Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem Vegyészmérnöki és Biomérnöki Kar Fizikai Kémia és Anyagtudományi Tanszék Kolloidkémia Csoport
Kitozán-zselatin hibrid filmek előállítása és tulajdonságai Szakdolgozat Készítette: Komlai Krisztina Témavezető: Dr. Hórvölgyi Zoltán Egyetemi docens
Konzulens: Kabainé Dr. Faix Márta Tudományos tanácsadó
Budapest, 2010
Köszönetnyilvánítás Szeretnék köszönetet mondani mindazoknak, akik segítettek szakdolgozatom elkészítésében. Köszönöm Dr. Hórvölgyi Zoltán docens úrnak, témavezetőmnek, dolgozatom elkészítéséhez nyújtott szakmai segítségét, iránymutatását. Hálásan köszönöm
Kabainé Dr. Faix
Márta tudományos
tanácsadónak,
konzulensemnek, hogy mindvégig irányította munkámat, fáradhatatlanul segített a felmerülő problémák megoldásában. Nélkülük ez a dolgozat létre sem jöhetett volna. A BME Anyagtudomány és Technológia Tanszék munkatársainak, Májlinger Kornél egyetemi tanársegédnek és Nagy Péter doktoránsnak, hogy lehetővé tették a SEM felvételek elkészítését. A BME Fizikai Kémia és Anyagtudományi Tanszék Lágy Anyagok Kutatócsoport valamennyi tagjának, hogy segítették a mechanikai mérések elvégzését. A BME Fizikai Kémia és Anyagtudományi Tanszék Kolloidkémia Csoport valamennyi dolgozó vagy hallgatói státuszban lévő tagjának, elsősorban Mártonné Pakai Márta vegyésztechnikusnak és Volentiru Emőke tudományos segédmunkatársnak, munkám során nyújtott kedvességüket, segítőkészségüket, a kellemes légkört. Végül szüleimnek, hogy egyetemi tanulmányaim alatt végig lelkesen támogattak, bíztattak.
A munkát anyagilag támogatták: Országos Tudományos Kutatási Alap (OTKA CK 78629), Nemzeti Fejlesztési Ügynökség (Társadalmi Megújulás Operatív Program, TÁMOP 4.2.1/B-09/1/KMR-2010-0002), Nemzeti Kutatási és Technológiai Hivatal (NKTH - A*STAR Kétoldalú TéT Pályázat, BIOSPONA)
1
Tartalomjegyzék Rövidítésjegyzék ....................................................................................................................... 4 1 Bevezetés .................................................................................................................................. 5 2 Irodalmi áttekintés ............................................................................................................. 6 2.1 Kitozán ......................................................................................................................... 6 2.2 Zselatin......................................................................................................................... 8 2.3 Kitozán film tulajdonságainak javítása ........................................................................ 9 2.4 Kitozán/zselatin hibrid filmek és egyéb rendszerek .................................................... 9
3 Kísérleti rész ........................................................................................................................ 13 3.1 Felhasznált anyagok ................................................................................................... 13 3.2 Felhasznált eszközök ................................................................................................. 14 3.3 Filmképzés ................................................................................................................. 14 3.3.1 Film előállítása kitozán hidrogélből préseléssel.................................................. 14 3.3.2 Film preparálása oldat öntéssel/elpárologtatással ............................................... 15 3.3.3 A filmek térhálósítása.......................................................................................... 15 3.4 Duzzadási vizsgálat.................................................................................................... 16 3.5 Morfológiai vizsgálatok ............................................................................................. 16 3.6 Nedvesedési vizsgálatok ............................................................................................ 17 3.7 Mechanikai vizsgálatok ............................................................................................. 17
4 Kísérleti eredmények, eredmények értékelése................................................... 18 4.1 Az előkísérletek során nyert eredmények .................................................................. 18 4.1.1 Filmképzés .......................................................................................................... 18 4.1.2 Térhálósítás hatása .............................................................................................. 19 4.2 Duzzadási vizsgálatok................................................................................................ 21 4.3 Morfológiai vizsgálatok ............................................................................................. 23 4.4 Nedvesedési vizsgálatok ............................................................................................ 25 4.5 Mechanikai vizsgálatok ............................................................................................. 27
2
5 Összefoglalás........................................................................................................................ 28 Irodalomjegyzék ..................................................................................................................... 30
3
Rövidítésjegyzék Az aminosavak jelölésére a peptidkémiában használt hárombetűs rövidítéseket alkalmaztam.
Név
Hárombetűs rövidítés
Alanin Arginin Aszparaginsav Glicin Glutaminsav Hidroxiprolin Prolin
Ala Arg Asp Gly Glu Hyp Pro
AcOH
Ecetsav
DA
Duzzadási arány
DD
Deacetilezettség foka
HPN
Hibrid polimer hálózat
K
Kitozán
KZ
Kitozán/zselatin hybrid film
NaAc
Nátrium-acetát
NaCMC
Karboximetil-cellulóz nátruim sója
PB
Foszfát puffer
PEG
Polietilénglikol
PVA
Polivinilalkohol
PVP
Polivinil-pirrolidon
SEM
Pásztázó elektronmikroszkóp
XRD
Röntgendiffrakciós módszer
Zs
Zselatin
4
1 Bevezetés Napjainkban nagymértékben megnövekedett a biopolimerek iránti érdeklődés, igény A műanyagokhoz képest, - melyek már önmagukban is rengeteg előnyös tulajdonsággal rendelkeznek (pl.: könnyűek, törésállók, vízzárók vagy vízoldhatók, ridegek vagy rugalmasak, hosszú élettartalmúak, könnyen kezelhetők és feldolgozhatók) – további különleges tulajdonságokat rendelkeznek. Ilyen például az, hogy biológiai úton lebomlanak,
azaz
biodegradábilisak.
