LAPORAN AKHIR PROGRAM KREATIVITAS MAHASISWA PENELITIAN (PKM-P) JUDUL KEGIATAN UJI EFEKTIVITAS EKSTRAK KULIT PETAI (Parkia speciosa Hassk) PADA MENCIT Balb/c SEBAGAI OBAT ANTI-INFLAMASI RHEUMATOID ARTHRITIS
Oleh : Aisyah Zahroh Aden Herlinda Mawardika Novembya Vilansari Firda Agustin Ganys Tri Silvana
/ 105090100111040/ 2010 (Nama Ketua Kelompok) / 115090113111004/ 2011 (Nama Anggota 1) / 115090100111004/ 2011 (Nama Anggota 2) / 115090101111004/ 2011 (Nama Anggota 3) / 115090107111020/ 2011 (Nama Anggota 4)
UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG 2013 i
1. Judul Kegiatan
: Uji Efektivitas Ekstrak Kulit Petai (Parkia Speciosa Hassk) pada Mencit Balb/c sebagai Obat Anti-Inflamasi Rheumatoid Arthritis. 2. Bidang Kegiatan : (√) PKM-P ( ) PKM-M ( ) PKM-KC ( ) PKM-K ( ) PKM-T 3. Ketua Pelaksana Kegiatan a. Nama Lengkap : Aisyah Zahroh Aden b. NIM : 105090100111040 c. Jurusan : Biologi d. Universitas : Brawijaya e. Alamat Rumah dan No Tel./HP : Jl. Kapi Pramuja IV, 18 D/ 17, Sawojajar, Malang, HP: 085755580049 f. Alamat email :
[email protected] 4. Anggota Pelaksana Kegiatan/Penulis : 4 orang 5. Dosen Pendamping a. Nama Lengkap dan Gelar : Muhaimin Rifa’i, S.Si., Ph.D. Med. Sc. b. NIDN : 0026066803 c. Alamat Rumah dan No Tel./HP : Jl. Kamelia No.26, Malang, No. Tel. 0341-492889, Hp. 081233011126 6. Biaya Kegiatan Total : Rp 9.000.000,00 a. Dikti : Rp 9.000.000,00 b. Sumber lain :7. Jangka Waktu Pelaksanaan : 5 bulan Malang, 19-Agustus-2013 Menyetujui Ketua Jurusan
Ketua Pelaksana Kegiatan
(Widodo S.Si., M.Si., Ph.D) NIP. 19730811.200003.1.002
(Aisyah Zahroh Aden) NIM. 105090100111040
Wakil Rektor Bidang Kemahasiswaan
(Ir. H. RB. Ainurrasjid, MS.) NIP. 195506181981031002
Dosen Pendamping
(Muhaimin Rifa’i, S.Si., Ph.D. Med. Sc.) NIDN. 0026066803
ii
Uji Efektivitas Ekstrak Kulit Petai (Parkia Speciosa Hassk) pada Mencit Balb/C sebagai Obat AntiInflamasi Rheumatoid Arthritis Aisyah Z.A., Firda A., Ganys T.S., Herlinda M., Novembya V.S. Universitas Brawijaya, Malang ABSTRAK Rheumatoid Arthritis (RA) merupakan penyakit inflamasi kronis yang menyebabkan degenerasi jaringan penyambung dan umumnya diatasi dengan obat anti-inflamasi. Kulit petai mengandung fenol dan flavonoid dalam jumlah besar yang berpotensi sebagai senyawa anti-inflamasi. Penelitian ini bertujuan untuk membuktikan efek anti-inflamasi ekstrak ethanol kulit petai dan mengetahui dosis ekstrak kulit petai yang optimal untuk menyembuhkan RA. Mencit Balb/C diaklimatisasi selama satu minggu dan dibuat model RA dengan diinjeksi emulsi Complete Freund Adjuvant (CFA) dan Ovalbumin kemudian dibooster dengan emulsi Incomplete Freund Adjuvant (IFA) dan Ovalbumin. Ekstrak kulit petai diperoleh dengan teknik maserasi menggunakan etanol absolut. Kelompok dosis hewan coba diberi ekstrak kulit petai secara oral dengan dosis 25mg/kgBB, 50mg/kgBB, dan 100mg/kgBB selama dua minggu. Data diperoleh dengan pengukuran berat badan, volume kaki, jumlah sel T dengan flowcytometry, dan uji toksisitas hepar. Data flowcytometry dianalisa dengan software CellQuest. Analisa statistik menggunakan ANOVA ( Analysis of Variance) dengan P < 0,05. Jumlah sel T CD4+ diketahui lebih tinggi daripada sel T CD8+ dengan peningkatan jumlah absolut sel T CD4+ dan CD8+ secara signifikan terlihat pada kelompok dosis 50 mg/kgBB. Volume kaki mencit berkurang dengan pemberian ekstrak dengan dosis 50mg/kgBB dan 100mg/kgBB. Presentase sel hepar nekrosis yang terbesar terjadi pada perlakuan dengan dosis 100mg/kgBB. Dosis optimal ekstrak kulit petai sebagai obat anti-inflamasi RA belum dapat ditentukan. Kata kunci : Inflamasi, Rheumatoid Arthritis, sel T, toksisitas
iii
