KÖZELI INFRAVÖRÖS SPEKTROFOTOMETRIA

2.2.40. Közeli infravörös spektrofotometria

Ph.Hg.VIII. – Ph.Eur.5.0 - 1

01/2005:20240

2.2.40. KÖZELI INFRAVÖRÖS SPEKTROFOTOMETRIA A közeli infravörös – röviden NIR (near-infrared) – spektrofotometria széleskörűen és változatosan alkalmazott gyógyszeranalitikai módszer. A NIRspektrumtartomány kb. 780 nm-től kb. 2500 nm-ig (kb. 12 800 cm–1-től kb. 4000 cm–1-ig) terjed. Egyes esetekben a leghasznosabb információ a kb. 1700 nm-től kb. 2500 nm-ig (kb. 6000 cm–1-től kb. 4000 cm–1-ig) terjedő tartományban található. A NIR-spektrumokban a C-H, N-H, O-H és S-H felhangrezonanciák, valamint az alaprezgések kombinációi jelennek meg; ezek rendkívül informatívak, amennyiben az információ kinyerésére megfelelő kemometriás algoritmusokat alkalmazunk. A NIR-sávok sokkal gyengébbek, mint azok a középinfravörös tartományban jelentkező alaprezgések, amelyekből származnak. Mivel a NIR-tartományban a moláris abszorpciós koefficiens értékek kicsik, a sugárzás többnyire még a szilárd halmazállapotú anyagokba is több milliméter mélyen behatol. Ez oly mértékű, hogy sok anyag (pl. az üveg) viszonylag átlátszó ebben a tartományban. A standard mintaelőkészítő és vizsgáló eljárásokon kívül a méréseket közvetlenül in situ mintán is végezhetjük. A NIR-spektrumból fizikai és kémiai információt egyaránt nyerhetünk, mégpedig mennyiségi és minőségi vonatkozásban is. A vizsgálandó anyag spektruma azonban nem hasonlítható össze közvetlenül egy kémiai referenciaanyag referenciaspektrumával, mint ahogyan az infravörös spektrofotometriában szokás; a NIR-spektrofotometriában az adatok megfelelő, validált matematikai feldolgozására van szükség. A NIR-spektrofotometria alkalmazása mind a kémiai, mind a fizikai analízisben igen sokféle, pl.: a kémiai analízis területén −

hatóanyagok, segédanyagok, gyógyszerformák, közti termékek, nyersanyagok és csomagolóanyagok azonosítása,

−

hatóanyagok és segédanyagok mennyiségi meghatározása, kémiai mérőszámok (pl. hidroxilszám, jódszám, savszám) és víztartalom meghatározása, továbbá a hidroxilezés fokának meghatározása, az oldószertartalom ellenőrzése,


−


folyamatellenőrzés.

a fizikai analízis területén −

kristályforma és kristályosság, részecskeméret vizsgálata,

−

kioldódási tulajdonságok, a szétesési folyamat típusa, a keménység vizsgálata,

−

filmek tulajdonságainak vizsgálata,

−

folyamatellenőrzés, pl. keveredés és granulálás követése.

polimorfia,

pszeudopolimorfia

és

A NIR-tartományban végzett méréseket sok – az alábbiakban ismertetett – kémiai és fizikai tényező befolyásolja; az eredmények reprodukálhatósága és megbízhatósága (helyessége) ezen tényezők ellenőrzésén múlik és a mérések általában csak meghatározott kalibrációs modell alkalmazásával tekinthetők érvényesnek. KÉSZÜLÉK A NIR-spektrofotométereket a kb. 780 nm-től kb. 2500 nm-ig (kb. 12 800 cm–1-től kb. 4000 cm–1-ig) terjedő spektrumtartományban használjuk. Minden NIR-mérés alapja az, hogy a mintán fényt engedünk át, illetve fényt engedünk behatolni a mintába és a mintát elhagyó (átengedett, szórt vagy visszavert) fénysugár gyengülését mérjük. A NIR-tartományban működő spektrofotométerek elemei: megfelelő fényforrás, monokromátor, illetve interferométer. Gyakorta használt monokromátorok: hangolható akuszto-optikai szűrők (AOTF), rácsok vagy prizmák. Nagy intenzitású fényforrások: pl. kvarc- vagy wolframlámpa, illetve ezekhez hasonlók. A wolframlámpa jól stabilizálható fényforrás. Ezért sok NIRkészülék egyutas elrendezésű. A detektorok elterjedten alkalmazott anyagai: szilikon, ólom-szulfid, indium-arzenid, indium-gallium-arzenid, higany-kadmiumtellurid (MCT) és deuterált triglicin-szulfát. Néhány szokványos mintatartó: hagyományos küvetta mintatartó, száloptikai szonda, transzmissziós merülő küvetta és forgó vagy …………………… mintatartó. A választást az alkalmazhatóság szabja meg, különös tekintettel arra, hogy a mintakezelési rendszer mennyire alkalmas a vizsgálandó minta típusának vizsgálatára. A rendszerhez általában megfelelő adatfeldolgozó és értékelő egységek is tartoznak.



