MIKROORGANIZMUSOK MINİSÉGI MEGHATÁROZÁSA (AZONOSÍTÁS) Az elızı fejezetben a mikroorganizmusok mennyiségének meghatározásának alapvetı módszereit mutattuk be. Ez a fejezet az egyes mikrobák identifikálásához (azonosításához) használt legfontosabb módszereket tárgyalja. A mikroorganizmusok azonosításához különféle határozók állnak rendelkezésre. A baktériumok rendszertani besorolásához világszerte a Bergey-féle baktériumhatározó a legelfogadottabb, melynek kilencedik kiadása (1984) tartalmazza a jelenleg érvényben levı nomenklatúrát, és egyben a legújabb azonosítási módszereket is. A mikroorganizmusok azonosításához számtalan vizsgálat használatos. A mikrobák identifikálása során alkalmazunk morfológiai, szaporodási minimum és optimum, az anyagcsere vizsgálatát célzó biokémiai, az antigénszerkezetet elemzı szerológiai, sıt újabban genetikai teszteket is. A mikroorganizmusok azonosítására részben célirányos felhasználásuk, részben az ellenük való védekezés szempontjából van szükség. MORFOLÓGIAI VIZSGÁLATOK A mikrobák morfológiai vizsgálatai között megkülönböztetünk mikromorfológiai és makromorfológiai vizsgálatokat. A mikromorfológiai vizsgálatok a sejt - vírusok esetében a virion - alaki tulajdonságainak megismerését célozzák. A baktériumok és gombák sejtjeinek mikromorfológiai vizsgálata fénymikroszkóppal - natív vagy festett preparátumok formájában - történik, mint ahogy arról már az V. fejezetben szó volt. Az akariota mikroorganizmusok vizsgálata, valamint a pro- és eukariota sejtek ultrastruktúrális vizsgálatának eszköze az elektronmikroszkóp. A makromorfológiai vizsgálatok a mikrobák folyékony és szilárd táptalajokban létrehozott tenyészeteinek alaktani tulajdonságait célozzák. A mikroorganizmusok telepeinek jól meghatározható, az adott mikroorganizmusra jellemzı morfológiai megjelenése van. A különbözı baktériumok és gombák szilárd táptalajon képzıdött telepeinek alakja, színe, szaga, szegélye különbözı. A telep fontos jellemzıje a pigmenttermelés formája is (extra-, vagy intracelluláris). Folyékony táptalajokban is más-más az egyes mikrobák megjelenési formája (üledékképzıdés, felszíni hártyaképzés, diffúz zavarosodás stb.). A.***Telepek A mikroorganizmusok néhány jellegzetes telepformája A)A baktériumok és gombák telepformái szilárd táptalajon: l. Telepek alakja felülnézetben 2. Telepek alakja oldalnézetben 3. Telepek szegélyei felülnézetben B) A baktériumtenyészetek néhány jellegzetes megjelenési formája folyékony táptalajokban: 1. Szaporodás a táptalaj belsejében; a. diffúz zavarosodás b. üledékképzıdés c. pelyhesedés 2. Szaporodás a táptalaj felszínén; a. hártyásodás b. pellikula-képzıdés (bırkésedés) c. győrős telepképzıdés A telepek jellege tekintetében megkülönböztetjük az R (rough)-, az S (smooth)- és az M (mucoid)-telepeket. Az R-telepek felszíne matt, rögös vagy érdes. Az S-telepek sima