KATA PENGANTAR Puji syukur kami panjatkan kehadirat Tuhan Yang Maha Esa karena atas rahmat-Nya kami dapat menyelesaikan penyusunan laporan akhir “Uji Efektivitas Ekstrak Kulit Petai (Parkia Speciosa Hassk) pada Mencit Balb/C sebagai Obat Anti-Inflamasi Rheumatoid Arthritis.’’ Penulisan laporan ini adalah salah satu syarat ketuntasan Program Kreativitas Mahasiswa. Atas tersusunnya laporan ini, maka penulis menyampaikan rasa hormat dan terima kasih kepada: 1. Bapak Muhaimin Rifa’i, S.Si., Ph.D. Med. Sc. selaku Dosen Pembimbing, atas bimbingan, kesabaran dan motivasinya kepada penulis selama penelitian dan penyusunan laporan 2. Prof. Aulani’am, atas berbagai saran yang mendukung selama pelaksanaan penelitian 3. Orang tua, atas doa dan semangat yang telah diberikan selama berlangsungnya penelitian dan penyusunan laporan 4. Bapak Harmaji, atas bantuan dan saran yang mendukung terlaksananya penelitian 5. Mas Bambang, Mbak Dewi Satwika, Mbak Ririn, Mas Uwais, dan Mas Ahmad Soni atas bantuan dan nasehat yang diberikan selama pengerjaan penelitian dan penyusunan laporan 6. Anisa Kusumaningtyas, Galuh Wening, Ayu Hilyatul, Vita Agustin, Wira Eka, Mbak Imroatul Khasanah, dan seluruh teman-teman Biologi angkatan 2010 dan 2011 yang bersedia memberi bantuan, doa, dan semangat hingga selesainya laporan penelitian Penulisan laporan akhir ini dirasa masih banyak kekurangan baik pada teknis penulisan maupun materi, mengingat kemampuan penulis yang terbatas. Untuk itu kritik dan saran dari semua pihak sangat kami harapkan demi penyempurnaan pembuatan laporan ini. Penulis berharap semoga penelitian ini dapat bermanfaat tidak hanya bagi penulis tetapi juga semua pihak.
Malang, 17 Agustus 2013 Penulis
iv
1
I. PENDAHULUAN 1) Latar Belakang Masalah Rheumatoid Arthritis (RA) adalah suatu penyakit inflamasi kronis yang menyebabkan degenerasi jaringan penyambung. Jaringan penyambung yang biasanya mengalami kerusakan pertama kali adalah membran sinovial yang melapisi sendi. Inflamasi tidak berkurang, namun menyebar ke struktur sendi termasuk kartilago artikular dan kapsul sendi fibrosa (Corwin, 2012). Pengidap penyakit radang sendi atau rheumatoid arthritis (RA) di Indonesia secara persentase mencapai 30%. Meski tidak menyebabkan kematian, dampak sistemik penyakit ini yaitu anemia, bahkan penyakit jantung (Pdpersi, 2012). Rheumatoid arthritis dapat diatasi dengan beberapa obat yang telah dikenal masyarakat. Obat kortikosteroid terbukti dapat menurunkan rasa sakit akibat penyakit ini. Penggunaan dalam jangka waktu yang lama dapat berakibat tukak lambung, hipertensi, dan diabetes. Selain itu juga terdapat obat salisilat yang termasuk obat dengan harga lebih murah akan tetapi juga dapat berdampak negatif (Yatim, 2006). Kulit petai diketahui memilki manfaat sebagai antioksidan, antidiabetik, dan antiangiogenik. Hal ini karena di dalamnya mengandung senyawa fenol dan flavonoid dalam jumlah yang besar (Karim dan Azrina, 2012). Dikalangan masyarakat hanya diketahui bahwa kulit petai yang mengandung fenol dapat digunakan untuk anti-inflamasi luar. Mengingat rheumatoid arthritis merupakan penyakit yang dapat diatasi dengan senyawa anti-inflamasi, maka penulis tertarik untuk melakukan penelitian dengan judul “Uji Efektivitas Ekstrak Kulit Petai (Parkia speciosa Hassk) Pada Mencit Balb/c Sebagai Obat AntiInflamasi Rheumatoid Arthritis.” 2) Perumusan Masalah 1. Apakah terdapat efek anti-inflamasi dari ekstrak ethanol kulit petai (Parkia speciosa Hassk) sebagai obat anti-inflamasi Rheumatoid Arthritis? 2. Berapakah dosis ekstrak kulit petai yang optimal sebagai obat anti-inflamasi Rheumatoid Arthritis? 3) Tujuan Program Penelitian ini bertujuan untuk membuktikan efek anti-inflamasi ekstrak ethanol kulit petai dan mengetahui dosis ekstrak kulit petai yang optimal untuk menyembuhkan Rheumatoid Arthritis. 4) Luaran yang Diharapkan Hasil penelitian ini diharapkan dapat diterbitkan dalam bentuk artikel dan dipatenkan menjadi alternatif baru pengobatan Rheumatoid Arthritis. 