BIOTECHNOLÓGIÁK EGYÉB IPARÁGAKBAN Középkori falfestmények restaurálása biotechnológiai eljárással Tárgyszavak: műemlékvédelem; biotechnológia; kazeinbontás; enzimimmobilizálás. A falfestmények konzerválását a XX.század második felében kazeines bevonással végezték. Az akkori elképzelés szerint ez mintegy 40-50 évre nyújtott védelmet a falfestmények felpúposodása és leomlása ellen. Meglepetéssel tapasztalták azonban, hogy 30 év elteltével a károsodás sokkal erőteljesebben jelentkezett, mint korábban a kazeines kezelést megelőzően. A szakemberek egyöntetű véleménye az volt, hogy a jelenséget a kazeinbevonat öregedése váltotta ki, aminek következtében a réteg rendkívül megkeményedett, páncélszerűvé vált. Egyetlen megoldás kínálkozott, a kazein minél gyorsabb és tökéletes eltávolítása a falfestményekről. A biotechnológiát már más esetben is sikeresen alkalmazták műemlékek restaurálásánál, illetve freskók konzerválásánál. A biotechnológiai módszer előnye minden egyéb kémiai vagy fizikai eljárással szemben az, hogy a kezelés kíméletes és a műemlék károsodása nélkül végezhető el. A kazeinréteg eltávolítása többféle módszerrel történhet. Ezek közé tartozik a különböző oldószerekkel végzett mechanikai tisztítás. Oldószerként rendszerint egészségkárosító szerves vegyületeket, pl. diklór-metánt, hangyasavat vagy etil-alkoholt alkalmaznak. Az enzimes kezelés vizes közegben végezhető, ami a restaurátorokra nézve kifejezetten előnyös. A jól megválasztott hordozóra rögzített enzim többször is felhasználható.
Anyagok és módszerek Enzimaktivitás meghatározása A kísérleti körülményeket is mérlegelve több proteolitikus enzim közül választották ki a legalkalmasabbat. A vizsgált enzimeket az 1. táblázat tartalmazza. Az enzimaktivitást Bradford-módszerrel határozták meg. Az eljárás lényege, hogy olyan festéket adnak az oldathoz, amelyik a bontatlan fehérjével kékszínű komplexet képez. A színintezitás a fehérje mennyiségével arányos. A meghatározásnál a következő összetételű oldatokat használták: a 0,01 %(V/V) Coomassie Brilliant Blue festéket 4,7 %(V/V) H3PO4 és
8,5 %(V/V) etanol elegyében oldva. Az oldathoz 30 másodpercenként 20 µl előemésztett mintát adtak. A 0,1–2,0 g/l kazeintartalmú oldat emésztését 0,1 %(V/V) natív enzimoldattal végezték (pH 8,3). Az oldat abszorpcióját λ = 595 nm hullámhosszon mérték meg. Az enzimek kinetikai paramétereit EPU (esterolytic protease unit, észterbontó proteáz egység) teszttel határozták meg, szubsztrátként 2,5–15 mg/l N-CBZ-L-valin-p-nitro-fenil észtert használtak. Az észterkötés hasításakor keletkező sárga színű p-nitro-fenol abszorpcióját átfolyó küvettában (Vössz= 5 ml) és automata analizátorral határozták meg 340 nm hullámhosszon. Az átfolyó küvettában az oldat áramlási sebessége 0,95 ml/min volt. Az adatgyűjtést és feldolgozást CAFCA (computer assisted flow control analysis) programmal végezték. A mérésekhez Cary 50 UV/VIS spektrofotométert használtak. 1. táblázat A vizsgált fehérjebontó enzimek Megnevezés
E.C. szám
Fajlagos aktivitás
Gyártó cég
Alcalase ® 2,4 L (technikai)
3.4.21.62
2,4 ⋅ 10-3 AU/mg*
Novo Nordisk
Alcalase® 2,5 DX L
3.4.21.62
2,5 ⋅ 10-3 AU/mg
Novo Nordisk
α-Kimotripszin
3.4.21.1
350 U/mg
Merck
Elastase
3.4.21.36
30,0 U/mg
Merck
Esperase®
3.4.21.62
8,0 ⋅ 10-4 KNPU/mg**
Novo Nordisk
Savinase®
3.4.21.62
1,6 ⋅ 10-2 KNPU/mg
Novo Nordisk
Szubtilizin A
3.4.21.14
6,0 ⋅ 10-4 AU/mg
Merck
Tripszin
3.4.21.4
40 U/mg
Merck
* Anson egység. ** Kilo Novo proteáz egység.
