Mikrobiální a molekulární ekologie lidského střeva, probiotika, prebiotika

MASARYKOVA UNIVERZITA V BRNĚ Ústav experimentální biologie Oddělení mikrobiologie

Mikrobiální a molekulární ekologie lidského střeva, probiotika, prebiotika (Bakalářská práce studijního programu Biologie oboru Obecná biologie – směr Mikrobiologie)

Petra Vídeňská

Brno, 2008

Poděkování Ráda bych poděkovala vedoucí mé bakalářské práce doc. RNDr Aleně Španové, Csc za poskytnutí potřebné literatury, cenných rad a za čas, který mi věnovala.

Obsah 1.

Seznam použitých zkratek: ............................................................................................. 5

2.

Úvod ................................................................................................................................... 6

3.

Cíl práce ............................................................................................................................ 7

4.

GIT a jeho mikroflóra...................................................................................................... 8

5.

6.

4.1.

Mikroflóra v gastrointestinálním traktu ....................................................................... 8

4.2.

Vývoj mikroorganizmů v gastrointestinálním traktu................................................. 11

4.3.

Funkce tlustého střeva ............................................................................................... 13

Prebiotika a prebiotika .................................................................................................. 16 5.1.

Probiotika................................................................................................................... 16

5.2.

Prebiotika ................................................................................................................... 20

Molekulární a mikrobiální ekologie lidského střeva ................................................... 23 6.1.

6.1.1.

Využití tečkové (dot-blot) analýzy ..................................................................... 25

6.1.2.

Fluorescenční hybridizace in situ (FISH)........................................................... 26

6.1.3.

Další metody využívající sondy ......................................................................... 28

6.2.

Analýzy mikrobiálních společenstev založené na PCR ............................................ 29

6.2.1.

DGGE ................................................................................................................. 29

6.2.2.

Využití DGGE .................................................................................................... 29

6.2.3.

DGGE a knihovna klonů .................................................................................... 32

6.2.4.

Kvantitativní PCR (qPCR) ................................................................................. 33

6.2.5.

Využití qPCR ..................................................................................................... 34

6.3. 7.

Strategie výzkumu za použití sond ............................................................................ 24

DNA čipy ................................................................................................................... 35

Probiotika a prebiotika u chorob GIT ......................................................................... 36 7.1.

Akutní gastroenteritidy .............................................................................................. 37

7.1.1.

Rotavirové infekce ............................................................................................. 37

7.1.2.

Postantibiotická kolitida způsobená C. difficile ................................................. 37

7.1.3.

Gastroenteritidy spojené s výskytem Helicobacter pylori ................................. 38

7.2.

Chronické gastroenteritidy ........................................................................................ 39

7.2.1.

Rakovina tlustého střeva .................................................................................... 39 3

7.2.2.

Ulcerózní kolitida ............................................................................................... 40

7.2.3.

Crohnova choroba .............................................................................................. 41

8.

Diskuze ............................................................................................................................ 43

9.

Závěr ................................................................................................................................ 45

10. Seznam literatury ........................................................................................................... 46

4

1.

Seznam použitých zkratek:

CD (crohn’s disease) – crohnova choroba CDAD (Clostridium difficile associated disease) – průjem způsobený Clostridium difficile CDCE (constant denaturant capillary electrophoresis) – konstantní denaturační kapilární elektroforéza CqPCR (competitive quantitative PCR) – PCR s kvantitativně kompetitivním stanovením DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis) – denaturační gradientová gelová elektroforéza Dot blot – hybridizace tečková EGF (epidermal growth factor) – epidermální růstový faktor EPEC (enteropathogenic E. coli) – enetropatogenní E. coli FAO (Food and agriculture organization) – Organizace spojených národů pro výživu a zemědělství FISH (fluorescence In situ hybridization) – fluorescenční hybridizace in situ FOS – fruktooligosacharidy GBF (germinated barley foodstuff) – mladý ječmen GIT – gastrointestinální trakt GOS – galaktooligosacharidy IBD (inflammatory bowel dinase) – idiopatické střevní záněty LDL (low density lipoprotein) – cholesterol s nízkou hustotou NDO (nondigestible oligosaccharides) – nestravitelné oligosacharidy qPCR (quantitative PCR) – kvantitativní PCR RFLP (restriction fragment length polymorphic) – polymorfizmus délky restrikčních fragmentů SCFA (short chain fatty acid) – mastné kyseliny s krátkými řetězci TGGE (temperature-gradient gel electrophoresis) – teplotní gradientová gelová elektroforéza UC (ulcerative colitis) – ulcerózní koltida WHO (World health organization) – Světová zdravotnická organizace 5-ASA – 5-aminosalicylová kyselina

5

2.

Úvod

Probiotika a prebiotika provází lidskou společnost již tisíciletí. Mléčným fermentovaným výrobkům se už dříve přičítala schopnost prodloužit život. Podle archeologických výzkumů je také nyní zřejmé, že naši předci konzumovali v různém poměru rostliny obsahující prebiotika, která jsou důležitou složkou lidské stravy mnoho století (Gibson a Rastall, 2006). Už před 9000 lety byly cíleně pěstovány v severní Americe rostliny s velkým podílem prebiotik, jako jsou například agáve (Agave spp.), sotol (Dasylirion spp., rostlina pocházející z Ameriky) a divoká cibule (Alium spp.). Jelikož je v současnosti v západních zemích jídla dostatek, začíná být vnímáno jako něco víc, než jen zdroj energie. V mnoha zemích narůstá počet obyvatel, zvyšuje se životní úroveň a z toho vyplývá i vyšší zájem o zdravotní péči. Také roste povědomí o správné výživě, která může pomoci v boji s nemocemi hlavně u stárnoucí populace. Jedná se o nemoci, které souvisejí se životním stylem, jako jsou například různé alergie, diabetes, osteoporóza, kardiovaskulární onemocnění a rakovina. V souvislosti s těmito poznatky vznikl koncept tzv. funkčních potravin. Ty jsou charakterizovány jako složky stravy, které mají příznivý účinek na fyziologickou aktivitu organismu hostitele, a tedy nejsou jen základními živinami, ale jsou také zdraví prospěšné (Milner, 2002). V České republice zatím nebyl termín „funkční potravina“ zaveden do legislativy. Mezi funkční potraviny patří potraviny obsahující probiotika a prebiotika. Produkty dostupné na trhu jsou například mléčné výrobky, dětská výživa, cereálie, pekařské výrobky, masné výrobky, instantní potraviny a doplňky stravy. Protože probiotika a prebiotika mají pozitivní vliv nejen na lidi, ale i na zvířata, začínají se objevovat i jim určená funkční krmiva. Využití probiotik a prebiotik při léčbě různých nemocí se zdá být slibné. Nicméně jsme teprve na počátku jejich uvedení do praxe a zatím známe jen některé jejich možnosti. Musíme nejdříve sekvencovat a analyzovat genom probiotik a v tom nám pomáhají stále se velmi dynamicky rozvíjející molekulární metody. Ty jsou nezbytné ke studiu nejen probiotik a hledání genů kódujících probiotické vlastnosti, ale i k poznání lidské střevní mikroflóry. Můžeme sledovat dopad aplikací probiotických a prebiotických preparátů na jedince a z toho vyvozovat patřičné závěry, což jsme předtím pouze s pomocí kultivačních metod nemohli.

6

3.

Cíl práce

Cílem této práce je seznámit čtenáře s mikroflórou gastrointestinálního traktu (GIT), zhodnotit používané přístupy, shrnout současné znalosti o mikrobiální ekologii lidského střeva a nastínit budoucí cesty výzkumu GI mikroflóry (včetně možností jejího ovlivnění) a jejího kladného působení na hostitelovo zdraví. Dále práce shrnuje základní informace o probiotikách a prebiotikách a jejich využití při léčbě či prevenci různých nemocí s tím, že podrobněji jsou uvedené některé choroby, u nichž mají probiotika a prebiotika velkou budoucnost.

7

4.

GIT a jeho mikroflóra

4.1. Mikroflóra v gastrointestinálním traktu GIT je pro člověka významný ze 3 důvodů. Prvním je příjem potravy, dále následuje zpracování potravy a nakonec vstřebávání živin. Z hlediska mikrobiologického osídlení nás nejvíce zajímají tyto části: žaludek, tenké střevo a tlusté střevo. Jsou to tři anatomicky velmi odlišné části GIT s rozdílným chemicko-fyzikálním prostředím, které ovlivňuje výskyt přirozené mikrobiální populace (obr.1) (Holzapfel a kol., 1998; Rabiu a Gibson, 2002).

Obr.1 Výskyt přirozené mikrobiální populace v GIT (upraveno podle www.crohn.cz/IMAGES/zazivaci_trakt.jpg)

V žaludku zdravého jedince je velmi nízké pH, navíc je zde potrava přítomna jen krátkou dobu, takže osídlení bakteriemi je minimální (Guarner a Malagelada, 2003). Nejznámější bakterií přežívající v žaludku je hlavně díky své patogenezi Helicobacter pylori. Je velmi pohyblivý pomocí mnoha unipolárních bičíků. Je usídlen mezi sliznicí žaludku a hlenovou vrstvou, která jej chrání proti působení nízkého pH. 8

Žluč, pankreatická šťáva a jiné sekrety tenkého střeva spolu s žaludeční šťávou inhibují většinu bakterií v duodenu a jejunu. Lze zde nalézt laktobacily a streptokoky. Populace bakterií dosahuje v této části GIT 100-10000 buněk na mililitr obsahu. Nicméně pomalá motilita distální oblasti tenkého střeva a nízké pH umožňuje vyšší mikrobiální kolonizaci ilea. Je osídlené řadou bakteriálních rodů a obsahuje 106 až 108 bakteriálních buněk na mililitr obsahu (Gibsona a Rastall, 2006). Navíc je zde větší diverzita bakterií než v horní části GIT (žaludku, duodenu a jejunu). Vyskytují se zde obligátní anaeroby, Gfakultativně-anaerobní bakterie, laktobacily a enterokoky. Nejvíce je bakteriemi osídleno tlusté střevo, kde se tráví strava asi 55-77h (u zdravého jedince) (Macfarlane a kol., 1998; Bourlioux a kol., 2003). V tlustém střevě je neutrální pH, nižší rychlost toku a hojné zásobení živinami, což je důvod extrémního osídlení tlustého střeva mikroorganismy. Hustota osídlení zdravého dospělého jedince přirozenou mikroflórou dosahuje 1011 až 1012 bakteriálních buněk na gram obsahu (Guarner a Malagelada, 2003). Také mikrobiální diverzita je velká – až na padesát různých bakteriálních rodů s více než 400 druhy (Ziemer a Gibson, 1998). Na obr. 2 je uveden fylogenetický strom dominantních druhů fekální mikroflóry. Nejvíce jsou v tlustém střevě zastoupeny nesporulující obligátní anaeroby (Gibson a Roberfroid, 1995). 30% z kultivovatelných bakterií jsou bakteroidy, dále jsou nejvíc zastoupeny eubakterie a bifidobakterie (Gibson a Rastall, 2006). Další součástí střevní mikroflóry jsou jak obligátní anaeroby, tak i fakultativní anaeroby, jako jsou peptostreptokoky, fusobakterie, laktobacily, enterobakterie, enterokoky, methanogeny a síru redukující bakterie (Tuohy a kol., 2001). Fakultativně anaerobní, gram pozitivní streptokoky jsou reprezentovány např. Streptococcus faecalis, S. bovis, S. equinus, a S. salivarus, který bývá izolován z úst (Gibson a Roberfroid, 1995). Mezi přítomné Ganarobní koky patří Veillonella a Acidaminococcus.

9

Obr. 2 Fylogenetický strom dominantních druhů fekální mikroflóry u zdravých dospělých jedinců. Data byla získána pomocí sond cílených na 16S rRNA. (upraveno podle Walker a kol., 2006)

Střevo také osídlují sporotvorné bakterie. Asi nejběžnějším rodem je Clostridium, hlavně Clostridium perfringens (Gibson a Roberfroid, 1995). Ačkoliv tento rod představuje jen malou součást mikroflóry, zahrnuje významné střevní patogeny. Rody z čeledě Enterobacteriaceae, zejména E. coli, jsou obvykle typické střevní bakterie, ale také se zde vyskytují patogenní zástupci významní v humánní medicíně (Gibson a Rastall, 2006). Poměrně nedávno byl ustanoven nový pojem mikrobiom, který je definován jako suma genů všech mikrobiálních druhů, které kolonizují střevo. Obsahuje odhadem stokrát více genů než má vlastní lidský genom. Bakterie v trávicím traktu mohou mezi sebou komunikovat (vnitrodruhová komunikace). Využívají k tomu tzv. quorum sensing a látky podobné hormonům (autoinducery). Tento signální systém umožňuje bakteriím mezi sebou koordinovaně regulovat expresi svých genů. Tím mohou synchronizovat své chování a chovat se v mnoha ohledech jako mnohobuněčný organizmus. Je pravděpodobné, že signální systém quorum sensing je schopen jisté míry komunikace s epitelovými buňkami hostitele (tzv. cross talk, mezidruhová komunikace, pozorována byla například mezi probiotikem a epiteliálními buňkami střeva) (obr 3) (Krejsek a kol., 2007b). 10

Obr. 3 Buněčné interakce ve střevě (upraveno podle Walker a kol., 2006)

4.2. Vývoj mikroorganizmů v gastrointestinálním traktu Složení a četnost mikroflóry lidského tlustého střeva ovlivňuje mnoho rozmanitých faktorů, jako jsou například genetické faktory hostitele, způsob porodu, zralost plodu při narození, délka kojení, strava, věk, zdraví, prostředí a buněčné interakce (mezi hostitelem a bakteriemi stejně jako mezi bakteriemi navzájem). Další faktory podílející se na složení mikroflóry ve střevě jsou shrnuty v tab. 1. Komplexnost a dynamika přirozené mikroflóry také hraje důležitou roli v lidském zdraví. Poskytuje totiž ochranu proti přerůstání alochtonních mikroorganismů (mohou způsobit onemocnění) a stimuluje imunitní systém (Gibson a Rastall, 2006). Bakterie osidlují lidské střevo krátce po narození v závislosti na způsobu porodu. U dětí narozených císařským řezem se GIT osidluje a střevní mikroflóra rozvíjí později než u dětí porozených přirozenou cestou (Grönlund a kol., 1999; Mackie a kol., 1999). U předčasně narozených dětí s nízkou porodní váhou je podle současných výzkumů GIT osídlen se zpožděním a zastoupení mikroorganizmů je v neonatální mikroflóře odlišné. Sedmileté děti narozené císařským řezem mají ve střevní mikroflóře větší zastoupení klostridií než přirozeně porozené dětí stejného věku i pohlaví (Salminen a kol., 2004). Kolonizaci střeva lze rozlišit do pěti fází. Neonatální mikroflóra se skládá zpočátku hlavně z fakultativních anaerobů, které pocházejí z mateřské vaginální a fekální bakteriální flóry (fáze 1, primární kolonizace). Snižují redox potenciál ve střevě, což umožňuje kolonizaci obligátními anaeroby, jako jsou bifidobakterie, bakteroidy a klostridia (fáze 2). 11

Novorozenecká strava má během fáze 2 základní úlohu nejen pro získání fekální mikroflóry, ale ovlivňuje i její složení a vývoj (Mountzouris a kol., 2002).

