Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem Vegyészmérnöki és Biomérnöki Kar Szervetlen és Analitikai Kémia Tanszék
Mesterséges édesítőszerek meghatározása energiaitalokban folyadékkromatográfiás módszerrel TDK dolgozat
Készítette: Marsi Zsófia Környezetmérnöki szak IV. évfolyam, Bsc
Témavezető: Dr. Fekete Jenő, egyetemi tanár Konzulens: Bobály Balázs, doktorandusz
Budapest 2014
TARTALOMJEG YZÉK MESTERS ÉGES ÉDESÍTŐSZEREK MEGHATÁROZÁSA ENERGIAITALOKB AN FOLYADÉKKROMATOGRÁFIÁS MÓDS ZERREL ................................................................................................ 1 TARTALOMJ EGYZ ÉK ....................................................................................................................................................... 2 1.
B EVEZ ET ÉS .................................................................................................................................................................. 3 1.1. M ESTERSÉGES ÉDESÍTŐSZEREK............................................................................................................................ 4 1.1.1 Szacharin ............................................................................................................................................................ 4 1.1.2 Aszpartám ........................................................................................................................................................... 5 1.1.3 Aceszulfám-K ..................................................................................................................................................... 6 1.2. EGÉSZ SÉGÜGYI ÉS KÖRNYEZETI HATÁSOK ......................................................................................................... 7 1.2.1 Egészségügyi hatások ....................................................................................................................................... 7 1.2.2 Környezeti hatások............................................................................................................................................ 8 1.3. M ÉRÉSI MÓDSZEREK .............................................................................................................................................. 9
2.
KÍS ÉRLETI RÉS Z .....................................................................................................................................................15 2.1. 2.2. 2.3. 2.4. 2.5. 2.6. 2.7.
3.
FELHASZNÁLT MINTA, ANYAGOK ÉS VEGYSZEREK .........................................................................................15 ESZKÖZÖK ÉS MŰSZEREZETT SÉG .......................................................................................................................15 M OZGÓFÁZIS, TÖRZSOLDAT , MUNKAOLDATOK KÉSZÍTÉSE............................................................................16 M INTAOLDAT ELŐKÉSZÍTÉSE..............................................................................................................................16 ST ANDARD ADDÍCIÓS KALIBRÁLÓ OLDAT SOROZAT KÉSZÍTÉSE.....................................................................16 A MÉRÉSI PARAMÉTEREK MEGHATÁROZÁSA ...................................................................................................17 M ÉRÉSI MÓDSZER.................................................................................................................................................20
MÉR ÉS I ERED MÉNYEK ÉS KIÉRTÉKEL ÉS ................................................................................................22 3.1. 3.2. 3.3.
LINEARIT ÁS...........................................................................................................................................................22 SZÓRÁS ÉS VISSZANYERÉS ..................................................................................................................................23 LOD, LOQ MEGHAT ÁROZÁSA ...........................................................................................................................24
4.
ÖSSZEFOGLALÁS ....................................................................................................................................................26
5.
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS...................................................................................................................................26
7.
IRODALOMJ EGYZ ÉK ............................................................................................................................................29
2
1. Bevezetés A mesterséges édesítőszerek intenzív édes ízű, alacsony kalóriatartalmú, cukormentes élelmiszer
adalékanyagok,
melyeket
az élelmiszer-,
üdítőital-
és gyógyszeriparba n
széleskörűen alkalmaznak. A szacharózénál 30-3000-szer édesebb íz érzetét keltik anélkül, hogy hasznos energiát szolgáltatnának az emberi szervezet számára. Így, segítenek az egészséges testsúly fenntartásában, az elhízás
és a cukorbetegség kezelésében [1]. A
leggyakoribb szintetikus édesítőszerek az aszpartám, aceszulfám-K, szacharin, ciklamát, szukralóz,
alitám,
neotám,
és a neoheszperidin-dihidrokalkon
[2]. Napjainkban
az
élelmiszeripar erőteljes hangsúlyt fektet a mesterséges édesítőszerek előnyös tulajdonsága inak kiemelésére, és egyre nagyobb fogyasztói igény mutatkozik az alacsony kalóriatarta lmú („light”, „diet” felirattal ellátott) termékek iránt. Intenzív édes ízüknek köszönhetően a normális íz elérése érdekében elegendő kis mennyiségek élelmiszerekhez történő adalékolása. Egyes mesterséges édesítőszereket önmagukban használnak fel, míg mások keserű ízük miatt csak keverékként alkalmazhatók. Egy jellemző példa a szacharin és ciklamát 1:10 térfogatarányú keveréke. [3] Alkalmanként citromsav adalékolásával fedik el egyes édesítőszerek keserű mellékízét, vagy fokozzák azok édes ízét. [4]. Az édesítőszerek szinergiás hatása a gyakorlatban kedvező jelentőséggel bír mind az egyes adalékanyagokra való határértékeknek könnyebb megfelelés, a költséghatékony előállítás, mind az egészségügyi- és környezeti kockázat csökkentésének szempontjából. Használatukat Európai Uniós előírások és magyar rendeletek is szabályozzák. Az Európai Unió által kiadott 89/107/EEK direktíva kimondja, hogy csak engedélyezett adalékanyagok használhatók fel élelmiszer-előállítási eljárások során. Fő elve, hogy csak akkor lehet engedélyezett egy adalékanyag, ha annak használata elkerülhetetlen, nem vezeti félre, és nem jelent egészségügyi kockázatot a fogyasztó számára [5]. Az Európai Élelmiszer-biztonsági Hatóság (European Food Safety Authority, EFSA) vizsgálati eljárása után hozza nyilvánosságra mely mesterséges adalékanyagok
engedélyezhetők.
További
direktívák - 94/35/EK, 96/83/EK, 2003/115/EK és 2006/52/EK – egyértelműen meghatáro zzák mely édesítőszerek milyen maximális koncentráció szinten adalékolhatók élelmiszer- és üdítőipari termékekhez [5]. Az egészségügyi kockázatcsökkentés érdekében az Egészségügyi Világszervezet (World Health Organization) Élelmiszer-adalékanyag Szakértői Bizottsága (Joint Food and Agricultural Organization Expert Committee on Food Additives) (JECFA) megállapít megengedhető napi beviteli (Acceptable Daily Intake – ADI) értékeket hét (aszpartám, aceszulfám-K, szacharin, ciklamát és sói, neotám, neoheszperidin dihidrokalko n), az EU tagországaiban engedélyezett különböző édesítőszerek esetében. A világ országaiban 3
különböző mesterséges édesítőszerek engedélyezettek, és eltérő megengedhető maximá lis dózisokat írnak elő a határérték-rendeleteik. [1] tanulmányában részletezi e különbségeket. Magyarországon az EU irányelveit követő Magyar Élelmiszerkönyvben előírt jogszabályok nak - 152/2009. (XI. 12.) FVM rendelet – és a rendelethez tartozó 3. mellékletben található határértékeknek kell megfelelni. [6]. Jelen dolgozat célja, a munkám során, napjainkban Magyarországon forgalma zott energia- és izotóniásitalok
édesítését szolgáló
három intenzív
édesítőszer–
szacharin,
aszpartám, aceszulfám-K –mennyiségi meghatározására fejlesztett folyadékkromatográ fiás mérési módszer bemutatása.