Immobilizációs eljárások Az enzimhordozók kiválasztását a Sartorius céggel közösen végezték. Az aktivált növényi és állati eredeti természetes rostokon (cellulóz és keratin) kívül megvizsgálták a Sartorius cég különböző membránjait is. A cellulóz és keratin aktiválását három módszerrel végezték: 1. Epoxidos aktiválás és enzimrögzítés: 30% hordozót, 5% epiklórhidrint és 0,4 M NaOH-oldatot 40 °C-on 2 órán át kevertek, a rögzítést ugyanolyan módszerrel végezték, mint membrán esetén. 2. Glutáraldehides aktiválás és rögzítés: 500 mg hordozóhoz 5 ml 2,5% glutáraldehidet adtak, és szobahőmérsékleten 1 órán keresztül inkubál-
ták. Az öblítést 20 ml ionmentes vízzel a membránoknál alkalmazott módszer szerint végezték, ezt követően 2 ml 5 µl natív proteázt tartalmazó 0,1 M foszfátpuffer oldattal (pH 7,5) 5 °C-on 24 órán át inkubálták. 3. Cián-bromidos aktiválás és rögzítés: száraz hordozó grammjára számított 20 mg CNBr-ot 300 µl 30 %(V/V) acetonban oldottak, és az oldatot hozzáadták a hordozóhoz. A mintát lehűtötték –15 °C-ra, és 3 perc alatt 179 µl 30 %(V/V) acetonban oldott 1,5 M trietil-amin-oldatot csepegtettek hozzá. A mintát ezután először 2 ml 30 %(V/V) acetontartalmú 0,1 M sósavval, majd 2 ml 30 %(V/V) acetonnal, végezetül 2 ml 0,1 M karbonátpufferrel (pH 9,5) mosták át. A rögzítést a membránoknál alkalmazott módszerrel végezték. Minden membránra rögzítést 2 ml-es kémcsőben végeztek, amelybe 5 %(V/V) natív proteáz oldatot 0,1 M foszfátpufferben mértek be (pH 7,5), és 40 °C-on 750 ford/min sebességgel 24 órán át keverték. Immobilizálás után az enzimmel terhelt hordozót háromszor átmosták 0,01 mólos foszfátpufferral (pH 7,5). A mintákat 2 ml 0,1 mólos foszfátpufferben (pH 7,5) 4 °C-on tárolták a felhasználásig. A rögzített enzim aktivitását automata analizátorral határozták meg. Az enzim mennyiségét 100 mg hordozóra vagy 1 cm2 membránfelületre vonatkoztatva adták meg. A membránon megkötött enzim mennyiségét standard fehérjeméréssel határozták meg, és ebből következtettek a membrán fehérjemegkötő kapacitására. A mérés BCA-módszerrel (bicinchoninic acid) történt. A festékoldat az A és B oldatok 1:50 arányú elegyéből állt. Az A oldat 1,0% BCA, a B oldat 4% CuSO4 ⋅ 5 H2O oldat volt. A festék az oldott natív fehérje mennyiségével arányos intenzitású kékszínű komplexet képez, amely 560 nm hullámhosszon abszorbeál. A meghatározást mikrotiter lemezen végezték, amelyre 20 µl mintát és 300 µl reagenst vittek fel. A kalibrációhoz 1,0 mg/ml