Ketrampilan Dasar Laboratorium Program Studi Ilmu Biomedik 20 2011 11
Kuliah 6: Oktober 19 Jadwal praktikum & kuliah UTS Jadwal pertemuan dgn DR Margi Elektroforesis Praktikum 7: Elektroforesis (Agarose serta SDS-PAGE)
Jadwal Kuliah dan Praktikum Ketrampilan Dasar Laboratorium Tugas: laporan praktikum (isolasi DNA dan elektroforesis agarose Okt 26/27 atau isolasi protein pk 14:30-16:30 kelompok pk 12:00-15:00 kelompok dan elektroforesis siang siang SDS-PAGE Proposal untuk metabolisme II Persiapan untuk UTS LT pk 10:00-14:00 Nop 3 (kesempatan untuk latihan teknik2 praktek) diserahkan ke DR Margi UTS LT pk 8:30 sp/d selesai; pakai jadwal (setiap mhs ikut ujian selama 30 Nop 10 menit) Teknik Kultur Sel LT pk Tugas: laporan Nop 16/17 pk 10:00-12:00 KULIAH 7 08:00-11:00/ pk 12:00-15:00 praktikum **HARI RABU** Elektroforesis: pk 12:3014:30 kelompok pagi
HARI KAMIS Elektroforesis pk 08:0011:00 kelompok pagi
UTS
Pada hari Kamis 10 Nopember di Laboratorium Terpadu
60 menit 7-9 soal 4-5 mhs masuk sekaligus Harus bawa pengaris, pensil, balpen dll Bahan/teknik yang diuji dari awal semester sampai praktikum isolasi protein dari darah Boleh bawa bahan penuntun Jadwal akan diumumkan di Biomedik
Topik2 UTS
tgl 10 Nopember 2011
~2 menit
Penggunaan timbangan
~5 menit
Penggunaan pH meter
~10 menit Buat grafik dari data yg disediakan ~2 menit
Penggunaan pipet
~5 menit
Persiapan pengenceran
~5 menit
Penggunaan alat spektrofotometer
~5 menit
Penggunaan alat sentrifuse
Interpretasi hasil (grafik, gel,dll) Langkah-langkah dalam teknik isolasi ~5 menit makromolekul ~5 menit
Jadwal Pertemuan di Ruangan Biomedik
merupakan kesempatan untuk membahas laporan, proposal metabolisme serta hal yang lain yang berkaitan dengan BM 506 30 menit sebaiknya 2 orang sekaligus tolonglah mengisi formulir
Teori Dasar Pemisahan Makromolekul melalui Teknik Elektroforesis pemisahan yg berdasar atas gerakan molekul2 protein atau asam nukleat yg berbeda berat dan muatan daya listrik
+ anode
bagian sempel yg bermuatan negatif
bagian sempel yg bermuatan sempel positif media pendukung (kertas, agarose, poliakrilimide,dll - katode
buffer
Teori Dasar Pemisahan Makromolekul melalui Teknik Elektroforesis
Elektroforesis Agarose (terutama dipakai untuk asam nukleat) Elektroforesis SDS-PAGE (terutama dipakai untuk protein) Kenapakah agarose digunakan untuk asam nukleat dan SDS-PAGE digunakan untuk protein?
Perbedaan elektroforesis agarose dan SDS SDS--PAGE Ukuran por-por bagi gel agarose agak besar. Protein merupakan makromolekul kecil (dibanding dengan molekul asam nukleat) jadi tidak terhambat lewat gel agarose. Akibat tidak dipisahkan dengan jelas. Gel poliakrilimide mempunyai por-por jauh lebih kecil. Selain protein,, gel poliakrilamide bisa A schematic digunakan untuk representation of the memisahkan fragmenagarose gel network fragmen asam nukleat yang kecil ( 10 bp ke atas dengan resolusi sekecil 1 bp)
Scanning electron micrograph of agarose gel (1×1 µm)
Perbedaan elektroforesis agarose dan SDS SDS--PAGE Agarose cocok untuk memisahkan molekul berdasar muatan negatif – tidak semua protein bermuatan negatif. Dengan teknik SDS-PAGE protein-protein dapat dipisahkan berdasar ukurannya oleh karena semua protein dinaturasi dan SDS, yang merupakan anion (bermuatan negatif) mengikat dengan protein
Akibatnya: protein-SDS kompleks bermuatan negatif dan protein yang lebih besar lebih banyak SDS lebih negatif lebih cepat jalan melewati gelnya.