A módszerrel
hidrofil
kölcsönhatáson
alapuló
(HILIC)
kromatográfiás elválasztást követően optikai (UV) detektálással egyszeri injektálás sa l, egyidejűleg határozhatók meg az édesítőszerek. A szakirodalomban főleg fordított fázisú eljáráson alapuló elválasztási módszerek találhatók. A magyar, szabványos (MSZ EN 12856) mérési eljárás is fordított fázisú elválasztási módszert ír elő [7]. Fordított fázisú elválasztás során az édesítőszerek polaritása (ld. 4. táblázat) miatt nem kapunk megfelelő visszatartást, ami az összetettebb mátrixok esetén a szelektivitás romlásához vezet. Az utóbbi években egyre elterjedtebb
a HILIC módszer,
melyet
előnyben
részesítenek
poláris
komponensek
folyadékkromatográfiás meghatározására. Munkám célja volt, hogy irodalmi ismeretek alapján HILIC elválasztást dolgozzak ki egy előre meghatározott kolonnán. Dolgozatomban áttekintem az irodalomban talált, édesítőszerek szimultán, kvantitatív elemzésére alkalmas módszereket, összehasonlítom a HILIC módszerrel, ismertetem a módszerfejlesztés egyes lépéseit, majd az általam kidolgozott módszer alkalmasságát a valós minta mérésével és a kapott adatok kvantitatív értékelésével bizonyítom. 1.1. Mesterséges édesítőszerek 1.1.1
Szacharin
A szacharin o-szulfobenzoesav, foszfor(V)-klorid és ammónia reakciójának eredménye. Kétszáz-háromszázszor édesebb a szacharóznál.
4
1. ábra A szacharin kémiai szerkezete [forrás: Chemspider adatbázis] A szacharin a legrégebben, 1879 óta használt édesítő. Hátránya, hogy néhányan érzik fémes, kesernyés mellékízét, mely erősebb hevítés, forralás hatására felerősödik. Másik édesítőszerrel kombinálva viszont az elnyomja ezt a kellemetlen utóízt. Vízben kismértékben, etanolban mérsékelten, lúgos oldatokban jól oldódik. Három formája kapható kereskedelmi forgalomban: a szacharin sav, a nátrium- és a kálcium-szacharinát, melyek élelmiszer- és üdítőital adalékanyagként körülbelül kilencven országban engedélyezettek. 25°C-on egy grammját 290ml víz oldja [8]. 1.1.2
Aszpartám
Az aszpartám két aminosavból álló dipeptid. Az L-aszparaginsav és a L-fenilala nin metil-észtere. Az 1970-es évek óta alkalmazzák az élelmiszeriparban NutraSweet, Canderel, Equal asztali édesítőszer formájában. Bomlásterméke az aszparagin és fenilalanin mellett a metanol. Vízben nem túl jól oldódik, vizes oldata enyhén savas kémhatású. Savas kémhatású vizes oldatokban oldhatósága jelentősen megnövekszik, ezért előszeretettel használják diétás üdítőitalok, szörpök készítésére. Az aszpartám édes íze sokkal jobban megközelíti a cukorét, mint a korábban kifejlesztett mesterséges édesítőszerek, ugyanakkor a répacukornál mintegy száznyolcvanszor édesebb ízű, ezért energiatartalma az ételekben– az alkalmazott tömeget is figyelembe véve – nagyságrendekkel kisebb (4 kcal/g), mint a cukoré. Az aszpartám hőstabilitása sokkal nagyobb, mint a szachariné, de savas és lúgos közegben és melegítés során is elhidrolizálhat.
5
2. ábra Az aszpartám kémiai szerkezete [forrás: Chemspider adatbázis] 1.1.3
Aceszulfám-K
Az aceszulfám-K-t az amidoszulfonsav származékaiból állítják elő szintézis útján. A keletkező fehér kristályos, szént, hidrogént, nitrogént, ként és káliumot tartalmazó anyag.
3. ábra Az aceszulfám-K kémiai szerkezete [forrás: Chemspider adatbázis] Az 1967-ben véletlenszerűen előállított vegyületet csökkentett cukortartalmú ételekben használják önállóan,
vagy szénsavas üdítőkben aszpartámmal és más édesítőszerekke l
kombinálva. Édesítő ereje a szacharóz kétszázszorosa. Hátránya a szacharinhoz hasonló enyhe keserű mellékíze,
amely főként magas koncentráció
értékeken érződik. Szemben az
aszpartámmal előnye, hogy édes ízét sütés és főzés során is megtartja. Asztali édesítőszernek, cukortartalmú rágógumik ízfokozására is alkalmas. Vízben való oldhatósága 20°C-on 290g/l [8].
6
Komponens
Eszám*
ADI* [mg/ttkg]
Olvadáspont [°C]
o-szulfobenzoesav, foszfor(V)-klorid, ammónia
5
229
E951
aszparaginsav, fenilalanin, metanol
40
246
E950
amidoszulfonsav
9
225
Kémiai név
Egyéb név
Szacharin
2H-1λ6,2-benzothiazol-1,1,3trion
Benzoszulfimid, o-szulfobenzamid
E954
Aszpartám
N-L-alfa-aszpartil-L-fenilalanin1-metilészter
NutraSweet, Canderel, Equal
Aceszulfám-K
Kálium 6-metil-2,2-dioxo-2H1,2λ6,3-oxathiazin-4-olát
Kálium aceszulfám
Bomlástermék
*E-szám=az Európai Unióban engedélyezett élelmiszer- adalékanyag kódja ADI= megengedhető napi beviteli érték (Acceptable Daily Intake – ADI)
1. táblázat A vizsgált édesítőszerek adatai 1.2. Egészségügyi és környezeti hatások 1.2.1
Egészségügyi hatások
Az 1970-es években merült fel a gyanú, hogy a szacharin növeli a rák kialakulásá nak kockázatát, mert egy kísérletben
a nagy dózisban,
Na-ciklamáttal kevert állatelede l
patkányokban hólyagrákot okozott. Ennek hatására használatát Kanadában ideiglenese n betiltották. Mivel az emberi szervezetre való karcinogén hatását vizsgálatok nem támasztják alá, végül az amerikai Élelmiszer- és Gyógyszerfelügyeleti Hatóság (FDA) 2001-ben biztonságosnak minősítette a szacharint emberi használatra. 2010-ben a környezetre is ártalmatlannak
minősítették.
A fenilketonuria
nevű anyagcsere-betegségben
szenvedők
számára a fenilalanin súlyos mérgezést idézhet elő, ezért kötelező feltüntetni az aszpartámma l édesített élelmiszereken, hogy fenil-alanin forrást tartalmaznak. Az aszpartámot is kapcsolatba hozták már egyéb betegségek kialakulásával.
Esetleges mutagén
és karcinogén,
agyi
alváltozásokat okozó hatása máig vitatott, ám az eddigi vizsgálatok nem mutattak ki egyértelmű egészségkárosító hatást az emberi szervezetre nézve [9]. Az aceszulfám-K esetleges karcinogén hatásának vizsgálatára rágcsálókísérleteket vittek véghez, melyek egyértelmű káros hatást nem bizonyítottak. 2008-ban DNS-károsító hatásáról jelent tanulmány. A vese mind a szacharint, mind a kálium-aceszulfámot változatlanul választja ki a szervezetből. Az eddigi toxikológiai és klinikai vizsgálatok alapján az ADI értkeknek megfelelő fogyasztásukat az FDA és az EU biztonságosnak ítéli meg az emberi szervezetre nézve.