5) Kegunaan Program Efek kulit petai sebagai obat anti-inflamasi yang telah diketahui dapat digunakan sebagai alternatif baru bahan alami pengobatan bagi kondisi inflamasi pada tubuh. Diversifikasi bahan alami bagi pengobatan inflamasi tubuh dapat diwujudkan sehingga penggunaan obat-obatan sintetis dapat dikurangi. Pemanfaatan petai dapat diperluas sehingga nilai jualnya dapat lebih meningkat. II. TINJAUAN PUSTAKA 1) Klasifikasi Botani Petai Kasifikasi botani petai adalah sebagai berikut (Plantamor, 2008): Kingdom : Plantae (Tumbuhan) Subkingdom : Tracheobionta (Tumbuhan berpembuluh) Super Divisi : Spermatophyta (Menghasilkan biji) Divisi : Magnoliophyta (Tumbuhan berbunga) Kelas : Magnoliopsida (berkeping dua / dikotil) Sub Kelas : Rosidae Ordo : Fabales Famili : Fabaceae (suku polong-polongan) Genus : Parkia Spesies : Parkia speciosa Hassk 2) Manfaat Petai Petai memiliki tiga macam kandungan gula alami, yaitu sukrosa, fruktosa, dan glukosa yang dikombinasikan dengan serat sehingga mampu memberikan dorongan tenaga yang instan, namun cukup lama dan cukup besar efeknya. Manfaat dari petai itu sendiri antara lain mengurangi: tingkat depresi, gigitan nyamuk, PMS (Premenstrual Syndrome) dengan menstimulasi produksi sel darah
2
merah dan membantu bila terjadi anemia, luka lambung, obat mabuk, tekanan darah tinggi, dan SAD (Seasonal Affective Disorder) (Winarno, 1995). 3) Kandungan Gizi Kulit Petai Bagian kulit petai diketahui juga memilki manfaat sebagai antioksidan, antidiabetik, dan antiangiogenik karena di dalamnya mengandung senyawa fenol dan flavonoid dalam jumlah yang besar. Ekstrak metanol dari kulit petai menunjukkan efek antiangiogenik secara signifikan (Karim dan Azrina, 2012). Kandungan fenol pada kulit petai lebih banyak jika dibandingkan kandungan biji petai. Perbandingannya dari 100 gram bahan, biji petai menghasilkan 20 persen fenol, sedangkan kandungan fenol kulit petai dua kali lipatnya, yaitu 40 persen. Fenol dari kulit petai itu bisa menghancurkan radikal bebas jenis Diphenyl Picril Hydrazil Hydrate (DPPH) yang bisa menyebabkan kanker (Kurniawan, 2012).
Gambar 1. Kulit Petai (Nus, 2011) 4) Rheumatoid Arthritis (Rematik) Rheumatoid Arthritis (RA) adalah suatu penyakit inflamasi kronis yang menyebabkan degenerasi jaringan penyambung. Inflamasi di tandai oleh akumulasi sel darah putih, aktivasi komplemen, fagositosis ekstensif, dan pembentukan jaringan perut. Pada inflamasi kronis, membran sinovial mengalami hipertrofi dan menebal sehingga menyumbat aliran darah dan akan menstimulasi nekrosis sel dan respons inflamasi. Reumatoid Arthritis merupakan salah satu penyakit yang agen pemicunya tidak diketahui secara pasti (Corwin, 2012). Agen infeksi seperti virus, bakteri, dan jamur, sering dicurigai sebagai pemicunya. Sejumlah ilmuwan juga berpendapat bahwa beberapa faktor risiko seperti faktor genetik dan kondisi lingkungan pun ikut berperan dalam timbulnya RA (Williams dan Wilkins, 1997). 5) Patofisiologi Reaksi autoimun pada RA terutama terjadi dalam jaringan sinovial. Proses fagositosis menghasilkan enzim-enzim dalam sendi. Enzim-enzim tersebut akan memecah kolagen sehingga terjadi edema, poliferasi membran sinovial dan akhirnya pembentukan pannus. Pannus akan menghancurkan tulang rawan dan menimbulkan erosi tulang yang akan menganggu gerak sendi. Hal ini juga berdampak pada otot karena serabut otot akan mengalami perubahan degeneratif dengan menghilangnya elastisitas otot dan kekuatan kontraksi otot (Brunner dan Suddarth, 2002). 6) Inflamasi Inflamasi adalah respon dari suatu organisme terhadap patogen dan alterasi mekanis dalam jaringan, berupa rangkaian reaksi yang terjadi pada tempat jaringan yang mengalami cedera, seperti karena terbakar, atau terinfeksi. Inflamasi distimulasi oleh faktor kimia (histamin, bradikinin, serotonin, leukotrien, dan prostaglandin) yang dilepaskan oleh sel yang berperan sebagai mediator radang di dalam sistem kekebalan untuk melindungi jaringan sekitar dari penyebaran infeksi (Janeway, et all., 2001). Bagian tubuh yang mengalami peradangan akan memiliki tanda-tanda seperti tumor atau membengkak, calor atau menghangat, dolor atau nyeri, rubor atau memerah, dan functio laesa atau daya pergerakan menurun (Shlomchik, 2001). 7) Ekstraksi Ekstraksi adalah kegiatan penarikan kandungan kimia yang dapat larut sehingga terpisah dari bahan yang tidak dapat larut dengan pelarut cair. Hasil dari ekstraksi disebut ekstrak. Bahan yang akan dipisahkan mutlak harus berada dalam bentuk larutan. Ekstrak dan pelarut biasanya harus dipisahkan dengan cara penguapan, destilasi atau rektifikasi, maka titik didih kedua bahan itu tidak boleh terlalu dekat. Ditinjau dari segi ekonomi, hal ini akan menguntungkan jika pada proses ekstraksi titik didih pelarut tidak terlalu tinggi (Fauziyah, 2008). III. METODE PENDEKATAN 1) Jenis Penelitian