MÉRÉSI MÓDSZEREK Transzmittancia. A transzmittancia (T) a mintán áthaladó sugárzás intenzitáscsökkenésének mértéke adott hullámhosszon. A mintát a fényforrás és a detektor közti optikai sugárútba helyezzük. Az elrendezés ahhoz hasonló, amelyet sok hagyományos spektrofotométerben alkalmaznak, és az eredmény közvetlenül transzmittanciában (T) és/vagy abszorbanciában (A) adható meg.

T=

I , I0

ahol I0 =

a beeső fény intenzitása,

I =

az áteresztett fény intenzitása,

A=

– log10 T = log10 ⎜

⎛I ⎛1⎞ ⎟ = log10 ⎜ 0 ⎝T ⎠ ⎝ I

⎞ ⎟. ⎠

Diffúz reflexió. Diffúz reflexiós üzemmódban a reflektanciát (R), azaz a mintáról visszaverődött fény intenzitásának (I) és a háttérről vagy egy referenciafelületről visszaverődött fény intenzitásának (Ir) hányadosát mérjük. A NIR-sugárzás képes mélyen behatolni a mintába, ahol a mintában jelenlévő vizsgálandó alkotórész kombinációs rezgései és felhangrezonanciái elnyelhetik. A sugárzás nemabszorbeált része a mintáról visszaverődik a detektorra. A NIR-reflexiós spektrumokat általában a log(1/R) kiszámításával, illetve az így kapott értékeket a hullámhossz vagy a hullámszám függvényében ábrázolva kaphatjuk meg.

R=

I , Ir

ahol I =

a mintáról diffúzan visszaverődött fény intenzitása,


Ir =


a háttérről vagy egy visszaverő referenciafelületről visszaverődő fény intenzitása,

⎛I ⎞ ⎛1⎞ AR = log10 ⎜ ⎟ = log10 ⎜ r ⎟ . ⎝R⎠ ⎝ I ⎠ Transzflexió. A transzflexiós módszer a transzmittancia és a reflektancia kombinációja. A transzflektancia (T*) mérése során tükröt vagy diffúzan visszaverő felületet alkalmazunk a mintán átengedett sugárzás másodszori visszaverésére, ezáltal kétszeresére növelve az úthosszat. A nemabszorbeálódott sugárzás a mintáról visszaverődve jut a detektorra.

T* =

I , IT

IT = a transzflektált fény intenzitása minta nélkül, I = a mintán átengedett és visszavert fény intenzitása, A* = log10 ⎛⎜

1 ⎞ . * ⎟ ⎝T ⎠

A MINTA ELŐKÉSZÍTÉSE, KEZELÉSE Transzmisszió. A transzmittancia (T) mérése a számításához használt háttértranszmittanciaspektrumtól függ. A referenciaháttér lehet levegő, üres küvetta és „üres” oldószer vagy – speciális esetekben – valamilyen referenciaminta. A módszert általában folyadékok (hígított vagy nem-hígított), diszperziók, oldatok és szilárd anyagok vizsgálatára alkalmazzuk. Szilárd anyagok transzmittanciaspektrumának felvételéhez megfelelő mintakezelő felszerelés szükséges. A mintákat a NIR-sugárzást átengedő, megfelelő rétegvastagságú (általában 0,5 – 4 mm-es) küvettában, vagy megfelelő elrendezésű száloptikai szonda bemerítésével vizsgáljuk; az így nyert spektrumnak olyan transzmittanciatartományba kell esnie, amely a készülék specifikációinak és a vizsgálat céljának egyaránt megfelel. Diffúz reflexió. Ezt a módszert általában szilárd anyagok vizsgálatára alkalmazzuk. A mintát megfelelő mintatartóba helyezzük. Ügyelni kell arra, hogy az egymásutáni minták mérési körülményei a lehető legnagyobb mértékben