koncentrációjú BSA (szarvasmarha szérum albumin) oldatot készítettek. Az enzimrögzítési művelet során keletkező valamennyi mosófolyadékot megvizsgáltak, három hígításban (1:1, 1:10, 1:20) megmértek a leoldott fehérjemolekulákat, és ezt összegezve számították ki a membránon megkötött enzim mennyiségét. Kazeinmeghatározási módszerek A falfelület kazeintartalmának roncsolásmentes meghatározására a spektroszkópos módszerek közül a kétdimenziós (2D) fluoreszcens spektroszkópia vált be (F 4500, Hitachi). Az üvegszáloptikával gerjesztették a mintákat, és az emissziót mérték. 5 nm résszélesség mellett a gerjesztés 250–350 nm közötti hullámhosszon, az emissziómérés λ = 300–400 nm hullámhosszon történt. A intenzitást relatív egységben adták meg. A rendszert RP-HPLC (fordí-
tott fázisú nagy teljesítményű folyamadékkromatográfia) módszerrel kalibrálták, amelyhez egy különleges, fényzáró adaptert készítettek. A fehérjehidrolízist kétféle módon ellenőrizték. Egyrészt aminosavmeghatározást végeztek, ill. a bontás során keletkező különböző peptideket határozták meg. Az aminosav-meghatározás 150×3,9 mm RP-C18 oszlopon 30 °C-on történt. Az alkalmazott A oldat 0,05 M NaCH3COO + 0,05 M NaH2PO4 (pH 7), a B oldat ionmentes vízzel hígított 54 %(V/V) metanol volt, elúciós gradiens 0–50 min. Detektáláshoz az aminosavak aminocsoportjával komplexet képező o-ftáldialdehidet (OPA) használtak. A komplex mérhető fluorszcens detektorral (RF-535), gerjesztéssel és emisszióval (gerjesztési hullámhossz: 330 nm, emissziós hullámhossz: 460 nm). Az emésztési rakció során keletkező különböző peptideket 30 °C-on RPC18 100-5 C18 AN oszlopon vizsgálták. Az A oldat ionmentes vízben oldott 0,1 %(V/V) TFA és a B oldat 80 %(V/V) acetonitrilben oldott 0,1 %(V/V) TFA volt, elúciós gradiens 0-5 perc. A mérést 214 nm hullámhosszon, a peptidkötés abszorpciós sávján UV/VIS detektorral, f = 0,3 ml/min áramlási sebesség mellett végezték. Mérési elrendezés A kazein enzimes bontásához egy különleges kialakítású 7,1 cm2 felületű membránpárnát terveztek. Az enzimmel terhelt membránt hab alátétre helyezték, amelyet egy henger alakú acélházba rögzítettek. Az enzimet hordozó membránpárnán 1,4 ml/min sebességgel 0,1 M NaHCO3/Na2CO3 (pH 9,0) oldatot áramoltattak át. Az így enyhén megnedvesített enzimtartalmú párnát kissé megnyomva helyezték fel a falfelületre, ezáltal az egyenetlen érdes felülettel is jó érintkezést biztosítottak. A rögzítés menynyezeten és boltíveken egyaránt alkalmazható volt.