3
Penelitian ini bersifat eksperimen dan bertujuan untuk membuktikan efektivitas anti-inflamasi kulit petai (Parkia Speciosa Hassk) sebagai obat anti-inflamasi Rheumatoid arthritis secara invivo. Penelitian dilakukan dengan menggunakan metode rancangan acak lengkap yang terdiri dari 3 kelompok dosis yang diberi terapi ekstrak kulit petai, kelompok kontrol positif, dan kelompok kontrol negatif. 2) Pelaksanaan Penelitian a. Persiapan Bahan Baku Bahan Baku untuk penelitian ini terdiri dari : - Kulit Petai - Entelan - Antibodi (Anti CD-4 dan - Mencit Balb/c - C.F. Adjuvant Anti CD-8) - Etanol 85% - I.F. Adjuvant - Hematoksilin Eosin - Aquadest - Ovalbumin - PBS - Alkohol 70% - Evans Blue - Xylol b. Persiapan Alat Alat- alat yang digunakan terdiri dari : A. Persiapan Hewan Coba (Mencit Balb/c) Kandang hewan coba, ram-raman kawat, tempat makan, tempat minum, dan serutan kayu. B. Ekstraksi Rotatori evaporator, erlenmeyer, blender, water bath, spatula, dan kertas saring. C. Uji Efek Anti-inflamasi Ekstrak Kulit Petai Spuit, alat inkubasi, mikropipet, microtube, blue tip, yellow tip, alat pencekok oral (gavage), magnetic stirrer, timbangan, botol kaca, spatula, dan cawan petri. D. Pemeriksaan Volume Radang Kaki Mencit Pletismometer air raksa. E. Uji Toksisitas Terhadap Hepar Mikroskop, mikrotom, obyek glass, cover glass, tissue, dan hot plate. F. Uji Flowcytometri Flowcytometer, cawan petri, label, kuvet, ice box, lampu spirtus, hand tally counter, hemositometer, mortar dan penggerus, wire, tabung propilen, sentrifuge dingin, mikropipet, microtube, blue tip, yellow tip, komputer, dan software Cell Quest. c. Variabel Penelitian Variabel Penelitian ini terdiri dari : 1. Variabel Terikat (Dependent variable) : Volume kaki mencit, kadar ekstrak terhadap toksisitas hepar, dan perubahan histologi dari hepar. 2. Variabel Bebas (Independent variable) : Dosis pemberian ekstrak kulit petai dan injeksi adjuvant. 3. Variabel kontrol : Strain mencit, jenis kelamin, umur, jumlah pakan, proses pemeliharaan, kandang mencit, cara pemberian perlakuan, dan konsenstrasi ekstrak kulit petai yang diinjeksikan. d. Langkah Penelitian 1. Persiapan dan Perawatan Hewan Coba Hewan coba yang digunakan dalam penelitian ini adalah 48 ekor mencit Balb/c yang sehat dengan umur kurang lebih 6-8 minggu dan berat badan ±25 gram. Hewan coba dimasukkan ke dalam beberapa kandang berlabel berisi serutan kayu dan berpenutup ram-raman kawat. Selain itu, mencit diberi makanan berupa pelet berbentuk biskuit dan air mineral dalam jumlah cukup. Hewan coba diaklimatisasi selama tujuh hari agar dapat beradaptasi pada lingkungan yang baru. 2. Ekstraksi Kulit petai yang segar (tidak busuk) diperoleh dari pedagang petai kupas di sekitar Pasar Kebalen Kota Malang. Kulit petai dicuci dengan air mengalir hingga bersih dan dikeringkan di bawah sinar matahari hingga diperoleh simplisia kering. Simplisia kering dipotong-potong dan diblender sampai menjadi bubuk kasar. Bubuk kasar sebanyak 100 gr dimaserasi dengan etanol absolut sebanyak 50 ml. Ekstrak yang dihasilkan disaring dan diuapkan dalam waterbath yang dipanaskan. Crude ekstrak berupa pasta, berwarna coklat tua, dan berbau khas diambil dan diletakkan dalam botol film berpenutup, kemudian disimpan dalam lemari pendingin bersuhu 4°C. 3. Induksi RA tahap 1 dan tahap 2 (booster)
4
