TEKNIK ISOLASI KUMAN ANTRAKS PADA BAHAN PEMERIKSAAN DARI DAERAH Koko Barkah dan M.B . Poerwadikarta Balai Penelitian Veteriner, Bogor
PENDAHULUAN Antraks dikenal sebagai penyakit menular pada hewan yang disebabkan oleh bakteri Bacillus anthracis. Penyakit ini dapat menular pada manusia dan dikelompokan kedalam penyakit zoonosis yang berbahaya . Di Indonesia, Antraks telah diketahui sejak tahun 1885 (Soemanagara, 1958) dan hingga saat ini beberapa daerah masih dikenal sebagai daerah endemik (Ditkeswan, 1992 ; Hardjoutomo, 1996) . Peneguhan diagnosis antraks dilaboratorium, secara kultur bakteriologik dan uji biologik dengan menggunakan hewan percobaan biasanya perlu dilakukan . Peneguhan diagnosis tersebut dimaksudkan untuk lebih meyakinkan bahwa penyebab kematian pada hewan yang diduga antraks disebabkan oleh Bacillus anthracis . Di laboratorium bakteriologik Balai Penelitian Veteriner (Balitvet) Bogor, peneguhan diagnosis antraks dilakukan dengan menggabungkan hasil dari tiga pemeriksaan, yaitu pemeriksaan mikroskopik, kultur bakteriologik dan pemeriksaan biologik . Dalam beberapa keadaan tertentu diagnosis juga dilakukan dengan pengujian secara serologik yaitu uji presipitasi ascoli dan teknik antibodi flouresencent sebagai pelengkap dalam pemeriksaan (Poerwadikarta dkk ., 1994) . Penyusunan makalah ini dimaksudkan untuk mempelajari teknik sederhana yang dapat dilakukan dalam mengisolasi kuman antraks pada bahan pemeriksaan antraks yang dikirim dari daerah . PENYIAPAN MEDIA PERTUMBUHAN Jenis media pertumbuhan yang biasa digunakan pada pengerjaan isolasi kuman antraks, antara lain media agar darah dan media agar nutrien . Media agar darah dibuat berdasarkan metoda Supar dan Ibrohim (1981) . Media agar darah mengandung bahan-bahan antara lain media alkalis bouillon (infusion broth) sebagai dasar media yang ditambahkan 5-10% darah normal domba sehat dan 2-3% agar bacto . Media agar nutrien mengandung bahan dasar media alkalis bouillon dengan penambahan 2-3% agar bacto . Kedua media tersebut memiliki derajat keasaam (pH) 7 .2-7 .4 dan dibuat pada cawan petri yang berdiameter 9 cm dengan ketebalan 1 .5 cm .
166
Lokakarya Fungsional Non Pene68
Penyiapan dasar media pertumbuhan alkalis bouillon dilakukan dengan melarutkan 10 gram pepton bacto dan 5 gram NaCl dalam 1000 ml air kaldu daging sapi yang dipanaskan dan ditambahkan 2-3% agar bacto . Selanjutnya media tersebut diukur derajat keasamannya dan disaring dengan menggunakan kertas saring . Sterilisasi media dilakukan pada suhu 121 ° C selama 30 menit menggunakan autoclave yang bertekanan 15 lb . Untuk media agar darah, penambahan darah dilakukan secara aseptik dan perlahan setelah media didinginkan menjadi suhu 56°C . Pada kondisi suhu 56 °C, secara aseptik media dituangkan kedalam cawan petri dengan volume 7 .5-10 ml . Penuangan media tersebut dilakukan dalam ruangan khusus bebas cemar (biohazard) . Selanjutnya media tersebut didiamkan sampai membeku dalam cawan petri . Untuk mengetahui adanya pencemaran pada media yang dibuat, sebelum dipergunakan media tersebut diinkubasikan pada suhu 37° C selama 24 jam . Media pertumbuhan dapat dipergunakan apabila tidak ada pertumbuhan kuman pencemar setelah diinkubasikan selama 24 jam . Media dapat disimpan dalam kondisi suhu 4 ° C sampai dipergunakan . Media agar nutrien dibuat pada botol Mc Cartney volume 30 ml dalam posisi miring dengan volume media 10 ml setiap botolnya . Penggunaan media agar nutrien ini adalah untuk menyimpan isolat kuman antraks yang diisolasi dari koloni yang tumbuh pada media agar darah . BAHAN PEMERIKSAAN ANTRAKS Beberapa bahan pemeriksaan berupa potongan kecil daging, Wit clan irisan daun telinga yang diperoleh dari beberapa daerah yang mengalami kejadian antraks . Bahan pemeriksaan tersebut diambil dari hewan mati yang diduga terkena antraks berdasarkan hasil diagnosis sementara dan dikirim oleh dinas Peternakan setempat untuk diteguhkan di laboratorium Balitvet TEKNIK ISOLASI