7
1.2.2
Környezeti hatások
2009-ben publikáltak először a mesterséges édesítőszerek szennyvízben és felszíni vízben való megjelenéséről [10] és azóta egyre több tanulmány foglalkozik környezetben való kiterjedésük nagyságának feltérképezésével és ezek lehetséges ökotoxikológiai hatásával. A legtöbb vizsgálat
a ciklamát,
szacharin,
szukralóz,
aszpartám és kálium aceszulfá m
komponensekkel foglalkozik. Az aceszulfám-K és a szukralóz bizonyul a legellenállóbbnak a szennyvíztisztítási mechanizmusokkal szemben, mert széles hőmérsékleti és pH tartományba n megőrzik
stabilitásukat. Az első kutatás során vizsgált két német város (Eggenste in-
Leopoldshafen és Karlsruhe) 20000 és 875000 lakosegyenértékű (LE) szennyvíztisztító befolyó szennyvízének aceszulfám és szacharin koncentrációja 34 és 50µg/l volt. A mechanikai és biológiai tisztításnak köszönhetően az aceszulfám 41%-át, a szacharin több mint 90%-át távolították el. Így az elfolyó szennyvizek koncentrációja 20µg/l és 2,8 µg/l volt a két komponensre nézve. A vizsgált folyóminták aceszulfám esetén 2µg/l, míg szacharinra 50150ng/l koncentráció értékeket állapítottak meg. Az aszpartám nem volt kimutatható egyik vizsgált vízmintából sem. [10] Az ökoszisztémák e komponensek alacsony koncentrációba n való krónikus kitettségének hosszú távú hatása egyelőre ismeretlen. Ám további kutatások azt mutatják,
hogy perzisztens
jelenlétüknél
fogva megbízható
szennyezési markerekként
használhatók talajvízfigyelő kutak és nyomonkövetési vizsgálatokban. Kimutatható, hogy míg a szennyvízkezelő létesítmények befolyó szennyvízébe a háztartási és ipari szennyvizekke l kerülnek az édesítőszerek, addig a felszíni vizek fő szennyezője, közvetlen kibocsátás útján, a háztartások és ipari létesítmények mellett az állattartás és mezőgazdaság. Egy adott városi környezetben
a komplex szennyezőanyag
források megállapítása
bonyolult
feladat a
koncentráció értékek nagy térbeli változékonysága miatt. A különböző országok vízgyűjtő ib e n megjelenő édesítőszerek a népesség fogyasztási szokásainak függvénye. Például sűrűn lakott svájci tavak vízgyűjtő területén lineáris összefüggést mutatható ki (R2 ≥ 0,88) a szacharin, aceszulfám-K, ciklamát koncentráció és a népesség(Q)/elfolyó szennyvízáram(Q) arány között [11]. Az édesítőszer-koncentrációk pedig jól korrelálnak egyes szennyezőanyagokkal, így mennyiségi adatot nyerünk a felszíni vizek antropogén szennyvízterheléséről. Ezt támasztja alá egy svájci tanulmány,
melyben a perfluoroalkil savak-népességszám összefüggést
az
aceszulfám-koncentráció segítségével bizonyít. Továbbá egy német monitoring program eredményeként kimutatható a Rajna és más nagy folyók vízében található karbamazepin, 1Hbenzotriazol
és
4-metil-benzotriazol
szennyezők
lineáris
összefüggése
az
aceszulfámtartalommal [12]. Valamint egy kanadai vizsgálat során is megállapították, hogy az 8
aceszulfám kloriddal és egyéb szennyvízszennyező anyagokkal való jó korrelációja okán megfelelő indikátora lehet a lakossági eredetű szennyezésnek fiatal (20 évnél fiatalabb) szennyvizek esetén [13]. Idősebb szennyvízmintákban a szacharin magasabb koncentráció szinten volt jelen az aceszulfámnál. Bár vízminőség ellenőrzési célból az elfolyó szennyvizek állapotának meghatározásánál szükség van szennyezési indikátorokra, markerekre, melyek hozzájárulnak az ivóvízbázisok és a természetes víztestek minőségének értékeléséhez, az előállított ivóvíz édesítőszer-tartalmának csökkentésére vizsgálták a különböző oxidációs eljárások hatékonyságát. A kémiai oxidációs eljárások közül (UV-besugárzás, klórozás, ózonozás) az ózonnal való oxidáció mutatkozik a legígéretesebb megoldásnak [14]. 1.3. Mérési módszerek Az édesítőszerek szinergiás hatását kihasználva a boltok polcaira kerülő cukormentes, mesterségesen édesített élelmiszer- és üdítőital árucikkekben édesítőszer-keverékek vannak. Mind a termék gyártójának, mind az élelmiszerbiztonsági hatóságoknak szükségük van megbízható, gyors analitikai módszerekre, melyekkel mennyiségi információkat szerezhetnek a forgalomba
helyezett
termék
édesítőszer-koncentrációjáról.
Az irodalomban
leírt,
édesítőszerek vizsgálatára alkalmas analitikai módszerek a kapilláris elektroforézis (CE), a micelláris
elektrokinetikus kromatográfia (MEKC), a szublimáció,
az elektroanalitika i
módszerek (differenciál impulzus voltammetria, potenciometria), a Fourier-transzformác iós infravörös spektroszkópia (FTIR), az áramló oldatos injektálásos
analízis (FIA) és a
kromatográfiás módszerek (gáz- (GC), vékonyréteg- (VRK), és folyadékkromatográ f ia (HPLC)). Nagyfokú stabilitásának és robosztusságának köszönhetően az 1980-as, ’90-es évektől kezdve egyre több HPLC módszert fejlesztettek
ezen komponensek
egyedi
kimutatására. Majd az egyidejű, egyszeri injektálású meghatározási módszerek kifejlesztésébe kezdtek, melyek a különböző komponensek eltérő fizikai-kémiai tulajdonságai miatt jelentenek kihívást. A 2. táblázatban felsorolt irodalmi adatokból látható, hogy az édesítőszerek szimultá n, kvalitatív és kvantitatív meghatározását lehetővé tévő alkalmazott módszerek döntő többsége fordított fázisú elválasztáson alapul. Az alkalmazott állófázisok többsége C18 [7, 10, 11, 15-20], C8 [17], XDB-C8-[18], fenil-hexil [1] módosítású szilikagél. A mozgófázis általában vízszerves oldószer (metanol, acetonitril) elegye 1-20mM oldott puffer, ammónium-acetát [1, 10, 11, 18], trietanolamin-formiát [20], foszfát [7, 15, 19] tartalommal. Fordított fázisú elválasztás során az édesítőszerek polaritása (ld. 4. táblázat) miatt nem kapunk megfelelő visszatartást, ami az összetettebb mátrixok esetén a szelektivitás romlásához vezet. 9
Alternatív nagyhatékonyságú
eljárást
jelent
anion-cserés
a
folyadékromatográfiás
elválasztás
módszereken
(nagyteljesítményű
belül
ionkromatográfia
a
angol
rövidítéséből HPIC). Az édesítőszer komponensek elválasztására kivitelezett módszerekben anioncserélő Dionex IonPac (AS4A-SC 250*4mm, I.D.) oszlopot 1mM Na2 CO3 és 12,5 mM Na2 CO3 mozgófázissal [4], a Dionex Ionpac AS11 (250*2mm, I.D.) kolonnát KOH mozgófázissal [21] és a Shimazdu Shim-pack IC-A3 (150*4,6mm, 5µm) oszlopot 5 mM vizes NaH2 PO 4 és 4 v/v% acetonitril eluens mellet [22] alkalmaztak. Az ioncserés elválasztás ionizálható csoportot tartalmazó vegyületek elválasztásánál bevett eljárási módszer. Az alkalmazott oszlop töltetek hatékonysága azonban kisebb a modern RP- és HILIC-LC állófázisok hatékonyságánál. A nem porózus ioncserélő töltettel erős kölcsönhatást alakítanak ki az ionizált komponensformák, mely csökkenti a kinetikai hatékonyságot. A fordított fázisú és hidrofil kölcsönhatási kromatográfiában az ionos kölcsönhatásnál gyengébb másodrendű hidrogénhíd-kötés dominál a poláris komponensek és a módosított szilikagél töltet között, amely gyorsabb kinetikát eredményez. A kölcsönhatási energiaerősség különbség miatt HPICmódszer
kinetikai
hatékonyságát
a szemcseátmérő
(7,5,3µm)
és a kolonna
hossz
csökkentésével javítva sem lehet a RP és HILIC-módszer hatékonyságánál előnyösebb eljáráshoz jutni. Analát
Mátrix
Módszer
Analitikai jellemzők
Ref.
aceszulfám-K, aszpartám, ciklamát, dulcin, glicirrizinsav, neotám, neoheszperidin dihidrokalkon, szacharin, szukralóz, szteviozid
27 ital (16 alkoholos és 11 alkoholmentes) és 15 konzervezett étel (zöldségek és gyümölcsök)
HPLC–MS/MS
Visszanyerés 75-120% LOD n.a. LOQ 0,1-0,5ug/g RSD < 20%
[1]
aceszulfám-K, aszpartám, szacharin
25 üditőital (7 növényi kivonat, 2 gyümölcslé, 16 mesterségesen ízesített ital)
RP-HPLC-DAD
Visszanyerés 96,2-101% LOD n.a. LOQ 0,3-0,5mg/l RSD 0,15-0,9%
[15]
aceszulfám-K, aszpartám, ciklamát só, neotám, neoheszperidin dihidrokalkon, szacharin, szukralóz
ivó- felszíni és szennyvíz
RP-HPLC-MS/MS (HILIC-HPLC-MS/MS)
Visszanyerés 23-111% LOD n.a. LOQ 1-10ng/L RSD n.a.