Tab. 1 Faktory podílející se na složení mikroflóry ve střevě (upraveno podle Fooks a kol., 1999) Typ stravy Množství, chemické složení a dostupnost růstových substrátů Dostupnost kolonizačních míst Imunologické interakce Způsob bakteriální fermentace Rychlost trávení Hodnota pH ve střevě Redox potenciál Dostupnost anorganických elektronových receptorů Produkce bakteriálních metabolitů Přítomnost antimikrobiálních látek Xenobiotické látky Peristaltika

Bylo publikováno mnoho prací, ve kterých se srovnávala fekální mikroflóra u dětí krmených mateřským mlékem a kojeneckou výživou. Většina těchto prací zahrnuje data získaná kultivačními metodami, ale novější práce využívají molekulárně biologické metody. Mezi výsledky jednotlivých autorů jsou rozdíly, ale všichni se shodují na tom, že je u zkoumaných dvou skupin rozdílná fekální mikroflóra. Děti krmené moderními kojeneckými výživami, které obsahují prebiotika, mají podobnější střevní mikroflóru jako děti kojené mateřským mlékem (Boehm a kol., 2002). Rozdíly mezi jednotlivými studiemi jsou nejspíše způsobeny různou metodologií (získávání a manipulace se vzorky, kultivace a identifikační strategie), faktory prostředí (například geografické, kulturní nebo sociálně-ekonomické rozdíly) nebo kojeneckou výživou. Základní zjištění je, že u dětí krmených výhradně mateřským mlékem (nebo kojeneckou výživou s prebiotiky) se vyskytuje mikroflóra, kde dominují bifidobakterie (ve fázi 2), zatímco u dětí krmených standardní výživou se rozvíjí mikroflóra různorodá (Gibson a Rastall, 2006). Třetí fáze bakteriálního osídlení kojeneckého GIT je spojeno se začátkem příjmu pevné stravy. U dětí krmených mateřským mlékem se změní mikrobiální zastoupení v mnohem různorodější populaci, která se podobá zastoupení u dětí krmených kojeneckou 12

výživou ve fázi 2. Predominantní skupinou se stávají bakteroidy (Mackie a kol., 1999). Fáze 4 je spojena s dosažením obdobného složení mikroflóry, jako mají dospělí. Kolonizace během 5 fáze zatím není zcela objasněna a dochází k ní v pozdějších letech života. Gorbach a kol. prokázali, že střevní mikroflóra starších lidí obsahuje nižší zastoupení bifidobakterií a vyšší zastoupení enterobakterií a kvasinek než u dospělých (Gorbach a kol., 1967 v Gibson a Rastall, 2006). Mitsuokovy výsledky potvrzují, že tyto mikrobiální změny nastávají ve vyšším věku (Mitsuoka, 1992 v Gibson a Rastall, 2006). Poslední studie využívající 16S rRNA analýzu ukazují, že střevní mikroflóra starších lidí je různorodější než u mladších lidí (Saunier a Doré, 2002). Tyto výsledky mohou mít přímý dopad na zdraví ve stárnoucí populaci Mohou pomoci vysvětlit, proč vzrůstá riziko vzniku GI infekcí a chronických onemocnění (jako je rakovina tlustého střeva, která má přímou souvislost se zvyšujícím se věkem).

4.3. Funkce tlustého střeva Člověk žije v úzkém kontaktu s ohromným množstvím mikroorganismů, které jsou přítomny na kůži, v ústech a v GIT. V lidském těle se nachází asi 1kg mikroorganismů. Tělo má 20 krát více bakteriálních buněk než lidských. Nejvíce mikroorganizmů se nachází v tlustém střevě (viz 4.1). Dříve se předpokládalo, že hlavní funkce tlustého střeva je vstřebávání vody a solí a že slouží pouze jako místo k uskladnění odpadního materiálu z potravy. Dnes už víme, že má i mnoho jiných důležitých biologických funkcí. Příkladem může být aktivní transport sodných a chloridových iontů, pravděpodobně sodík za vodík a chlorid za uhličitan (Gibson a Rastall, 2006). Dále absorbuje produkty bakteriální fermentace, jako jsou mastné kyseliny s krátkými řetězci (SCFA), amoniak a další metabolity (tab. 2). Sliznice tlustého střeva také vylučuje sekret, který je potencionálním zdrojem hormonů a neuropeptidů, které se podílejí na lokálním řízení střevních funkcí (Gibson a Rastall, 2006). Tlusté střevo a přirozená mikroflóra přispívají k lepšímu trávení složek potravy, jako jsou škroby, rostlinné polysacharidy a proteiny, které nejsou stráveny a neabsorbují se v tenkém střevě. Voda, nestrávená potrava a endogenní zdroje živin postupují z tenkého střeva do vzestupného tračníku a jsou pro zde sídlící bakterie bohatým zdrojem živin. Bakterie se zde množí velmi rychle a produkce SCFA snižuje střevní pH. Jak střevní obsah postupuje tlustým střevem, tak sacharidy a jiné bakteriální substráty jsou vyčerpávány, snižuje se hladina kyselosti a pH se blíží k neutrálnímu (Gibson a Rastall, 2006).

13

Pomocí tzv. bezmikrobních (germfree) zvířat lze sledovat, jak střevní mikroflóra ovlivňuje celkovou homeostázi organismu (Tannock, 1998). Experimenty ukázaly, že biochemické, fyziologické a imunologické vlastnosti silně souvisí se složením mikroflóry ve střevě. Dietetické faktory, jako jsou probiotika a prebiotika, ovlivňují a regulují složení střevní mikroflóry a pomáhají snížit počet patogenních bakterií kompetitivní okluzí. Dále mohou pomoci hostiteli posílit imunitní systém a ustanovit homeostázi (Roberfroid, 2001).

Tab. 2 Dominantní produkty metabolismu sacharidů v lidském tlustém střevě (upraveno podle Gibson, 1999) Konečný produkt Acetát

Propionát

Příslušné bakterie

Osud metabolitu

Bakteroidy, bifidobakterie, eubakterie, laktobacily, klostridia,ruminokoky, peptokoky, veillonelly, peptostreptokoky, propionibakterie, fusobakterie, butyvibrio Bakteroidy, proponibakterie, veillonelly

Je metabolizován ve svalech, ledvinách, srdci a mozku

Přečištěný játry může sloužit jako glukogenní prekurzor, potlačuje syntézu cholesterolu

Butyrát

Klostridie, fusobakterie, butyrovibrio, peptostreptokoky

Je metabolizován buňkami střevního epitelu, reguluje buněčný růst a proliferaci

Etanol, sukcinát, laktát, pyruvát

Bakteroidy, bifidobakterie, eubakterie, laktobacily, klostridie, ruminokoky, peptostreptokoky, propionibakterie, fusobakterie, enterokoky a aktinomycety Klostridie, ruminokoky, fusobakterie

Absorpce tlustým střevem

Vodík

Částečně je vylučován dechem, je metabolizován bakteriemi

Z imunologického hlediska je střevo největším sekundárním imunitním orgánem. Podle současných názorů je klíčovým obdobím pro nastavení individuální imunitní reaktivity období těsně po narození, tj. kojenecké a batolecí období vývoje, které je ovlivňováno kvalitativním i kvantitativním složením stravy. Během tohoto období bývá nejdůležitější součástí stravy mateřské mléko obsahující rozmanité proteiny s unikátními vlastnostmi. Trávením těchto proteinů jsou rychle rostoucímu kojenci dodávány v optimální podobě aminokyseliny. Další proteiny jsou součástí enzymů, které napomáhají kojenci trávit lipidy a škroby. Význam tlustého střeva však spočívá v již zmíněném rozvoji imunitní odpovědi jedince.

14

Mateřské mléko obsahuje peptidy s antibakteriálními účinky, jako jsou například defenziny, které usmrcují bakterie prostřednictvím poškození cytoplazmatické membrány. Dále byly prokázány desítky látek charakteru cytokinů. Na maturaci střevní sliznice působí epidermální růstový faktor (EGF). V neposlední řadě mateřské mléko obsahuje řadu látek s prebiotickými vlastnostmi a to především oligosacharidové substance, které v kolostru dosahují podílu cca 20g/l. Toto množství se s věkem snižuje až na hladinu asi 12g/l. Individuální stravou se modeluje střevní mikroflóra jedince do tzv. osidlovacích vzorů mikroorganizmů. Průmyslově vyráběné potraviny jsou během výrobního procesu zbavovány mikroorganizmů. Člověk je při konzumaci takto připravené potravy zbaven expozice živými mikroorganizmy. I to má nepochybně negativní vliv na rozvoj individuální imunitní reaktivity.

Kojení,

mikroorganizmů

by

aplikace mohly

látek

s prebiotickými

pozitivně

ovlivnit

vlastnostmi nežádoucí

a trend

probiotických v prevalenci

imunopatologických nemocí v populaci (Krejsek a kol., 2007a).

15

5.

Prebiotika a prebiotika

5.1. Probiotika První zaznamenané probiotikum bylo fermentované mléko. Kladné účinky fermentovaného mléka na člověka byly známé již před mnoha stoletími. Vědecký zájem o význam potravy pro zdraví člověka však nastal až po publikaci knihy nazvané Prodloužení života od Mečnikova v roce 1908. Upozornil na to, že lidé by měli konzumovat fermentované mléko, které obsahuje laktobacily, aby si prodloužili život (Suvarna a Boby, 2005). Definice probiotik se stále mění. Podle nejnovější definice jsou probiotika charakterizována jako monokultury nebo směsné kultury živých mikroorganismů, které po konzumaci prospěšně ovlivňují hostitele zlepšením vlastností jeho vlastní střevní mikroflóry. Mezi probiotika jsou v současné době řazeny laktobacily, bifidobakterie, streptokoky, enterokoky a sacharomycety. Nejčastěji používaná probiotika jsou shrnuta v tab. 3 (Nevoral, 2005).

Tab. 3 Nejčastěji používaná probiotika (upraveno podle Nevoral, 2005) Laktobacily L. acidophilus L. casei, spec. rhamnosus (Lactobacillus GG) L. casei Shirota L. delbrueckii subsp. bulggaricus L. reuteri L. brevis L. cellobiosus L. curvatus L. fermentum L. plantarum Gram pozitivní koky Lactococcus lactis subsp. cremonis Streptococcus salivarius subsp. thermophilus Enterococcus faecium S. diacetylactis S. intermedius Bifidobakterie B. bifidum B. adolescentis B. animalis B. infantis B. longum B. thermophilum E. coli (sérotyp O83:K24:H1) Kvasinky Saccharomyces boulardii

16

Probiotika mohou přinášet člověku užitek mnoha způsoby. Například při intoleranci laktózy, která je způsobená nedostatečnou aktivitou laktázy v lidském střevě. Více než polovina světové populace není schopna v dospělosti využívat laktózu a již při požití malého množství se u nich dostavují zažívací potíže. Laktóza je totiž ve střevě metabolizována bakteriemi a důsledkem je průjem, zvracení a bolesti břicha. Tito lidé lépe snášejí fermentované mléčné výrobky. Vysvětluje se to delší dobou průchodu zažívacím ústrojím a delším účinkem živých bakterií, které produkují laktázu. Toleranci k laktóze mohou zlepšit i kmeny produkující β−galaktosidázu (Nevoral, 2005; Suvarna a Boby, 2005). Dále je probiotikům přisuzován i protirakovinný účinek. Epidemiologické studie ukazují, že konzumace tuků s vysokým obsahem nasycených mastných kyselin představuje zvýšené riziko kolorektální rakoviny. Na zvířecích modelech se osvědčil kmen Bifidobacterium longum. Při bakteriální fermentaci většího množství vlákniny ve střevech je produkován butyrát a SCFA, které mají protirakovinné účinky (Yuan a kol., 2004). Střevní mikroflóra je také schopna ovlivňovat tvorbu karcinomu produkcí enzymů, které zabraňují v přeměně prekarcinogenů v karcinogen. Probiotika se uplatňují i u koronárního onemocnění srdce. Podle provedených studií probiotika mohou ovlivnit koncentraci cholesterolu v plazmě a tím i incidenci onemocnění srdce. Je známo, že hladina cholesterolu je odrazem složení stravy. Probiotické bakterie významně snižují obsah LDL cholesterolu v krvi tím, že jej metabolizují jako svůj zdroj energie (např. L. casei). Velký význam pro nás mají probiotika i při střevních infekcích. Dále mohou být nápomocné při trávení některých hůře stravitelných potravin a při zažívacích potížích. Fermentované mléko obsahuje mírně odlišné živiny. Fermentační proces činí proteiny dostupnějšími proteolytické aktivitě. Pro preventivní a terapeutické využití probiotik je důležitá jejich schopnost stimulovat specifickou i nespecifickou imunitu. V tab. 4 jsou uvedeny mechanizmy možného působení probiotik (Fooks a kol., 1999). Pro zařazení mezi probiotika musí jednotlivé kmeny splňovat řadu požadavků, které jsou shrnuty v tab. 5. Bakteriální kmeny musí mít prokazatelně pozitivní vliv na zdraví hostitele a musí být zdravotně nezávadné, izolované ze stejného živočišného druhu jako je předpokládaný příjemce a nesmí být toxické ani patogenní. Forma, ve které je probiotikum podáváno musí obsahovat dostatečné množství životaschopných bakterií (Nevoral, 2005).

