAGUÉS A.X., MOLINA A.P., HERNÁNDEZ-HERRERO M.M., 2002: Histamine and tyramine-forming microorganisms in Spanish traditional cheeses. Europian Food and Research Technology, 215, s. 96-100

ROIG-SAGUÉS A. X., HERNÀNDEZ-HERRERO M. M., LÓPEZ-SABATER E. I., RODRÍGUEZ-JEREZ J. J., MORA-VENTURA M. T., 1997: Evaluation of three decarboxylating agar media to detect histamine and tyramine-producing bacteria in ripened sausages, In Letters in Applied Microbiology, roč. 25, s. 309-312

ROBINSON R., ROBINSON R., 2005: Dairy microbiology handbook, 3 rd ed. New York: Wiley Interscience, s. 765, ISBN 97-80471723950 126

RUSSO P., SPANO G., ARENA M.P., CAPOZZI V., FIOCCO D., GRIECO F.,BENEDUCE L., 2010: Are consumers aware of the risk related to biogenic amines food? In, MÉNDEZ.VILAS A.: Current Research, Technology and Education Topics in Applied Microbiology and Microbial Biotechnology,Vol 2, Formatex, s. 1087-1095 ISBN: 13:978-84614-6195-0

RŮŽIČKA F., 2003: Grampozitivní sporulující aerobní tyčinky, In VOTAVA M. a kol., Lékařská mikrobiologie speciální, Neptun Brno, s.129-133, ISBN: 80-902896-6-5

SARANTINOPOULOS P., ANDRIGHETTO CH., GEORGALAKI M.D., REA M.C., LOMBARDI A., COGAN T.M., KALANTZOPOULOS G., TSAKALIDOU E., 2001: Biochemical properties of enterococcus relevant to thein technological performance, International Dairy Journal, 11, s. 621-647

SEDLÁČEK I., 2007: Taxonomie prokaryot, Masarykova univerzita, Brno, ISBN: 80-2104207-9

SHAH P., SWIATLO E., 2008: A multifaceted role for polyamines in bacterial pathogens, Molecular Microbiology, 68, s. 4-16

SHALABY A.R., 1996:Significance of biogenic amines to food safety and human nutrition, Food Research International, 29, s.675-690

SHIRONE M., TOFALO R., VISCIANO P., CORSETTI A., SUZZI G., 2012: Biogenic amines in Italián Pecorino Cheese, Fron Microbiol., 3/171

SILLA-SANTOS, M.H., 2001: Toxic Nitrogen Compounds Produced Dutiny Processing: Biogenic Amines, Ethyl Carbamides, Nitrosamines, In ADAMS R.M.,NOUT R.J.M.,: Fermentation and food safety, An Aspen publication, s. 312, ISBN: 0-8342-1843-7

SILLA SANTOS M.H., 1996: Biogenis amines: thein importace in foods, Journal of Food science, 29, s. 213 – 231 127

SOUCI S. W., FACHMANN W., KRAUT H., 2000: Food Composition and Nutrition Tables. Stuttgart: Medpharm GmbH Scientific Publisher

SPANO G., RUSSO P., LONVAUD-FUNEL A., LUCAS P., ALEXANDRE H., GRANDVALET C., COTON E., COTON M., BARNAVON L., BACH B., RATTRAY F., BUNTE A., MAGNI C., LADERO V., ALVAREZ M., FERNÁNDEZ M., LOPEZ P., DE PALENCIA P. F., CORBI A., TRIP H., LOLKEMA J. S., 2010: Biogenic amines in fermented foods. Eur. J. Clin. Nutr.,64, s. 95–100

STRATTON J. E., HUTKINS R. W., TAILOR S.L., 1991: Biogenic amine in cheese and other fermented food, Journal of Food Protection, 54, s. 460-470

STRAUB B. W., TICHACZEK P. S., KICHERER M., HAMMES W. P.,1994: Formation of tyramine by Lactobacillus curvatus LTH972. Z. Lebensm. Unters. Forsch.199, s. 9–12.