Ez
adja
környezetvédelmi
területen
való
felhasználásuk iránti fokozódó érdeklődést. Megújuló nyersanyagforrásokból hozhatjuk létre, ezáltal takarékoskodhatunk az értékes fosszilis nyersanyagokkal. Új hulladékkezelési lehetőséget biztosítanak és a hagyományos műanyagokhoz viszonyítva csökkennek az ezzel járó költségek is. [1] A szakdolgozatom tárgya a kitozán is egyfajta biopolimer. Előnyös tulajdonságai nagyban szerepet játszanak abban, hogy egyre elterjedtebb, s ez által szélesebb körben alkalmazzák
(orvosbiológiai,
biotechnológiai,
gyógyszerkémiai).
Ilyen
előnyös
tulajdonságok például: a biokompatibilitás és a biológiai lebonthatóság. Más, szintetikus és természetes, biodegradábilis és kompatibilis polimerekkel (pl.: PVP, PVA, PEG, NaCMC stb.) társítva, jelentősen javíthatjuk a mechanikai, kolloidkémiai, hatóanyag megkötési tulajdonságait. [2–5] Kísérleti munkám során különböző összetételű kitozán/zselatin filmeket állítottam elő és vizsgáltam a filmek duzzadási, morfológiai, nedvesedési és mechanikai tulajdonságait. Vizsgáltam azt, hogy a kitozán/zselatin arány, a duzzasztó közeg pH-ja és a térhálósítás milyen hatással van a filmek duzzadására. A vizsgálatok során nyert eredmények hozzájárulhatnak a kitozán/zselatin filmek, membránok, mikro- és makro hidrogélek, kriogélek és mag-héj („core-shell”) szerkezetű hatóanyag hordozó mátrixok fejlesztéséhez.
5
2 Irodalmi áttekintés 2.1 Kitozán A kitin a második leggyakoribb természetes polimer a cellulóz után. Megtalálható a rákok páncéljában, gombákban. A kitozán (1. ábra), amelyet a kitin lúgos deacetilezésével állítják elő (2. ábra), egy lineáris, kristályos szerkezetű biopolimer, mely számos előnyös tulajdonsággal
rendelkezik:
biológiailag
lebontható,
nem
mérgező,
valamint
antimikrobiális hatású. A deacetilezési fok (DD) 60-100%-ig terjedhet. Ezen jellemzőknek köszönhetően széles körben alkalmazzák akár önmagában, akár egyéb, természetes illetve mesterséges polimerekkel keverve. [6]
OH
OH HO HO
O
OH O
O
O
HO
O HO
NH2
N
1. ábra: A kitozán szerkezete
2. ábra: Kitozán előállítása a kitin deacetilezésével [7]
6
OH NH2
NH2
Antimikrobiális hatás A
kitozánt
antimikrobiális
hatásának
köszönhetően
felhasználják
az
élelmiszeriparban, textiliparban és a mezőgazdaságban. Alkalmazzák továbbá víztisztító membránoknál és kozmetikumok összetevőjeként is. Nem csak baktériumok, hanem fonalas gombák és élesztő gombák ellen is hatásosnak bizonyult. Antibakteriális hatását több tényező befolyásolhatja: [6] 1) Mikrobiális tényezők, a kapcsolódó mikroorganizmus fajtája és a sejt kora; Eltérő hatékonyságot mutat a Gram-negatív és a Gram-pozitív baktériumokkal szemben, melynek oka valószínűleg az eltérő sejtfelszíni tulajdonságokban keresendő. A tanulmányok kimutatták, hogy a gombák érzékenyebben viselkedtek a kitozánnal szemben, mint a gombák.
2)
A kitozánt jellemző fizikai és kémiai paraméterek: pozitív töltéssűrűség, molekulatömeg, hidrofil/hidrofób karakterisztika, kelátképző képesség; A pozitív töltéssűrűség (polikationos szerkezet) alapvető fontosságú az erős elektrosztatikus
kölcsönhatás
kialakításában.
A
magasabb
DD
nagyobb
töltéssűrűséghez vezet, mely biztosítja a kedvezőbb hatást. A molekulatömeggel kapcsolatban számos ellentétes eredmény született már, egyes vizsgálatok szerint a növekedésével csökken az antimikrobiális hatás, mások szerint épp a magas molekulatömeg kedvez e tulajdonságnak.
3)
Fizikai állapot: vízben oldott vagy szilárd kitozán A mikrobaölő sajátság szempontjából nem mindegy, hogy a kitozánt oldott- vagy szilárd állapotban (például filmként) használjuk-e fel.
4)
Környezeti tényezők: a közeg ionerőssége, pH, hőmérséklet; A kutatások bebizonyították, hogy a kitozán antimikrobiális tevékenysége pH függő. Nem csak azért, mert a biopolimer savas közegben oldódik, hanem mert ebben a környezetben már polikationos formában van jelen, melynek jelentőségét fentebb tárgyaltam. [6, 8]
7
2.2 Zselatin Biokompatibilis
polipeptid,
mely
a
szervezetbe
kerülve
antigenitást
és
bioadszorptivitást mutat. Gyakran használják a gyógyászatban, köszönhetően annak, hogy gélesedési hőmérséklete közel azonos az emberi testhőmérséklettel. Egyéb kedvező jellemzője a plaszticitás és a tapadóképesség, valamint a viszonylag alacsony ár. Ennek köszönhetően alkalmazzák kapszulák, kötszerek, sebészeti célú adszorbens párnák összetevőjeként, s nagy szerepet játszik a 3 dimenziós szöveti regenerációban is. [9 – 12] Amorf polimer, melynek fontosabb építőelemei a 3. ábrán feltüntetett aminosavak.