DAN IDENTIFIKASI ISOLAT KUMAN ANTRAKS Pengerjaan isolasi kuman antraks pada bahan pemeriksaan yang dikirim dari daerah dilakukan berdasarkan metoda Hardjoutomo dkk (1990) dan dikerjakan dilaboratorium sesuai dengan jenisnya . Untuk bahan pemeriksaan yang berupa potongan daging, kulit dan telingga dikerjakan dengan cara menghancurkan . Penghancuran dilakukan menggunakan alat penghancur (stomacher) setelah bahan pemeriksaan tersebut dicuci dan dipotong-potong kecil atau diiris menggunakan pisau skalpel steril . kemudian ditambahkan larutan NaCI physiologis sebanyak 5 ml untuk setiap 5-10 gram bahan pemeriksaan dan dimasukan kedalam tabung reaksi volume 10 ml . Larutan bahan pemeriksaan tersebut selanjutnya dikocok menggunakan alat pengocok (vortex) selama 2-3 menit dan dipanaskan pada suhu 70 ° C selama
1 67
Lokakarya Fungsional Non PeneAW
pengocok (vortex) selamaa 2-3 menit dan dipanaskan pada suhu 70 ° C selama 30 menit dalam pemanas air (water bath) . Tujuan pemanasan ini dilakukan agar bakteri pencemar lainnya dapat terbunuh dan tidak menghambat pertumbuhan B . anthracis . Selanjutnya, setelah diendapkan bagian supernatan larutan bahan pemeriksaan tersebut ditanam pada media agar darah dan diinkubasikan pada suhu 37°C selama 24 - 72 jam . Pertumbuhan koloni bakteri B . anthracis biasanya sudah mulai tampak setelah 24-48 jam inkubasi . Koloni yang dicurigai diambil dengan menggunakan ose dan dipindahkan pada media agar nutrien untuk diidentifikasi secara marfologi dan sifat biokimianya (Tabel 1 .) . Pemeriksaan marfologi dan biokimia dilakukan berdasarkan metoda Pesti (1990) dan Cowan (1974) . Tabel 1 . Bentuk morfologi dan sifat biokimia B. anthracis Karakteristik Morfologi dan pertumbuhan Pewarnaan Gram Bentuk sel Kapsul Anaerob Penisilin 10 IU Reaksi biokimia Katalase Fermentasi - Gukosa - Arabinosa - Xylose Karbohidrat (hidrolisis) Citrat (penggunaan) Gelatin Nitrat (reduksi) Voges -Proskauer Lecithinase (aktivitas) Patogenitas pada marmot ')
B. anthracis*)
b
+ +
v
= sumber data dari Pesti (1990) . ; b = bentuk batang
+ = Positif ; - = Negatif ; V = Variasi ; . = Tidak Dilakukan
1 68
Lokakarya Fungsional Non Penelit
PENGGUNAAN HEWAN PERCOBAAN UNTUK UJI BIOLOGIK Untuk keperluan pemeriksaan biologik antraks dilaboratorium, hewan percobaan diperlukan untuk mengetahui keganasan dari kuman antraks yang berhasil diisolasi . Dalam pemeriksaan antraks dilaboratorium, hewan marmot dan mencit digunakan sebagai hewan percobaan . Hewan-hewan tersebut dapat menggambarkan sifat keganasan dari isolat antraks yang diisolasi . Hewan marmot biasanya lebih sering digunakan sebagai hewan percobaan dalam pemeriksaan bahan spesimen, karena hewan tersebut lebih peka terhadap antraks . Sebagian dari supernatan bahan pemeriksaan tersebut dijadikan sebagai bahan inokulum untuk disuntikan pada hewan percobaan marmot yang digunakan . Penyuntikan bahan inokulum dilakukan pada bagian daging paha marmot (intramuscular) dengan dosis 0 .5 ml setiap ekornya . Untuk mencit penyuntikan dilakukan pada bagian rongga perut (intraperitonial) dengan dosis 0 .1-0 .2 ml setiap ekomya . Setiap bahan pemeriksaan biasanya digunakan 2-3 ekor hewan percobaan . Hewan percobaan yang telah disuntik dengan bahan pemeriksaan tersebut di amati sampai 7 hari . Dari beberapa pengamatan biasanya kematian hewan percobaan yang disuntik dengan bahan pemeriksaan positif antraks terbunuh 48 jam setelah penyuntikan . Kematian hewan percobaan tersebut biasanya diikuti tandatanda keluarnya darah dari hidung dan anus, pembengkakan pada bagian bekas penyuntikan dengan pengembungan bagian perut dan hewan terlihat kaku . Selanjutnya Hewan percobaan yang terbunuh diperiksa bangkai dan seluruh organ bagian dalamnya . Pada marmot yang terbunuh karena antraks terlihat pada bagian antara kulit dan daging terdapat cairan seperti gelatin, organ limpa membesar berwarna merah kehitaman dan rapuh, organ jantung membengkak, besar melebihi bentuk normal . Dari hewan