STANDAROVÁ E., VORLOVÁ L., BORKOVCOVÁ I., 2009: Zastoupení vybraných biogenních aminů v sýrech s bílou plísní na povrchu, Acta fytotechnica et zootechnicaMimoriadne číslo, Nitra, Slovacia Universitas Agriculture Nitriae, s.610-617

STANDAROVÁ E., BORKOVCOVÁ I., VORLOVÁ L., 2008: Obsah biogenních aminů v sýrech z české obchodní sítě, Veterinářství, 58/11, s. 735 – 738, ISSN: 05068231

SUMMER S.S., SPECKHARD H.W., SOMERS E.B., TAYLOR S.L., 1985: Isolation of histamine-producing Lactobacillus buchneri from Swis cheese implicated in a food poisoning outbreak, Applied and Environmental Mikrobiology, 50, s. 1094-1096

SUZZI G., GARDINI F., 2003: Biogenic amines in dry fermented sausages: a review, International Journal of Food Microbiology, s. 41-54

ŠILHÁNKOVÁ L., 2008: Mikrobiologie pro potravináře a biotechnology, Academia, Praha, s.363, ISBN: 978-80-200-1703-1

128

ŠVEC, P., DEVRIESE, L. A., 2009: Genus I. Enterococcus, s. 594 – 607. In: WHITMAN, W. B., (eds.) Bergeys Manual of Systematic Bacteriology vol. three. Springer, NY USA, 1450 s.

TSAI Y.H., KUNG H.F., CHANG S.C., LEE T.M., WEI C.I., 2006: Histamine formativ by histamine- forming bacterian Douchi a Chinese traditional fermented soybean products, Food Chemistry, 103, s. 1305-1311

VALSAMAKI K., MICHAELIDOU A., POLYCHRONIADOU A., 2000: Biogenic amine production in Feta cheese, Food Chemistry, 71, s. 259-266

VALLENZUELA A.S., OMAR N.B., ABRIOUEL H., LÓPEZ R.L., VELJOVIC K., CANAMERO M.M., TOPISIROVIC M.K.K, GÁLVEZ A., 2009: Virulence factors, antiniotic resistence and bacteriocinic in enterococci from artisan foods of animal origin, Food Control, 20, s. 381-385

VELÍŠEK J. et al., 2002: Chemie potravin – III., OSSIS, Tábor, ISBN: 80-86659-02-X

VINCI G., ANTONELLI M. L., 2002: Biogenic amines: Duality index of freshness in red and white meat, Food Control ,13, s. 519 – 524

WALSTRA P., WOUTERS J.T., GEURTS T., 2006: Dairy science and technology, Boca Raton, s.782, ISBN 08-247-2763-0

WESTFALL T.C., WESTAFALL D.P., 2006: Adrenergic agonists and antagonists, In: BRUNTON L.L., LAZO J.S., PARKER K.L., BUXTON I.L.O., BLUMENTHAL D.: Goodman &Gilamn´s The Pharmacological Basis of Therapeutics. 11th ed. New York, Mc Grave Hill, s. 237-295

WOUTERS J. T. M., AYAD E. H. E., HUGENHOLTZ J., SMIT G., 2002, Microbes from raw milk for fermented dairy products, Int. Dairy J.,12, s.91–99. ZAHRADNÍČEK O., 2003: Gramnegativní fakultativně anaerobní tyčinky, In VOTAVA M. a kol., Lékařská mikrobiologie speciální, Neptun Brno, s.129-133, ISBN: 80-902896-6-5 129

ZHAO S., HUANG Y., SHI M., LIU Y.M., 2009: Quantification of biogenic amines by microchip electrophoresis with chemiluminiscence detection, J Chromatogr A.m, 1216/26, s. 5155-5159

