FRVŠ 916/2012/G4 Materiály vznikly díky finanční podpoře FRVŠ
Tvůrčí práce studentů směřující k inovaci vzdělávací činnosti
Zavedení techniky skenovacího elektrochemického mikroskopu do výuky oboru analytické biochemie Mgr. David Kovář Doc. RNDr. Petr Skládal, CSc. Mgr. Jana Mrázková
Skenovací elektrochemická mikroskopie teoretický úvod
Na počátku ... • • • •
1922 – objev polarografie 1924 – sestrojen polarograf Prof. Jaroslav Heyrovský (*1890-†1967) 1959 – Nobelova cena za chemii za objev a rozpracování analytické metody
4
Na počátku ... • Richard Phillips Feynman (*1918-†1988) • 1959 – There's Plenty of Room at the Bottom • Považován za zakladatele nanotechnologie (mikrotechnologie) • 1974 – Norio Taniguchi • 1986 – Kim Eric Drexler - Engines of Creation: The Coming Era of Nanotechnology „if you want to make atomic-level manipulations, first you must be able to see what’s going on“
Mikroskopie skenující próbou Senzor
Zpětná vazba
Próba Interakce próby se vzorkem Vzorek 6
Mikroskopie skenující próbou • • • • •
(1972 – Topografiner) 1981 – STM 1985 – AFM 1989 – SECM 1992 – SNOM
7
Princip STM
STM hrot 100 mV V
Tunelovací proud ~100 pA
} 5 – 10 Å
Vodivý vzorek
Druhy mikroskopií
9
Na počátku ... • 1981 – Skenovací tunelová mikroskopie (Scanning tunneling microscopy) • Gerd Binnig a Heinrich Rohrer • 1986 – Nobelova cena za fyziku
Mikroskopie skenující próbou Řada technik využívající skenující sondu/próbu Rastrovací pohyb - po řádcích („line by line“) Obraz je zprostředkován digitálně Pohyb sondy ve výšce desítek – stovek nanometrů nad zkoumaným povrchem • Fyzikálně-chemická interakce mezi hrotem a povrchem → topografie, specifická vlastnost povrchu (elektrická, magnetická, optická, atomární, …)
• • • •
Mikroskopie skenující próbou • • • • • • • • • •
Skenovací tunelová mikroskopie (STM) Mikroskopie atomárních sil (AFM) Mikroskopie laterálních sil (LFM) Mikroskopie modulovaných sil (FMM) Mikroskopie magnetických sil (MFM) Mikroskopie elektrostatických sil (EFM) Skenovací tunelová spektroskopie (STS) Skenovací tunelovací potenciometrie (STP) Mikroskopie blízkého optického pole (NFSOM) Skenovací elektrochemická mikroskopie (SECM)
Úvod do elektrochemie – základní jednotky • Elektrický proud „I“ - základní jednotka SI. Elektrický proud je roven celkovému množství elektrického náboje, které projde průřezem vodiče za jednotku času. • Jednotkou je ampér (A): 1 A je takový proud, který při průchodu dvěma rovnoběžnými přímkovými vodiči, nekonečně dlouhými, zanedbatelného kruhového průřezu, umístěnými ve vakuu ve vzájemné vzdálenosti 1 m, vyvolá mezi těmito vodiči sílu rovnou 2∙10-7 N (newton) na 1 m délky. • Proud v běžných elektrických rozvodech může být stejnosměrný nebo střídavý. Dohodnutý směr toku stejnosměrného proudu je od kladného pólu zdroje k zápornému. Skutečný směr toku elektronů v pevných vodičích je však opačný!!!
Úvod do elektrochemie – základní jednotky • Elektrické napětí „U“ je definováno jako práce vykonaná elektrickou silou při přemístění kladného jednotkového elektrického náboje mezi dvěma body v prostoru. Lze ho chápat i jako rozdíl elektrických potenciálů v obou bodech v prostoru. • Jednotkou je volt (V): 1 V je takové napětí, které je mezi konci vodiče, do kterého konstantní proud 1 A dodává výkon 1 W. Odpor vodiče je v tomto případě 1 Ω. • Jednotka volt je odvozena z jednotek soustavy SI: V (volt) = m2∙kg∙s-3∙A-1.
Úvod do elektrochemie – základní jednotky • Elektrický odpor „R“ charakterizuje schopnost elektrických vodičů vést elektrický proud. Velikost odporu je dána materiálem, tvarem i teplotou vodiče. Velikost odporu je přímo úměrná délce vodiče a nepřímo úměrná průřezu vodiče, materiálu a teplotě. Odpor nabývá vždy kladných hodnot. • Jednotkou je ohm (Ω). Také je jednotkou odvozenou: Ω (ohm) = V∙A-1 = m2 kg∙s-3 A-2
Úvod do elektrochemie – elektrody • Elektroda (poločlánek) - soustava tvořená vodivými fázemi (l, s, g) ve vzájemném kontaktu. Na styku těchto fází (fázových rozhraních) i uvnitř těchto fází se mohou pohybovat ionty, elektrony i molekuly a mohou zde probíhat reakce (chemické, redoxní) případně výměna nabitých částic – výsledkem je potenciálový rozdíl mezi fázemi. Vodivost jednotlivých fází je zpravidla odlišná.
