HPLC
Nagyhatékonyságú Folyadékkromatográfia A kromatográfia a többfokozatú, nagyhatékonyságú, dinamikus elválasztási módszerek gyűjtőneve: közös alapjuk az, hogy az elválasztandó komponensek egy állófázis és egy azon, meghatározott irányban átáramló mozgófázis (eluens) között megoszlanak. A komponensek – általában valamilyen szorpción alapuló – megkötődése az állófázison és visszajutása a mozgófázisba dinamikusan ismétlődik. A mozgófázisban a komponensek eltérő sebességgel haladnak, így egymástól elválnak. Az állófázis egy meghatározott pontján (általában a végén) egy érzékelő (detektor) jelzi a komponenseket, valamilyen fizikai vagy kémiai tulajdonságuk mérésével. A detektor által előállított jel kiértékelése teszi lehetővé az elválasztott komponensek azonosítását (minőségi analízis) és mennyiségük meghatározását (kvantitatív analízis). A kromatográfiás módszerek többféleképpen csoportosíthatók. A mozgófázis halmazállapota alapján beszélhetünk gázkromatográfiáról vagy folyadékkromatográfiáról, a megkötődés alapjául szolgáló fizikai-kémiai folyamat szerint adszorpciós (az állófázis szilárd anyag), abszorpciós vagy megoszlásos (az állófázis folyadék), illetve ion(csere) kromatográfiáról. Technikai kivitelezéstől függően beszélhetünk oszlop- vagy sík(vékonyréteg-, papír-) kromatográfiáról. A nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia a mozgófázis halmazállapota szerint folyadékkromatográfia, a megkötődés alapjául szolgáló fizikai-kémiai folyamat szerint adszorpciós, abszorpciós vagy ioncsere, technikai kivitelezés szerint oszlopkromatográfia. A folyadékkromatográfiában a mozgófázis folyadék. Míg a gázkromatográfiában a vivőgáz általában kémiailag inert, a komponensek gőznyomása független az alkalmazott vivőgáz minőségétől, a folyadékeluensek ritkán inertek, a minta komponenseivel kölcsönhatásba lépnek, azokat szolvatálják. Ezért az elválasztandó vegyületek oldhatósága és megoszlási hányadosa az eluens minőségétől is függ. A rendelkezésre álló nagyszámú folyadékkromatográfiás állófázis kiválasztása segít a feladat megoldásában, ezáltal a folyadék kromatográfiás elválasztások sokrétűbbek lehetnek. Gázkromatográfiában az analitikai feladat megoldásához alapvetően az állófázist kell meg választani, folyadékkromatográfia esetében mindkét fázis változtatása hatékonyságnövekedést eredményezhet. További lehetőség a folyadékkromatográfiában, hogy az eluens összetétele egy kromatogram kifejlesztése során is változtatható. Az oszlopon megvalósított folyadékkromatográfia tradicionálisan kétféle lehet. Az egyik a hagyományosnak nevezhető oszlop-folyadékkromatográfia. Ennek analitikai szempontból ma már alig van jelentősége, preparatív vagy tisztítási célokra használják. A másik a nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia (az angol nyelvi szakirodalomban HPLC = High Performance Liquid Chromatography) a leggyakrabban használt, modern analitikai módszerek egyike. Sokkal gyorsabb, mint a klasszikus folyadék kromatográfia. több komponenstű minták gyakran, néhány perc alatt meganalizálhatók Ezt új, hatékony kolonnatöltetek és nagy teljesítőképességű detektálási módszerek kifejlesztése tette lehetővé. Az eluens elkészítése és továbbítása A nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiában a komponensek elúcióját vagy állandó (izokratikus elúció), vagy meghatározott program szerint változó (gradienselúció) mozgófázis összetétellel hajtják végre. A gradienselúcióhoz értelemszerűen legalább két különböző eluenst alkalmaznak és a mozgófázisokat célszerűen még a kisnyomású oldalon keverik össze mikroprocesszor vezérelte szivattyúkkal. Elvárás továbbá az eluenstől, hogy oldott gázt (főleg reaktív oxigént) ne tartalmazzon. Hélium átbuborékoltatásával és ultrahangos fürdő alkalmazásával lehet csökkenteni az eluensben az oldott gázok mennyiségét. 1
HPLC
Nagy nyomás előállítására speciális szerkezeti anyagból készülő, az eluensek széles körének kémiailag ellenálló dugattyús pumpákat alkalmaznak.