Induksi RA tahap pertama diawali dengan melarutkan 100 µg serbuk Ovalbumin (OVA) dengan 50 µl PBS. OVA yang telah larut diemulsikan dengan Complete Freund Adjuvant (CFA) sebanyak 50 µl dengan cara divorteks hingga terbentuk emulsi yang stabil. Setiap mencit pada seluruh kelompok perlakuan kecuali kelompok kontrol negatif, diinjeksi dengan hasil emulsi OVA dan CFA sebanyak 100 µl pada bagian pangkal ekor dengan spuit steril 1 ml secara subkutan. Bagian ekor diusap dengan alkohol 70% sebelum dan setelah diinjeksi. Mencit yang telah diinjeksi diinkubasi selama 3 minggu untuk kemudian dilakukan booster (injeksi ke dua). Booster dilakukan dengan cara menginjeksikan emulsi OVA dengan Incomplete Freund Adjuvant (IFA) yang dibuat seperti sebelumnya. Emulsi tersebut diinjeksikan pada kedua telapak kaki belakang (50 µl setiap telapak kaki) menggunakan spuit steril 1 ml dan diinkubasi selama 1 minggu hingga terbentuk RA pada kaki mencit. 4. Pemeriksaan Volume Radang Kaki Mencit Mencit yang telah mengalami RA ditandai dengan timbulnya pembengkakan pada kaki. Perubahan volume kaki mencit setelah diinjeksi RA diukur dengan menggunakan plestimometer air raksa. Pengukuran volume kaki mencit juga dilakukan setelah 2 minggu perlakuan pemberian ekstrak etanol kulit petai secara oral. 5. Pemberian Perlakuan Ekstrak Etanol Kulit Petai secara Oral Mencit ditimbang dan dihitung rata-rata berat badannya (BB). Crude ekstrak kulit petai hasil ekstraksi ditimbang berdasarkan dosis dan BB mencit, kemudian dilarutkan dengan akuades hingga diperoleh volume sediaan yang diinginkan. Kelompok perlakuan diberi volume sediaan sesuai dengan dosis yang ditentukan. Pemberian sediaan ekstrak kulit petai secara oral dilakukan selama 14 hari. Kelompok kontrol positif dan negatif tidak diberi perlakuan pemberian ekstrak kulit petai secara oral. 6. Pembedahan Seluruh mencit yang digunakan dalam penelitian didislokasi pada bagian leher dan dibedah untuk diisolasi organ spleen dan heparnya. Organ spleen yan diperoleh direndam dalam larutan PBS dan diperlakukan hingga diperoleh suspensi pelet. Suspensi pelet diambil sebanyak 20 µl dan diresuspensi dengan 80 µl Evans Blue. Jumlah sel yang masih hidup dari resuspensi tersebut dihitung menggunakan hemocytometer untuk perhitungan jumlah absolut sel. Sedangkan hepar mencit diawetkan dalam larutan formalin 4 % untuk dijadikan preparat. 7. Uji Toksisitas Terhadap Hepar Pengujian ini dilakukan dengan parafinasi dan deparafinasi jaringan hepar mencit. Kemudian dilakukan tahap rehidrasi yang dilanjutkan dengan perendaman preparat dalam aquadest selama 15 menit. Ditetesi pewarna Hematoksilin Eosin dan diinkubasi sebelum dicuci dengan alkohol seri. Alkohol selanjutnya diserap dengan kertas hisap. Preparat dimasukkan dalam larutan xylol selama 10 menit dan ditetesi entelan untuk kemudian ditutup dengan cover glass. Preparat yang telah jadi diamati dengan mikroskop untuk menentukan jumlah sel hepar yang mengalami nekrosis. 8. Pengujian Pengaruh Ekstrak Kulit Petai terhadap Jumlah Sel T (Uji Flowcytometry) Spleen diletakkan pada cawan petri dan digerus dalam PBS. Sampel spleen disaring menggunakan wire. Homogenat ditampung dalam propilen hingga mencapai volume 10 ml dan disentrifugasi pada kecepatan 2500 rpm, suhu 4˚C selama 5 menit. Pelet kemudian ditambah PBS 1 ml dan dihomogenkan. Homogenat kedua kemudian diambil 50 µl dan diletakkan dalam mikrotube berisi 500 µl PBS untuk disentrifugasi kembali. Supernatan dibuang, pelet yang ada kemudian ditambah 50 µl larutan antibodi (Anti CD-4 dan Anti CD-8). Pelet yang telah distaining dengan antibodi diresupensi dengan 300 µl PBS, lalu dimasukkan dalam kuvet dan dirunning pada alat BD FACS Calibur TM flowcytometer. Jumlah sel relatif yang diperoleh dari analisis flowcytometry akan digunakan untuk menghitung jumlah absolut sel. Data yang diperoleh dianalisa dengan software CellQuest dan diuji dengan analisa statistik ANOVA ( Analysis of Variance) dengan P < 0,05. IV. PELAKSANAAN PROGRAM 1) Waktu dan Tempat Pelaksanaan Pembuatan, revisi, dan pengajuan proposal dilakukan pada bulan Oktober 2012. Penelitian hingga pembuatan laporan akhir dilakukan sejak bulan Maret sampai bulan Juli 2013.Tempat untuk penelitian ini yaitu di Laboratorium Anatomi Fisiologi Hewan, Animal Room, dan Laboratorium Kimia, Universitas Brawijaya Malang.
