Metody práce s proteinovými komplexy
Zora Nováková, Zdeněk Hodný
Proteinové komplexy • tvořeny dvěma a více proteiny spojenými nekovalentními vazbami Van der Waalsovy síly vodíkové můstky hydrofobní interakce • nekovalentní asociace mohou být narušeny odchylkou od fyziologických podmínek
Možný vliv proteinových interakcí • změna kinetiky proteinů • konverze substrátu • vytvoření nového vazebného místa • inaktivace proteinu • změna substrátové specifity
Stabilita proteinových komplexů faktory ovlivňující stabilitu: • iontová síla • pH • teplota • použití detergentů proteiny jsou nejstabilnější ve vodném prostředí při neutrálním pH, při fyziologické iontové síle (330 miliosmolů) a v přítomnosti dalších proteinů
Význam studia proteinových interakcí identifikace partnera interagujícího se známým proteinem
Obecný postup studia 1.
určení všech případných vazebných partnerů i v případě nedodržení fyziologických podmínek
2.
ověření existence interakcí, nalezených v kroku 1, za fyziologických podmínek
3.
studium povahy nalezené interakce (např. její modulace v buňce nebo stabilita)
Metodické přístupy • nativní izolace a separace • hmotnostní spektrometrie • crosslinking • funkční testy – dvojhybridní systém • genetické metody – mutační analýza vzhledem v obtížnosti udržení fyziologických podmínek při studiu nekovalentních proteinových interakcí je nutné ověřit výsledky alespoň dvěma nezávislými metodami
Purifikace a separace komplexů • afinitní chromatografie – imunoprecipitace, značené fúzní proteiny • gelová filtrace – separace podle velikosti částic • centrifugace ‐ diferenční c. – oddělení kompartmentů • použití sacharosových nebo glycerolových gradientů: ‐ izokinetická c. – separace podle hmotnosti a tvaru částic v mírném gradientu ‐ izopyknická c. – separace podle hustoty částic ve strmém gradientu
Purifikace a separace komplexů (pokr.) • elektroforetická separace ‐ BN‐PAGE (Blue Native PAGE ‐ separace podle molekulové hmotnosti komplexu) ‐ CN‐PAGE (Colorless Native PAGE ‐ separace podle celkového náboje komplexu) ‐ nativní agarosová gelová elektroforesa (separace velkých částic – např. virové partikule)
Afinitní chromatografie • proteinový komplex izolován přes specifickou afinní vazbu protein‐ligand • ligand kovalentně navázán na nosič • ligand – protein, cukr, nukleová kyselina, protilátka, kofaktor, ATP, ... Molekula
Ligand
antigen
protilátka
enzym
substrát
receptor
ligand
protein važící nukleovou kyselinu
nukl. kyselina
polysacharid, glykoprotein
lektin
Afinitní chromatografie (pokr.) • eluce komplexu z kolony – změna pH, zvýšení koncetrace solí, přebytek volného ligandu, chaotropní činidla
• imunoprecipitace – ligandem je protilátka • koimunoprecipitace – izolace nekovalentně asociovaných proteinů, proteinových komplexů – detekce protein‐proteinových interakcí
Imunoprecipitace
Eluce proteinů z kolony za fyziologických podmínek • eluce volným ligandem
• eluce kompetujícím proteinem
Afinitní značky • peptidy (proteiny) kovalentně připojené na studovaný protein (takto značený protein vzniká expresí fúzního genu) • interagují s malou molekulou ligandu zakotveném na pevném povrchu NEBO vazebným partnerem zakotveném na chromatografické matrici NEBO protilátkou připojenou na matrici • nástroj pro purifikaci rekombinantních proteinů a nativních proteinových komplexů • umožňují izolaci z hrubých buněčných extraktů
Přehled používaných afinitních značek
J. J. Lichty et al., 2005 Comparison of affinity tags for protein purification. Protein Expression and Purification 41, 98‐105