[10]
aceszulfám-K, ciklamát, szacharin, szukralóz
talaj, trágya, szennyvíziszap
RP-HPLC-ESI-MS/MS
Visszanyerés 63-127% LOD 0,001-0,1ppm LOQ n.a. RSD n.a.
[11]
10
RP-HPLC-ESI-MS/MS Visszanyerés 73-112% (HILIC-HPLC-ESI-MS/MS) LOD 0,001-0,1ppm LOQ 0,01-0,5μg/l RSD <10%
[18]
aceszulfám-K, aszpartám, étrendkiegészítők, asztali szacharin, citromsav, benzoát édesítők, alkoholmantes só üdítő-, energia- és izotóniás italok
HPLC-CAD-UV/DAD
[16]
befolyó és elfolyó szennyvíz aceszulfám-K,aszpartám, alitám, neotám, szacharin, ciklamát, szukralóz, neoheszperidin dihidrokalkon
RP-HPLC-ESI-MS/MS Visszanyerés 39-97% (HILIC-HPLC-ESI-MS/MS) LOD 0,24-4,4μg/l LOQ 0,80-14,8μg/l RSD 4,2-20%
aceszulfám-K, aszpartám, ciklamát, neoheszperidin dihidrokalkon, szacharin, szukralóz
szennyvíz- és felszíni víz
Visszanyerés 98,1-101% LOD 0,06-2,70ppm LOQ 0,19-8,09μg/l RSD 0,11-1,73%
[2]
aceszulfám-K, aszpartám, ciklaminsav, dulcin, neotám, neoheszperidin dihidrokalkon, szacharin, szukralóz, alitám
szénsavas és szénsavmentes RP-HPLC-ELSD üdítőitalok, gyümölcskonzerv és –befőttek, joghurtok
Visszanyerés 93-109% LOD <15μg/g LOQ <50μg/g RSD 5-8%
[17]
szacharin só, aszpartám, aceszulfám-K és ciklamát só, citromsav
üdítőital és asztali édesítőszer HPIC-UV/CD
Visszanyerés 93-107% LOD 0,019-0,22μg/ml LOQ n.a. RSD 0,84-1,72%
[4]
aceszulfám-K, aszpartám, ciklamát, neotám, szacharin, szukralóz, szteviozid, alitám
üdítőitalok, konzervezett gyümölcsök, sütemények
Visszanyerés 95,4-104,3% LOD <10μg/ml LOQ n.a. RSD n.a.
[20]
aceszulfám-K, aszpartám, szacharin, benzoesav, szorbinsav, koffein, teobromin, teofillin
-HPLC-UV üdítőitalok, gyümölcslevek, erjesztett tejitalok, tartósított gyümölcsök, tabletták
Visszanyerés 85-104% LOD 4-30mg/l LOQ n.a. RSD 1-5%
[22]
aceszulfám-K, aszpartám, szacharin, benzoesav, szorbinsav, Ponceau 4R, Sunset Yellow, Tartrazin
üdítőitalok
HPIC-UV
Visszanyerés 98,1-102,3% LOD 0,1-3mg/l LOQ n.a. RSD n.a.
[19]
aceszulfám-K, aszpartám, szacharin, ciklamát
szénsavas kóla, gyümölcslevek, tartósított gyümölcsök
HPIC-CD
Visszanyerés 97,96-105,42% LOD <0,019-0,89mg/l LOQ n.a. RSD n.a.
[21]
RP-HPLC-ESI-MS/MS
2. táblázat Irodalmi adatok az édesítőszerek folyadékkromatográfiás meghatározási módszereiről A hidrofil
kölcsönhatási
folyadékkromatográfia
(hydrophilic
interaction
liquid
chromatography - HILIC) nagy polaritású és ionos vegyületek vizsgálatára jött létre, így cukrok elválasztására régóta alkalmazzák. A hagyományosnak tekinthető normál-, fordított fázisú, ioncserés, ionpár és kromatográfia mellet új módszernek számít a HILIC. Jellegzetessége, hogy a poláris állófázis mellett egy kevésbé poláris, nagy szervesanyag- és kis víztarta lmú oldószerelegy képezi a mozgófázist.
Nagy előnye, hogy használatakor nincs szükség a 11
normálfázisú folyadékkromatográfiában alkalmazott toxikus és drága apoláris oldószerekre. A számos hozzá kapcsolható detektálási lehetőséggel – tömegspektrométer (MS) és optikai detektorok, kiterjeszti az elemezhető vegyületek és mintamátrixok körét. Irodalmi adatokat összehasonlítva, az optikai detektorok UV-, ELSD és a vezetőképességi detektorok alsó kimutatási határértékeiből [3, 4], hogy az UV-detektálás érzékenyebb, így megfelelőbb az aceszulfám és szacharin sók mennyiségi meghatározására üdítőital és asztali édesítőszer mintákból. A három, UV-detektorral együtt mérhető komponens abszorciós maximuma i különböző hullámhosszon vannak (λ max, aszpartám=190nm, λmax, szacharin =202nm, λmax, aceszulfám-K =226nm). Számos
kolonna
alkalmas
HILIC
módban
való
alkalmazásra
peptidek,
oligoszacharidok, aminosavak, nukleotid bázisok, biogén aminok, gyógyszerhatóanya gok, metabolitok elválasztásakor. A legismertebb állófázisok: módosítatlan szilikagél, alumínium oxid, zirkónium-oxid, titán-dioxid, szilika alapú amino-, nitril-, amido-, ciano-, karbamát-, diol, poliol-, zwitter- ionos szulfobetain, vagy poli(2-szulfoetil-aszpartamid) és egyéb polárisan módosított szilikagél állófázisok [23]. A HILIC módszer sajátossága a HILIC hatás, mely a komponensek visszatartási folyamatában játszik jelentős szerepet [24]. Lényege, hogy az állófázisok poláris jellegéből adódóan felületi vízréteg alakul ki, melyekbe a molekulár is formában
lévő
komponensek
folyadékkromatográfiában
beoldódnak.
alkalmazott
Szemben
apoláris
a hagyományos
mozgófázisokkal,
normálfá zis ú
a HILIC
eljárások
mozgófázisai mindig tartalmaznak vizet (min. 2-3%), amely lehetővé teszi a szilanolcsopo rtok disszociációját.
A kis molekulatömegű szerves, nagy polaritású vegyületek elemzésére
alkalmas HILIC-nél fázisviszonyokat értelmezünk.
A meghatározandó komponenseknek
oldódniuk kell a mozgófázisban kémiai átalakulás nélkül. Az állófázissal való különböző mértékű kölcsönhatásuk pedig biztosítja a megfelelő elválasztást. Így, az oldódás feltétele a mozgófázis poláris jellege, míg az állófázissal való kölcsönhatás pedig úgy jöhet létre, ha az polárisabb a mozgófázisnál. Megállapíthatjuk, hogy az állófázis polárisabb a mozgófázis ho z képest. Az állófázis a folyadékkromatográfiában elsősorban a vegyületek visszatartá sát határozza meg. A mozgófázis növekvő polaritásával, nő a poláris, vagy ionos komponensek mozgófázisban való oldhatósága, így csökken a visszatartás az állófázison. A poláris csoportot tartalmazó szilánnal kémiailag módosított szilikagélek közül a szénhidrátok, cukrok analitika i vizsgálatánál kiemelt fontosságú az aminocsoportokkal való módosítás.