5
2) Tahapan Pelaksanaan Tabel 1. Jadwal Faktual Pelaksanaan
3) Instrumen Pelaksanaan Penelitian ini dilaksanakan dengan menggunakan berbagai bahan dan perlatan pendukung. Bahan yang digunakan diantaranya yaitu berupa hewan coba mencit Balb/C, kulit petai, etanol absolut, CFA, IFA, Ovalbumin, Anti CD-4, Anti CD-8, dan berbagai reagen pendukung lainnya. Peralatan yang dibutuhkan diantaranya meliputi peralatan perawatan mencit, peralatan ekstraksi, alat cekok oral, plestimometer air raksa, peralatan bedah dan flowcytometry, serta peralatan pembuatan preparat hepar. Data yang diperoleh dianalisa dengan software CellQuest dan diuji dengan analisa statistik ANOVA ( Analysis of Variance) dengan P < 0,05. 4) Rekapitulasi Rancangan dan Realisasi Biaya Rekapitulasi rancangan Tabel 2. Rekapitulasi Rancangan
Realisasi Biaya Tabel 3. Realisasi Biaya
6
V.
HASIL DAN PEMBAHASAN Pelaksanaan penelitian ini menghasilkan beberapa data yang kemudian diolah dan dianalisis secara statitik. Hasil yang diperoleh adalah sebagai berikut : a. Data Rata-Rata Berat Badan Mencit Data rata-rata berat badan mencit berdasarkan hasil yang diperoleh diketahui menunjukkan hasil beragam (Grafik1). Peningkatan berat badan terlihat pada kelompok perlakuan kontrol negatif, kontrol positif, dan dosis 25 mg/kgBB. Mencit dengan perlakuan ekstrak kulit petai dosis 50mg/kg BB dan 100mg/kgBB mengalami penurunan rata-rata berat badan.
Grafik 1. Perbandingan Rata-Rata Berat Badan Mencit Sebelum dan Setelah Perlakuan 3.2. Data Rata-Rata Volume Kaki Mencit Rheumatoid arthritis pada mencit ditandai dengan sendi-sendi menjadi merah, bengkak, sakit, dan sensitif. Hal ini terjadi karena jaringan pelapis dari sendi meradang sehingga produksi cairan sendi menjadi berlebihan (Nelson, et all., 1996). Pemberian terapi ekstrak kulit petai terhadap kelompok perlakuan dosis menunjukkan efek perubahan volume inflamasi kaki yang berbeda-beda jika dibandingkan dengan kelompok perlakuan yang tidak diberi ekstrak kulit petai (Grafik 2).
7
(a) (b) Grafik 2. Perubahan Rata-Rata Volum Kaki Mencit. (a) Rata-Rata Volum Kaki Kiri dan (b) Rata-Rata Volum Kaki Kanan Rata-rata volume kaki kanan mencit berkurang setelah diberi perlakuan ekstrak kulit petai dengan dosis 50 mg/kg BB dan 100mg/kgBB. Sedangkan volume kaki kanan maupun kaki kiri dari mencit kontrol mengalami kenaikan. Kaki kiri mencit dengan perlakuan dosis 25mg/kgBB, 50 mg/kgBB, dan 100mg/kgBB tidak mengalami perubahan. 2.3. Hasil Analisis Flowcitometry Seluruh mencit yang diberi perlakuan masih dalam keadaan sehat, berdasarkan hasil analisis Flowcitometry yang diperoleh. Presentase jumlah relatif sel CD4+ menunjukkan hasil yang berbeda jika dibandingkan dengan persentase jumlah relatif sel CD8 + (Gambar 2. (a)). Rata-rata persentase jumlah relatif sel CD4+ yang paling tinggi diperoleh dari perlakuan dengan dosis ekstrak kulit petai 25mg/kgBB, sedangkan jumlah relatif sel CD8+ tertinggi ditunjukkan oleh perlakuan kontrol negatif. Selain itu, rata-rata persentase jumlah relatif sel CD4+ lebih tinggi jika dibandingkan dengan jumlah relatif sel CD8+ (Grafik 3. (a)).
