Mitokondriális neuroprotekció Doktori értekezés
Dr. Szilágyi Géza Semmelweis Egyetem Szentágothai János Idegtudomány Iskola
Témavezető: Dr. Nagy Zoltán egyetemi tanár, MTA doktora Hivatalos bírálók: Dr. Horváth Sándor osztályvezető főorvos, PhD. Dr. Kovács Tibor egyetemi docens, PhD. Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Sándor Péter, egyetemi tanár, MTA doktora Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Fekete István, egyetemi tanár, MTA doktora Dr. Bartha Katalin, tud. mts., PhD
Budapest 2008
Tartalomjegyzék oldalszám Rövidítések jegyzéke
4
Bevezetés
7
Szabadgyökök
7
Mitokondrium szerepe az ischaemiában
8
Apoptózis
9
Mitokondriális apoptózis szignál
11
Mitokondriális átmeneti permeabilitási pórus
12
Perifériás benzodiazepin receptor
14
Perifériás benzodiazepin receptor és a mitokondriális funkciók
15
Vinpocetin és származékai
16
Deprenyl és származékai
18
Célkitűzések
21
Módszerek
22
Állatkísérletek
22
Permanens cerebri media okklúzió patkányban
22
Kétoldali, átmeneti artéria carotis interna lekötése egérben
22
PC-12 sejttenyészet
23
Hypoxia-reoxigenizáció PC-12 sejttenyészetben
23
TTC festés
23
Propidium jodid festés
24
Immunhisztokémia
24
TUNEL/Kaszpáz-3 festés
24
PBR immunhisztokémia
24
Szabadgyök festés és a mitokondrium transzmembrán potenciál meghatározás PC-12 sejtekben
25
Konfokális lézer szkenning mikroszkópia
25
Képalkotás PC-12 sejttenyészetben
25
Képalkotás szövettani metszetben
27
PET vizsgálat
27
Humán PET vizsgálatok
27
2
Majom PET vizsgálatok
28
Kísérleti elrendezések
29
Eredmények
32
Metodikai eredmények
32
Vinpocetin eredmények
32
Sejtbiológiai mérések
32
PET vizsgálatok
34
Humán PET vizsgálat
34
Majom PET vizsgálat
36
Deprenyl eredmények
37
Sejtbiológiai mérések
37
Állatkísérleti eredmények
39
N-oxid deprenyl eredmények
40
Sejtbiológiai mérések
40
Állatkísérleti eredmények
45
Megbeszélés
47
Metodikai eredmények
47
Vinpocetin eredmények
48
Deprenyl eredmények
50
Deprenyl-N-oxid eredmények
51
Következtetések
55
Összefoglalás
56
Irodalomjegyzék
58
Saját publikációk jegyzéke
67
Köszönetnyilvánítás
69
3
Rövidítések jegyzéke A amfetamin AIF apoptózis indukáló faktor ANC adenin nukleotid transzporter APAF-1 apoptózis aktiváló faktor ATP adenozin trifoszfát BAD proapoptotikus fehérje a Bcl-2 fehérje családból BAK proapoptotikus fehérje a Bcl-2 fehérje családból BAX proapoptotikus fehérje a Bcl-2 fehérje családból Bcl-2 B sejtes leukémia/limfóma-2 fehérje BclXL antiapoptotikus fehérje a Bcl-2 fehérje családból CA1, CA2 hippocampus régió cAMP ciklikus adenin mononuklein sav CBF agyi vér perfúzió cFOS un. korai gén cGMP ciklikus guanin mononuklein sav cJUN un. korai gén CLSM konfokális lézer szkenning mikroszkóp CMR Agyi glükóz metabolizmus COX ciklooxigenáz enzim cyclin D sejtciklust szabályozó fehérje DD dezmetil deprenyl DISC sejthalál elindító jel komplex DMEM Dulbecco módosított sas tápoldat DNA dezoxiribonuklein sav DNA-PK DNS függő fehérje kináz DNase DNS bontó enzim DNO deprenyl-N-oxid FAS halálreceptor FDG F18-deoxi-D-glükóz 4
FITC fluoreszcens festék GAP-43 növekedés függő fehérje GDNF glia eredetű trófikus faktor HBA humán agy atlasz HPLC nagy nyomású folyadék kromatográfia HSP hősokk fehérje IAP (XIAP) apoptózis inhibitor fehérje JC-1 kationos membrán potenciál festék MA metamfetamin MAO monoamino oxidáz MCAO középső agyi artéria elzárás MMP mitokondriális transzmembrán potenciál MPTP mitokondriális átmeneti permeabilitási pórus MPTP/MPP+ 1-metil-4 fenil-1,2,3,6-tetrahidro-piridin NADPH nikotinsavamid foszfát oxidáz NeuN idegsejt mag ellenes antitest NGF idegsejt növekedési faktor NMDA N-metil-d-aszpartát NO nitrogén alapú szabadgyök NOS NO szintetizáló enzim p53 daganat növekedést gátló gén p53 response protein p53-ra reagáló fehérje P450 mikroszómális citokróm enzim rendszer PARP poli(ADP-ribóz) polimeráz PBR perifériás benzodiazepin receptor PC-12 patkány phaechromocytoma sejttenyészet PDE foszfodiészteráz enzim PET pozitron emissziós tomográfia pMCAO végleges középső agyi artéria lekötés PKC fehérje kináz C PK11195 isoquinoline származék, PBR antagonista RB retinoblasztóma fehérje
5
ROS oxigén alapú szabadgyök SKF 525A citokróm P450 enzim gátló SMAC/DIABLO IAP kötő fehérje SOD szuperoxid dizmutáz T1, T2A dupla és tripla szűrők konfokális mikroszkóphoz TNF tumor nekrózis faktor, halál receptor TRAIL TNF-hez kapcsolt halál receptor TTC 2, 3, 5-trifeniltetrazolium klorid TUNEL apoptózis festék VDAC feszültség függő anion csatorna VEGF érfali endotél növekedési faktor VOI vizsgált térfogati egység ΔΨM mitokondriális transzmembrán potenciál 522 DF 32 522 nm-s sávszűrő 585 EFLP 585 nm-es sávszűrő
6
Bevezetés A fokális agyi ischaemiát leggyakrabban az intra- és extrakraniális agyi artériák tromboembóliája vagy atherothrombotikus elzáródása okozza. A patológiai kimenetel egyaránt függ az ischaemia mértékétől és idejétől. Amikor a véráramlás egy bizonyos szint alá csökken, egy sor biokémiai folyamat indul el, mely az agyi funkciók elvesztéséhez, majd a sejtek pusztulásához vezet. Az oxigén és glükóz szint csökkenése energiakrízishez vezet, amit az ATP, foszfokreatin és a glikogén gyors elfogyása jellemez. Ezen túl az anaerob glikolízis laktátot termel, ami acidózist okoz. Az energiakrízis az ischaemiás szövetben membrán depolarizációt okoz következményes ionzavarokkal:
toxikus
mennyiségű
Ca2+
emelkedés
a
citoplazmában
és
extracellulárisan K+ szint emelkedés. A keringés helyreállásával az oxigénellátás javul, ami a normálishoz képest többszörös szabadgyök (ROS) termelést indít el. Ezek a folyamatok a sejtek károsodásához, illetve pusztulásához vezetnek. Az hogy egy sejt nekrózis vagy apoptózis útján pusztul el, két fő tényezőtől függ: a károsító hatás nagyságától és a sejtek ATP termelési képességétől, mivel ugyanis az apoptózis energiaigényes folyamat. Disszertációmban ezen folyamatok vizsgálataival és gyógyszeres beavatkozás eredményeivel foglalkozom.
Szabadgyökök Szabadgyököknek nevezzük azokat a molekulákat, melyeknek külső elektronhéján párosítatlan elektron van. Ennek következtében rendkívül reakcióképes molekulák. A reaktív oxigén gyökök (ROS) a molekuláris oxigén tökéletlen redukciója során jöhetnek létre: O2 + e- O2-. + e- + 2H+ H2O2 + e- + H+ OH. + e- + H+ H2O. A biológiailag legfontosabb ROS molekulák: O2-. szuperoxid anion, OH. hidroxilgyök és a H2O2 hidrogén peroxid, mely definíció szerint nem szabad gyök. A reaktív oxigéngyökök
alapvető
szerepet
játszanak
az
ischaemiás
agykárosodások
kialakulásában. Reperfúzió során emelkedik a szöveti oxigénellátás, melynek hatására az ischaemiás szövetekben oxidációs reakciók sora indul meg. Az agyban normál állapotban is elég magas az oxidatív metabolizmus szintje. Annak ellenére, hogy az agy tömege a test tömegéhez képest minimális, mégis a teljes oxigén felhasználás nagy
7
részét teszi ki. Normál körülmények között a felhasznált oxigén 2-3%-ból keletkezhetnek reaktív oxigéngyökök, ez az agyszövetben elérheti a 3-5% is. Elsősorban szuperoxid anion, hidroxil gyök és szuperoxid keletkezik. A szabadgyökök kétféle úton jöhetnek létre: enzimatikus és nem enzimatikus úton. Az enzimatikus utak közül a legfontosabb a NADPH oxidáz, mely a makrofágok és az endotél sejtek membránjában működik. További oxidázok a COX, LOX, MAO, glükóz-oxidáz, xantin-oxidáz, melyek működése során főleg szuperoxid anion és hidrogén peroxid keletkezhet. A szabadgyökök legnagyobb forrása a mitokondrium légzési lánca, amely a nem enzimatikus út. A folyamatban a Fe2+ atom fontos szerepet játszik, oxigénnel reagálva részlegesen redukált származékokat hozhat létre a Fenton reakció során. A keletkezett reaktív gyökök eliminációja két úton történik: enzimatikus (dizmutázok, pl. SOD, katalázok és peroxidázok) és nem enzimatikus (antioxidáns anyagok, pl. E és Cvitamin) folyamatok útján. Az oxidatív folyamatok által létrejött károsodások nagysága egyenesen arányos a reaktív molekulák keletkezésének sebességével és fordítottan arányos a védekező mechanizmusok potenciáljával. Az idegszövetben az antioxidáns rendszer aktivitása jóval kisebb, mint más szervekben, így az okozott károsodás nagyobb. A ROS mérésével következtetni lehet az oxidatív stressz mértékére, illetve a gyógyszeres terápiás beavatkozások hatékonyságára. Sajnos a ROS pontos detektálása nehéz feladat, mivel gyorsan reakcióba lép a környezettel. Számos módszert fejlesztettek ki az elmúlt évtizedben a szabad gyökök mérésére: kemilumineszcens módszer (Guzik 2005), enzimatikus meghatározás (Cao 2005), fluoreszcenciaalapú módszerek, elektron spin csapda módszer (Tarpey 2004). Az alkalmazott módszerekkel jól mérhetjük a ROS mennyiségét, de egyik sem ad jó vizualizációt a ROS sejten belüli eloszlásáról.
A mitokondrium szerepe az ischaemiában Az ischaemiás károsodások kialakulásában a mitokondriumoknak kulcsszerepük van: egyrészt a sejtek energiatermeléséért felelősek, másrészt az apoptotikus szignálok fontos átkapcsolói. Az agyi perfúzió csökkenésével mind az oxigén, mind a glükóz szállítása károsodik. A mitokondriális enzimrendszerekben ez egy több fázisú, bonyolult változást eredményez.
8
Az első fázisban az I. komplex gátlása alakul ki. Ez a folyamat nem vezet számottevő ATP szint csökkenéshez, viszont a szukcinát dehidrogenáz útvonal aktiválódik, és ezzel kompenzálja az energiatermelést. A második fázisban a további hypoxia hatására a légzési láncban az elektron transzfer gátlódik a citokróm b és c között. Ezért az ATP termelés már csökken. Igaz a IV. komplex ép és képes a normális működésre, azonban az elektron transzport károsodása miatt csökken az aktivitása. A második fázisban az ATP koncentráció és a parciális oxigén nyomás között egyenes arányosság van. A citokróm oxidáz komplett inaktivációja csak az anoxia közelében következik be. A harmadik fázisban a sejtlégzés és az oxidatív foszforiláció teljesen megáll. A hypoxiás fázisok jól korrelálnak a sejtek energiafüggő folyamatainak változásaival. A terminális fázisban bekövetkező ATP csökkenés olyan mértékű, hogy már a sejtek vitális funkcióinak fenntartásához is elégtelen az ATP mennyisége. A sejtpusztulás vezető oka a kialakult energiadeficit, mely az ischaemiás léziók magjában jellemző. A penumbra régióban, ahol kisebb az energia deficit egy sor biokémiai változás figyelhető
meg:
az
ún.
korai-gének
aktiválódása
olyan
másodlagos
gének
expressziójához vezet, melyek citokineket, gyulladásos faktorokat, növekedési hormonokat, illetve többek közt az apoptózisban részvevő fehérjéket kódolják. A mitokondriumok az apoptózis folyamatában központi szerepet kapnak: mind a kaszpáz függő, mind a független utat is képesek aktiválni. A mitokondrium a citokróm C, az ATP, a Ca++ és az AIF (apoptosis-inducing factor) forrása. Ezek az anyagok feltétlenül szükségesek az apoptózishoz. Amennyiben ezek kiszabadulnak a citoplazmába, programozott sejtpusztulás következik be (mitokondriális apoptózis szignál).
Apoptózis Az ischaemia következtében kialakult idegsejt károsodás egyik formája az apoptózis. Az apoptózis kifejezés nevét és definícióját 1972-ben Kerr és Wyllie írta le először (Kerr 1972). Morfológiai jellemzői a következők: a plazma membránon kitüremkedések jelennek meg, majd a sejtmag kondenzálódik, később darabokra esik szét, a citoplazmában vakuólumok jelennek meg, végül a sejt membránnal határolt, a különböző sejtalkatrészeket magába foglaló, ún. apoptotikus testekre darabolódik szét. Maga a programozott sejthalál az egyik alap mechanizmus a homeosztázis 9
fenntartásában, az embrionális fejlődésben és a regenerációra nem alkalmas, károsodott sejtek elpusztításában. Az apoptózist sejtszignálok indítják be és vezérlik. Ezek a szignálok lehetnek extracelluláris és intracelluláris molekulák (Hengartner 2000). Az utóbbiak lehetnek: hormonok, növekedési faktorok, citokinek, illetve nitrogén-monoxid is. A belső folyamat a sejtben felszabadult vegyületek hatására indul be. Ezt előidézheti: sugárzás, magas hőmérséklet, vírusfertőzés. A halálutak lejátszódásának feltétele, hogy a jelmolekula kötődjön receptorához. Összegezve elmondható, hogy létezik: •
Intrinszik, azaz belső, mitokondriális útvonal,
•
Extrinszik, azaz külső útvonal (halál szignálok, ligandok bekötődése a
sejtmembrán receptoraira).
1. ábra. Az apoptózis útvonalai.