Zselatin aminosav összetétele
21%
22%
6%
12% 8% 12%
9%
Gly
Pro
10%
Hyp
Glu
3. ábra: Zselatin aminosav összetétele
8
Ala
Arg
Asp
Egyéb
2.3 Kitozán film tulajdonságainak javítása Annak ellenére, hogy számos kedvező tulajdonsággal rendelkezik, a nem megfelelő mechanikai sajátságok (merev, törékeny) nagyban korlátozzák a kitozán film felhasználását. [10] Ennek kiküszöbölésére más, természetes vagy akár mesterséges polimerekkel szokták társítani. Ilyen polimerek például: PVP, itt is csak korlátozott felhasználásról beszélhetünk, lévén még mindig nem teljesen megfelelőek a mechanikai tulajdonságok. [4] PEG, szintén biológiailag összeférhető és nem toxikus; kitozán/PEG film szabályozott hatóanyag-leadását vizsgálták [2] Poliolok/glicerin, lágyítóként használják összetett filmek gyártásánál; A lágyító használatának
következtében
csökken
a
rugalmassági
modulusza
és
a
szakítószilárdsága a filmnek (30%-os lágyító tartalom mellett legfeljebb 50%-al csökken), ellenben a relatív megnyúlás értéke növekszik (akár 150%-a is lehet az eredeti értéknek) [9] NaCMC, kitozánnal társítva oldható polielektrolitkomplex hozható létre, mellyel javítható a membrán szeparációs eljárás hatékonysága [3] Alginát, jó bevonatképző, kitozánnal képzett kétrétegű membránját dializáló készülékekben alkalmazzák [13] PVA, membránok, orvosbiológiai felhasználás [14]
2.4 Kitozán/zselatin hibrid filmek és egyéb rendszerek A kitozánt szívesen társítják zselatinnal. Ennek talán az egyik fő oka az, hogy az így készített hibrid filmeket, makro-, mikro- vagy nanorészecskéket, szálakat lio-, xero-, ill. kriogél formában az orvosbiológia és a biotechnológia területén alkalmazzák. Megjegyzendő, hogy folynak próbálkozások ehető, biológiailag lebomló csomagolóanyag kifejlesztésére is.
9
Ezeket a csomagolóanyagokat aktív biofilmeknek nevezik és a kitozánt nem kizárólag zselatinnal, hanem más anyagokkal is társítják: növényi és állati fehérjékkel, poliszacharidokkal, antimikrobiális peptidekkel (pl.: kitozán - tápióka keményítő alapú étkezési filmek és bevonatok, kitozán – tejsavó fehérje filmek, hal zselatin – kitozán filmek stb.). [8]
A filmek tulajdonságait a polimer láncok között kialakuló kölcsönhatás befolyásolja. Sok esetben hogy a polimerek kompatibilisek legyenek, azaz molekulárisan elegyedjenek egymással.
4. ábra: Kölcsönhatások a polimer molekulák között; (a) kitozán molekulák között kialakult térháló sematikus rajza, (b) különböző polimer molekulák között kialakuló térháló sematikus rajza (hibrid polimer hálózat: HPN) [15] Vastag vonal: kitozán molekulák, Vékony vonal: másik polimer, +: pozitív töltés A 4. ábrán látható, hogy a kitozán polimer láncok egymással is képesek kölcsönhatásba lépni, közöttük másodlagos inter- és intramolekuláris kötések alakulnak ki. Egy hibrid polimer hálózatnál - amilyen például a kitozán/zselatin hibrid - szintén erős intermolekuláris kölcsönhatás, hidrogénkötés lép fel a két polimer láncai között. A kitozánt, más töltéssel nem rendelkező polimerekkel társítva szintén hidrogénkötések alakulnak ki. A kötések kialakulása a polimer láncokon megtalálható amino-, hidroxil- és karboxil csoportoknak köszönhető. Az így létrejött filmek hatóanyag leadási – és mechanikai tulajdonságai jelentősen függnek a keresztkötések sűrűségétől.
10
A kölcsönhatásoknak köszönhetően egy hálószerű struktúra alakul ki, amely lehetővé teszi a bioaktív vegyületek felvételét és ezen anyagok diffúzió útján történő kibocsátását. [15] Zselatinnal való kölcsönhatáskor csökken a kitozán kristályossága, melyet XRD vizsgálattal igazoltak [11]. Az 5. ábrán látható, ahogyan nő a filmek zselatin tartalma, a röntgen diffrakciós csúcsok intenzitása egyre csökken. Ebből arra lehet következtetni, hogy a kitozán kristályossági foka csökken.
5. ábra: XRD felvételek; a) m-1 minta 0,3 kitozán tartalom, b) m-2 minta 0,5 kitozán tartalom, c) m-3 minta 0,7 kitozán tartalom, d) m-4 minta/ kitozán membrán [11] Kitozán/zselatin kriogél A kitozán/zselatin hibrideket hidrogél képző tulajdonságuk következtében kriogélek
előállításához
is
felhasználják.
