Návrh směrnic pro správnou laboratorní diagnostiku Friedreichovy ataxie. Připravila L.Fajkusová Online Mendelian Inheritance in Man: #229300 FRIEDREICH ATAXIA 1; FRDA *606829 FRDA GENE; FRDA
Popis onemocnění Friedreichova ataxie (FRDA) je autosomálně recesivní neurodegenerativní onemocnění s frekvencí výskytu 1:50 000 v Evropské populaci (frekvence přenašečů 1:120). V 98% případů je příčinou FRDA homozygotní dynamická mutace spočívající v amplifikaci repetice GAA uvnitř 1. intronu genu X25. Tento gen je lokalizován na chromosomu 9 v oblasti 9q1321.1 a kóduje protein frataxin. V normální populaci je počet repetic GAA 636, patologické alely obsahují 901300 repetic. Počet repetic 34100 je považován za premutaci, která může v dalších generacích expandovat do plné mutace . Analýza počtu repetic GAA u kontrolních vzorků vytvořila dvě skupiny alel: 83% alel obsahovalo 610 repetic („malé normální alely“), 17% mělo 1236 repetic („velké normální alely“). Sekvenční analýza ukázala, že žádná standardní alela neobsahuje více než 27 nepřerušených repetic GAA. U všech standardních alel s počtem repetic větším než 27 byla repetice GAA přerušena hexanukleotidovou repeticí GAGGAA . Repetice GAA na normálních chromosomech jsou stabilní při přenosu z rodičů na potomstvo, zatímco expandované repetice vykazují meiotickou i mitotickou nestabilitu . Expanze repetice GAA vede k potlačení exprese genu X25 a to pravděpodobně z důvodu tvorby stabilní nonB struktury DNA, která blokuje transkripci . Množství výsledné mRNA a tedy i samotného proteinu je v opačné korelaci s velikostí expanze repetice GAA. Tento efekt vytváří biologický základ pro korelaci mezi velikostí expanze a výsledným fenotypovým projevem onemocnění (tj. věkem počátečních projevů choroby, závažností a rozsahem postižení) . Doposud bylo u pacientů s FRDA popsáno cca 17 bodových mutací. Pacienti, u kterých byly bodové mutace detekovány, jsou složení heterozygoti s expanzí repetice GAA na jedné alele a bodovou mutací na druhé alele. Zatím nebyl zachycen pacient homozygot nebo složený heterozygot na bodové mutace .
Gen X25 (6 exonů) kóduje protein frataxin (210 aminokyselin, 18 kDa). Frataxin je lokalizován na vnitřní mitochondriální membráně a jeho absence má za následek nadměrnou mitochondriální akumulaci železa a deficit aktivity mitochondriálních FeS proteinů v případě analýzy endomyocardiálních biopsií a mozkové tkáně pacientů s diagnózou FRDA . V kultivovaných kožních fibroblastech nebo kosterních svalech pacientů s FRDA významnější deficit aktivity FeS proteinů prokázán nebyl . Kritéria pro klinickou diagnostiku FRDA navrhla A. E. Harding a podrobněji je o nich psáno v kapitole Výběr pacientů pro molekulárně genetickou diagnostiku FRDA. Kromě neurodegenerativních příznaků, jejichž frekvence se liší v závislosti na délce trvání nemoci, má většina pacientů hypertrofickou kardiomyopatii a téměř třetina pacientů má diabetes nebo nižší stupeň glukosové tolerance . Kliniká kriteria mohou být použity pro rozdělení pacientů s FRDA na typické a netypické případy. Na jedné straně jsou pacienti, kteří nemají všechny kliniké příznaky FRDA a přesto jsou nositeli homozygotní expanze repetice GAA v genu X25. Na druhé straně jsou pacienti klinicky podobni pacientům s FRDA, ale geneticky je onemocnění spojeno s genem pro protein přenášející alfatokoferol na chromosomu 8q13. Mutace v tomto proteinu mají za následek poruchu inkorporace vitaminu E do VLDL (verylowdensity lipoprotein) . V roce 2001 byl pomocí vazebné analýzy na chromosomu 9 nalezen další lokus spojený s FRDA. Tento lokus se nachází v oblasti 9p239p11 a obsahuje 81 genů. Nyní je u pacientů s vazbou FRDA a lokusu 9p239p11 prováděna sekvenční analýza vytypovaných genů .