Eredmények és kiértékelés A proteolitikus enzimek vizsgálata Az 1. táblázatban felsorolt fehérjebontó enzimek közül választották ki a rögzítésre legalkalmasabb kazeinbontó proteázt. A vizsgált nem szelektív szerin proteázokat baktériumokból izolálták. Az Asp32, Ser221 és His64 aktív centrummal rendelkező szerin proteázok igen jól bontották a kazeint (1. ábra). A vizsgálatokat vizes közegben végezték, így pontosan be lehetett állítani az oldat kazeinkoncentrációját. Legnagyobb aktivitást a kereskedelemben kapható Alcalase® 2,5 DX L enzimkészítménynél mértek (vmax = 7,35±5,31 µm/l ⋅ s. Az Alcalase® 2,5 DX L enzim tipikus nem szelektív szerin proteáz, amelyet igen elterjedten használ-
nak a gyakorlatban olyan esetekben, amikor a teljes hidrolízis kívánatos, pl. mosószereknél. Az EPU-teszttel meghatározott kinetikai paraméterek is kedvezően alakultak (3,1±0,34 ⋅ 106 U/l), ezenkívül az enzim 4 °C-on hosszú időn át igen stabil, felezési ideje 13,7 hónap. Alcalase 2,5 DX L
Savinase
Alcalase 2,4 L
Esperase
Szubtilizin A
Kimotripszin
Elastase
Tripszin
2,2
kazeinkoncentráció (mg/ml)
2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0
2
4
6
8
10
bontási idő tp (min)
1. ábra A kazeinbontó enzimek vizsgálata Bradford-módszerrel (kísérleti körülmények: 10 ml 2 g/l kazein, pH 8,3, 0,1 %(V/V) enzim, T = 25 °C, r = 750 ford/min) A kinetikai vizsgálatoknál és az enzimrögzítésre legalkalmasabb hordozó kiválasztásánál egyaránt az EPU-tesztet alkalmazták nemcsak azért, mert egyszerűbben kivitelezhető, mint a Bradford-módszer, hanem mert érzékenyebb is. A további optimálási kísérletek már csak Alcalase® 2,5 DX L enzimtartalmú rendszerrel folytak. Enzimrögzítés A legjobb hidrolitikus aktivitású immobilizált enzim az epoxiddal funkcionalizált cellulóz-acetát membrán hordozóra (Sartobind Epoxymembran 18706) rögzített Alcalase® 2,5 DX L enzim volt (látszólagos vmax =3,24±0,42 µmól/l ⋅ s, EPU-teszt szerint) (2. ábra).
Vmax(mol/l ⋅ s)
3,0x10-6
2,0x10-6
1,0x10-6
0,0 1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
a hordozó sorszáma
(1, 2, 3 – pamut, 4, 5, 6 – birkagyapjú, 7 – T60-membrán, 8 – T103-membrán, 9 – epoxid membrán, 10 – perjodát membrán, 11 – Satrobind S – 18842, 12 – Sartobind Q – BJ 61,2)
2. ábra A különböző hordozókra rögzített Alcalase® 2,5 DX L látszólagos vmax értékei A keratinrostra (birkagyapjú) rögzített Alcalase® 2,5 DX L enzimaktivitása is magas volt (vmax = 6,25±0,94 ⋅ 10-1 µmól/l ⋅ s), de mivel az enzim magát a keratinrostot is bontotta, a rendszer nem volt stabil. Az aldehiddel aktivált cellulóz-acetát membránon rögzített enzim aktivitása is megfelelt volna (vmax = 1,81±0,29 µmól/l ⋅ s), de a rögzítés nem stabil, és az enzim már a harmadik felhasználás során lemosódott a hordozóról. A további kísérletek a Sartobind Epoxymembran 18706 membránnal folytak. A membránra rögzített Alcalase® 2,5 DX L fehérjekötő kapacitását BCA módszerrel határozták meg. Az eredmény 37,25±1,86 µg/cm2, jól egyezett a BSA módszerrel mért 50 µg/cm2 fajlagos fehérjekötő kapacitással. A felületegységre vonatkozó enzimaktivitás 0,49±0,06 U/cm2 volt. A kazeinbontási folyamat elemzése A kazeinmeghatározás a fehérjében levő aminosav, a triptofán belső fluoreszcenciája alapján történt. A triptofán 288 nm hullámhosszon abszorbeál és 336 nm hullámhosszon fluoreszkál. Triptofánt elsősorban az αs1- és αs2-kazein tartalmazza, amelyek a kazeinmolekula erősen hidrofób tartományában helyezkednek el (Trp164 és Trp199). A kötésben levő triptofán fluoreszcenciája nagymértékben függ a környezet hidrofóbiájától. A kazeinben előforduló másik két aminosav, a tirozin és fenilalanin is mutat belső fluoreszcenciát, de ezek intenzitása igen gyenge. A hidrolízis során a hidrofób környezetből felszabaduló triptofán és bomlástermékei vizes közegbe kerülnek. A folyamat előrehaladtával egyre csökken
a triptofán fluoreszcenciája, és az eredeti hullámhosszak helyett 290 nm és 360 nm-en adnak jelet. A kötésben levő triptofán 288 nm-en és 336 nm-en mért fluoreszcencia-maximumaiból számítható az oldat kazeinkoncentrációja. Az exponenciális lefutású görbe, amit a kazeinkoncentráció csökkenésével arányos fluoreszcenciajel mutat, megegyezik a Bradford-módszerrel kapott eredménnyel, a hiba 5%-nál kisebb (3. ábra). Ez megerősíti azt a feltételezést, hogy a 2D fluoreszcencia módszer alkalmas a kazeinproteolízis folyamatának nyomon követésére.