(a) (b) Gambar 2. Persentase Jumlah Sel T CD4+ dan CD8+ pada Setiap Perlakuan (a) Persentase Jumlah Relatif dan (b) Persentase Jumlah Absolut
Grafik 3. Analisa Statistik Rata-Rata Jumlah Sel T CD4 dan Sel CD8 pada Setiap Perlakuan (a) Rata-Rata Presentase Jumlah Relatif dan (b) Rata-Rata Jumlah Absolut
8
Presentase jumlah absolut sel T CD4+ dan CD8+ pada organ spleen dari kelompok perlakuan terdapat perbedaan (Gambar 2. (b)). Jumlah absolut sel T CD4 + secara umum lebih tinggi dibandingkan dengan sel T CD+ + (Grafik 3. (b)). Jumlah absolut sel T CD4+ meningkat secara signifikan (p< 0.05) dari 6 juta sel menjadi 202 juta sel pada dosis 50 mg/kgBB. Pemberian ekstrak etanol kulit petai juga menunjukkan peningkatan pada dosis 25 mg/kgBB jika dibandingkan dengan kontrol positif (tidak diberi injeksi dan ekstrak). Peningkatan terendah terjadi pada dosis 100 mg/kgBB yaitu sebesar 25 juta sel. Namun, peningkatan ketiga kelompok perlakuan tersebut tidak signifikan (p>0.05). Sedangkan jumlah absolut sel T CD8 mengalami peningkatan pada kelompok dosis dan kelompok kontrol negatif, namun peningkatan tersebut tidak signifikan jika dibandingkan dengan kontrol positif. Jumlah absolut sel T CD8 + pada dosis 25 mg/kgBB sebesar 17 juta sel dan pada dosis 100 mg/kgBB hanya sebesar 14 juta sel. Hasil tersebut menunjukkan penurunan jumlah sel jika dibandingkan dengan kelompok yang hanya diberi injeksi RA tetapi tidak diberi ekstrak kulit petai (kontrol negatif). Dosis 50 mg/kgBB mengalami peningkatan yang signifikan jika dibandingkan dengan kontrol, yakni mencapai 202 juta sel. Aktivasi dari sel T berpengaruh terhadap penyakit RA. Hal ini dikarenakan sel T berperan pada inflamasi, aktifasi fagositosis makrofag, aktivasi dan proliferasi sel B dalam produksi antibodi. Sel T naif yang terpajan dengan kompleks antigen MHC dan dipresentasikan APC akan berkembang menjadi subset sel T berupa CD4+ dan CD8+. Sel CD4+ ini akan berkembang menjadi subset sel Th1 atau Th2 dan mensintesis sitokin yang mengaktifkan fungsi sel imun lain seperti sel CD8+. Sel T CD8+ naif yang keluar dari timus atau CTL/Tc dapat juga menghancurkan sel terinfeksi bakteri intraseluler (Baratawidjaja dan Iris, 2010). Penyebab lain dari rheumatoid arthritis adalah autoantibodi. Hilangnya efektivitas sistem imun biasanya disebabkan oleh perubahan kompartemen sel T yang terjadi sebagai hasil involusi timus untuk menghasilkan interleukin 10 (IL-10). Risiko imun ditandai dengan ratio CD4:CD8 < 1, lemahnya proliferasi sel T in vitro, peningkatan jumlah sel-sel CD8+CD28-, dan sedikitnya jumlah sel B (Sucio-Foca, et all., 2003). Pemberian ekstrak kulit petai diharapkan dapat menekan jumlah sel T penghasil sitokin proinflamasi. Namun, hasil menunjukkan bahwa pemberian ekstrak jutsru meningkatkan jumlah sel T CD4+ dan CD8+ yang memicu inflamasi. Hal ini sesuai dengan pernyataan Baratawidjaja dan Iris (2010) bahwa sel CD4+ yang mengenali antigen akan berkembang menjadi subset Th1 untuk mensekresi INFγ. Sel CD4+ juga dapat memproduksi IL-2 yang berpengaruh pada peningkatan proliferasi sel CD8+. Sel CD8+ berkembang lebih cepat dan terus mensekresi sitokin termasuk seperti TNFα dan INFγ yang merangsang terjadinya inflamasi. 2.4 Analisis Toksisitas Hepar Persentase jumlah sel hepar yang mengalami nekrosis berdasarkan hasil penelitian pada pemberian ekstrak kulit petai dosis 25 mg/kgBB, 50 mg/kgBB, dan 100 mg/kgBB menunjukkan perbedaan jika dibandingkan dengan kelompok kontrol negatif maupun positif (Grafik 4). Tingkat kerusakan sel hepar semakin meningkat sesuai dengan meningkatnya dosis. Kelompok dosis 100 mg/kgBB menunjukkan tingkat kerusakan yang terberat dibandingkan dengan kelompok perlakuan lain. Hal ini dibuktikan dengan jumlah sel nekrosis yang mencapai 57%. Kelompok dosis 50 mg/kgBB memiliki tingkat kerusakan lebih besar dibandingkan dengan kelompok dosis 25 mg/kgBB namun lebih ringan dibandingkan kelompok dosis 100 mg/kgBB karena sel nekrosis yang teramati sebesar 20%. Hasil yang diperoleh tersebut menunjukkan bahwa pemberian ekstrak kulit petai pada dosis 50 mg/kgBB dan 100 mg/kgBB dalam jangka waktu lama dapat menimbulkan toksisitas.