17

Tab. 4 Mechanizmy možného působení probiotik (upraveno podle Nevoral, 2005) Stabilizace střevní flóry kompeticí s patogenními mikroorganizmy o vazebná místa na receptorech a o živiny Produkce mastných kyselin s krátkými řetězci (SCFA, zvl. kyselina máselná) Pokles pH střevního obsahu Zvýšení rozpustnosti minerálních látek Omezení zpětné resorpce žlučových kyselin Stabilizace střevní slizniční bariéry, úprava střevní permeability Produkce antimikrobiálních substancí Modifikace toxinů a toxinových receptorů Zeslabení virulence Stimulace imunitní odpovědi na patogeny (zvýšená produkce sekrečního IgA, IgG, IgM, protizánětlivě působících cytokinů IL-10, TGF-β; snížená produkce prozánětlivých cytokinů TNF-α, interferonu-γ, stejně jako mediátorů zánětu např. matrixmetalloproteináz).

Tab. 5 Nejdůležitější charakteristiky probiotik (upraveno podle Nevoral, 2005) Prospěšnost pro zdraví Schopnost kolonizace a adherence Antagonistický vliv na patogenní flóru Schopnost tvorby antimikrobiálních substancí Schopnost imunomodulace Měřitelná a klinicky dokumentovatelná užitečnost pro zdraví příjemce Mikrobiologické bezpečnostní požadavky Přesné taxonomické zařazení Humánní původ Netoxické a nepatogenní Geneticky stabilní Schopnost přežívat, růst a být metabolicky aktivní v trávicím ústrojí příjemce Potencionálně resistentní proti antimikrobiálním látkám původní mikroflóry příjemce Resistentní proti žaludeční kyselině a žlučovým kyselinám Průmyslové parametry Stabilita žádaných vlastností během výroby, transportu a skladování potravinového výrobku Příznivé organoleptické vlastnosti Prospěšnost pro zdraví U aplikace probiotik je zvolení dávky velmi důležitým aspektem. Při příliš nízké dávce se účinek probiotik nemusí projevit, naopak velká dávka může způsobit zažívací potíže. 18

Potraviny s probiotiky by měly mě obsahovat 108-1011 živých bakterií. Velikost dávky může m ovlivnit i výsledky studií, kdy se stejné výsledky jako u kontroly zdůvod ůvodňují příliš nízkou dávkou probiotika (Dendukuri a kol., kol 2005). Probiotika mohou ou být podávána ve formě form prášku, tabletek nebo kapslí, dále v tekutém stavu např. ve spreji. Nejčastější častější formou příjmu p probiotických kultur je fermentované ermentované mléko (Fooks a kol., 1999). 1999) Přii dodávání nových probiotik na trh musí být splněny spln ny směrnice, smě které byly ustanoveny roku 2002 FAO a WHO. Je to souhrn doporučených doporu ených pravidel a metodických postupů vedoucích k identifikaci a charakterizaci nových novýc probiotik. Bylo ylo také ustanoveno, jaký by měll být minimální zdravotní přínos p probiotik. Obr. 4 zobrazuje postupy, postupy které platí pro hodnocení probiotik v potravinách (Reid a kol., 2003).

Obr.4 Směrnice rnice pro hodnocení probiotik v potravinách (upraveno podle Reid a kol., 2003) 19

5.2. Prebiotika Prebiotika jsou nestravitelné složky potravy, které podporují selektivně růst nebo aktivitu jednoho druhu nebo omezeného počtu druhů střevních bakterií a tím pozitivně ovlivňují složení střevní mikroflóry, čímž mají celkově pozitivní vliv na zdraví a celkovou pohodu jedince (Gibson a Roberfroid, 1995). Takovéto potravinové doplňky musí splňovat následující kritéria: •

odolnost proti nízkému pH v žaludku a tenkém střevě

•

rezistence k trávicím enzymům

•

hydrolýza a fermentace střevními bakteriemi

•

selektivní stimulace růstu pouze limitovaného počtu prospěšných střevních mikroorganizmů

Hlavním cílem prebiotik jsou bakterie mléčného kvašení a bifidobakterie, protože ovlivňují mnohé funkce tlustého střeva a stimulují imunitní systém (Fuller a Gibson, 1997). Jakákoliv nestrávená strava vstupující do tlustého střeva může být potencionálním prebiotikem (Collins a Gibson, 1999). Jedná se např. o sacharidy, jako jsou odolné škroby a vláknina z potravy, dále také proteiny a lipidy (Ziemer a Gibson, 1998). Hlavním cílem prebiotik jsou bakterie mléčného kvašení a bifidobakterie, protože ovlivňují mnohé funkce tlustého střeva a stimulují imunitní systém (Fuller a Gibson, 1997). Nicméně, aby bylo prebiotikum efektivní, musí splňovat několik atributů (tab. 6). Nejčastěji se jedná o některé nestravitelné oligosacharidy, které splňují požadovaný stupeň fermentační selektivity (Gibson a kol., 1995).

Tab. 6 Navržené charakteristiky pro prebiotika (upraveno podle Gibson a Rastall, 2006) Žádané vlastnosti prebiotik

Vlastnosti oligosacharidů

Stabilita při trávení

Mít volná 1-6 vazebná místa a pyranosylový kruh

Stálost ve střevě

Vysoká molekulová hmotnost

Nemít vedlejší efekty

Být selektivně metabolizován prospěšnými bakteriemi, ale neprodukovat plyn, nepodporovat růst hnilobných organismů, atp.

Účinné v nízkých dávkách

Být selektivně a efektivně metabolizován bifidobakteriemi nebo laktobacilů

Kontrola změn mikroflóry

Být selektivně metabolizován omezeným počtem bakterií

Inhibice adheze patogenů

Obsahovat receptorové sekvence

Měnící se sladkost

Složení z různých monosacharidových jednotek

20

Prebiotické doplňky stravy, hlavně inulin a fruktooligosacharidy (FOS), bývají dávány do různých potravin, aby ovlivnily mikroflóru v tlustém střevě. Prebiotika mají nízkou energetickou hodnotu (< 9kJ/g) a zvyšují objem stolice. Nadměrným užíváním potom vzniká nadbytek produktu, což se projevuje plynatostí, nadýmáním, abdominálními křečemi a průjmem (Gibson a Rastall, 2006). Zvýšená produkce SCFA střevní mikroflórou, která využívá tyto nestravitelné oligosacharidy, může být obranou proti rozvoji kolorektální rakoviny (Hughes a Rowland, 2001; Augenlicht a kol., 2002). Další možností v terapii prebiotiky je jejich užívání při prevenci proti střevním infekcím a v modulaci střevní imunitní odpovědi při idiopatických střevních zánětech (IBD). Užívání živých bakterií (probiotik) jako potravinového doplňku při léčbě určitých nemocí (IBD etc.) je poměrně dobře zdokumentováno. Užívání prebiotik poskytuje určité výhody oproti probiotikům pokud jde o schopnost přežít v GIT a o dlouhotrvající stabilitu v potravinách.

Prebiotika

nabízejí

potenciál

v prevenci

a

léčbě

významných

gastrointestinálních chorob. Budoucí studium prebiotik pravděpodobně bude více zaměřeno na přímý vliv na patogenní mikroflóru. Například přítomnost celobiózy značně snižuje u Listeria monocytogenes expresi genů odpovídajících za její virulenci (Park a Kroll, 1993). Ballongue a kol.

potvrdili

prebiotické

vlastnosti

laktulózy

při

experimentu

s dobrovolníky.

Dobrovolníkům, kterým bylo podáváno buď prebiotikum, nebo placebo dvakrát denně po 10g, byly odebírány vzorky stolice a určovány bakterie pomocí selektivních médií. Cílovými populacemi byli Bacteroides, Clostridium, koliformní bakterie, Eubacterium, Lactobacillus a Streptococcus.

Autoři

zaznamenali

během

experimentu

významné

zvýšení

počtu

bifidobakterií, laktobacilů a streptokoků, zatímco klesl počet bakteroidů, klostrídií, koliformních bakterií a eubakterií. To by mohlo být způsobeno prebiotickou aktivitou laktulózy, přestože použití selektivního agaru na rozlišení bakterií není přesné (Ballonge a kol., 1997 v Gibson a Rastall, 2006). Fruktooligosacharidy se přirozeně vyskytují v mnoha různých rostlinách, nejvíce potom v česneku, cibuli, chřestu, čekance, artyčoku, banánu, pšenici, pórku a topinamburu (Gibson a Rastall, 2006). Bylo provedeno několik studií na dobrovolnících, které potvrdily jejich prebiotickou aktivitu, třebaže dávka, strava, trvání studie a zkoumané subjekty byly rozdílné. Gibson a kol. (1995) zveřejnil výsledky experimentu, kdy dospělí dobrovolníci jedli kontrolovanou stravu doplněnou denně o 15g FOS. Jako kontrola byla použita sacharóza. Vzorky stolice byly zpracovány během třiceti minut po odebrání.

21

Důležité je, že tato studie využila k identifikaci bakterií, které se pomnožily během speciálního stravovacího režimu, ověřené techniky fenotypové charakterizace. Studie ukázala, že příjem potravy s FOS významně mění kompozici fekální mikroflóry. Několikanásobně je stimulován především růst bifidobakterií, které se po dvou týdnech užívání upravené stravy staly predominantní bakteriální skupinou. Dále se užíváním FOS významně snížil počet bakteroidů, fusobakterií a klostrídií. Tento efekt trval po celou dobu konzumace prebiotik. I po následovném dvoutýdenním ověřování obsahovala fekální flóra všech dobrovolníků více bifidobakterií, než měla před doplněním stravy o prebiotika. Prebiotika, která vynikají antiadhezivními vlastnostmi proti patogenům, by také mohla ovlivnit střevní patogenezi. Střevní patogeny využívají obvykle proteiny vážící sacharidy k tomu, aby mohly napadnout buňky a iniciovat onemocnění. Exogenní látky (prebiotika) obsahují stejné zbytky sacharidů, jaké jsou vyžadovány patogeny, což potlačuje bakteriální adhezi na buňky střevního epitelu a zamezuje kolonizaci. Prebiotika obsahující takovéto sacharidové zbytky mohou působit jako blokující faktor (Gibson a Rastall., 2006). Některé z těchto sacharidů byly již dříve identifikovány v mateřském mléku, které je považováno za kompletní stravu a stimulanta růstu bifidobakterií (Collins a Gibson, 1999). V tab. 7 jsou shrnuty základní mechanizmy účinku prebiotik.

Tab. 7 Mechanizmy účinku prebiotik Jsou substrátem pro člověku prospěšné bakterie Mají přímý vliv na patogenní mikroflóru Vykazují antiadhezivní vlastnosti proti patogenům Neutralizují toxiny (toxin A u C. difficile)

Kombinace probiotika a prebiotika se nazývá synbiotikum. V synbiotiku je probiotikum kombinováno s prebiotikem, které je pro ně specifické (tab. 8). Tato kombinace potom přispívá k prodloužení přežívání probiotika, pro které je prebiotikum specifickým substrátem vhodným k fermentaci. Tento přístup nachází největší uplatnění u nekojených dětí a starších lidí (Fooks a kol., 1999).

Tab. 8 Synbiotika (upraveno podle Collins a Gibson, 1999) Probiotikum

Bifidobacterium

Lactobacillus

Bifidobacterium

Prebiotikum

FOS

Laktikol

GOS

22

6.

Molekulární a mikrobiální ekologie lidského střeva

Mnoho ze starších prací, zabývajících se výzkumem mikrobiální ekologie lidského GIT, využívalo kultivační metody a následnou charakterizaci bakteriálních izolátů. Z počátku byla k rozlišení a identifikaci jednotlivých izolátů využívána fenotypová charakterizace. Tyto testy zahrnovaly popis tvaru kolonií a morfologii jednotlivých buněk, růstové požadavky, stanovení rezistence k různým látkám a charakterizace metabolizmu bakteriálních izolátů. Pomocí fenotypizace však nelze jednotlivé izoláty přesně taxonomicky klasifikovat. Například stejné fenotypové vlastnosti mohou vykazovat i geneticky velmi nepříbuzné biotypy. Analýza se často potýkala s problémem reprodukovatelnosti, nebo dávala nejednoznačný výsledek způsobený plasticitou bakteriálního metabolizmu. Z toho logicky vyplývá, že stanovení fenotypových parametrů je nedostačující. Příchod molekulárních technologií umožňuje genotypovou klasifikaci bakteriálních kmenů, jejíž výsledek je taxonomicky i fylogeneticky nadřazený fenotypovým identifikačním postupům (McCartney, 2002). Navíc, molekulární genotypové analýzy umožňují rychlejší a spolehlivější klasifikaci jednotlivých izolátů a umožňují rozšíření jejich aplikací, včetně studia diferenciace (Olive a Bean, 1999). Nicméně, hlavní přínos kultivačních metod a fenotypové charakterizace je to, že poskytují základní informace a znalosti mikrobiální fyziologie. Molekulární analýza (včetně metody DNA fingrprintů, využití sond a hybridizací a analýzy společenství) umožňuje spolehlivou diferenciaci nižších fylogenetických taxonů (například druhů a poddruhů). Nejprve se molekulární analýzy využívaly hlavně k identifikaci bakteriálních izolátů získaných během kultivačních studií a zahrnovaly zejména metody nepřímé, jako DNA fingrprinty založené na polymorfizmu délky restrikčních fragmentů (RFLP) (McCartney, 2002). Velmi rychle se rozvíjely i metody založené na stanovení sekvence DNA. Díky stále se rozšiřujícím databázím s bakteriálními sekvencemi genů pro ribozomální RNA se tato metoda stala rychlou a přesnou pro identifikaci genotypu. Dále se rozvíjejí metody, které využívají sondy. Podobně i vznik a následné využívání amplifikačních technik (PCR), společně s metodami, pomocí kterých se dají zjišťovat fylogenetické vztahy (například denaturační gradientová gelová elektroforéza (DGGE)), se rozšířily naše možnosti vedoucí k porozumění lidské střevní mikroflóry. Molekulární

technologie

využíváme

v mikrobiologii

lidského

střeva

hlavně

k identifikaci bakteriálních izolátů, stanovení specifických fylogenetických skupin, sledování organismů, které mají pro nás zvláštní význam (jako jsou probiotika) a pro charakterizaci 23

bakteriální diverzity a dynamičnosti v čase a mezi jednotlivci nebo studovanými skupinami. Aktuální rozvoj studia molekulární ekologie lidského střeva umožňuje využívání vysoce výkonných systémů (včetně mikročipů) a funkční genomiky (jako je metabonomika, proteomika a nutrigenomika). 6.1.