1000
2,2 Bradford-módszer 2D fluoreszcencia
2,0
800
1,6 1,4
600
1,2 1,0
400
0,8 0,6
relatív fluoreszcencia
kazeinkoncentráció, (g/l)
1,8
200
0,4 0,2 0
2
4
6
8
10
bontási idő tp (min)
3. ábra A 2D fluoreszcenciamérés és a Bradford-módszerrel kapott kazein-proteolízis eredményei (kísérleti körülmények: 10 ml 2 g/l kazein, pH 8,3, 0,1 %(V/V) enzim, T = 25 °C, fordulatszám = 750 ford/min) A hidrolízis megindulását RP-HPLC módszerrel ellenőrizték. A kazein emésztési görbéje jól mutatja, hogy a 40–60 perc retenciós idejű nagyméretű és apoláros peptidek fokozatosan eltűnnek az oldatból. Ezek a peptidek általában 120 s után hidrolizálnak. A rövidebb, 3–20 perc közötti retenciós idejű kisebb és poláros peptidmolekulák mennyisége meredeken nő a hidrolízis megindulását követően, és koncentrációjuk hosszú időn át változatlan. Néhány peptid koncentrációjának alakulásával jól követhető a proteolízis (4. ábra). Egyes peptidek rövid időn belül elbomlanak (pl. β-kazomorfin 75–81, retenciós idő 18,6 perc), amit jól mutat követlenül a bontás megindulása után megjelenő maximum. Ugyanakkor egyes peptidek koncentrációja hosszabb
időn keresztül egyenletesen magas, mint pl. az αs1-kazein 100–105, retenciós idő 7,8 min, ami nagyfokú stabilitásra utal. Ezek a görbék rendszerint hiperbola alakúak. A peptidek harmadik típusa részben a kiindulási kazeinből, részben pedig a kazein bomlástermékeiből keletkezik, pl. apoláros peptidekből és gyorsan el is bomlanak (pl. αs2-kazein 1–15, retenciós idő 40 min). Ezek menynyisége lépcsőzetesen csökken az idő előrehaladtával. A kazein vizes oldatának hidrolízisekor csak 24 óra elteltével jelennek meg nagyobb mennyiségben szabad aminosavak.
koncentráció (mól/l)
1,2x 10-5 1
1,0x 10-5
3
8,0x 10-6 6,0x 10-6 2 -6
4,0x 10
1 α-kazein fragmentum, 100-105 2 β-kazomorfin, 75-81 3 α-kazein fragmentum, 1-15
2,0x 10-6 0,0 0
2
4
6
8
10
bontási idő tp (min)
4. ábra A proteolízis során keletkező egyes peptidek koncentrációjának alakulása (kísérleti körülmények: 2 g/l kazein, pH 8,3, 0,1 %(V/V) enzim, RT) A fenti vizsgálatokból megállapítható, hogy az Alcalase® 2,5 DX L enzim igen gyorsan elbontja a fehérjét, a bontás során különböző lánchosszúságú bomlástermékek keletkeznek. A kazeinmolekula kevesebb, mint 1 perc alatt elbomlik. Ezután a bomlás felgyorsul, és ez a proteolízis befejezéséig (72 óra) tart. A jelenségnek az a magyarázata, hogy az oldat rövid peptidjei végül szabad aminosavakra bomlanak. A vizes kazeinoldat vizsgálati körülményeit úgy választották meg, hogy azok lehetőleg megfeleljenek a restaurálásra váró falfestmények körül uralkodó körülményeknek (hőmérséklet, pH, puffer). A kazein szabályozott eltávolítása Az előkísérletekben a pontos kísérleti körülmények beállítása és a paraméterek meghatározása miatt végezték a kazeinbontást vizes közegben. A valóságban ennél sokkal bonyolultabb rendszer része a kazein, ezért a következő lépés ennek a rendszernek a modellezése volt. 30×30 cm-es és 2 cm