reprodukálhatók legyenek. Ha száloptikai szondát merítünk a mintába, ügyelni kell arra, hogy a szonda helyzete a spektrumfelvétel folyamán ne változzék és hogy az egymásutáni minták mérése során a vizsgálati körülmények – amennyire csak lehetséges – reprodukálhatók legyenek. Az alapvonal felvételéhez végigpásztázzuk a referenciaháttér reflexióját, és ezután felvesszük a vizsgálandó minta (minták) reflexiós spektrumát (spektrumait). Szokásos reflexiós referenciaanyagok: kerámialapok, perfluor-polimerszármazékok és arany. Egyéb alkalmas anyagok is használhatók. Csak olyan spektrumokat lehet közvetlenül összehasonlítani, amelyeket azonos optikai tulajdonságú háttérrel vettünk fel. A részecskeméretet, a kristályvíztartalmat, illetve a szolvatáció mértékét figyelembe kell venni. Transzflexió. A minta mögé reflektáló anyagot helyezünk, ezáltal kétszeresére növelve a rétegvastagságot (az úthosszat). Ez az elrendezés a reflexiós rendszer és a száloptikai szonda rendszer a készülék geometriájával is megvalósítható; ilyenkor a fényforrás és a detektor a mintának ugyanazon oldalán van elhelyezve. A mintát küvettába helyezzük, és a vizsgálathoz tükröt vagy megfelelő diffúzan reflektáló anyagot alkalmazunk, melynek anyaga fém vagy egyéb inert, a NIR-tartományban nem abszorbeáló anyag (pl. titán-dioxid). A SPEKTRÁLIS VÁLASZT BEFOLYÁSOLÓ TÉNYEZŐK A minta hőmérséklete. A hőmérsékletnek fontos szerepe van vizes oldatok és sok más folyadék esetében, amikoris néhány foknyi különbség lényeges spektrális változást eredményezhet. A hőmérséklet a víztartalmú szilárd anyagok, illetve porok esetében is fontos tényező. Nedvesség és oldószermaradvány. Ha a minta nedvességet vagy oldószermaradványt tartalmaz, jellegzetes abszorpciós sávok jelennek meg a NIRtartományban. A minta rétegvastagsága. Köztudott, hogy a minta rétegvastagsága módosítja a spektrumot; ezt ismerni és/vagy ellenőrizni kell. Például, reflexiós mérés folyamán a minta rétegvastagsága vagy „végtelen” nagy, vagy amennyiben kisebb rétegvastagságú mintát vizsgálunk, úgy a rétegvastagságnak állandónak, a hátteret képező diffúzan reflektáló anyagnak stabilnak kell lennie, és állandó, lehetőleg erős fényvisszaverőképességgel kell rendelkeznie. A minta optikai tulajdonságai. Szilárd anyagok esetében mind a felületen, mind az anyag belsejében bekövetkező fényszóródást figyelembe kell venni. A fizikai, kémiai és optikai szempontból egyenetlen minták esetén megfelelő spektrumok