Az intrinszik útvonalról a következő fejezetben bővebben írok. Az extrinszik útvonal az apoptózis evolúciójának legmagasabb szintjén jelenik meg. Az ún. halál ligandok olyan citokinek, amelyek a receptorukkal való kapcsolódás után az arra érzékeny sejtekben
10
apoptózist indukálnak (Ashkenazi 1998). A halálreceptorok fontos szerepet játszanak a finoman szabályozott szöveti homeosztázis fenntartásában. Működésük zavara meghatározó lehet számos patológiás folyamatban, mint pl. a daganatképződésben vagy néhány neurodegeneratív betegségben. A legismertebb halálligandok a tumor nekrózis faktor (TNF), FAS és TRAIL ligandok. A halálreceptorokhoz az aktiválódás után adaptor fehérjék (DISC, apoptózis indukáló szignál komplex) kapcsolják az ún. iniciátor kaszpázokat. Ez a komplex aktiválja végül az effektor kaszpázokat, az apoptózist végrehajtó gépezetet (Budihardjo 1999). A 1. sematikus ábrán összefoglalva láthatjuk a programozott sejthalál elindító és végrehajtó folyamatait.
Mitokondriális apoptózis szignál Az apoptózis indukciójáért felelős jelek egy része nem a halál-receptorokon keresztül hat, hanem a mitokondriumokban összegződik (Brenner 2000). A mitokondriumok olyan fehérjéket tartalmaznak, melyek
a citoplazmába jutva elindítói vagy
elengedhetetlen résztvevői az apoptotikus folyamatoknak: apoptózis indukáló faktor (AIF),
citokróm-C,
SMAC/DIABLO.
Ezen
fehérjék
citoplazmába
jutása
a
mitokondriális apoptózis folyamat egyik kulcsa. Ahhoz, hogy a fehérjék kijussanak, a mitokondrium külső membránjának áteresztővé kell válnia. A következő fejezetben részletesen írok az átmeneti permeabilitási pórusról, melynek megnyílása lehetővé teszi az apoptózis fehérjék kiszabadulását a citoplazmába. Ezt a pórust sokféle anyag szabályozza: a bongkrekát, a ciklosporin A, a Bcl-2 és a Bcl-XL, stb. gátolja, míg a BAX, BAK, Ca2+, zsírsavak, ROS és nitrogén monoxid elősegíti a pórus megnyílását. A citokróm-C a citoplazmában az ATP-vel és az APAF-1-gyel képezi az apoptoszómát, melyhez a prokaszpáz-9 is kapcsolódik (Pekins 2000). Ennek az enzimkomplexnek a feladata a kaszpáz-9 aktiválása. Az apoptoszóma kialakulását a HSP-90 és a HSP-27 gátolja, az APAF-1 és citokróm-C gátlásán keresztül. A kaszpázok apoptoszómán keresztüli aktivációját nemcsak az APAF-1 gátlásával lehet akadályozni, hanem az ún. apoptózis gátló fehérjecsalád (IAP, XIAP) tagjai is képesek a kötődésükkel gátolni a kaszpáz 3 aktiválódását. A mitokondriumból felszabaduló SMAC/DIABLO az IAP gátlásán keresztül az apoptózisra érzékennyé teszi a sejteket. Ezen túlmenően a permeabilitási pórus megnyílásakor egy további fehérje is kiszabadul és a sejtmagba transzlokálódik, ez pedig az AIF. Ez egy 57 kD nagyságú oxidoreduktáz aktivitású 11
fehérje, mely a sejtmagban DNS fragmentációt és kromoszómakondenzációt okoz, illetve a plazmamembrán foszfatidil-szerinjének felszínre kerülését segíti elő. Ez az útvonal a jelen ismeretek szerint független a kaszpázoktól (Dauglas 2000).
Mitokondriális átmeneti permeabilitási pórus A mitokondrium membránban egy ún. mitochondrial permeability transition pore complex (MPTP) található. Ez egy olyan multiprotein komplex, mely a külső és belső membránt összeköti és egy nagy átmérőjű csatornát alkot (Halestrap 1999). Az MPTP átmérője 2 nm-nél nem nagyobb és csak a 1.5 kDa alatti nagyságú anyagokat engedi át, pl. az ionokat, szabadgyököket. Az MPTP szabályozza a mitokondrium mátrix Ca2+ koncentrációját, a pH-t, a ∆ψm-t (transzmembrán potenciál) és a mitokondrium méretét. Az MPTP rövid idejű megnyílása lehetővé teszi a légzési láncnak, hogy az elektrokémiai gradienst létrehozza, mely az ATP termelés meghajtója (Kroemer 2000). A csatorna felépítésében több alkotórész vesz részt: hexokináz, VDAC (voltage dependent anion channel, mitochondrial porin), ANC ( adenine-nucleotid carrier), cyclophilin D, kreatin kináz és a PBR (2. ábra).
2. ábra. Az MPTP sematikus szerkezete.
Az MPTP bonyolult szabályzásában részt vesznek a Bcl-2 fehérjecsalád tagjai. Ez a család 16 fehérjéből, illetve az őket kódoló génekből áll, ebből hat (Bcl-2, Bcl-xl, stb.)
12
antiapoptotikus, míg 10 (Bcl–xs, Bax, Bad, Bag, stb.) proapoptotikus hatású (Chao 1998). Az MPTP szerkezeti elemeihez kötődve, annak változtatásával képesek megnyitni vagy bezárni a csatornát. A proapoptotikus hatású proteinek a külső membránhoz kötődve, a VDAC/ANC komponensekkel kapcsolatba lépve, olyan konformáció változást eredményeznek, aminek hatásaként 2.3-3 nm nagyságúra nyílik meg az MPTP. Ezen keresztül már nagyobb molekulák is átjutnak. A csatorna megnyílása következtében a transzmembrán potenciál, a pH gradiens hirtelen lecsökken, az ATP termelés szinte azonnal megszűnik. A nagyobb csatorna méret miatt az AIF és a citokróm C kikerül a citoplazmába, ahol az apoptózis folyamatában kulcsfontosságú szerepet tölt be. Az antiapoptotikus hatású Bcl-2 család fehérjéi képesek ezt a nagyobb méretű csatornát gátolni és bezárni. Így a transzmembrán potenciál és a pH gradiens újra felépülve ismételt ATP termeléshez vezet, ezzel a sejt túléléséhez, vagy az energiaigényes apoptózishoz üzemanyagot szolgáltat. Tehát a Bcl-2 család anti- és proapoptotikus fehérjéinek egyensúlya fontos induktora az apoptózis szignáloknak. Mint látjuk a mitokondriumnak központi szerepe van az oxidatív károsodások kialakulásában. Ezen folyamatok pontos időbeli és mennyiségi lefutása még nem pontosan tisztázott. A mitokondrium aktuális állapota három végponthoz vezethet: nekrózis, apoptózis és sejttúlélés/regeneráció. Feltételezések és mérések szerint az MPTP nyitva tartásának ideje, a „nyitott” mitokondriumok száma dönti el a kimenetelt (Halestrap 2004). A 3. ábrán láthatjuk, hogy minél több mitokondrium károsodik és nyílik meg, annál inkább az apoptózis/nekrózis irányába fordulnak a történések. A második sarkalatos pont, hogy mennyi ideig van nyitva az MPTP. Ha sokáig van nyitva, akkor a mitokondrium membránpotenciálja és az ATP termelés gyakorlatilag megszűnik, az egész mitokondrium duzzadni kezd és végül fragmentálódik, ekkor nekrózis alakul ki. Amennyiben az MPTP be tud záródni, de már az AIF és citokróm C nagy része a plazmába kiszabadult és az apoptotikus szignálok elindultak, a transzmembrán potenciál felépül és elég ATP-t tud termelni a sejt számára, hogy az apoptózis energiaigényes folyamatai végbemenjenek.
13
3. ábra Sematikus összefoglaló. Az MPTP megnyílás/zárás hogyan determinálja a sejtpusztulást az apoptózis vagy nekrózis irányába. Átvéve Halestrap 2004-es közleményéből.
Perifériás benzodiazepin receptor (PBR) 1977-ben Braestrup közölte elsőként a benzodiazepin kötődését a PBR-hez patkány vesében (Braestrup 1977.). A perifériás név arra szolgál, hogy a centrális benzodiazepin receptortól megkülönböztesse. Későbbi vizsgálatok azt bizonyították, hogy a PBR főként a mitokondriumok külső membránjában helyezkedik el, bár egyes sejttípusokban a plazmamembránban és a sejtmag körül is megtalálható. Szöveti eloszlása szerint legnagyobb mennyiségben a mirigyekben és a szekretoros szövetekben fordul elő, közepes mennyiségben a vesében és a szívben, míg legkisebb az előfordulása a májban és a központi idegrendszerben (Anholt 1985). Az utóbbiban a gliasejtek, főleg az asztroglia és a mikroglia tartalmazzák (Park 1996). Szerkezetét tekintve ez a receptor egy 18 kDa nagyságú 5 α-helix. VDAC-al és ANC-el hármas komplexet képes alkotni (2. ábra). Az utóbbi évtizedben számos vizsgálat történt a funkciójának kiderítésére. A legjobban dokumentált hatása a szteroid bioszintézis szabályozása. (Besman 1989). A koleszterin átjutását szabályozza a mitokondrium külső membránjáról a belsőre.
14
Perifériás benzodiazepin receptor és a mitokondriális funkciók Az elmúlt 20 évben számos mitokondriális funkciót vizsgáltak a PBR aspektusából. Elsőként 1991-ben Baker és munkatársai igazolták, hogy a PBR és a Rhodobacter capsulatus fotoszintetizáló baktérium CrtK fehérjéje nagyfokú hasonlóságot mutat (Baker 1991). Ez alapján felmerült, hogy a kék baktériumok egyik faja volt a közös ős, mely szimbiózisban élve a mitokondrium ősét képezte a sejtekben. Ezt az elméletet Yeliseev 1997-ben igazolta, amikor a Rhodobacter sphaeroides baktériumban a funkcionálisan hibás, mutálódott CrtK-t PBR-rel pótolta, mely oxigén jelenlétében negatívan szabályozta a fotoszintézist (Yeliseev 1997). További vizsgálatok azt mutatták, hogy a PBR aktivációval a IV. légzési állapot növekedett, a III. állapot rövidebb lett, ezzel a légzési kontroll arány szignifikánsan csökkent. Egy másik vizsgálatban a hidrogén-peroxid toxicitást vizsgálták hemopoetikus sejtekben. Azt találták, hogy a peroxid elleni rezisztencia korrelál a PBR expresszióval (Carayon 1996). Ezen eredmények alapján feltételezhető, hogy a PBR sejtszintű oxigén szenzorként is viselkedik, részt vesz az oxigén triggerelt jelek indításában és a sejtszintű adaptációs válasz létrehozásában. A korábbi fejezetben részleteztem az MPTP szerepét az apoptózisban. A PBR-hez kötődő molekulák az MPTP-t képesek aktiválni vagy gátolni. Két jól ismert molekulát vizsgáltak a legtöbbször: a diazepam egyik származékát az Ro5-4864-t, illetve egy isoquinoline származékot a PK11195-t. A viselkedése alapján az Ro5-4864-t agonistának, míg a PK11195-t antagonistának klasszifikálták (LeFur 1983). Hatását tekintve a PK11195 proapoptotikus (Hirsch 1998), míg az Ro5-4864 antiapoptotikus hatású molekula (Bono 1999). A
klinikai
vizsgálatokban
egyre
több
bizonyítékot
találnak
arra,
hogy
a
neurodegeneratív betegségekben a mitokondrium diszfunkciója lehet az egyik patomechanizmus. Több vizsgálatban bizonyították, hogy a PBR receptor denzitás emelkedik gyulladásban (Banati 1997), traumás állatmodellben, ischaemiában (Stevenson 1995), Alzheimer kórban (Diorio 1991), és Huntington kórban (Messmer 1998). Az in vivo képalkotásban ezt a jelenséget használhatjuk ki, a PBR ligandokkal a reaktív gliosist, sőt, esetleg a daganatokat korai fázisban ki lehet mutatni (Casellas 2002).
15
Vinpocetin és származékai A Vinpocetint (vinpocetin-ethyl-apovincaminsav) az 1960-as évek végén szintetizálták a Vinca Minor növény vincamin alkaloidjából (4. ábra). 1978-óta Cavinton néven használják Magyarországon a cerebro-vaszkuláris megbetegedések kezelésére. A molekula
hatásmechanizmusáról
számos
elmélet
született.
Három
fő
hatást
tulajdonítanak a vinpocetinnek: antioxidáns, vazodilatációs és neuroprotektív hatást. Az utóbbi időben
leginkább
mechanizmushoz
kötik
a
„dirty hatását
drug”-nak (5.
tartják,
ábra).
mert
Tekintsük
nem egy konkrét át
a
legfontosabb
mechanizmusokat:
4. ábra Vinpocetin és származékai
•
Foszfodiészteráz 1 gátlás: A ciklikus nukleotidok, cAMP és cGMP a másodlagos jelátvivő rendszerekben játszanak fő szerepet a normál és patológiás folyamatokban. A cAMP és cGMP a foszfodiészteráz enzimeken metabolizálódnak. A vinpocetin a PDE 1 izoemzimet gátolja (IC50=30-200 µM), ezzel emeli a cGMP szintjét és aktivitását a sejtekben (Beavo 1976). A cGMP szint emelkedése az agyi erekben vazodilatációt okoz, mely következményes agyi keringésjavulást eredményez. Ezen kívül a vérlemezkék csökkent aggregációját észlelték Cavinton adása után, ami a 16
cerebro-vaszkuláris betegségek megelőzésében és kezelésében rendkívül fontos hatás, bár ennek mértéke nem azonos bármely konvencionális antiaggregációs szer hatásával. •
Ion csatornákra gyakorolt hatás: A vinpocetin legtöbb hatását magyarázó mechanizmus a feszültség függő Na csatorna gátlása a neuronokban (Molnar 1995). Ez a gátlás dózisfüggő (IC50=44.2 µM), erősségben hasonlatos az egyik tipikus Na csatorna gátlóval, a Phenytoinnal. Mindkét molekula tartósan inaktiválja a csatornát. A postszinaptikus membránon a kalcium beáramlást is gátolja az NMDA (N-metild-aszpartát) receptor gátlásával. Ezzel a Ca2+ szint emelkedését gátolja meg a neuronokba.
Hypoxiában,
illetve
ischaemiában
a
felszabaduló
toxikus
neurotranszmitterek, mint pl. a glutamát, károsító hatását csökkenti a Na csatorna gátlással és a Ca beáramlás csökkenésével, és ezzel neuroprotektív hatást fejt ki (Miyamoto 1989). .
5. ábra Vinpocetin hatásmechanizmusianak sematikus összefoglalója (a képet a www.vinpocetin.info oldalról vettem át)
17
Sejtbiológiai vizsgálatokban azt találták, hogy a vinpocetin sejtvédő hatása 10-6 M koncentrációnál változik meg, ennél nagyobb koncentrációban fokozza a sejtpusztulást, míg ennél kisebb koncentrációban védő hatást fejt ki oxigén hiányos modellben. Ennek alapján a vizsgálatunkban 10-5, 10-6 és 10-7M-os koncentrációban mértük a vinpocetin hatását
Deprenyl és származékai
6. ábra A deprenyl metabolizmusa és a főbb metabolitok.
