KUTATÁSI TERV A MAGYARY ZOLTÁN POSZTDOKTORI ÖSZTÖNDÍJHOZ Új vegyületek fejlesztése súlyos bakteriális és virális fertőzések ellen Dr. Sipos Attila Bevezetés: A tudományos program vagy kutatási terv tárgya, címe, a témaválasztás indoklása, motiváció
A következőkben kifejtett kutatási programhoz kötődő pályázat pozitív elbírálása esetén lehetőségem nyílna a Debreceni Egyetemen (illetve jogelődjén, a Kossuth Lajos Tudományegyetemen) tradicionális és nemzetközi mércével mérve is igen magas szinten művelt kutatási terület, az antibiotikumok gyógyszerészi kémiájának továbbvitelére és nagymértékben hozzájárulna a jelenleg folyó külhoni posztdoktori tanulmányutamról való visszatérésemhez. Ezen a széles tématerületen belül a glikopeptid antibiotikumok tanulmányozása és továbbfejlesztése különösen hangsúlyos, hiszen a vankomicin, teikoplanin és szerkezeti rokonaik a modern gyógyászatban kimagasló helyet foglalnak el Gram-pozitív baktériumok által kiváltott súlyos fertőzések kezelésében. Az 1980-as évek végétől megjelentek és állandó, magas fokú kockázati faktort jelentenek a glikopeptid-rezistens enterococcus, glikopeptid származékoknak is ellenálló Staphylococcus aureus valamint teikoplanin-rezisztens Staphylococcus hemolyticus kórokozók, melyek azonnali és hathatós fejlesztéseket tesznek a mai napig szükségessé [1]. Ez a kutatási irány több nemzetközileg meghatározó kutatócsoport fő tevékenységi területévé vált, így például Boger [2] és Preobrazhenskaya [3] csoportjaié, de meg kell említeni, hogy a rezisztencia és a peptidoglikán antbiotikumok hatásmechanizmusa problémaköreinek tanulmányozásában elért eredmények nagyban hozzájárultuk Venkatraman Ramakrishnan, Steitz, Yonath munkásságának Kémiai Nobel-díjjal való elismeréséhez [4]. A glikopeptid antibiotikumok alkalmazása azonban nem szűkül az önmagában is meghatározó baktériumellenes hatásra, hiszen az antivirális, HIVellenes és daganatellenes hatásai is kimagaslóak és több területen áttörést ígérnek [5]. Célkitűzés: A kutatási program célja Több sorozat vankomicin, teikoplanin és risztocetin származék szintézisét tervezem megvalósítani, melyek mind antibakteriális, mind antivirális területen ígéretes hatást mutathatnak, mivel tervezésüknél azokat a megfontolásokat alkalmazom, melyeket a debreceni kutatócsoport számos esetben kiváló hatékonysággal alkalmazott és emellett a számítási kémia egyre bővülő eszköztárát is ki kívánom aknázni az eddig ismeretessé vált szerkezet-hatás összefüggések még alaposabb hasznosítása érdekében. Tervezett vizsgálataim természetesen elképzelhetetlenek megfelelő farmakológiai háttér nélkül, ehhez azonban szilárd bázis nyújt kutatótársaim és elődeim gazdag múltra visszatekintő együttműködése kiváló hazai és európai farmakológiai partnerekkel. Új célként fogalmazom meg a már ismert és az előállítani tervezett glikopeptid származékok komplexképzési sajátosságainak átfogó analitikai és in silico vizsgálatát élettani szempontból meghatározó átmenetifém ionokkal. Különös hangsúlyt kívánok fektetni a peptidoglikánok hatásmechanizmusvizsgálata szempontjából alapvető ’host-guest’ kölcsönhatások műszeres (fejlett NMR és mikrokalorimetriás) mérésekkel valamint a számítási kémiai eszköztárával megvalósítandó tanulmányozására.
Ütemterv: Munka és időbeosztás negyedévekre lebontva, milyen lépésekben, milyen ütemezéssel és módszerekkel kívánja megvalósítani az adott célt 1. Kutatócsoportunk is kiváló antibakteriális és antivirális eredményekkel alkalmazta a glikopeptid származékok lipofil oldallánccal történő szubsztituálásának koncepcióját [6]. Különösen jelentős aktivitású teikoplanin és risztocetin származékokat sikerült szintetizálnunk úgynevezett többkomponensű reakciók alkalmazásával az eredeti glikopeptid váz szabad amino csoportját felhasználva [7, 8]. Ezt a vezérfonalat követve több származékképzési eljárást is megvalósítani kívánok a vankomicin, teikoplanin és risztocetin aglikonok illetve pszeudoaglikonok N- és Cterminálison valamint a biaril-éter egységen történő módosítására.