A
kriogél
általában
összekapcsolt
makropórusokból áll, ahol akadálytalanul áramolhatnak akár a nano-, akár a mikroszemcsék is. Előállításuk az oldószer kristályosodási hőmérsékleténél alacsonyabb hőfokon történik. A fagyasztás során a folyadék kristályok növekednek, felületük
11
találkozik, miközben a prekurzol-szol töményedik és megindul a gélesedési folyamat A rendszert kiolvasztva összefüggő pórushálózatot kapunk. [16] A kitozán/zselatin kriogéleket szövetek létrehozásához használják. A kriogélre építik fel az élő szövetet és ezt ültetik vissza a páciensbe. A kriogél biológiailag lebomlik és úgy viselkedik, mint egy extracelluláris mátrix, amely sablonként szolgál a sejtadhézióhoz, a szöveti fejlődéshez és annak terjedéséhez. [17]
12
3 Kísérleti rész 3.1 Felhasznált anyagok Kitozán/ zselatin hibrid filmek előállításához felhasznált anyagok Kitozán,
közepes mólsúlyú, 98%-ban deacetilezett,
Aldrich;
Zselatin,
egyéb információt nem tudtak róla megadni,
Lágymányosi Patika;
Ecetsav,
100%-os, a.r.,
Merck;
NaOH,
szemcsés, puriss.,
Reanal;
Desztillált víz Duzzadási vizsgálatokhoz használt anyagok saját készítésű*,
PB puffer,
Merck
NaAc-os puffer, saját készítésű**,
Merck
Térhálósításhoz használt anyagok Trinátrium-citrát, a.t. ,
Reanal
* 0,2 M törzsoldat: 31,74 g/l NaH2PO4.H2O és 73,14 g/l Na2HPO4.12H2O, a.t. ** 0,1 M törzsoldat: 5,72 cm3/l ecetsavat és 13,6 g/l NaAc-ot , a.t. 1. táblázat: Különböző pH-jú puffer oldatok összetétele Bemért törzsoldatok (ml) pH
AcOH
NaAc
NaH2PO4.H2O
Na2HPO4.12H2O
4
84,7
15,3
-
-
4,8
35,7
64,3
-
-
5,8
5,2
94,8
-
-
7,2
-
-
28
72
8
-
-
5,3
94,7
13
3.2 Felhasznált eszközök 1) Tára mérleg (Sartorius Laboratory) 2) Analitikai mérleg (Ohaus Explorer) 3) Ultrahangos kád (Elmasonic S 15 H) 4) Kézi pH mérő (Adwa AD11) 5) Video kamera (Elektro Optika Kft.) 6) Centrifuga (Orto Alresa) 7) Pásztázó elektronmikroszkóp (BAL TEC SCD 005 sputter coater; Philips XL30 FEG ESEM) 8) Szakítógép (Instron 5543)
3.3 Filmképzés 3.3.1 Film előállítása kitozán hidrogélből préseléssel A munkám során kitozán hidrogélből próbáltam filmet előállítani préseléses módszerrel. [11] Kitozán hidrogél előállítása: 0,1 g kitozánt oldottam 100 ml 2 V/V%-os ecetsav oldatban. A kitozán oldatot állni hagytam a polimer teljes feloldódásáig. Ezután elkezdtem lassan csepegtetni a 10m/V%-os vizes NaOH oldatot a kitozán oldatba, addig amíg el nem értem a 11-es pH-t. Ekkor az oldat kitozán hidrogél keletkezése következtében beopálosodott (fázis szeparáció) történik?). A keletkezett gélszuszpenziót dekantálva mostam mindaddig, amíg a közeg pHja 7 lett.
A szuszpenziót 3900-as fordulaton 40 percig centrifugáltam. A dekantálás
végeztével a felülúszót leöntöttem. Kitozán/zselatin oldat és film preparálása: 2 m/V%-os zselatin oldatot készítettem, majd a hidrogélt a zselatin oldattal elegyítettem, és 50oC-on kevertettem. Az oldatot szűrőpapíron leszűrtem, és megpróbáltam két műanyag lap között filmmé préselni.
14
3.3.2 Film preparálása oldat öntéssel/elpárologtatással („Casting/solvent evaporation technique”) Oldatok elkészítése: 2,5 g kitozánt oldottam 250 ml 1%-os ecetsav oldatban. Az így előállított oldat kitozánra nézve 1%-os volt. 10 g zselatint oldottam 10 ml desztillált vízben melegítés közben. Különböző összetételű filmek preparálása: 20 ml kitozán oldathoz hozzáadtam a választott arányoknak megfelelő zselatin oldatot, valamint készítettem csak kitozánt és csak zselatint tartalmazó filmeket is. A mintákat Petri-csészébe öntöttem, majd több napi levegőn való szárítás után spatula segítségével leválasztottam a filmeket az üveg edényről, s az összetétel szerint borítékban tároltam őket.
Az alábbi mintákat állítottam elő: 2. táblázat: Kitozán/zselatin hibrid filmek összetétele és kódja; K: kitozán, KZs: kitozán/zselatin hibrid, Zs: zselatin Mintaazonosító
Keverési arány (K/Zs)
K KZs-2 KZs-1 KZs-0,5
1:0 1:0,5 1:1 0,5:1
Zs
0:1
3.3.3 A filmek térhálósítása A filmeket száradás után feldaraboltam, majd analitikai mérlegen lemértem a tömegüket. Ezután elkészítettem a 2%-os trinátrium-citrát oldatot, majd 20%-os ecetsavval a pH-t 6-ra állítottam. A filmeket ebben a közegbe mártottam úgy, hogy a film teljes felületét nedvesítse. 45 perc után a mintát kivettem az oldatból, desztillált vízzel mostam és papírvattával leitattam. Az így készített filmek duzzadási tulajdonságait vizsgáltam. 15
3.4 Duzzadási vizsgálat Az általam készített filmeken duzzadási vizsgálatokat végeztem. Ehhez desztillált vizet és különböző puffer oldatokat használtam. A puffer oldatok pH-ja rendre a következő volt: 4 pH; 4,8 pH; 5,8 pH; 7,2 pH; 8 pH. 1) A kész, kiszáradt filmből levágtam egy darabot, aminek analitikai mérlegen lemértem a tömegét. 2) Majd Petri-csészébe tettem és 20 ml puffer oldattal/desztillált vízzel felöltöttem. 3) A filmet úgy helyeztem el, hogy minden oldalról levegőmentesen körbevegye a duzzasztó közeg. 4) A mintákat 30 percig duzzasztottam, majd analitikai mérleg mellett kivettem őket a duzzasztó folyadékból, papírtörlő segítségével leitattam a felesleges folyadékot és lemértem a duzzasztott film tömegét. 5) Ezután óraüvegen/üveglapon/Petri-csészében szárítottam és a tömeg állandóság beállta után visszamértem analitikai mérlegen. A duzzadást a duzzadási aránnyal jellemeztem
(1)
3.5 Morfológiai vizsgálatok A méréseket SEM-el végeztem. A felület vizsgálatához a filmből levágtam egy tetszőleges méretű darabot, amit kétoldalú szénszalaggal ellátott mintatartóra ragasztottam. A keresztmetszeti képhez a filmeket szakítottam, és ezeket a mintákat is hasonló módon rögzítettem. Ez az eljárás nem tekinthető szabványosnak, az irodalom szerint a filmeket folyékony nitrogénbe kéne mártani és aztán eltörni. [18] Mivel a mintáim nem vezetők, ezért mérés előtt aranyozni kellett őket, s csak eztán helyezhettük be a mintatartót a készülékbe.