A deprenylt (fenil-izopropil-metil-propargylamin) 1962-ben szintetizálták először. 1965-ben írták le először MAO gátló hatását, majd később pontos mérések bizonyították, hogy szelektíven és irreverzibilisen gátolja a MAO-B enzimet (Knoll 1965, Knoll 1972). A klinikai alkalmazás során ezt a hatását használják ki Parkinson kórban szenvedő betegek kezelésére. A deprenylt a betegség korai szakaszában alkalmazva a levodopa kezelés kezdete későbbre tolódik ki, csökken a szükséges dózisa 18
és csökken a tünetek fluktuációja (Parkinson Study Group 1998). A betegek kezelésére 5-10 mg/nap dózisban alkalmazzák, mely nemcsak a nigro-striatalis rendszerben okoz dopamin hatást, hanem a mesolimbikus, tubero-hipofizealis és a kemoszenzitív trigger zónában is, mely rendszerek a mellékhatásokért lehetnek felelősek (Shoulson 2002). A deprenyl gyorsan metabolizálódik a szervezetben. A 6. ábrán láthatjuk a fő metabolitokat, amelyek két enzim rendszeren keresztül alakulnak ki. A fő útvonal a citokróm P450 enzimen keresztüli dezalkiláció. Ebből a reakcióból keletkezik a metamfetamin (MA), amfetamin (A) és dezmetil-deprenyl (DD) (Katagi 2002). A másik metabolikus útvonal a flavin tartalmú monoaminooxidáz enzim, amelyből a pár éve felfedezett és szintetizált deprenyl-N-oxid (DNO) keletkezik. Ez a metabolikus útvonal a korábbi HPLC módszerek hibája miatt maradt rejtve, mivel acil reagenst használva a DNO gyorsan átalakul MA-ná és DD-lé, és így nem lehetett kimutatni. A deprenylről először 1984-ben írták le, hogy az 1-metil-4 fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridin (MPTP/MPP+) toxikus hatását csökkenti azáltal, hogy az MPTP/MPP+ átalakulást gátolja a MAO-B-n keresztül (Cohen 1984). Későbbi vizsgálatban az MPP+ direkt toxikus hatását is sikerült gátolni a deprenyllel, mely már MAO-B független hatás lehet, bár az irodalom ellentmondásos ezen a téren (Waldmeier 2000). DSP-4 noradrenalinerg neuronok szelektív toxinjával végzett kísérletek alapján vizsgálták először a deprenyl és egyes metabolitjainak hatását. Ezek szerint a deprenyl szignifikánsan csökkenti a DSP-4 károsító hatását, viszont SKF 525A jelenlétében, mely a P450 enzimrendszer gátlója, ez a hatás megszűnik. Ez felveti, hogy a deprenyl metabolitjainak potencírozó hatásuk van (Magyar 1996). Felmerült a kérdés, hogy a deprenyl, vagy valamelyik metabolitja az aktív neuroprotektív hatású molekula? 2002ben Tatton PC-12 sejttenyészetben azt találta, hogy a dezmetil-deprenyl lenne az aktív neuroprotektív metabolit (Tatton 2002). Ennek ellentmond Magyar és munkatársainak humán melanoma sejteken végzett vizsgálata, amely során kizárólag a deprenyl alacsony koncentrációjánál találtak antiapoptotikus hatást (Magyar 1998). A kutatások szerint a deprenyl antiapoptotikus hatása bifázisos természetű: nagy koncentrációban
(10-3M)
pro-,
míg
alacsony
koncentrációban
(10-9-10-13M)
antiapoptotikus hatású (Tatton 2000, Tatton 2002, Magyar 1998). Az antiapoptotikus hatást többféle mechanizmussal magyarázzák. PC-12 sejtkultúrában igazolták, hogy a deprenyl kezelés a szérum megvonás, illetve NGF megvonás után 10-9M
19
koncentrációban a mitokondrium ∆ψm csökkenését kivédte (Wadia 1998). Ezen túlmenően a deprenyl több mint 50 gén expressziós változását eredményezi (Tatton 1996) A proapoptikus proteinek (BAX, c-JUN, c-FOS, GAPDH, glutation peroxidáz, stb.) szintjét csökkenti, míg a túlélést javító fehérjék (Bcl-2, Bcl-XL, SOD1, SOD2, katalázok, HSP 70, stb.) szintjét emeli. A jelenleg elfogadott elmélet szerint a deprenyl sejtvédő hatását az MPTP mitokondriális csatorna szabályozásában résztvevő gének és antioxidáns hatású fehérjék expressziós változtatásán keresztül fejti ki.
20
Célkitűzések Munkám során a neurológiai kezelésben régóta használt vinpocetin és deprenyl neuroprotektív hatását vizsgáltam. Mindkét molekulának ismert volt ez a hatása, de a pontos mechanizmusról ellentmondásos adatok jelentek meg. A célkitűzéseim a következők: •
egyesített szabadgyök és mitokondriális transzmembrán potenciál mérésére szolgáló metodika kialakítása és validálása,
•
a vinpocetin dózisfüggő hatásának vizsgálata sejtpusztulás, ROS és MMP mérés alapján,
•
vinpocetin PBR receptorhoz való kötődésének igazolása PET vizsgálattal,
•
stroke-ot elszenvedő betegek agyában a vinpocetin kezelés után a glükóz metabolizmus és a véráramlás pontos regionális változásának meghatározása,
•
PC-12
sejttenyészetben
a
deprenyl
és
deprenyl-N-oxid
dózisfüggő
neuroprotektív hatásának vizsgálata, •
a deprenyl és deprenyl-N-oxid antiapoptotikus hatásának vizsgálata patkány és egér agyi stroke modellben,
•
a deprenyl fő metabolikus útvonalának gátlásával bizonyítani, hogy a deprenylN-oxid az aktív metabolit.
21
Módszerek Állatkísérletek A kísérletek során 320-460 g testtömegű hím Wistar patkányokat, 40-60 g tömegű hím Mongol Gerbil egereket, illetve 4.0-7.1 kg tömegű nőstény makákó majmokat használtunk. Az állatokat az Európai Unió megfelelő rendelkezéseivel összhangban tartottuk és kezeltük. A kísérleti folyamatot a helyi (Budapesti és Stockholmi) Etikai Bizottság megvizsgálta és elfogadta.
Permanens cerebri media okklúzió patkányban A kísérleti állatok 320–460 g testtömegű hím Wistar patkányok voltak. A kísérleti állatokat 4% halotánnal altattuk, majd a mély narkózist 70% N2O és 30% O2 keverékében 2–2,5% halotánnal tartottuk fenn, maszk segítségével. A pMCAO kivitelezéséhez standardizált technikát használtunk (Coyle 1982). Az ischaemiás léziót a bal oldali artéria cerebri media (MCA) agyfelszínen végzett elektrokoagulálásával hoztuk létre. Körülbelül 3 mm átmérőjű csontablakot készítettünk éppen a bal oldali artéria cerebri media felett. Eltávolítottuk a dura matert. Ezt követően azonosítottuk az artéria cerebri mediát, majd bipoláris koagulátor segítségével elzártuk a fő ágait. A koagulálás után az agyfelszínt Spognostane-val fedtük be, majd előbb az izmokat varrtuk össze, utána pedig a sebfelszínt zártuk le. A műtét után az állatokat visszahelyeztük a ketrecbe.
Kétoldali, artéria carotis interna átmeneti lekötése egérben A kísérleti állatok 40-60 g testtömegű hím Gerbil egerek voltak. A kísérleti állatokat 4% halotánnal altattuk, majd a mély narkózist 70% N2O és 30% O2 keverékében 2–2,5% halotánnal tartottuk fenn, maszk segítségével. A nyakon középvonali metszés után mindkét oldalon a carotis internát kipreparáltuk, úgy hogy a mellette futó vagus ideg sértetlen maradjon (Nakanishi 1994). A preparálás után Codman aneurysma mikroklippel 10 percre lezártuk a keringést mindkét oldalon. 10 perc után a klippeket eltávolítottuk és ellenőriztük, hogy a carotisokban a keringés elindult-e. A nyaki bőrseb zárása után az altatást befejeztük és ébredés után az állatokat visszahelyeztük a ketreceikbe.
22
PC-12 sejttenyészet PC 12 (ATCC, Manassas, VA, USA) sejteket DMEM tápoldatban tenyésztettük, mely 10% borjú-, 5% lószérumot, 2 mM L-glutamint, 50 IU/ml penicillint és 50 UI/ml streptomycint tartalmazott. A sejteket a 24 lyukú tenyésztő lemezre helyeztük, melye a lyukak átmérője 15 mm volt. Minden lyukba patkány farokból izolált kollagénnel bevont kerek üveglemezt helyeztünk, erre növesztettük rá a sejteket (Csonka 1980). NGF kezeléssel a PC 12 tenyészetet differenciáltattuk 5 napig.
Hypoxia-reoxigenizáció PC-12 sejttenyészetben A 24 lyukú edényben tenyésztett sejtek fölé argon gázt rétegeztünk, így elvonva az oxigént (Kusumoto 1996). Egy órás beavatkozás hatására a tápoldatban mért 154.65±1.35 Hgmm-es parciális oxigén nyomás 51.96±2.53 Hgmm-re csökkent, ezzel kb. 30%-os oxigén szintet értünk el. A hypoxiát követően az argon gázt eltávolítottuk a tenyészetről, majd 24 órára normál termosztátba helyeztük, ez volt a reoxigenizációs időszak. A kontroll sejtek folyamatosan a termosztátban voltak normál oxigén szint mellett.
TTC festés A patkányok agyát eltávolítottuk, felszeleteltük, majd a károsodott szövetek térfogatának méréséhez a 2 mm vastag, friss agyszeleteket 2,3,5-trifeniltetrazóliumklorid reakcióval (TTC-módszer) megfestettük (Bederson 1986). A TTC-reakció pirosra festi a mitokondriális dehidrogenázokat. A fehéren maradt, nem festődött területet infarcerálódott agyszövetként azonosítottuk. Ezt követően a TTC-vel festett agyszeleteket lefényképeztük, a fényképeket digitalizáltuk, majd a lézió területét az egyes agyszeletekben számítógépes morfometria segítségével határoztuk meg. A művelet során az UTHSCA ImageTool nevű programot használtuk. Az egyes állatok infarktusának térfogatát mm3-ben kaptuk meg, a szeletvastagság és az infarcerálódott terület szorzatát összegezve, az adott állatból származó agyszeletekre nézve.
23
Propidium jodid festés A 24 órás reoxigenizáció után a sejtekről eltávolítottuk a tápoldatot, majd 1.5 µg/ml-es koncentrációjú propidium jodid oldattal 2 percig festettünk. Az élő és halott sejteket 490nm-es fényt kibocsátó fluoreszcens mikroszkópban számoltuk meg 585nm-es szűrő mellett. A sejtpusztulás mértékét százalékos értékben adtuk meg az az összes leszámolt sejthez képest.
Immunhisztokémia TUNEL/Kaszpáz-3 festés. A 10%-os paraformaldehidben való fixálás, valamint paraffinba való beágyazás után 6 µm-es metszeteket készítettünk a kísérleti állatok agyából. Minden állatból a hippokampuszról 4 db 1 mm távolságú síkban 3-3 metszetet készítettünk. A konfokális lézerpásztázó mikroszkópos (CLSM) tanulmányozáshoz előtisztított, szilánozott lemezekre vittük fel a deparafinált metszeteket. Az infarktus körüli régióban található apoptotikus sejtek azonosításához a törött DNS-végeket fluoreszcens TUNEL kit segítségével jelöltük meg (F. Hoffmann- La Roche Ltd, Basel, Switzerland). Ezzel egyidejűleg kaszpáz-3 primer antitesttel (Immunotech, egér anti-kaszpáz-3, Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA, USA) 1:500-as hígításban és Alexa 568 másodlagos antitesttel (kecske anti-egér Alexa 568, Molecular Probes, Invitogen GMBH, Austria) 1:200-as hígításban fluoreszcens immunhisztokémiát is végeztünk. A festés során nem használtunk antigén felfedő előkezelést, ezért az alapszintű kaszpáz-3-kifejeződést nem detektáltuk, a permanens artéria cerebri media okklúziót követő fokozódott kaszpáz-3expressziót viszont regisztráltuk. PBR immuncitokémia. A PBR receptor denzitás meghatározására immunfestést használtunk a PC 12 sejtekben. 0.25% paraformaldehid 2 perces fixálás után PBS-sel kétszer átmostuk a tenyészetet. Anti-PBR elsődleges antitesttel (nyúlban termelt anti-PBR antitest, R&D Systems Inc., Minneapolis, USA) egy óráig festettünk 1:500-as hígításban, majd PBS lemosás után a FITC jelölésű másodlagos fluoreszcens antitesttel (kecske anti-nyúl IgG FITC, Molecular Probes, Invitogen GMBH, Austria) kezeltük a sejteket 1:200-as hígításban.
24
Szabadgyök festés és a mitokondrium transzmembrán potenciál meghatározás PC-12 sejtekben A két festési módszert módosítottuk és egy közös módszert hoztunk létre (Szilágyi 2006). Emiatt ebben a fejezetben együtt tárgyaljuk a festéseket. A korábban kidolgozott módszerekkel jól mérhetjük a ROS mennyiségét, de egyik sem ad jó képet a ROS sejten belüli eloszlásáról. Az utóbbi években, a konfokális lézer szkenning mikroszkópia elterjedésével új ROS kimutatási módszerre nyílt lehetőség. A cérium klorid (CeCl3) molekula a külső elektronhéjon keringő párosítatlan elektron miatt rendkívül könnyen reakcióba lép a szabad gyökökkel. Ebből a reakcióból cérium-perhidroxid molekula keletkezik, amely fényvisszaverő tulajdonságú, oldhatatlan csapadék (Robinson 1990, Halbhuber 1996, Telek 1999). Ezt a fényvisszaverő tulajdonságot lehet kihasználni a CLSM reflexiós üzemmódjában. Ezt a módszert egészítettük ki egy másik mitokondriális modalitás, az MMP mérésével. Festés leírása: A DMEM-t eltávolítottuk, majd 300 μl, 10 μg/ml koncentrációjú JC-1 (Molecular Probes, Invitogen GMBH, Austria) festéket adtunk a sejtekhez 10 percig. Ezután a sejtkultúrát fiziológiás sóoldattal mostuk át. Majd két percig festettünk ismét 300 μl mennyiségű, 20 mmol/l koncentrációjú Ringer-laktátban feloldott CeCl3–dal (Sigma-Aldrich Co, St. Luis, MO, USA). A CeCl3 oldat eltávolítása után ismételten fiziológiás sóoldattal öblítettük át a sejteket. Ezután 0.25%-os glutáraldehiddel fixáltuk azokat 2 percen keresztül. A kerek üveglemezen fixált sejteket Vectashield fluoreszcens lefedővel (Vector Laboratories, Inc. Burlingame, CA) tárgylemezen rögzítettük.