Úvod do elektrochemie – elektrody • Polarizovatelné elektrody – lze jim udělit z vnějšího zdroje určitý potenciál – elektrody 1. druhu s malým povrchem • Nepolarizovatelné elektrody – udržují si svůj potenciál na konstantní hodnotě bez ohledu na zvnějšku vkládané napětí – elektrody 2. druhu (proto se používají jako referentní) nebo elektrody 1. druhu s velkým povrchem. • Depolarizátor - látka, která se při určitém potenciálu může oxidovat / redukovat (depolarizace elektrody) a elektrodou může téci proud
Úvod do elektrochemie – elektrody • Elektrody 1. druhu – Kovové elektrody ponořené do roztoku svých iontů RT 0 E=E + ⋅ ln a M + zF
• Elektrody 2. druhu – Kovové elektrody potažené málo rozpustnou solí tohoto kovu ponořené do roztoku dobře rozpustné soli se společným aniontem Ks RT 0 E=E + ⋅ ln zF a x-
Úvod do elektrochemie – elektrody • Elektrody 3. druhu – Oxidačně-redukční elektrody realizované ušlechtilým kovem (Pt, Au), nebo grafitem (uhlíková elektroda) ponořeným do roztoku obsahující Red i Ox formu dané látky. Potenciál těchto elektrod je odvislí od vzájemného poměru aktivit obou forem látky – Ox + ze Red
a A ox RT E=E + ⋅ ln zF a A red 0
Úvod do elektrochemie – elektrody • Iontově-selektivní elektrody – Roztok definované koncentrace iontu oddělen membránou od roztoku vzorku – Přenos elektrického náboje v důsledku rozdílných koncentrací na obou stranách membrány – membránový (Donnanův) potenciál – Mechanismus iontové výměny zajišťuje výměnu iontů mezi vzorkem a membránou a to bez změny oxidačního čísla RT / E=E + ⋅ ln a I zF
Úvod do elektrochemie - Voltametrie • Lineární změna napětí vkládaného na elektrodu • Proud vs. vložený potenciál • V přítomnosti depolarizátoru (oxidace/redukce) dochází k průchodu elektrického proudu I
E
t
E
Úvod do elektrochemie - Polarografie • Voltametrie s pomalým nárůstem potenciálu – Na elektrodě se stačí ustavit rovnováha odpovídající okamžitému potenciálu – Měříme limitní difuzní proud - úměrný koncentraci analytu dané pouze difuzí k povrchu elektrody
• Voltametrie na rtuťové kapající elektrodě nebo rotující diskové elektrodě
Úvod do elektrochemie – Cyklická voltametrie
• Lineární změna napětí z minima (Einit) přes maximum (Efin) zpět do minima • Dopředná a zpětná větev • Poloha píku, půlvlnový potenciál, výška píku, …
E
Red → Ox + z e-
I > <
Ox + z e- → Red
t
E
Úvod do elektrochemie - Amperometrie • Odvozená voltametrická metoda – stejná instrumentace • Potenciál je v čase konstantní • Hodnota potenciálu – limitní proud v přítomnosti depolarizátoru – úměrný koncentraci E • Proud v závislosti na čase
t
Úvod do elektrochemie – 2E vs. 3E systém
SECM • Scanning electrochemical microscopy • Skenovací elektrochemická mikroskopie
Allen J. Bard 26
Statistika publikační činnosti 100
SECM
80 60 40 20 0
800
STM
600 400 200 0 4000
AFM
3000 2000 1000 0 1985
1990
1995
2000
Rok
2005
2010
Hlavní autoři • • • • • • • • • • • •
Bard, A.J. Unwin, P.R. Schuhmann, W. Wittstock, G. Matsue, T. Shiku, H. Mirkin, M.V. Yasukawa, T. Kranz, C. Girault, H.H. Heinze, J. Macpherson, J.V.,
81 62 54 54 42 33 28 23 21 18 18 17
SECM – Pracovní schéma Bipotenciostat ME
R
C
PC Zkoumaný vzorek
Hlavní součásti mikroskopu • Mikroelektroda – Různé typy a variace (kovové, ISE, kapilární) – Velikost mikroelektrody ovlivňuje rozlišení metody
• Polohovací systém schopný pohybu ve 4D – Spolu s ME udává rozlišení
• Bipotenciostat – Kontroluje nastavení potenciálu
• Optika pro kontrolu polohy hrotu – Digitální kamery – Mikroskopy
Mikroelektrody • Zvláštní druh elektrod • Malé rozměry = potlačení kapacitních proudů na úkor faradických • Velmi nízké proudy (nA až pA) • Zanedbatelný odpor = možnost rychlých potenciálních změn (až 106 V/s) • Křehké!