A
vákuum
beállása
után
16
elkészítettük
a
felvételeket.
3.6 Nedvesedési vizsgálatok A szokásos módon képzett filmek nem bizonyultak megfelelőnek ezen vizsgálat elvégzéséhez (nem volt vízszintes felület, amin mérni lehetett volna). Ezért a nedvesedési vizsgálatokhoz új mintákat állítottam elő. Mikroszkóp tárgylemezeket vágtam félbe üvegvágó
segítségével
és
az
elkészített
oldatokat
erre
öntöttem
rá,
majd
szobahőmérsékleten szárítottam. Az így kapott filmek a vizsgálat során kezelhetőek voltak. A mérést telített gőztérben végeztem ülő csepp módszerrel. Az üvegkalitkában lévő vattára desztillált vizet csöpögtettem, majd lezártam egy fóliával és 30 percig hagytam állni. Ekkor behelyeztem a mintát, s ismét rögzítettem a fóliát. Beállítottam a mikroszkóp lámpát, hogy megfelelő megvilágításba helyezzem a filmet. A kamera összeszerelése és beüzemelése után, Hamilton-fecskendő segítségével desztillált vízből 10 l-es cseppet építettem a film felületére, közben digitális felvételt készítettem, amiből a későbbiek során a Pinnacle Studio 9.4-es verziójú programmal kivágtam a szükséges képeket, majd a megfelelő alkalmazás segítségével érintő módszerrel meghatároztam a
peremszögeket. A
cseppfelépítési technikával haladó peremszögek közel maximális értékeit határoztam meg.
3.7 Mechanikai vizsgálatok A mechanikai vizsgálatokhoz Instron 5543 szakítógépet használtam. A szakítószilárdság méréséhez az általam elkészített próbatesten (5mm x 50 mm –es filmcsík) statikus szakítóvizsgálatot végeztem. Ez azt jelenti, hogy a gép lassan, fokozatosan növelte a húzóerőt, miközben rögzítette a minta feszültség-alakváltozás diagramját. [19] A szakítógépre az 50 N-os mérőfejet szereltem, majd a filmcsíkot a befogó pofákba rögzítettem. (Hogy ki ne csússzon papírt hajtogattam a végére, rögzítés előtt.) A filmeket 1 mm/sec sebességgel szakítottam.
17
4 Kísérleti eredmények, eredmények értékelése 4.1 Az előkísérletek során nyert eredmények A Kolloidkémia Csoportnál kitozánnal foglalkozó tanulmányok korábban nem folytak, ezért nagyon fontos volt bizonyos előkísérletek elvégzése. A filmek tulajdonságát nagymértékben befolyásolhatja a kitozán deacetilezettségi foka, molekulatömege és sokszor az eredete is. Ezért az irodalomban megtalálható recepteket egy az egyben nem tudtam alkalmazni. Azt tapasztaltam, hogy a filmek desztillált vízben való duzzasztásakor, az eredmények nagyon szórtak, ezért a duzzadási vizsgálatokat mindig puffer oldatban végeztem.
4.1.1 Filmképzés Film előállítása különböző technikákkal A préseléses eljárást pár próbálkozás után elvetettem. Ennek oka, hogy az előállítás hosszadalmas volt, és nem lehetett homogén, transzparens filmeket készíteni. Emellett nem tudtam a megfelelő körülményeket biztosítani, ugyanis préselésre alkalmas szerkezet nem állt rendelkezésemre. Ezzel szemben az öntéses módszer alkalmazhatónak bizonyult. Kezdetben az oldatot üveglapra öntöttem, de az így öntött filmeket nem lehetett szépen, egybefüggően leszedni a felületről. Próbálkoztam műanyag lemezre való öntéssel is. Végül is a filmképzést úgy hajtottam végre, hogy Petri - csészébe öntöttem és így egyenletes vastagságú filmet kaptam. (A filmek vastagságát a sűrűséget 1-nek véve 30-35 µm-re becsültük, de ezt az adatot nem használtuk fel)
18
Kevertetési idő és hőmérséklet hatása az előállított filmek duzzadására A méréshez a KZs-1 kódú mintát használtam. Az első esetben (KZs-1a) az oldatokat melegítettem, majd üvegbot segítségével összekevertem és filmet öntöttem. A második esetben (KZs-1b) a hőmérsékletet 55-60°C között tartva, 1 órán keresztül kevertettem az oldatot. A 3. táblázatban és a 6. ábrán jól látható, hogy a két módszer alkalmazásával lényeges különbség nem tapasztalható az egyes filmek duzzadási tulajdonságaiban. Az egyetlen szembeötlő eltérés, hogy a KZs-1b minta duzzadása 4,8-as pH-nál is mérhető volt, ezzel szemben a KZs-1a minta ezen a pH-n beoldódott a puffer oldatba. 3. táblázat: Kevertetés körülményeinek hatása a duzzadási arányra eltérő pH-knál Duzzadási arány pH
KZs-1a
KZs-1b
4,0
-
-
4,8
-
43,70
5,8
38,93
30,32
7,2
5,40
6,27
8,0
6,50
6,00
4.1.2 Térhálósítás hatása Ismeretes,
hogy
a
kitozán
filmek
duzzadása
Megvizsgáltuk, hogy a hibrid filmek duzzadására
térhálósítással
csökkenthető.