12
4. ábra Aminocsoportot tartalmazó polárisan módosított szilikagél és az aminocsoport ionvisszaszorított, ionizált formája Az amino-módosítású szilikagél felületén többféle kölcsönhatás kialakítására képes csoport található. Reagálatlan szilanolok, aminocsoport, valamint a propil- és metilcsoportok. Irodalmi adatok bizonyítják, hogy retenció csökkenést okozhatnak savas csoporttal rendelkező komponensek elválasztásánál az állófázis felületén visszamaradt, reagálatlan szilanol csoportok és az anionos kompenensek között fellépő elektrosztatikus taszítóerők. Ennek a problémának az elkerülése érdekében célszerű erősen savas (pH<2) körülmények között, és amino-, vagy zwitter-ion módosítású állófázison dolgoznunk [25]. A mozgófázis pH-jától függően a szila no l és aminocsoport
molekuláris
formája,
így
kölcsönható
képessége
is
változik.
A
szilanolcsoportok pKa értéke 2-6, ebből következően kis pH értéken többnyire (pH<3) protonált formában vannak. A szilikagél polisav, így az alacsony pH-jú közegben nem oldódik. A primer aminocsoport pKa értéke ~10,5, így savas pH-n protonálódik. A HILIC elválasztá sra ajánlott aminocsoporttal módosított szilikagél állófázisok általában a 1,5-7 pH tartományba n stabilak. A vizsgált komponensek állófázison való visszatartása több kölcsönhatás együttes eredménye. Az aktív hidrogén atomot tartalmazó vegyületekkel az aminocsoport hidrogénhídkötést alakít ki. A szilanolcsoport szintén hidrogén-kötés kialakítására képes. Az energetika ila g heterogén felület propil- és metilcsoportjai apoláris kölcsönhatás kialakítására képesek a vizsgált
komponensekkel.
Az állófázis
határfelületén
kialakult
vízréteget
a protonált
aminocsoportok hidratációja, az ionvisszaszorított szilanolcsoportokkal létrejövő hidrogénhíd hozza létre [24]. k = 𝑘𝑣 + k 𝑖𝑐 + k 𝐻 + k dk
13
Hangsúlyozandó tehát, hogy a vegyületek visszatartását (k) és szelektivitását az állófázison a vízrétegbeli megoszlás (kv ), az ioncsere (kic), a hidrogén-kötés (kH) és a diszperziós kölcsönhatás (kd) együttesen határozza meg. Az aminocsoporttal módosított szilikagél poláris, anionos és semleges vegyületek elválasztására is alkalmas. A szacharin, az aszpartám és az aceszulfám-K édesítőszerek savas és bázikus funkcióscsoportokat egyaránt tartalmaznak.
Az aceszulfám-K
szulfonsavanhidrid,
a szacharin
savamid
csoportjai
dominálnak, míg az aszpartám amino- és karboxil csoportjai miatt amfoter vegyület. A Pallas szakértő szoftver kinyert adatok alapján megállapíthatjuk, hogy a szacharin és az aceszulfá m logD-pH függvénye lefutó jellegű, ami savas karakterre utal. Az aszpartám savas pH-n gyenge bázis, bázisos pH-n gyenge sav jellegét mutatja.
5. ábra A vizsgált édesítőszerek lgD-pH függvénye a Pallas szakértői szoftver előrejelzéséből Ezért érdemes az amino-módosítású szilikagél választása (például diol-módosítás helyett), mert az aminocsoportok felületi töltése kompenzálja az esetleges savas szilano lok negatív felületi töltését.
14
Képlet
Molekulatömeg
pKa*
LogP*
CAS-szám
Szacharin
C7 H5 NO3 S
183,18
4,98
0,23
81-07-2
Aszpartám
C14 H18 N2 O5
294,31
8,12
-1,53
22839-47-0
C4 H5 NO4 S
163,15
5,12
-0,19
55589-62-3
Komponens
Aceszulfám-K
Szerkezet
3. táblázat Adatok a Pallas szakértői szofver előrejelzéséből
2. Kísérleti rész 2.1. Felhasznált minta, anyagok és vegyszerek A módszer fejlesztése során vizsgált valós minta WATT izotóniás ital volt. A vizsgálatok során analitikai tisztaságú aszpartám (Supelco,≥99,0%), aceszulfám (Supelco, ≥99,9%) és szacharin acetonitrilt
(Sigma,
≥99,9%) standardokat alkalmaztam.
(Merck, gradiens tisztaságú) és nagytisztaságú
A mozgófázis ho z
vizet (Millipore),
valamint
koncentrált foszforsavat (Merck, 85%) használtam. 2.2. Eszközök és műszerezettség A mintaelőkészítéshez 3db 10ml-es mérőlombikot, 3db főzőpoharat, 2db mérőhenger t, 100, 250, 1000, 5000 µl-es Hamilton fecskendőket, 0,2 µm-es Phenomenex regenerált celluló z szűrőt, illetve 2ml-es eldobható fecskendőket használtam. A mintát gázmentesítés céljából ultrahangoztam. A méréseket egy Waters Aquity UPLC rendszeren végeztem, mely ultra nagy nyomású
szivattyúból,
automata
mintaadagolóból,
5
µl-es
mintahurokbó l,
kolonnatermosztátból és fotodióda soros detektorból (PDA) állt. A kiértékelést az Empower 2 és Excel szoftverekkel végeztem. Az édesítőszerek elválasztása Phenomenex Luna NH2 (150*4,6mm, 3 µm) analitikai oszlopon történt. 15
2.3. Mozgófázis, törzsoldat, munkaoldatok készítése Az A mozgófázishoz kimértem 500 ml vizet mérőhengerrel, majd hozzáöntöttem 1 ml tömény foszforsavat. A B mozgófázishoz kimértem 950 ml acetonitrilt mérőhengerrel, majd hozzáöntöttem 50 ml vizet. Ehhez fecskendővel hozzámértem 2 ml tömény foszforsavat. 3000, 4010, 6010 ppm (µg/ml) koncentrációjú közös törzsoldatot (TO) készítettem a következő módon. 30,0 mg szacharint, 40,1 mg aszpartámot, 60,1 mg aceszulfám-K standardot mértem be analitikai mérlegen egy 10 ml-es mérőlombikba. A lombikot félig megtöltöttem vízze l, ultrahangoztam. Majd 300, 401, 601 ppm koncentrációjú közös munkaoldatot (MO 1 ) készítettem egy 10 ml-es mérőlombikba, oly módon, hogy 1 ml-et kivettem a 3000, 4010, 6010 ppm-s törzsoldatból, majd a mérőlombikot jelre állítottam mozgófázissal. Végül 1500, 2005, 3005 ppm koncentrációjú munkaoldatot (MO 2 ) készítettem egy 10 ml-es mérőlombikba, oly módon, hogy 5,00 ml-et kivettem a 3000, 4010, 6010 ppm-s törzsoldatból,
majd a
mérőlombikot jelre állítottam mozgófázissal. 2.4. Mintaoldat előkészítése Az izotóniás italt felbontás után főzőpohárban 10 percig ultrahangoztam, majd 0,2 µmes regenerált cellulóz szűrőn átszűrtem. 2.5. Standard addíciós kalibráló oldatsorozat készítése Azonos térfogatú mintaoldathoz a benne előzetesen nagyságrendileg megbecsült édesítőszer koncentráció értékek 30, 50, 75, 100 és 125%-át adtam hozzá az elkészített standard munkaoldatokból, majd mozgófázissal egészítettem ki a végső térfogatra.