felületőek, fénylık, vajszerőek. Az M-telepekre a nyálkás felszín jellemzı. Elıfordul, hogy a tenyészet elöregedése vagy a sorozatos passzálások hatására a telepmorfológia megváltozik. A burkos Gram-pozitív baktériumok, amelyek S telepeket képeznek, mutáció révén elveszíthetik buroktermelı képességüket (és ezzel együtt általában virulenciájukát is). A buroktermelı-képességüket elvesztett baktériumok R-telepeket képeznek. A gramnegatív baktériumok S→R mutációjának leggyakoribb oka az "O"-antigént kódoló gének megváltozása, ami az LPS-komplexben található poliszacharid oldalláncok fokozatos elvesztésében; és így az antigénszerkezet átalakulásában nyilvánul meg. Az "O"-antigén elvesztése - akár a buroktermelı-képesség elvesztése - általában együtt jár a virulencia részleges vagy teljes megszőnésével. A mikroorganizmusok morfológiai tulajdonságainak ismerete nagymértékben leszőkíti azoknak a biokémiai teszteknek a mennyiségét, amelyet az adott mikroba azonosítása érdekében el kell végezni. A KÖRNYEZETI TÉNYEZİK HATÁSÁNAK VIZSGÁLATA A MIKROORGANIZMUSOK SZAPORODÁSÁRA A mikroorganizmusokra ható élı és élettelen környezeti tényezık között meg kell említeni a tápanyagokat, a hımérsékletet, a sugárzást, a pH-t és a redoxpotenciált, a vízaktivitást, a különbözı gátlóanyagokat és a mikroorgamzmusok közti, valamint a mikroorganizmusok és magasabb rendő szervezetek közti kölcsönhatásokat. A mikroorganizmusok tápanyagigényének vizsgálata különbözı összetételő táptalajokon történhet, amirıl az elızı fejezetben már szó esett. Az ionizáló és nem ionizáló sugárzások mikrobákra gyakorolt hatásával a "Sterilezés" címő fejezetben foglalkoztunk. A mikroorganizmusok és a magasabb rendő szervezetek kölcsönhatásainak bemutatását külön tárgyaljuk az immunológia tárgykörében. 1. Gátlóanyagok hatása a mikroorganizmusok szaporodására Gátlóanyagoknak nevezzük mindazon vegyületeket, amelyek a mikroorganizmusok szaporodását gátolják. Hatás szempontjából ezen belül megkülönböztetünk sztatikus és cid hatású anyagokat. A sztatikus hatás csak a mikroorganizmusok szaporodásának gátlását jelenti, cid hatás alatt a mikrobák elpusztítását értjük. Gyakran egy anyagra nem lehet egyértelmően azt mondani, hogy sztatikus, vagy cid hatású, mivel ezt az anyagi minıségen kívül befolyásolja a koncentráció, a hımérséklet, a pH és a behatás ideje is. A baktericid, fungicid, sporocid, illetve viricid hatású vegyület elpusztítja a baktériumokat, gombákat, spórákat illetve vírusokat. Az az anyag, amely valamennyi mikroorganizmust, a gombák szaporítóképleteit és a bakteriális endospórákat egyaránt el tudja pusztítani, germicid hatású. Vannak fertıtlenítıszerek, amelyek kisebb koncentrációban csupán bakterio-, vagy fungisztatikus hatást fejtenek ki, magasabb koncentrációban viszont hatásuk cid jellegő. A gátlóanyagok lehetnek szervetlen vagy szerves, abiogén vagy biogén vegyületek. Biogén eredető szerves anyagok a fitoncidok, amelyeket magasabb rendő növények termelnek (pl. vöröshagyma, fokhagyma, kapor stb.), az állati eredető epesavas sók, vagy a természetes antibiotikumok. A gátlóanyagokat felhasználás szempontjából is csoportosíthatjuk, bár ez a csoportosítás az alkalmazás szerteágazósága miatt - nem túl gyakorlatias. Gátlóanyagokat használunk pl.
tartósítószerként, fertıtlenítıszerként, vagy mikroorganizmusok szelektív tenyésztésekor.