percobaan yang terbunuh dilakukan isolasi dari bagian organ tubuhnya yang secara makroskopis menunjukkan perubahan abnormal, seperti yang disebutkan diatas . Dari organ tubuh limpa, jantung dan cairan gelatin marmot mati diambil sedikit dengan mengoleskan alat ose yang sebelumnya sudah dipanaskan . Selanjutnya ose yang mengandung bagian dari organ tubuh marmot tersebut ditanamkan pada media agar darah dan diinkubasikan pada suhu 37 ° C selama 24-72 jam . Jika perlu pengamatan pertumbuhan koloni kuman antraks dilakukan sampai 7 hari . Untuk pemeriksaan mikroskopis kuman antraks dari hewan marmot yang mati terbunuh dilakukan dengan membuat preparat ulas dari bagian organ tubuh jantung, limpa dan cairan gelatin . Preparat ulas difiksasi dengan alkohol 96% selama 1 jam dan dicuci dengan air bersih . Preparat ulas dapat diwarnai dengan pewarnaan cepat Giemsa atau Loeffler methylena blue . Pencucian preparat ulas dilakukan lagi setelah diwarnai dan dikeringkan untuk
1 69
Lokakarya Fungsional Non PeneMi
dapat Iangsung diperiksa secara mikroskopik . Pemeriksaan preparat ulas secara mikroskopik dilakukan dengan dibawah mikroskop menggunakan pembesaran 100 x pada lensa objektif dan 10 x pada lensa ocular. Untuk peneguhan diagnosis antraks di laboratorium bakteriologi Balitvet, pengerjaan isolasi kuman antraks dilakukan secara kultur bakteriologik dan biologik . Berdasarkan jenis bahan pemeriksaan yang diperoleh dari daerah yang disebutkan dapat dikelompokan antara lain bahan pemeriksaan berupa potongan kulit, daging dan telinga . Dari ketiga jenis bahan pemeriksaan tersebut, potongan daging jumlahnya paling banyak dibandingkan dengan bahan pemeriksaan Iainnya seperti pada Tabel 2 . Tabel 2 . Bahan pemeriksaan dari hewan yang diduga antraks dari daerah untuk pengerjaan isolasi kuman antraks di laboratorium No .
Jenis bahan pemeriksaan
Jumlah
1.
Kulit
2. 3.
Isolasi kuman prosentase
65
Hasil pemeriksaan positif 24
Daging
121
17
7 .1
Telinga
55
8
3 .3
Jumlah
241
49
20 .3
9 .9
Dari hasil pemeriksaan dan pengerjaan isolasi kuman antraks yang dilakukan menunjukkan bahwa prosentase keberhasilan isolasi pada bahan pemeriksaan berupa kulit hewan yang mati terbunuh antraks menunjukkan jumlah 9 .9% (24/241) . Jumlah tersebut merupakan jumlah yang paling tinggi dibandingkan dengan hasil isolasi kuman antraks pada bahan pemeriksaan yang berasal dari potongan daging dan telinga hewan yang terkena antraks . Prosentase keberhasilan isolasi pada bahan pemeriksaan berupa potongan daging adalah 7 .1% (17/241), sedangkan isolasi bahan pemeriksaan berupa potongan telinga adalah 3 .3% (8/241) . Keberhasilan isolasi kuman antraks pada bahan-bahan pemeriksaan yang diperoleh dari daerah tersebut menunjukkan masih rendah (20 .3%) . Hal ini diperkirakan bahwa terdapat kendala yang terletak pada beberapa hal, antara lain : (1) kurang tepatnya penanganan bahan pemeriksaan sejak dari pengambilan dan pengirimannya ; (2) karena pengiriman bahan pemeriksaan dari lapang kelaboratorium memerlukan waktu cukup lama, sehubungan dengan tersebarnya daerah kasus dan seringkali bahan pemeriksaan sudah mengalami pembusukan, terutama pada bahan pemeriksaan yang berupa organ . Bahan pemeriksaan yang demikian sangat sulit dilakukan isolasi agen penyebabn.ya, karena pertumbuhan kuman antraks dipengaruhi oleh 1 70
Lokakarya Fungsiona/ Non Penetitr
lingkungan yang diubah kuman pembusuk lainnya, seperti Pseudomonas sp, Bacillus sp . Sejalan dengan pendapat Christie (1987) dan Titball dkk .(1991), bahwa kuman antraks dalam bentuk vegetative dapat terbunuh dengan cepat oleh proses pembusukan dalam organ tubuh hewan yang sudah mati . Selain itu, produk metabolik mikroorganisme lain dan perubahan batas pH lingkungan dapat mempengaruhi kondisi sporulasi kuman yang terjadi dalam tanah (Choquette dan Broughton, 1981) . Untuk itu diperlukan perhatian yang baik terhadap penanganan bahan pemeriksaan agar diagnosisnya dapat ditegakkan secara tepat dan cepat .