130

SEZNAM ZKRATEK BA

Biogenní aminy

PA

Polyaminy

Arg

Arginin

Orn

Ornitin

Lys

Lyzin

Fea

Fenylalanin

Tyr

Tyrozin

His

Histidin

Try

Tryptofan

PUT

Putrescin

AGM

Agmatin

HIS

Histamin

TYR

Tyramin

TRY

Tryptamin

FEA

2-fenylathylamin

SPM

Spermin

SPD

Spermidin

CAD

Kadaverin

HMT

Histaminmetyltransferáza

MAO

Monoaminooxidasa

DAO

Diaminooxidasa

BMK

Bakterie mléčného kvašení

CPM

Celkový počet mikroorgasnimů

CCM

Česká sbírka mikroorganismů

Ldc

Lyzindekarboxyláza

Adc

Arginindekarboxyláza

Odc

Ornitindekarboxyláza

Fdc

Fenyalanindekarboxyláza

Hdc

Histidindekarboxyláza

Tdc

Tyrozindekarboxyláza

Trdc

Tryptofandekarboxyláza

131

SEZNAM TABULEK Tabulka 1: Rody BMK, jejich fermentační typ a produkty (GÖRNER, VALÍK, 2004)…...18 Tabulka 2: Skupina I obligátně homofermentativní (GÖRNER, VALÍK, 2004)…………..19 Tabulka 3: Skupina II fakultativně heterofermentativní (GÖRNER, VALÍK, 2004)……….20 Tabulka 4: Skupina III. Obligátně heterofermentativní (GÖRNER, VALÍK, 2004)………..20 Tabulka 5: Rozdělení biogenních aminů (KALAČ, KŘÍŽEK, 1998)……………………….25 Tabulka 6: Minimální hodnoty aw pro růst mikroorganismů (GÖRNER, VALÍK, 2004)…..28 Tabulka 7: Biogenní aminy v mléce a v mléčných produktech (mg/kg) (LINARES, 2012).43 Tabulka 8: Biogenní aminy v sýru (mg/kg) (LINARES, 2012)…………………………….44 Tabulka 9: Biogenní aminy v sýru roquefort (mg/kg) (LINARES, 2012)………………...45 Tabulka 10: Biogenní aminy v sýru z pasterovaného mléka (mg/kg) (LINARES, 2012)…...47 Tabulka 11: Vizuální hodnocení barevných reakcí………………………………………….51 Tabulka 12: Izoláty bakterie Escherichia coli……………………………………………….52 Tabulka 13: Izoláty bakterie Bacillus licheniformis…………………………………………53 Tabulka 14: Izoláty rodu Bacillus……………………………………………………………54 Tabulka 15: Izoláty rodu Lactobacillus………………………………………………………54 Tabulka 16: Izoláty rodu Enterococcus……………………………………………………....55 Tabulka 17: Bakterie Escherichia coli s dekarboxylázovou aktivitou……………………….63 Tabulka 18: Bakterie Bacillus licheniformis s dekarboxylázovou aktivitou…………………71 Tabulka 19: Izoláty rodu Bacillus s dekarboxylázovou aktivitou…………………………...77 Tabulka 20: Izoláty rodu Lactobacillus s dekarboxylázovou aktivitou……………………..81 Tabulka 21: Izoláty rodu Enterococcus s dekarboxylázovou aktivitou……………………..84 Tabulka 22: Průměrné zastoupení vybraných aminokyselin a mastných kyselin v kozím a kravským mléce (Gajdůšek, 2002, Dičáková, 2005)………………………………………...88 Tabulka 23: Stanovené skupiny mikroorganismů v syrovém kozím a kravském mléce…….89 Tabulka 24: Stanovené skupiny mikroorganismů v pasterovaném kozím a kravském mléce a tvarohu………………………………………………………………………………………..90 Tabulka 25: Počty mikroorganismů v KTJ/ml a produkce CO2 v µl/l u kontrolního vzorku kravského a kozího mléka kultivované 3 dny při daných teplotách………………………….91 Tabulka 26: Počty mikroorganismů v KTJ/ml a produkce CO2 v µl/l u kontrolního vzorku kravského a kozího tvarohu kultivované 3 dny při daných teplotách………………………..92 132