Mikroelektrody • • • • • • •
Ø hrotu obvykle méně než 25 µm Pt, Au, Ag, C Amperometrické Potenciometrické ISE skleněné ME ISE krystalické membrány ISE tekuté
Sklo Elektroda
Charakterizace mikroelektrod • Průměr elektroaktivního povrchu ME – „a“ • Průměr ME včetně izolantu – „b“ • Podíl poloměru RG = b/a – RG je vždy větší než 1 (obvykle hodnoty 2-10)
• Cyklický voltamogram – Ideálně provádět před skenováním i po něm
Charakterizace mikroelektrod • Time required to attain a steady state (ustálený stav) – velikost elektrody – čím menší elektroda tím rychlejší je proces ustálení
34
Komerční mikroelektrody – Kation Scientific
35
Komerční mikroelektrody – Kation Scientific
36
Au-SPE 5 4 3
I [mA]
2 1 0 -1 -2 -3 -4 -0,2
0,0
0,2
0,4
U [V]
0,6
0,8
Pt-ME (15 µm) 0,012
0,010
I [µA]
0,008
0,006
0,004
0,002
0,000
-0,002 -0,1
0,0
0,1
0,2
0,3
U [mV]
0,4
0,5
0,6
0,7
Přibližovací křivka
Proud
• Charakterizace tvaru hrotu • Vzdálenost přiblížení ke vzorku
Vzdálenost hrotu od povrchu
SECM – Módy • Hrot v nekonečné vzdálenosti od povrchu • Prostá difuse substrátu • Proud úměrný koncentraci substrátu a průměru ME
I T ,∞ = 4nFDca
R
-e-
O
SECM – Módy • Oxidace blízko vodivého povrchu – Pozitivní zpětná vazba – Dochází k zacyklení substrátu – Měřený proud výrazně narůstá čím blíže je ME povrchu
O O
-e-
+eVodič
R R
SECM – Módy • Oxidace blízko nevodivého povrchu – Negativní zpětná vazba – Substrát nemůže k povrchu ME – Proud klesá čím blíže je ME povrchu
R
R
Nevodič
SECM – Módy • Elektrochemická částice generovaná ME a měřená povrchem – TG/SC (Tip generation/surface collection)
R
R
R Vodič
R
R
SECM – Módy • Elektrochemická částice generovaná povrchem a měřená ME – SG/TC (Surface generation/tip collection)
R
R
R R Vodič
R
Zobrazování povrchů • Režim konstantní výšky – Hrot skenuje v konstantní výšce – Problém s nakloněním roviny vzorku
• Chemické zobrazování – Aktivita látky v určité oblasti – Enzymy vázané na organely, …
• Katalytická aktivita – Rychlý sken vhodných kandidátů
Kombinované techniky • SECM/AFM – Výroba kombinovaných hrotů
• NSOM/SECM • ECL/SECM • OM/SECM
Komerční zařízení SECM
SECM370 Scanning Electrochemical Microscope System (Uniscan Intruments)
Komerční zařízení SECM
CHI900B Scanning Electrochemical Microscope (CH Instruments)
Komerční zařízení SECM
Electrochemical probe scanner (HEKA)
SECM – „Home made“
SECM – Mikropolohovač MP-285
SECM – Aplikace I. • Zobrazování • Charakterizace tvaru ultramikroelektrod • Měření kinetiky – Homogenní – Heterogenní
• • • •
Studium dějů na mezifázi kapalina/kapalina Studium membrán a tenkých filmů Povrchové reakce (mikrokoroze) Studium povrchů polovodičů
SECM – Aplikace II. • Kinetika elektrochemických reakcí; palivové články • Elektrochemie v malých objemech • • • •
Studium biologických systémů Skenování spotřeby kyslíku - životaschopnost buněk Skenování vzniku kyslíku – průběh fotosyntézy (Bio)senzorika
SECM – Aplikace III. SECM – koncentrace kyslíku kolem buňky. Měřený proud v pA.