gyógyászati
célból,
valamint
a
1.1. A fitoncidok hatásának vizsgálata lyukteszttel A fitoncidok olyan - gyakran illó, a baktériumokra kis koncentrációban is mérgezı vegyületek, melyeket magasabb rendő növények termelnek. GYAKORLAT Szükséges anyagok és eszközök: Tesztagar pH 7,2, agarfúró, lándzsa, fokhagyma-szuszpenzió, cseppentı Mikroorganizmusok: Staphylococcus aureus és Escherichia coli tenyészetekbıl készített szuszpenzió A gyakorlat menete: A baktérium-szuszpenziókból néhány cseppet Petri-csészébe pipettázunk, majd a felolvasztott tesztagarral lemezeket öntünk. A lemezek megszilárdulása után a lelángolt agarfúróval a lemezekbe 2-2 lyukat fúrunk. A kiszúrt agarkorongokat lelángolt lándzsával távolítjuk el a lemezbıl. Az egyik lyukba steril hígítóvizet, a másikba pedig fokhagymaszuszpenziót cseppentünk. 37 °C-on 48 órán át tartó inkubálás után megvizsgáljuk a baktériumnövekedést a lyukak körül. Értékelés: 1.2. A festékek bakteriosztatikus hatásának vizsgálata Számos festékanyag; így pl. a trifenil-metán típusú festékek viszonylag nagy hígításban is gátolják a baktériumok szaporodását. GYAKORLAT Szükséges anyagok és eszközök: Tesztagar pH 7,2, agarfúró, lándzsa, 0,1 és 0,01 %-os kristályibolya-oldat, cseppentı Mikroorganizmusok: Staphylococcus aureus és Escherichia coli tenyészetekbıl készített szuszpenzió A gyakorlat menete: A baktérium-szuszpenziókból néhány cseppet Petri-csészébe pipettázunk, majd a felolvasztott tesztagarral lemezeket öntünk. A lemezek megszilárdulása után a lelángolt agarfúróval a lemezekbe 3-3 lyukat fúrunk. A kiszúrt agarkorongokat lelángolt lándzsával távolítjuk el a lemezbıl. Az egyik lyukba steril hígítóvizet, a másik kettıbe pedig a
különbözı koncentrációjú kristályibolya-oldatokat cseppentjük. 37 °C-on 48 órán át tartó inkubálás után megvizsgáljuk a baktériumnövekedést a lyukak körül. Értékelés: 1.3. A mikroorganizmusok antibiotikum-érzékenységének kimutatása korongteszttel A mikrobiológiai vizsgálatok során igen nagy hangsúlyt kap a mikroorganizmusok antibiotikum-érzékenységének vizsgálata. Humán- és állategészségügyi szempontból nagy a jelentısége a célzott antibiotikum-terápia megvalósításában. Bizonyos - antibiotikumokra fokozottan érzékeny - törzseket (pl. Bacillus sterarothermophilus var. calidolactis) felhasználjuk az antibiotikumok élelmiszerekbıl történı kimutatására. A mikroorganizmusok antibiotikum-érzékenységének gyors kimutatására a legelterjedtebben alkalmazott módszer az agardiffúziós korongteszt. Ennek lényege, hogy logaritmikus szaporodási fázisban lévı tiszta levestenyészetbıl lemezöntéssel szilárd tenyészetet készítünk, majd a lemez felszínére különbözı antibiotikumokkal átitatott papírkorongokat helyezünk. A lemezeket megfelelı hıfokon adott ideig inkubáljuk. Ezalatt az antibiotikum radiálisan az agarba diffundál, és így a papírkorong körül - amennyiben az adott mikroorganizmus érzékeny az alkalmazott antibiotikumra - gátlási zóna alakul ki. Adott antibiotikumra vonatkoztatva a mikroba érzékenysége arányos a gátlási zóna átmérıjével. GYAKORLAT Szükséges anyagok és eszközök: Tesztagar pH 7,2, antibiotikummal átitatott "RESISTEST" korongok (szumetrolim, chloramphenicol, ofloxacin, tetracyclin), steril csipesz Mikroorganizmusok: Staphylococcus aureus és Escherichia coli tenyészetekbıl készített szuszpenzió A gyakorlat menete: A baktériumszuszpenziókból néhány cseppet Petri-csészébe pipettázunk, majd a felolvasztott tesztagarral lemezeket öntünk. A lemezek megszilárdulása után a lemezek felszínére steril csipesszel negyedenként a Petri-csésze aljára írt számok fölé elhelyezünk 11 RESISTEST korongot, majd a lemezeket egyenes állásban 48 órára 37 °C-os termosztátba helyezzük. Az inkubációs idı eltelte után lemérjük a kialakult gátlási zónák átmérıjét, és így adjuk meg, hogy az adott mikroorganizmus melyik antibiotikumra a legérzékenyebb. Értékelés:
A BAKTÉRIUMOK ANYAGCSERÉJÉNEK VIZSGÁLATA A baktériumok anyagcsere-folyamatai rendkívül változatosak: a baktériumok között találhatók fotoautotróf fotoheterotróf, kemoautotróf és kemoheterotróf szervezetek. Ezek közül élelmiszerhigiéniai és humán- valamint állategészségügyi jelentısége elsısorban a kemoheterotróf baktériumoknak van. Mint minden azonosítási próbában a biokémiai vizsgálatok során is alapvetı feltétel, hogy a próbák kiindulási alapja tiszta tenyészet legyen. A mikroorganizmusok anyagcsere-folyamataiban szerepet játszó extra- és intracelluláris enzimek, a biokémiai reakciók köztes illetve végtermékei jellemzıek az adott mikroorganizmusra, ezért vizsgálatuk diagnosztikai szempontból igen fontos. Emellett a különbözı anyagcsere- és légzéstípusra utaló vizsgálatok során hasznos felvilágosítást kaphatunk az adott mikroba mezıgazdasági és élelmiszeripari hasznosíthatóságáról is. A biokémiai vizsgálatokat hagyományosan speciális táptalajok és reagensek segítségével végzik. Az utóbbi években egyre elterjedtebbek a több tulajdonság egyidejő vizsgálatát lehetıvé tevı tesztkészletek, amelyek különálló rekeszeiben igen kis mennyiségő, különbözı biokémiai vizsgálatok elvégzését célzó speciális táptalajokat öntenek (Enterotube II; API). Az eredmények leolvasása történhet szabad szemmel vagy olyan - számítógépes egységgel összekötött - coloriméter, segítségével, amely alkalmasak ezen biokémiai tesztkészletek automatizált, a szubjektivitást kizáró elemzésére. 1. A baktériumok szénhidrátforgalmának vizsgálata A szénhidrátok - mint tápanyagok - igen jelentıs szerepet töltenek be a kemoheterotróf mikroorganizmusok anyagcseréjében: egyrészt, mint szénforrás másrészt, mint energiaforrás játszanak benne szerepet. A baktériumok anyagcsere-utjai jellemzıek az adott baktériumra. Szénhidrát-anyagcseréjükön belül vizsgáljuk a hasznosított szénhidrátok körét, a lebontás módját, a katalizáló enzimek jelenlétét, különbözı metabolitok termelését. 1.1.A szénhidrátbontás vizsgálata A szénhidrátbontás vizsgálata arra terjed ki, hogy a vizsgált baktérium milyen szénhidrátokat képes lebontani. Ezt - igénytelen baktérium esetében - vizsgálhatjuk 1% tetszıleges szénhidrátot és indikátort tartalmazó peptonvízben. Igényes baktériumok esetében a táplevest ki kell egészíteni 10 % savóval, triptonnal és élesztıkivonattal. A táptalajok készítésekor tekintettel kell lenni arra, hogy sem a szénhidrát-oldat, sem pedig a savó nem hıkezelhetı, ezért ezeket autoklávozás után kell a levesbe keverni. Táptalajok készítéséhez csak egészséges állat sterilen vett vérébıl steril körülmények között készített savó, és membránfilteren való szőréssel sterilezett cukoroldat használható. A leveseket a tiszta tenyészetrıl lelángolt oltókaccsal levett teleppel oltjuk be, majd 30 °C hımérsékleten, 24-48 órán át inkubáljuk a csöveket. Az elbírálás alapja, hogy a baktériumok nagy része a szénhidrátokból savat és esetenként gázt termel. A savtermelés kimutatását szolgálja a levesbe kevert pH-indikátor a gáztermelés kimutatására pedig Durham-féle fermentációs csövet helyezhetünk a levesbe. Anaerob baktériumok esetében tekintettel kell lenni arra a tényre, hogy ezek a baktériumok erıs redukáló hatással