KESIMPULAN DAN SARAN Teknik isolasi kuman antraks yang dilakukan dilaboratorium, dengan pengerjaan bahan pemeriksaan antraks dari daerah secara pupukan (kultur bakteriologik) pada media agar darah, merupakan teknik sedehana yang dapat dilakukan untuk isolasi kuman antraks . Untuk memperoleh hasil peneguhan diagnosis laboratorik secara cepat dan tepat, sebaiknya perlu diperhatikan penanganan bahan pemeriksaan secara tepat . Penggunaan teknik diagnosis konvensional yang dilakukan dengan kultur bakteriologik dan biologik kiranya dianjurkan untuk dapat diterapkan pada laboratorium diagnostik veteriner di daerah-daerah endemik antraks .
DAFTAR PUSTAKA Choquette, L .P .E . and Broughton, E . 1981 . Anthrax . In : Infectious Diseases of Wild Mammals ., 2nd eds .ed . Davis, J .W ., Kastrad L .H . and Trainer, D .O ., Ames, Iowa, Iowa State University Press, pp .288-296 . Christie, A .B . 1987 . Infectous Diseases : Epidemiology and Clinical Practise, 4th eds . Edinburgh, Churchill Livingstone, pp .983-1003 . Cowan S .T ., 1974 . Cowan and Steel's : Manual for Identification of Medical Bacteria, 2nd eds ., Cambridge and London, Cambridge University Press . Direktorat Bina Kesehatan Hewan . 1992 . Pedoman Umum Pembinaan Keseahatan Hewan . Rapat Konsultasi Teknis Nasional Dit .Jend .Nak . Jakarta, 5-6 Pebruari 1992, hal .40 . Hardjoutomo, S . 1996 . Incidence of anthrax in Indonesia : Salisbury Medical Bulletin . Special Supplement, (87) ;9
1986-1995 .
Office International Des Epizooties (OIE) . 1992 . Anthrax In : Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines . Second edition ;142-157
1 71
Lokakarya Fungsiona/ Non Panama
Pesti, L . 1990 . Methods for the Diagnosis of Anthrax . In : G .G . Alton,G .R . Carter, A .C . Kibor and L . Pesti . Veterinary Diagnostic Bacteriology . A . Manual of Laboratory Procedures for Selected Diseases of Livestock . FAO Animal Production and Health Paper . 81 :77-74 Poerwadikarta, M .B ., S . Hardjoutomo Dan E . Martindah . 1994 . Studi Retrospektif laboratorik antraks di Indonesia : 1973-1992 . Prosiding Seminar Teknologi Veteriner. hal .1-6 Soemanagara R .Md .T ., 1958 . Ichtisar singkat dari penyakit Radang limpa, penyakit Ngorok dan Radang paha di Indonesia . Hemera Zoa . 65 :95-109 Supar dan Ibrohim . 1981 . Kultur Media dan Cara Pembuatannya . Balai Penelitian Penyakit Hewan, Bogor . 1981 ; 12-26 Titball, R .W ., P .C .B . Turnbull and R .A . Hutson . 1991 . The Monitoring and Detection of B . anthracis in the environment, Journal of Applied Bacteriology Symposium Supplement, 70 ;9S-18S .
1 72