A kalibráló
standardoldatokat 900 µl mintához adtam hozzá. Az első négy pontnál a MO 1 -ot, az ötödik pontnál a MO 2 -ot használtam fel, majd mozgófázissal hígítottam az 5. táblázatnak megfelelőe n.
16
Pontok (%)
Mintaoldat (µl)
A MO1 * (1-4.) és a MO2 * (5.) munkaoldatból bemért térfogat (µl)
A bemért B mozgófázis (µl)
30
900
30
70
50
900
50
50
75
900
75
25
100
900
100
0
125
900
25
75
* MO1 =munkaoldat1, MO2 =munkaoldat2
4. táblázat Standard addíciós kalibráló oldatsorhoz szükséges bemérendő térfogatok, végkoncentráció 2.6. A mérési paraméterek meghatározása A módszerfejlesztés során közös standard oldatok spektrumát DAD detektorral felvéve a 215nm állapítottam meg a mérés ideális hullámhosszának. Alacsonyabb hullámhosszon nő az oldószer fényelnyelése, ami zavarja a mérés érzékenységét. Magasabb hullámhosszon pedig a komponensek jelerőssége csökken. HILIC módszer esetén az erősebb eluens a víz. A mintao ldat nagy víztartalma miatt vizsgálni kellett az injektálási térfogat változtatásának hatását is, hogy a kolonnára juttatott növelt mozgófázis mennyiség milyen módon hat a csúcsminősé gre. Megállapítható, hogy a mért tartományban (2-5µl) nem tapasztalható csúcsminőség romlás (ld. 6. ábra).
6. ábra Az injektált térfogat változtatásának hatása a csúcsminőségre 17
Az édesítőszerek különböző hidrofobicitása miatt gradiens elúciót alkalmaztam. A gradiens elúció során nagytisztaságú mozgófázist alkalmazunk, mert a gyenge elúciós szakaszban a mozgófázis szennyezői dúsulnak a kolonna elején, majd az erős elúciós fázisban szellemcsúcsokként jelennek meg. A legnagyobb kihívást az aszpartám és aceszulfá m- K komponensek egymástól és a minta- mátrixtól való elválasztása jelentette. Ennek megoldására több gradiensprogramot írtam és futtattam le.
M5. Idő (min)
Áramlási sebesség (ml/perc)
Mozgófázis A (%)
B (%)
M8. Idő (min)
Áramlási sebesség (ml/perc)
Mozgófázis A (%)
B (%)
0
1
0
100
0
1
0
100
4,5
1
0
100
4
1
0
100
12
1
20
80
6
1
10
90
12,01
1
0
100
13
1
10
90
20
1
0
100
13,01
1
0
100
16
1
0
100
A: 100 v/v% víz, 0,2 v/v% cc. H 3PO4 B: 95 v/v% ACN, 5 v/v% víz, 0,2 v/v% cc. H3 PO4
5. táblázat Az M5 és M8 gradiensprogram kromatogramjainak összehasonlítása Az M5 gradiensprogramhoz tartozó kromatogramon látszik, hogy az első komponens (szacharin) sok időt tölt az állófázison, a nagy visszatartás csúcsszélesítő hatású volt. A 20 18
v/v%-os A mozgófázis erősnek bizonyult. A mátrix komponensek nem váltak el egymástól, a szelektivitás nem volt kielégítő. Az M8-as programban egy gyorsabb felfutású gradienst állítottam
be, majd
megtartottam
az M5 programhoz
képest gyengébb
(10v/v%)
eluenserősséget állítottam be, amelyet további hét percig lineárisan tartottam. Az aceszulfá mK továbbra is átlapolt a mátrixban található szennyező komponenssel.
M11. Idő (min)
Mozgófázis
Áramlási sebesség (ml/perc)
A (%)
M14. Idő (min)
Áramlási sebesség (ml/perc)
B (%)
Mozgófázis A (%)
B (%)
0
1
0
100
0
1
0
100
3
1
0
100
3
1
0
100
8
1
25
75
5
1
15
85
8,01
1
0
100
15
1
15
85
14
1
0
100
15,01
1
0
100
19
1
0
100
A: 100 v/v% víz, 0,2 v/v% cc. H 3PO4 B: 95 v/v% ACN, 5 v/v% víz, 0,2 v/v% cc. H3 PO4
6. táblázat Az M11 és M14 gradiensprogram kromatogramjainak összehasonlítása Az M11 programban a poláris mátrix-komponensek szétválasztásával kísérleteztem. A mozgófázis erősségének jelentős növelése nem segítette a szelektivitást. Az M14 program 19
mérési eredményéből megállapítottam, hogy az elválasztás érdekében a gyorsabb felfutás ú gradiens után szükség van egy hosszabb lineáris szakaszra. És a kapott eredmények után a gradienserősséget 15v/v%-nál határoztam meg. Az M14-es program kromatogramján látszik, hogy tizenkét perc után már nem eluálódik komponens a kolonnáról, így a végső módszer vizsgálati idejét lecsökkentettem. A kifejlesztett módszerben (7. táblázat) három percnél indítottam a gradienst, amely keskeny szacharin csúcsot eredményezett. eluenserősségű
hétperces izokratikus
szakasznak
köszönhetően
A megfe le lő
a módszer
megfe le lő
szelektivitást ért el a vizsgált szacharin, aszpartám és aceszulfám-K komponensek tekintetében. 2.7. Mérési módszer Az édesítőszerek elválasztása egy 150*4,6 mm-es, 3 µm szemcseátmérőjű Phenomene x Luna NH2 módosítású analitikai oszlopon történt. Az A mozgófázis 100 v/v% nagytisztasá gú víz és 0,2 v/v% tömény foszforsavat tartalmazott, míg a B mozgófázis 95 v/v% acetonitril és 5 v/v% víz elegye volt, 0,2% tömény foszforsavval, így a pH-érték 1,90 körüli volt. A kolonnatermosztátot egységesen 27,5°C-ra állítottam. A mozgófázis áramlási sebessége 1 ml/perc és az injektálási térfogat 5 µl volt. A gradiensprogramban beállított mozgófá zis arányokat a 6. táblázat mutatja. Az UV-detektálás 215 nm-en történt. A tűmosó folyadék acetonitril-víz (1:1), a mérési idő 12 perc volt. Idő (min)
Mozgófázis
Áramlási sebesség (ml/perc) A (%)
B (%)
0
1
0
100
2
1
0
100
3
1
5
95
5
1
15
85
12
1
15
85
12,01
1
0
100
16
1
0
100
A: 100 v/v% víz, 0,2 v/v% cc. H 3PO4 B: 95 v/v% ACN, 5 v/v% víz, 0,2 v/v% cc. H3 PO4
7. táblázat A kifejlesztett HILIC-HPLC elválasztási módszer végső gradiensprogramja
20
21
8. táblázat Az édesítőszer komponensek kromatogramjai a 100ppm-es standard oldatban (A), a WATT mintában (B) és a szpájkolt mintában (C) 3. Mérési eredmények és kiértékelés 3.1. Linearitás A standard addíciós kalibrációt a valós mintában lévő mátrix zavaró hatásának kiküszöbölése miatt alkalmaztam. Az előkészített (gáztalanított és szűrt) mintaoldatho z növekvő koncentrációban hozzáadott standard munkaoldatokat a végső mérési módszerrel lemértem, addíciós grafikont hoztam létre. A mérési pontokra a legkisebb négyzetek elvével illesztett
kalibráló
egyenesek lineárisak
az alkalmazott tartományban.
Az R2 értékek
megfelelőek (ld. 8. táblázat). A kalibráló egyenesek y-tengelyt metsző pontjai adják meg a mintaoldat
vizsgált
komponenseinek
elméleti
koncentrációértékeit.