Tabulka 27: Růst bakterie Enterococcus faceium a jejich produkce oxidu uhličitého v pasterovaném kravském a kozím mléce a tvarohu ………………………………………..94 Tabulka 28: Růst bakterie Enterobacter aerogenes a její produkce oxidu uhličitého v pasterovaném kravském a kozím mléce a tvarohu………………………………………..97 Tabulka 29: Růst bakterie Escherichia coli a její produkce oxidu uhličitého v pasterovaném kravském a kozím mléce a tvarohu………………………………………………………....100 Tabulka 30: Růst bakterie Pseudomonas fluorescens a její produkce oxidu uhličitého v pasterovaném kravském a kozím mléce a tvarohu………………………………………...103 Tabulka 31: Růst bakterie Proteus vulgaris a její produkce oxidu uhličitého v pasterovaném kravském a kozím mléce a tvarohu…………………………………………………………105 Tabulka 32: Růst mikromycety Geotrichum candidum a její produkce oxidu uhličitého v pasterovaném kravském a kozím mléce a tvarohu………………………………………..108

133

SEZNAM GRAFŮ Graf 1: Dekarboxylázová aktivita Escherichia coli při teplotě 30 °C 10. den kultivace…..61 Graf 2: Dekarboxylázová aktivita Escherichia coli při teplotě 37 °C 10.den kultivace……62 Graf 3: Dekarboxylace ornitinu izoláty Escherichia coli (1 - 12Ec) v průběhu 10 dnů při teplotě 37 °C ……………………………………………………………………………64 Graf 4: Dekarboxylace ornitinu izoláty Escherichia coli (12 - 24Ec) v průběhu 10 dnů při teplotě 37 °C ……………………………………………………………………………64 Graf 5: Dekarboxylace tyrozinu izoláty Escherichia coli (1 - 12Ec) v průběhu 10 dnů při teplotě 37 °C…………………………………………………………………………….65 Graf 6: Dekarboxylace tyrozinu izoláty Escherichia coli (12 - 24Ec) v průběhu 10 dnů při teplotě 37 °C ……………………………………………………………………………66 Graf 7: Dekarboxylace tryptofanu izoláty Escherichia coli (1 - 12Ec) v průběhu 10 dnů při teplotě 37 °C ……………………………………………………………………………66 Graf 8: Dekarboxylace tryptofanu izoláty Escherichia coli (12 - 24Ec) v průběhu 10 dnů při teplotě 37 °C…………………………………………………………………..67 Graf 9: Dekarboxylace fenylalaninu izoláty Escherichia coli (1 - 12Ec) v průběhu 10 dnů při teplotě 37 °C ……………………………………………………………………………68 Graf 10: Dekarboxylace fenylalaninu izoláty Escherichia coli (12 - 24Ec) v průběhu 10 dnů při teplotě 37 °C …………………………………………………………………………….68 Graf 11: Dekarboxylázová aktivita izoláty Bacillus licheniformis (1 - 10Bl) při teplotě 25,30, 37 °C 10.den kultivace……………………………………………………………………………………..70 Graf 12: Dekarboxylázová aktivita izoláty Bacillus licheniformis (11 - 20Bl) při teplotě 25,30, 37°C10. den kultivace………………………………………………………………………..70 Graf 13: Dekarboxylázová aktivita pro tyrozin izoláty Bacillus licheniformis při teplotě 6, 25, 30 a 37 °C 10.den kultivace…………………………………………………………………..72 Graf 14: Dekarboxylace tyrozinu izoláty Bacillus licheniformis (1 - 10Bl) v průběhu 10 dnů při teplotě 25 °C………………………………………………………………………………73 Graf 15: Dekarboxylace tyrozinu izoláty Bacillus licheniformis (11 - 20Bl) v průběhu 10 dnů při teplotě 25 °C………………………………………………………………………………73 Graf 16: Dekarboxylace tyrozinu izoláty Bacillus licheniformis (1 - 10Bl) v průběhu 10 dnů při teplotě 30 °C………………………………………………………………………………74