Molekulárněgenetická diagnostika Obecná strategie: 1. Kritéria pro výběr pacientů pro molekulárněgenetickou diagnostiku FRDA. a) Nezbytná kritéria ( > 95%): • věk projevu nemoci před 25. rokem, • progredující ataxie chůze a končetin, • autosomálně recesivní dědičnost, • areflexie dolních končetin, • extenční iritační pyramidové jevy (Babinského příznak), • měření rychlosti vedení motorickými nervy na horních končetinách > 40 m/s, • malé nebo nevýbavné SNAP (sensory nerve action potential). b) Přídatná kritéria ( > 65%): • dysarthrie, • centrální paréza dolních končetin, • areflexie horních končetin, • pallanestezie a ztráta polohocitu dolních končetin, • skolióza,
abnormální EKG. c) Další příznaky (asi 50%): • nystagmus, • optická atrofie, • hluchota, • distální slabost a atrofie, • pes cavus. •
2. Izolace DNA 3. Stanovení počtu repetic GAA v 1. intronu genu X25 pomocí: a) PCR Sekvence primerů ohraničují repetici GAA : GAA104F: 5´GGCTTAAACTTCCCACACGTGTT3´ GAA629R: 5´AGGACCATCATGGCCACACTT3´ Použité chemikálie: Systém pro amplifikaci dlouhých úseků DNA Expand Long Template PCR System (Roche) Sekvence amplifikovaného úseku DNA: agtttgtact ttaggcttaa acttcccaca cgtgttattt ggcccacatt gtgtttgaag aaactttggg attggttgcc agtgcttaaa agttaggact tagaaaatgg atttcctggc aggacgcggt ggctcatgcc cataatctca gcactttggg aggcctagga aggtggatca cctgaggtcc ggagttcaag actaacctgg ccaacatggt gaaacccagt atctactaaa aaatacaaaa aaaaaaaaaa aaaagaagaa gaagaagaag aagaagaaga aaataaagaa aagttagccg ggcgtggtgt cgcgcgcctg taatcccagc tactccagag gctgcggcag gagaatcgct tgagcccggg aggcagaggt tgcattaagc caagatcgcc caatgcactc cggcctgggc gacagagcaa gctccgtctc aaaaaataat aataataaat aaaaataaaa aataaaatgg atttcccagc atctctggaa aaataggcaa gtgtggccat gatggtcctt (pozn: silně jsou vyznačeny místa nasedání primerů)
Velikost produktů PCR: 500 + 3n pb (n je počet repetic GAA) Velikost standardních alel je 518 až 608 pb (odpovídá 636 repeticím GAA). Velikost mutantních alel je 770 až 4400 pb (odpovídá 901300 repeticím GAA). Velikost premutantních alel je 602 až 800 pb (odpovídá 34100 repeticím GAA).
Produkty PCR jsou rozděleny v 1% agarósovém gelu a jejich velikost je vyhodnocena srovnáním s komerčně dostupnými fragmenty DNA o známé velikosti. Analyzovany vzorek je nutné současně amplifikovat se vzorky standardní DNA (u které se nepředpokládá expanze sledované repetice) a se vzorky DNA pacientů, u kterých již byla diagnóza FRDA potvrzena molekulárněgenetickými metodami. V případě detekce produktu PCR o velikosti na rozhraní standardní alela/mutantní alela (velikost cca 602 až 800 pb) je vhodné provést sekvenční
analýzu PCR produktu a přesvědčit se tak o možnosti přerušení repetice GAA hexanukleotidovou repeticí GAGGAA (možnost stabilizace repetice GAA?). b) Southernova blotingu a hybridizace Restrikce genomové DNA, přenos rozdělené DNA na membránu, hybridizace s radioaktivně značenou sondou a následná autoradiografie detekuje v případě standardní DNA fragmenty o velikosti 2,4 kb (restrikce endonukleasou BsiHKA1), 5,6 kb (restrikce EcoRV ) a 8,2 kb (restrikce EcoR1). V případě expanze repetice GAA sonda hybridizující s 1. exonem a částí 1. intronu genu X25 detekuje fragmenty o délce související s velikostí expanze . c) Detekce bodových mutací u heterozygotních přenašečů expanze repetice GAA amplifikace jednotlivých exonů