Konfokális lézer szkenning mikroszkópi A vizsgálataink nagy részében fluoreszcens festési módszert használtunk. Ennek a detektálására konfokális lézer szkenning mikroszkópot használtunk, amely egy Nikon OPTIPHOT mikroszkópra telepített (Donsanto Corp., Nattick, Massachusetts) BIORAD MRC 1024 konfokális rendszer (Bio-Rad Corp., Hertfordshire, England). Képalkotás a PC-12 sejttenyészetben A vizsgálatok során PC-12 sejttenyészetben JC-1 és CeCl3 kettősfestést és PBR immunfestést mértünk konfokális mikroszkóppal. Általános szabályként alkalmaztuk, hogy az összes méréshez használtunk saját kontroll csoportot, amihez a mért értékeket viszonyítottuk. Ezzel elkerülhető a szabadgyök és a mitokondrium membránpotenciál
25
mérésnél a más-más napon használt tenyészetekben feltételezhető eltérésekből származó hiba, annak ellenére, hogy a tenyésztés, a kezelés és a festési eljárások standard módon történtek. A különböző mérési beállításokat rögzítettük és mérés közben nem változtattunk raja. Vegyük sorra a mérési beállításokat. A JC1 festés során 488 és 568 nm-es gerjesztést, T1 és T2a 560 DRLP tükröket, 522 DF35, illetve 585 LP emissziós szűrést használtunk. A JC-1 monomer formája ilyen beállítás mellett zöld fluoreszcens jelet, míg a Jaggregátum piros jelet ad (7.ábra). A CeCl3 festett sejtek detektálása során a konfokális mikroszkóp reflexiós üzemmódját használjuk: 488 nm-es gerjesztést, B1 és T1 tükröket és kék-reflexiós szűrőt. A BPR immunfestésnél a másodlagos antitest FITC jelzésű így a következő beállítást használtuk: 488 nm-es gerjesztést, T1 és T2a 560 DRLP tükröket, 522 DF35 emissziós szűrést.
7. ábra. A, C kép ugyanazon sejtek a kontrollcsoportból, míg B és D kép a hypoxia reperfúzió csoportból. A felső sor demonstrálja a JC-1 J-aggregátum (piros jel) és monomer (zöld jel) egymásra vetített képét. Az A képen a viszonylag sok piros jel normális mitokondrium transzmembrán potenciálra utal. Az alsó sorban a cérium perhidroxid reflexiós jele piros, míg a zöld jel a sejtek jobb láthatósága miatt a JC-1zöld monomerje
A kvantitatív elemzéshez nagy felbontású (820x) képeket készítettünk. Minden mérési csoportban véletlenszerűen 100-100 sejtet fotóztunk le, majd egy beépített software (LaserSharp Processing, Bio-Rad Corp., Hertfordshire, England) segítségével a sejtekben mért átlag intenzitást határoztuk meg.
26
Képalkotás szövettani metszetben Szövettani metszeteken, mind a patkány, mind az egér kísérletekben TUNEL/Caspase-3 immunfestést használtunk 6 µm vastag fixált metszeteken. Az egyidejű képalkotásnál a TUNEL festés zöld jelet adott a FITC fluoreszcens festés miatt, míg a Caspase-3 esetén piros jelet kaptunk az Alexa 568-as másodlagos antitest miatt. Az alábbi beállítást használtuk: 488 és 568 nm-es gerjesztést, T1 és T2a 560 DRLP tükröket, 522 DF35, illetve 585 LP emissziós szűrést. A metszetekről nagyfelbontású (60-100x) képeket készítettünk. A TUNEL és Caspase-3 pozitív sejteket automatikusan számoltuk meg az Image J 1.37 software (NIH, USA) segítségével.
PET vizsgálat Humán PET vizsgálatok A vizsgálatot az Európai Unió megfelelő rendelkezéseivel összhangban a Debreceni Egyetem Etikai Bizottsága megvizsgálta és elfogadta. 13 ischaemiás stroke-on átesett vizsgálati személyt vizsgáltunk. Mind az MR, mind a PET vizsgálat során a betegek egyedileg elkészített műanyag sisakot viseltek, hogy a két vizsgálati modalitás azonos síkban készüljön. Az MR vizsgálat Shimadzu SMT100x1.0 T készüléken történt, a PET vizsgálat GE 4096 Plus teljes test pozitron kamerával készült 5 mm-es felbontással és 6.5 mm-es rétegvastagsággal. 10 mCi aktivitású F18-deoxy-D-glucose-t (FDG) használtunk a metabolizmus, 45 mCi aktivitású O15-butanolt az agyi véráramlás mérésére. Az aktivitás görbe számításhoz könyök vénából vettünk vért (Phelps 1979 ). A butanol-PET elvégzése után 45 perc késleltetéssel készült el az FDG-PET vizsgálat. A regionális agyi glükóz metabolizmust (CMRglc) a PET mérések és az aktivitás görbék alapján határoztuk meg a Kuwabara modell felhasználásával (Kuwabara 1990 ). A butanol (CBF) felvételeket Ohta féle két kompartment modell alapján rekonstruáltuk (Ohta 1996 ). A Karolinska Intézet Human Brain Atlas (HBA) rendszerében az MRI képeket a Talairach koordináta rendszerhez beforgattuk a fő síkok szerint. Ezután az individuális MRI képeket a HBA standard agy kontúrjához torzítottuk, majd az identikus PET képeket is a Talairach koordináta rendszer szerint beforgattuk (Talairach 1988). Így a két modalitás képei képpontonként teljesen egyeztethetővé váltak (8. ábra). Ezután a standard agyban VOI-kat (volume of interest) határoztunk meg az alábbi agyterületben:
27
jobb és bal félteke, az ép oldalon a frontális, parietális temporális, occipitális kéreg, talamusz, putamen, lencsemag, kisagy és agytörzs, míg a károsodás oldalán stroke terület, talamusz, kisagy és agytörzs. A VOI-kat felhasználva az egyedi PET képeken a VOI-n belül a parametrikus adatokat (rCBF, rCMRglu) meghatároztuk. Az adatokat ANOVA statisztikai módszerrel elemeztük.
8. ábra PET és MR felvétel egy betegről. (A) T1 súlyozott MR, (B) T2 súlyozott MR, CBF kép infúzió előtt (C) és után (D), CMRglc képek infúzió előtt (E) és után (F)
Majom PET vizsgálatok Makákó majmokban határoztuk meg a vinpocetin PBR receptor kötését. A vizsgálatban ECAT
EXACT
feloldóképességgel.
HR47
(Siemens)
Három-dimenziós
PET
rendszert
üzemmódban
használtunk, 47
3.8
horizontális
mm-es szeletet
készítettünk 3.125 mm-s rétegvastagsággal. A majmokat ismételt intramuszkuláris altatószerrel (0.8-1.0 ml/óra, ketamin (KetalarR, Parker-Davis, 50g/ml) és xylazine (RompunR vet, Bayer; 20 mg/ml) 1-1 arányú keverék) altattuk. Az állatokat sztereotaxias fixációval rögzítettük, hogy a mérések azonos pozícióban történjenek. A lábszárba intravénás kanült helyeztünk be az izotóp beadásához. A 63 perces mérés
28
során az első állat 60 illetve 66 MBq (1.62 és 1.78 mCi) dózisú [ 11C] PK11195-t, a másik állat 63 illetve 66 MBq (1.70 és 1.78 mCi) dózisú [11C]vinpocetin-t kapott. A két majom agyi képeit a Karolinska Intézet digitális majom agy atlaszához standardizáltuk (Roland 1994). Ezután mértük a teljes és a regionális radioaktivitást az izotóp beadás utáni 9. és 63. perc között (9. ábra). A jelzett vinpocetin és PK11195 felvételét, teljes és regionális kötési potenciálját a Logan féle lineáris analízis alapján határoztuk meg (Logan 1996)
9. ábra (A és B) a vizsgált majom MR képei a Talairach koordináta rendszerben z=2 és z=-10 mm, (C) [11C]PK11195 eloszlása előkezelés nélkül, illetve (D) 3mg/kg vinpocetinnel történt előkezelés után. (E) [11C]vinpocetin eloszlása előkezelés nélkül, illetve (F) 1mg/kg PK11195-tel történt előkezelés után.
Kísérleti elrendezések 1. kísérlet : PC-12 sejttenyészetben 1 órás Argon hypoxiát hoztunk létre, majd 24 órás re-oxygenizáció után feldolgoztuk a sejteket. Csoportok: kezeletlen normoxiás kontroll, kezeletlen hypoxiás kontroll, illetve vinpocetinnel kezelt (10-5, 10-6 és 10-7 M) hypoxiás csoportok. A kezelést közvetlenül a hypoxia után kezdtük el és 24 órán keresztül folytattuk. Mért paraméterek: sejtpusztulás mérése propidium jodid festéssel minden csoportból 10-10 látótér vizsgálatával, MMP és ROS termelés mérése a módosított kettős festéssel, minden csoportban 100-100 sejtet mértünk.
Minden mérés során 3-3 párhuzamos lyukat
használtunk fel.
29
2. kísérlet: Ebben a vizsgálatban 13 ischaemiás stroke-kal kezelt beteget vizsgáltunk (9 férfi, 4 nő, átlagéletkor 59,7±13,2 év). A betegek 14 napon keresztül 500 ml Salsol infúziót kaptak. 7 beteg csak sóoldatot, míg 6 beteg 1 mg/kg dózisban Cavintonos infúziót kapott kettős vak módon. Minden betegnél az infúziók előtt agyi glükóz metabolizmus (CMRglc) és véráramlás (CBF) PET vizsgálat történt (8. ábra). Ezen kívül neurológiai klinikai skálákat vettünk fel, doppler vizsgálatot és rutin laboratóriumi vizsgálatot végeztünk. 3. kísérlet: Ebben a mérésben a pozitron sugárzó
11
C-vel jelzett vinpocetin és
PK11195 felvételét és eloszlását vizsgáltuk majom agyban kontroll és előkezelt állapotban. A 63 perces mérés során az első állat 60 illetve 66 MBq (1.62 és 1.78 mCi) dózisú [11C] PK11195-t, illetve az izotópos mérések között előkezelésként 3 mg/kg jelöletlen vinpocetin-t kapott. A másik állat 63 illetve 66 MBq (1.70 és 1.78 mCi) dózisú [11C]vinpocetin-t kapott, előkezelésként 1 mg/kg dózisban PK11195-t adtunk. 4. kísérlet: PC-12 sejttenyészetben 1 órás Argon hypoxia után 24 órás reoxygenizáció következett. Csoportok: kezeletlen normoxiás kontroll, kezeletlen hypoxiás kontroll és deprenyllel kezelt (10-3, 10-8 és 10-12 M) hypoxiás csoportok. A kezelést közvetlenül a hypoxia után kezdtük el és 24 óráig tartott. Mért paraméterek: sejtpusztulás mérése propidium jodid festéssel minden csoportból 10-10 látótér vizsgálatával, MMP és ROS termelés mérése a módosított kettős festéssel, minden csoportban 100-100 sejtet mértünk. Minden mérés során 3-3 párhuzamos lyukat használtunk fel. 5. kísérlet: hím Wistar patkányban végleges artéria cerebri média elzárást (pMCAO) végeztünk. Vizsgálati csoportok: kezeletlen csoport (n=8), kezelt csoport (n=8). A deprenyl kezelést közvetlenül a pMCAO után kezdtük el 0,2mg/kg/nap dózisban. A kezelést 2 napon keresztül ozmotikus minipumpával tartottuk fenn. Mért paraméterek: infarktus térfogat mérése során TTC-vel festett 2 mm vastag sorozatmetszetekből határoztuk meg a térfogatot csoportonként 4-4 állatból, az apoptotikus sejtek TUNEL, NeuN és kaszpáz 3 festés alapján határoztuk meg. Konfokális mikroszkóppal a penumbra területről 30 db 270x270 µm négyzetet fényképeztünk le és azt dolgoztuk fel.
30
6. kísérlet: PC-12 sejttenyészetben 1 órás Argon hypoxia után 24 órás reoxygenizáció következett. Csoportok: kezeletlen normoxiás kontroll, kezeletlen hypoxiás kontroll és DNO-val kezelt (10-5, 10-8 és 10-12 M) hypoxiás csoportok. A kezelést közvetlenül a hypoxia után kezdtük el és 24 óráig tartott. Mért paraméterek: sejtpusztulás mérése propidium jodid festéssel minden csoportból 10-10 látótér vizsgálatával, MMP és ROS termelés mérése a módosított kettős festéssel, minden csoportban 100-100 sejtet mértünk. Minden mérés során 3-3 párhuzamos lyukat használtunk fel. 7. kísérlet: PC-12 sejttenyészetben 1 órás Argon hypoxia után 24 órás reoxygenizáció következett. Csoportok: kezeletlen normoxiás kontroll, kezeletlen hypoxiás kontroll és DNO-val kezelt (10-5, 10-8 és 10-12 M) hypoxiás csoportok. A hypoxia után a tenyészetet előkezeltük 10-5M koncentrációjú SKF 525A-val, majd ez után kezdtük el a DNO kezelést, mely 24 óráig tartott. Mért paraméterek: sejtpusztulás mérése propidium jodid festéssel minden csoportból 10-10 látótér vizsgálatával, MMP és ROS termelés mérése a módosított kettős festéssel, minden csoportban 100-100 sejtet mértünk. Minden mérés során 3-3 párhuzamos lyukat használtunk fel. 8. kísérlet: PC-12 sejttenyészetben mértük a DNO MMP-re gyakorolt hatását. 1 órás Argon hypoxiát hoztunk létre. Csoportok: kezeletlen hypoxiás kontroll, DNO-val előkezelt (10-12 M) és DNO-val utókezelt (10-12 M). Mért paraméter: JC-1 festéssel mértük az MMP-t. 9. kísérlet: PC-12 sejttenyészetben 1 órás Argon hypoxiát követően 24 órás reoxygenizáció volt. Csoportok: kezeletlen normoxiás kontroll, deprenyl 10-8 M normoxiás csoport, DNO 10-8 M normoxiás csoport, kezeletlen hypoxiás kontroll, deprenyl 10-8 M hypoxiás csoport és DNO 10-8 M hypoxiás csoport. Mért paraméter: PBR receptor denzitás immunfestéssel, minden csoportból 100-100 sejtet mértünk. 10. kísérlet: hím Gerbil egérben átmeneti artéria carotis interna elzárást (tACIO) végeztünk. Vizsgálati csoportok: kezeletlen csoport (n=6), DNO kezelt csoport (n=6). A DNO kezelést közvetlenül a tACIO után kezdtük el, 0,4mg/kg/nap dózisban adtuk intraperitonealisan 4 napon keresztül. Minden agyból 1 mm-s sorozatmetszetet készítettünk a hippocampusról, majd konfokális mikroszkóppal
31
a CA1 és CA2 régiót lefényképeztük és a TUNEL/Kaszpáz-3 pozitív sejteket leszámoltuk.
Eredmények Metodikai eredmények A mérési módszerünkkel a ROS termelés és MMP összefüggését tudjuk egy sejten belül vizsgálni kvantitatív módon (10. ábra). Ezt a kapcsolatot egy inverz függvénnyel írhatjuk le: y = 7.41x−0.47, ahol az y a cérium klorid festés jele, az x pedig a JC-1 arány.