Perbedaan elektroforesis agarose dan SDS SDS--PAGE Protein-protein bisa berinteraksi satu dengan yang lain (atau dengan molekul yang lain, seperti DNA) dan teknik elektroforesis agarose tidak cocok untuk memisahkan kompleks tersebut.
Dengan teknik SDS-PAGE protein-protein mengalami dinaturisasi dan ikatan-ikatan diantara proteinprotein dipecahkan. Akibatnya: hasil SDS-PAGE (untuk pemisahan campuran protein) lebih gampang diinterpretasi dari pada hasil gel agarose.
Elektroforesis Agarose: Asam Nukleat
The most commonly used stain for detecting DNA/RNA is Ethidium Bromide (EtBr). EtBr is a DNA intercalator, inserting itself into the spaces between the base pairs of the double helix.
double stranded DNA separated on agarose; stained with a fluorescent dye Figure 8-33 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Standard Curve: Semi-log
Molecular Weight Determination
100,000
Size (bp) Distance (mm) 11.0
9,400
13.0
6,500
15.0
4,400
18.0
2,300
23.0
2,000
24.0
10,000
Size, base pairs
23,000
B
1,000
100 0
5
10
15
Distance, mm
20
A
25
30
Protein Elektroforesis: sodium dodecyl sulfatesulfatepoliakrilamide gel elektroforesis (SDS--PAGE) (SDS
Detergen SDS digunakan supaya semua protein bermuatan negatif. Kadar poliakrilimida dapat diatur supaya protein2 tertentu dipisahkan berdasar ukurannya
Recommended acrylamide concentration for protein electrophoresis Separation size range (kD) 36-205 24-205 14-205 14-66* 14-45*
% Acrylamide
5% 7.5% 10% 12.5% 15%
* The larger proteins fail to move significantly into the gel
Penggunaan standar pada SDS SDS--PAGE Jarak migrasi protein pada gel SDS-PAGE berhubungan lurus dengan berat molekul (kDaltons) pada skala logarithmik
Contoh2 SDS SDS--PAGE…. PROTEIN2 SERUM
inflamasi serum (kontrol)
sampel2 yg diduga kelainan
normal serum (kontrol)
Contoh2 SDS SDS--PAGE…… MEMONITOR PROSES ISOLASI PROTEIN
Enzyme purification stages (stained with Coomassie Blue)
mw (daltons) 100,000
40,000
15,000
Contoh2 SDS SDS--PAGE…… 2D (D (DUA DIMENSI )SDS )SDS--PAGE 2D SDS-PAGE dari jaringan hati mencit dimana lebih dari 1000 protein (spots) dapat dibedakan (ukuran gel = 24cm; radiolabelled)
Digunakan untuk mengikuti perubahan2 yang terjadi pada suatu protein yang berada di tipe sel atau jaringan tertentu
Ada alat 2D SDS-PAGE di Lab Terpadu USU
PAGE untuk Asam Nukleat 100
Elektroforesis Agarose untuk Asam Nukleat
50
10
single stranded DNA separated with PAGE; 1,2,3,4 indicate fragments ending in G,A,T and C respectively
double stranded DNA separated on agarose; stained with a fluorescent dye Figure 8-33 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Langkah--langkah sesudah elektroforesis Langkah elektroforesis?? DNA (elektroforesis agarose) : Ukur jarak pita-pita dari awal gel pemisah dan memperbandingkan dengan standar supaya dapat berat fragmen DNA Mentransfer ke membran (electrophorectic transfer) untuk Southern blotting, yaitu meneliti lebih lanjut dengan probe-probe DNA. Northern blotting: meneliti hasil elektroforesis RNA lebih lanjut dengan probe hibridisasi RNA Eastern blotting: meneliti hasil elektroforesis protein dengan probe khusus utk karbohidrat, lipida atau fosforilasi supaya modifikasi post-translational pada protein dapat didektsi
Langkah--langkah sesudah elektroforesis Langkah elektroforesis?? PROTEIN: Fixation dan mewarnai dengan larutan 9:2:9 (metanol: akuades: asam asetic) dan perwarna Coomassie Blue. Lalu mencuci. Ukur jarak pita-pita dari awal gel pemisah dan memperbandingkan dengan standar supaya dapat berat molekulnya Mentransfer ke membran (electrophorectic transfer) untuk Western blotting, yaitu meneliti lebih lanjut dengan antibodi-antibodi.