vastag nyersvakolat lapokat készítettek az eredeti leírás szerint, amelyeket CaCO3-mal vontak be. A mintalapokat ezután a korábban használatos festékekkel megfestették (Kremer pigment), és kazeinréteggel vonták be. A megfestett lapokat ellenőrzött körülmények között több hónapon át mesterségesen öregítették, így sikerült a valóságban tapasztalt elváltozásokat előidézni, vagyis a festett fal felpúposodását, ill. leomlását. A 2D fluoreszcenciás felületi mérés a triptofánra jellemző 288 nm-en és 331 nm-en adott maximumot. A kazeintartalom felületegységre számítva 0,054–0,401 mg/cm2 között mozgott. Megfigyelték, hogy a fluoreszcenciajel intenzitása a falfelület összetételétől és minőségétől függött. A kalciumkarbonát- vagy vas-oxid-tartalmú mintadarabok jól értékelhető erős jelet adtak, míg a réztartalmú festék, pl. a Paratacamit jelintenzitása igen gyenge volt. Ennek az volt a magyarázata, hogy a festék abszorpciós sávja egybeesett a triptofán emissziós maximumával. A mérés során a felületi porozitás és a kazein egyéb kísérő anyagainak hatását is számításba kellett venni. Ezt úgy oldották meg, hogy a minta keresztmetszetéről fluoreszcenciaprofilt készítettek. A lehetséges felületi eltérésekre kalibrációs görbét vettek fel, és az eredményeket ennek alapján korrigálták az egyes mintáknál. A rögzített enzimet tartalmazó mérési elrendezés bevált a falminták mérésénél és a görbék alapján jól lehetett követni a folyamatot (5. ábra). A görbéket három, 10 percenként vett minták 2D fluoreszcenciás mérési eredményei alapján vették fel. A görbéből leolvasható, de szabad szemmel is jól lehetett követni, hogy 30 perc után 56–100%-os proteolízist értek el. A fluoreszcenciamérés alapján 96,5%-os értéket kaptak. A kezelés után újabb 6 hónapon keresztül öregítették a mintát, és figyelték a felületi elváltozásokat. Ez alatt az idő alatt nem észleltek változást, vagyis a kazeinmentesítés kellő biztonságot nyújtott a további károsodás ellen. A proteolízis időbeli lefutását a 2D fluoreszcenciamérés és a RP-HPLC mérés összekapcsolásával követték. A mérési eredmények egyeztek az 5. ábrán bemutatott eredményekkel, ezenfelül a bontás folyamatába is sikerült bepillantást nyerni. A kazeinréteget 30 perc alatt sikerült tökéletesen eltávolítani. A reakciótermékek összetétele nem változott a folyamat alatt, inkább a fragmentumok koncentrációja kismértékben csökkent. Ennek az a magyarázata, hogy a bomlástermékeket folyamatosan kimosták a rendszerből, amelyek már nem hidrolizáltak tovább. A mérés során csak az okozott problémát, hogy a mosófolyadék folyamatosan hígult, aminek következtében egyre csökkent a csúcsok magassága, ami az értékelést nehezítette. Ezen úgy segítettek, hogy időnként 3,45 ml mintát vettek a mosófolyadékból, és ezt bekoncentrálták 100 µl térfogatra.