nyeréséhez szükség lehet a minták átlagolására, amit a sugárnyaláb méretének, vagy a vizsgált minták számának növelésével, vagy a szonda forgatásával érhetünk el. Bizonyos tényezők – pl. a porított anyagok különböző fokú tömörítése vagy szemcsemérete, továbbá felületi egyenetlensége – jellegzetes spektrális eltéréseket okozhatnak. Polimorfia. A kristályszerkezet különbözősége (polimorfia) befolyásolja a spektrumot. Ennek köszönhető, hogy adott anyag különböző kristályformái és amorf formája a NIR-spektrumaik alapján megkülönböztethetők egymástól. Ha többféle kristályforma van jelen, ügyelni kell arra, hogy a kalibrációs standardokban a kristályformák egymáshoz viszonyított aránya megfeleljen a felhasználási célnak. A minták kora. Az idő folyamán változhatnak a minták kémiai, fizikai és optikai tulajdonságai. Ügyelni kell arra, hogy a NIR-analízis alá vetett minták e tekintetben is megfeleljenek a kalibráláshoz használtaknak. Ha különböző korú mintákat kell vizsgálni, számítani kell arra, hogy sajátosságaik eltérők lesznek. A MŰSZER TELJESÍTŐKÉPESSÉGÉNEK VIZSGÁLATA A műszert a gyártó által megadott utasítás szerint használjuk, és a készülék használatától, valamint a vizsgálandó anyagoktól függően, szabályos időközönként elvégezzük az előírt ellenőrzéseket. A hullámhossz-skála ellenőrzése (a szűrővel ellátott műszerek kivételével). A hullámhossz-skálát általában a kb. 780 nm-től kb. 2500 nm-ig (kb. 12 800 cm–1-től kb. 4000 cm–1-ig) terjedő vagy egy kiválasztott tartományban ellenőrizzük, egy vagy több olyan, alkalmas hullámhossz-standardot felhasználva, amelyek a kívánt hullámhossztartományban jellegzetes maximumokkal, illetve minimumokkal rendelkeznek. Pl. megfelelő referenciaanyag a diklórmetán vagy a ritkaföldfémoxidok valamilyen keveréke. A spektrumot ugyanolyan spektrális felbontással vesszük fel, mint amellyel a referenciaanyag bizonylatán feltüntetett értékeket nyerték, és – a szükséges tartományban arányosan elosztva – legalább három csúcsot kiválasztunk, és ezeknek a helyzetét lemérjük. Az elfogadható eltérések: 1200 nm-en ±1 nm, 1600 nm-en ±1 nm és 2000 nm-en ±1,5 nm (8300 cm-1-en ±8 cm-1, 6250 cm-1-en ±4 cm-1 és 5000 cm-1-en ±4 cm-1). Az alkalmazott referenciaanyagnak a fentebb felsorolt pontokhoz legközelebb álló csúcsaira a megfelelő elfogadható eltéréseket alkalmazzuk. FT-műszerek hullámhosszskálájának kalibrálásához használhatjuk a vízgőz keskeny, 7299,86 cm-1-es vonalát, vagy egy bizonylattal ellátott anyag keskeny vonalát. A ritkaföldfém-oxid



referenciaanyagok közül legalkalmasabb a NIST 1920 (a). (NIST = National Institute of Standards and Technology.) Transzmittanciamérés. A hullámhossz-skála ellenőrzésére 1,0 mm optikai úthosszúságú R diklórmetán alkalmazható. A diklórmetán jellegzetes, éles sávval rendelkezik 1155, 1366, 1417, 1690, 1838, 1894, 2068 és 2245 nm-en. A kalibráláshoz használatos sávok: 1155, 1417, 1690 és 2245 nm. Egyéb megfelelő standardok is használhatók. Diffúz reflexió (reflektancia) mérés. A diffúz reflexió (reflektancia) méréséhez a hullámhossz-skála ellenőrzésére diszprózium-, holmium- és erbium-oxid 1+1+1 tömegarányú keveréke vagy egyéb bizonylatolt anyag használható. Ez a referenciaanyag 1261, 1681 és 1935 nm-en mutat jellemző sávokat. Amennyiben szilárd külső standardok alkalmazása nem lehetséges, továbbá, ha a diffúz reflexió mérését küvettában végezzük, vagy ha száloptikai szondát alkalmazunk, 1,2 g R titán-dioxidból kb. 4 ml R diklórmetánnal – erőteljes összerázással – szuszpenziót készítünk, és közvetlenül ezt töltjük a küvettába, illetve ebbe merítjük a szondát. A spektrum felvétele előtt 2 percet várakozunk. A titán-dioxid nem rendelkezik abszorpcióval a NIR-tartományban. A spektrumfelvételekhez használható maximális névleges műszer-sávszélesség 2500 nm-en 10 nm (4000 cm-1-en 16 cm1 ). A méréseket a kívánt spektrumtartományban legalább 3 csúcson kell elvégezni. Az elfogadható eltéréseket lásd a „A hullámhossz-skála ellenőrzése …” bekezdésben. Az alkalmazott referenciaanyagra a mérési csúcsokhoz legközelebbi csúcsokra megadott elfogadható eltéréseket alkalmazzuk. A hullámhossz ismételhetőségének ellenőrzése (a szűrővel ellátott műszerek kivételével). A hullámhossz ismételhetőségét megfelelő standardokkal ellenőrizzük. A hullámhossz szórása feleljen meg a műszer gyártója által megadott specifikációnak. A fotometriás linearitás és a válasz-stabilitás ellenőrzése. A fotometriás linearitást ismert százalékos transzmittancia-, illetve reflektancia-értékekkel rendelkező transzmissziós, illetve reflexiós standardkészlet felhasználásával igazoljuk. A reflektanciamérésekhez szénbevonatú polimer standardok használatosak. A 10 % és 90 % közti tartományban legalább négy standardot használunk, mégpedig 10, 20, 40 és 80 %-nál, ahol a megfelelő abszorbanciaértékek sorrendben 1,0, 0,7, 0,4 és 0,1. Amennyiben a vizsgálandó anyag abszorbanciája 1,0-nél nagyobb, 2 %-os és/vagy 5 %-os standarddal kiegészítjük a készletet. A mért abszorbancia-értékeket a referenciaanyag abszorbanciaértékeinek függvényében ábrázoljuk és kiszámoljuk a lineáris regressziót. A