egy többértékű anionnal való
térhálósítás miként hat. KZs-1 és KZs-2 jelű mintákat 2%-os trinátrium-citráttal térhálósítottam. Az eredmények azt mutatták, hogy térhálósítás esetén a filmek jóval kisebb mértékben duzzadtak, mint a nem térhálósított minták (7. ábra). Ennek oka az, hogy a polimer molekulák között jóval sűrűbben fordulnak elő keresztkötések, melyek rögzítik a láncokat, ezzel lecsökkentve a duzzadás mértékét.
19
Térhálósított minta duzzadási aránya az összetétel függvényében Duzzadási arány
70,00 60,00 50,00 KZs-2
40,00
KZs-2 térhálósított
30,00
KZs-1 20,00
KZs-1 térhálósított
10,00 0,00
Összetétel
7. ábra: Különböző összetételű (KZs-2 és KZs-1) térhálósított és nem térhálósított minta duzzadási vizsgálatának eredményei. A duzzasztó oldat pH-ja 5,8.
20
4.2 Duzzadási vizsgálatok Kitozán/zselatin tömegarány és pH hatása a duzzadásra Az előkísérletek során bebizonyosodott, hogy a pH nagy szerepet játszik a filmek duzzadásában. Ezért a duzzadást különböző (4-8 pH-jú) puffer oldatokban vizsgáltam. Az eredményeket a 4. táblázatban valamint a 8. ábrán mutatom be. A méréseknél gondot okozott a duzzadt filmek kivétele a folyadék közegből és a felületre tapadt víz eltávolítása papírtörlővel. A megbízhatatlan eredményeket a táblázatban nem tüntettem fel. A feltüntetett értékek szórása 10% körül volt. 4. táblázat: Összefoglaló táblázat, Duzzadási vizsgálatok különböző pH-kon és eltérő összetételnél pH
K
KZs-2
Duzzadási arány KZs-1
4,0 4,8 5,8 7,2 8,0
11,68 5,13
66,41 7,26 4,94
38,93 5,40 6,50
KZs-0,5
Zs
55,43 32,77 18,53 6,20 6,35
5,38 4,61 4,18 4,75 4,60
Az 8. ábra jól szemlélteti a különböző összetételű filmek, eltérő pH-n mutatott duzzadási arányát. A kitozán és a kitozán/zselatin hibrid filmek (K, KZs-2, KZs-1) savas tartományban, bizonyos pH alatt oldódnak vagy szétesnek. Ennek oka az, hogy a kitozán láncokon lévő amino csoportok savas közegben protonálodnak és a láncok között erős taszítási kölcsönhatás működik. Mivel a kitozán pK-ja ~6 körüli érték, érthető, hogy a kitozán film 7,2 pH-nál már hidrogélt képez, és a hidrogél duzzadása a pH növekedésével csökken. Minden pH-nál mért duzzadási arány azt mutatja, hogy a zselatin tartalom növelésével a filmek duzzadóképessége csökkent, amit feltehetően a két polimer molekulái között fellépő intermolekuláris kölcsönhatás (hidrogén kötések) kialakulása eredményezett. Adott összetétel mellett a pH növekedésével a duzzadási fok csökkent, mert a kitozán töltéssűrűségének csökkenése kedvezett a molekulák közötti H- kötések, hálópontok kiépülésének. A zselatin film duzzadására a pH változás kevésbé hat.
21
Duzzadási arány az összetétel és a pH függvényében
Duzzadási arány
70 60 50 40
K
30
KZs-2 KZs-1
20
KZs-0,5 10
Z
0 4,0 4,8
pH
5,8 7,2 8,0
8. ábra: Duzzadási arány függése a pH-tól és az összetételtől, K: kitozán, Zs: Zselatin, KZs: Kitozán/zselatin hibrid; Ahol a duzzadási arány 0, a filmek feloldódnak ill, szétesnek.
22
4.3 Morfológiai vizsgálatok A kiválasztott mintákat pásztázó elektronmikroszkóppal vizsgáltam,a mintákról készült képeket a 9. ábra mutatja.
23
9. ábra: SEM felvételek, 1000x-es nagyítás; a) kitozán film felülete, b) kitozán film keresztmetszeti képe, c) KZs-1 keresztmetszeti képe, d) zselatin keresztmetszeti képe; a nyíl a film keresztmetszetét jelöli Az a) képen a film felületéről készített kép látható. A felület teljesen sima, homogén, amint az az irodalmi adatok alapján várható volt. [11] A b) képen látható keresztmetszeti felvétel is a film homogenitására utal. A kitozán és zselatin 1:1 arányú hibrid film ( c) ábra), - a mintaelőkészítés hibájából adódó egyenetlenségektől eltekintve - homogén szerkezetet láthatunk. A zselatin film esetében megfigyelhető a kéregképződés, mely további vizsgálatok tárgyát képezheti. A filmekről azért nem készültek nagyobb nagyítású képek, mert az arany bevonat ellenére az elektron nyaláb egy idő után lyukakat égetett a filmbe, mely meghamisította volna a mérési eredményeket.