A két rajz közül válassz egyet (szerintem a 2. egyszerűbb). Mintaadagolás, kolonna védelem A mintaadagolás a folyadékkromatográfiának is kényes művelete. Követélmény, hogy nagy nyomás alatt az injektálásból eredő sávkiszélesedés minimalizálása végett dugószerűen kerüljön az eluensáramba a kicsinytérfogatú (1-20 μl) minta. Leggyakrabban a gázkromatográfiánál már bemutatott 4 vagy 6 utas adagolószelepeket használják. A folyadékkromatográfokat gyakran ellátják olyan szűrőegységgel, ami az eluensben lévő vagy a mintaadagolás során bejutó, szilárd szennyeződéseket eltávolítja Erre a célra nagyon gyakran ún. előtét-(vagy védő) kolonnákat alkalmaznak. Az előtétkolonna olyan típusú, de nagyobb szemcseméretű (kisebb áramlási ellenállású) töltetet tartalmaz, mint maga az analitikai kolonna. Ezek az előtétkolonnák azon túl, hogy megakadályozzák az analitikai kolonna elszennyeződését - azzal az előnnyel is járnak, hogy kialakul rajtuk egy elő-
2
HPLC
egyensúly az eluens és az álló fázis közölt (az eluens telítődik a megosztófázissal) megnövelve ezzel az analitikai kolonnák élettartamát.
A két rajz közül válassz egyet (szerintem a 2. jobb). Kiválasztás, kolonnák A kolonnák 1-4 mm belső átmérőjű, 10-30 cm hosszúságú acél vagy vastag falú üvegcsőből készülnek. A kolonna töltete apró szemcséjű (2-40 μm átmérőjű) adszorbens: folyadék-szilárd kromatográfiánál szilikagél, alumínium-oxid, esetleg aktív szén, ill. folyadék-folyadék kromatográfiánál megosztófolyadékkal fedett porózus hordozó. A kolonnákat általában szobahőmérsékleten használják, bizonyos feladatok megoldásához esetenként termosztálható térben helyezik el. Kolonnatöltet készítéséhez használatos adszorbenseknek vagy szilárd hordozóknak nagy fajlagos felülettel kell rendelkezniük. A napjainkban alkalmazott kolonnák elméleti tányérszáma gyakran eléri a 40000-60000 tányér/méter értéket. Adszopciós (szilárd-folyadék) kromatográfiában leggyakrabban enyhén savas szilanol- (-Si-OH) csoportokat tartalmazó tölteteket alkalmaznak Az ilyen típusú adszorbensen jól kötődnek a bázikus. illetve telítetlen csoportokat tartalmazó vegyületek. Az eluens alkalmas megválasztásával a különböző báziserősségű vegyületek széles skálán választhatók el. Az elválasztás során ugyanis versengés alakul ki az adszorbens aktív helyeiért az eluensmolekulák és a minta komponenseinek molekulái között. Az elválasztás jellege változtatható azzal is. ha az eluenshez ún. módosítókat adnak. Nagyon kevés víz hozzáadásával például a szilikagél nagyon poláros szilanol-csoportjai blokkolhatók, aminek következtében a töltet látszólagos polaritása csökken és esetenként jobb elválasztás és rövidebb analízisidő érhető el. Abszorpciós (folyadék-folyadék) kromatográfiában mindazon megoszlófolyadékok használhatók, amelyek a gázkromatográfiában. A töltet elválasztóképessége, polaritása a választott szerves R-csoporttól függ. A leggyakrabban használt tölteteken alkil- (etil-, oktil-, 3