A
számíto tt
koncentrációérték a szacharin esetében: 0=𝑦 0 = 29434𝑥 + 258000 |𝑥 | = 8,77𝑝𝑝𝑚 Az előkészített
kalibráló
oldatok
900µl-re
tartalmazta
a vizsgált
édesítőszer
komponensek anyagmennyiségét, az 1,1-szorzós hígítási faktorral számolt végső értékeket az 10. táblázat tartalmazza. Komponens
Adagolt mennyiség (ppm)
Csúcsterület (mAU*min)
Csúcsmagasság (mAU)
Szacharin
9
522839
115114
15
696253
163411
22,5
922568
218750
30
1146403
272473
37,5
1357387
316059
12,03
341039
60520
Aszpartám
Aceszulfám-K
20,05
460962
80206
30,075
606928
105051
40,1
748896
123979
50,125
883772
138291
18,03
229779
65641
30,05
291211
88720
45,075
397386
119828
60,1
487923
145600
75,125
587422
172678
Egyenes egyenlete
R2
y=29434x+258000
0,9999
y=14262x+173676
0,9996
y=6331,2x+109561
0,9985
9. táblázat Mennyiségi meghatározás adatai 22
1500000
1300000
y = 29434x + 258000 R² = 0,9999
Csúcsterület (mAU*min)
1100000
Szacharin Aszpartám Aceszulfám-K
y = 14262x + 173676 R² = 0,9996
900000 700000
y = 6331,2x + 109561 R² = 0,9985
500000 300000 100000
-40
-20 -100000 0
20 40 Hozzáadott koncentráció (ppm)
60
80
100
7. ábra Standard addíciós kalibráció 3.2. Szórás és visszanyerés A mérési módszer precizitását
az injektálás
ismételhetőségével jellemzem.
A
vizsgálatához a mintát előkészítettem és háromszor injektáltattam, majd megvizsgáltam a mérési eredmények szórását. A korrigált tapasztalati szórást (standard deviancia, SD) és a relatív tapasztalati szórást a képletek alapján számoltam. ∑(𝑥 𝑖 − 𝑥̅ )2 𝑆𝐷 = √ 𝑛−1 Ahol SD a szórás x a konkrét érték 𝑥̅ az átlag n-1 az átlagtól való eltérés szabadságfoka
𝑅𝑆𝐷 =
𝑆𝐷 ∙ 100% 𝑥̅
Ahol RSD a relatív standard deviáció SD a szórás 𝑥̅ a mérési eredmények átlaga
A mintaelőkészítés helyességét a visszanyeréssel jellemzem. A mintaelőkészítés során, szűrés előtt és szűrés után a mintaoldathoz azonos, ismert mennyiségben adagoltam a standard
23
munkaoldatból (MO 1 ), majd lemértem a mintákat. A két értéket egymással elosztva kaptam meg a visszanyerést százalékos formában (R). Az eredményeket (SD, RSD, R) a 10. táblázatban adtam meg.
Komponens
Szacharin
Aszpartám
Aceszulfám-K
Csúcsterület (mAU*min) 1
267693
182526
141596
2
250116
182419
135820
3
252514
179666
145785
Átlag
256774
181537
141067
SD
9532
1621
5004
RSD (%)
3,71
0,89
3,55
Mintainjektálás
Analátkoncentráció a mintában Mintainjektálás
9,65 ± 0.36 ppm
13,4 ± 0.12 ppm
19,0 ± 0.67 ppm
Szűrés előtt addícionált
1204914
840976
589461
Szűrés után addícionált
1183423
828745
552117
102
102
106
R (%)
10. táblázat Szórás, visszanyerés, édesítőszer-koncentráció eredmények 3.3. LOD, LOQ meghatározása Kimutatási határnak azt a koncentrációt fogadjuk el, ahol a jel nagysága háromszorosa az alapvonal zaj nagyságának. A mennyiségi meghatározás alsó határának pedig azt, ahol a jelnagyság az alapvonal zaj nagyságának tízszerese. A határokat a koncentráció – magasság diagramok egyenes egyenletei alapján számítottam. LoD = LoQ =
3∙alapvonalzaj érzékenység 10∙alapvonalzaj érzékenység
A meghatározás és a mennyiségi kimutatás alsó határának megállapításához a valós mintában lévő koncentrációértékeket vettük alapul, melyeket a standard addíciós kalibráló egyenesekből kapunk meg oly módon, ha a tengelymetszeteknek a minta átlagos csúcsterülete it feleltetjük meg. A szacharin esetében az alábbi számítás alapján: y = 29434x + 256774 |x| = 8,72ppm
24
Ehhez az értékhez hozzáadva az addícionált koncentrációértéket kapjuk meg a csúcsmagasságokhoz tartozó eredeti koncentrációértéket. x = 8,72 + 9 = 17,7ppm
Komponens
Szacharin
Aszpartám
Aceszulfám-K
Alapvonalzaj
Összkoncentráció (ppm)
Csúcsmagasság (mAU)
17,7
115114
23,7
163411
31,2
218750
38,7
272473
46,2
316059
24,1
60520
32,1
80206
42,1
105051
52,2
123979
62,2
138291
35,1
65641
47,2
88720
62,2
119828
77,2
145600
92,2
172678 500
Érzékenység
LOD
LOQ
6915,1
0,22ppm
0,70ppm
2358,6
0,60ppm
2,00ppm
1886,6
0,75ppm
2,00ppm
1500mAU
5000mAU
11. táblázat A fejlesztett módszer LOD, LOQ adatai
25
8. ábra Az LOD, LOQ meghatározása 4. Összefoglalás Munkám tervezése során feladatul tűztük ki három, napjainkban széleskörűe n alkalmazott mesterséges édesítőszer – szacharin, aszpartám, aceszulfám-K – izotóniás italokból való szimultán meghatározását. A szakirodalomban található legtöbb eljárás és a magyar szabvány is fordított fázisú elválasztási módszert ír elő, amely az édesítőszerek polaritása (logP értékek -1,53 (aszpartám), -0,19 (aceszulfám-K) és 0,23 (szacharin)) miatt nem kapunk megfelelő visszatartást, ami az összetettebb mátrixok esetén a szelektivitás romlásához vezet. A szakirodalom az utóbbi években egyre elterjedtebb HILIC módszert részesíti
előnyben
poláris
komponensek
folyadékkromatográfiás
meghatározására.
Dolgozatomban az irodalmi adatok alapján egy előre kiválasztott, 150*4,6 mm-es, 3 µm szemcseátmérőjű Phenomenex Luna NH2 módosítású analitikai oszlopon történő általam kifejlesztett hidrofil kölcsönhatáson alapuló (HILIC) folyadékkromatográfiás elválasztá s i módszert ismertetem. határozhatók
A HILIC elválasztást
meg az édesítőszerek
követően optikai (UV) detektálással
215 nm hullámhosszúságon.
Az édesítőszerek
különböző hidrofobicitása miatt gradiens elúciót alkalmazunk. A mozgófázis acetonitril- víz különböző koncentrációjú elegye. Az A mozgófázis 100 v/v% nagytisztaságú víz és 0,2 v/v% tömény foszforsavat tartalmazott, míg a B mozgófázis 95 v/v% acetonitril és 5 v/v% 26
víz elegye volt, 0,2% tömény foszforsavval. A teljes mérési idő 12perc, mely szelektív és hatékony elválasztást tesz lehetővé. A módszer alkalmasságának bizonyítására olyan a valós mintát, melyben mindhárom édesítőszer megtalálható. A WATT izotóniás ital megfelel ennek a kritériumnak, mert szacharint, aceszulfám-K-t, aszpartámot egyaránt tartalmaz.
A mátrix-hatást
kiküszöbölve
standard addíciós kalibrációt
alkalma zva
határoztuk meg a minta édesítőszer-koncentrációit, mely 9,65 ppm, 13,4ppm, 19,0ppm volt rendre a szacharin, aszpartám, aceszulfám-K komponensek esetén. A kapott értékek alul maradnak
a
megszabott
egészségügyi
határértékeknek.