OH
HO O
O
H
HN
N H
O
Cl H H N
O
OH
O
HOOC
HO
Cl
O
H N H H2 N
O
H H N O
N H
CH 3 NH H
O OH OH aglikovankomicin
a. A palládium-katalizált keresztkapcsolási módszerek kimagasló fontosságúak a szerves kémiában egyre bővülő alkalmazhatóságuk és teljesítőképességük révén, melyet hitelesen reprezentál az e terület három alapvető eljárásának kidolgozásáért és további fejlesztéséért odaítélt 2010. évi Kémiai Nobel-díj [9]. Arimoto és társai 2010-ben számoltak be [10] a vankomicin második aminosav egységében végrehajtott regioszelektív Suzuki-Miyaura kapcsolásról. Az így a molekulába épített vinil-biaril funkció figyelemre méltóan javította a vankomicin-rezisztens Staphylococcus aureus elleni hatását a referencia vegyületnek. Mivel O, N-heterociklusos vegyületek palládium-katalizált keresztkapcsolásában jártasságot szereztem [11], széles körben tervezem Suzuki-Miyaura, Heck és Buchwald-Hartwig reakciók alkalmazásával gyarapítani a biaril-éter egységben aril, aralkil, alkil, alkenil és alkilamin szubsztituált glikopeptid antibiotikumokról rendelkezésre álló kémiai és farmakológiai ismereteket.
b. A folyadékkromatográfiás technikák között meghatározó királis elválasztást lehetővé tevő királis állófázisok fejlesztésében már sikerrel alkalmazott egyszerű és hatékony eljárásokat kívánom
származékképzési módszerekre felhasználni [12]. Ilyen reakció az ureténok kialakulásához vezető izocianát addíció, a terminális vicinális diolokból enyhe oxidációval képezhető α-hidroxi-aldehidekkel redukálószer mellett végbemenő reduktív aminálás és a láncvégi epoxidokkal addíciós reakcióban 1,2-aminoalkohol kialakítása. Ezek a példák kizárólag a peptidoglikán struktúrák szabad Nterminálisát érintik, így elsősorban teikoplanin és risztocetin-analogonok esetében lehetnek számottevőek, azonban alkalmasak lehetnek változó méretű lipofil oldalláncok bevitelére megfelelő oldószer választása esetén. Így számottevően bővíthetőek az N-terminálisban szubsztituált analogonokra rendelkezésre álló szerkezet-hatás összefüggések.
c. A C-terminálison elvégzett kémiai módosítások valamelyest kisebb figyelmet kaptak eddig az új antibiotikum-származékok fejlesztésében, azonban igen figyelemre méltó belga és orosz kutatók megfigyelése az e molekularészben kialakított új izokinolin egységek hatásáról [13]. Azt találták, hogy ezek a származékok antiretrovirális, in vitro HIV-ellenes hatást mutatnak, miközben kedvező toxicitási értékekkel bírnak. A különböző telítettségi fokú izokinolin egységek kialakítása a heterociklusos kémia egyik kimagasló területe, elsősorban a természetben nagy számban és változatos szubsztitúciós mintázattal előforduló variánsok miatt [14]. A C-terminális által biztosított karboxil csoport és annak alapreakciókkal előállítható származékai (észterek, amidok, stb.) alkalmas kiinduló pontot jelentenek izokinolin heterogyűrű zárásához. Emellett olyan megoldások is teret nyerhetnek, mint a Noyori és munkatársai által közölt módszer, mely szerint karbonsavak izokinolin egységekkel 1-alkilizokinolin képződése és szén-dioxid kilépése közben reagálnak [15]. Az így előállítandó vegyületek várhatóan antivirális, HIV-ellenes hatást mutatnak.