HPLC
oktadecil)-csoportot kötnek meg. A szénlánc hosszának növekedésével általában növekszik az elválasztandó vegyületek retenciós ideje. Közepes polaritású megosztófázisok állíthatók elő nitril, például cianoetil funkciós csoportok megkötésével míg az amino-alkil-csoportokat tartalmazó hordozók erősen polárosak. Az állófázisok elválasztóképessége és szelektivitása nemcsak a megkötött csoport polaritásával, hanem más kémiai tulajdonságának alkalmas megválasztásával is befolyásolható. Fenil-szilán-csoportokat tartalmazó hordozón a kialakuló kölcsönhatások következtében például az aromás vegyületek elválasztása lehet hatékony Királis funkciós csoportok használata az optikailag aktív izomerek analízisét teszi lehetővé. A megoszlásos kromatográfiában is nagy jelentősége van az eluensösszetétel helyes megválasztásának Az ún. normálfázisú kromatográfiánál (ahol az állófázis polárosabb és a mozgófázis apolárosabb) az eluciót teljesen apoláros mozgófázissal (pl. heptánnal) kezdve a kevésbé poláros komponensek viszonylag rövid idő alatt eluálódnak. Ha a minta polárosabb komponenseket is tartalmaz, az eluens összetételét változtatva (gradiensclúció) - például metanol vagy dioxán komponensek is elfogadható idő alatt elhagyják az oszlopot. így egy beadagolással sokféle komponens analizálható. Az ún. fordított fázisú kromatográfiában (ahol az állófázis apoláros) például alkilcsoportokat tartalmaz, és az eluens poláros) az apoláros komponensek (például a szénhidrogének) erősebben kötődnek, mint a polárosak (például alkoholok). Gradienselucióval (az iménti példánál az eluens polaritásának csökkentésével) azonban egy kromatografálással elválaszthatók a különböző polaritású komponensek. A nem vagy nehezen analizálható vegyületek a pH beállításával, ionpárképzéssel vagy származékképzéssel mérésre alkalmas formába hozhatjuk. Folyadékkromatográfiás detektorok A kellő kimutatási képességű és érzékeny detektálási módok kidolgozása döntően meghatározta a HPLC fejlődését. A detektálás lehet ún. eluensérzékenv, ahol az eluens valamilyen fizikai-kémiai tulajdonságának megváltozását mérjük, vagy komponensérzékeny, ahol a komponens képezi a ténylegesen mért jelet. Eluensszelektív a törésmutató különbség (RI) mérésen alapuló detektor. Ez a kolonnát elhagyó (és az elválasztott komponenseket tartalmazó) eluens. az ún. efluens törésmutatóját hasonlítja össze a tiszta eluensével. Bár az RI-detektor kimutatási képessége nem túl jó. és a kísérleti körülmények (hőmérséklet és áramlási sebesség) stabilitását jobban igényli, előnye, hogy majdnem minden szerves anyag kimutatására használható.