10. ábra Az MMP és ROS termelés összefüggése PC-12 sejtekben 1 órás hypoxia és 24 órás reoxigenizáció után. (ábra átvéve saját közleményből)
Vinpocetin eredmények Sejtbiológiai mérések Vinpocetin hatása a sejtpusztulásra. A normoxiás kontroll csoportban a sejtpusztulás 18,7±1,4%, ami a hypoxiát követően 43,6±5,9%-ra növekedett (11. ábra). A vinpocetin kezelés 43,4±4,6%, 32,4±3,8% és 23,4±2,1% -ra csökkentette a károsodást (10-5,10-6,10-7M-os koncentrációban). A változás csak a 10-7M-os csoportban volt szignifikáns.
32
11. ábra Vinpocetin kezelés egy órás hypoxia után. A sejtpusztulást PI festéssel határoztuk meg 24 órás reoxigenizáció után. (átlag±SEM, p<0.05 * a hypoxiás kontrolhoz képest)
Vinpocetin hatása a mitokondriális membrán potenciálra (MMP). A normoxiás kontroll csoportban az MMP 2,8±0,34%, ami a hypoxiát követően 0,4±0,02%-ra csökkent (12. ábra). A vinpocetin kezelés 0,67±0,06%, 0,64±0,02% és 0,93±0,04%-ra változtatta a piros-zöld jel aranyát (10-5,10-6,10-7M-os koncentrációban). A változás mindhárom kezelt csoportban szignifikáns volt.
12. ábra Vinpocetin kezelés egy órás hypoxia után. A mitokondriális transzmembrán potenciált JC-1 festéssel (piros és zöld jel aránya) határoztuk meg 24 órás reperfúzió után. (átlag±SEM, p<0.05 *)
33
13. ábra Vinpocetin kezelés egy órás hypoxia után. A ROS termelést CeCl3 festéssel határoztuk meg 24 órás reperfúzió után. (átlag±SEM, p<0.05 *)
Vinpocetin hatása a ROS termelésre. A normoxiás kontroll csoportban a reflexiós jel átlagintenzitása 18,03±0,6%-ról 27,67±0,8%-ra emelkedett a hypoxiát követően (13. ábra). Vinpocetin kezelés 16,38±0,6%, 14,19±0,5% és 25,89±1,0%-ra változtatta a reflexiós szintet (10-5,10-6,10-7M-os koncentrációban). Szignifikáns változás a 10-5 és 10-6M-os koncentrációban volt. PET vizsgálatok Humán PET vizsgálat. Agyi véráramlás változása: A kezelt és kontroll csoportban nem változott szignifikánsan a teljes agyi CBF érték az infúziós kezelés előtt és után (1. táblázat). A regionális véráramlás méréseknél a kontroll csoportban a legnagyobb változást a középagyban, a hídban és a kisagyban észleltük, de egyik sem érte el a szignifikancia szintjét. Cavintonnal kezelt csoportban a legnagyobb változás az ellenoldali talamuszban, lencsemagban és a károsodás területén volt, de ezek sem érték el szignifikancia szintjét. A p értékek a Cavintonos csoportban alacsonyabbak (0,12-0,46) voltak, mint a kontroll csoportban (0,5-0,99).
34
1. táblázat Agyi véráramlás mérése különböző agyi területekben kezelés előtt és után (táblázat átvéve saját közleményből)
2. táblázat Agyi glükóz metabolizmus mérése különböző agyi területekben kezelés előtt és után (táblázat átvéve saját közleményből)
Az agyi glükóz metabolizmus mérésénél a kiindulási értékek mind a teljes agyban, mind a különböző régiókban alacsonyabb lett az infúziós kezelés után (2. táblázat).
35
A
metabolikus változások az agy stroke-s oldalán nagyobbak, a placebo csoportban kifejezettebbek voltak. A változások itt sem voltak szignifikánsak. Majom PET vizsgálat. [11C] PK11195 beadása után a mérés teljes tartama alatt a beadott izotóp radioaktivitásának csupán 0,77%-át mértük, míg a 3 mg/kg vinpocetinnel előkezelt mérésnél csak 0,6%-át észleltünk. A változás -22%. A [11C]vinpocetin beadása után a teljes radioaktivitás 3,84%-át mértük agyban, ezzel szemben az 1 mg/kg PK11195 előkezelés után 5.96%-ra emelkedett a mért mennyiség. Ez 36%-os emelkedést jelent (14. ábra).
14. ábra Radioaktivitás görbe a kijelölt agyi régiókban. A regionális aktivitást nCi/ml egységben adtuk meg. (A) [11C]PK11195 kontroll és előkezelt mérések, (B) [11C]vinpocetin kontroll és előkezelt mérések (az ábra átvéve saját közleményből)
36
Deprenyl eredmények Sejtbiológiai mérések Deprenyl hatása a sejtpusztulásra. A normoxiás kontroll csoportban a sejtpusztulás 19,5±2,18%, ami a hypoxiát követően 36,6±3,25%-ra növekedett (15. ábra). A deprenyl kezelés 44,2±5,78%, 21,5±2,33% és 21,4±3,97% -ra csökkentette a károsodást (10-3,10-8,10-12M-os koncentrációban). A változás a 10-8 és 10-12M-os csoportban volt szignifikáns.
15. ábra Deprenyl kezelés egy órás hypoxia után. A sejtpusztulást PI festéssel határoztuk meg 24 órás reoxigenizáció után. (átlag±SEM, p<0.05 *)
Deprenyl hatása a mitokondriális membrán potenciálra (MMP). A normoxiás kontroll csoportban az MMP 1,07±0,02%, ami a hypoxiát követően 0,68±0,01%-ra csökkent (16. ábra).
37
16. ábra Deprenyl kezelés egy órás hypoxia után. A mitokondriális transzmembrán potenciált JC-1 festéssel (piros és zöld jel aránya) határoztuk meg 24 órás reoxigenizáció után. (átlag±SEM, p<0.05 *)
Deprenyl kezelés 1,68±0,09%, 2,33±0,07% és 2,83±0,1%-ra változtatta a piros-zöld jel aranyát (10-3,10-8,10-12M-os koncentrációban). A változás mindhárom kezelt csoportban szignifikáns volt.
17. ábra Deprenyl kezelés egy órás hypoxia után. A ROS termelést CeCl3 festéssel határoztuk meg 24 órás reoxigenizáció után. (átlag±SEM, p<0.05 *)
38
Deprenyl hatása a ROS termelésre. A normoxiás kontroll csoportban a reflexiós jel átlagintenzitása 23,8±0,78%-ról a hypoxiát követően 28,9±0,65%-ra emelkedett (17. ábra). Deprenyl kezelés 32,1±0,65%, 28,8±0,78% és 20,8±0,58%-ra változtatta a reflexiós
szintet
(10-3,10-8,10-12M-os
koncentrációban).
A
10-3 és
10-12M-os
koncentrációban volt szignifikáns a változás. Állatkísérleti eredmények Patkányban permanens cerebri media okklúziós modellben vizsgáltuk a deprenyl neuroprotektív hatását. TTC festéssel határoztuk meg a károsodás mértékét. A kontroll csoportban 65,8±28,6 mm3 volt a lézió nagysága, míg a kezelt csoportban ez 36,5±24,4 mm3-re szignifikánsan csökkent (18. ábra).
18. ábra Infarktus mérete patkány agyban permanens cerebri media okklúzió után két nappal. 1 mm-s agyi szeleteken TTC festéssel volumetriát készítettünk. A deprenylt 0,2mg/kg/nap dózisban 2 napig adtuk a kezelt csoportban (átlag±SEM, p<0.05 *)
Immunfestéssel vizsgáltuk
a penumbra régióban az apoptózis
mértékét.
A
TUNEL/kaszpáz-3 pozitív sejtek átlagszáma a kezelt csoportban látóterenként 8±6-ról 3,3±3-ra szignifikánsan csökkent (19. ábra). A TUNEL jelzett neuronok száma 9±7-ről 6±6-ra csökkent a deprenyl kezelés hatására (20. ábra). Ez a változás nem volt szignifikáns.
39
19. ábra TUNEL-kaszpáz-3 kettős jelölésű sejtek száma a kontroll- és a kezelt csoportban. A TUNEL-kaszpáz-3 kettős jelölésű sejtek száma 30 mintára nézve és átlagolva: 8±6 a kontroll állatokban, 3±3 a kezelt állatokban (p=0,0003) (átlag±SEM, p<0.05 *)
20. ábra A TUNEL pozitív neuronok száma a kezelt és a kontrollcsoportban. A TUNEL módszerrel festett neuronok száma 30 mintára nézve és átlagolva 9±7 a kontroll állatokban, 6±6 a kezelt állatokban (p=0,1460) (átlag±SEM, p<0.05 *)
Deprenyl-N-oxid eredmények Sejtbiológiai mérések Deprenyl-N-oxid hatása a sejtpusztulásra. A normoxiás kontroll csoportban a sejtpusztulás 2,37±0,4%, ami a hypoxiát követően 11,3±1,0%-ra növekedett (21. ábra). A DNO kezelés 8,9±0,78%, 6,5±0,83% és 5,5±0,43%-ra csökkentette a károsodást (10-5,10-8,10-12M-os koncentrációban). A változás mindhárom csoportban szignifikáns volt.
40
21. ábra Deprenyl-N-oxid kezelés egy órás hypoxia után. A sejtpusztulást PI festéssel határoztuk meg 24 órás reoxigenizáció után. Az A panelen a DNO kezelés önmagában, a B panelen DNO kezelés SKF 252A gátlószer adása után (átlag±SEM, p<0.05 *)
Az SFK 525A kezelés után a sejtpusztulás 9,84±0,47%-ról 18,6±1,1%-ra emelkedett. A metabolizmus gátlás mellett a DNO 14,8±0,82%, 12,6±0,71 és 11,4±0.51%-ra csökkentette a károsodást. A változás mindhárom koncentrációban szignifikáns. DNO hatása a mitokondriális membrán potenciálra (MMP). A normoxiás kontroll csoportban az MMP 1,24±0,25%, ami a hypoxiát követően 0,59±0,08%-ra csökkent.
41
22. ábra Deprenyl-N-oxid kezelés egy órás hypoxia után. A mitokondriális transzmembrán potenciált JC-1 festéssel (piros és zöld jel aránya) határoztuk meg 24 órás reoxigenizáció után. Az A panelen a DNO kezelés önmagában, a B panelen DNO kezelés SKF 252A gátlószer adása után (átlag±SEM, p<0.05 *)
DNO kezelés 1,28±0,12%, 1,68±0,21% és 2,07±0,31%-ra változtatta a piros-zöld jel aranyát (10-5,10-8,10-12M-os koncentrációban, 22. ábra). A változás mindhárom koncentrációban szignifikáns. Az SFK 525A kezelés után az MMP 0,82±0,14%-ról 0,64±0,03%-ra csökkent. A metabolizmus gátlás mellett a DNO 0,94±0,07%, 1,1±0,1 és 1,2±0.13%-ra emelte piros-zöld jel arányát. A változás mindhárom koncentrációban szignifikáns.
42
23. ábra Deprenyl-N-oxid kezelés egy órás hypoxia után. A ROS termelést CeCl3 festéssel határoztuk meg 24 órás reoxigenizáció után. Az A panelen a DNO kezelés önmagában, a B panelen DNO kezelés SKF 252A gátlószer adása után (átlag±SEM, p<0.05 *)
DNO hatása a ROS termelésre. A normoxiás kontroll csoportban a reflexiós jel átlagintenzitása 2,36±1,1%-ról a hypoxiát követően 8,9±3,0%-ra emelkedett (23. ábra). DNO kezelés 8,8±2,7%, 4,0±2,4% és 1,47±0,8%-ra változtatta a reflexiós szintet (10-5,10-8,10-12M-os koncentrációban), a változás 10-8 és 10-12M-os koncentrációban szignifikáns. Az SFK 525A kezelés után a ROS szintje 4,2±1,6%-ról 7,6±2,6%-ra emelkedett. A metabolizmus gátlás mellett a DNO 5,2±3,0%, 3,1±1,2 és 2,6±1.8%-ra csökkent reflexiós szint. A változás mindhárom koncentrációban szignifikáns.
43
DNO hatás időfüggése a mitokondriális membrán potenciálra (MMP).
A vizsgált
molekulát 10-12M koncentrációban alkalmaztuk a hypoxia előtt és közvetlen utána (24. ábra). Ebben a mérésben a JC-1 festés előtt nem fixáltuk a sejteket, hanem közvetlenül az élő sejteket festettük meg. A kontroll csoportban a piros és zöld jel aránya a kiinduláskor 3.7±1.5 volt. Az előkezelt csoportban az arány 1.7±0.2, 2.2±0.4, 3.2±1.0 és 3.0±0.6 volt 60, 75, 90 és 120 perccel a hypoxia kezdetétől számítva. Az utókezelt csoportban az arány 0.7±0.1, 1.5±0.2, 1.8±1.3, illetve 3.4±0.9 volt, míg a kezeletlen csoportban 0.7±0.1, 0.8±0.1, 1.7±0.5, illetve 1.9±0.3 volt a piros és zöld jel aránya (60., 75., 90. és 120. perc).
24. ábra Deprenyl-N-oxid (10-12M) kezelés MMP-re kifejtett hatásának időfüggése PC-12 sejttenyészetben
Deprenyl és DNO hatása a perifériás benzodiazepin receptor expresszióra.
A
kezeletlen normoxiás csoportban a fluoreszcens jel 0,88±0,41-ről 0,81±0,23-ra, illetve 0,45±0,14-re csökkent a deprenyl és DNO csoportban (25. ábra). A DNO kezelés szignifikánsan csökkentette a PBR expressziót. A hypoxiás csoportokban 1,26±0,39-ről 1,1±0,39-re illetve 0,61±0,28-ra csökkentette a fluoreszcens jel szintjét a deprenyl és a DNO. A DNO hatása szignifikáns volt.
44
25. ábra PBR expressziós változás deprenyl és DNO kezelésre PC-12 sejttenyészetben (átlag±SEM, p<0.05 *)
Állatkísérleti eredmények A műtét utáni negyedik napon az állatok agyát kivettük és immunfestéssel vizsgáltuk az ép és apoptotikus sejtek arányát a hippocampus területén (27. ábra). A CA1 hippocampális régióban a TUNEL/kaszpáz pozitív sejtek aránya 44.8±15.0% volt a kontroll csoportban, szemben a kezelt csoporttal, ahol 39.7±13.1% volt az apoptotikus sejtek aránya (26. ábra). A CA2 régióban az apoptotikus sejtek aránya 50.5±15.6%-ról szignifikánsan csökkent 41.9±9.8%-ra.
45
26. ábra TUNEL/kaszpáz-3 pozitív sejtek aránya a CA1 és CA2 Gerbil hippocampus régiókban. (átlag±SEM, p<0.05 *)
27. ábra Konfokális lézer szkenning képek gerbil hippocampusból 4 nappal a kétoldali artéria carotis interna átmenti elzárása után. TUNEL pozitív sejtek zöld,a kaszpáz-3 pozitív sejtek pedig piros színben látszanak. A bal oldali panelen DNO kezelt állatról készült felvétel, míg a jobb oldalin kezeletlen kontroll felvétel van.