A
módszer
analitika i
teljesítményjellemzőit (mintaelőkészítés visszanyerését, az injektálás ismételhetősé gét, linearitást, LOD és LOQ értékeket) vizsgáltam. A kapott kimutatási határértékek (LOD) 0,15ppm, 0,6ppm, 0,75ppm, a mennyiségi analízis alsó határa (LOQ) értékek 0,5ppm, 2ppm, 2,5ppm rendre a szacharin, aszpartám és aceszulfám-K komponensekre, melyek kielégítőnek bizonyultak. A kutatás folytatásaként a módszert szeretném átdolgozni, hogy alkalmas legyen tömegspektrometriás (MS) detektálásra, mely összetettebb mátrixok esetén is megfelelő szelektivitást nyújthat. A szakirodalomban egyre több publikáció születik a települési
szennyvizekben
Európa-szerte
µg/l
koncentráció
szinten
megjele nő
édesítőszerekről, melyek a szennyvíztisztítási eljárásoknak részlegesen ellenállnak. A µg/l és ng/L koncentrációjú vízminták vizsgálatához a DAD detektornál érzékenyebb és szelektívebb MS detektálásra van szükség. A kidolgozott HILIC-HPLC-MS módszer így a környezetvédelmi analitika területén is gyakorlati jelentőségre tehetne szert.
27
5. Köszönetnyilvánítás Köszönettel tartozom témavezetőimnek Dr. Fekete Jenő Tanár Úrnak és Bobály Balázsnak, hogy a Szervetlen és Analitikai Kémiai Tanszék HPLC laborjában végezhettem a munkámat.
Köszönöm nekik és Varga Bozsanának,
hogy szakmai hozzáértésükke l,
meglátásaikkal, türelmükkel odaadóan segítették a dolgozatom létrejöttét.
28
6. Irodalomjegyzék [1] Chui-Shiang Chang, Tai Sheng Yeh, Detection of 10 sweeteners in various foods by liquid chromatography/tandem mass spectrometry, Journal of Food and Drug Analysis, 2014, 22, 318328. [2] Maroula G. Kokotou, Nikolaos S. Thomaidis, Analyticak Methods, Determination of eight artificial sweeteners in wastewater by hydrophilic interaction liquid chromatography-ta nde m mass spectrometry, 2013, 5, 3825-3833. [3] Agata Zygler,
Andrzej
Wasik, Jacek Namiesnik,
Analytical
methodologies
for
determination of artificial sweeteners in foodstuffs, Trends in Analytical Chemistry, 2009, 28, 9, 1082-1101. [4] Qing-chuan Chen, Shi-fen Mou, Ke-na Liu, Zu-ying Yang, Zhe-ming Ni, Separation and determination of four sweeteners and citric acid by high-performance anion-excha nge chromatography, Journal of Chromatography A, 1997, 771, 135-143. [5] Európai Tanács 89/107/EGK irányelve (1988. december 21.) és az azt módosító Európai Parlament
és Tanács 94/35/EK, 96/83/EK, 2003/115/EK, 2006/52/EK irányelvei)
az
élelmiszerekben felhasználandó édesítőszerekről. [6] 152/2009. (XI. 12.) FVM rendelet a Magyar Élelmiszerkönyv kötelező előírásairól. [7] Magyar Szabvány MSZ EN 12856 Élelmiszerek. A K-aceszulfám, az aszpartám és a szacharin meghatározása. Nagy felbontású folyadékkromatográfiás módszer. 2000 decembere. [8] Leo M. L. Nollet, Fidel Oldra, Food Analysis by HPLC, Third Edition, CRC Press, 2012 [9] Serkan Yılmaz, Aslı Ucar, Cytotechnology, A review of the genotoxic and carcinoge nic effects of aspartame: does it safe or not?, Cytotechnology, 2013, DOI 10.1007/s10616-0139681-0 [10] Marco Scheurer, Heinz-J, Brauch, Frank T. Lange, Analysis and occurance of seven artificial sweeteners in German waste water and surface water and in soil aquifer treatment (SAT), Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2009, 394,1585-1594.
29
[11] J. Buerge, M. Keller, H.-R. Buser, M. Kahle, M. D. Muller, T. Poiger, Saccharin and Other Artificial
Sweeteners in Soils: Estimated
Inputs from Agriculture
and Households,
Degradation, and Leaching to Groundwater, Environmental Science and Technology, 2011, 45, 615-621. [12] M. Scheurer, F. R. Storck, C. Graf, H.-J. Brauch, W. Ruck, O. Lev, F. T. Lange, Correlation of six anthropogenic markers in wastewater, surface water, bank filtrate, and soil aquifer treatment, Journal of Environmental Monitoring, 2011, 13, 966-973. [13] D. R. Van Stempvoort, J. W. Roy, S. J. Brown, G. Bickerton, Artificial sweeteners as potential tracers in groundwater in urban environments, Journal of Hydrology, 2011, 401, 126133. [14] Maroula G. Kokotou, Alexandros G. Asimakopoulos, Nikolaos S. Thomaidis, Artific ia l sweeteners as emerging
pollutants in the environment: analytical methodologies and
environmental impact, Analytical Methods, 2012, 4, 3057-3070. [15] Maja Serdar, Zorka Knezevic, Determination of artificial sweeteners in beverages and special nutritional products using high performance liquid chromatography, Archives of Industrial Hygiene and Toxicology 2011, 62, 169-173. [16] Malgorzata
Grembecka, Piotr Baran, Agata Blazewicz,
Zbigniew
Fijalek, Piotr
Szefer,Simultaneous determination of aspartame, acesulfame-K, saccharin, citric acid and sodium benzoate in various food products using HPLC-CAD-UV/DAD, European Food Research and Technology, 2014, 238, 357-365. [17] Andrzej Wasik, Josephine McCourt, Manuela Buchgraber, Simultaneous determination of nine intense sweeteners in foodstuffs by high performance liquid chromatography and evaporative light scattering detection – Development and single- laboratory validation, Journal of Chromatography A, 2007, 1157, 187-196. [18] Edgar Y. Ordonez, José Benito Quintana, Rosario Rodil, Rafael Cela, Determination of artificial sweeteners in water samples by solid-phase extraction and liquid chromatograp hytandem mass spectrometry, Journal of Chromatography A, 2012, 1256, 197-205.
30
[19] N. Dossi, R. Toniolo, S. Susmel, A. Pizzarello, G. Bontempelli, Simultaneous RP-LC Determination of Additives in Soft Drinks Chromatographia 2006, 63, 557. [20] D. Yang, B. Chen, Simultaneous Determination of Nonnutritive Sweeteners in Foods by HPLC/ESI-MS, Journal of Agricultural and Food Chemistry 2009, 57, 3022. [21] Y. Zhu, Y. Guo, M. Ye, F. S. James, Separation and simultaneous determination of four artificial sweeteners in food and beverages by ion chromatography Journal of Chromatography A, 2005, 1085, 143. [22] Q. Chen, J. Wang, Simultaneous determination of artificial sweeteners, preservatives, caffeine, theobromine and theophylline in food and pharmaceutical preparations by ion chromatography, Journal of Chromatography A, 2001, 937, 57. [23] Pavel Jandera, Stationary and mobile phases in hidrophilic interaction chromatography: a review, Analytica Chimica Acta, 2011, 692, 1. [24] Dr. Fekete Jenő, A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai, HILIC, 2008. [25] Aurélie Periat, Benjamin Debrus, Serge Ruday, Davy Gillarme, Screening of the most relevant parameters for method developement in ultra-high performance hydrophilic interactio n chromatography, Journal of Chromatography A, 2013, 1282, 72. Dr. Fekete Jenő, Folyadékkromatográfia elmélete és gyakorlata, Edison House Kft., Dabas, 2007. Dr. Fekete Jenő, Kormány Róbert, Fekete Szabolcs, A folyadékkromatográfia fejleszté s i irányai, Gyors folyadékkromatográfia, 2014.
31