Praktikum 7 Elektroforesis:: Agarose Elektroforesis serta SDS SDS--PAGE
Tgl 26 dan 27 Oktober Bagian praktikum Hari Rabu: SDS-PAGE hasil isolasi protein (dijalankan 4-8 jam) Hari Kamis: Hasil SDS-PAGE dicuci dan elektroforesis agarose hasil isolasi DNA serta PCR
Gel SDSSDS-PAGE disiapkan disiapkan…. …. Plat dan klem Video (alat-alat yang agak terkini dibanding dengan alat kita!!)
Sampel-sampel protein yg terisolasi dari Sampeldarah dapat diperiksa dengan SDS SDS--PAGE **Tambahan kegiatan** praktikum isolasi protein berada di situs web kita –
protokol mengukur konsentrasi protein dengan reagensia Buiret
M S Gs Gp Es Ep ......
group meja 1 2 3 4
st 1.043 0.977 1.085 1.064
plasma M S Gs Gp Es Ep 1.157 0.77 4 0.991 0.022 0.148 0.253 1.03 0.475 4 0.895 0.029 2.042 2.472 1.015 0.639 4 0.982 0.024 1.31 3.472 0.987 1.433 4 0.993 0.039 1.27 1.309 **konsentrasi standar = 2g/100ml
Hasil SDS SDS--PAGE protein dari darah dari tahun 2010
St St Gs Es S P S M Es Gs P Gp Ep St S M Ep P Es Gp Gs St M S Gp Ep Es P Gs
P Ep Es Gp Gs S M St Ep Es Gp Gs S M P St
Elektroforesis Agarose utk DNA
An agarose gel is prepared by combining agarose powder and a buffer solution.
Buffer
Flask for boiling
Agarose
Preparing the Casting Tray
casting tray and combs
Seal the edges of the casting tray and put in the combs. Place the casting tray on a level surface. None of the gel combs should be touching the surface of the casting tray.
Melting the Agarose Heat carefully until the solution boils
Agarose is insoluble at room temperature
After boiling the solution is clear
Pouring the Gel
Allow the agarose solution to cool slightly (~60ºC). Carefully pour the agarose solution into the casting tray. Avoid air bubbles.
Allow to cool (30-45 minutes) so that the agarose polymerizes, forming a flexible gel. Remove the combs and tape.
Prepare the electrophoresis chamber
buffer
kutub minus
wells
kutub plus
Place the gel in the electrophoresis chamber. Add enough electrophoresis buffer to cover the gel to a depth of at least 1 mm. Make sure each well is filled with buffer.
Applying the samples DNA samples (human and fruit) are mixed with sample loading buffer and tracking dye. This allows the samples to be seen when loading onto the gel, and increases the density of the samples, causing them to sink into the gel wells. Loading Buffer: Bromophenol Blue (for color) Glycerol (for weight)
Carefully place the micropipette tip over a well and gently expel the sample. The sample should sink into the well. Be careful not to puncture the gel with the pipette tip.
Running the gel 1. Place the cover on the electrophoresis chamber, connecting the electrical leads. 2. Connect the electrical leads to the power supply. 3. When the power is turned on, bubbles should form on the electrodes in the electrophoresis chamber. (-) wells
DNA (-)
dye marker Gel
(+)
After the current is applied, make sure the gel is running in the correct direction. The dye used will run in the same direction as the DNA. Run the gel for 30 minutes.
Visualising the gel 1. Turn off the electrophoresis apparatus.
2. Remove the gel from the chamber and transfer it to the UV reader platform.
3. Turn on the UV lamp and view the DNA bands
Laporan:: Laporan Anda harus menyiapkan laporan mengenai praktikum isolasi DNA dan elektroforesis agarose atau mengenai praktikum isolasi protein dan SDSPAGE
References:: References Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K. & Walter, P. 2008. Molecular Biology of the Cell (5th ed), Garland Science, Taylor & Francis Group, New York. Dunn, S.M.J. 1990. PMCOL 306 Course Notes, University of Alberta Pharmacology Department Holme, D. J. & Peck, H. 1998. Analytical Biochemistry (3rd ed), Addison Wesley Longman Inc., New York.