46
Megbeszélés Metodikai eredmények Vizsgálataink során neuroprotektív molekulák hatásait vizsgáltuk sejtbiológiai aspektusból. Ehhez a sejtpusztuláson kívül a szabadgyök termelés mértékét és a mitokondrium traszmembrán potenciál szintjét figyeltük meg. Számos módszert fejlesztettek ki az elmúlt évtizedben a szabad gyökök mérésére: kemilumineszcens módszer (Guzik 2005), enzimatikus meghatározás (Cao 2005), fluoreszcencia alapú módszerek, elektron spin csapda módszer (Tarpey 2004). Az alkalmazott módszerekkel jól mérhetjük a ROS mennyiségét, de egyik sem ad jó vizualizációt a ROS sejten belüli eloszlásáról. Az utóbbi években, a konfokális lézer szkenning mikroszkóp elterjedésével új ROS kimutatási módszerre nyílt lehetőség. A cérium klorid (CeCl3) molekula a külső elektronhéján keringő párosítatlan elektron miatt rendkívül könnyen reakcióba lép a szabad gyökökkel. Ebből a reakcióból cérium-perhidroxid molekula keletkezik, amely fényvisszaverő tulajdonságú, oldhatatlan csapadék (Robinson 1990, Halbhuber 1996, Telek 1999). Ezt a fényvisszaverő tulajdonságot lehet kihasználni a CLSM reflexiós üzemmódjában. Ezt a módszert egészítettük ki egy másik mitokondriális modalitás, a transzmembrán potenciál mérésével. A mitokondrium MMP szabályozása bonyolult folyamat, amely a sejtek aktuális állapotától függ. Ennek mérésére a JC-1 festési módszert állítottuk be. A JC-1 kationos festék potenciálfüggő módon halmozódik fel a különböző sejtkomponensekben. Minél nagyobb a JC-1-koncentráció, annál több úgynevezett J-aggregátum jön létre, amit a CLSM képekben piros színnel ábrázoltunk (7. ábra). Ez főleg a mitokondriumokban a sejtplazmához képest relatív magas potenciálkülönbség miatt jön létre. Az alacsony potenciál mellett a JC-1 monomerré alakul át, amit a képeken zöld színnel ábrázoltunk. A két szín intenzitásának arányából jó
közelítéssel
meghatározható
a
mitokondriális
membránpotenciál.
Laboratóriumunkban a fenti két ismert festési eljárást módosítottuk és közös eljárássá alakítottuk át. Ezzel olyan módszert dolgoztunk ki, amellyel egy sejten belül lehet meghatározni a mitokondriális membránpotenciált és a ROS mennyiségét (Szilágyi 2006a, b). Így az eljárásunk alkalmas mind sejtbiológiai folyamatok monitorozására, mind gyógyszeres terápia hatékonyságának vizsgálatára is.
47
Normális légzési körülmények között a felhasznált oxigén körülbelül 5%-a szabad gyökké alakul át a légzési lánc szerkezetéből adódóan. Reperfúzió során ennek a többszörösére növekszik a ROS termelése. Számos vizsgálatban igazolták az MMP és a ROS összefüggését (Levraut 2003, Sharikabad 2001, Turrens 2003). Starkov eredményei szerint az izolált mitokondriumokban az MMP csökkenés együtt ját a H2O2 termelés fokozódásával (Starkov 2003). Ezt a kapcsolatot egy inverz függvénnyel írhatjuk le: y = 7.41x−0.47, ahol az y a cérium klorid festés jele, az x pedig a JC-1 arány (10. ábra).
Vinpocetin eredmények A vinpocetinről korábban számos vizsgálatban igazolták a citoprotektív hatás koncentrációfüggő voltát. Azt találták, hogy a védő hatás a 10 -6 M koncentrációnál változik meg: ennél nagyobb koncentrációban fokozza a sejtpusztulást, míg ennél kisebb koncentrációban védő hatást fejt ki. Ennek alapján a vizsgálatunkban 10 -5, 10-6 és 10-7M-os koncentrációban mértük a vinpocetin hatását. PC-12 sejttenyészetben 1 órás hypoxia és 24 órás reoxigenizációs modellben sikerült a korábbi eredményeket megismételnünk és mi is leírtuk a koncentrációfüggő hatást. 10-7M-os koncentrációban a vinpocetin szignifikánsan csökkentette a sejtpusztulás mértékét. Gabryel és munkatársai tenyésztett asztrocitákban vizsgálták a vinpocetin és a piracetam hatását hypoxia után. Azt mutatták ki, hogy a 10-6M koncentrációban a vinpocetin a mitokondriális funkciókat javította, emelte az intracelluláris ATP szintet és gátolta a kaszpáz-3 aktivitását (Gabryel 2002). Ezt megerősítve a saját vizsgálatunkban kimutattuk, hogy a vinpocetin mindhárom vizsgált koncentrációban, koncentrációfüggő módon szignifikánsan emelte a JC-1 festék piros és zöld jelének arányát. A legjobban a 10-7M-os koncentrációban emelte az arányt. A szabadgyök mérésnél fordított tendenciát találtunk. Bár a 10-7M-os koncentrációban a ROS szint jelentősen nőtt de erre magyarázatot nem találtunk. Az MMP-re és a ROS termelésre kifejtett hatás alapján felmerül, hogy a vinpocetin a mitokondriumra közvetlen hatást gyakorol és azon belül is az MPTP regulációjával magyarázható az eredmény. A vinpocetint évtizedek óta használják cerebrovascularis betegségek kezelésére (Vas 2005) . A bevezetőben részleteztem azokat a mechanizmusokat, amelyekkel a klinikai 48
hatásait magyarázzák. A klinikai vizsgálatokban leírták az thrombocita aggregatiora gyakorolt hatását, bár ennek kissé ellentmondásos az irodalma (Akopov 1992, Kuzuya 1985, Lindgren 1990). Az agyi keringésre kifejtett hatását transzkranialis Doppler és infravörös közeli spektroszkóp módszerrel vizsgálták. Egy dupla vak vizsgálatban 20 mg vinpocetint kaptak a vizsgált személyek 500 ml Salsolban, a kontroll csoport csak az infúziót kapta. Az eredmények szerint a vinpocetin egyszeri adagja is megemelte az agyi perfúziót és a szöveti oxigén felvételt (Bönöczk 2002). Ennek a klinikai megfigyelésnek a pontosítására terveztük meg saját PET vizsgálatunkat, amelyben a 14 napos Cavintonos infúziós kezelés hatását mértük strokes betegekben. Agyi véráramlás változása: a teljes agyi CBF érték az infúziós kezelés előtt és után, sem a kezelt és sem a kontroll csoportban nem változott szignifikánsan. A regionális véráramlás méréseknél a kontroll csoportban a legnagyobb változást a középagyban, a hídban és a kisagyban észleltük, de egyik sem érte el a szignifikancia szintjét. Cavintonnal kezelt csoportban a legnagyobb változás az ellenoldali talamuszban, lencsemagban és a károsodás területében volt, de ezek sem érték el a szignifikancia szintjét. Az agyi glükóz metabolizmus méréseknél a kiindulási értékek mind a teljes agyban, mind a különböző régiókban alacsonyabb lett az infúziós kezelés után. Korábbi élettani vizsgálatok bizonyították, hogy az agyi perfúzió javításával párhuzamosan az aerob/anaerob ATP szintézis aránya javul (Cave 2000). A vérkeringés javulásával az oxigén ellátottság javul, így a glükóz felhasználás csökken az alábbi képlet alapján: JATP=2Jglc+6JO2, ahol a JATP az ATP termelés,a Jglc a glükóz felhasználás, illetve a JO2 az oxigénfogyasztás (Gjedde 2002). Ezt a jelenséget egy korábbi PET vizsgálatban már megerősítették, a gyógyszer nélküli infúzió csökkentette az agyi metabolikus értéket (Huber 1993). Saját vizsgálatunkban a metabolizmus értékek azért érdekesek, mert a placebo csoportban kifejezettebb volt a metabolikus változás, mint a Cavintonnal kezelt betegekben. Ezt azzal tudjuk magyarázni, hogy a sima infúzió aerob/anaerob metabolizmus javításán túl a vinpocetin a glükóz felhasználást javította. A vinpocetin eddig ismert hatásmechanizmusaival ezek a hatások nem magyarázhatóak jól. Korábbi receptor kötési vizsgálatból már ismert volt, hogy a vinpocetin a perifériás benzodiazepin receptorhoz jól kötődik.
49
28. ábra Vinpocetin kezelés antiapoptotikus hatásának általunk felvetett hatásmechanizmusa.
Majom PET vizsgálatunkban ezt a megfigyelést bizonyítottuk, miszerint a jelzett vinpocetin közel 4%-a átjut a vér-agy gáton és bizonyos agyi területeken kötődik az agyban. A kötési potenciált a jól ismert PBR ligand csökkentette, ami arra utal, hogy mind a két szer azonos helyen kötődik a sejtekben. Azzal, hogy a vinpocetin PBR-hez kötődik és azt regulálja, már magyarázható válik mind a sejtbiológiai eredményeink, mind a PET vizsgálati eredményeink (28. ábra).
Deprenyl eredmények A deprenylt már több min 30 éve használjuk a neurológiában MAO-B gátló hatása miatt, Parkinson kóros betegek kezelésére. A deprenylt a betegség korai szakaszában alkalmazva a levodopa kezelés kezdete későbbre tolódik ki, csökkenti a levodopa szükséges dózisát és csökkenti a tünetek fluktuációját. 1984 írták le először a neuroprotektív hatását bizonyos toxinokkal szemben. Későbbi vizsgálatok már felvetették, hogy a protektív hatás MAO-B független (Waldmeier 2000). SKF 525A-val, P450 enzimrendszer gátlóval történt vizsgálatok bizonyították, hogy a deprenyl
50
metabolitjainak potencírozó hatásuk van (Magyar 1996). Felmerült a kérdés, hogy a deprenyl vagy valamelyik metabolitja az aktív neuroprotektív hatású molekula? A kutatások szerint a deprenyl antiapoptotikus hatása bifázisos természetű: nagy koncentrációban
(10-3M)
pro-,
míg
alacsony
koncentrációban
(10-9-10-13M)
antiapoptotikus hatású (Tatton 2000, Tatton 2002, Magyar 1998). Az antiapoptotikus hatást többféle mechanizmussal magyarázzák. PC-12 sejtkultúrában igazolták, hogy a deprenyl kezelés a szérum megvonás, illetve NGF megvonás után 10-9M koncentrációban a mitokondrium ∆ψm csökkenését kivédte (Wadia 1998). Deprenyllel történt vizsgálataink során mi is PC-12 sejttenyészetben vizsgáltuk a sejtpusztulásra, mitokondriális membrán potenciálra és a szabadgyök termelésre kifejtett hatást. A PC-12 tenyészetre ezért is esett a választásunk, mert a sejtekben MAO-B expresszió nincs, így biztosan a MAO-B független hatást tudjuk vizsgálni (Youdim 1986). A bifázisos antiapoptotikus hatás miatt 10-3, 10-8 és a 10-12M-os koncentrációt vizsgáltuk. Propidium jodiddal történt festéssel határoztuk meg a sejtpusztulást, mely a korábbi eredményeket megerősítette: a deprenyl 10-3M-os koncentrációban növelte a halott sejtek arányát, míg a 10-8 és a 10-12M-os koncentrációban szignifikánsan csökkentette azt. A mitokondriális transzmembrán potenciál mérésénél azt találtuk, hogy a deprenyl mindhárom vizsgált koncentrációban szignifikánsan emelte a hypoxiás kontrollhoz képest a piros és zöld jel arányát. Ezzel szemben a szabadgyök szint mérésnél a deprenyl nagy koncentrációban (10-3M) növelte a ROS termelést és csak a legkisebb koncentrációban (10-12M) csökkentette szignifikánsan. Patkány stroke modellben a deprenyl antiapoptotikus hatását néztük. A cerebri médiát elektrokoagulációval zártuk el véglegesen, majd két napon keresztül ozmotikus minipumpával adagoltuk a deprenylt. Két nap után mértük a károsodás nagyságát, az apoptózis mértékét. 0,2mg/kg/nap dózisban adagolva a deprenylt, azt találtuk, hogy a lézió térfogatát szignifikánsan, körülbelül a felére csökkentette. A penumbra régió nagy felbontású
felvételein
az apoptotikus
sejteket
azonosítottuk
és
látóterenként
megszámoltuk. A deprenyl a kezelés a TUNEL/kaszpáz-3 pozitív sejtek számát szignifikánsan csökkentette, de a csak TUNEL pozitív neuronok száma is csökkent.
Deprenyl-N-oxid eredmények 2002-ben Tatton PC-12 sejttenyészetben azt találta, hogy a dezmetil-deprenyl lenne az aktív neuroprotektív metabolit (Tatton 2002). Ennek ellentmond a Magyar és 51
munkatársainak humán melanoma sejteken végzett vizsgálata, ami szerint kizárólag a deprenyl alacsony koncentrációjánál találtak antiapoptotikus hatást (Magyar 1998). Így továbbra is kérdéses, hogy a deprenyl vagy valamelyik metabolitja az aktív neuroprotektív hatású.
További vizsgálatainkban az FMO rendszeren keresztül
metabolizálódó molekulát a deprenyl-N-oxid hatásait vizsgáltuk. A deprenyl-N-oxidot csak egy pár éve szintetizálták először, így erről a molekuláról kevés információnk van (Yoshida 1986, Lévai 2004). A derpenylhez hasonlóan a DNO-t PC-12 tenyészetben vizsgáltuk 1 órás hypoxia és 24 órás reoxigenizációs kondícióban. A DNO-t a sejtbiológiai méréseknél 10-5, 10-8 és 10-12M-os koncentrációban alkalmaztuk. Első mérési sorozatban a sejtpusztulást, az MMP-t és a ROS szintet mértük meg. Azt találtuk,
hogy
szignifikánsan
csökkentette
a
sejtpusztulást
és
a változások
koncentrációfüggést mutattak (10-12M koncentráció volt a leghatékonyabb). A mitokondrium ∆ψm csökkenését kivédte koncentrációfüggő módon, sőt a 10-8 és 10-12M-os koncentrációban a normál potenciál felé emelte azt. A szabadgyök szintet hypoxia után csak a 10-8 és 10-12M-os koncentrációban csökkentette. Tehát az eredményeink szerint a DNO hasonló protektív hatást fejt ki, mint a deprenyl. A kérdés továbbra is az, hogy ez egy aktív metabolit vagy sem. Ezért SKF 525A, egy P450 enzimrendszer gátló szert alkalmaztunk, mert a deprenyl és a DNO fő metabolizmusa ezen az enzimrendszeren keresztül valósul meg. Az előző mérési sorozatot megismételtük 10-5M koncentrációjú SKF 525A jelenlétében. Mindhárom mérési modalitásban hasonló koncentrációfüggő kinetikát találtunk és a sejtvédő hatás is kis eltérésekkel azonos volt. Ez azt jelenti, hogy a DNO lehet a deprenyl régóta keresett aktív metabolitja. A deprenyllel történt vizsgálatok számos kérdésre választ adtak. Jól elfogadható magyarázat a ∆ψm stabilizálására az, hogy a deprenyl változtatja az MPTP-t reguláló fehérjék (Bcl-2, Bcl-XL, BAX, BAD) expresszióját és ezzel szabályozza a transzmembrán potenciált. Mikor 2003-ban De Marchi és munkatársai a menadion okozta MPTP megnyílást vizsgálták, arra az eredményre jutottak, hogy a deprenyl pár percen belül képes a transzmembrán potenciál csökkenését kivédeni, illetve a mitokondrium duzzadását csökkenteni (De Marchi 2003). Ez pedig ellentmond a gén expressziós elméletnek, hiszen a de novo fehérje szintézissel nem magyarázható a pár perc alatt bekövetkezett hatás. De Marchi elmélete alapján a DNO hatás időfüggését
52
vizsgáltuk mi is, azzal a különbséggel, hogy a membrán potenciál csökkenést 1 órás hypoxiával indukáltuk. Azt találtuk, hogy a DNO 10-12M-os koncentrációban előkezelésként alkalmazva közel fél óra múlva stabilizálta az MMP-t, míg közvetlenül a hypoxia után adva a DNO-t egy óra múlva okozott membrán potenciál stabilizációt (13. táblázat). Ezzel az eredménnyel azt a hipotézist támasztottuk alá, ami a deprenyl közvetlen mitokondriális hatását veti fel. A vinpocetin vizsgálataink eredménye alapján kezdtük el vizsgálni a PBR receptor expressziót deprenyl és DNO kezelés mellett. Az eredmények azt mutatták, hogy mind normál körülmények közt, mind hypoxia után a deprenyl és a DNO is csökkenti a PBR expressziót. A DNO hatása szignifikáns volt. Eredményeink alapján a deprenyl és metabolitjainak a direkt MPTP regulációs hatását vetettük fel (29. ábra).