A komponensérzékeny detektoroknak több típusát is használják A legelterjedtebb az (UVlátható) spektrofotometriás detektor, amely egy speciálisan kialakított, rögzített vagy 4
HPLC
változtatható hullámhosszúságon mérő spektrofotométerben elhelyezett, általában 10 ml térfogatú és 10-40 mm hosszúságú átfolyásos küvetta. Nehézséget jelent a detektálás során, hogy a komponensek maximális elnyelésének hullámhosszúsága változhat. A modern berendezésekben ismert komponenseket tartalmazó minták analízise során a hullámhosszúság a komponensek elúciójának megfelelő, meghatározott program szerint változtatható. Jelentős előrelépést jelentett az ún. diódasoros detektorok használata, ahol a teljes elnyelési spektrum (190 nm-800 nm között) egyidejűleg és akár 0,01 másodperces időközökben felvehető, és ezáltal minden komponens abszorbanciája az elnyelési maximumán mérhető. Diódasoros detektálásnál természetesen a mérési adatok tárolása és értékelése számítógép használatát igényli. Gyakran gondot jelent, hogy az elválasztott komponensnek a készülék hullámhosszúság tartományában nincs mérhető elnyelése, illetve abszorbanciája kicsiny. Ezekben az esetekben származékképzéssel (pl. aromás csoportok bevitelével) válik analizálhatóvá a minta.
Fluoreszkáló vagy fluoroforcsoportok beépítésével fluoreszkálóvá tehető komponensek elválasztása során használhatók a fluoreszcenciás detektorok, amelyek speciálisan kialakított fluoriméterben elhelyezett átfolyásos küvettát tartalmaznak. Kevésbé elterjedtek az elektrokémiai detektorok. Ezek átfolyásos cellában elhelyezett, állandó potenciálon tartott elektródok, amelyek víz vagy vizet tartalmazó eluensekkel elválasztott, voltammetriásan aktív komponensek detektálására használhatók. A nagyhatékonyságú kromatográfia és a vele kombinált tömegspektrometria, illetve infravörös spektrofotometria biztosítja a leghatékonyabb és legsokoldalúbban használható analitikai elválasztást. A detektorból jövő jeleket a számítógép feldolgozza, amiből mi egy detektorjel-idő függvényt kromatogramot kapunk. A kromatogram egyik legfontosabb jellemzője a retenciós (visszatartási) idő (tR), amely a minta mozgófázisba (eluensbe) történő bevitelének pillanatától (adagolásától) a komponens maximális koncentrációban való megjelenéséig eltelt idő. Ez az idő minden mintaalkotóra más és más. A tR tartalmazza azt az időt is, amit az eluens a mintaadagolóban, a kolonnaszemcsék közötti térben és a detektorban (a jel képzéséig) eltölt. Ezzel ún. holtidővel (tM) csökkentve a tR értékét a redukált (nettó) retenciós időt kapjuk: tR’=tR - tM. (A tM értékét például a gázkromatográfiában a kolonnán nem kötődő gáz áthaladásának idejével lehet meghatározni.) Kapacitásaránynak (kapacitási tényezőnek):
a mérendő komponens állófázisában (nS) és mozgófázisában (nM) lévő anyagmennyiségei. 5
HPLC
Megoszlási hányados:
Szelektivitási tényező:
6
HPLC
Az elválasztás hatékonyságának jellemzése Elmélet tányérszám:
Felbontás:
R = 1,0 értékén a csúcsterületek átfedése kb. 2%. Ahhoz, hogy az átfedés ne legyen több 0,1 %-nál, R > 1,5 feltételnek kell teljesülnie. Az elválasztást a retenciós idők változtatásával tudjuk befolyásolni. A retenciós időket pedig elsősorban a megoszlási hányados határozza meg. A megoszlási hányadosra ható kísérleti tényezők a következők: 1. Hőmérséklet. A hőmérséklet növelésével csökken a megoszlási hányados és csökken a retenciós idő. A legalacsonyabb forráspontú anyag eluálódik először. 2. Az állófázis fizikai, kémiai tulajdonságai. Az állófázis cseréje a megoszlási hányados megváltozását okozhatja, ami a kromatográfiás elválasztások hatékonyságát javíthatja. 