0,20
kazeintelítettség (mg/cm2)
egy kazeinréteg 0,16
két kazeinréteg
0,12
0,08
0,04
0,00 0
4
8
12
16
20
24
28
32
bontásiidő időtp tp (min) bontási (min)
5. ábra Egy és két kazeinréteggel bevont kalcium-karbonát standard emésztési görbéi (kísérleti körülmények: 0,1 M NaHCO3/Na2CO3 puffer, pH 9,0, áramlási sebesség: 1,4 ml/min; aktív felület 7,1 cm2, enzimtartalom 0,485 U/cm2, T = 25 °C)
Műemléképületek falfestményeinek vizsgálata Két német műemléképület (Allerheiligen Kapelle, Wienhausen és St. Alexander Kirche, Wildeshausen) falfestményeinek vizsgálatakor azt tapasztalták, hogy a kazeines konzerválásra feltételezett 50 év előtt jóval a romlás már jelentkezett. A további vizsgálatokkal sikerült fényt deríteni arra is, hogy a falfelületen nagyszámú különböző mikroorganizmus telepedett meg. A falakon sókivirágzást is észleltek. A mikroorganizmusok azonosítása folyamatban van. Az előzetes vizsgálatok alapján különböző baktériumok és penészek jelenlétét mutatták ki. A rögzített enzimrendszerrel sikerült a veszélyeztetett falfelületekről eltávolítani a kazeinréteget. A 30 perces enzimes kezelés nemcsak szemmel látható javulást hozott a freskókon, hanem még a sóvirágok is eltűntek. A fehérjebontásnál használt pufferoldathoz 1 %(V/V)-os biocid hatású benzalkóniumkloridot adagoltak, amivel sikerült megtisztítani a falat a mikroorganizmusoktól is. Ezzel a kezeléssel a mikroorganizmusok legalább 40%-át sikerült elpusztítani.
Összefoglalás A műemléképületek falfestményei súlyosan károsodnak az idő múlásával, ami még a teljes megsemmisüléssel is fenyeget. Az 1970–80-as években a műemlékvédelmi szakemberek úgy gondolták, hogyha a falfestményeket kazeinréteggel vonják be, akkor azzal megakadályozzák a további károsodást. Az akkori ismeretek szerint ez kb. 50 évre szóló védelmet jelentett. Az idő előrehaladtával nem várt jelenségre lettek figyelmesek a restaurátorok. A védelmi célból felvitt kazeinréteg a műemléki környezetben annyira megkeményedett, hogy sokkal nagyobb faldarabok kezdtek leválni, mint a kezelést megelőzően. Nem maradt más választás, mint a freskók megszabadítása a kazeinrétegtől a lehető legrövidebb időn belül. Erre egy enzimes bontáson alapuló módszert dolgoztak ki, ami a rendkívüli körülmények között is bevált. A megfelelő fehérjebontó enzim és hordozó kiválasztása után olyan rendszert állítottak össze, amely alkalmas volt a hidrolízis folyamatos ellenőrzésére. A 2D fluoreszcencia-spektroszkópiával roncsolásmentesen és megbízhatóan lehetett követni a kazeinmentesítés egész folyamatát. A rendszer nemcsak mennyezeteken és boltíveken, hanem még az igen eltérő minőségű falfelületeken is eredményesen alkalmazható. A 2D fluoreszcencia-spektroszkópia és a RP-HPLC kombinálásával sikerült behatóan tanulmányozni és megismerni a bomlási mechanizmust. Megállapították, hogy a fehérjebontás más mechanizmus szerint megy végbe vizes közegben és szilárd falfelületen. A kidolgozott eljárás egyik legnagyobb előnye, hogy a kezelés kíméletes, nem károsítja sem a festményt, sem a falat, és tartós eredményt nyújt. Ismét bebizonyosodott, hogy a sokoldalú biotechnológia a műemlék-restaurálásban is eredményesen alkalmazható. (Haidekker Borbála) Beutel, S.; Klein, K. stb.: Controlled enzymatic removal of damaging casein layers on medieval wall paintings. = Biotechnology and Bioengineering, 80. k. 1. sz. 2002. okt. 5. p. 13–21. Clark, D. S.; Bailey, J. E.: Structure-function relationships in immobilized chymotripsin catalysis. = Biotechnology and Bioengineering, 79. k. 5. sz. 2002. szept. 5. p. 539–549.