24
4.4 Nedvesedési vizsgálatok A kísérletileg meghatározott víz peremszögek haladó értékeit az 5. táblázatban adtam meg. A peremszögek a tanulmányozott minták jelentős hidrofobitását mutatják, értékük nagyobb, mint 90o. A paralel mérések eredményeit átlagoltam és Excel segítségével meghatároztam a szórásukat. 5. táblázat: A minták felületén nyert víz peremszögek haladó értékei; Minden egyes értéket több cseppre kapott értékek átlagolásával nyertem. K: kitozán, KZs1: kitozán-zselatin keverék, Zs: zselatin. Film összetétele
Peremszög
K
92
4o
KZs-1
117
8o
Zs
117
6o
Kitűnik a zselatin hidrofobizáló hatása. A vízlepergető hatás oka minden bizonnyal a filmet alkotó molekulák orientációjával magyarázható: a makromolekulák poláris részei befelé, míg apolárisabb részei a levegő fázis felé fordultak a száradás idején. A cseppekről készített felvételek az 10., 11. és 12. ábrákon láthatóak. A peremszögek csökkenésének és a cseppek alakváltozásának oka feltételezhetően az, hogy a víz kölcsönhatásba lép a szubsztrátummal. Duzzasztja, ill. beoldja a polimert. Ez utóbbi folyamat eredményeként nő a vízcsepp polimer tartalma. A folyadék feltehetően liogéllé alakul, miközben a csepp peremvonalának körszimmetriája megszűnik, a csepp szabályos alakja pedig idővel nagymértékben torzul. Jól megfigyelhető, hogy a duzzadás a kitozán film (K jelű minta) esetében jóval gyorsabban megy végbe, mint a kompozit filmnél. A vízcsepp alakja ebben az esetben időben torzul. Zselatin, ill. zselatin tartalmú filmekre helyezett cseppek nem torzultak a vizsgálat időtartama alatt, ezek a filmek tehát ellenállóbbnak mutatkoztak. Kitozán filmeken a peremszögek időbeli változása nem is tanulmányozható, a cseppek gyorsan bekövetkező (30 másodpercen belüli) torzulása miatt.
25
Több közleményben is beszámolnak kitozán, ill. zselatin felületén nyert víz peremszög adatokról. Ezek számottevően kisebbek az általam mért víz peremszög értékeknél [5, 13]. A legtöbb közleményben azonban nem számolnak be a peremszög mérés körülményeiről, így korántsem bizonyos, hogy az irodalomban megadott adatok a peremszögek haladó értékei. Az összehasonlításra ezért nem nyílik lehetőség. A kitozán filmeken megfigyelt jelenségek kiinduló pontként szolgálhatnak további nedvesedési vizsgálatoknak. Nyilvánvaló ugyanis, hogy különböző összetételű, ill. pH-jú vizes oldatok szubsztrátummal való kölcsönhatása más és más, amelyről a peremszögek időbeli változása, ill. a torzulási folyamat elindulásának időpontja számszerűsíthető információt adhatnak.
10. ábra: A kitozán filmen lévő csepp alakjának időbeli változása
11. ábra: Kitozán/zselatin kompozit filmen lévő csepp alakjának változása az időben
12. ábra: Zselatin film haladó peremszögéről készült felvétel
26
4.5 Mechanikai vizsgálatok K, KZs-2, KZs-1 és KZs-0,5 jelű minták szakítószilárdságát vizsgáltam, az eredmények 6. táblázatban találhatók. Zs film erősen töredezett, ezért nem tudtam a szakítószilárdságát meghatározni. KZs-1 jelű film esetén a szakítószilárdság 50 N feletti érték volt. A további felhasználás
szempontjából
ez
még
előnyös
lehet
a
biológiailag
lebomló
csomagolóanyagok gyártásakor. Látható, hogy a legkevésbé ellenállónak a kitozán film bizonyult, s a szakítószilárdság növekedését a zselatin adagolásával lehetett elérni. 6. táblázat: Összefoglaló táblázat; Különböző összetételű minták szakítószilárdsága; K: kitozán, KZs: kitozán/zselatin kompozit Minta
Szakítószilárdság (N)
K
16,86
KZs-2
20,24
KZs-1
> 50
KZs-0,5
31,15
A maximális szakítószilárdságot az 1:1 arányú kitozán/zselatin film mutatta.
27
5 Összefoglalás Munkám célja a kitozán filmek tulajdonságainak módosítása, amit zselatinnal való társítással kívántam elérni. Vizsgáltam a filmek duzzadását, morfológiáját, nedvesedési és mechanikai tulajdonságát. Az előkísérletek során több fontos tényező hatását tisztáznom kellett. Azt tapasztaltam, hogy a preparációs módszer jelentősen befolyásolja az elkészült filmek homogenitását,
transzparenciáját.
Vizsgálatok
azt
mutatták,
hogy
az
oldat
öntéses/oldószer-elpárologtatásos („Casting/solvent evaporation technique”) technikát használva sikerült homogén, átlátszó filmeket létrehozni. A filmek duzzadását a duzzasztó közeg pH-ja jelentősen befolyásolja. A duzzasztási vizsgálatokat széles pH tartományban (4 - 8-as pH) végeztem. tapasztaltam, hogy a kitozán film savas (pH
Azt
6) duzzasztó közegekbe beoldódik. Ezt a sok
tekintetben kedvezőtlen folyamatot különböző mennyiségű zselatin hozzáadásával szabályozni lehetett. A zselatin arányának növelésével a filmek duzzadóképessége (adott pH-nál) csökkent, amit feltehetően a két polimer molekulái között fellépő intermolekuláris kölcsönhatás (hidrogén kötések) kialakulása eredményezett. Adott összetétel mellett a pH növekedésével a duzzadási fok csökkent, mert a kitozán töltéssűrűségének csökkenése kedvezett a molekulák közötti H- kötések, hálópontok kiépülésének. Trinátrium-citráttal való térhálósítás után a kitozán/zselatin filmek duzzadási foka jelentős mértékben csökkent. A mintákról készült SEM felvételek alapján próbáltam a filmek morfológiájára következtetni. A kitozán film felülete és belső szerkezete a képek alapján homogénnek tűnt. A zselatin filmnél kéregképződésre utaló felületi réteg mutatkozott. A kitozán/zselatin filmeknél - a mintaelőkészítés hibájából adódó egyenetlenségektől eltekintve - homogén szerkezetet láthattunk.