rendelkeznek, ami szintén megváltoztathatja az indikátor színét. Ezért anaerob tenyészetek esetében a pH-változást célszerő pH-mérıvel ellenırizni. 1.2. Metilvörös próba A metilvörös próba annak eldöntését szolgálja, hogy a vizsgált baktérium erısen vagy gyengén savtermelı-e. A baktérium tiszta tenyészetével be kell oltani egy glükóztartalmú levestáptalajt, majd a megfelelı inkubáció után a táptalajhoz néhány csepp metilvörös indikátort adni. Pozitív esetben - 4,4 alatti pH-értéken - az indikátor piros színt mutat. A próbának gyakorlati jelentısége, hogy segítséget nyújt a kóliformok Enterobacter-fajoktól való elkülönítésében. 1.3. OF teszt A teszt a szénhidrátbontás módjának meghatározását szolgálja, segítségével megállapítható, hogy egy adott baktérium a szénhidrátokat oxidatív, vagy fermentatív úton bontja-e. A vizsgálathoz 1 % szénhidrátot és indikátort (pl. brómtimolkék) tartalmazó félfolyékony magasagart használunk, amelyet a vizsgálandó baktérium színtenyészetével szúrásos technikával párhuzamos beállítása mellett oltunk be. Az egyik csövet aerob, a másik csövet anaerob körülmények között inkubáljuk. Megfelelı inkubációs idı eltelte után a csöveket az indikátor színváltozására tekintettel bíráljuk el. Az aerob báktériumok oxidátív, az anaereobok mind oxidatív, mind pedig fermentatív úton képesek a szénhidrátokat bontani. A próba elbírálását az alábbi táblázat tartalmazza: Aerob tenyésztés + + -
Anaerob tenyésztés + + -
Elbírálás Oxidatív (obligát aerob) Fermentatív (obligát anaerob) Oxidatív és fermentatív (fakultatív anaerob) Nem bontja a glükózt
GYAKORLAT Szükséges anyagok és eszközök: 4 csı OF-agar, oltóttő, paraffinolaj Mikroorganizmusok: Staphylococcus aureus és Micrococcus ssp. ferdeagaros tenyészete A gyakorlat menete: Mind a Staphylococcus aureus, mind a Micrococcus ssp. tenyészetbıl átoltást végzünk 2-2 OF-agart tartalmazó csıbe szúrásos technikával. Mindkét átoltás egyik csövét parffinolajjal fedjük. A csöveket 24 órán át 37 °C-on inkubáljuk, majd a brómtimolkék indikátor sárga színváltására nézve bíráljuk el. Értékelés:
1.4. A redukáló hatás vizsgálata-csak olvasni Erıs redukáló hatással azon baktériumok esetében kell számolni, amelyek az anyagok lebontását dehidrogénezéssel végzik, vagyis képesek fermentatív szénhidrátbontásra. Ezek közé kell sorolni az anaerob és fakultatív anaerob baktériumokat. A redukáló hatás vizsgálható metilénkék táptalajba keverésével, mert a metilénkék redukció hatására elszíntelenedik. Több differenciáló táptalaj alkalmas a baktériumok redukáló hatásának vizsgálatára. A fontosabbakat az alábbi táblázat tartalmazza: Vizsgált baktérium Táptalaj
Reakció
2−
SO 3
⇒
2+
2−
Eredmény
S
2−
Mezofil szulfitredukáló Clostridiumok
Szulfitredukciós leves (DRCM)
Staphylococcusok
Baird-Parker agar
Tellurit redukciója tellurrá
Salmonellák
Fe2+ -tartalmú táptalaj
Kéntartalmú aminosavakból H2S telepek Fe2+ + H2S →FeS + 2 H+
Fe
+S
Fekete csapadék
⇒ FeS Grafitszürke vagy fekete telepek