Strategie výzkumu za použití sond

Molekulární analýzy využívající sondy se uplatňují při sledování převládajících bakteriálních skupin ve smíšených bakteriálních populacích. Existuje velké množství metodologických přístupů, například hybridizace na pevných podkladech, tečkové (dot blot) hybridizace a in situ hybridizace. Jádrem těchto technologií je hybridizace oligonukleotidů (sond), obvykle připravených synteticky, s cílovou specifickou sekvencí bakteriální DNA. Teoreticky může být takto využita jakákoliv sekvence DNA, rozhodující je její specificita a selektivita. Fyzikální a chemické vlastnosti bakteriálního genomu, včetně sekundární a terciální struktury, vylučují použití této metody na některé oblasti genomu. Specificita oligonukleotidových sond je závislá na cílové sekvenci a na hybridizačních podmínkách (Charteris a kol., 1997). Většina metod založených na použití sond se při výzkumu smíšených bakteriálních populací zaměřuje na bakteriální ribozomy, především na16S rDNA sondy. Výhoda genů pro 16S rRNA je přítomnost vysoce konzervativních, variabilních a vysoce variabilních oblastí (umožňujících selekci oligonukleotidových sekvencí s různou taxonomickou specificitou), a dostupnost rozsáhlé databáze těchto sekvencí. Vysoce konzervativní oblast obsahuje univerzální cílové sekvence (např. doménová sonda, Bact 338), variabilní oblast skupinové sekvence (jako je EREC 482, sonda pro skupinu Clostridium coccoides/Eubacterium rectale) a hypervariabilní oblast pro rodově a druhově specifické sekvence (např. Bif 164 pro Bifidobacterium spp a Bdis 656 pro Bacteroides distasonis) (Franks a kol., 1998; Harmsen a kol., 2002). V tab. 9 jsou uvedeny příklady sond využívané pro detekci potencionálních probiotik z rodu Lactabacillus a Bifidobacterium. Další studie se zabývaly potenciálem jiných bakteriálních genů, jako je například gen pro enzym fruktosa-6-fosfátfosfoketoláza, specifický pro druhy Bifidobacterium a Gardnerella (Gibson a Rastall, 2006). Použití sond je limitováno mírou specificity a detekčním limitem. Jak se rozšiřuje naše poznání v oblasti střevní mikroflóry, objevují se a identifikují nové druhy, tak se i zvětšuje nabídka oligonukeotidových sond (zejména sondy cílené na 16S rRNA). Nejvíce se ke studiu lidské střevní mikroflóry využívají metody tečkové hybridizace a fluorescenční hybridizace in situ (FISH).

24

Tab. 9 Olignukleotidové sondy pro identifikaci potencionálních probiotických laktobacilů a bifidobakterií (Charteris a kol., 1997) Sonda

5‘,3‘ sekvence

Cílová rRNA

Specifita pro druhy Lactobacillus a Bifidobacterium:

Lba(1)

TCT TTC GAT CC.4 TCC ACA

23S

L. acidophilus

Lba(2)

AGC GAG CUG AAC CAA CAG AUU C

16S

L. acidophilus

Lbcp

CAA TCT CTT CCC TAG CAC

23S

L. crispatus

Lbg

TCC TTT CAT ATG CAT CC.4

23S

L. gasseri

Lbj

ATA ATA TAT GCA TCC ACA G

23S

L. johnsonii

Lbcr

GCAGGCAATACA CTGATG

23S

L. casei/rhamnosus

Lbcrp

CTG ATG TGT ACT GGG TTC

23S

L. casei/paracasei/rhamnsus

Lbpa

CAC TGA CAA GCA ATA CAC

23S

L. paracasei

Lbr

CAT CCA TCG TC.A ATC AGG

16S

L. reuteri

Lbfe( 1) GCG ACC AAA ATC AAT CAG G

16S

L. fermentum

Lbfe(2)

AAC GCG UUG GCC CAA UUG AUU G

16S

L. fermentum

Lbp

AAC GAA CUA UGG UAU UGA UUG G

16S

L. plantarum

Lbpp

ATC TAG TCG TAA CAG TTG

23S

L. plantarum

a1

GGA TC CTG AAA ACC CGG

16S

rod Bifidobacterium

a2

GGA TCC CTT AAA ACC CGG

16S

B. adolescentis/coryneforme

a3

GAC GCG GCG ACG CGG A

16S

B. longum/infantis/suis

a4

GAC CTC GTG AGG GGG A

16S

B. adolescentis

a5

GAC AGT GCG AGC TGG A

16S

B. breve

a6

GAC ACG GCG ACG TGG A

16S

B. pseudocatenualtum

Bif164

CAT CCG GCA TTA CCA CCC

16S

rod Bifidobacterium

Bif662

CCA CCG TTA CAC CGG GAA

16S

rod Bifidobacterium

Bif1278

CCG GTT TTC AGG ATC C

16S

rod Bifidobacterium

PAD

GCT CCC AGT CAA AAG CG

16S

B. adolescentis

PBI

GCA GGC TCC GAT CCG A

16S

B. bifidum

PBR

AAG GTA CAC TCA ACA CA

16S

B. breve

PIN

TCA CGC TTG CTC CCC GAT A

16S

B. infantis

PLO

TCT CGC TTG CTC CCC GAT A

16S

B. longum

a1-a6 – potencionální sondy 6.1.1.

Využití tečkové (dot-blot) analýzy

Při tečkové analýze se sondy hybridizují s DNA extrahovanou z bakteriálních izolátů nebo přímo ze vzorku. Výsledkem je procentuální index z celkové 16S rRNA, která zahrnuje 25

každou specifickou populaci. Větší počet oligonukleotidových sond nebo vzorků může být simultánně testován s využitím tečkové hybridizace využívající šachovnicový formát (DNA nebo sondy), při kterém se používají stejné podmínky hybridizace pro všechny sondy (McCartney, 2002). Tuto metodu využily ve svých výzkumech dva týmy při sledování dominantní fekální mikroflóry zdravých lidí (Sghir a kol., 2000; Marteau a kol., 2001). Sghir a kol. (2000) ve své studii uvedli, že dominantní je skupina Bacteroides, podskupina Clostridium leptum a skupina Clostridium coccoides/Eubacterium rectale. Zastupují 37, 16 a 14% z celkové rRNA. Jiné výsledky se objevily v druhé studii, v práci Marteau a kol. (2001), kde výše jmenované tři skupiny bakterií zastupují 44% z celkové rRNA. Hopkins a kol. (2001) využili tečkové analýzy a tradičních kultivačních metod k výzkumu mikrobiálního zastoupení lidské střevní mikroflóry u čtyř skupin dobrovolníků (děti, dospělí, starší lidé a starší pacienti trpící průjmem způsobeným Clostridium difficile (CDAD)). Zajímavé bylo, že výrazně vyšší zastoupení enterobakterií bylo pozorováno u dětí (ve srovnání s dospělými). Dále byl prokázán rozdíl v zastoupení bifidobakterií v závislosti na věku, kdy obě skupiny starších jedinců měly méně bifidobakterií než děti a dospělí. Ovšem i mezi skupinou starších lidí byla pozorována velká individuální variabilita v zastoupení bifidobakterií (někteří měli vysoké zastoupení a někteří extrémně nízké). Nicméně pacienti trpící CDAD měli nejnižší zastoupení bifidobakterií ze všech skupin. U této skupiny byl také prokázán nižší obsah bakteroidů a zvýšený obsah klostridií v porovnání s ostatními skupinami. V dodatečných studiích bylo prokázáno, že starší lidé a zdraví dospělí se liší v zastoupení fekálních 16S rRNA. Byl pozorován nižší rRNA index bakteroidů, bifidobakterií a Clostridium leptum, a zvýšený rRNA index laktobacilů. Tato studie tedy prokazuje, že se zvyšujícím se věkem se zároveň zvyšuje i diverzita bakterií ve střevě. Zatímco u dospělých sondy pokryjí 80% z celkové rRNA, u starších lidí už jen 50% (Gibson a Rastall, 2006). 6.1.2.

Fluorescenční hybridizace in situ (FISH)

Fluorescenční hybridizace in situ umožňuje přímou kvantifikaci bakteriálních buněk ve smíšené populaci (jako je mikroflóra lidského střeva). Pro detekci hybridizovaných buněk ve vzorku se využívá epifluorescenční mikroskop nebo flow cytometr. Výstupem je kvantitativní vyjádření cílové populace (počet buněk na vzorek nebo vzájemný poměr z celkové rRNA). FISH analýza se stala jednou z metod, která změnila studium dominantních bakteriálních skupin v lidském GIT. Tuto metodu využívá velké množství studií věnujících se výzkumu 26

mikroflóry ve vztahu ke zdraví a dietetickým zásahům (Franks a kol., 1998; Harmsen a kol., 2002; Zoetendal a kol., 2002b). Jedna průběžná studie využila metodu FISH ke sledování fekální mikroflóry u devíti dobrovolníků (Franks a kol., 1998). Více než 90% buněk obarvených DAPI bylo hybridizováno s univerzální bakteriální sondou (Bact 338). Stejně jako u dat z tečkové analýzy, je predominantní flóra podle této práce složena z rodů Bacteroides a Clostridium coccoides/Eubaterium rectale (tvoří téměř 50% z celkového obsahu bakterií). Další dominantní populace je skupina eubakterií s nízkým obsahem G+C a bifidobakterie (Franks a kol., 1998). Bylo pozorováno, že se fekální mikroflóra v průběhu času mění a že nejvíce kolísá obsah bifidobakterií. Současné studie s využitím širšího výběru sond potvrzují, že rod Bacteroides z celkového obsahu činí cca 28% a skupina Clostridium coccoides/Eubaterium rectale 23%. Pomocí dalších sond byly identifikovány následující dominantní rody: Atopobium (12%), Eubacterium s nízkým G+C poměrem/Fusobacterium prausnitzii (reklasifikováno jako Faecobacterium prausnitzii) (11%) a skupina Ruminococcus (10%). Bifidobakterie reprezentují přibližně 5% z celkového obsahu. Dalšími zástupci dominantní fekální mikroflóry zdravého jedince jsou Eubacterium hallii, Lachnospira a Eubacterium cylindroides. Byly identifikovány i subdominantní skupiny bakterií vyskytující se s četností nižší než 1% (Harmsen a kol., 2002). Znalosti získané pomocí dalších molekulárních strategií upozornily na významné bakteriální skupiny ve fekální mikroflóře. Například genová knihovna ribozomálních klonů ze vzorku lidské stolice často obsahuje sekvence podobné Ruminococcus obeum. Vyvstává tedy otázka, zda predominance tohoto druhu vyplývá z jeho skutečného zastoupení ve vzorku, nebo zda jde o chybu při analýze klonů. Problematikou se zabýval Zoetendal a kol. (2002b) a vyvinul sondu Urobe 63, která je specifická pro Ruminococcus obeum. Předběžně byly vyšetřovány vzorky devíti holandských dobrovolníků (pěti mužů a čtyř žen). Bylo demonstrováno, že rod Ruminococcus obeum je poměrně dominantní (zahrnuje ~2,5% z buněk hybridizovaných s univerzální sondou Bact 338 a ~16% v RNA ze skupiny Clostridium coccoides/Eubacterium reptale). Fylogenetický strom konstruovaný s využitím 16S rDNA bakterií GIT je uveden na obr. 4. Podobná práce byla vypracovaná pro skupinu Faecalibacterium prausnitzii.(Gibson a Rastall, 2006).

27

Obr. 4 Fylogenetický strom Na tomto fylogenetickém stromě lze pozorovat příbuznost mezi sekvencemi 16S rDNA nekultivovatelných bakterií jako je R. obeum (jsou vyznačené tučným písmem) a některých blízce i vzdáleně příbuzných bakterie (upraveno podle Zoetendal, 2002b) 6.1.3.

Další metody využívající sondy

Byla vytvořena knihovna oligonukleotidů a vypracována nová generace metod využívajících sondy, například metoda mikrouspořádání na čipu, která umožňuje vysoce výkonnou analýzu smíšených mikrobiálních společenství. Byly publikovány dvě studie stejné skupiny autorů, kteří využívají tuto metodu a zkoumají 60 oligonukleotidových sond pokrývajících 20 bakteriálních druhů (Wang a kol., 2002b). Výsledky získané ze zdravých jedinců odpovídají závěrům již výše zmíněných prací. Týká se to druhů Bacteroides sp., Clostridium clostridioforme, Clostridium leptum, Faecalibacterium prausnitzii, Ruminococcus sp. a Bifidobacterium, které tvoří predominantní mikroflóru. Opět je zde pozorována variabilita mezi zdravými jedinci. Mikroflóra jedince s dlouhodobým průjmem obsahovala méně běžných bakteriálních druhů, které jsou predominantní u zdravých jedinců (Wang a kol., 2002a)

28

Genetické metody využívající sondy umožňují studovat predominantní mikroflóru. Vývoj nových sond neustále pokračuje. Jsme ale omezeni prahem detekce, obzvlášť ve sledování méně dominantních druhů ve smíšené populaci (Franks a kol., 1998). Avšak metody se stále vylepšují, knihovna sond se neustále rozšiřuje a vědci se snaží vyvinout postupy s větší specifitou a senzitivitou a s celkovým jednodušším provedením.