Grafik 4. Persentase Sel Hepar yang Mengalami Nekrosis pada Setiap Perlakuan
9
Dosis yang meningkat menyebabkan kerusakan yang semakin berat. Hal ini sesuai dengan teori dosis-respon. Teori ini menyatakan bahwa dosis yang besar dapat menimbulkan kerusakan sel hepar yang lebih besar pula. Jenis zat, dosis yang di berikan, dan lamanya paparan merupakan beberapa faktor yang berpengaruh terhadap kerusakan hepar (Firdaus dan Gugum, 2010). Toksisitas dipengaruhi oleh beberapa faktor. Faktor yang nyata adalah dosis dan lamanya pajanan. Faktor lain yang juga berpengaruh yaitu spesies dan strain hewan, jenis kelamin, umur, serta status gizi dan hormonal. Efek toksik juga dapat di pengaruhi oleh zat kimia lain yang diberikan bersamaan (Arianti dan Rini, 2012). Sesuai dengan hasil yang diperoleh dapat diketahui bahwa dosis optimal untuk anti-inflamasi belum dapat ditentukan karena pemberian ekstrak kulit petai dengan dosis 50 mg/kgBB dan 100 mg/kgBB menyebabkan terjadinya penurunan volume kaki mencit dan meningkatnya sel T CD4 + dan CD8+, namun disisi lain juga menimbulkan toksisitas yang ditandai dengan besarnya jumlah sel nekrosis pada hepar. VI. KESIMPULAN DAN SARAN Sesuai dengan hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa terdapat efek anti-inflamasi dari ekstrak ethanol kulit petai (Parkia speciosa Hassk) yang dibuktikan dengan penurunan volume kaki mencit yang mengalami pembengkakan dan terjadi peningkatan jumlah sel T CD4 + dan CD8+ setelah pemberian ekstrak selama dua minggu. Dosis ekstrak kulit petai yang optimal untuk menyembuhkan Rheumatoid Arthritis belum dapat ditentukan karena pemberian ekstrak ternyata juga menyebabkan terjadinya toksisitas pada sel hepar. Berdasarkan hasil penelitian, maka diperlukan penelitian lebih lanjut mengenai penggunaan dosis antara 25 dan 50 mg/kgBB untuk mengetahui dosis yang optimum dan pemberian ekstrak kulit petai dalam jangka waktu yang lebih lama untuk menentukan perubahan volume kaki yang lebih signifikan. VII. DAFTAR PUSTAKA Arianti, Rini. 2012. Aktivitas Hepatoprotektor dan Toksisitas Akut Ekstrak Alang-Alang (Imperata cylindrica ).www. repository.ipb.ac.id. Diakses 20 Juli 2013. Baratawidjaja, Karnen G, Iris R. 2010. Imunologi Dasar Edisi ke-9. Jakarta : Balai Penerbit FKUI. Brunner, Suddart. 2002. Buku Ajar Keperawatan Medikal Bedah. Jakarta : Buku Kedokteran EGC. Corwin EJ. 2012. Buku Saku Patofisiologi. Jakarta : Gramedia. Dewi LK. 2011. Pengaruh Pemberian Ekstrak Etanol Daun Sirsak ( Annona muricata Linn.) terhadap Peningkatan jumlah Anti-Cd 4 Dan Anti- Cd8. Malang : Biologi Universitas Brawijaya. Fauziyah N. 2008. Efek Antiinflamasi Ekstrak Etanol Daun Petai Cina (Leucaena glauca, Benth) Pada Tikus Putih Jantan Galur Wistar. www.readbag.com. Diakses 8 September 2012. Firdaus, Gugum. 2010. Uji Toksisitas Aku Ekstrak Meniran (Phyllanthus niruri) terhadap Hepar Mencit Balb/C . www.eprints.undip.ac.id. Diakses 20 Juli 2013. Janeway, Charles A, Travers P. 2001. Immunobiology. New York : Garland Publishing. Karim A, Azrina A. 2012. Review: Fruit Pod Extracts as a Source of Nutraceuticals and Pharmaceuticals. www.mdpi.com/journal/molecules. Diakses 20 Oktober 2012. Kurniawan FA. 2012. Kulit Petai Mampu Cegah Kanker. www.surabayapost.co.id. Diakses 23 Oktober 2012. Nelson WE, Behrman RE, Kliegman RM, Arvin AM. 1996. Nelson Textbook of Pediatrics 15th ed. USA : WB Saunders Company Nus. 2011. Parkia speciosa Hassk. www.rmbr.nus.edu. Diakses 20 Oktober 2012. Pdpersi. 2011. Radang Sendi Memicu Jantung. www.pdpersi.co.id. Diakses 11 September 2012. Plantamor. 2008. Klasifikasi Botani Petai. www.plantamor.com. Diakses 11 September 2012. Shlomchik M. 2001. Immunobiology. New York : Garland Publishing. Suciu FN, Manavalan JS, Cortesini R. 2003. Generation and Function of Antigen-Specific Suppressor and Regulatory T Cells. Transpl. Immunol. 11:235-244. Williams, Wilkins. 1997. Arthritis and Allied Condition : Texbook of Rhemathology. 13th Edition Volume One. Pennsylvania : A Waverly Company. Winarno FG. 1995. Kimia Pangan dan Gizi. Jakarta: PT Gramedia Pustaka Utara. Yatim F. 2006. Penyakit Tulang dan Persendian (Arthritis atau Arthralgia). Jakarta : Pustaka Populer Obor. Lampiran Dokumentasi Kegiatan
10
Lampiran Bukti Kuitansi Realisasi Biaya