1.5. Kataláz-próba A baktériumok egy részénél - szemben a magasabb rendő állatokkal - a terminális oxidációban a citokróm-oxidáz egyetlen pár hidrogénatomot továbbít a hidrogénakceptor szerepét betöltı molekuláris, oxigénhez. A reakció végtermékeként víz helyett hidrogénperoxid keletkezik, amely oxidáló tulajdonságánál fogva sejtméreg, így a környezetben felhalmozódva a baktériumokra is toxikus. A hidrogén-peroxidot a baktériumok kataláz nevő enzime vízre és oxigénre bontja. 2 H2 O2 2 H2 O + O2 Azon baktériumok, amelyek nem rendelkeznek kataláz enzimmel, általában az anaerobok közé tartoznak (esetleg aerotoleransak lehetnek). Kataláz enzimet termel minden obligát aerob baktérium, és a fakultatív anaerobok egy része is, így pl. a Staphylococcus aureus. A kataláz próba két változata terjedt el: a tárgylemez- és a kémcsı-próba Az elıbbit szilárd tenyészetek, az utóbbit pedig levestenyészetek esetében alkalmazzuk. A tárgylemezpróba elvégzése során a tenyészetbıl egy kacsnyi mennyiséget tárgylemezre viszünk, majd 3%-os hidrogén-peroxid-oldatot cseppentünk rá. Az oldatba nem szabad fémkaccsal nyúlni, mert az katalizálhatja a hidrogén-peroxid bontását, és fals pozitív eredményt kaphatunk. A kémcsıpróba során a levestenyészetbe kb. 1 ml hidrogén-peroxidoldatot kell önteni. Mind a tárgylemez- mid pedig a kémcsıpróba esetében a pozitív reakciót gázképzıdés, (pezsgés) jelzi. Tárgylemez-próba esetén elıfordul, hogy a gyenge kataláz-aktivitással rendelkezı baktériumok esetében a próba csak lupe segítségével bírálható el. A vizsgálatokhoz nem célszerő töményebb oldatot használni, mert könnyen bomlik. A hidrogén-peroxid-oldatot sötétített üvegben kell tartani, mert fény hatására is bomlik. GYAKORLAT Szükséges anyagok és eszközök: tárgylemez, oltókacs, 3 %-os hidrogén-peroxid-oldat
Mikroorganizmusok: Micrococcus spp., Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis ferdeagaros tenyészete Értékelés:
1.6. Oxidáz próba Oxidáz-próba alatt az oxidatív anyagcserét folytató baktériumok terminális oxidációjában szerepet játszó citokróm-oxidáz enzim kimutatását értjük. A kimutatás során a tiszta tenyészetbıl egy telepet 1 %-os színtelen tetrafenilén-diamin-oldattal átitatott szőrıpapírcsíkra a viszünk. Amennyiben a mikroba termel oxidáz-enzimet a szőrıpapíron sötétkék elszínezıdés látható. Az oxidáz-próbához - akárcsak a kataláz-teszthez - fém oltókacs nem használható. 1.7. Voges-Proskauer próba A Voges-Proskauer próba a butándiolos erjedés köztitermékének, az acetil-metilkarbinolnak (acetoin) a kimutatását szolgálja. A próba lényege, hogy az acetoin lúgos, közegben oxigén jelenlétében piros színő diacetillé oxidálódik. Az oxidációt α-naftol vagy kreatinin hozzáadásával elısegíthetjük. CH3
CH3 CH-OH C=O CH3
40%-os KOH α-naftol, vagy kreatinin
C=O C=O CH3
A próba elvégzéséhez 1 % glükózt tartalmazó levestáptalajra van szükség, amit beoltunk a vizsgálandó mikroba tiszta tenyészetével, majd 30 °C-on 24-48 órán át inkubáljuk. Az inkubációs idı eltelte után a levestenyészethez cseppentünk 1-1 csepp reagenst. Pozitív esetben 10-15 perc várakozási idı után a leves pirosan elszínezıdik. GYAKORLAT Szükséges anyagok és eszközök: 2 csı beoltott Voges-Proskauer leves, VP-reagens l (5 %-os etanolos (96 %) 1-naftol) és VP-reagens 2 (40 %-os kálium-hidrixid-oldat), kreatin Mikroorganizmusok: Bacillus cereus és E. coli VP-levesbe oltva A gyakorlat menete:
A beoltott és 30 °C-on 24 órán át inkubált VP-levestenyészetek 1 ml-éhez 0,2 ml VPreagens 2-t és 0,6 ml VP-reagens 1-t, valamint néhány kreatin kristályt adunk. A csöveket 1 órán át szobahımérsékleten állni hagyjuk, majd elbíráljuk. Pozitív esetben piros színreakció tapasztalható. Negatív esetben 24 óra inkubálás után újra el kell bírálni a reakciót. 2. A baktériumok nitrogén-anyagcseréjének vizsgálata N-forrásként a mikrobák egy része szervetlen, másik csoportja pedig szerves anyagokat hasznosít. A szervetlen nitrogénforrásokat hasznosító baktériumok egyik csoportját képezik a nitrogén-kötı baktériumok (Rhizobium, Azotobacter), amelyek képesek megkötni, és ammómum-sókká alakítani a levegı molekuláris nitrogénjét. Az ammónium-sókat nitrifikáló baktériumok képesek nitrátokká és nitritekké alakítani. A szervetlen nitrogént hasznosító baktériumok a szerves savak aminálásával állítják elı a szervezetük felépítéséhez szükséges aminosavakat. A baktériumok zöme azonban nitrogénforrásként aminosavakat vagy oligopeptideket igényel. A szerves nitrogénforrást hasznosító baktériumok másik csoportjába tartoznak a proteolitikus enzimeket termelı rothasztó baktériumok (pl. Clostridiumok, Proteusok), amelyek a lebontó folyamatok során a hullamérgeknek is nevezett biogén aminokat ( putreszcin, kadaverin, hisztamin, triptamin) is termelnek. 2.1. A nitrát redukció vizsgálata Egyes mikroorganizmusok a nitrátokat nitritekké redukálják. A vizsgálatot a tiszta tenyészet nitrát tartalmú levestáptalajba történı átoltásával kell kezdeni. A beoltott csöveket 30 °C-on 24-48 órán át kell inkubálni. Az inkubálási idı lejárta után a táptalajhoz néhány csepp nitrát-reagenst adva nitritek jelenléte esetén piros színreakciót tapasztalunk. Amennyiben a piros szín nem alakul ki, akkor vagy nem történt meg a nitrátok redukciója, vagy a keletkezett nitriteket a baktérium tovább redukálta. Ennek ellenırzése késhegynyi cinkpor hozzáadásával ellenırizhetı, mert ha a rendszerben nitrát van, akkor a cink hatására ez nitritté redukákódik, aminek következtében kialakul a piros szín. A fentiek alapján a próba elbírálását az alábbi táblázat tartalmazza: Nitrát reagens Piros Nincs színváltozás Nincs színváltozás
Cink Nincs színváltozás Piros
Eredmény Pozitív (nitrit) Pozitív (nitrit továbbredukálása)
Negatív (nitrát)
2.2 Ureáz-próba Az ureáz próba során a baktériumok karbamid-bontó enzimének jelenlétét próbáljuk kimutatni. A próba lényege, hogy amennyiben a vizsgált baktérium termel ureáz enzimet akkor karbamid-tartalmú levesbe oltva a karbamidból lúgos kémhatást eredményezı ammónia keletkezik, a lúgos kémhatás pedig pH-indikátor hozzáadásával kimutatható. Az urobaktériumok dezaminálást végzı ureáz enzime hatására bekövetkezı reakció: H 2 NO C = O + 2 H 2O → ( NH 4 ) 2 − CO3 H 2 NN
( NH 4 ) 2 − CO3 → CO2 + H 2O + 2 NH 3 lúgos 2.3. Indol próba Az indol-próba során az egyes baktériumok által (pl. Escherichia coli) triptofánból termelt indolt mutatjuk ki. A próba lényege, hogy a vizsgált baktérium tiszta tenyeszetébıl triptofán-tartalmú levesbe oltva 37 °C-on 24-48 órán át tartó inkubálást követıen a tenyészethez Kovács-féle indol reagenst adva pozitív esetben a levestáptalaj felszínén piros győrő alakul ki. E .coli
Kovács − reagens
triptofán → indol → rozindol (meggypiros) 3. Egyes extracelluláris enzimek kimutatása Az extracelluláris enzimek általában a baktériumok sejthártyájában szintetizálódnak, innen választódnak ki. Ezek az enzimek nem baktériumok szoros értelemben vett anyagcseréjében játszanak szerepet, hanem a környezethez való viszonyukat szabják meg. Az extracelluláris enzimek igen széles skálájából csak a leglényegesebbeket emeljük ki. 3.1. A lináz- és lecitináz-aktivitás vizsgálata A lipáz és lecitináz enzimeket kódoló génszakaszok a baktériumokban általában kapcsoltan öröklıdnek, így az esetek nagy részében