6.2. Analýzy mikrobiálních společenstev založené na PCR 6.2.1.

DGGE

Hledat významné bakteriální skupiny (na úrovni rodu nebo druhu) můžeme i pomocí metody PCR. Je to rychle se vyvíjející technologie, která nám může pomoci zkoumat predominantní druhy u takových společenstev, jakým je například i lidská střevní mikroflóra. Metody analýzy DNA, jako je DGGE, mohou být využity ke zkoumání predominantních druhů ve vzorku pomocí programu snapshot. Výběr zaměření těchto snapshotů se může nastavovat i během selekce primerů. Například za použití univerzálních primerů můžeme získat celkový přehled, zatímco chceme-li detailnější informace, můžeme využít skupinově, rodově nebo druhově specifické primery při amplifikaci. Takto můžeme pomoci DGGE zmapovat (s různou úrovní detailů) mikrobiální diverzitu ve vzorcích z prostředí, jako jsou fekálie, biopsie a další klinický materiál (Gibson a Rastall, 2006). Amplikony jsou separovány podle chemické stability nebo podle teploty tání jednotlivých sekvencí genů. Omezující je fakt, že i fylogeneticky nepříbuzné sekvence se mohou chovat podobně. Ale to lze vyřešit nastavením gradientu. Dalším omezujícím faktorem je limit detekce, kdy se nemusí kvůli malé senzitivitě zachytit méně dominantní bakteriální druhy ve smíšené kultuře (Zoetendal a kol., 1998). Výhodou této metody je možnost rychle vyšetřit a srovnat bakteriální diverzitu v komplexních bakteriálních vzorcích. Skupiny bakterií, které jsou obzvlášť zajímavé, např. ty, co jsou v různých vzorcích zastoupeny různě, lze vyšetřovat s využitím dalších metod (například vyříznutím amplikonu, jeho klonováním a sekvencováním). 6.2.2.

Využití DGGE

Narůstá počet prací, které vyžívají metodu DGGE (popř. TGGE) ke sledování fekální mikroflóry (včetně experimentů se změnou stravy) (Zoetendal a kol., 1998; Satokari a kol., 2001; Walter a kol., 2001; Favier a kol., 2002; Zoetendal a kol., 2002a). Pomocí metody DGGE navíc sledujeme nejen individuální výkyvy, ale i individuální stabilitu (stanovení profilu pomocí DGGE v čase). Můžeme rovněž sledovat přítomnost běžných skupin bakterií u 29

různých subjektů. Byl prokázán lineární vztah mezi genetickou příbuzností hostitelů a podobností indexů DGGE profilů. Nicméně, už nebyla zaznamenána korelace mezi DGGE profily a pohlavím či stylem života u nepříbuzných subjektů. DGGE analýza tedy prokázala, že hostitelský genotyp koreluje s bakteriálním složením lidské střevní mikroflóry (Gibson a Rastall, 2006). Favier a kol. (2002) využili PCR DGGE k výzkumu bakteriální diverzity a dynamičnosti u dvou chlapců v prvních dvanácti měsících jejich života. Počáteční profily byly u obou chlapců podobné, ačkoliv byly zaznamenány i drobné individuální variace. Bylo pozorováno, že se zvyšující se diverzitou mikrobiálního osazení v GIT v čase měli oba kojenci relativně stabilní mikroflóru po dobu několika týdnů. Změna stravy (částečně mléčná, ale začátek přechodu na pevnou stravu – fáze odstavování dítěte) znamenala změnu ve složení střevní mikroflóry a DGGE profil byl složitější. Zajímavé bylo, že odstavení mělo výrazný vliv na diverzitu mikroflóry chlapce, který byl až do odstavení krmen pouze mateřským mlékem. U chlapce krmeného smíšenou stravou byla prokázána zvyšující se rozmanitost a relativní rovnováha dominantních amplikonů. U obou chlapců byly v prvních 6 měsících dominantní složkou mikroflóry bifidobakterie. Jedna ze studií se zabývala aplikací PCR-DGGE cílenou na gen kódující transaldolázu pro identifikaci a detekci fekálních bifidobakterií. Bylo vyšetřováno devět druhů a jenom druhy Bifidobacterium angulatum a Bifidobacterium catenulatum nebyly být při této analýze rozlišeny. Výzkum diverzity bifidobakteriální flóry u deseti zdravých dospělých jedinců odhalil, že 4 osoby byly osídleny Bifidobacterium adolescentis a Bifidobacterium longum, u jedné osoby byly detekovány dva odlišné amplikony Bifidobacterium adolescentis, u další osoby Bifidobacterium adolescentis a jeden nedefinovaný amplikon, u dvou osob se detekovaly amplikony Bifidobacterium longum a Bifidobacterium bifidum a u jedné osoby se netvořil žádný PCR-DGGE produkt (tab .10) (Requena a kol., 2002). Stejný výzkum bifidobakteriální flóry byl proveden ještě u deseti vzorků pocházejících ze dvou zdravých dětí. Ukázalo se, že osm z těchto vzorků obsahovalo Bifidobacterium bifidum (z nichž jeden ještě obsahoval druhý neidentifikovaný amplikon), jeden vzorek obsahoval Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum a neidentifikovaný amplikon, poslední vzorek nedal žádný PCR-DGGE produkt (tab. 10) (Requena a kol., 2002). K potvrzení bakteriální diverzity u všech dvaceti fekálních vzorků (deset z dospělých a deset z dětí) použil Matsuki a jeho kolegové cílené PCR primery odvozené z druhově specifické 16S rRNA a zjistil určitý nesoulad mezi oběma metodami. Obecně se dá říci, že větší diverzita byla zaznamenána za použití PCR metody cílené na 16S rRNA než pomocí DGGE. 30

Tab. 10 Detekce fekálních bifidobakterií u zdravých dospělých jedinců a u dětí (upraveno podle Requena a kol., 2002) Subjekt

Druhy byly identifikovány : Druhově specifickými primery

PCR-DGGE

F1

B. adolescentis, B. longum, B. catenulatum

B. adolescentis, B. adolescentis

F2

B. adolescentis, B. longum, B. catenulatum

B. longum

F3

B. bifidum

B. bifidum

F4

B. adolescentis, B. longum, B. bifidum

B. adolescentis, B. longum

F5

B. adolescentis, B. longum, B. bifidum, B. catenulatum

B. adolescentis, B. longum

F6

B. adolescentis, B. longum, B. catenulatum

B. adolescentis, B. longum

F7

B. adolescentis, B. longum, B. catenulatum

Nedefinovaný amplikon

F8

B. adolescentis, B. longum, B. bifidum, B. catenulatum

B. adolescentis, not identified

F9

B. adolescentis, B. longum, B. infantis, B. catenulatum

B. adolescentis, B. longum

F10

B. adolescentis, B. longum, B. infantis, B. catenulatum

B. longum

B1

Netvořil se produkt

Netvořil se produkt

B2

B. bifidum

B. bifidum, nedefinovaný amplikon

B3

B. bifidum

B. bifidum

B4

B. bifidum

B. bifidum

B5

B. bifidum

B. bifidum

B6

B. bifidum, B. longum

B. bifidum

B7

B. bifidum, B. longum

B. bifidum

B8

B. bifidum, B. longum, B. catenulatum

B. bifidum

B9

Netvořil se produkt

B. infantis, B. longum, nedefinovaný amplikon

B10

B. bifidum

B. bifidum

F - dospělí B – děti

Vyšetření na mukózu vázaných baterií a fekální mikroflóry u 10 subjektů (5 žen a 5 mužů) ukázalo velkou podobnost DGGE profilů z různých oblastí tlustého střeva ze stejného dárce. Na druhou stranu bylo ale pozorováno, že na mukózu vázaná mikroflóra je odlišná od vzorků stolice toho samého jedince. Lactobacillus-specifické DGGE profily byly u vzorků mukózy i stolice podobné u šesti z deseti dobrovolníků (s jedním významným amplikonem). Větší rozdíly mezi individui byly pozorovány v celém společenství DGGE jak u vzorků mukózy, tak i stolice (Zoetendal a kol., 2002a).

31

6.2.3.

DGGE a knihovna klonů Alternativní přístup k profilování pomocí DGGE je sekvenční zpracování knihoven

klonů bez oddělování amplikonů užitím denaturačního gradientu. DGGE umožňuje rychlé porovnávací analýzy různorodých vzorků. Vyžaduje ale další kroky k určení charakteristik amplikonů přítomných v každém profilu. Knihovna klonů umožňuje detailní analýzu predominantních druhů, založenou na sekvencích každého amplikonu. Obě metody trpí nedostatky stejně jako všechny metody založené na amplifikaci DNA. Je to zejména nedostatečná nebo předčasná lyze buněk, dále inhibice PCR a rozdíly v amplifikaci (ať v důsledku amplifikační účinnosti nebo různým počtem kopií rRNA genů) (Wintzingerode a kol., 1997). Celkově by se ale dalo říci, že metody využívající PCR mají velký význam pro výzkum mikrobiální ekologie a představují rychlý a efektní nástroj zkoumání diverzity uvnitř smíšených mikrobiálních populací (včetně komplexních systémů, jako je i mikroflóra lidského střeva). U analýz využívající knihovnu klonů, jako je DGGE, se nejprve extrahuje celková DNA ze vzorku a následně se amplifikují cílové geny. Jednotlivé amplikony jsou posléze klonovány a následně sekvencovány (Suau a kol., 1999). Podle klonů získaných z komplexních bakteriálních vzorků, jako je lidské střevo, se připravují knihovny klonů. Nástup automatického sekvencování a robotiky poněkud snížil náročnost některých analýz. Nicméně, některé výzkumy dokazují, že je ještě mnoho druhů, které nebyly objeveny. Jedná se hlavně o rozšíření znalostí nekultivovatelných bakterií. Tři zde uvedené práce se zabývaly problematikou, ve které by sekvence částečné knihovny klonů umožnily určit predominantní bakteriální mikroflóru lidského střeva (Wilson a Blitchongton, 1996; Suau a kol., 1999). První dvě studie analyzovaly sekvence klonů třech hlavních monofyletických skupin, jmenovitě skupinu Bacteroides, Clostridium coccoides a Clostridium leprum (Wilson a Blitchongton, 1996; Suau a kol., 1999). Sice byla u těchto prací zaznamenána jistá nesourodost, zejména co se týče relativního zastoupení jednotlivých skupin, ale ta se přičítá spíše individuální variabilitě. Významné je, že v obou knihovnách klonů chyběly sekvence bifidobakterií, přestože jejich přítomnost byla prokázána pomocí 16S rRNA tečkové hybridizace (Suau a kol., 1999). Výzkum prováděný jako součást projektu Evropské unie Lidská střevní mikroflóra ukázal velkou mikrobiální diverzitu v knihovnách klonů u starších subjektů. Navíc se ukázalo, že značná část taxonomických jednotek u starších jedinců není známá na rozdíl od knihovny klonů dětí a dospělých. Tento výzkum upozornil na významné součásti fekální lidské

32

mikroflóry a ukázal, kam se bude ubírat výzkum využívající nových sond a primerů s cílem objektivně objasnit složení predominantní mikroflóry v GIT člověka (Gibson a Rastall, 2006). 6.2.4.

Kvantitativní PCR (qPCR)

Kromě PCR a PCR-DGGE může být standardní PCR technologie využita ke zjištění, v jakém množství je ta která zajímavá skupina bakterií přítomna a případně jaká je její aktivita. Metoda qPCR byla původně vyvinuta a využívala se hlavně ke sledování kvalitativních změn mezi rozdílnými vzorky nebo populačními skupinami. Nynější PCR technologie s fluorescenční emisí nám navíc umožňují i kvantitativní analýzu, stanovení počátečního počtu kopií cílových sekvencí na DNA templátu (tj. PCR v reálném čase) (Sharkey a kol., 2004). Využívá se inkorporace nějaké chemické látky, jako jsou například fluorofory nespecificky se vážící na DNA (například SYBR Green) nebo fluorescenčně označené oligonukleotidové sondy. Měří se množství amplikonů po každém cyklu (Sharkey a kol., 2004). Další možností pro kvantitativní PCR (qPCR) je kompetitivní qPCR strategie (CqPCR), kdy se použije vnitřní standard (kompetitorová DNA o známé koncentraci). Po amplifikaci se vypočítá poměr cílových amplikonů a kompetitorových amplikonů, a následně se z kalibrační křivky odečte množství cílové DNA v templátu (Lim a kol., 2001). Obě qPCR metody mají své limity, které jsou společné všem PCR metodám. Tyto limity se týkají hlavně analýz mikrobiální diverzity ve smíšených kulturách (což je ale hlavní cíl ekologických studií). CqPCR má ale jednu výhodu oproti PCR v reálném čase, a to schopnost opravit odchylky mezi jednotlivými vzorky (způsobené PCR inhibitory a velkým množstvím necílové DNA) během společné amplifikace vnitřního standardu a cílové DNA (Lim a kol., 2001). Výběr kompetitorové DNA je klíčový (v praxi to znamená co nejshodnější amplifikační efektivitu jako má cílová DNA, která ale umožní odlišit amplikony). Lim a kol. (2001) demonstrovali, že kombinace CqPCR a konstantní denaturační kapilární elektroforézy (CDCE) odstraňuje tyto problémy. Pomocí této kombinace lze prakticky rozlišit i kompetitor stejný jako je cílová DNA. Na druhou stranu, PCR v reálném čase poskytuje větší množství produktu a nevyžaduje post – PCR úkony. Navíc jsou systémy PCR v reálném čase a potřebné chemikálie poměrně dostupné, včetně 5´ nukleázového testu (TaqMan), barviva vázajícího se na DNA (SYBR Green I), fluorogenních PCR primerů (škorpiónů), molekulárních majáčků, fluorescenčně značených oligonukleotidových sond a látek prodlužujících svítivost (LUX), fluorogenických primerů apod. (Sharkey a kol., 2004).