134

Graf 17: Dekarboxylace tyrozinu izoláty Bacillus licheniformis (11 - 20Bl) v průběhu 10 dnů při teplotě 30 °C………………………………………………………………………………74 Graf 18: Dekarboxylace tyrozinu izoláty Bacillus licheniformis (1 - 10Bl) v průběhu 10 dnů při teplotě 37 °C………………………………………………………………………………75 Graf 19: Dekarboxylace tyrozinu izoláty Bacillus licheniformis (11 - 20Bl) v průběhu 10 dnů při teplotě 37 °C………………………………………………………………………………75 Graf 20: Dekarboxylázová aktivita izoláty rodu Bacillus při teplotě 25,30, 37 °C 10. den kultivace………………………………………………………………………………………77 Graf 21: Dekarboxylace tyrozinu izoláty rodu Bacillus v průběhu 10 dnů při teplotě 25 °C...78 Graf 22: Dekarboxylace tyrozinu izoláty rodu Bacillus v průběhu 10 dnů při teplotě 30 °C...78 Graf 23: Dekarboxylace tyrozinu izoláty rodu Bacillus v průběhu 10 dnů při teplotě 37 °C...79 Graf 24: Dekarboxylázová aktivita izoláty rodu Lactobacillus při teplotě 25, 30, 37 °C 10.den kultivace …………………………………………………………………………………….. 80 Graf 25 : Dekarboxylace argininu izoláty rodu Lactobacillus v průběhu 10 dnů při teplotě 25, 30 a 37 °C……………………………………………………………………………………..82 Graf 26: Dekarboxylázová aktivita izoláty rodu Enterococcuss při teplotě 25, 30, 37 °C 10. den kultivace………………………………………………………………………………….83 Graf 27: Dekarboxylace argininu a tyrozinu izoláty 3En (Enterococcus sp.) a 4En (Enterococcus mundtii) v průběhu 10 dnů při teplotě 37 °C…………………………………85 Graf 28: Dekarboxylace argininu izolátem 3En (Enterococcus sp.) v průběhu 10 dnů při teplotě 6, 25, 30, 37 °C……………………………………………………………………….85 Graf 29: Dekarboxylace tyrozinu izoláty rodu Enterococcus při 25 °C……………………...86 Graf 30: Dekarboxylace tyrozinu izoláty rodu Enterococcus při 30 °C….…………………..87 Graf 31: Dekarboxylace tyrozinu izoláty rodu Enterococcus při 37 °C………………….…..87 Graf 32: Produkce BA bakterií Enterococcus faecium v kravském tvarohu…………………95 Graf 33: Produkce BA bakterií Enterococcus faecium v kozím tvarohu…………………….95 Graf 34: Produkce BA bakterií Enterobacter aerogenes v kravském tvarohu …………….98 Graf 35: Produkce BA bakterií Enterobacter aerogenes v kozím tvarohu …………………..98 Graf 36: Produkce BA bakterií Escherichia coli v kravském tvarohu………………………101 Graf 37: Produkce BA bakterií Escherichia coli v kozím tvarohu……………………….... 101 Graf 38: Produkce BA bakterií Pseudomonas fluorescens v kravském tvarohu……………104 Graf 39: Produkce BA bakterií Pseudomonas fluorescens v kozím tvarohu………………..104 Graf 40: Produkce BA bakterií Proteus vulgaris v kravském tvarohu……………………...106 135

Graf 41: Produkce BA bakterií Proteus vulgaris v kozím tvarohu……………………….. 106 Graf 42: Produkce BA mikromycetou Geotrichum candidum v kravském tvarohu………..109 Graf 43: Produkce BA mikromycetou Geotrichum candidum v kozím tvarohu…………...109

136