meredekségre elfogadható eltérés 1,00 ±0,05, a tengelymetszetre elfogadható eltérés pedig 0,00 ±0,05. A reflektanciastandardokról felvett spektrumok a gyári kalibrálás, illetve a későbbi felhasználás során alkalmazott kísérleti körülmények különbözősége következtében eltérhetnek egymástól. Emiatt a kalibrációs standardkészlethez mellékelt százalékos reflektancia-értékek nem okvetlenül alkalmasak arra, hogy adott műszer „abszolút” kalibrálását ezekre próbáljuk alapozni. De addig, amíg a standardok kémiailak vagy fizikailag nem változnak, és a bizonylaton feltüntetett érték mérésekor alkalmazott referenciaháttérrel megegyező hátteret alkalmazunk, ugyanazon standardok azonos körülmények között végzett egymásutáni mérései – beleértve a minta pontos elhelyezését is – információt adnak a fotometriás válasz hosszú távú stabilitásának tartósságára nézve. A hosszú távú stabilitásra elfogadható eltérés ±2 %; ez csak akkor szükséges, ha a spektrumokat előkezelés nélkül használjuk. A fotométerzaj ellenőrzése. A fotométerzajt alkalmas reflexiós standard, pl. fehér, fényvisszaverő kerámialemez vagy hőre lágyuló fényvisszaverő gyanta (pl. teflon) alkalmazásával határozzuk meg. A gyártó ajánlásai szerint megfelelő hullámhossz-, illetve hullámszámtartományban felvesszük a reflexiós standard spektrumát és – csúcsról csúcsra kiszámoljuk a fotométerzajt. Ennek értéke közelítőleg a szórás értékének kétszerese. A fotométerzajnak meg kell felelnie a spektrofotométer specifikációjában megadott értéknek. AZONOSÍTÁS ÉS SAJÁTSÁGOK (MINŐSÉGI ANALÍZIS) Referenciaspektrum-könyvtár létesítése. A spektrumfelvételeket az anyag elegendő számú gyártási tételből származó, az előírt specifikációk szerint teljes vizsgálattal ellenőrzött mintáiból készítjük, amelyek között megtalálhatók a vizsgálandó anyag jellemző (pl. gyártótól, fizikai megjelenéstől, részecskemérettől függő) változatai. Az így nyert spektrumsorozat tartalmazza azt az azonosításhoz és jellemzéshez szükséges információt, amely kijelöli az adott anyag hasonlósági határait, és ezzel az anyag bekerülhet az azonosításra szolgáló spektrumkönyvtárba. A spektrum-könyvtárt képező anyagok száma a speciális alkalmazástól függ, de a túl nagy könyvtárak meg is nehezíthetik a különböző anyagok egymástól való megkülönböztetését és a spektrum-könyvtár validációját. A spektrumkönyvtárt alkotó valamennyi spektrum −

spektrális tartománya és adatpontjainak száma,


−

felvételi technikája,

−

adat-előkezelési módja


azonos kell, hogy legyen. Amennyiben alcsoportokat (alkönyvtárakat) alakítunk ki, a fenti követelményeket az egyes csoportokra egymástól függetlenül kell alkalmazni. A könyvtárban található spektrumgyűjteményt az azonosításra használt matematikai módszerrel definiálva többféleképpen lehet megjeleníteni, pl.: −

az anyagra jellemző egyedi spektrumok összességével,

−

az anyag gyártási tételeiből nyert átlagspektrummal,

−

szükség esetén az anyag spektrumaiban előforduló variábilitás leírásával.