33

Výhody analýz založených na PCR jsou bezesporu jejich jednoduchost, rychlost, selektivita (která je ale závislá na tom, ve které taxonomické úrovni se pohybujeme) a sensitivita. Využití PCR se v minulosti zaměřovalo hlavně k diagnostické analýze DNA a k určení patogenů (Nogva a kol., 2000). qPCR metody byly využity i u mnoha environmentálních prací, včetně výzkumu mikrobiální ekologie půdy a vzorků z vodního prostředí (sladkovodního i mořského) (Johnses a kol., 1999). Potenciál této techniky je evidentní. Můžeme počítat s tím, že v budoucnu se tato technika ještě zdokonalí a umožní nám získat další informace a nové poznatky. Vzrůstající zájem o mikrobiální ekologii lidského střeva, společně se zvětšující se nabídkou PCR primerů a oligonukleotidových sond cílených na mikroorganismy (na všech fylogenetických úrovních) naznačuje, že optimalizace qPCR je jen otázkou času a metoda tak bude přístupná pro tyto výzkumy. Začínají vycházet první práce využívající těchto metod. Například Furret a kol. využili metodu qPCR k analýze bakterií mléčného kvašení ve fermentovaných mléčných výrobcích a Vitali a kol. kvantifikovali specifické kmeny Bifidobacterium ve smíšené probiotické kultuře (Furret a kol., 2004; Vitali a kol., 2003 v Gibson a Rastall, 2006). 6.2.5.

Využití qPCR

qPCR může být využita ke zkoumání mikrobiální ekologie lidského GIT. Situaci komplikují rozdíly v množství kopií genů pro rRNA různých bakteriálních druhů a rodů, stejně jako fakt, že se pracuje s DNA a tedy se neodlišuje, zda je buňka mrtvá nebo živá. Další přístup využívá reverzně transkripční PCR v reálném čase (real-time RT-PCR), která umožňuje qPCR analýzu genové exprese (oproti qPCR analýze s cílem zjistit množství kopií genů) (obr. 6). Další alternativou jsou DNA čipy využívající současné znalosti sekvencí velkého množství genů (Sharkey a kol., 2004). Složitost obou těchto metod (RT-PCR v reálném čase a čipy) spočívá v precizní izolaci celkové mRNA ze vzorků a odlišení, zda jde o rozdíly v genové expresi nebo zda se jedná o artefakty mRNA.

34

Obr. 6 Technika RT-PCR (upraveno podle Sharkey a kol., 2004) 6.3.

DNA čipy

Schopnost zkonstruovat DNA čipy, č které na jednom skleněném sklíčku ku mohou obsahovat až tisíce rozdílných oligonukleotidových sond, sond otevřela úžasné možnosti mikrobiální ekologii ve sledování mikroorganizmů z různých prostředí, včetně lidských vzorků stolice (Gibson a Rastall, 2006). Pomocí DNA čipů č se může zkoumat i komunikace nikace mezi hostitelem a mikroby mikrob (též nazývaná jako cross-talk) talk) v GIT, včetně sledování dování exprese genů v odpovědi na přítomnost ítomnost dalších bakterií (probiotika a patogeny), stejně jako exprese ve vztahu v ke komensálním organismům. Připravují se čipy ipy zacílené na geny kódující důležité d ležité vlastnosti bakterií, jako jsou například i probiotické vlastnosti stnosti, nebo na geny kódující virulenci a patogenitu (Gibson a Rastall, 2006). Čipy ipy vyvinuté s oligonukleotidovými sondami cílenými enými na 16S rRNA geny představují vysoce výkonný systém s rychlou taxonomickou charakterizací charakteri smíšené mikrobiální populace (Rudi a kol., 2002). Wang a kol.(2002a.b)) využili tento přístup p u dobrovolníků

ke

sledování

p ítomnosti přítomnosti

predominantních

bakterií

s

vyžitím

60

oligonukleotidových sond.

35

7.

Probiotika a prebiotika u chorob GIT

Probiotika a prebiotika se uplatňují při prevenci a léčbě mnoha chorob GIT. Tyto choroby lze rozdělit do dvou kategorií, na akutní a chronické gastroenteritidy. Projevem onemocnění může být průjem nebo zácpa, zvracení a bolesti v oblasti břicha Akutní gastroenteritidy jsou celosvětově rozšířené a jsou významným ekonomickým i lékařským problémem, především v rozvojových zemích, kde stojí i za vysokým procentem dětské úmrtnosti. Obvykle se člověk nakazí vodou či potravinami, které jsou kontaminované patogenními mikroorganizmy nebo jejich toxiny (Salmonella sp., rotavirus atp.). Neplatí však vždy, že známe jejich etiologické agens. Podstatné je, že onemocnění nemá dlouhé trvání a dochází u pacienta k vyléčení. Někdy se příznaky mohou opakovaně vracet. Potom se akutní onemocnění stává chronickým. U chronických onemocnění je situace složitější. Trvají celé roky, často do konce života. Nemoc nelze dostupnými prostředky zcela vyléčit, nebo se dá vyléčit, ale často nastává recidiva. Zatímco cílem léčby akutního onemocnění je návrat pacientova zdraví k normálu, při chronickém onemocnění je pacientův život nevratně změněn. Cílem léčby potom je umožnit pacientovi pokračovat v nezávislém životě a těšit se z něj. Mezi akutní gastroenteritidy, při jejichž léčbě by mohla být probiotika a prebiotika přínosem, patří například: •

enteropatogenní E. coli (EPEC) způsobující průjmy

•

gastroenteritidy způsobené Salmonelou

•

pseudomembranozní kolitida nebo postantibiotická kolitida způsobená C. difficile

•

gastroenteritidy vyvolané Helicobacter pylori

•

rotavirové infekce

•

průjem při onemocnění AIDS

•

syndrom vznětlivého střeva

•

atopický ekzém

Chronickými chorobami jsou: •

zánět žaludeční sliznice a peptické vředy

•

rakovina střeva

•

ulcerózní kolitida

•

Crohnova choroba 36

7.1. Akutní gastroenteritidy Mezi nejznámější akutní gastroenteritidy patří onemocnění vyvolané rotaviry, Clostridium difficile a Helicobacter pylori. 7.1.1.

Rotavirové infekce

Rotavirus patří mezi viry neobalené, s dvojitou kapsidou. Inkubační doba trvá přibližně dva dny. Nemoc se projevuje zvracením a vodnatým průjmem, který trvá 3-8 dní. Také je častá horečka a bolesti břicha. Léčba není specifikována a spočívá v rehydratační terapii jako prevenci dehydratace. Bylo zaznamenáno, že probiotika a prebiotika mohou významně snížit délku rotavirového onemocnění a mohou napomoci i v prevenci. Podle studie provedené Guandaliny a kol. se děti, které dostávaly Lactobacillus GG, zotavily rychleji než ty, které dostávaly placebo (Guandaliny a kol., 2000 v Gibson a Rastall, 2006). V jiné studii bylo uvedeno, že léčba Lactobacillus GG snižuje nebezpečí rozvoje průjmu (Szajewska a Mrukowicz, 2001). Další studie potvrdila, že u podvyživených dětí pomohl Lactobacillus GG předejít průjmu. Prebiotika s glykoproteinovým základem mohou být významná při prevenci rotavirových infekcí a mohou představovat alternativu k rehydratační terapii, hlavně u imunokomprimovaných a podvyživených pacientů. Glykoproteiny se váží přímo na rotaviry na přístupný oligosacharid, jež váže kyselinu sialovou, která je potřebná pro účinnou rotavirovou infekci tkáňové kultury buněk MA-104. Kyselina sialová hraje důležitou úlohu v interakci rotavirů s glykoproteiny a buňkami, v nichž dochází k replikaci rotaviru. Glykopeptid, glykomakropeptid a laktadherin znemožňují navázání rotaviru na epiteliální buňky. Při nízkém obsahu laktadherinu v mateřském mléce je u kojených dětí pravděpodobnější symptomatická infekce rotavirem (Gibson a Rastall, 2006). Efektivita tohoto procesu ochrany střevní sliznice je závislá na koncentraci probiotik a hustotě vazebných oligosacharidů na jejich povrchu (Colber-Garapin a kol., 2007). Ačkoliv ještě nebyla uskutečněna žádná studie vlivu glykomakropeptidů na rotavirové infekce na lidech, předběžné výsledky se zdají být slibné a Lactobacillus GG může představovat opravdovou alternativu k tradiční léčbě. 7.1.2.

Postantibiotická kolitida způsobená C. difficile

C. difficile je oportunní patogen, který za jistých okolností (nejčastěji po léčbě antibiotiky) proliferuje ve střevě a tak dochází k selhání kolonizační rezistence. Tato gram pozitivní sporulující tyčka může být přítomna v GIT i u zdravého jedince. U asymptomatických nosičů 37

probíhá onemocnění většinou mírněji (Shim a kol., 1998). Onemocnění se projevuje častější stolicí, bolestí břicha a zvýšenou teplotou. C. difficile produkuje dva proteinové enterotoxiny, toxin A a toxin B, které způsobují průjem a kolitidu. Kromě kolitidy jsou dalšími důsledky infekce například toxický megacolon, perforace střeva a smrt, zejména u starší a oslabené části populace (Rolfe, 2000). Standardní léčba C. difficile může být drahá a obtížná, obvykle se používá vankomycin a metronidazol. Jako alternativní léčba, vedoucí k navození homeostáze, mohou být užívána probiotika a prebiotika, která obnoví normální střevní mikroflóru, tedy efektivní kolonizační bariéru. Nejúspěšnější se podle studií ukázalo být podávání Lactobacillus GG v dávce 1x 1010 živých organizmů na den a Saccharomyces boulardii v dávce 1g na den. Jednoduchý mechanizmus jejich působení spočívá v masivním osídlení střevní sliznice těmito prospěšnými bakteriemi (Saavedra a kol., 1994). Z prebiotik se uplatňují různé inertní výživy (např. Synsorb), které obsahují rozmanité oligosacharidy. Ty efektivně neutralizují toxin A a umožňují tedy potenciální terapii průjmů způsobených C. difficile. Užívání nestravitelných oligosacharidů (NDO) může také představovat způsob, jak obnovit nebo vyrovnat kolonizační rezistenci. Všechny NDO stimulují růst bifidobakterií a redukují populaci C. difficile. GOS je preferovaným substrátem pro Bifidobacterium adolescentis, B. angulatum a B. bifidum, zatímco FOS stimuluje hlavně růst B. catenulatum (Gibson a Rastall, 2006). Efektivními na různorodých modelech se ukazují být i antiadhezivní oligosacharidy. Jejich účinek ale musí být ještě potvrzen experimenty na dobrovolnících. Mohou představovat mnohem levnější alternativu prevence návratu průjmu způsobeného C. difficile, společně s doplněním stravy o různé NDO s cílem zlepšit kolonizační rezistenci. 7.1.3.

Gastroenteritidy spojené s výskytem Helicobacter pylori

H. pylori je charakterizován jako G- zakřivená tyčka pohyblivá pomocí bičíků. Má ureázovou aktivitu. H. pylori je arteriální patogen obvykle zodpovědný za peptické vředy a chronické gastritidy B (infekčních je přibližně 90% všech případů) a zánětlivou odpověď sliznice, což nakonec může vést k buněčné hyperproliferaci a maligní transformaci. Bakterie je chráněna před kyselostí žaludečních šťáv hlenovou vrstvou a malá část buněk adheruje na žaludeční epitel. Problém běžných terapií nemocí způsobených H. pylori je zvyšující se rezistence proti antibiotikům. Proto se zdá být prevence formou výživy praktickou alternativní cestou (Gibson 38

a Rastall, 2006). Ukazuje se, že většina probiotik a prebiotik neeradikuje H. pylori, ale snižují počty bakterií u infikovaných pacientů (Felley a kol., 2001) Ve studii Felley a kol (2001), dobrovolníci s H. pylori dostávali Lactobacillus johnsonii. Redukoval se zánět i gastritida, a snížil se také počet H. pylori. Michetti a kol. publikovali, že kultura získaná ze supernatantu syrovátky Lactobacillus acidophilus má částečný, na kyselosti nezávislý, dlouhotrvající tlumivý efekt na H. pylori u člověka (Michetti a kol., 1999 v Gibson a Rastall, 2006). Během kojeneckého věku má ochrannou funkci proti infekci H. pylori kojení. V mateřském mléce je nositelem antimikrobiální aktivity kasein. Derivát K-kaseinu glykomakropeptid pravděpodobně inhibuje adhezi H. pylori na buněčnou membránu tím, že se naváže na receptorová místa patogenu. Zatím však nebyl efekt na žaludeční mikroflóru dostatečně prozkoumán, což znamená, že doposud není možné určit celkovou vhodnost tohoto prebiotika (Gibson a Rastall, 2006). Látky produkované L. johnsonii mohou pomáhat snižovat infekci H. pylori a zároveň potlačují zánět. Doplňky stravy obsahující glykomakropeptidy nebo jiné konjugáty, které se specificky váží na H. pylori, představují užitečnou alternativu k tradiční antibiotické léčbě nebo léčbě pomocí bismutu.

7.2. Chronické gastroenteritidy Mezi nejznámější chronické gastroenteritidy patří rakovina tlustého střeva a idiopatické střevní záněty, jako je ulcerózní kolitida a Crohnova choroba. 7.2.1.

Rakovina tlustého střeva

Rakovina tlustého střeva je definována jako rakovina ve kterékoliv části tlustého střeva nebo rekta. Symptomy spojené s rozvojem rakoviny jsou různé, zahrnují trvalou bolest břicha, zvyšuje se naléhavost vyměšování, krvácení z rekta a anémie. Způsob léčby je závislý na oblasti výskytu tumoru, jeho příčině a vývoji. Může být provedena resekce dané oblasti střeva, nebo je pacient léčen pomocí chemoterapie či radioterapie. V současné době se zájem obrací na prevenci rakoviny střeva užíváním probiotik a prebiotik, která mohou mít význam i při léčbě před plným rozvinutím rakoviny. Strava hraje klíčovou roli při rozvoji a léčbě rakoviny. Existuje spojení mezi mikroorganismy ve střevě a rozvojem nemoci. Některé bakterie chrání střevo před rozvinutím kolorektální rakoviny a některé naopak rozvoj tohoto onemocnění podporují. Ve střevech lidí přijímajících větší množství vlákniny, je více produkován butyrát a SCFA.