3. Az állófázis mennyiségétől Minőségi analízis 1. A legegyszerűbb módszer a retenciós idők (pontosabban a redukált retenciós idők) összehasonlítása ismert vegyületek retenciós idejével. Az anyagok azonosításának ez a módja azonban nagyon munkaigényes, különösen, ha a minta összetevőiről nincs előzetes információnk, hiszen a retenciós idők több paramétertől (kolonnahosszúság, áramlási sebesség, hőmérséklet, stb.) függenek. Megbízhatóbb azonosítást nyerhetünk, ha az ismert anyagok retenciós (vagy relatív retenciós) idejével való összehasonlítást két, különböző állófázist tartalmazó kolonnán is elvégezzük. Különösen a gázkromatográfiában használható eredményesen a szintén relatív retenciós adatokon alapuló ún. homológ sorok módszere. Az a tapasztalat ugyanis, hogy szénhidrogén-származékok homológ sorában a retenciós idők a szénatomszámmal exponenciálisan növekednek. Ennek megfelelően a lg tR’ értékeit a szénatomszám függvényében ábrázolva, egy homológ soron belül egyenest nyerünk. Csak említés szintjén: 2. A minőségi azonosítás megbízhatóbb módja, ha akromatográf szelektív detektorhoz, tömegspektrométerhez, infravörös spektrométerhez, esetleg induktív csatolású plazmát (ICP) alkalmazó spektrométerhez csatlakozik közvetlenül (on line). Ezekkel a kombinált módszerekkel az átfedő kromatográfiás csúcsok is kellő biztonsággal analizálhatók. Mennyiségi értékelés A mennyiségi analízis alapja az, hogy a kromatográfiás csúcsok területe arányos a mintakomponensek mennyiségével, ill. koncentrációjával. Csak aki érti, és biztos a dolgában: A mennyiségi értékelésnél a mért csúcsterülethez (A) keressük az anyagmennyiséget (m). Ehhez viszont ismernünk kell az arányossági tényezőt (a), amit a műszeres analitikában érzékenységnek neveznek. A=a.m 7
HPLC
A detektorok érzékenysége komponensenként más és más lehet, és az minden anyag esetében külön-külön meghatározandó. Egy adott komponenstől származó jelet akkor fogadunk el értékelhetőnek, ha az a háttér szórásának (zajszint) háromszorosát meghaladja. Ez tekinthető az adott komponens kimutatási határának, ami a módszerrel mérhető legkisebb anyagmennyiség.
A kromatográfiában is alkalmazzák a műszeres mérési módszereknél jól ismert kalibrációs (hitelesítési) eljárásokat (úgymint kalibrációs görbe felvétele, addíciós és belső standard módszer). Kalibrációs módszer: A standardból 1-5 tagú oldatsorozatot készítünk, azokat kromatografáljuk, és meghatározzuk az adott koncentrációkhoz tartozó csúcs alatti területeket (csúcsterületek meghatározására elektronikus integrátorok, illetve számítógépes programok szolgálnak). Az ismeretlen mintát azonos körülmények között kromatografáljuk, és az előbbi standardokból készített kalibrációs görbe segítségével ismeretlenünk koncentrációja meghatározható. Belső standard módszer: A vizsgálandó mintához egy olyan anyagot keverünk, amelyet a minta eredetileg nem tartalmaz, de a kromatografálás során jól elváló csúcsot ad. A kiértékelés során a belső standardra kapott jelet hasonlítjuk az ismeretlenhez. A nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia alkalmazása A HPLC a kicsiny tenziójú, poláros vagy apoláros tulajdonságú komponensek analízisére is használható. Korlátja, hogy a mintának kellő mértékben oldódnia kell az eluensben. A 2000-nel kisebb relatív molekulatömegű vegyületekre általában teljesül ez a feltétel. Nem analizálhatók folyadékkromatográfiásan a gázok és a szervetlen vegyületek egy része. A HPLC, illetve csatolt technikái LC-MS, LC-IR jól alkalmazhatóak a gyógyszeriparban anyagok tisztítására, minőségellenőrzésére, azonosítására. Használható a kozmetikaiparban és az élelmiszeriparban is.
8