A spektrum-könyvtár létesítéséhez használt „nyers” elektronikus adatokat archiválni kell. Az adatok előkezelése. Sok esetben, különösen reflexiós spektrumokhoz hasznos a spektrum matematikai előkezelésének valamilyen formája, mielőtt egy osztályozási vagy egy kalibrációs modellt fejlesztenénk ki. Például célul tűzhetjük ki az alapvonalváltozatok csökkentését, a felhasználásra kerülő matematikai modelleket zavaró, ismert különbözőségek hatásának csökkentését, továbbá, az adatok alkalmazás előtti tömörítését. Szokványos módszerek: a többszörös-szóráskorrekció (multiplicative scatter correction, MSC), a Kubelka-Munk transzformációk, a spektrális tömörítési módszerek (esetleg ablakozási technikával és zajcsökkentéssel), valamint a spektrum első, illetve második deriváltjának kiszámítása. Magasabbrendű deriváltak alkalmazása nem ajánlott. Egyes esetekben a spektrumok normalizálhatók is, pl. a maximális abszorbanciára, az abszorbanciaátlagra vagy a spektrumalatti területre (integrált abszorbancia). Bármilyen matematikai transzformáció alkalmazásakor óvatosan kell eljárni, mivel műtermékek keletkezhetnek, vagy alapvető (a minősítési módszerek tekintetében fontos) információt veszíthetünk el. Érteni kell az algoritmust és a transzformáció alkalmazásának ésszerűségét minden esetben dokumentálni kell. Az adatok értékelése. A vizsgálandó anyag spektrumát közvetlenül hasonlítjuk össze az adatbázisban lévő összes anyag egyedi vagy átlag-referenciaspektrumával

2.2.40. Közeli infravörös spektrofotometria 10

Ph.Hg.VIII. – Ph.Eur.5.0 -

ezek matematikai korrelációi vagy más megfelelő algoritmusok alapján. Az ismert átlag-referenciaspektrumokból álló készletet és az ilyen átlagspektrumok szórását megfelelő algoritmus alkalmazásával az anyagok osztályozására is felhasználhatjuk. Léteznek (a NIR-műszerek szoftverjeiben vagy „harmadik fél” szoftverjeként alkalmazva) a fő komponens analízisére alapozott algoritmusok (PCA = principal component analysis), klaszter-analízissel kombinálva, SIMCA(soft independent modelling by class analog) és COMPARE-függvények szűrők alkalmazásával, valamint UNEQ (unequal dispersed class) és egyéb algoritmusok. Adott alkalmazás céljaira választott algoritmus megbízhatóságát validálni kell. Például, a korrelációs koefficiens, a reziduális szórásnégyzetek összege vagy a távolság a klaszter-analízis alkalmazása során, meg kell, hogy feleljen a validálási eljárásban előírt elfogadási határértékeknek. Az adatbázis validálása Specificitás. A validálás során igazolni kell az adatbázis spektrumait egy adott anyag pozitív azonosítására felhasználó osztályozás szelektivitását, valamint az anyagnak az adatbázisban lévő többi anyagtól való megfelelő megkülönböztetését. Elfogadási határértékeket kell előírni. Szigorú határértékek jobb megkülönböztethetőséget tesznek lehetővé, de – ugyanazon anyag változatossága miatt – bizonyos mértékű tévedési lehetőséget is rejtenek magukban. Kevésbé szigorú határértékek megoldják ezeket a problémákat, viszont nem adnak egyértelmű eredményeket. A spektrális adatbázisok teljesítőképességét próbára kell tenni. Ehhez olyan anyagok használhatók fel, amelyek küllem, kémiai szerkezet vagy név tekintetében hasonlítanak az adatbázis tagjaihoz. Az ilyen anyagnak nem szabad megfelelnie az azonosítási próba követelményeinek. Az adatbázisban szereplő, bár a létesítéséhez nem használt független mintáknak (azaz más gyártási tételekből származó anyagoknak, keverékeknek) viszont pozitív azonosítási próbát kell adniuk. Robusztusság. A minőségi vizsgálat robusztusságát is ki kell próbálni annak érdekében, hogy kiderüljön, milyen hatást gyakorolnak a szokásos vizsgálati körülmények kis változásai az analízisre. Ilyenkor sem az előkészítési eljárás, sem a kalibráció algoritmus-paraméterei nem változhatnak. Tipikus próbák: −

az operátorok közti különbségek, ill. a környezeti feltételek (pl. a laboratórium hőmérséklete és páratartalma) változásának hatása,



−

a minta hőmérsékletének, optikai ablakba helyezésének, illetve a szonda bemerülési mélységének hatása, valamint az anyag tömörítésének, illetve csomagolásának hatása,

−

a műszer egyes részeinek, illetve a mintaelőkészítő eszközöknek a cseréje.