39

Butyrát ovlivňuje vznik rakoviny několika způsoby. Z toho vyplývá, že bakteriální kmeny, které metabolizují prebiotika za vzniku butyrátu by měly pomoci při léčbě kolorektální rakoviny. Van de Weile a kol. (2004) studovali prebiotikum inulin na in vitro modelu. Byl pozorován nárůst laktobacilů a bifidobakterií ve střevě, což bylo doprovázeno i zvýšenou produkcí butyrátu a kyseliny propionové. Potencionální protirakovinný efekt mají i pšeničné otruby. Při jejich studiu se uplatnila metoda měření fekálních mutagenů. Podle studie Reddy a kol., zvýšený příjem zkvasitelné vlákniny snížil obsah mutagenů ve stolici (Reddy a kol., 1989 v Gibson a Rastall, 2006). Studie účinků prebiotik během léčby kolorektální rakoviny je poměrně novou oblastí výzkumu. Zatím je nedostatek dat z klinických studií pacientů s rakovinou tlustého střeva. Je mnoho metodických přístupů, které se snaží objasnit iniciaci rakoviny, ale více úsilí se vynakládá na zhodnocení účinku různých prebiotik. 7.2.2.

Ulcerózní kolitida

Ulcerózní kolitida (UC) a Crohnova choroba (CD) patří do skupiny idiopatických střevních zánětů (IBD), u kterých není známé etiologické agens. UC je charakterizována jako akutní neinfekční zánět střevní sliznice, který se projevuje krvácením z rekta nebo krvavým průjmem, často doprovázeným abdominální bolestí (Ghosh a kol., 2000). Onemocnění se projevuje střídáním aktivní a zmírněné fáze, které mohou mít trvání jen několik dní, ale i měsíce. Cílem současné medicíny je zmenšit lokální zánět ve střevě. Jako první léky se podávají kortikosteroidy a kyselina 5-aminosalicylová (5-ASA). Tyto léky však mají často nepříznivé vedlejší účinky (gastrointestinální poruchy, bolesti hlavy a artralgie), které snižují jejich terapeutickou hodnotu. Dále se využívají imunosupresivní látky, jako je cyklosporin A, 6-merkaptopurin a azathiopurin, které jsou poměrně efektivní při léčbě UC. Jejich vedlejší účinky jsou nyní studovány. Zmírnění zánětu sliznice bylo pozorováno po podání L. salivarius subsp. salivarius (Gibson a Rastall, 2006). Bifidobakterie fermentující mléko se ukázaly být prospěšné v udržování remise (Ishikawa a kol., 2003). Pro udržení remise u pacientů,kteří nesnáší dobře konvenční léčbu 5-ASA, se uplatňují smíšené probiotické preparáty obsahující L. casei, L. plantarum, L. acidophilus, L. delbruekii subsp. bulgaricus, B. longum, B. breve, B. infantis a Streptococcus salivarius subsp. thermophilus (Venturi a kol., 1999). Zvýšená koncentrace laktobacilů a bifidobakterií ve střevě zároveň normalizuje fyziologické funkce střeva (Madsen a kol., 2001). Probiotické bakterie redukují záněty střevní sliznice tak, že stimulují přirozenou 40

a získanou imunitu. Nepatogenní kmen E. coli Nissle zabraňuje navázání patogenní E. coli na střevní epitel a její následné invazi, což vede k prodloužení remise (Boudeau a kol., 2003). Při udržení remise a snížení nebezpečí rozvoje zánětu u UC pacientů je účinná i celá řada prebiotik. Při jedné studii bylo zjištěno, že psyllium (Plantago ovatum, indický jitrocel) napomáhá redukovat symptomy u 69% pacientů v klidové fázi UC (Hallert a kol., 1991). Fernandez a kol. (1999) na konci experimentu učinili závěr, že prebiotika byla stejně účinná v udržování remise jako konvenční léčba. Během užívání psyllia u pacientů s UC vzrostl obsah butyrátu ve stolici, což s sebou neslo další prospěšné důsledky. Nedávno byla provedena studie účinků mladého ječmene (GBF), který obsahuje jako prebiotikum málo zdřevnatělou hemicelulózu (Kanauchi a kol., 1999a). GBF stimuluje růst Bifidobacterium a Eubacterium limosum u zdravých dobrovolníků, což má za následek zvýšení koncentrace butyrátu (Kanauchi a kol., 1999b). Prebiotika zlepšují stav pacientů s UC a to jak prodloužením remise, tak i zlepšením symptomů během akutní fáze (především krev ve stolici a průjem). Na rozdíl od konvenční terapie nemají vedlejší efekt. Prebiotika mohou zlepšit nejen kvalitu života, ale i jeho délku, protože nejenom zmenšují zánět, ale při dlouhodobém užívání i minimalizují risk vzniku rakoviny. 7.2.3.

Crohnova choroba

Crohnova choroba (CD) je subakutní nebo chronický relaxující zánětlivý stav GIT, který se může vyskytnout kdekoliv mezi ústy a konečníkem. Symptomy CD jsou podobné symptomům, které pozorujeme u pacientů s UC. Jsou charakterizovány podélným vředy a epiteliálními granulomy. Etiologie zůstává neznámá, ačkoliv poslední studie ukazují, že se na onemocnění podílí prostředí (například škodlivý efekt má kouření) a dědičnost. Zkoumá se i možnost, že původcem může být bakterie (Mycobacterium avium subsp paratuberculosis, H. pylori). Léčí se kortikosteroidy, antibiotiky, anti-TNF−α monoklonálními protilátkami, inhibitory adhezivních molekul a v pokročilém stádiu chirurgicky – resekcí postižené části GIT. Užívání probiotik je při zmírňování zánětu podobné jako u UC. Studie na zdravých dobrovolnících byly v nedávné době zaměřeny na výzkum využití synbiotik, kombinace B. bifidum a B. lactis s prebiotikem na inulinovém základu (Synergy 1) pro léčbu pacientů s CD (Bartosch a kol., 2005). Užívání prebiotik vede k růstu počtu bifidobakterií, které mohou zlepšit prognózu pro pacienty s CD. Růst bakterií mléčného kvašení redukuje počet kauzativních mikroorganismů lokální změnou luminálního pH (produkcí SCFA) a kolonizační 41

inhibicí. Při léčbě pacientů s IBD se ukazuje být účinný GBF (Kanauchi a kol., 2003) a další prebiotika, která tak zůstávají slibnou potenciální cestou léčby pro pacienty s CD.

42

8.

Diskuze

Molekulární mikrobiální technologie v posledních letech neuvěřitelně pokročily. Jsou dostupné, umožňují rychlou a spolehlivou analýzu mikrobiálního složení a aktivity komplexních ekosystémů, jako je i lidský GIT (Gibson a Rastall, 2006). K prohloubení znalostí se využívají i metody z oborů proteomiky a metabonomiky. Tyto komplexní analýzy umožňují detailní popis dopadu stravy na zdraví, včetně dopadu užívání probiotik a prebiotik na GI mikroflóru a jejich interakci s hostitelem. V této bakalářské práci je uvedeno mnoho aplikací probiotik a prebiotik, nicméně je jejich využívání stále na počátku. Zatím bylo provedeno jen málo studií, navíc někdy s rozdílnými výsledky. Byly pozorovány i negativní důsledky užívání probiotik a prebiotik, jako je například nadýmání apod. Při dlouhodobém užívání probiotik je třeba uvážit, zda není jejich aplikace spojena s nebezpečím translokace z trávicí trubice (např. při léčbě zářením, krvavých průjmech, imunosupresi, recentní chirurgii dutiny ústní a trávicí trubice) (Frič, 2005). Je třeba mít na vědomí i riziko sekundární infekce. Jako perspektivní cíle probiotik lze uvést postnatální kolonizaci trávicí trubice, využití probiotik jako nosiče vakcín a přípravu rekombinantních probiotik s in situ přípravou a cílenou aplikací terapeutických molekul (Frič, 2005; Frič, 2007). Lze počítat i s tím, že mnoho lidí bude užívat probiotika ve formě funkčních potravin, kde lze očekávat nebezpečí nedostatečné koncentrace a různorodé kvality probiotik. Pro správný účinek je potřeba určit pacientovi správný kmen (či směsici kmenů), dávku a dobu užívání. O velké budoucnosti lze mluvit i u prebiotik. Výzkumy se orientují na jejich antiadhezivní aktivitu. Navázání na receptory patogenů je první krok k procesu kolonizace, protože mnoho střevních patogenů utilizuje monosacharidové a krátké oligosacharidové sekvence jako receptory. Znalost těchto receptorových míst má význam pro rozšiřování použití prebiotik. Anti-adhezivní vlastnosti by mohly být další hlavní předností při léčbě a prevenci střevních nemocí. Inkorporace monosacharidových nebo oligosacharidových receptorových sekvencí a peptidů s navázanými sacharidovými skupinami, jako je glykomakropeptid, mohou být další alternativou k současným prebiotikům. Některé skupiny mikroorganismů jsou přítomny před infekcí a navazují se na receptová místa místo patogenů. Další variantou jsou tzv. „decoy“ prebiotika, která slouží jako návnada pro patogeny, které se naváží na ně místo na sliznici. Nebiotické proteiny představují další ještě ne zcela známé možnosti a např. α-laktalbumin může být prvním

43

novým „antimikrobiálním prebiotikem“. Zatím jsou tyto možnosti více využívané k prevenci než k terapii (Gibson a Rastall, 2006).

44

9.

Závěr

Dynamický

vývoj

molekulárních

technologií

nám

umožňuje

porozumět

složitým

ekologickým systémům, jako je i mikrobiální společenství GIT. Můžeme tedy lépe prostudovat jak patogenní bakterie, tak i probiotika a porozumět interakcím mezi nimi. Toho potom lze využít při prevenci a léčbě mnoha nemocí.

45

10. Seznam literatury Augenlicht L.H., Mariadason J.M., Wilson A., Arango D., Yang W., Heerdt B.G., Velcich A. (2002): Short chain fatty acids and colon cancer. American Society for Nutritional Sciences. 132: 3804-3808 Ballongue J., Schumann C., Quignon P. (1997): Effects of lactulose and lacticol on colonic microflora and enzymatic activity. Scand. J. Gastroenterol. 32: 41-44 Bartosch S., Woodmansey E.J., Paterson J.C.M., McMaurdo M.E.T., Macfarlane G.T. (2005): Microbiological effects of consuming a synbiotic containing Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium lactis, and oligofructose in elderly persons, determined by real-time polymerase chain reaction and counting of viable bacteria. Clinical Infectious Diseases. 40: 28-37 Boehm G., Lidestri M., Casetta P., Jelinek J., Negretti F., Stahl B., Marini A. (2002): Supplementation of a bovine milk formula with an oligosaccharide mixture increases counts of faecal bifidobacteria in preterm infants. Archives of Disease in Childhood. Fetal and Neonatal Edition, 86: 178-181 Boudeau J., Glasser A.L., Julien S., Colombel J.F., Darfeuille-Michaud A. (2003): Inhibitory effect of probiotic Escherichia coli strain Nissle 1917 on adhesion to and invasion of intestinal epithelial cells by adherent-invasive E-coli strains isolated from patients with Crohn's disease. Alimentary Pharmacology & Therapeutics. 18: 45-56 Bourlioux P., Koletzko B., Guarner F., Braesco V. (2003): The intestine and its microflora are partners for the protection of the host: report on the Danone Symphosium The Intelligent Intestine. American Journal of Clinical Nutrition. 78: 675-683 Charteris W.P., Kelly P.M., Morelli L., Collins J.K. (1997): Review article: selective detection, enumeration and identification of potential probiotik Lactobacillus and Bifidobacterium species in mixed culture populations. International Journal of Food Microbiology. 35: 1-27 Colbére-Garapin F., Martin-Latil S., Blondel B., Mousson L., Pelletier I., Autret A., Francois A., Niborski V., Grompone G., Catonnet G, van de Moer A. (2007): Prevention and treatment of enteric viral infection: possible benefits of probiotic bacteria. Microbes and Infection 20: 1-9 Collins M.D., Gibson G.R. (1999): Probiotics, prebotics and synbiotics: approaches for modulating the microbial ecology of the gut. M. J. Clin. Nutr. 69: 1052-1057 Dendukuri N., Costa V., McGregor M., Brophy J.M. (2005): Probiotic therapy for the prevention and treatment of Clostridium difficile-associated diarrhea: a systematic review. Canadian Medical Associaion Journal. 173: 167-170 Favier C.F., Vaughan E.E., de Vos W.M., Akkermans A.D.L. (2002): Molecular monitoring of succession of bacterial communities in human neonates. Applied and Environmental Microbiology. 68: 219-226

46

Felley C.P., Corthesy-Theulaz I., Rivero J.L., Sipponen P., Kaufmann M., Bauerfeind P.,Wiesel P.H., Brassart P., Pfeifer A., Blum A.L., Michetti P. (2001): Favourable effect of an acidified milk (LC-1) on Helicobacter pylori gastritis in man. Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. 13: 25-29 Fernandez-Banares F., Hinojosa J., Sanchez-Lombrana J.L., Navarro E., Martinez-Salmeron J.F., Garcia-Puges A., Gonzalez-Huix F., Riera J., Gonzalez-Lara V., Dominguez-Abascal F., Gine J.J., Moles J., Gomollon F., Gassull M.A. (1999): Randomized clinical trial of Plantago ovata seeds (dietary fiber) as compared with mesalamine in maintaining remission in ulcerative colitis. American Journal of Gastroenterology. 94: 427-433 Fooks L.J., Fuller R., Gibson G.R. (1999): Prebiotics and human gut microbiology. Internatinal Dairy Journal. 9: 53-61 Franks A.H., Harmsen H.J.M., Raangs G.C., Jansen G.J., Schut F., Weling G.W. (1998): Variations of bacterial populations in human feces measured by fluorescence in situ hybridization with group-specific 16S rRNAtargeted oligonucleotide probes. Applied and Environmental Microbiology 64: 3336-3345 Frič P. (2005): Probiotika v terapii chorob trávicího ústrojí. Interní medicína pro praxi. 10: 434-437 Frič P. (2007): Probiotics and prebiotics-renaissance of therapeutic principle. Cental European Journal of Medicine. 2: 237-270 Fuller R., Gibson G.R. (1997): Modification of the intestinal microflora using probiotics and prebiotics. Scand. J. Gastroenterol. 222: 28-31 Ghosh S., Shand A., Ferguson A. (2000): Regular review: Ulcerative colitis. British Medical Journal. 320: 11191123 Gibson G.R. (1999): Dietary modulation of the human gut microflora using the prebiotics oligofructose and inulin. Journal of Nutrition. 129: 1438-1441 Gibson G.R., Beatty E.R., Wang W., Cummings J.H. (1995): Selective stimulation of bifidobacteria in the human colon by oligofructose and inulin. Gastroeneterology. 108: 975-982 Gibson G.R., Rastall R. A. (2006): Prebiotics: Development and Application. John Wiley & Sons Ltd, West Sussex. 264 s. Gibson G.R., Robefroid M.B. (1995): Dietary modulation of the human colonic microbiota: introducing the concept of prebiotics. J. Nutr. 125: 1401-1412 Grönlund M.-M,. Lehtonen O.P., Eerola E., Kero P. (1999): Fecal microflora in healthy infats born by different methods of delivery: permanent changes in intestinal flora after Cesarean delivery. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 28: 19-25 Guarner F., Malagelada J.R. (2003): Gut flora in health and disease. Lancet. 361: 512-519