SECM – Aplikace IV. AC-SECM – kontrola metabolismu živých buněk bez přídavku toxického redox-aktivního mediátoru
SECM – Aplikace IV. Hovězí chrupavka
Série spotů antigen-protilátka
Spoty imobilizované GOx
Published in: Dominik Schäfer, Monika Maciejewska, Wolfgang Schuhmann, SECM visualization of spatial variability of enzyme–polymer spots: 1. Discretisation and interference elimination using artificial neural networks, Biosensors and Bioelectronics, Volume 22, Issues 9–10, 15 April 2007, Pages 1887-1895, ISSN 0956-5663, DOI: 10.1016/j.bios.2006.07.039
58
Spoty imobilizované peroxidasy SECM-AFM
Published in: C Kranz, A Kueng, A Lugstein, E Bertagnolli, B Mizaikoff, Mapping of enzyme activity by detection of enzymatic products during AFM imaging with integrated SECM–AFM probes, Ultramicroscopy, Volume 100, Issues 3–4, August 2004, Pages 127-134, ISSN 0304-3991, DOI: 10.1016/j.ultramic.2003.10.004.
59
Mřížka GOx – technika Ink-jet
60
Odčerpávání elektronů - fotosyntéza
Schematic of noncyclic PET and potential positioning of nanoelectrodes within chloroplasts. The inset depicts insertion of the nanoelectrode into a granal stack of thylakoid membranes.
Published in: WonHyoung Ryu; Seoung-Jai Bai; Joong Sun Park; Zubin Huang; Jeffrey Moseley; Tibor Fabian; Rainer J. Fasching; Arthur R. Grossman; Fritz B. Prinz; Nano Lett. 2010, 10, 1137-1143. DOI: 10.1021/nl903141j Copyright © 2010 American Chemical Society
61
SECM/AFM AFM image (constant force mode)
SECM image
62
SECM etching ← WLI images of etch pits produced in enamel by the application of a current of 100 nA for (a) 20 s and (b) 300 s.
← An optical micrograph of a series of etch pits at 100 nA showing pits at 60, 120, 180, 240, and 300 s.
Published in: Carrie-Anne McGeouch; Martin A. Edwards; Michael M. Mbogoro; Charles Parkinson; Patrick R. Unwin; Anal. Chem. 2010, 82, 9322-9328. DOI: 10.1021/ac101662h Copyright © 2010 American Chemical Society
63
MEAM • Microelectrode array microscope
Developed in: Idaho National Laboratory (USA)
64
Co dokáže nanotechnologie ...
Skenovací elektrochemická mikroskopie praktické cvičení
Výroba mikroelektrod I. • Do skleněné kapiláry s jedním zataveným koncem se vloží kovový drátek požadovaného průměru • Kapilára se připojí na vakuum a umístí do smyčky z odporového drátu • Smyčku připojíme ke zdroji a pozorujeme její rozžhavení • Kontrolujeme zatavení konce kapiláry – natavená část se nesmí příliš prohnout
Výroba mikroelektrod II. • Vychladlou kapiláru brousíme do požadovaného tvaru – aby drátek (budoucí ME) byl pokud možno ve středu a výsledný hrot měl symetrický tvar • Tvar hrotu kontrolujeme mikroskopem • Vybroušený hrot leštíme postupně pomocí leštících prášků (1 µm; 0,3 µm; 0,05 µm) • Do kapiláry aplikujeme uhlíkovou vodivou pastu a vložíme drátek, který poslouží jako kontakt
Charakterizace ME • Připravíme čerstvý roztok 3 mM K4[Fe(CN)6] v 0,5 M KCl • Provedeme měření CV v rozmezí potenciálu -100 mV – +600mV • Voltamogram má typický tvar • V případě neideálního voltamogramu se povrch ME musí přeleštit!
Přibližovací křivka • ME umístíme na nosné rameno mikroskopu a připojíme kontakt • Ostatní elektrody si předem připravíme do Petriho misky a rovněž připojíme kontakty • Hrot ME polohujeme do výšky cca 150 µm nad povrchem – dle typu povrchu volíme hodnotu proudu, který nastavujeme v ovládacím SW I = IT ,∞ × 0,25 pro negativní zpětnou vazbu I = IT ,∞ ×1,25 pro pozitivní zpětnou vazbu
Skenování SPE • Do Petriho misky se umístí sítotisková elektroda a přelije se roztokem mediátoru • Proměří se přibližovací křivka a zvolí se správná výška hrotu nad vzorkem • V ovládacím sw se nastaví skenovaná oblast a rychlost skenování • Naměřená data se importují do analytického SW Origin a vynesou graficky
Skenování SPE-GOX • SPE se odmastí 30 min v acetonu • Na zlatou elektrodu se nanese roztok cysteaminu (20 mg/ml v DW) – 2h RT • Po oplachu následuje inkubace s glutaraldehydem – 1h RT • Enzym glukosaoxidasa se inkubuje přes noc v lednici • Roztok pro měření: 50 mM glukosa v 0,150 M KCl • Naměřená data se vyhodnotí v Originu
Děkuji za pozornost! 73