genu X25 a přímá sekvenční analýza produktů PCR. Sekvence primerů : Exon 1 (240 pb) 1F: 5´AGCACCCAGCGCTGGAGG3´ 1R: 5´CCGCGGCTGTTCCCGG3´ Exon 2 (168 pb) 2F: 5´AGTAACCTACTTCTTAACTTTGGC3´ 2R: 5´AGAGGAAGATACCTATCACGTG3´ Exon 3 (227 pb) 3F: 5´AAAATGGAAGCATTTGGTAATCA3´ 3R: 5´AGTGAACTAAAATTCTTAGAGGG3´ Exon 4 (250 pb) 4F: 5´AAGCAATGATGACAAAGTGCTAAC3´ 4R: 5´TGGTCCACAATGTCACATTTCGG3´ Exon 5a (223 pb) 5aF: 5´CTGAAGGGCTGTGCTGTGGA3´ 5aR: 5´TGTCCTTACAAACGGGGCT3´ Exon 5b (224) 5bF: 5´CCCATGCTCAAGACATACTCC3´ 5bR: 5´ACAGTAAGGAAAAAACAAACAGCC3´ Metody molekulárně genetické diagnostiky zavedené v Centru molekulární biologie a genové terapie, Fakultní nemocnice Brno: stanovení počtu repetic GAA v 1. intronu genu X25 pomocí PCR. Pozn.: V případě zájmu by bylo možné vyšetření doplnit o detekci bodových mutací u heterozygotních přenašečů expanze repetice GAA a o sekvenční analýzu alel s premutací.
Interpretace výsledků molekulárně genetické diagnostiky založené na PCR
1. Expanze repetice GAA není detekována (po elektroforéze jeden popř. dva pruhy o velikosti menší než 608 pb): pacient s největší pravděpodobnosí nemá diagnózu FRDA. 2. Detekce expanze repetice GAA na obou alelách (po elektroforéze jeden popř. dva pruhy o velikosti nad 770 pb): pacient s diagnózou FRDA. 3. Detekce expanze repetice GAA na jedné alele, druhá alela standardní (po elektroforéze jeden pruh o velikosti nad 770 pb, druhý o velikosti pod 608 pb): v závislosti na klinických projevech se může jednat o přenašečství FRDA nebo o pacienta s expanzí GAA a bodovou mutací na druhé alele (přicházíli v úvahu druhý případ je nutné vyšetření doplnit o sekvenční analýzu exonů genu X25). Neobvyklé kombinace s obtížnou interpretací: 4. Detekce expanze repetice GAA na jedné alele, druhá alela s premutací (po elektroforéze jeden pruh o velikosti nad 770 pb, druhý o velikosti 602 až 800 pb): v závislosti na klinických projevech se může jednat o pacienta s FRDA – vyšetření je vhodné doplnit sekvenční analýzou premutované alely a zjistit možnot přerušení repetice GAA hexanukleotidovou repeticí GAGGAA. 5. Detekce alely s premutací, druhá alela standardní (po elektroforéze jeden pruh o velikosti 602 až 800 pb, druhý pod 608 pb): pravděpodobně se nebude jednat o pacienta s FRDA, v závislosti na klinických projevech je vhodné vyšetření doplnit o sekvenční analýzu premutované alely (možnot přerušení repetice GAA hexanukleotidovou repeticí GAGGAA) a sekvenční analýzu exonů genu X25. 6. Detekce dvou alel s premutací (po elektroforéze jeden popř. dva pruhy o velikosti 602 až 800 pb): pravděpodobně se nebude jednat o pacienta s FRDA, v závislosti na klinických projevech vyšetření doplnit o sekvenční analýzu premutovaných alel.
Návrh kontroly kvality Kontrola kvality DNA diagnostických laboratoří v rámci ČR bude provedena referenční laboratoří kontrolovanou EMQN (European Molecular Genetics Quality Network). Laboratoře, které mají zájem o provedení kontroly kvality diagnostiky FRDA, osloví referenční laboratoř a ta jim minimálně jednou do roka zašle vzorky DNA od zdravých kontrol, pacientů popř. přenašečů FRDA (potvrzeno analýzou DNA v referenční laboratoři). Výsledky DNA diagnostiky předají testované laboratoře referenční laboratoři, která provede vyhodnocení provedených analýz, tj. písemnou formou zašle kontrolovaným laboratořím výsledek.