47

Hallert C., Kaldma M., Petersson B.G. (1991): Ispaghula husk may relieve gastrointestinal symptoms in ulcerative-colitis in remission. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 26: 747-750 Harmsen H.J.M., Raangs G.C., He T., Degener J.E., Welling G.W. (2002): Extensive set of 16S rRNA-based probes for detection of bacteria in human feces. Applied and Environmental Microbiology. 68: 2982-2990 Holzapfel W.H., Haberer P., Schillinger U., Huis in’t Veld J.H.J. (1998): Overwiev of gut flora and probiotics. Interantional Journal of Food Microbiology. 41: 85-101 Hopkins M.J., Sharp R., Macfarlane G.T. (2001) Age and disease related changes in intestinal bacterial populations assessed by cell culture, 16S rRNA abundance, and community cellular fatty acid profiles. Gut. 48: 198-205 Hughes R., Rowland I.R. (2001): Stimulation of apoptosis by two prebiotik chicory fructans in the rat colon. Carcinogenesis. 22: 43-47 Ishikawa H., Akedo I., Umesaki Y., Tanaka R., Imaoka A., Otani T. (2003) Randomized controlled trial of the effect of bifidobacteria-fermented milk on ulcerative colitis. Journal of the American College of Nutrition. 22: 56-63. Johnsen K., Enger O., Jacobsen C.S., Thirup L., Torsvik V. (1999): Quantitative selective PCR of 16S ribosomal DNA correlates well with selective agar plating in describing population dynamics of indigenous Pseudomonas spp. in soil hot spots. . Applied and Environmental Microbiology 65: 1786-1789 Kanauchi O., Andoh A., Iwanaga T., Fujiyama Y., Mitsuyama K., Toyonaga A., Bamba T. (1999a): Germinated barley foodstuffs attenuate colonic mucosal damage and mucosal nuclear factor kappa B activity in a spontaneous colitis model. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 14: 1173-1179 Kanauchi O., Fujiyama Y., Mitsuyama K., Araki Y., Ishii T., Nakamura T., Hitomi Y., Agata K., Saiki T., Andoh A., Toyonaga A. Bamba T. (1999b): Increased growth of Bifidobacterium and Eubacterium by germinated barley foodstuff, accompanied by enhanced butyrate production in healthy volunteers. International Journal of Molecular Medicine. 3: 175-179 Kanauchi O., Mitsuyama K., Homma T:, Takahama K., Fujiyama, Y., Andow A., Araki Y., Suga T., Hibi T, Naganuma M., Asakura H., Nakano H., Shimoyama T., Hida N., Haruma K., Koga H., Sata M., Tomiyasu N., Toyonaga A., Fukuda M., Kojima A., Bamba T. (2003): Treatment of ulcerative colitis patients by long-term administration of germinated barley foodstuff: Multi-center open trial. International Journal of Molecular Medicine. 12: 701-704. Krejsek J., Kudlová M., Koláčková M., Novosad J. (2007a): Nutrice, probiotika a imunitní systém I. část: imunitní system, principy fungování. Pediatr. pro Praxi. 2007: 80-87 Krejsek J., Kudlová M., Koláčková M., Novosad J. (2007b): Nutrice, probiotika a imunitní systém II. část: nutrice, přirozená slizniční mikroflóra a individuální imuntní reaktivita. Pediatr. pro Praxi. 2007: 156-162

48

Lim E.L. Tomita A.V., Thilly W.G., Polz M. (2001): Combination of competitive quantitative PCR and constant-denaturant capillary. Electrophoresis for high-resolution detection and enumeration of microbial cells. Applied and Environmental Microbiology. 67: 3897-3903 Macfarlane G.T., Macfarlane S., Gibson G.R (1998): Validation of a three-stage contiunous culture system for investigating the effect of retention time on the ecology and metabolism of bacteria in the human colon. Microbial Ecology. 35: 180-187 Mackie R.I., Sghir A., Gaskins H.R (1999): Developmental microbial ecology of the nenatla gastrointestinal tract. American Journal of Clinical Nutrition. 69: 1035-1045 Madsen, K., Cornish A.,. Soper P., McKaigney C., Jijon H., Yachimec C., Doyle J., Jewell L., De Simone C. (2001): Probiotic bacteria enhance murine and human intestinal epithelial barrier function. Gastroenterology. 121: 580-591 Marteau P., Pochart P., Doré J., Béra-Maillet C., Bernalier A., Corthier G. (2001): Comparative study of bacterial groups within the human cecal and fecal microbiota. Applied and Environmental Microbiology. 67: 4939-4942 McCartney A.L. (2002): Application of molecular biological methods for studying probiotics and the gut microflora. British Journal of Nutrition. 88: 29-37 Milner, J.A. (2002): Functional foods and health: a US perspective. British Journal of Nutrition. 88: 151-158 Mountzouris K.C., McCartney A.L., Gibson G.R. (2002): Intestinal microflora of human infants and current trends for its nutritional modulation. British Journal of Nutrition. 87: 405-420 Nevoral J., (2005): Prebiotika, probiotika a synbiotika. Pediatr. pro Praxi. 2005(2): 59-65 Nogva H.K., Rudi K., Naterstad K., Holck A., Lillehaug D. (2000): Application of 5 '-nuclease PCR for quantitative detection of Listeria monocytogenes in pure cultures, water, skim milk, and unpasteurized whole milk. Applied and Environmental Microbiology. 66: 4266-4271 Olive D.M., Bean P. (1999): Principles and applications of methods for DNA-beased typing of microbial organisms. Journal of Clinical Microbiology. 37: 1661-1669 Park S.F., Kroll R.G. (1993): Expression of listeriolysin and phosphatidylinositol-specific phospholipase-C is repressed by the plantderived molecule cellobiose in Listeria monocytogenes. Molecular microbiology. 8: 653661 Rabiu B.A., Gibson G.R. (2002): Carbohydrates: a limit on bacterial diversity within the colon. Biological Rewiews of the Cambridge Philosophical Society. 77: 443-453 Reid G., Jass J., Sebulsky T., McCormick J.K. (2003): Potential uses of probiotics in clinical practice. Clinical microbiology reviews. 16: 658-672

49

Requena T., Burton J., Matsuki T., Munro K., Simon M.A., Tanaka R., Watanabe K., Tannock G.W. (2002): Identification, detection, and enumeration of human Bifidobacterium species by PCR targeting the transaldolase gene. Applied and Environmental Microbiology. 68: 2420-2427 Robefroid M.B. (2001): Prebiotics preferential substrates for specific germs? Am. J. Clin. Nutr. 73: 406-409 Rolfe R.D. (2000): The role of probiotic cultures in control of gastrointestinal health. J. Nutr. 130: 396-402 Rousselon N., Delgenes J.P., Godon J.J. (2004): A new real time PCR (TaqMan (R) PCR) system for detection of the 16S rDNA gene associated with fecal bacteria. Journal of Microbiological Methods. 59: 15-22 Rudi K., Flateland S.L., Hanssen J.F., Bengtsson G., Nissen H. (2002): Development and evaluation of a 16S ribosomal DNA array-based approach for describing complex microbial communities in ready-to-eat vegetable salads packed in a modified atmosphere. Applied and Environmental Microbiology. 68: 1146-1156 Saavedra J.M., Bauman N.A., Oung I., Perman J.A., Yolken R.H. (1994): Feeding of Bifidobacterium bifidum an Streptococcus thermophilus to infants in hospital for prevention of diarrhea and shedding of rotavirus. Lancet. 344: 1046-1049 Salminen S., Gibson G.R., McCartney A.L., Isolauri E. (2004): Influence of mode of delivery on gut microbiota composition in seven year old children. Gut. 53: 1388-1389 Satokari, R.M., Vaughan E.E., Akkermans A.D.L., Saarela M., de Vos V.M. (2001): Bifidobacterial diversity in human feces detected by genus-specific PCR and denaturing gradient gel electrophoresis. Applied and Environmental Microbiology. 67: 504-513 Saunier K., DoreJ. (2002): Gastrointestinal tract and the elderly: functional foods, gut microflora and healthy ageing. Digestive and Liver Disease. 34: 19-24 Sghir A., Gramet G., Suau A., Rochet V., Pochart P., Dore J. (2000): Quantification of bacterial groups within human fecal flora by oligonucleotide probe hybridization. Applied and Environmental Microbiology. 66: 22632266 Sharkey F.H., Banat I.M., Marchant R. (2004). Detection and quantification of gene expression in environmental bacteriology. Applied and Environmental Microbiology. 70: 3795-3806 Shim J.K., Johnson S., Samore M.H., Bliss D.Z., Gerding D.N. (1998): Primary symptomless colonisation by Clostridium difficile and decreased risk of subsequent diarrhoea. Lancet. 351: 633–636 Suau A., Bonnet R., Sutren M., Godon J.J., Gibson G.R., Collins M.D., Dore J. (1999): Direct analysis of genes encoding 16S rRNA from complex communities reveals many novel molecular species within the human gut. Applied and Environmental Microbiology. 65: 4799-4807 Suvarna V.C., Boby V.U. (2005): Probiotics in human heatlh: a current assessment. Current Science. 88: 17441748

50

Szajewska H., Mrukowicz J.Z. (2001): Probiotics in the treatment and prevention of acute infections diarrhea in infants and children: a systematic review of published randomized, double blind, placebo-controlled trails. J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 33: 17-25 Tannock G.W. (1998): Studies of the intestinal microflora: a prerequisite for the development of probiotics. Int Dairy J. 8: 527-533 Tay S.T.L., Hemond F.H., Krumholz L.R., Cavanaugh C.M., Polz M.F. (2001): Population dynamics of two toluene degrading bacterial species in a contaminated stream. Microbial Ecology. 41: 124-131 Tuohy K.M., Kolida S., Lustenberger A.M, Gibson G.R. (2001): The prebiotic effects of biscuits containing partially hydrolysed guar gum and fructo-oligosaccharides-a human volunteer study. British Journal of Nutrition. 86: 341-348 Van de Wiele T., Boon N., Possemiers S., Jacobs H., Verstraete W. (2004): Prebiotic effects of chicory inulin in the simulator of the human intestinal microbial ecosystem. Fems Microbiology Ecology. 51: 143-153 Venturi, A., Gionchetti P, Rizzello F, Johansson R, Zucconi E, Brigidi P, Matteuzzi D., Campieri M. (1999): Impact on the composition of the faecal flora by a new probiotic preparation: preliminary data on maintenance treatment of patients with ulcerative colitis. Alimentary Pharmacology & Therapeutics. 13: 1103-1108 Walker W.A., Goulet O., Moreli L., Antoine J.-M. (2006): Progress in the science of probiotics: from cellular microbiology and applied immunology to clinical nutrition. European Journal of Nutrition. 45: 1-18 Walter J., Hertel C., Tannock G.W., Lis C.M., Munro K., Hammes W.P. (2001): Detection of Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc, and Weissella species in human feces by using group-specific PCR primers and denaturing gradient gel electrophoresis. Applied and Environmental Microbiology. 67: 2578-2585 Wang R.F., Beggs M.L., Robertson L.H., Cerniglia C.E. (2002a). Design and evaluation of oligonucleotidemicroarrays method for the detection of human intestinal bacteria in fecal samples. Fems Microbiology Letters. 213: 175-182 Wang R.F., Kim S.J., Robertson L.H., Cerniglia C.E. (2002b): Development of a membrane-array method for the detection of human intestinal bacteria in fecal samples. Molecular and Cellular Probes. 16: 341-350 Wilson K.H., Blitchington R.B. (1996). Human colonic biota studied by ribosomal DNA sequence analysis. Applied and Environmental Microbiology. 62: 2273-2278 Wintzingerode F.V.,Gobel U.B., Stackebrandt E. (1997): Determiation of microbial diversity in environmental samples: pitfalls of PCR-based rRNA analysis. FEMS Microbiology reviews. 21: 213-229 www.crohn.cz/IMAGES/zazivaci_trakt.jpg Yuan H., Liddle F.J., Mahajan S., Franj D.A. (2004): IL-6-induced survival of colorectal carcinoma cells is inhibited by butyrate through down-regulation of the IL-6 receptor. Carcinogenesis. 25: 2247-2255

51

Ziemer C.J., Gibson G.R. (1998): An overwiev of probiotis, prebiotics and synbiotics in the functional food koncept: perspectives and future strategies. Int. Dairy J. 8: 473-479 Zoetendal E. G., Akkermans A.D.L., de Vos V.M. (1998): Temperature gradient gel electrophoresis analysis of 16S rRNA from human fecal samples reveals stable and host-specific communities of active bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 64: 3854-3859 Zoetendal E.G., vin Wright A., Vilpponen-Salmela T., Ben-Amor K., Akkermans A.D.L., de Vos W.M (2002a): Mucosa-associated bacteria in the human gastrointestinal tract are uniformly distributed along the colon and differ from the community recovered from feces. Applied and Environmental Microbiology 68: 3401-3407 Zoetendal, E.G., K. Ben-Amor, H. J. M. Harmsen, F. Schut, A. D. L. Akkermans and W. M. de Vos. (2002b). "Quantification of uncultured Ruminococcus obeum-like bacteria in human fecal samples by fluorescent in situ hybridization and flow cytometry using 16S rRNA-targeted probes." Applied and Environmental Microbiology 68: 4225-4232

52