29. ábra Deprenyl antiapoptotikus hatásának általunk felvetett hatásmechanizmusa
Korábbi vizsgálataink szerint a két napos deprenyl kezelés a patkány agyi hypoxiás károsodásokat szignifikánsan csökkentette. A DNO-t Gerbil átmeneti kétoldali, carotis
53
leszorításos modellben vizsgáltuk. Azért esett a választásunk a Gerbil modellre, mert ez késleltetett, tiszta apoptózis modell. Nem kell a penumbra területet meghatározni és az apoptózist a nekrózistól elkülöníteni. Két nappal a carotis lekötés után a hippocampusban apoptózis alakul ki, főleg a CA1 és CA2 régióban. Ezért vizsgálatunkban ebben a két régióban mértük az apoptózis mértékét. Eredményeink azt mutatták, hogy a DNO 0,4mg/kg/nap dózisban adagolva a hippocampus CA1 és CA2 régiójában csökkentette az apoptotikus sejtek arányát, CA2 régióban a változás szignifikáns volt.
54
Következtetések A kapott eredményekből az alábbi következtetések vonatók le. •
egyesített szabadgyök és mitokondriális transzmembrán potenciál mérésére szolgáló metodika jól használható és kvantitatív elemzésre is lehetőséget ad,
•
vinpocetin dózisfüggő hatást mutatott a sejtpusztulás, ROS és MMP mérés alapján, a legkisebb vizsgált koncentrációban (10-7M) volt a legkifejezettebb a hatás,
•
PET vizsgálattal igazoltuk a vinpocetin kötését a PBR receptorhoz, illetve pontosan meghatároztuk a stroke-ot elszenvedő betegek agyában a glükóz metabolizmus és véráramlás pontos regionális változásait a vinpocetin kezelés után,
•
PC-12 sejttenyészetben igazoltuk a deprenyl és deprenyl-N-oxid dózisfüggő neuroprotektív hatását,
•
deprenyl és deprenyl-N-oxid antiapoptotikus hatású patkány és egér agyi stroke modellben,
•
a deprenyl fő metabolikus útvonalának gátlásával bizonyítottuk, hogy a deprenyl-N-oxid az aktív metabolit.
Rövid összefoglalásként elmondhatjuk, hogy mindkét, évtizedek óta használt gyógyszerrel kapcsolatban teljesen új hatásmechanizmussal foglalkoztunk. Az eredményeink alapján kimondhatjuk, hogy mindkét molekula jelentősen csökkenti a károsodás mértékét az oxigénhiányos állapotokban és ezt a mitokondriumon keresztül fejti ki. Eredményeinkkel ezt az új hatásmechanizmust még nem bizonyítottuk teljesen, ezért további vizsgálatokat tervezünk a bizonyítás céljára és az esetleges klinikai alkalmazhatóság vizsgálatára.
55
Összefoglalás PhD munkám során a vinpocetin, deprenyl és deprenyl-N-oxid sejtvédő hatását vizsgáltam. A vizsgálatokban a molekulák sejtbiológiai és főleg mitokondriális hatásait írtuk körül. A munkaidőszakom első részében a módszertant dolgoztam ki, mely során két jól ismert metodikát a JC-1 mitokondrium membrán potenciál festést és a CeCl3 szabadgyök festést módosítottuk és egy közös módszert alakítottunk ki (Géza Szilágyi, László Simon, Péter Koska, Géza Telek, Zoltán Nagy, Visualization of mitochondrial membrane potential and reactive oxygen species via double staining Neurosci Lett 2006 May;399(3):206-9.). Laboratóriumunkban gyors és könnyen reprodukálható mérési sorozattal (sejtpusztulás, mitokondrium membrán potenciál és szabadgyök mérés) PC-12 sejttenyészetben vizsgáltuk a vinpocetin, a deprenyl és a deprenyl-N-oxid sejtbiológiai hatásait. Ennek során mindhárom molekuláról bizonyítottuk, hogy koncentrációfüggő módon védik a sejteket a hypoxiás károsodásoktól (Simon L, Szilágyi G, Bori Z, Telek G, Magyar K, Nagy Z. Low dose (-)deprenyl is cytoprotective: It maintains mitochondrial membrane potential and eliminates oxygen radicals. Life Sci. 2005 Dec 5;78(3):225-31.). A vinpocetin PET vizsgálataiban egy feltételezett, új hatásmechanizmusát, a PBR receptor kötését vetettük fel és bizonyítottuk. Ezen mechanizmuson keresztül magyarázhatóvá válik a vinpocetin összes általunk mért sejtbiológiai hatása és a stroke-on átesett betegek agyában mért aerob/anaerob glükóz metabolizmus változása (G. Szilágyi, et al. Effects of vinpocetin on the redistribution of cerebral blood flow and glucose metabolism in chronic ischaemic stroke patients: a PET study J Neurol Sci 2005 May;229-230:275-284). A deprenyl újonnan szintetizált metabolitjáról bebizonyítottuk, hogy a derpenylhez hasonlóan védő hatást fejt ki MAO-B független útvonalon. A vizsgálatok alapján feltételezzük, hogy a deprenyl aktív metabolitja valószínűleg a DNO. Deprenyl-N-oxiddal történt mérések alapján felvetettük a deprenylnek egy új hatásmechanizmusát a mitokondriális átmeneti permeabilitási pórus szabályozásán keresztül.
56
Summary In my PhD work I have investigated the cell protective effect of vinpocetin, deprenyl and deprenyl-N-oxide. The present investigations focused on these drugs’ cellular effects, with special regard to their mitochondrial effects. In first part of the PhD period I established a new method by combining two well known methods: JC-1 staining (a mitochondrial transmembrane potential dye) and
CeCl3 staining (which could assess
the free radical production) (Géza Szilágyi, László Simon, Péter Koska, Géza Telek, Zoltán Nagy, Visualization of mitochondrial membrane potential and reactive oxygen species via double staining Neurosci Lett 2006 May;399(3):206-9.). Furthermore, in our laboratory we established fast and well reproducible methods for assessing cell death, measuring mitochondrial membrane potential, and free radical staining. The cell biological effects of vinpocetin, deprenyl and deprenyl-N-oxide were investigated in PC-12 cell culture. We proved that all molecules have a concentration dependent protective effect against hypoxia (Simon L, Szilágyi G, Bori Z, Telek G, Magyar K, Nagy Z. Low dose (-)deprenyl is cytoprotective: It maintains mitochondrial membrane potential and eliminates oxygen radicals. Life Sci. 2005 Dec 5;78(3):225-31.). We suggested and proved a new mechanism of vinpocetin: that vinpocetin is a PBR ligand. With this new mechanism we could explain the cellular effects as well as the changes in aerobic/anaerobic metabolism in the brain after the treatment with vinpocetin (G. Szilágyi, et al. Effects of vinpocetin on the redistribution of cerebral blood flow and glucose metabolism in chronic ischaemic stroke patients: a PET study J Neurol Sci 2005 May;229-230:275-284). We have demonstrated a concentration dependent protective effect of deprenyl-N-oxide, a newly synthesized metabolite of deprenyl. This effect was MAO-B independent. On the basis of our result we suggest that the active metabolite of deprenyl is DNO. Furthermore we hypothesise that DNO has an affect on the mitochondrial transition permeability pore complex.
57
Irodalomjegyzék Akopov SE, Gabrielian ES. (1992) Effects of aspirin, dipyridamole, nifedipine and cavinton which act on platelet aggregation induced by different aggregating agents alone and in combination. Eur J Clin Pharmacol, 42(3):257-259. Anholt RR, De Souza EB, Oster-Granite ML, Snyder SH. (1985) Peripheral-type benzodiazepine receptors: autoradiographic localization in whole-body sections of neonatal rats. J. Pharmacol. Exp. Therap, 233:517–526. Ashkenazi A, Dixit VM. (1998) Death receptors: Signaling and modulation. Science, 281:1305-1308. Baker ME, Fanestil DD. (1991) Mammalian peripheral-type benzodiazepine receptor is homologous to CrtK protein of Rhodobacter capsulatus, a photosynthetic bacterium. Cell, 65:721–722. Banati RB, Myers R, Kreutzberg GW. (1997) PK (peripheral benzodiazepine)-binding sites in the CNS indicate early and discrete brain lesions: microauto-radiographic detection of [3H]PK11195 binding to activated microglia. J. Neurocytol, 26:77–82. Beavo JA. (1995) Cyclic nucleotide phosphodiesterases: functional implications of multiple isoforms. Physiol Rev, 75:725-748. Bederson JB, Pitts LH, Germano SM, Nishimura MC, Davis RL, Bartkowski HM. (1986) Evaluation of 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride as a stain for detection and quantification of experimental cerebral infarction in rats. Stroke, 17:1304-1308. Besman MJ, Yanagibashi K, Lee TD, Kawamura M, Hall PF, Shively JE. (1989) Identification of des-(Gly-lle)-endozepine as an effector of corticotropin-dependent adrenal steroidogenesis: stimulation of cholesterol delivery is mediated by the peripheral benzodiazepine receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86:4897–4901.
58
Bono F, Lamarche I, Prabonnaud V, Le Fur G, Herbert JM. (1999) Peripheral benzodiazepine receptor agonists exhibit potent antiapoptotic activities. Biochem. Biophysic. Res. Communun., 265:457–461. Bönöczk P, Pánczél G, Nagy Z. (2002) Vinpocetin increases cerebral blood flow and oxygenation in stroke patients: A near infrared spectroscopy and transcranial Doppler study. Eur J Ultrasound, 15:85–91. Braestrup C, Squires RF. (1977) Specific benzodiazepine receptors in rat brain characterized by high affinity [3H]diazepam binding. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 74:3805–3809. Brenner C, Kroemer G. (2000) Mitochondria – the death signal integrators. Science, 289:1150-1151. Budihardjo I, Oliver H, Lutter M, Luo X, Wang X. (1999) Biochemical pathways of caspase activation during apoptosis. Annu Rev Cell Dev Biol, 15:269-290. Cao Y, Guo P, Xu Y, Zhao B. (2005) Simultaneous detection of NO and ROS by ESR in biological systems. Methods Enzymol, 396:77-83. Carayon P, Portier M, Dussossoy D, Bord A, Petitpretre G, Canat X, Le Fur G, Casellas P. (1996) Involvement of peripheral benzodiazepine receptors in the protection of hematopoietic cells against oxygen radical damage. Blood, 87:3170–3178. Casellas P, Galiegue S, Basile AS. (2002) Peripheral benzodiazepine receptors and mitochondrial function Neurochem Int, 40:475-486. Cave AS, Ingwal JS, Friedrich J, Liao R, Saupe KW, Apstein CS, et al. (2000) ATP synthesis during low-flow ischemia: influence of increased glycolytic substrate. Circulation, 101:2090-2096.
59
Chao DT, Korsmeyer SJ. (1998) BCL-2 family: regulators of cell death. Annu Rev Immunol, 16:395-419. Cohen G, Pasik P, Cohen B, Leist A, Mytilineou C, Yahr MD. (1984) Pargyline and deprenyl prevent the neurotoxicity of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) in monkeys. Eur J Pharmacol, 106(1):209-210. Coyle P. (1982) Middle cerebral artery occlusion in the young rat. Stroke, 13:855-859. Csonka E, Szemenyi K, Miskulin M, Robert AM. (1980) Morphological examinations of aortic endothelial and smooth muscle cells grown in vitro on collagen membranes. Artery, 8:243– 258. Dauglas E, Nochy D, Ravagan L, Loeffler M, Susin SA, ZamzamiN, Kroemer G.(2000) Apoptosis-inducin factor AIF): a ubiquitos mitochondrial oxidoreductase involved in apoptosis. FEBS Lett, 476:118-123. De Marchi U, Pietrangeli P, Marcocci L, Mondovi B, Toninello A. (2003) L-Deprenyl as an inhibitor of menadione-induced permeability transition in liver mitochondria. Biochem Pharma, 66:1749-1754. Diorio D, Welner SA, Butterworth RF, Meaney MJ, Suranyi-Cadotte BE. (1991) Peripheral benzodiazpeine binding sites in Alzheimer’s disease frontal and temporal cortex. Neurobiol Aging, 12:255–258. Gabryel B, Adamek M, Pudełko A, Małecki A, Trzeciak HI. (2002) Piracetam and vinpocetin exert cytoprotective activity and prevent apoptosis of astrocytes in vitro in hypoxia and reoxygenation. Neurotoxicol, 23:19–31. Gjedde A, Marrett S, Vafaee M. (2002) Oxidative and nonoxidative metabolism of excited neurons and astrocytes. J Cereb Blood Flow Metab, 22:1–14.