MENNYISÉGI ANALÍZIS Referenciaspektrum-könyvtár létesítése kalibrációs modellhez. Kalibrációnak nevezzük az olyan matematikai modell megszerkesztési folyamatát, amelynek segítségével az analitikai műszer válasza összefüggésbe hozható a minták tulajdonságaival. Bármilyen kalibrációs algoritmus alkalmazható, amely egzakt matematikai összefüggés formájában egyértelműen definiálható és megfelelő eredményeket ad. Felvesszük megfelelő számú, a mérendő tartományban ismert tartalmi értékekkel (pl. víztartalom) rendelkező minta spektrumát. Annak igazolására, hogy a kalibráció során a vizsgálandó anyag sávjait alkalmazzuk, a kalibrációs modellben alkalmazott hullámhosszakat összehasonlíthatjuk a vizsgálandó anyag és a mátrix ismert sávjaival. A kalibrációs modell létesítéséhez a vizsgált mintáknak mintegy kétharmadát használjuk fel; a maradék egyharmadot az adatbázissal hasonlítjuk össze. Minden mintára a módszer célja szerint meghatározott pontossági intervallumon belüli kvantitatív eredményt kell kapnunk. A mérési eredmények helyességét többféle, egymástól legfeljebb a megadott mértékben eltérő mátrix jelenlétében bizonyítani kell. A szokásos modellek: többszörös lineáris regresszió (multiple linear regression, MLR), parciális legkisebb négyzetek (partial least square, PLS) és a fő komponens regressziója (principal component regression, PCR). A PLS vagy PCR kalibráció esetén az együtthatókat ábrázolhatjuk és a nagy együtthatók tartományát összehasonlíthatjuk a vizsgálandó anyag spektrumával. A kalibrációs modellhez felhasznált nyers adatokat – adat-előkezelés nélkül – archiválni kell. Az adatok előkezelése. Az adatok előkezelése a NIR-spektrum adatainak matematikai transzformációját jelenti a spektrális jellemzők javítása, és/vagy a nemkívánt hibaforrások kiküszöbölése, illetve csökkentése érdekében, a kalibrációs modell létrehozása előtt. Az adatok előkezelésére és a kalibrációra sokféle alkalmas algoritmus létezik. A választást az elérendő cél szabja meg. A hullámhossz-szelekció növelheti a kalibrációs modellek (pl. az MLR) hatékonyságát (pl. a részecskeméret meghatározásakor). Egyes esetekben – pl. a hidrát-formában kötött víz meghatározása esetében – hasznos lehet bizonyos


hullámhossztartományok alávethetjük.

törlése.

Az


adatokat

hullámhossztömörítésnek

is

Validációs paraméterek A NIR-módszerek validációjának igazolásához választható analitikai teljesítmény-jellemzők jellemzők hasonlóak azokhoz, amelyeket bármely más analitikai eljárásra megkövetelünk. Az egyedi elfogadási követelményeknek minden egyes validációs paraméter esetén a módszer felhasználási céljához kell igazodniuk. Specificitás. A relatív megkülönböztető képességnek és a szelektivitásnak a kvantitatív meghatározások esetén is hasonlónak kell lenniük a „Minőségi analízis” bekezdésben leírtakhoz. A specificitás vizsgálatának mértéke az alkalmazástól és az ellenőrzés alá vont kockázatoktól függ. A mátrix koncentrációváltozásai a módszer mérési tartományán belül nem befolyásolhatják lényegesen a mennyiségi méréseket. Linearitás. A linearitás validációja magában foglalja az adott algoritmussal a NIRválaszokból számított NIR-eredmények és a referenciamódszerrel kapott, a kalibrációs modell teljes tartományát reprezentáló eredményei közötti korreláció megállapításait. A nem-lineáris tényleges NIR-válaszok is lehetnek értékelhetők (validak). Tartomány. A vizsgálandó anyag referenciaértékeinek tartománya meghatározza a NIR-módszer tartományát és a mennyiségi meghatározás határait. Megfelelő ellenőrzéssel biztosítani kell, hogy a validált tartományon kívüli eredmények ne legyenek elfogadhatók. Az eredmények helyessége; torzításmentesség (accuracy.) Az eredmények helyességét meghatározhatjuk a validációs módszerrel vagy ismert mintákkal („üres” mintákat és a vizsgált anyag hozzáadott részleteit tartalmazó mintákkal) való összehasonlítással. Az eredmények helyessége jellemezhető a NIR-módszerrel nyert predikció standard hibájával (SEP), amelynek jól kell egyeznie a validált módszerrel kapott adatokkal. A SEP a NIR-eredményeknek az előírt mintákra vonatkozó analitikai referenciaadatokkal való összehasonlításával nyert reziduálisok szórása. A helyességet a NIR-eredmények és az analitikai referenciaadatok közti korrelációval, a SEP és a validációhoz alkalmazott referenciamódszer összehasonlításával kell igazolni. Úgy is eljárhatunk, hogy a statisztikai összehasonlító módszereket alkalmazzuk a NIR-eredményeknek a referenciaértékkkel való összehasonlítására (páros t-próba, torzítás-értékelés).