együtt termelıdnek. A lipáz enzim a triglicerideket, a lecitináz pedig a lecitint bontja. Mindkét enzim aktivitásának vizsgálata tojássárga-emulziót tartalmazó táptalajon történik. Ennek egyik legjellegzetesebb példája a Baird-Parker agar, amely az un. politróp táptalajok közé tartozik, mivel a Staphylococcusoknak több biokémiai tulajdonságát is vizsgálható rajta: így a telluritredukáló-képesség, valamint a lipáz és lecitináz-aktivitás. A lipáz-aktivitás következtében emulzióban található zsírsavcseppek glicerinre és zsirsavakra hidrolizálódnak és a kiváló zsírsavcseppek gyöngyház-fényővé teszik az egyébként matt fekete, vagy szürke telepek felszínét. A lecitináz-aktivitás következtében az opálos, átlátszatlan táptalaj a telepek körül udvar formájában feltisztul. Ez utóbbi jelenséget nevezzük Nagler-reakciónak. Staphylococcusok esetében a próba jelentısége, hogy a lipáz és lecitináz enzimek termelése gyanút kelt a koaguláz enzim termelésére., ami viszont a Staphylococcusok patogenitására utal. 3.2. A koaguláz enzim kimutatása A koaguláz-enzim a vérsavó fehérjéit megalvasztja. A próba jelentısége a patogén Staphylococcusok kiszőrésében rejlik. A Staphylococcusokat koaguláz-termelésük alapjan három csoportba soroljuk. A St. aureus csoport extracelluláris, szabad koagulázt termel, a
St. intermedius sejthez kötött koagulázt, míg a St. epidermidis nem termel koagulázt. A St. aureus fakultatív patogén gennyes folyamatokból lehet izolálni, ezen kívül hıstabil polipeptid enterotoxint termel, tehát az ételmérgezı mikroorganizmusok közé tartozik. A masik két csoportba tartozó bakériumok szaprofiták, kivéve a St. epidermidis csoportba tartozó St. hyicus, amely a sertések exsudatív bırgyulladását okozza, de humán egészségügyi jelentısége nincs. A próba során a Baird-Parker lemezen izolált gyanús telepekbıl n , de legalább öt telepet egyenként nem szelektív levesbe oltunk, majd 37 °C hımérsékleten 24 órán át inkubáljuk. Tenyészetenként egy-egy Wassermann-csıbe 0,3 ml nyúlsavót pipettázunk, majd 0,1 ml mennyiséget mérünk hozzá a vizsgálandó mintából. A próbát 4 órás inkubációs idı után bíráljuk el. Pozitívnak tekintendı a próba, ha a tenyészet a nyúlsavót megalvasztotta. A próba elbírálását mindenképpen idıben kell elvégezni, mert a Staphylococcusok egy része fibrinolizin enzimet is termel, ami elfolyósítja a koagulátumot. Az utóbbi idık vizsgálatainak eredménye a módosított Baird-Parker agar, amibe tojássárgaemulzió helyett nyúlsavót kell keverni koagauláz poztív Staphylococcus telepek közül az egyébként tiszta, áttetszı táptalajban opálos udvar keletkezik. 3.3 hemolizinek vizsgálata A hemolizinek a hemoglobin bontásáért felelıs enzimek. Általában virulencia-faktorok. Vizsgálatuk véres- vagy csokoládéagaron történik. A véresagar készítésének lényege, hogy a sterilezett, kb. 45 °C-ra hőtött alaptáptalajba 7 % defibrinált birkavért keverünk. A csokoládéagar ettıl abban különbözik, hogy ebbe még a hıkezelés elıtt keverjük a vért, és a hıkezelt vér adja a táptalaj sötétbarna színét. A hemolízisnek két formáját különböztetjük meg: az α- és a β-hemolízist. A β-hemolízisre jellemzı, hogy a hemolizáló telepek körül a táptalaj teljesen, éles határral feltisztul, mert a vörösvérsejtek és a hemoglobin lebomlik. Ezzel szemben a az α-hemolízises zóna nem éles határú és zöldes árnyalatú. Ez azzal magyarázható, hogy a vörösvérsejtek ez esetben nem esnek szét, a zöldes színt pedig a hemoglobin egyik bomlásterméke adja.