60
Guzik TJ, Channon KM. (2005) Measurement of vascular reactive oxygen species production by chemiluminescence. Methods Mol Med, 108:73-89. Halbhuber KJ, Scheven C, Jirikowski G, Feuerstein H, Ott U. (1996) Reflectance enzyme histochemistry (REH): visualization of cerium-based and DAB primary reaction products of phosphatases and oxidases in cryostat sections by confocal laser scanning microscopy. Histochem Cell Biol, 105:239-49. Halestrap AP. (1999) The mitochondrial permeability transition: its molecular mechanism and role in reperfusion injury. Biochem. Soc. Sympos, 66:181–203. Halestrap AP, Clarke SJ, Javadov SA. (2004) Mitochondrial permeability transition pore opening during myocardial reperfusion – a target for cardioprotection. Cardiovasc Research, 61:372-385. Hengartner MO. (2000) The biochemistry of apoptosis. Nature, 407:770-776. Hirsch T, Decaudin D, Susin SA, Marchetti P, Larochette N, Resche-Rigon M, Kroemer G. (1998) PK11195, a ligand of the mitochondrial benzodiazepine receptor, facilitates the induction of apoptosis and reverses the induction of apoptosis and reverses Bcl-2mediated cytoprotection. Exp Cell Res, 241:426–434. Huber M, Kittner B, Hojer C, Fink GR, Neveling M, Heiss WD. (1993) Effect of propentofylline on regional cerebral glucose metabolism in acute ischemic stroke. J Cereb Blood Flow Metab, 13:526–530. Katagi M, Tatsuno M, Tsutsumi H, Miki A, Kamata T, Nishioka H, Nakajima K, Nishikawa M, Tsuchihashi H. (2002) Urinary excretion of selegiline N-oxide, a new indicator for selegiline administration in man. Xenobiotica, 32(9):823-831.
61
Kerr JE, Wyllie AH, Currie AR. (1972) Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br. J. Cancer, 26:239. Knoll
J,
Ecseri
Z,
Kelemen
K,
Nievel
J,
Knoll
B.
(1965)
Phenylisopropylmethylpropinylamine (E-250), a new spectrum psychic energizer. Arch Int Pharmacodyn Ther, 155(1):154-164. Knoll J, Magyar K. (1972) Some puzzling pharmacological effects of monoamine oxidase inhibitors. Adv Biochem Psychopharmacol, 5:393-408. Kroemer G, Reed JC. (2000) Mitochondrial control of cell death. Nature Med, 6:513– 519. Kusumoto M, Dux E, Paschen W, Hossmann KA. (1996) Susceptibility of hippocampal and cortical neurons to argon-mediated in vitro ischemia. Journal of Neurochemistry 67:1613–1621. Kuwabara H, Evans AC, Gjedde A. (1990) Michaelis–Menten constrainsimproved cerebral glucose metabolism and regional lumped constant measurement with F18fluorodeoxyglucose. J Cereb Blood Flow Metab, 110:180–189. Kuzuya F. (1985) Effects of vinpocetin on platelet aggregability and erythrocyte deformability. Ther Hung, 33(1):22-34. LeFur G, Perrier ML, Vaucher N, Imbault F, Flamier A, Benavides J, Uzan A, Renault C, Dubroeucq MC, Gueremy C. (1983) Peripheral benzodiazepine binding sites: effect of
PK11195,
1-(2-chlorophenyl)-N-methyl-N-(1-methyl-propyl)-3-isoquinoline
carboxamide. Life Sci, 32:1839–1847. Lévai F, Fejér E, Szeleczky G, Szabó A, et al. (2004) In vitro formation of selegiline-Noxide as a metabolite of selegiline in human, hamster, mouse, rat, guinea-pig, rabbit and dog. Eur J of Drug Metab and Pharmacokin, 29(3):169-178.
62
Levraut J, Iwase H, Shao ZH, Vanden Hoek TL, Schumacker PT. (2003) Cell death during ischemia: relationship to mitochondrial depolarization and ROS generation. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 284:549-558. Lindgren SH, Andersson TL, Vinge E, Andersson KE. (1990) Effects of isozymeselective phosphodiesterase inhibitors on rat aorta and human platelets: smooth muscle Acta Physiol Scand, 140(2):209-219. Logan J, Fowler JS, Volkow ND, Wang GJ, Ding YS, Alexoff DL. (1996) Distribution volume ratios without blood sampling from graphical analysis of PET data. J Cereb Blood Flow, 16:834–840. Magyar K, Szende B, Lengyel J, Tekes K. (1996) The pharmacology of B-type selective monoamine oxidase inhibitors; milestones in (-)-deprenyl research. J Neural Transm Suppl, 48:29-43. Magyar K, Szende B, Lengyel J, Tarczali J, Szatmáry I. (1998) The neuroprotective and neuronal rescue effects of (-)-deprenyl. J Neural Transm Suppl, 52:109-123. Messmer K, Reynolds GP. (1998) Increased peripheral benzodiazepine binding sites in the brain of patients with Huntington’s disease. Neurosci. Lett, 241:53–56. Miyamoto M, Murphy TH, Schnaar RL, Coyle JT. (1989) Antioxidants protect against glutamateinduced cytotoxicity in a neuronal cell line. J Pharmacol Exp Ther, 250:1132-1140. Molnar P, Erdo SL. (1995) Vinpocetin is as potent as phenytoin to block voltage-gated Na+ channels in rat cortical neurons. Eur J Pharmacol, 273:303-306.
63
Nakanishi H, Katsuta K, Koide T, Ueda Y, Shirakawa K and Yoshida K. (1994) Protective effect of FR115427 against ischemic hippocampal damage in gerbils. Jpn. J. Pharmacol, 64:189-193. Ohta S, Meyer E, Fujita H, Reutens DC, Evans A, Gjedde A. (1996) Cerebral [15O]water clearance in humans determined by PET: I. Theory and normal values. J Cereb Blood Flow Metab, 16:765-780. Park CH, Carboni E, Wood PL, Gee KW. (1996) Characterization of peripheral benzodiazepine type sites in a cultured murine BV-2 microglial cell line. Glia, 16:65-70. Parkinson Study Group. (1998) Mortality in DATATOP: a multicenter trial in early Parkinson's disease. Ann Neurol, 43(3):318-325. Pekins ChL, Fang G, Kim CN, Bhalla KN. (2000) The role of Apaf-1, caspase-9 and Bid protein sin etoposide- or paclitaxel induced mitochondrial events during apoptosis. Cancer Res, 60:1645-1653. Phelps ME, Huang SC, Hoffman EJ, Selin C, Sokoloff L, Kuhl DE. (1979) Tomographic measurement of local cerebral glucose metabolic rate in humans with (F-18)2-fluoro-2-deoxy-d-glucose: validation of method. Ann Neurol, 6:371-388. Robinson JM, Batten BE. (1990) Localization of cerium-based reaction products by scanning laser reflectance confocal microscopy. J Histochem Cytochem, 38:315-318. Roland PE, Graufelds CJ, W7hlin J, Ingelman L, Andersson M, Ledberg A, et al. (1994) Human brain atlas: for high-resolution functional and anatomical mapping. Hum Brain Map, 1:173-184. Rosdy B, Balázs M, Szporny L. (1976) Biochemical effects of ethyl apovincaminate. Arzneim Forsch/Drug Res 26:1923–1926.
64
Sharikabad MN, Ostbye KM, Brors O. (2001) Increased [Mg2+] reduces Ca2+ influx and disruption of mitochondrial membrane potential during reoxygenation. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 281:2113-2123. Shoulson I, Oakes D, Fahn S, Lang A, Langston JW, LeWitt P, Olanow CW, Penney JB, Tanner C, Kieburtz K, Rudolph A; Parkinson Study Group. (2002) Impact of sustained deprenyl (selegiline) in levodopa-treated Parkinson's disease: a randomized placebo-controlled extension of the deprenyl and tocopherol antioxidative therapy of parkinsonism trial. Ann Neurol, 51(5):604-612. Starkov AA, Fiskum G. (2003) Regulation of brain mitochondrial H2O2 production by membrane potential and NAD(P)H redox state. J Neurochem, 86:1101-1107. Stevenson DT, Schober DA, Smaistig EB, Mincy RE, Gehlert DR, Clemens JA. (1995) Peripheral benzodiazepine receptors are colocalized with activated microglia following transient global forebrain ischemia in the rat. J. Neurosci, 15:5263–5274. Talairach J, Tournoux P. (1998) Co-planar stereotaxic atlas of the human brain. Stuttgart7 Thieme Verlag. Tarpey MM, Wink DA, Grisham MB. (2004) Methods for detection of reactive metabolites of oxygen and nitrogen: in vitro and in vivo considerations. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 286:431-444. Tatton WG, Wadia JS, Ju WY, Chalmers-Redman RM, Tatton NA. (1996) (-)-Deprenyl reduces neuronal apoptosis and facilitates neuronal outgrowth by altering protein synthesis without inhibiting monoamine oxidase. J Neural Transm Suppl, 48:45-59. Tatton WG, Chalmers-Redman RM, Elstner M, Leesch W, Jagodzinski FB, Stupak DP, Sugrue MM, Tatton NA. (2000) Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase in neurodegeneration and apoptosis signaling. J Neural Transm Suppl, 60:77-100.
65
Tatton WG, Chalmers-Redman RM, Ju WJ, Mammen M, Carlile GW, Pong AW, Tatton NA. (2002) Propargylamines induce antiapoptotic new protein synthesis in serum- and nerve growth factor (NGF)-withdrawn, NGF-differentiated PC-12 cells. J Pharmacol Exp Ther, 301:753-764. Telek G, Scoazec JY, Chariot J, Ducroc R, Feldmann G, Roz C. (1999) Cerium-based histochemical demonstration of oxidative stress in taurocholate-induced acute pancreatitis in rats. J Histochem Cytochem, 47:1201-1212. Turrens JF. (2003) Mitochondrial formation of reactive oxygen species. J Physiol, 552:335-344. Vas A, Gulyas B. (2005) Eburnamine Derivatives and the Brain. Medicinal Research Reviews, 25(6):737-757. Wadia JS, Chalmers-Redman RM, Ju WJ, Carlile GW, Phillips JL, Fraser AD, Tatton WG. (1998) Mitochondrial membrane potential and nuclear changes in apoptosis caused by serum and nerve growth factor withdrawal: time course and modification by (-)deprenyl. J Neurosci, 18(3):932-947. Waldmeier PC, Boulton AA, Cools AR, Kato AC, Tatton WG. (2000) Neurorescuing effects of the GAPDH ligand CGP 3466B. Neural Transm Suppl, 60:197-214. Yeliseev AA, Krueger KE, Kaplan S. (1997) A mammalian mitochondrial drug receptor functions as a bacterial oxygen sensor. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 94:5101-5106. Yoshida T, Yamada Y, Yamamoto T, Kuroiwa Y. (1986) Metabolism of deprenyl, a selective monoamine oxidase (MAO) B inhibitor in rat: relationship of metabolism to MAO-B inhibitory potency. Xenobiotica, 16:129-136.
66
Youdim MB, Heldman E, Pollard HB, Fleming P, McHugh E. (1986) Contrasting monoamine oxidase activity and tyramine induced catecholamine release in PC 12 and chromaffin cells. Neuroscience, 19:1311-1318. .
Saját publikációk jegyzéke A disszertációhoz felhasznált publikációk 1. Simon L., Szilágyi G, Bori Z., Orbay P., Nagy Z.: A (-)deprenyl hatása kísérletes agyi ischaemiában. Agyérbetegségek, 2001.7. (4) p.6-11. 2. Szilágyi G., Nagy Z.: Új módszerek a hypoxia kutatásban Ideggyógyászati szemle 2006;59(11-12):411-415 3. László Simon, Géza Szilágyi, Zoltán Bori, Péter Orbay and Zoltán Nagy (-)-dDeprenyl attenuates apoptosis in experimental brain ischemia. Eur J of Pharma 2001. Nov;430(2-3):235-41. 4. B. Gulyás, C. Halldin, Á. Vas, RB. Banati, E. Shchukin, S. Finnema, J. Tarkainen, K. Tihanyi, G. Szilágyi, and L. Farde
[11C]Vinpocetin: a
prospective peripheral benzodiazepine receptor ligand for primate PET studies J Neurol Sci 2005 May;229-230:219-223 5. G. Szilágyi, et al. Effects of vinpocetin on the redistribution of cerebral blood flow and glucose metabolism in chronic ischaemic stroke patients: a PET study J Neurol Sci 2005 May;229-230:275-284 6. Simon L, Szilágyi G, Bori Z, Telek G, Magyar K, Nagy Z. Low dose (-)deprenyl is cytoprotective: It maintains mitochondrial membrane potential and eliminates oxygen radicals. Life Sci. 2005 Dec 5;78(3):225-31.
67
7. Géza Szilágyi, László Simon, Péter Koska, Géza Telek, Zoltán Nagy, Visualization of mitochondrial membrane potential and reactive oxygen species via double staining Neurosci Lett 2006 May;399(3):206-9. A disszertációtól független közlemények 1. Szilágyi G, Szamosi T, Sárai A, Szemerédi P, Nagy Z.: Kumulatív kockázati index a stroke-prevencióban Orvosi Hetilap. 2000 Apr 23; 141(17):901-3. 2. Gubucz István dr., Kakuk Ilona dr., Major Ottó dr., Szegedi Norbert dr., Barsi Péter dr., Pánczél Gyula dr., Varga Dániel dr., Ovary Csaba dr., May Zsolt dr., Ricsói Gabriella dr., Kenéz Júlia dr., Szilágyi Géza dr. és Nagy Zoltán dr. Az agykamrába
törô
vérzések
lokális
fibrinolízisének
biztonságossága
és
hatékonysága (prospektív, randomizált vizsgálat) Orvosi Hetlap 2004. 145(31): 1609-15. 3. B.Gulyás, J. Dobai, G. Szilágyi, G. Csécsei, G. Székely, Continouosmonitoring of post mortem temperature changes int he human brain Neurochem Res 2006 Feb;31(2):157-66. 4. Laszlo Denes, Géza Szilágyi, Anikó Gál, Zoltán Bori, Zoltán Nagy, Cytoprotective effect of two synthetic enhancer substances, (−)-BPAP and (−)deprenyl, on human brain capillary endothelial cells and rat PC12 cells Life Sci 2006 Aug 8;79(11):1034-9. 5. L. Denes, G. Szilagyi, A. Gal, Z. Nagy, Talampanel a non-competitive AMPAantagonist attenuates caspase-3 dependent apoptosis in mouse brain after transient focal cerebral ischemia Brain Res Bull 2006 Jul;70(3):260-2. 6. Gál A, Szilágyi G, Wappler E, Sáfrány G, Nagy Z. Bcl-2 or Bcl-XL gene therapy reduces apoptosis and increases plasticity protein GAP-43 expression in PC12 cells. Brain Res Bull 2007 doi:10.1016/j.brainresbull.2007.11.001 68
Köszönetnyilvánítás. Szeretném köszönetemet kifejezni témavezetőmnek, Nagy Zoltán professzor úrnak, aki a munkámhoz minden segítséget megadott és irányt mutatott a neurológiai klinikumban és a kutatásokban. Maximális köszönet jár a laboratórium összes munkatársának, dr. Skopál Juditnak, Lantos Tibornénak, Badar Bélánénak Oroszné Tóth Katalinnak az áldozatos munkájukért és segítségükért. Köszönöm a PhD hallgató társaimnak, dr. Simon Lászlónak, Gál Anikónak és dr. Wappler Edinának. Külön köszönetemet fejezem ki dr. Gulyás Balázs professzornak, aki barátként segítette és támogatta a munkámat. Köszönöm a felségemnek és gyermekeimnek, hogy türelmesek voltak, amíg dolgoztam és nem utolsó sorban köszönöm szüleimnek és testvéremnek.
69