2. A glikopeptid antibiotikumok nyomelemként előforduló fémionokkal kialakított komplexeinek szerkezeti és biológiai hatása eddig kevéssé vizsgált területnek tekinthető az antibiotikumok gyógyszerészi kémiájában. Néhány alaposan felépített kutatássorozat azonban már rámutatott, elsősorban réz-ionok esetében, a peptidláncon bekövetkező jelentős szerkezeti változásokra, melyek minden bizonnyal élettanilag is fontos szerepet játszanak [16]. Ezeket a vizsgálatokat ki kívánom terjeszteni a vankomicinen túl más peptidoglikán antibiotikumokra és egyéb élettani és az infekció kialakulásánál-transzmissziójánál meghatározó fémionokra (pl.: vas-ionok, mangán-ionok, cinkionok). Ezek a vizsgálatok biztos analitikai hátteret feltételeznek, mely a Debreceni Egyetemen Kémia Intézetében adott és Kutatócsoportunk állandó együttműködő partnerei (Prof. Dr Antus Sándor és Dr. Kurtán Tibor circular dichroismus mérés, Prof. Dr. Batta Gyula NMR mérések, Dr. Bényei Attila röntgen krisztallográfiás mérések) az egyes szakterületek vezető kutatói. Ezek a technikák kiterjednek nagyterű NMR technikákra, cirkuláris dichroizmus mérésekre, röntgendiffrakciós szerkezetmeghatározásokra, elektrokémiai mérésekre és egyéb kapcsolódó módszerekre. Mindezeken túl terveim között szerepel a komplexképzési folyamatok in silico vizsgálata, a szerkezetek feltérképezése és az ismert glikopeptid antibiotikumokra jellemző hatásmechanizmus szempontjából betöltött szerepük tanulmányozása a Debreceni Egyetemen rendelkezésre álló szuperszámítógép alkalmazásával [17].
3. A számítási kémia szerepét azonban nem tervezem korlátozni a fém-komplexekkel kapcsolatos vizsgálatokra, meghatározó szerepet szánok ennek a szerteágazó eszköztárnak az 1-es pontban említett vegyületek tervezése szempontjából (erősen támaszkodva az ismert, hatásos vegyületek szerkezetének elemzésére), és mindezeken túl a glikopeptid antibiotikumok hatásmechanizmusa szempontjából kimagasló ’host-guest’ kölcsönhatások tanulmányozására. A ’host-guest’ kölcsönhatások tanulmányozását kísérletesen tervezem megalapozni, nagy hangsúlyt fektetve az aktív vegyületek esetén elvégzendő modern több-dimenziós (NOESY, TOCSY, ROESY) és a szaturáció transzfer jelenségére alapozott (STD) NMR módszerekre [6b] valamint a mikrokalorimetriás mérésekre [18]. A termodinamikai és molekuláris szerkezeti adatok együttese és az in silico technikák alkalmazása lehetőséget teremt a hatásmechanizmus további részleteinek feltárására. Ezek a vizsgálati technikák szintén elérhetőek a Kémia Intézetében és partnerek bevonásával új információkkal gyarapíthatjuk a glikopeptid antibiotikumok sejtfallal kialakított komplexeiről meglévő ismereteket [19].
Összegzés: Elvárt eredmények, a kutatási eredmények tervezett hasznosítása A kutatási tervben célul kitűzött kémiai és farmakológiai eredmények alapját képezhetik a pályázat pozitív elbírálása esetén évenként legalább három nemzetközi, a tématerületen meghatározó folyóiratban megjelenő szakcikknek illetve évente egy nemzetközi konferencián és legalább kettő hazai rendezvényen bemutatandó poszternek/előadásnak. A pályázó véleménye szerint fontos hátteret jelenthet a pályázatnak, hogy a régió meghatározó (gyógyszer)ipari vállalata, a TEVA Gyógyszergyár zRt. debreceni üzeme, a közelmúltban indította el a vankomicin alapanyag gyártását. A Debreceni Egyetem TEVA Gyógyszergyárban Kihelyezett Tanszékén keresztül reális esély mutatkozik a kutatási együttműködés újbóli kiépítésére. Fontosabb irodalomjegyzék: [1] Williams, D. H.; Bardsley, B. Angew. Chem. Int. Ed. 1999, 38, 1172-1193. Kahne, D.; Leimkuhler, C.; Lu, W.; Walsh, C. Chem. Rev. 2005, 105, 425–448. [2] Crane, C. M.; Pierce, J. G.; Leung, S. S. F.; Tirado-Rives, J.; Jorgensen, W. L.; Boger, D. L. J. Med. Chem. 2010, 53, 7229–7235. [3] Pavlov, A. Y.; Berdnikova, T. F.; Olsufyeva, E. N.; Lazhko, E. I.; Malkova, I. V.; Preobrazhenskaya, M. N. J. Antibiot. 1993, 46, 1731–1739; Balzarini, J.; Keyaerts, E.; Vijgen, L.; Egberink, H.; De Clercq, E.; Van Ranst, M.; Printsevskaya, S. S.; Olsufyeva, E. N.; Solovieva, S. E.; Preobrazhenskaya. M. N. Antiviral Res. 2006, 72, 20–33. [4] Puglisi, J. D. Mol. Cell 2009, 36, 720-724. [5] Preobrazhenskaya, M. N.; Olsufyeva, E. N. Antiviral Res. 2006, 71, 227–236; Křen, V.; Řezanka, T. FEMS Microbiol. Rev. 2008, 32, 858–889. [6] a. Naesens, L.; Vanderlinden, E.; Rőth, E.; Jekő, J.; Andrei, G., Snoeck, R.; Pannecouque, C.; Illyés, E.; Batta, Gy.; Herczegh, P.; Sztaricskai, F. Antiviral Res. 2009, 82, 89–94.