A mérés pontossága (precision). A mérés pontossága az előírt körülmények között végzett méréssorozaton belüli egyezést fejezi ki. Ennek megállapításához legalább hat mérést kell végezni a kifejlesztett analitikai módszerrel. A mérés pontosságát két szinten lehet figyelembe venni, az egyik az ismételhetőség (ugyanazon mintára vonatkozó párhuzamos mérések – a minta helyzetének változtatásával vagy anélkül), a másik a közbenső pontosság (különböző vizsgáló személyektől származó párhuzamos mérések, különböző napokon végzett mérések). Robusztusság. Ez magában foglalja a hőmérséklet, a nedvesség, a mintakezelés különbözőségének hatásait, valamint a műszerváltás befolyását. Kívüleső eredmények. Egy, a kalibrációs tartományon kívüli vizsgálandó anyagot tartalmazó minta NIR-méréseiből származó, kívüleső eredmények azt jelzik, hogy további vizsgálatok szükségesek. Amennyiben megfelelő analitikai módszerrel további vizsgálat alá vetve a mintát, az derül ki, hogy a vizsgálandó anyagra nézve a tartalom megfelel a követelményeknek, a minta a vizsgálandó anyag vonatkozásában elfogadható és megállapítható, hogy megfelel a követelményeknek. Tehát, egy NIR-mérésből származó, kívüleső eredmény ellenére a minta – az analizált anyag vonatkozásában – megfelelhet a követelményeknek. FOLYAMATOS MODELLÉRTÉKELÉS A felhasználásra validált NIR-modellek teljesítőképességét folyamatosan értékelni és a validációs paramétereket folyamatosan figyelni kell. Amennyiben rendellenességeket tapasztalunk, javító beavatkozásra van szükség. A megkövetelt revalidáció mértéke a változás természetétől függ. Adott minőségi modell revalidációjára szükség van, ha a referenciakönyvtárba új anyag kerül, és szükség lehet rá, ha az anyag fizikai tulajdonságaiban történik valamilyen változás, vagy a beszerzési forrás változik meg. Adott mennyiségi modell revalidációjára akkor van szükség, ha a végtermék összetétele vagy a gyártási folyamat vagy a nyersanyagok beszerzési forrása, illetve minőségi fokozata változik. AZ ADATBÁZISOK ÁTVITELE Amikor adatbázisokat viszünk át egy másik műszerre, a spektrumtartományt, az adatpontok számát, a spektrális felbontást és egyéb paramétereket figyelembe kell



venni. Azt, hogy a modell az új adatbázissal vagy új műszerrel is érvényes marad, további eljárások és követelmények alkalmazásával kell igazolni. AZ ADATOK TÁROLÁSA Az elektronikus NIR-spektrumokat, könyvtárakat és adatokat az érvényes szabályozások szerint kell tárolni. Az adott cél (pl. azonosítás, részecskeméret-analízis, víztartalom meghatározás, stb.) eléréséhez szükséges adat-előkezelésnek alávetett NIR-spektrumokat az érvényes követelmények szerint kell tárolni.

KÖZELI INFRAVÖRÖS SPEKTROFOTOMETRIA

Recommend Documents