28
A nedvesedési vizsgálatok során a kitozán filmek sajátságos tulajdonságának köszönhetően, - miszerint a cseppek alakja időben torzul, duzzadás játszódik le - csak a kezdeti, haladó peremszögeket lehetett meghatározni. Megmutatkozott a zselatin hidrofobizáló tulajdonsága, melyet a molekulán belüli poláris és apoláris csoportok eltérő orientációja eredményezett. A mechanikai vizsgálatok igazolták, hogy a zselatin adagolásával kedvezőbbé tehetőek a kitozán tulajdonságai. A szakítószilárdság az 1:1 összetételű hibrid film esetében volt a legnagyobb, az 1:0 összetételű filmnél (kitozán) pedig a legkisebb. A zselatin szakítószilárdságát a minta törékenysége miatt nem lehetett meghatározni.
29
Irodalomjegyzék [1] http://www.pointernet.pds.hu/ujsagok/transpack/2007/12/20080116231359560000007630. html. [2] Controlled release of ciproXoxacin hydrochloride from chitosan/polyethylene glycol blend films. Qun Wang, Zhanfeng Dong, Yumin Du, John F. Kennedy. 2007., Carbohydrate Polymers 69, 336–343. [3] Synthesis and characterization of soluble chitosan/sodium carboxymethyl cellulose polyelectrolyte complexes and the pervaporationdehydration of their homogeneous membranes . Qiang Zhaoa, Jinwen Qiana, Quanfu Ana, Congjie Gaob , Zhangliang Guia, Huangtao Jina. 2009., Journal of Membrane Science 333, 68–78. [4] Preparation, characterization and surface pKa values of, poly(N-vinyl-2-pyrrolidone)/chitosan blend films . Serkan Demirci, Ali Alaslan, Tuncer Caykara. 2009., Applied Surface Science 255, 5979–5983. [5] Studies of chitosan: II. Preparation and characterization of chitosan/poly(vinyl alcohol)/gelatin ternary blend films . Cheng-Ho Chen, Fang-Yu Wanga, Ching-Feng Maoa, Wei-Tung Liao, ChingDong Hsieha. 2008., International Journal of Biological Macromolecules 43, 37–42. [6] Antimicrobial properties of chitosan and mode of action: A state of the art review. Ming Kong, Xi Guang Chen, Ke Xing, Hyun Jin Park. 2010., International Journal of Food Microbiology 144, 51–63. [7] Schematic drawing of the enzymatic synthesis of Chitosan. NEUROtiker. 2008., Wikipédia. [8] Chitosan application for active bio-based films production and potential in the food industry: Review. Aider, Mohammed. 2010., LWT - Food Science and Technology 43, 837–842. [9] Chitosan and gelatin based edible films: state diagrams, mechanical and permeation properties. Ioannis S. Arvanitoyannis, Atsuyoshi Nakayama, Sei-ichi Aiba. 1998., Carbohydrate Polymers 37, 371–382. [10] Study on physical properties and nerve cell affinity of composite films from chitosan and gelatin solutions. Mingyu Cheng, Jinguang Deng, Fei Yang, Yandao Gong, Nanming Zhao, Xiufang Zhang. 2003., Biomaterials 24, 2871–2880. [11] Preparation and characterization of novel chitosan/gelatin membranes using chitosan hydrogel. H. Nagahama, H. Maeda, T. Kashiki, R. Jayakumar, T. Furuike, H. Tamura. 2009., Carbohydrate Polymers 76, 255–260.
30
[12]Composite and bi-layer films based on gelatin and chitosan. S. Rivero, M.A. García, A. Pinotti. 2009., Journal of Food Engineering 90, 531–539. [13] Evaluation of Alginate coated Chitosan Membrane for Guided Tissue Regeneration. Shyh Ming Kuo, Shwu Jen Chang, Yun Ting Hsu, Ta Wei Chen. 2005., Engineering in Medicine and Biology 27th Annual Conference . [14] Evaluation of chitosan/PVA blended hydrogel membranes . Jen Ming Yang, Wen Yu Sua, Te Lang Leub, Ming Chien Yangb. 2004., Journal of Membrane Science 236, 39–51 . [15] Structure and interactions in covalently and ionically crosslinked chitosan hydrogels for biomedical applications. J. Berger, M. Reist, J.M. Mayer, O. Felt, N.A. Peppas, R. Gurny. 2004., European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 57, 19–34. [16] Polymeric cryogels as promising materials of biotechnological interest. Vladimir I. Lozinsky, Igor Yu. Galaev,Fatima M. Plieva,Irina N. Savina,Hans Jungvid,Bo Mattiasson. 2003., TRENDS in Biotechnologie 21(10), 445-451. [17] Synthesis and characterization of elastic and macroporous chitosan–gelatin cryogels for tissue engineering. Neeraj Kathuria, Anuj Tripathi, Kamal K Karb, Ashok Kumar. 2009., Acta Biomateriala 5, 406-418. [18] Electrically treated composite FILMS based on chitosan and methylcellulose blends. M.A. Garcia, A. Pinotti, M. Martino, N. Zaritzky. 2009., Food Hydrocolloids 23, 722–728. [19] http://hu.wikipedia.org/wiki/Szak%C3%ADt%C3%B3szil%C3%A1rds%C3%A1g.
31