b. Pintér, G.; Batta, Gy.; Kéki, S.; Mándi, A.; Komáromi, I.; Takács-Novák, K.; Sztaricskai, F.; Rőth, E.; Ostorházi, E.; Rozgonyi, F.; Naesens, L.; Herczegh, P. J. Med. Chem. 2009, 52, 6053–606. [7] Sipos, A.; Máté, G.; Rőth, E.; Borbás, A.; Batta, Gy.; Bereczki, I.; Kéki, S.; Jóna, I.; Ostorházi, E.; Rozgonyi, F.; Vanderlinden, E.; Naesens, L.; Herczegh, P. Eur. J. Med. Chem. 2012, 58, 361-367. [8] Sipos, A.; Török, Zs.; Rőth, E.; Kiss-Szikszai, A.; Batta, Gy.; Bereczki, I.; Fejes, Zs.; Borbás, A.; Ostorházi. E.; Rozgonyi, F.; Naesens, L.; Herczegh, P. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2012, 22, 7092-7096. [9] Halford, B. Chem. Engineer. News. 2010, 88, 156-158. [10] Araki, K.; Sawada, Y.; Nakamura, J.; Xu, S.; Miura, K.; Maki, H.; Arimoto, H. J. Med. Chem. 2010, 53, 2528–2533. [11] Sipos A., Berényi S. Lett. Org. Chem. 2007, 4, 146-150; Sipos, A.; Debreceni, Sz.; Szabó, R.; Gyulai, Zs.; Berényi, S. Synth. Commun. 2007, 37, 2549-2558; Berényi, S.; Sipos, A.; Szabó, I., Kálai, T. Synth. Commun. 2007, 37, 467-471. [12] D’Acquarica, I.; Gasparrini, F.; Misiti, D.; Pierini, M.; Villani, C: HPLC Chiral Stationary Phases Containing Macrocyclic Antibiotics: Practical Aspects and Recognition Mechanism; Advances in Chromatography, 46. évfolyam, 109-176. oldalak. [13] Balzarini, J.; Pannecouque, C.; DeClercq, E.; Pavlov, A.; Printsevskaya, S.; Miroshnikova, O.; Reznikova, M.; Preobrazhenskaya, M.N. J. Med. Chem. 2003, 46, 2755–2764. [14] Hermecz, I.; Vasvari-Debreczy, L.; Matyus, P. (8.23 fejezet, 563. oldal), és más fejezetek a Comprehensive Heterocyclic Chemistry; Katritzky, A. R., Rees, C. W., Scriven, E. V. F., Eds.; Pergamon: London, 1996. [15] Noyori, R.; Lato, M.; Kawanisi, M.; Nozaki, H. Tetrahedron 1969, 25, 1125-1169. [16] Swiatek, M.; Valensin, D.; Migliorini, C.; Gaggelli, E.; Valensin, G.; Jezowska-Bojczuk, M. Dalton Trans. 2005, 3808–3813; Kucharczyk, M.; Brzezowska, M.; Maciag, A.; Lis, T.; Jezowska-Bojczuk, M. J. Inorg. Biochem. 2008, 102, 936–942; Brzezowska, M.; Kucharczyk-Klaminska, M.; Bernardi, F.; Valensin, D.; Gaggelli, N.; Gaggelli, E.; Valensin, G.; Jezowska-Bojczuk, M. J. Inorg. Biochem. 2010, 104, 193–198. [17] Yang, Z.; Vorpagel, E. R.; Laskin, J. J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 13013-13022; Li, D.; Sreenivasan, U.; Juranic, N.; Macura, S.; Puga II, F. J.; Frohnert, P. M.; Axelsen, P. H. J. Mol. Recog. 1997, 10, 73-87. [18] McPhail, D.; Cooper, A. J. Chem. Soc., Faraday Trans. 1997, 93, 2283-2289. [19] Rekharsky, M.; Hesek, D.; Lee, M.; Meroueh, S. O.; Inoue, Y.; Mobashery, S. J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 7736-7737.