Faktory ovlivňující úspěšnost afinitní purifikace • struktura proteinu (malý protein se lépe produkuje a imobilizuje, reaguje méně nespecificky) • výběr buněčného materiálu (purifikovaný protein/komplex musí být přítomen ve vzorku v dostatečném množství) • volba nosiče a protokolu (nespecifická vazba na nosič může být minimalizována volbou vhodného typu oplachů a blokací) • separace a detekce izolovaných proteinů/komplexů – na SDS‐PAGE, na 2D‐IEF/SDS‐PAGE nebo pomocí hmotnostní spektrometrie (rozhodujeme se podle síly nespecifického pozadí a podle složitosti izolovaného komplexu)
Tandemová afinitní purifikace • izolace proteinového komplexu za nativních podmínek pomocí dvou značek • kazeta obsahující sekvenci: ‐ nízkoafinní značka (calmodulin‐binding peptide) ‐ místo enzymatického štěpení ‐ vysokoafinní značka (protein A)
Afinitní purifikace/MS analýza • limitace – množství proteinu potřebné pro MS analýzu band detekovatelný CBB barvením ~ 50 ‐ 10 ng ~ 50 kDa protein obsažený v 1 buňce v 10 000 kopiích izolovaný z 6 x 107 buněk je výhodné obohatit výchozí frakci o izolovaný protein, tj. izolovat předem buněčný kompartment, v němž se protein vyskytuje
Gelová filtrace • separace podle velikosti částic • stacionární fáze tvořena kuličkami z porózního materiálu, póry mají různou velikost • náplně: dextran (Sephadex), agarosa (Sepharose, Bio‐Gel A), polyakrylamid (Bio‐Gel P) nejmenší molekuly putují nejpomaleji – jsou zdržovány průchodem všemi póry, střední molekuly prochází jen některými póry a putují tedy rychleji, velké molekuly obtékají kuličky a rychle vytékají z kolony ven
Gelová filtrace
BN‐PAGE (Blue Native PAGE) • separuje proteinové komplexy v nativním stavu při pH 7,5 • separace v gradientovém gelu probíhá v rozsahu 30 ‐ 1 500 kDa • CBB G udává proteinům záporný náboj • aminokapronová kyselina udržuje komplexy v solubilním stavu během separace, zabraňuje arteficiálním agregacím
RNA Pol I
membrány kvasinek
jádra HeLa buněk
BN‐PAGE gel
RNA Pol II nuclear DNA helicase II
• v kombinaci s SDS‐PAGE vznikají dvourozměrné mapy proteinů, z nichž je možné určit podjednotkové složení proteinových komplexů
blot MW [kDa]
MW [kDa]
669 440
669
232
140 67
440 232
2D – BN/SDS-PAGE 2. dimension – SDS-PAGE
proteiny cytoplasmatické membrány kDa 135
1. dimension – BN-PAGE
97 78 57,5
38,5 33,5
140
232
440
669
kDa
Hmotnostní spektrometrie • MALDI – analýza jednotlivých separovaných proteinů • iontová past – analýza proteinových komplexů, směsných vzorků
Proteins nad Proteomics, R. J. Simpson, CSHL Press, 2003
Crosslinking vznik nové kovalentní vazby mezi proteinovými řetězci
• chemický – crosslinkery o různé délce (řádově 1 nm), formaldehyd • indukovaný UV – arylazidy, benzafenony • indukovaný dlouhovlnným světlem – Ru(II)(bpy)32+
2. rozměr – SDS-PAGE redukující
1. rozměr – SDS-PAGE neredukující
Dvojhybridní systém • studium přímé interakce mezi dvěma proteiny • detekce neznámých asociačních partnerů • kvasinkový Gal4 protein ‐ tvorba fúzních proteinů • omezení pro: proteiny ovlivňující reporterový gen proteiny vyžadující posttranslační modifikaci nebo neproteinovou složku (např. DNA)
Princip metody nativní Gal4 transkripce UASG
hybridní Gal4 - X
GAL1-lacZ
X
DNA vazebná doména Gal4 GAL1-lacZ
UASG
hybridní Gal4 - Y
Y
X
UASG
aktivační doména Gal4
GAL1-lacZ
UASG
interakce mezi X a Y obnoví Gal4 aktivitu
aktivační doména nativního Gal4 proteinu
Y
transkripce GAL1-lacZ
vazebná doména nativního Gal4 proteinu
X
hybrid vazebné domény a proteinu X
Y
hybrid aktivační domény a proteinu Y
Literatura • Proteins nad Proteomics, R. J. Simpson, CSHL Press, 2003 • Protein‐Protein Interactions, E. Golemis, CSHL Press, 2002 • E. M. Phizicky and S. Fields, 1995, Microb Rev, Protein‐Protein Interactions: Methods for Detection and Analysis, 59, 1, 94‐123
